Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Высоцкая Лидия Борисовна
РАСПРОСТРАНЕНИЕ ГОРМОНАЛЬНЫХ, ГИДРАВЛИЧЕСКИХ И ТРОФИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В РАСТЕНИЯХ ПРИ ВНЕШНИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА КОРНЕВУЮ СИСТЕМУ
03.01.05 - Физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Уфа Ц2012
Работа выполнена в лаборатории физиологии растений Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Кудоярова Гюзель Радомесовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кузнецов Виктор Васильевич доктор биологических наук, профессор Усманов Искандер Юсуфович доктор биологических наук, доцент Яруллина Любовь Георгиевна
Ведущая организация: Нижегородский Государственный Университет им. Н.И. Лобачевского
Защита состоится 29 марта 2012 г. в ЕЕ. часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 в Башкирском государственном университете.
Адрес: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Биологический факультет Башкирского государственного университета, ауд. 332.
Факс (347)2736778, email: disbiobsu@mail.ru Официальный сайт БашГУ:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.
Автореферат разослан ЕЕЕЕЕЕ. 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н., профессор М.Ю. Шарипова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Способность координировать процессы, которые происходят в разных органах - важное свойство растений, обеспечивающее их реакцию на организменном уровне и приспособление к изменению условий обитания. Одно из важных проявлений этого свойства - изменение гидравлической проводимости корней в соответствие с транспирационным запросом, обеспечивающее баланс между поглощением и испарением воды (Steudle, 2000; Mеinzer, 2002; Parent et al., 2010). Другое проявление координации процессов, происходящих в разных органах растений - это относительная активация роста корней за счет ингибирования роста побега, лежащая в основе приспособления растений к дефициту воды и ионов (Beck, 1996; Poorter, Nagel, 2000; Bogeat-Triboulot et al., 2007). Известно, что фитогормоны могут выполнять функцию сигналинга на уровне целого растения, передавая информацию из органа в орган (Кулаева, 1962; Davies et al., 2005; Романов, 2009; Титов, Таланова, 2009). Впервые это было показано на примере синтезируемых в корнях цитокининов, которые транспортируются в побег и влияют на происходящие там процессы (Кулаева, 1962). Была показана сигнальная функция корневой абсцизовой кислоты (АБК) в передаче в побег сигналов о наступающей засухе (Zhang, Davies, 1990). Идея о роли корневой АБК в адаптации растений к дефициту воды стала весьма популярной (см.
обзор Schachtman, Goodger, 2008), а роль корневых цитокининов в нитратном сигналинге была недавно подтверждена в опытах японский исследователей (Takei et al., 2001; Sakakibara et al., 2007). Тем не менее, не всегда удается доказать роль гормонов в качестве системных сигналов, обеспечивающих реакцию на уровне целого организма. Так, не у всех растений удалось зарегистрировать повышение притока АБК из корней при подсыхании почвы (Dodd 2005). Отдельные эксперименты с трансгенными растениями свидетельствовали против роли цитокининов в качестве системных сигналов (Faiss et al., 1997). В них было показано, что только локальная индукция ipt-гена в побегах трансгенного привоя приводит к активации роста боковых побегов, а индукция синтеза цитокининов в корнях трансгенного подвоя не давала такой реакции. Из литературы известна роль гидравлических (Malone, 1992; Холодова и др., 2006; Christman et al., 2007), электрических (Fromm, Lautner, 2007) и субстратных (трофических) (Forde, 2002; Rolland et al., 2006) сигналов в координации процессов в растениях. Высказывалось предположение о том, что их распространение по растению может вызывать локальные изменения в метаболизме гормонов, обеспечивая, тем самым их участие в дистанционном сигналинге (Кудоярова и др., 1990; Полевой и др, 1997; Christmann et al., 2007;
Barlow, 2008). Способность гормонов влиять на концентрацию друг друга (Brugier et al., 2003; Reski, 2006) может играть важную роль в обеспечении распространения гормональных сигналов по растению. Вместе с тем, взаимодействию гормональных, гидравлических и трофических сигналов уделяется крайне мало внимания. Также немногочисленны исследования, которые позволили бы выявить роль взаимовлияния разных гормонов в осуществлении гормональной системой функции сигналинга на уровне целого растения. Вместе с тем, можно было предполагать, что транспорт одного гормона может влиять на локальный метаболизм другого гормона, вовлекая его в системный сигналинг.
Цель работы состоит в выявлении роли гидравлических, гормональных и трофических сигналов в обеспечении реакции растения на уровне целого организма при воздействиях на корневую систему. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Оценить вклад притока гормонов из корней и их метаболизма in situ в формировании гормонального статуса побега растений томатов при локальном дефиците воды в почве. Выявить роль гормональных и гидравлических сигналов в регуляции метаболизма цитокининов в побеге.
2. На модели трансгенных растений табака с индуцируемой экспрессией iptгена изучить влияние локального повышения продукции цитокининов в корнях на скорость транспирации и содержание ЦК в листьях.
Изучить транспорт ЦК из корней, динамику содержания АБК, а также активность цитокининоксидазы в побеге с целью выявления компенсаторных механизмов, направленных на обеспечение поддержания водного баланса у трансгенных растений табака после индуцированного повышения уровня цитокининов.
3. Изучить влияние частичного удаления корней на рост листьев растяжением, накопление массы побега и корней, ветвление корней, концентрацию элементов минерального питания, показатели водного обмена, содержание и транспорт гормонов у растений пшеницы. На основании анализа этих данных выявить возможные гидравлические и гормональные сигналы, запускающие компенсаторные реакции, направленные на поддержание потока воды из корней и повышение их поглотительной способности.
4. Оценить влияние дефицита элементов минерального питания в среде на рост побега и корней, соотношение их массы, содержание гормонов и показатели водного обмена (водный и осмотический потенциал, тургор, устьичная и гидравлическая проводимость) у растений пшеницы. На основании анализа результатов этих экспериментов выявить относительную роль гидравлических, гормональных и трофических сигналов в регуляции относительной активации роста корней как адаптивной реакции на дефицит питания..
5. Проверить гипотезу о том, что сопряженность сигналинга ЦК и АБК обусловлена влиянием АБК на активность цитокининоксидазы и содержание цитокининов в растениях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Х Трофические и гидравлические сигналы оказывают влияние на содержание гормонов в побегах и корнях и их ксилемные и флоэмные потоки.
Координация ростовых реакций побега и корня при воздействиях на корни осуществляется за счет изменения метаболизма и перераспределения гормонов между побегом и корнем.
Х Системное действие цитокининов в регуляции водного баланса растений реализуется через влияние уровня продукции цитокининов в корнях на устьичную проводимость. Реакция устьиц при воздействиях на корневую систему зависит от соотношения АБК и цитокининов, которое, в свою очередь, определяется как притоком гормонов из корней (корневые гормональные сигналы), так и их метаболизмом in situ.
Х В основе согласованности изменений уровня цитокининов и АБК и сопряженности их действия на устьичную проводимость и соотношение массы побег/корень лежит влияние АБК на уровень ЦК, реализуемое через повышение уровня транскриптов и активности цитокининоксидазы.
Х Компенсаторное повышение поглотительной способности корневой системы после ее редукции достигается за счет повышения гидравлической проводимости в результате концентрирования АБК в редуцированной корневой системе и активации ветвления под влиянием ауксинового сигнала, поступающего из побега.
Научная новизна. Выявлен относительный вклад транспорта и метаболизма цитокининов in situ в регуляцию их содержания в листьях при разбавлении питательного раствора, локальном подсыхании почвы (PRD) и удалении части корней. Показано, что при данных воздействиях уровень этого гормона в большей степени зависит от его метаболизма: снижается за счет активации цитокининоксидазы при дефиците элементов минерального питания и поддерживается - в результате снижения активности этого фермента при редукции корневой системы. С помощью ингибитора синтеза АБК флуридона доказано существование причинно-следственной связи между накоплением АБК и снижением уровня цитокининов в растении при стрессовых воздействиях, в основе которого лежит активация цитокининоксидазы под влиянием АБК. На модели трансгенных растений с локальной индукцией синтеза цитокининов в корнях растений показана системная роль дальнего транспорта цитокининов в повышении устьичной проводимости и, тем самым, - в регуляции водного обмена на уровне целого растения. Выявлен высокий адаптивный потенциал корневой системы растений пшеницы, который проявляется в способности редуцированной корневой системы обеспечивать побег достаточным количеством воды за счет быстрого подъема гидравлической проводимости, а также компенсаторной активации роста боковых корней.
Показано, что увеличение поглотительной способности редуцированной корневой системы обусловлено перераспределением гормонов: приток АБК из побега в корень - способствует увеличению гидравлической проводимости, а повышение притока ауксинов - активирует формирование боковых корней.
Выявлена роль гидравлических сигналов, которая проявляется в активации потоков АБК и ИУК в корень под влиянием транзиторного дефицита воды в побеге.
Научно-практическая значимость работы. Показано, что в основе разнообразия адаптивных реакций растений лежит сочетание различных сигналов и их взаимодействие. В работе раскрыто, каким образом воздействия на корень индуцируют передачу гормональных, гидравлических и трофических сигналов, которые не только вызывают ответные реакции в побеге, но и генерацию обратных сигналов из побега в корень, обеспечивая тем самым координацию процессов, лежащих в основе роста и водного обмена. Эта информация углубляет представления о механизмах, лежащих в основе регуляции продуктивности и устойчивости растений и будет полезна в поиске путей их повышения. Основные результаты работы используются в учебном процессе на кафедре физиологии растений - включены в учебное пособие Гормоны и адаптация растений к условиям обитания. Уфа: РИО БашГУ, 2003.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Исследования проводились в рамках планов НИР лаборатории физиологии растений Института биологии УНЦ РАН Оптимизация и стабилизация продуктивного процесса растений в условиях стресса уровнем минерального питания и регуляторами роста (1996-1998), Исследование системы регуляции концентрации фитогормонов как фактора интеграции растительного организма (2000-2003), Механизмы передачи сигналов между органами растения и согласования процессов, обеспечивающих рост и водный обмен в изменяющихся условиях внешней среды (2004-2006), Регуляция роста и водного обмена растений в изменяющихся условиях внешней среды (20072009). Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ: 97-04-49962, 99-04-49291, 02-04-97908, 03-04-49780, 05-04-50824-МФ, 05-04-97900, 06-0449166, 06-04-49276, 08-04-00591, 09-04-00942, 11-04-97023.
Декларация личного участия. Автором была определена тема исследования и подбор экспериментальных моделей. Часть результатов, представленных в разделах 3.3 и 3.4 диссертации получены в совместной работе с к.б.н. Л.Н. Тимергалиной, к.б.н. А.В. Коробовой, автор был научным руководителем их кандидатских диссертаций. Автору принадлежит замысел и окончательный текст диссертации. В диссертации использованы опубликованные в соавторстве работы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях, наиболее важные из которых: III, IV, V, VI съезд обществ физиологов растений (Москва, 1997; Москва, 1999; Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007), XI-XIV конгрессы европейских обществ физиологов растений (Варна, 1998; Будапешт, 2000; Крит, 2002; Краков, 2004; Лион, 2006), 5-я междунар.
конф. Регуляторы роста и развития растений (Москва, 1999), 3-я Всеросс.
конф. Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологи (Уфа, 2000), междунар. конф. по экологической ботанике (Сыктывкар, 2002), 2-я междунар. конф. Integrated Approaches to Sustain and Improve Plant Productivity under Drought Stress (Рим, 2005), междунар. симпозиум Сигнальные системы растений: роль в адаптации и иммунитете (Казань, 2006), междунар. конф. Современная физиология растений: от молекул до экосистем (Сыктывкар, 2007), междунар. конф.
Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений (Екатеринбург, 2008), Всероссийская конф. Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды (Иркутск, 2009), 8-я междунар. конф. Eco-Physiological aspects of plant responses to stress factors (Cracow, 2009), Всероссийский симпозиум Растение и стресс (Москва, 2010), II-ая Международная конф. Регуляция роста и развития растений: физиологобиохимические и генетические аспекты (Харьков, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 32 работы, в том числе 1 монография, 17 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для защиты докторских диссертаций, 9 статей в крупных региональных изданиях.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 283 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список литературы) и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, заключения и выводов. В работе представлено 35 таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 397 наименований, из них 346 иностранных.
Благодарности. Автор благодарит к.б.н Тимергалину Л.Н., к.б.н.
Коробову А.В., за помощь в проведении экспериментов и анализе результатов, проф. Веселова С.Ю., проф. Трапезникова В.К., д.б.н. Веселова Д.С., к.б.н Архипову Т.Н., к.б.н. Иванова И.И. за ценные советы и рекомендации, проф.
Кудоярову Г.Р. за чуткое руководство и предоставление всех необходимых условий для выполнения экспериментов, а также весь коллектив нашей лаборатории и членов своей семьи.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводили на растениях яровой твердой пшеницы (Triticum durum Desf., сорт Безенчукская-139), томатов (Solanum lycopersicum L., cv. Ailsa Craig) и трансгенного табака (Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana HSIPT). Трансгенная линия была получена путем трансформации растений табака Nicotiana tabacum L., сорт. Petit Havana SR- 1 бактериальным ipt геном, находящимся под контролем HS-протеин-70 промотором дрозофилы (Drosoph melanogaster) (Schmulling et al., 1989).
Семена растений пшеницы проращивали в темноте в течение 2-3 суток на водопроводной воде при температуре 24/18 оС (день/ночь). На четвертые сутки проростки пересаживали на 10 %-ную среду Хогланда-Арнона-I и выращивали при освещенности 400-500 мкмоль м-2с-1 ФАР и 14-часовой продолжительности светового дня в лабораторных условиях. В возрасте 7 суток растения переносили на 1% раствор Х-А (дефицит питания) или удаляли четыре из корней. Корни удаляли (см. схему эксперимента в разделе 3) в питательном растворе для предупреждения закупорки ксилемных сосудов и над питательным раствором, для того чтобы предотвратить поступление питательного раствора через разрезанные ксилемные сосуды.
Растения томатов выращивали в контролируемых условиях при температуре 20-24 оС с 12-часовым фотопериодом при освещенности 2мкмоль м-2с-1 ФАР. Семена проращивали в почве. Через 14 дней в момент появления первого настоящего листа проростки пересаживали в контейнеры с отверстиями в боковых стенках. Через неделю контейнеры помещали в специальные сосуды с двумя отсеками, между которыми в процессе роста распределялись корневые пряди.
Семена растений табака после проращивания в почве пересаживали в горшки с песчано-почвенной смесью (1:2) и выращивали в лабораторных условиях. После появления восьмого листа корни растений прямо в горшках с почвенной смесью подвергали локальному нагреванию в течение 1 ч при 40С, используя водяную баню (отсчет времени инкубации начинался с момента достижения температуры почвы 40С). Открытую поверхность воды в бане изолировали фольгой. В качестве контроля служили растения, которые находились в тех же условиях, но не подвергались нагреванию.
Рост растений регистрировали с помощью датчика роста на основе линейного дифференциального трансформатора с подвижным сердечником ДЛТ-2. Для измерения растяжимости листа дополнительный груз массой 2г подвешивали к коромыслу датчика роста со стороны сердечника. Коэффициент растяжения (m) расчитывали по формуле (Thomas et al., 1999): m=(Х1-Х0)/(Lgr * ) (сек-1* Па), где - Х0 (м/сек)- скорость роста без груза, Х1 (м/сек)- стабильная скорость роста после добавления груза, Lgr (м) - длина зоны растяжения листа, - изменение тянущего усилия, рассчитанное по формуле =9,8 P/106* r(Па), где Р - вес груза (н), а r - радиус основания листа (м).
Число боковых корней и примордиев боковых корней определяли при помощи микроскопа после фиксации корней по Кларку в смеси этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1) и окрашивания ацетокармином (Площинская и др., 2002).
Транспирацию определяли гравиметрическим методом.
Относительное содержание воды определяли в дифференцированной части листьев по фрмуле ОСВ=100%*(сырая масса - сухая масса)/(тургорная масса - сухая масса). Для определения устьичного сопротивления использовали порометр (MK Delta-T). Устьичную проводимость и скорость ассимиляции углекислого газа измеряли при помощи газового анализатора (CIRAS-2, PP- Systems, UK). Осмотическое давление ксилемного сока и тканевой жидкости, отжатой после замораживания, определяли с помощью цифрового микроосмометра (KAMLAB Limite, UK).
При помощи камеры давления (Scholander-type pressure chamber, Plant Moisture Systems, USA) измеряли водный потенциал листа растений томата ( ) и собирали ксилемный сок. В экспериментах с растениями пшеницы и лист табака ксилемный сок собирали как описано (Vysotskaya et al., 2004).
Для оценки транспорта гормонов из побега в корень основание отделенных побегов погружали в 20 мМ раствор ЭДТА (этилендиаминотетрауксусной кислоты) с рН 7 для предотвращения закупорки флоэмных сосудов и выдерживали в темноте при 24oC (Caputo and Barneix, 1999). Затем в растворе определяли содержание гормонов. Содержание ионов в тканевой жидкости и ксилемном экссудате определяли методом капиллярного электрофореза на ионном анализаторе Нанофор 01.
Содержание азота в растущей части побега определяли с помощью CHNS - анализатора (EURO EA 3000) фирмы HEKAtech GmbH, Германия.
Гидравлическую проводимость корня рассчитывали по формуле Lp=V/(x 0), где Lp - гидравлическая проводимость; V - поток воды из корней; x - осмотическое давление пасоки; 0 - осмотическое давление питательной среды. Общую гидравлическую проводимость измеряли с помощью вакуумной установки, имитируя транспирацию интактного растения (Freundl et al., 1998). Для определения содержания гормонов в тканях растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80%-ным этанолом. Спиртовый экстракт центрифугировали и супернатант упаривали до водного остатка. Для очистки и концентрирования АБК и ИУК использовали модифицированный метод (Veselov et al., 1992). ЦК разделяли при помощи ТСХ (Kudoyarova et al., 1998). Иммуноферментный анализ и иммуногистохимическую локализацию ИУК проводили с использованием специфических антител к гормонам (Веселов, 1998), активность цитокининоксидазы определяли как описано ранее (Веселов, Симонян, 2004).
Уровень экспрессии гена цитокининоксидазы (ЦКО) оценивали методом ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли с использованием гуанидинтиоцианатного буфера, рН 8.0. кДНК получали реакцией обратной транскрипции в 30 мкл реакционной смеси, содержавшей 1 мкг растительной РНК, 0.5 мкг праймера oligo(dT)12-18, 40 ед. активности обратной транскриптазы М-MuLV ("MBI Fermentas", США), 250 мМ Tрис-HCl, рН 8.3, 250 мM KCl, мM MgCl2, 50 мM ДTT, по 10 мM каждого дНTФ и 20 ед. РНКзина. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37С. Затем проводили амплификацию с использованием Taq-полимеразы и праймеров F (5'-CCCTCGTCGTCTACCCACTCAAC-3'), и R (5'-CCTCTTGGGGTCGTACTTGTCCTT-3'), гомологичных к консервативным участкам гена ЦКО пшеницы (Авальбаев и др., 2006). Полученные амплификаты фракционировали в 1-2% агарозном геле, и после их окрашивания бромистым этидием проводили оценку содержания кДНК в отдельных полосках геля на Gel Camera System ("UVP", США). В качестве внутреннего контроля использовали конститутивно экспрессирующийся ген -тубулина пшеницы, праймеры к которому имели следующую последовательность: F (5Т-TCTTCATGGTGGGCTTCGC-3Т) и R (5Т-CGCCTCGGGTGAACTCCATCT-3Т) (Ciaffi et al., 2006).
Для статистической обработки данных использовали Analysis Toolpack и встроенные функции MS Excel.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Гормональные и гидравлические сигналы в регуляции роста и устьичной проводимости у растений томатов при локальной засухе в области корней На примере цитокининов была впервые показана роль гормонов в передаче сигналов из корня в побег при дефиците минерального питания (Кулаева, 1962). При изучении дефицита воды больше внимания уделялось АБК (см. обзоры Jiang, Hartung, 2008; Wilkinson, Davies 2010). Вместе с тем, имеется ряд противоречий в гипотезе о роли корневой АБК в качестве сигнала о подсыхании почвы, и высказывалось мнение, что их можно разрешить, уделяя внимание другим гормонам (Davies et al., 2005). Для изучения роли цитокининовых сигналов в реакции на дефицит воды мы использовали способ раздельного полива (partial root drying, PRD), когда корневая система поделена между сосудами, один из которых поливают, а во втором почва подсыхает (Gowing et al., 1990; Sobeih et al., 2004). При таком подходе за счет ослабления гидравлических сигналов ярче проявляются гормональные сигналы о подсыхании почвы. Наша задача состояла в том, чтобы измерить концентрацию цитокининов как в листьях, так и в собранном из них ксилемном соке.
Наблюдения проводили в течение пяти дней.
Снижение содержания воды в почве повышало концентрацию АБК в ксилемном соке более чем в два раза, снижало транспирацию в среднем на 22 % и водный потенциал листа - в среднем на 0,08 МПа (рис 1.1).
окальная засуха в корневой зоне не вызывала у растений томата резкого снижения водного потенциала листа (не более 0,1 МПа) (рис. 1.1) и не индуцировала уменьшения суммарной концентрации производных зеатина в ксилемном соке (рис. 1.2а). Небольшой подъем концентрации цитокининов в ксилемном соке в начале воздействия мог быть следствием уменьшения объема транспирационного потока. При этом содержание цитокининов в листьях PRDЦ растений снизилась на 46% (рис.1.2б), а площадь листьев на 16 % (данные в диссертации).
1,4PRD 1,WW 1,30,2PRD 0,0,1WW 0,0 -1 1 3 5 -1 1 3 Время, сутки Время, сутки -0,Рис. 1.1. Концентрация АБК в ксилеме, -1 1 3 водный потенциал листа, транспирация после перевода растений -0,томата на частичную корневую засуху PRD (полив одной корневой пряди объемом воды равным 50% от -0,транспирационных потерь WW). В качестве контроля (WW) служили PRD растения, обе пряди корней которых WW -0,8 поливали до полной компенсации транспирационных потерь, n=Z Z б 35 а ZR ZR ZN ZN PRD PRD PRD Контр Контр Контр PRD PRD PRD Контр Контр Контр 2 4 2 4 Время, сутки Время, сутки Рис. 1.2. Динамика концентрации производных зеатина (Z, ZR и ZN) в ксилемном соке (а), собранном из 6 и 8 листьев, и в девятом листе (б) после перевода растений томата на частичную корневую засуху PRD (полив одной корневой пряди объемом воды равным 50% от транспирационных потерьWW) В качестве контроля (WW) служили растения, обе пряди корней которых поливали с полной компенсацией транспирационных потерь, n=растений снизилась на 46% (рис.1.2б), а площадь листьев на 16 % (данные в диссертации).
* ммоль/(м с) Транспирация, Концентрация АБК, нМ Водный потенциал, МПа сырой массы соке, нг/мл Содержание ЦК в листе, нг/г Концентрация ЦК в ксилемном По данным литературы более сильная почвенная засуха (снижение водного потенциала на 1 МПа) приводила к снижению концентрации цитокининов в листьях растений Medicago sativa на 40%. Концентрация цитокининов в верхушечной почке PRDЦрастений винограда (Vitis vinifera) снижалась на 49% и 26% соответственно по сравнению с контрольными растениями (WWЦрастения), хотя водный потенциал листа не менялся (Stoll et al., 2000). У растений подсолнечника в условиях частичной засухи в корневой зоне также не было изменений водного потенциала листа и концентрация зеатинрибозида и дигидрозеатинрибозида в ксилемном соке из корня была близка к контролю (Masia et al., 1994). Таким образом, можно предположить, что умеренная почвенная засуха ( <0,1 MPa) влияет на цитокининовый лист статус побега, хотя концентрация гормона в ксилемном соке может не изменяться.
В результате обнаруженного нами уменьшения в содержании ЦК на 46 % возможны значительные изменения в росте и развитии растений. Пониманию физиологического значения пониженного ЦК статуса помогло создание трансгенных растений со сверхэкспрессией цитокининоксидазы (ЦКО).
Концентрация цитокининов у таких растений составляла 30-45 % от уровня нетрансформированных растений (Werner et al., 2001, 2003), и они характеризовались замедленным развитием побега и относительно более сильным развитием корня. Поскольку аналогичные изменения роста и развития характерны для растений засушливых условий (Sharp, LeNoble, 2002; Lafitte et al., 2007; Guo et al., 2010), то снижение содержания цитокининов может быть отчасти ответственным за физиологические изменения, вызванные почвенной засухой. Поэтому было важно выявить механизмы, вызывающие это снижение.
Совершенно очевидно, что цитокининовый статус листа зависит от баланса между накоплением гормона (доставка цитокининов по ксилеме и синтез в самом листе) и его расходованием (катаболизм и экспорт по флоэме). Исходя из того, что приток цитокининов в побег равен произведению их концентрации на скорость транспирационного потока (Jackson, 1993), он должен был снизиться не более, чем на 22% (степень снижения транспирации при неизменной концентрации цитокининов). При этом содержание ЦК в листьях уменьшилось на 46% (рис. 1.2б). Следовательно, снижение содержания гормона в листе не было пропорционально скорости его доставки, что позволяет предположить наличие других механизмов регуляции концентрации ЦК.
Синтез ЦК может происходить в листе (Miyawaki et al., 2004), но в более зрелых листьях, с которыми мы работали, он незначителен по сравнению с молодыми развивающимися листьями (Nordstrom et al., 2004). Поэтому снижение содержания цитокининов в листе скорее может быть связано с изменением скорости их распада в листьях при дефиците воды. Несмотря на то, что активность цитокининоксидазы в растениях кукурузы, подвергнутых водному стрессу, так и не была измерена напрямую, накопление транскриптов ЦКО увеличивалось в ответ и на водный дефицит, и на экзогенную АБК (Brugiere et al., 2003). Более того, несколько форм ЦКО были охарактеризованы и показана их внеклеточная локализация (Werner et al., 2003). Так как активность различных форм этого фермента лежит в пределах pH 6.5Ц8.(Motyka et al., 1996), защелачивание, по сравнению с обычным (рН 5Ц6) уровнем, ксилемного сока и апопласта листа растений томата, вызываемое почвенной засухой (Wilkinson et al., 1998; Sobeih et al., 2004), может активировать деградацию цитокининов.
Пока не ясно, что более значимо для регуляции цитокининзависимых процессов: содержание цитокининов в ксилемном экссудате или в листе. В исследованиях последнего десятилетия была показана последовательность событий, ведущих от восприятия ЦК-сигналов к широкому спектру ЦК ответов (DТAgostino and Kieber, 1999; Kiba et al., 2005; Романов и др., 2009). Так как ЦК связываются с локализованной в плазмолемме гистидинкиназой, выполняющей роль рецептора ЦК, один из доменов которой расположен снаружи клетки в апопласте (DТAgostino and Kieber, 1999), содержание цитокининов в ксилеме может быть наиболее важным. А поскольку у растений томата концентрация цитокининов в ксилемном соке не снижалась под влиянием дефицита воды (рис. 1.2), это могло способствовать поддержанию ростовых и других ЦКзависимых процессов. Вместе с тем, присутствие в цитоплазме цитокининсвязывающих белков (Brovko et al., 2007) указывает на функциональное значение общего содержания цитокининов в листьях.
а б 400 4300 300 Рис. 1.3. Корреляция между устьичной 200 2проводимостью (gs), 100 1водным потенциалом 0 листа ( ) (а, б) и листа -0,8 -0,6 -0,4 -0,8 -0,6 -0,концентрацией ксилем листа, МПа листа, МПа ной АБК (в, г), через двое (а, в) и четверо (б, г) суток после перевода г в 44растений томата на 3300 частичную корневую засуху. На рисунках 22представлены данные 11парных измерений для PRD и WW растений и 0 200 40 200 4проведена линейная Концентрация АБК, нМ Концентрация АБК, нМ регрессия (P<0,05) Было показано, что цитокинины способствуют открытию устьиц в эпидермальных стрипах (обзор Dodd, 2003). Однако изменения водного потенциала листа и содержания АБК в ксилеме также важны для регуляции этого процесса (Bunce, 1996; Davies et al., 2005). Снижение водного потенциала листа PRD-растений (рис. 1.1) ставит вопрос о том, не регулирует ли сам водный потенциал устьичную проводимость, что считается возможным (Comstock, 2002). Однако в наших экспериментах это представляется маловероятным, так как высокая устьичная проводимость сопровождается низким водным потенциалом (рис. 1.3а). На основании этих данных мы можем лишь предположить, что устьичная проводимость контролирует водный потенциал, а не наоборот. Далее в наших экспериментах через четверо суток произрастания растений в условиях частичной засухи в зоне корня (PRD) высокая устьичная проводимость (gs) коррелирует с низким содержанием АБК в ксилемном соке (рис. 1.3г), что согласуется с литературными данными о том, что ксилемная АБК регулирует устьичную проводимость (Zhang and Davies, g s, ммоль/(м * с) g s, ммоль/(м * с) g s, ммоль/(м * с) g s, нмоль/(м * с) 1990; Dodd, 2005). Если верно предположение о том, что замыкающие клетки чувствительны к изменению концентрации ЦК, а не к их доставке, то отсутствие изменений концентрации цитокининов в ксилеме PRD-растений свидетельствует против регуляторной роли корневых ЦК.
Таким образом, у растений томатов при частичной засухе в области корней формировался корневой АБКЦсигналинг, регулирующий устьичную проводимость листьев. Концентрация ЦК в ксилеме существенно не менялась, но значительно снижалась в побеге растений. Снижение содержания этого гормона в побеге предположительно может быть обусловлено повышением активности цитокининоксидазы, а неизменная концентрация цитокининов в ксилемном соке на фоне снижения транспирации растений говорит в пользу регуляции загрузки ЦК в самом корне. В этих экспериментах мы видим лишь косвенное доказательство того, что цитокинины могут выступать в роли корневого сигнала и регулировать протекающие в побеге процессы. В поисках более прямых доказательств цитокининового корневого сигналинга мы использовали для исследований IPT-трансгенные растения табака, у которых можно локально вызвать активацию синтеза гормона. Данные представлены в следующем разделе. Что касается гидравлических сигналов, то в данной серии экспериментов наблюдали лишь небольшое изменение водного потенциала листа, и устьичная проводимость влияла на водный потенциал, а не наоборот.
Вместе с тем, как небольшие изменения водного потенциала листа, так и концентрации АБК в ксилемном соке могли быть теми сигналами, которые запускали процессы, направленные на снижение содержания цитокининов в побеге. На такую возможность указывали некоторые публикации (Brugiere et al., 2003), и она была проверена при выполнении работы, представленной в следующих разделах.
2. Сигнальная роль корневых цитокининов в регуляции устьичной проводимости при локальной индукции синтеза цитокининов в корнях Участие цитокининов в передаче сигналов из корня в побег было убедительно показано в ряде экспериментов (Кулаева, 1962; Takei et al., 2002).
Тем не менее, все шире распространяется представление о том, что эти гормоны действуют только там, где они синтезируются (Riefler et al., 2006; Kurakawa et al., 2007). Kakimoto (2003) в своем обзоре заявил, что транспортируемые цитокинины могут быть важны только при низком их содержании на фоне дефицита элементов минерального питания и что роль механизма дальнего транспорта цитокининов является проблемой, требующей дальнейшего изучения. Задача исследований, представленных в данном разделе, состояла в оценке роли цитокининов во взаимодействии побега и корня путем индукции синтеза цитокининов в корнях ipt-трансгенных растений. Это достигалось благодаря тому, что ген, кодирующий изопентенилтрансферазу, был поставлен под контроль промотора белка теплового шока, и его локальную экспрессию индуцировали в корнях путем их прогрева при 40 С. В отличие от Faiss с соавторами (Faiss et al., 1997), которые с помощью аналогичного подхода изучали относительно медленные реакции (снятие апикального доминирования), мы сосредоточились на ответных реакциях (изменение устьичной проводимости и транспирации), которые могут проявляться уже через несколько минут после изменения концентрации гормона.
SR, контроль 3SR, нагревание корней ** ipt, контроль 2ipt, нагревание Рис. 2.1. Концентрация зеатина (Z), корней его рибозида (ZR) и нуклеотида (ZN) * 2* в корнях нетрансформированных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana SR-1 и трансгенных Nicotiana tabacum 1L., cv. Petit Havana, HSIPT (ipt) растений табака через 1 ч после 100 локального нагревания корней при 40 C в течение 1 ч. Статистически достоверные различия по концентрации каждой формы ЦК между контролем и нагреванием корней показаны: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; t-test Z ZR ZN Локальное нагревание корней растений табака привело к двукратному накоплению цитокининов в корнях трансгенных ipt-растений, в то время как в корнях нетрансформированных растений их содержание достоверно не Концентрация ЦК, нг/г сырой массы изменялось (рис. 2.1). При этом содержание зеатинрибозида повышалось как у трансгенных растений, так и нетрансформированных.
Рис. 2. 2. Концентрация зеатина и 4его производных (Z+ZR+ZN) в ** SR, контроль разных листьях побега и его SR, нагревание корней верхушке (апекс) 3ipt, контроль нетрансформированных Nicotiana ipt, нагревание корней tabacum L., cv. Petit Havana SR-1 и * * трансгенных Nicotiana tabacum L., 2cv. Petit Havana, HSIPT растений * * табака через 1 ч после локального * нагревания корней при 40 C в 1течение 1 ч. Статистически достоверные различия по концентрации ЦК в каждом ярусе листьев между контролем и 3 4 5 6 7 апекс нагреванием корней показаны: * - Р<0,05; ** - Р<0,01, t-test Номер листа от основания побега Содержание цитокининов в верхушке побега было максимальным и не изменялось после корневого теплового шока ни у трансформированных, ни у SRЦрастений (рис. 2.2). Уровень производных зеатина в наибольшей степени повышался в верхних сформированных листьях растений. В то же время накопление цитокининов в листьях трансгенных растений было выражено в большей степени по сравнению с нетрансформированными. Повышенный уровень цитокининов в листьях трансгенных растений табака, индуцированный тепловым шоком, удерживался в течение нескольких часов после прекращения действия температуры на корень (до 3 ч) (данные приведены в диссертации).
Таким образом, содержание цитокининов в листьях растений табака повышалось после нагревания корневой зоны. Для доказательства сигнальной функции корневых цитокининов важно было показать, что высокий уровень содержания цитокининов в листьях трансгенных растений был результатом экспрессии ipt-гена в корнях. Прежде всего, в пользу этого предположения свидетельствует общее повышение уровня цитокининов в термоиндуцированных корнях. Еще одним аргументом может служить обнаруженное в них накопление рибозида зеатина, который принято считать транспортной формой гормона (Mok D., Mok M., 2001). Определение содержания Концентрация ЦК, нг/г сырой массы цитокининов в ксилемном экссудате подтвердило наши предположения об усиления притока ЦК из корней (табл. 2.1).
Таблица 2.1. Содержание зеатина (Z), его рибозида (ZR), нуклеотида (ZN) и их суммы в ксилемном экссудате нетрансформированных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana SR-(SR) и трансгенных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana, HSIPT (ipt) растений табака через 1 ч после локального нагревания корней при 40 C в течение 1ч. Статистически значимые различия для каждого вида гормона обозначены разными буквами (P < 0.05, ANOVA, LSD test) Варианты ZN Z ZR ZN+Z+ZR SR, контроль 2,8 a 10,7 a 3,0 a 13,6 a SR, тепловой шок 2,9 a 13,9 a 3,2 a 16,5 a ipt, контроль 4,6 b 16,6 b 4,4 a 25,6 b ipt, тепловой шок 14,9 c 37,3 c 22,4 b 74,6 c При этом следует отметить, что содержание зеатина увеличивалось примерно в два раза, в то время как концентрация зеатинрибозида достигала пятикратного увеличения. Накопление цитокининов в листьях трансгенных растений, куда цитокинины поступают из корней с транспирационным потоком, и отсутствие их накопления в апексе побега, для которого характерен низкий уровень транспирации, еще раз подтверждает то, что при воздействии теплового шока на корни трансгенных растений местом синтеза гормона не был сам побег. Наши результаты противоположны тем, которые были получены в случае индукции iptЦгена в побеге растений, в апексе которых аккумуляция цитокининов была максимальной (Веселов и др., 1999).
Почему же тепловая индукция iptЦгена, приводящая к сверхпродукции цитокининов в корнях, не вызывала многократного накопления гормона в растении и, в частности, в листьях? В побеге суммарное содержание производных зеатина было примерно вдвое выше по сравнению с контролем через час после теплового воздействия (данные приведены в диссертации ).
Оценка активности ЦКО через час после воздействия температуры показала, что уровень ее был значительно выше в листьях трансгенных растений и незначительно превышал уровень контроля у SRЦрастений (iptЦ растения: 1163114 и 2847149 пмоль ИПА/мг белка/ч у контрольных и опытных растений соответственно; SRЦрастения: 117697 и 1292127 пмоль ИПА/мг белка/ч у контрольных и опытных растений соответственно; n=8).
Активация цитокининоксидазы в листьях трансгенных растений табака также является аргументом в пользу того, что источником для накопления гормона в листьях являются термоиндуцированные корни. По данным литературы, экспрессия гена, кодирующего ЦКО, локализована в клетках листа, расположенных вокруг проводящих пучков (Yang et al., 2002), а регуляция этого гена осуществляется через каскад реакций цитокининового сигналинга, который запускается взаимодействием ЦК со специфическим рецептором клеточной мембраны (Brugiere et al. 2003). В соответствии с этим представлением ЦКО скорее может активироваться не внутриклеточным цитокинином, а гормоном, поступающим в апопласт из корней. Соответственно, в наших опытах активация ЦКО в листьях ipt-растений табака после индукции трансгена тепловым шоком в области корней, подтверждает, что ЦК в лист поступали из корней.
Важно было установить сигнальную функцию поступающих из корней цитокининов. Для этого необходимо было связать повышение их концентрации в листьях с физиологическими эффектами в побеге. Как видно из рисунка (рис.
2.3), нагревание корней повышало устьичную проводимость SR, контроль SR, нагревание корней 4* ipt, контроль 3ipt, нагревание корней Рис. 2.3. Устьичная проводимость (Gs) 3** листьев нетрансформированных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana 250 ** SR-1 и трансгенных Nicotiana tabacum 200 L., cv. Petit Havana, HSIPT (ipt) * растений табака через 1 ч после 1локального нагревания корней при * C в течение 1 ч. Статистически 1значимые различия для каждого листа обозначены: *, Р<0,05; **, Р<0,01. t-test 3 4 5 6 Номер листа от основания побега практически всех листьев растений табака обеих групп (ipt- и SR-растений), при этом наиболее яркие достоверные различия были характерны для верхних Gs, ммоль H O/(м * с) листьев. Следует также отметить, что в большей мере устьичная проводимость активировалась у трансформированных ipt- растений.
Сопоставляя данные по устьичной проводимости (рис. 2.3) с изменением содержания цитокининов в листьях и ксилемном экссудате (табл. 2.1, рис. 2.2) через 1 час после прекращения нагревания корней, можно заметить, что накопление гормона сопровождается высоким уровнем транспирации. По данным литературы, экзогенные ЦК поддерживают устьица в открытом состоянии (Badenoch-Jones et al. 1996), а изменение их эндогенного содержания коррелирует с устьичной проводимостью (Shashidhar et al., 1996; Stoll et al., 2000; Веселова и др., 2006). Поэтому можно сделать вывод, что пришедшие из корней цитокинины могли стимулировать открывание устьиц, т.е. оказывать воздействие на побег.
В литературе чаще обсуждается участие АБК в регуляции размера устьичной щели как доминирующего фактора, вызывающего закрытие устьиц (Jackson 1993; Hartung et al., 2002). В экспериментах с ipt-растениями в начальный период после теплового шока существенного накопления АБК в побегах через час после теплового шока не было обнаружено (данные приведены в диссертации). Вместе с тем, через три часа содержание АБК в листьях термоиндуцированных растений превышало содержание этого гормона в контроле примерно вдвое, при этом в большей степени это проявлялось у трансгенных растений (ipt-растения: 929 и 18015 нг/г сырой массы у контрольных и термоиндуцированных соответственно, (n=9)). Известно, что АБК быстро синтезируется в растении в ответ на повышение дефицита воды в тканях (Zeevaart, Creelman, 1988; Verslues, Bray, 2006) и падение тургора (Pierce, Raschke, 1980). Важно отметить, что через 3 часа после прекращения прогрева корней возрастал дефицит воды в листьях, что, очевидно, было следствием повышенного уровня транспирационных потерь (рис. 2.4).
SR, контроль а б SR, нагревание корней ipt, контроль ipt, нагревание корней * * * ipt, контроль ipt, нагревание корней SR, контроль SR, нагревание корней 0 50 100 150 215 мин 1 ч 3 ч Время после нагревания корней, мин Время после нагревания корней Рис. 2.4. Динамика транспирации (а) и относительного содержания воды (б) в 3-листьях от основания побега нетрансформированных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana SR-1 и трансгенных Nicotiana tabacum L., cv. Petit Havana, HSIPT (ipt) растений табака через 1 ч после локального нагревания корней при 40 C в течение 1 ч. *- статистически достоверное отличие значений между контролем и нагреванием, Р<0,Снижение ОСВ и могло быть стимулом для повышения уровня АБК. Ее накопление сопровождалось уменьшением транспирации ниже уровня контрольных растений табака. По всей видимости, нарушение водного обмена в результате повышенного притока цитокининов послужило тем гидравлическим сигналом, который вызвал накопление АБК и закрытие устьиц, направленное на восстановление водного баланса.
Таким образом, результаты экспериментов с трансгенными растениями табака показали, что вслед за индукцией iptЦгена в корнях трансгенных растений табака активность ЦКО в листьях возрастает, при этом в побеге за счет транспорта из корней поддерживается высокое содержание цитокининов, которые влияют на поведение устьиц. Следовательно, поступающие в побег цитокинины могут выступать в качестве корневого сигнала, который вызывает изменение скорости транспирации листьев.
* О СВ, % Транспирация, мг/(см ч) 3. Сигнальные механизмы, обеспечивающие координацию роста и регуляцию водного обмена при частичном удалении корней у растений пшеницы Регуляция соотношения массы побега и корня - одно из наиболее важных проявлений способности растения координировать процессы роста на уровне целого организма (Beck, 1996; Poorter, А Б Nagel, 2000; Bogeat-Triboulot et al., 2007).
Поэтому представляло интерес последить реакцию растения на удаление части корней. Поскольку при данном воздействии уменьшается поглощающая поверхность корневой системы, можно Рис. 3.1. Схема постановки было предполагать участие экспериментов - удаление корней у 7гидравлических сигналов в ответной дневных проростков пшеницы. Слева на право: интактное растение, реакции растений. Для того, чтобы удаление корней в питательном растворе (А) и над поверхностью выявить их возможную роль, были питательного раствора (Б) использованы 2 варианта постановки опыта. В одном из них срезы четырех из пяти зародышевых корней 7-дневных растений пшеницы были погружены в питательный раствор, за счет чего вода могла свободно поступать через них в растение, во втором - срезы размещали над питательным раствором, и при этом поток воды шел лишь через один Рис. 3.2. Скорость роста первого листа растений пшеницы после удаления оставшийся корень (рис. 3.1).
четырех корней из пяти. Удаление Регистрация скорости роста листа корней в питательном растворе (А) и над поверхностью питательного растяжением при помощи датчика точных раствора (Б) положений (Фархутдинов и др., 2003) показала, что характер кривой роста зависел от способа удаления корней (рис. 3.2). В случае проникновения воды в растение по единственному корню рост листа очень быстро прекращался, и даже наступало его сжатие (рис. 3.2А).
Через полтора часа после удаления корней скорость роста листа стабилизировалась на уровне, более низком, чем у интактного растения. В Контроль Опыт варианте опыта, при котором вода беспрепятственно поступала в побег по * * разрезанным ксилемным сосудам в * местах удаления корней, напротив, происходило быстрое транзиторное почти двукратное повышение скорости 0 10 30 60 90 120 1роста листа, после которого она Время, мин возвращалась до исходной (рис. 3.2).
Рис. 3.3. Содержание воды в растущей части побега интактных растений пшеницы Известно, что рост растяжением связан (контроль) и растений с редуцированным с обеспеченностью растения водой: он корнем (опыт); * - достоверные различия между вариантами (t-test, P<0,01) зависит от поглощения воды клетками (Munns et al., 2000; Parent et al., 2009; Tardie et al., 2010). Следовательно, торможение роста листа указывает на то, что в случае поступления питательного раствора в побег по единственному оставшемуся корню у растения быстро развивается дефицит воды.
Измерение содержания воды подтвердило небольшое транзиторное снижение ее уровня в зоне роста листа в случае поступления воды лишь через один оставшийся корень (рис. 3.3). В том же случае, когда вода могла поступать через срезы корней, дефицита воды Д(-) не было обнаружено. Далее растения первого варианта будут обозначены как Д(+), а второго - Д(-).
Оба способа удаления четырех корней из пяти у растений пшеницы приводили к активации роста корневой системы за счет увеличения числа боковых корней и примордиев боковых корней на оставшемся главном корне растений (табл. 3.1).
Содержание воды, % Таблица 3.1. Длина главного корня, число боковых корней (БК), примордиев боковых корней (ПБК) через 1,5 суток, содержание ИУК в корне, скорость вытекания ИУК из побега в раствор с ЭДТА через 3 ч после редукции корневой системы у интактных растений (контроль), Д(-) и Д(+) - растений (n=50 для БК и ПБК и n=12 для ИУК) Скорость Длина Содержание Число БК на Число ПБК диффузии Варианты главного ИУК, нг/г корень на корень ИУК, корня, см сырой массы пг/растение/ч Контроль 18,41,3 5,01,1 21,81,8 12216 130Д(-)-растения 18,21,1 8,02,1 28,02,3 21423 230Д(+)-растения 18,90,7 12,91,9 32,01,9 34234 320По данным литературы известно, что с момента начала первых делений клеток перицикла на стадии формирования примордия и до его выхода на поверхность материнского корня проходит 36-57 часов (Van Staden, Harty, 1988; Площинская и др., 2002). Появление через 1,5 суток большего числа боковых корней на главном корне опытного растения по сравнению с контролем говорит в пользу активации роста уже сформированных примордиев. Поэтому можно говорить о том, что мы наблюдали активацию роста уже сформированных примордиев, которая сопровождалась активной закладкой новых.
Стимуляция роста боковых корней на главном единственном корне, оставшемся после удаления остальных, является естественной компенсаторной реакцией растений пшеницы на потерю части корневой системы (Jackson, 1993). При этом степень активации роста как боковых корней, так и закладки примордиев была выше у растений у Д(+) - растений по сравнению с Д(-) - растениями).
Поскольку роль ауксинов в закладке и формировании боковых корней активно обсуждается (Blakely et al., 1992; Reed et al., 1998; Fukaki, Tasaka, 2009;
Kiba et al., 2011), было изучено влияние данного воздействия на содержание ИУК в корнях растений. В наших экспериментах мы обнаружили значительное и быстрое повышение содержания ауксинов в главном корне, оставшемся после удаления четырех из пяти корней (табл. 3.1). Содержание ауксинов было выше в корнях Д(+) - растений, т.е. именно в тех корнях, где появилось больше боковых корней и сформировалось больше примордиев боковых корней (таб. 3.1).
Более высокие концентрации ауксина необходимы для формирования меристемы корня и для инициации деления компетентных клеток перицикла, из которых формируется примордий (Sabatini et al., 1999; Casson, Lindsey 2003).
Иммунное окрашивание срезов зоны образования боковых корней с помощью антител к ИУК показало повышенный уровень содержания ауксинов в клетках примордиев и центрального цилиндра (рис. 3.4.).
А Б 50 m 50 m Рис. 3.4. Иммуногисто-химические окрашивание примордиев боковых корней с помощью антител к ИУК (А). Б - окрашивание с использованием неиммунной сыворотки. 1 - примордии боковых корней. 2 - клетки коры Наши результаты соответствуют данным литературы о том, что именно в эти клетки может направляться поток ауксинов с помощью переносчиков (Benkova et al., 2003). Однако вопрос о роли ауксинов, поступающих из побега, в регуляции роста боковых корней остается спорным, поскольку есть данные о том, что ауксины могут синтезироваться в кончике корня (Bhalerao et al., 2002;
Иванов, 2011) и в самом формирующемся боковом корне (Laskowski et al., 1995). Вместе с тем есть данные о том, что ингибирование транспорта ауксинов из побега подавляет образование корней (Malamy, Ryan, 2001). В наших экспериментах удаление большей части корней приводило к тому, что первоначально весь поток гормона мог направляться в оставшийся корень.
Поэтому само удаление четырех корней из пяти могло быть причиной пассивного концентрирования ИУК в оставшемся корне. Вместе с тем, оценка транспорта ауксинов по количеству гормона, диффундирующего из срезанного побега в раствор, показала, что удаление части корней активировало поток ИУК из побега в корень, и эта активация в большей степени была выражена у растений с большим числом появившихся боковых корней и примордиев (табл.
3.1). Это указывает на то, что одной из причин увеличения содержания ауксинов в единственном оставшемся корне, могло быть увеличение оттока гормона из побега.
Таким образом, наши данные подтверждают положение о том, что формирование бокового корня из зрелого примордия связано с потоком ауксина из побега. Роль гидравлического сигнала (временное снижение содержания воды в растущей части побега) заключается в повышении притока и накопления ауксинов и стимуляции ветвления корней.
Компенсаторную стимуляцию ветвления корней под влиянием редукции корневой системы, направленную на восстановление поглощающей поверхности корня, наблюдали более чем через сутки после начала воздействия.
Важно было выяснить, как растения справлялись с поглощением воды в более ранние сроки. В этой связи большой интерес вызывают результаты экспериментов, в которых мы наблюдали более яркую ростовую реакцию за счет временного снижения содержания воды в побеге в ответ на редукцию корня. Поэтому далее в автореферате будут представлены результаты исследований только на одной модели (Д(+) - растения) - растениях с одним корнем, через который поступал весь поток воды.
Вслед за временным возрастанием дефицита воды в зоне роста листа содержание воды восстанавливалось до уровня контроля. Поэтому нам следовало выяснить, каким образом растения после потери практически 75% поглощающей поверхности корневой системы могли обеспечивать водный баланс. Известно, что при снижении способности корней поглощать воду водный баланс может поддерживаться за счет закрытия устьиц (Meinzer, 2002;
Cochard et al., 2002; Aroca et al., 2003). Однако, вопреки ожиданиям, ни скорость транспирации (рис. 3.5), ни устьичная проводимость (данные приведены в диссертации) существенно не снижались даже при высоких уровнях освещенности, обуславливающих транспирационный запрос, а при более высокой влажности воздуха оставались выше исходного уровня, по меньшей мере, в течение нескольких часов после воздействия. Можно предполагать, что в первые минуты после удаления корней проявляется влияние гидропассивных эффектов, индикатором которых является быстрое первоначальное снижение скорости удлинения листа (рис. 3.2). Но маловероятно, что подобный эффект может объяснить поддержание растением устьиц в открытом состоянии продолжительное время (несколько часов). Мы попытались проанализировать механизмы, предотвращающие закрытие устьиц у растений с редуцированной корневой системой.
3 ОСВ 35-45% 3,ОСВ 45- 50% ОСВ 55-60% ОСВ 60-65% А Б 2,2,1,1,0,0,0 20 40 60 80 100 120 10 20 40 60 80 100 120 1Время, мин Время, мин Рис. 3.5. Влияние удаления четырех корней из пяти (момент удаления показан стрелкой) на транспирацию семидневных растений пшеницы при освещенности 50-1мкмоль/м2 с (А) и 400-500 мкмоль/м2 с (Б) ФАР и разной влажности воздуха (ОСВ), n=(А) и 30 (Б) В течение первых трех часов после удаления корней мы наблюдали повышение содержания цитокининов в тканях побега (рис. 3.6).
Содержание АБК в побеге и ксилемном соке при этом не возрастало (данные приведены в диссертации).
Поскольку известно, что цитокинины способны поддерживать устьица в открытом состоянии (Davies et al., 2005;
Рис. 3.6. Динамика концентрации Dodd 2005), их высокая концентрация в производных зеатина (Z+ZR+ZN) в побегах интактных семидневных побеге растений с частично удаленными растений пшеницы и растений с корнями могла предотвращать закрытие удаленными четырьмя корнями из пяти, n=устьиц. Этому также могло Транспирация, ммоль/м с Транспирация, ммоль/м с способствовать отсутствие накопления АБК.
Представляло интерес выяснить, каким образом в побегах растений с удаленными корнями поддерживался высокий уровень цитокининов. Удаление большей части корней уже через час привело к пятикратному снижению концентрации цитокининов в пасоке (13312 и 296 нг/г в контроле и опыте соответственно), что хорошо согласуется с признанием корня в качестве основного продуцента цитокининов (Кулаева, 1962; Henson, Wareing, 1984;
Aloni et al., 2005). Расчет скорости доставки цитокининов из корней в побег также показал ее снижение (данные в диссертации). Восстановление и концентрации, и скорости доставки цитокининов до уровня интактных растений наблюдали через сутки, что можно объяснить появлением к этому времени большого количества боковых корней и их примордиев, где синтезируются цитокинины (Miyawaki et al., 2004). Вместе с тем, трудно было объяснить, каков источник быстрого накопления ЦК в побеге растений, у которых доставка гормона снижалась в 5 раз. В предыдущем разделе мы показали, что активность цитокининоксидазы может зависеть от многих факторов, в том числе и концентрации самих цитокининов. Если их избыточное поступление из корней и накопление в тканях побега трансгенных растений табака активировало 1разрушающий их Рис. 3.7. Относи-тельный фермент, то резкое уровень ЦКО 1транскриптов в побеге снижение доставки растений пшеницы через цитокининов могло 30 мин после удаления части корней. ОТ-ПЦР привести к снижению метод. Выравнивание активности ЦКО.
количества РНК в образцах, взятых в Это предположение реакцию, проводили подтвердили путем сравнения в них экспрессии гена ЦКО полученные нами тубулина. 1 - интактные растения, 2Ц растения с данные о снижении в тубулин удаленными четырьмя из побеге уровня как пяти корнями экспрессии гена (рис. 3.7), так и активности ЦКО по сравнению с интактными растениями через 30 мин после удаления части корней (таб. 3.2).
транскриптов, % от контроля Относительный уровень ЦКО Таблица 3.2. Активность in vitro ферментов, катализирующих деградацию цитокининов, выделенных из побегов интактных (контроль) и с одним главным корнем, оставшимся после удаления четырех первичных корней у семидневных растений пшеницы, n=Время после Активность фермента, удаления пмоль ИПА/мг белка/ч корней, мин Контроль Удаление корней 30 85241 60760 60023 524Очевидно, что это важный механизм (Horgan, 1992; Zazimalova et al., 1999), но, вероятно, не единственный, который мог бы способствовать накоплению цитокининов в побеге. В работе Ю.Штратниковой и О.Кулаевой (2008) было сформулировано предположение, что поступающие из корней цитокинины могут ингибировать экспрессию генов изопентенилтрансфераз в побеге. Это позволяет объяснить высокое содержание цитокининов в побеге растений с редуцированной корневой системой уменьшением автоингибирования синтеза цитокининов в побегах при снижении их притока из корней.
Таким образом, высокий уровень цитокининов в листьях растений мог поддерживать устьица открытыми. Но сам по себе этот механизм не мог обеспечить сохранение высокого уровня оводненности растений, потерявших большую часть корней. Единственным объяснением наблюдаемому эффекту могло быть то, что оставшийся единственный корень каким-то образом был способен проводить необходимое для побега количество воды. Измерение общей гидравлической проводимости показало, что она быстро повышается (в течение пяти мин) после удаления четырех корней из пяти на фоне градиента гидростатического давления (табл. 3.3).
Таблица 3.3. Влияние удаления четырех корней из пяти на общую и осмотическую гидравлическую проводимость оставшегося корня семидневных растений пшеницы. В таблице представлены средние значения и ошибки средних, * - достоверное равзличие между показателями интактного растения и растения с одним оставшимся корнем, ttest, P=0.Время после удаления Общая гидравлическая Осмотическая корней, мин проводимость, гидравлическая мг/(гчMПa) проводимость, мг/(гчMПa) 0 626125 38715 54181137* 267190 140803238* 1785446* Поскольку при этом осмотическая проводимость, зависящая от проницаемости мембран (Жесткова и др., 2009), не менялась, повышение способности единственного корня проводить воду могло осуществляться за счет увеличения потока по апопластному пути. Хотя это явление еще во многом остается загадочным, мы предполагаем, что оно могло быть связано с разбавлением апопластного раствора (данные приводятся в диссертации) и изменением его рН, которое было 6,9 и 7,3 у интактных и с редуцированным корнем растений соответственно. По данным Н.Мейчик и И.Ермакова, возрастание рН и разбавление раствора приводит к увеличению объема фракции клеточных стенок (Meychik, Yermakov, 1999). In vivo набухание клеточной стенки должно увеличить объем апопласта, что может привести к возрастанию способности тканей проводить воду при радиальном транспорте (от поверхности корня к сосудам), который характеризуется наибольшим сопротивлением в корне (Ионенко, Анисимов, 2008; Peterson et al, 1993).
Измерения, проведенные через 1,5 часа после удаления корней, дали совершенно иной результат. В конце эксперимента гидравлическая проводимость оставшегося корня в отсутствие гидростатического градиента была выше, чем у интактного растения (табл. 3.3), что свидетельствует о возрастании проницаемости клеточных мембран для воды (вероятно, благодаря повышению активности аквапоринов).
Важно было оценить уровень АБК в корнях, поскольку известна способность этого гормона повышать гидравлическую проводимость (Maurel et al., 2008; Parent et al., 2009). Мы обнаружили накопление АБК в тканях корня (рис. 3.8).
Рис. 3.8. Динамика концентрации АБК Наиболее простое объяснение в корнях интактных семидневных растений пшеницы и растений с этому может состоять в том, что удаленными четырьмя корнями из пяти, n=9 транспортируемый из побега гормон после воздействия поступает в корень, уменьшенный по объему примерно в раза. Однако измерение количества гормона, диффундирующего из срезанного побега, показало, что поток АБК из побега возрастал в четыре раза (7834 у интактных и 30845 пг/растение час у растений с одним корнем). Все это свидетельствует в пользу того, что накопление АБК в корнях было не просто следствием уменьшения корневой системы, а результатом активных процессов, регулирующих отток АБК из побега в корень Ранее было показано, что АБК влияет на уровень экспрессии и активность водных каналов путем их фосфорилирования и повышения экспрессии генов аквапоринов (Johansson et al, 1998; Schaffner, 1998; Tardieu et al., 2010), поэтому логично было предположить, что в наших экспериментах накопление ее в корне могло иметь важное физиологическое значение для растения - повлиять на активность аквапоринов и увеличить гидравлическую проводимость корня.
В опытах с удалением корней также прослеживается роль трофических сигналов. Уже через 20 мин после удаления корней (период максимальной активации скорости транспирации) в оставшемся корне повышалась концентрация содержащихся в питательном растворе ионов (данные приведены в диссертации). Известно, что нитраты выполняют сигнальную функцию (Forde, Clarkson, 1999; Crawford, 1995; Kiba et al., 2011). В наших экспериментах показано, что уже через 20 мин концентрация нитрат-ионов в оставшемся корне увеличилась на 12% по сравнению с интактным растением, через 60 мин - на 21%, а через 120 мин - на 25%. Предполагается, что цитокинины могут участвовать в нитратном сигналинге. Были получены доказательства того, что один из генов семейства изопентенилтрансфераз (AtIPT3) индуцируется нитратионом (Miyawaki et al., 2004). Эти факты позволяют нам предположить, что нитрат-ионы, которые накапливались в оставшемся корне, могли стимулировать накопление в нем цитокининов. Еще больший интерес вызывает влияние нитратов на рост корней (Drew, Saker, 1975; Forde, 2002). В отдельных работах показано, что механизмы регуляции роста корней локальным нитратом связаны с регуляцией содержания в них ауксинов (Guo et al, 2005; Walch-Liu et al., 2006;
Иванов, 2009).
Таким образом, удаление части корней вызвало сложную ответную реакцию, контролируемую сочетанием трофических, гидравлических и гормональных сигналов, направленную на поддержание способности растений поглощать воду. Эти эксперименты показывают, что даже при значительной редукции корневой системы главный корень молодых растений пшеницы, способен проводить необходимое количество воды для поддержания водного баланса при транспирационных затратах на уровне и даже несколько выше интактных растений.
4. Роль трофических, гидравлических и гормональных сигналов в регуляции ответа растений пшеницы на дефицит минерального питания Известно, что дефицит воды и элементов минерального питания сопровождается ингибированием роста побега и относительной активацией роста корней, что повышает их поглотительную способность (Kuiper et al., 1988; Green et al., 1994; Frensch, 1997; Рахманкулова и др., 2001; Laffite et al., 2007; Bogeat-Triboulot et al., 2007). Предполагается, что эта ростовая реакция связана с накоплением АБК и снижением содержания цитокининов (Chapin, 1990; Sharp, LeNoble, 2002; Werner, 2010). Эта точка зрения основана на том, что цитокинины необходимы для роста побега, но в высокой концентрации тормозят рост корней (Cary et al., 1995; Werner, 2001), в то время как АБК в большей степени подавляет рост побега, чем корней, и может даже поддерживать их рост в стрессовых условиях (Yamagucki, Sharp, 2010).
Использование трансгенных растений с пониженным содержанием цитокининов (Werner et al., 2010) и дефицитных по АБК мутантных растений (Sharp, LeNoble, 2002) подтвердило участие этих гормонов в ростовой реакции растений на дефицит воды. Однако дефициту ионов уделялось меньше внимания. Поэтому мы включили в наши задачи, наряду с анализом динамики показателей роста и транспорта ионов, дать оценку содержания гормонов при дефиците элементов минерального питания в питательном растворе.
В предварительных экспериментах нами была подобрана концентрация питательного раствора (10%-ный раствор Хогланда-Арнона), которая обеспечивала максимальное накопление сырой массы 7-дневных проростков пшеницы (Кудоярова и др., 1993). Сходство в ростовой реакции растений на дефицит ионов и воды указывает на возможную роль в ней гидравлических сигналов. Эту гипотезу подтверждали ряд опытов, где было показано снижение устьичной проводимости при дефиците ионов, предположительно, в результате снижения гидравлической проводимости (Carvajal et al., 1996; Wilkinson et al., 2007). Поэтому особое внимание в этих опытах мы уделяли влиянию дефицита элементов минерального питания на показатели водного обмена.
Пониженное содержание ионов в питательном растворе приводило к достоверному ингибированию накопления сырой массы побега, которое проявлялось к концу вторых суток (1% Х-А - 202 мг, 10% Х-А - 225 мг), в то время как масса корня оставалась на уровне контрольных растений (1% Х-А - 131, 10% Х-А - 132 мг, табл. 4.4). Снижение скорости роста побега, в то время как рост корня поддерживался на уровне контроля, приводило к снижению соотношения массы побег/корень.
Таблица 4.1. Транспирация и устьичная проводимость через двое суток после разбавления питательного раствора Х-А от 10 до 1% (n = 10) Транспирация, Устьичная проводимость, Питательный раствор моль м-2с-1 ммоль м-2с-10 % Х-A 2,51 861 % Х-A 2,3 1 95В наших экспериментах разбавление питательного раствора не снижало устьичную проводимость и транспирацию, по меньшей мере, в течение первых двух суток наблюдения (табл. 4.1). ОСВ в листьях также держалось на уровне контроля (данные в диссертации). Осмотический поток воды через мембраны (V) снижался при дефиците питания за счет падения осмотического давления ксилемного сока (-x) (табл. 4.2).
Таблица 4.2. Осмотическое давление питательной среды (-o), ксилемного сока (-x), скорость потока ксилемного сока (V) и осмотическая гидравлическая проводимость корня (Lр) растений пшеницы через 2 суток после разбавления питательного раствора Х-А с 10 до 1 % (t - время после разбавления) (n = 9) раствор V, Lp, t, ч -x, МПа -o, МПа Х-А, % г/ч растение г/ч/МПа/растение 10 0,0900,003 0,030 0.002 0,013 0.002 0,2150,01 0,0300.002 0,010 0.001 0,006 0.002 0,3200,010 0,1100,002 0,030 0.002 0,010 0.002 0,1200,01 0,0700,003 0,010 0.001 0,005 0.002 0,0750,При этом проницаемость мембран для воды уменьшалась лишь на вторые сутки, что могло быть следствием выращивания растений в гидропонической культуре. Снижение гидравлической проводимости (Lp) (табл. 2) сопровождалось уменьшением оводненности зоны роста листа (88,90,3% и 86,80,4% содержание H2O в контроле и опыте соответственно, n=9) и могло способствовать торможению его удлинения. Однако эти изменения происходили недостаточно быстро для того, чтобы быть причиной обнаруженного в наших опытах опережающего снижения скорости роста побега (табл. 4.4).
Хотя данное воздействие не вызывало закрытия устьиц и уменьшения оводненности дифференцированной части листа, оно приводило к снижению уровня ассимиляции углекислого газа (рис.4.1).
По данным литературы, 1% Х-А 10% Х-А уменьшение концентрации азота в питательной среде могло повлиять на активность ферментов фотосинтеза, поскольку азот входит в состав и белков, и пигментов фотосинтезирующего 24 ч 48 ч аппарата (Paul, Driscoll, 1997; Reich et al., Рис. 4.1. Скорость ассимиляции 1995; Niinemets, Tenhumen, 1997; Reich углекислого газа растений пшеницы через 1 и 2 суток после разбавления et al., 1997; Garnier et al., 1999; Forde, питательного раствора Хогланда2002). Измерения показали, что уже Арнона с 10 до 1% (n = 20) через 3,5 ч концентрация нитрат-ионов была в два раза ниже у растений, которые росли на разбавленном питательном растворе (табл. 4.3).
Таблица 4.3 Концентрация нитрат- сульфат- и хлорид-ионов (мМ) в ксилемном экссудате растений пшеницы при разбавлении питательного раствора Х-А с 10 до 1% (дефицит питания) (n=9) Время, ч 3,5 Ионы NO3 SO42 Cl NO3 SO42 Cl 10% Х-А 6,80,3 1,10,1 0,80,1 7,30,3 1,20,2 0,80,1% Х-А 3,20,3 1,00,2 0,70,1 1,60,2 0,70,1 0,50,Однако достоверного снижения уровня азота в растущей части листа не было выявлено, очевидно, за счет его больших запасов в листе (контроль - 8,00,2 и дефицит - 7,60,2% от сухой массы, n=5. В наших экспериментах отсутствие прямой зависимости снижения скорости фотосинтеза (рис. 4.1) и накопления массы растений (табл. 4.4) от содержания воды или азота в листе, которые достоверно не изменялись, указывает на возможную роль гормонов в регуляции этих процессов при дефиците ионов.
мкмоль/м * с Скорость ассимиляции СО, Мы не обнаружили накопления АБК в корнях, а в ксилемном экссудате при дефиците ионов возрастала только концентрация связанной формы АБК (в контроле 648 нМ, а у растений, росших на разбавленном растворе, - 136нМ). При этом в побеге содержание свободного гормона повышалось в несколько раз уже через сутки (табл. 4.6). Таким образом, поведение устьиц связано с концентрацией свободной АБК в апопласте, а не с ее общим содержанием в листе, что соответствует некоторым сведениям (Zhang, Davies, 1989; Dodd, 2005; Jiang, Harting, 2008).
Судя по данным литературы о влиянии АБК непосредственно на фотосинтез (Rook et al., 2006), накопление хлоропластных белков (Kusnetsov et al., 1994) и экспрессию кодирующих их генов (Zubo et al., 2008), повышение уровня АБК в побеге растений пшеницы могло быть причиной обнаруженного нами снижения уровня фотосинтеза, не зависящего от устьичной проводимости.
Кроме того, предполагается участие АБК в регуляции распределения фотоассимилятов между побегом и корнем (Киселова, Каминская, 2002; Yang et al., 2002). Добавление в разбавленную питательную среду ингибитора синтеза АБК флуридона приводило к восстановлению соотношения масс побег/корень до уровня растений с оптимальной питательной среды (табл. 4.4), что подтверждает необходимость этого гормона для относительной активации роста корней при дефиците питания.
Таблица 4.4. Сырая масса побегов и корней, их соотношение у растений пшеницы через два дня после разбавления питательного раствора с 10%-го до 1%-го Х-А и добавления флуридона в 1%-ный раствор Х-А 1% Х-А + Обработка 10% Х-А 1% Х-А флуридон Масса побега, мг 2255 2026* 1937* Масса корня, мг 1325 1316 111Побег/корень 1,7 1,5* 1,Многие воспринимают АБК только как ингибитор роста, но данные на этот счет неоднозначны. Так, предполагают, что этот гормон поддерживает рост корней при дефиците воды путем подавления продукции этилена (Sharp, LeNoble, 2002). Хотя мы не обнаружили общего накопления АБК в корнях растений при дефиците минерального питания, возрастал ее приток из побега (от 26029 до 44035 пг/(растение*ч), n=9) и содержание АБК в растущем кончике корня длиной 3-4 мм (263 и 404 нг/г сырой массы в контроле и опыте соответственно, n=9). Эти результаты подтверждают значение АБК в поддержании роста корней при дефиците ионов. Что же могло послужить сигналом для накопления АБК в побеге и ее ретранслокации по флоэме из побега в корень? Свой вклад могло вносить повышение притока из корней связанной формы АБК, из которой гормон высвобождается в результате гидролиза. Также известно, что накопление АБК может происходить при падении тургора клеток (Zeevaart, Creelman 1988; Pierce, Raschke, 1980; Verslues, Bray, 2006). Расчет этого показателя (формула для расчета приводится в диссертации) в наших экспериментах показал снижение тургора клеток листа за счет уменьшения уровня осмотиков (табл. 4.5).
Таблица 4.5. Показатели водных отношений (МПа) листьев и корней растений пшеницы, которые постоянно росли на 10% растворе Х-А и через сутки после переноса на 1% Х-А. Отбор проб осуществлялся одновременно. n=5, *- статистически достоверно отличающиеся от контроля значения (t-тест, p<0,05) Концентрация Водный Осмотический Осмотический Тургор листа Х-А потенциал листа потенциал листа потенциал корня 10% Х-А -0,650,04 -1,240,06 0,590,03 -0,460,1% Х-А -0,610,05 -1,050,05 0,440,03* -0,420,Таким образом, сигнал, осуществивший запуск накопления АБК при дефиците ионов, мог генерироваться в побеге как следствие дефицита ионов и фотоассимилятов (трофический сигналинг).
При разбавлении раствора мы не обнаружили существенного изменения концентрации цитокининов в ксилемном экссудате (табл. 4.6). Приток цитокининов из корней также оставался неизменным, т.к. не изменялась транспирация при данном воздействии. Эти результаты согласуются с данными экспериментов, которые показывают отсутствие корреляции между доставкой цитокининов из корней и ростовым ответом растений при дефиците азота (Dodd et al., 2006). Несмотря на неизменный уровень доставки цитокининов, их концентрация в побегах и корнях уменьшалась примерно вдвое (табл. 4.6).
Таблица 4.6. Содержание гормонов (нг/г сырой массы) в побегах и корнях, а также в ксилемном соке (нг/г ксилемного экссудата) растений пшеницы на 10%-ном растворе Х-А и через день после переноса на 10%-ный раствор Х-А, содержащий АБК (конечная концентрация 3 мг/л), 1%-ный раствор Х-А и 1%-ный раствор Х-А с флуридоном (конечная концентрация 5 мг/л). Достоверно отличающиеся значения обозначены разными буквами, t-тест, P0,ЦК (Z+ZR+ZN) АБК Обработка Ксилемный Ксилемный Побег Корень Побег Корень экссудат экссудат 10 % Х-А 868 a 395 a 525 a 204 a 142 b 889 b 10 % Х-А +АБК 608 b 263 b 483 a 628 b 479 c 1308 c 1 % Х-А 557 b 194 b 506 a 517 b 111 ab 10011 b 1 % Х-А 748 ab 304 ab 544 a 306 a 81 a 596 a +флуридон Как и в случае PRD-растений, дефицит питания мог привести к изменению метаболизма цитокининов в самом побеге. Особый интерес представляет изучение цитокининоксидазы. Ее активность увеличивалась в побегах при различных внешних стрессовых воздействиях (например, при охлаждении корней, Veselova et al., 2005). В наших экспериментах активность этого фермента также возрастала, что могло быть причиной снижения содержания цитокининов (19023 и 43049 нг ИПА/ч/мг белка в контроле и при разбавлении питательного раствора, t-тест, P0,95).
Одновременное накопление АБК и снижение уровня цитокининов, которое было обнаружено в наших опытах, является характерной особенностью стрессовой реакции растений (Dodd, 2005; Davies et al., 2005). Была сформулирована гипотеза о существовании между этими эффектами причинноследственной связи. Так, было показано повышение экспрессии гена ЦКО как под влиянием АБК, так и засухи (Brugiere et al., 2003). На этом основании предполагалось, что именно накопление АБК при засухе может активировать цитокининоксидазу. Однако эта гипотеза не была проверена экспериментально.
Поэтому в нашу задачу входило определение уровня активности ЦКО у растений, обработанных АБК и ингибитором ее синтеза. Флуридон действительно способствовал предотвращению накопления АБК (табл. 4.6), повышению уровня активности ЦКО (рис. 4.2), а также - повышению уровня цитокининов в растении при дефиците минерального питания (табл. 4.6).
6c Рис. 4.2. Активность цитокинин500 c оксидазы в побегах растений b 400 пшеницы на 10%-ном Х-А и через сутки после переноса на 10%-ный 3Х-А, содержащий АБК (конечная a концентрация 3 мг/л); 1%-ный Х-А 2и 1%-ный Х-А, содержащий флуридон (конечная концентрация 15 мг/л). Достоверно отличающиеся значения обозначены разными 10% Х-А 1% Х-А 10% Х-А 1% Х-А буквами, t-тест, P0,+АБК +флуридон Добавление АБК в 10%-ный питательный раствор Х-А приводило к активации цитокининоксидазы так же, как и десятикратное разбавление самого питательного раствора (рис. 4.2), что совпадало со снижением содержания цитокининов в побегах (табл. 4.6).
Опыты с флуридоном подтвердили, что абсцизовая кислота, накапливающаяся в побеге при разбавлении 10%-го питательного раствора Х-А до 1%-го, может индуцировать разрушение цитокининов через активацию цитокининоксидазы. Они также подтвердили значимость изменений как содержания АБК, так и цитокининов в регуляции соотношения побега и корня при дефиците питания.
Заключение Проделанная работа выявила сложную картину разнообразных сочетаний сигналов и соответствующих ответных реакций при воздействии на корни.
Очевидно, это разнообразие отражает пластичность растительного организма и обеспечивает адекватное приспособление к изменяющимся условиям внешней среды. В работе было показано, что взаимосвязанное сочетание, как минимум, сигналинга АБК, ИУК и цитокининов обеспечивает такой важный для адаптации процесс, как координация роста побега и корня. При воздействиях на корень изменение уровня гормонов в побегах является результатом как изменения их притока из корней (корневой гормональный сигнал), так и изменения метаболизма in situ, которое инициируется поступающими из корней * нг ИПА/ч мг белка сигналами. Так, снижение притока ионов из корней при дефиците питания приводит к снижению тургора клеток и тем самым индуцирует синтез АБК в побеге, которая, в свою очередь, снижает уровень цитокининов через активацию ЦКО. Резкое снижение концентрации ЦК в ксилемном соке при удалении корней приводит к падению активности и снижению уровня экспрессии гена ЦКО. Результирующее разнообразие гормональных ответов на корневые воздействия обеспечивает разнообразие таких ответных реакций, как (1) открытие устьиц за счет повышения притока цитокининов из корней при локальной индукции их синтеза в корнях и их последующее компенсаторное закрытие в результате падения водного потенциала и накопления АБК в самом листе; (2) закрытие устьиц при локальном подсыхании почвы под влиянием увеличения концентрации АБК в ксилемном соке и снижения уровня цитокининов; (3) поддержание устьиц в открытом состоянии при дефиците элементом минерального питания и редукции корневой системы благодаря отсутствию накопления АБК в ксилемном соке и сохранению высокого уровня цитокининов при редукции корневой системы. Передача сигналов из корня в побег и обратно в корень обеспечивает согласованность изменений устьичной и гидравлической проводимости. Выявлена поразительная пластичность корневой системы растений пшеницы. Так, поток АБК из побега повышает гидравлическую проводимость, что обеспечивает достаточный приток воды из редуцированной корневой системы и поддерживает водный баланс без закрытия устьиц. При этом поток ауксинов из побега обеспечивает компенсаторное увеличение поглотительной способности корней за счет активации их ветвления. Роль гидравлических сигналов при этом проявляется в активации потока ауксинов и АБК в корни.
Таким образом, сочетание и взаимодействие гормональных, гидравлических и трофических сигналов, передаваемых из корня в побег и обратно, запускает множество реакций, обеспечивающих координацию процессов на уровне целого организма, разнообразие ответов на внешние воздействия и адекватное к ним приспособление.
Выводы 1. Снижение концентрации цитокининов в листе при локальном подсыхании почвы происходит за счет уменьшения их притока из корней и метаболических превращений этих гормонов в побеге. Сигналом, вызывающим изменение метаболизма цитокининов в побеге, может служить как увеличение уровня АБК в ксилемном соке, так и снижение водного потенциала.
2. С использованием ipt-трансгенных растений табака получены экспериментальные доказательства системной роли продуцируемых в корнях цитокининов в регуляции водного обмена растений. Так, локальная экспрессия гена изопентенилтрансферазы в корнях приводит к увеличению концентрации цитокининов не только в корнях, но и ксилемном соке, и листьях растений, что сопровождается увеличением устьичной проводимости и усилением транспирации.
3. Повышение содержания цитокининов в листьях трансгенных растений табака и связанное с ним увеличение транспирационных потерь приводит к падению относительного содержания воды (гидравлический сигнал) и накоплению АБК. Увеличение уровня АБК под влиянием гидравлического сигнала в свою очередь приводит к компенсаторному падению устьичной проводимости. Важную роль в регуляции закрытия устьиц и восстановлении оводненности листьев играет также понижение концентрации цитокининов в листьях вследствие активации цитокининоксидазы.
4. Редукция корневой системы проростков пшеницы - удаление четырех из пяти зародышевых корней - не приводит к снижению потока воды в побег.
Данный эффект достигается за счет повышения гидравлической проводимости оставшегося корня и поддержания устьичной проводимости листьев, а также компенсаторной активации ветвления оставшегося корня, связанных с перестройками в гормональной системе растений:
(а) возрастание гидравлической проводимости единственного оставшегося корня обусловлено накоплением АБК за счет ее притока из побега;
(б) поддержание устьичной проводимости листьев растений с редуцированной корневой системой на уровне интактных растений связано с поддержанием высокого содержания цитокининов в листьях вследствие снижения уровня транскриптов гена цитокининоксидазы и активности этого фермента;
(в) активация ветвления оставшегося корня обусловлена резким возрастанием притока в него ауксинов. О важной роли ауксинов в регуляции этого процесса свидетельствуют данные об их локализации в примордиях боковых корней. Роль гидравлических сигналов (временное снижение содержания воды в зоне роста листа) проявляется в подавлении роста побега, дополнительном усилении притока ауксинов в корень и, соответственно, стимуляции его ветвления.
5. При дефиците минерального питания выявлен приоритет гормональных сигналов в регуляции соотношения масс корень/побег у растений пшеницы:
снижение уровня цитокининов в корнях и побегах, накопление АБК в побеге, увеличение концентрации конъюгированной АБК в ксилемном соке и притока ее свободной формы в корень.
6. В условиях дефицита минерального питания выявлена роль трофических сигналов, проявляющаяся в снижении концентрации осмотически активных веществ, что приводит к снижению тургора клеток, накоплению АБК в листе и усилению ее транспорта из побега в зону роста корней.
7. С использованием ингибиторного анализа обнаружено, что повышение соотношения масс корень/побег и снижение содержания цитокининов в растениях пшеницы за счет активации цитокининоксидазы при дефиците минерального питания связано с накоплением АБК.
Список работ по теме диссертации Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р. Ауксин-индуцированное накопление АБК и цитокининов в проростках пшеницы // Агрохимия. - 1998. - № 2. - С. 71-74.
2. Vysotskaya L.B., Timergalina L.N., Simonyan M.V., Veselov S.Yu., Kudoyarova G.R. Growth rate, IAA and cytokinin content of wheat seedlings after root pruning // Plant Growth Regulation. - 2001. - V.33. - № 1. - P. 51-57.
3. Черкозьянова А.В., Высоцкая Л.Б., Кудоярова Г.Р. Влияние минерального питания на скорость роста и водный обмен молодых растений пшеницы // Агрохимия. - 2003. - № 7. - С.14-17.
4. Vysotskaya L.B., Arkhipova T.N., Timergalina L.N., Kudoyarova G.R. Effect of partial root excision on shoot water relations, IAA content and leaf extension in wheat seedlings // J. Plant Physiol. - 2003. - V. 160. - P. 1011-1015.
5. Vysotskaya L.B., Kudoyarova G.R., Veselov S., Jones H.G. Unusual stomatal behaviour on partial root excision in wheat seedlings // Plant Cell Environment. - 2004. - V. 27. - P. 69-77.
6. Vysotskaya L.B., Arkhipova T.N., Timergallina L.N., Dedov A.V., Veselov S.U., Kudoyarova G.R. Effect of partial root excision on transpiration, root hydraulic coductance and leaf growth in wheat seedlings // Plant Physiology and Biochemistry. - 2004. - V. 42. - P. 251-255.
7. Черкозьянова А.В., Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция соотношения массы побег/корень не связана с водным обменом при дефиците минерального питания у растений пшеницы // Физиология растений. - 2005. - №5. - С.
708-714.
8. Высоцкая Л.Б. Механизмы координации ростового ответа проростков пшеницы при нарушении соотношения побег/корень // Физиология растений. - 2005. - № 5. - С. 763768.
9. Высоцкая Л.Б., Тимергалина Л.Н., Веселов С.Ю., Кудоярова Р.Г. Влияние азотсодержащих солей на содержание цитокининов в изолированных листьях пшеницы // Физиология растений. - 2007. - № 2. - С. 217-222.
10. Высоцкая Л.Б., Черкозьянова А.В., Веселов С.Ю., Кудоярова Р.Г. Роль ауксинов и цитокининов в формировании боковых корней у растений пшеницы с частично удаленными первичными корнями // Физиология растений. - 2007. - № 3. - С. 455-460.
11. Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Веселов Д.С., Филиппенко В.Н., Иванов Е.А., Иванов И.И., Кудоярова Г.Р. Иммуногистохимическая локализация и количественное определение ИУК при исследованиях регуляции роста корней // Физиология растений. - 2007. - № 6. - С.
926-931.
12. Kudoyarova G.R., Vysotskaya L.B., Cherkozyanova A., Dodd I.C. Effect of partial rootzone drying on the concentration of zeatin-type cytokinins in tomato (Solanum lycopersicum L.) xylem sap and leaves // J. Exp. Bot. - 2007. - V. 58. - P. 161-168.
13. Vysotskaya Lidiya B., Korobova Alla V., Kudoyarova Guzel R. Abscisic acid accumulation in the roots of nutrient-limited plants: its impact on the differential growth of roots and shoots. J.
Plant Physiology. - 2008. - V. 165. - P. 1274-1279.
14. Vysotskaya L.B., Korobova A.V., Veselov S.Y., Dodd I.C., Kudoyarova G.R. ABA mediation of shoot cytokinin oxidase activity: assessing its impacts on cytokinin status and biomass allocation of nutrient deprived durum wheat // Functional Plant Biology. - 2009. - V. 36. - P.
66Ц72.
15. Высоцкая Л. Б., Авальбаев А. М., Юлдашев Р. А., Шакирова Ф. М., Веселов С. Ю., Кудоярова Г. Р. Регуляция активности цитокининоксидазы как фактора, определяющего содержание цитокининов // Физиология растений. - 2010. - 57, № 4. - С. 530-537.
16. Vysotskaya Lydia B., Veselov Stanislav Yu., and Kudoyarova Guzel R. Effect on shoot water relations, and cytokinin and abscisic acid levels of inducing expression of a gene coding for isopentenyltransferase in roots of transgenic tobacco plants // J. Exp. Bot. - 2010. - V. 61. - P.
3709-3717.
17. Дедова М.А., Высоцкая Л.Б., Иванов И.И., Кудоярова Г.Р. Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у ipt-трансгенных и нетрансформированных растений табака // Известия Самарского научного центра РАН. - 2011. - Т.13, № 5(3). - С. 136-139.
Монографии и главы в монографиях 1. Веселов Д.С., Веселов С.Ю., Высоцкая Л.Б., Кудоярова Г.Р., Фархутдинов Р.Г. Гормоны растений. Регуляция концентрации, связь с ростом и водным обменом. Москва: Наука. - 2007. - 160 с.
Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях 1. Vysotskaya L & Kudoyarova G. Auxin induced changes in ABA and cytokinin concentration in wheat seedlings // In: Box JE, Jr (ed) Root Demographics and Their Efficiencies in Sustainable Agriculture, Grasslands and Forest Ecosystems / Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. - 1998. - P. 631-635.
2. Kudoyarova G, Dedov A.,Veselov D., Symonyan M., Mustafina A.,М Vysotskaya L., Veselov S.
Fast shoot responses to root treatment. Are hormones involved? // Recent Advances of Plant Root Structure and Function / Eds. Gasparikova O., Ciamporova., Mistrik I., Baluska F.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. - 2001. - P. 135-141.
3. Черкозьянова А.В., Высоцкая Л.Б., Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю. Влияние дефицита минерального питания на рост, транспирацию и поглощение воды у проростков пшеницы // Итоги биологических исследований / Под ред. И.Ю.Усманова и др. - 2003. - С. 197-200.
4. Тимергалина Л.Н., Высоцкая Л.Б., Кудоярова Г.Р., Симонян М.В., Веселов С.Ю.
Регуляция концентрации гормонов в проростках пшеницы при частичном удалении корней // Материалы III конференции Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии- Уфа, 3-6 октября, 2000. - С.78-84.
5. Высоцкая Л.Б., Тимергалина Л.Н., Архипова Т.Н., Дедов А.В., Кудоярова Г.Р. Гормоны и показатели водного обмена у растений пшеницы с частично удаленными корнями // Материалы III конференции Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. - Уфа, 3-6 октября, 2000. - С.88-93.
6. Л.Б. Высоцкая. Роль гормональных сигналов в регуляции роста побега и корня при дефиците ионов в питательном растворе. // Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Материалы докладов Международной конференции (в трех частях). - Сыктывкар, 2007. - Часть 1. - С. 263-264.
7. Высоцкая Л. Б., Дедова М.А., Кудоярова Г.Р. IPT-трансгенные растения табака как объект для исследований роли цитокининов в передаче сигналов из корня. // Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Материалы докладов Международной конференции (в трех частях). - Сыктывкар, 2007. - Часть 3. С. 230-232.
8. Высоцкая Л.Б., Коробова А.В., Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция соотношения массы побега и корня как важного адаптивного признака растений при дефиците минерального питания. // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды. Материалы Всероссийской конференции. - Иркутск, 2009. - С.81-84.
9. Высоцкая Л.Б. Содержание цитокининов в побегах в ответ на локальное воздействие на корень. Участвуют ли цитокинины в передаче сигнала из корня в побег? // Материалы конференции II-ой международной конференции. Регуляция роста и развития растений:
физиолого-биохимические и генетические аспекты, Харьков,11-13 октября 2011. - Харьков. - С. 19-20.
Список сокращений АБК - абсцизовая кислота; Х-А - раствор Хогланда-Арнона;
ИПА - изопентениладенозин; ЦК - цитокинины;
ИУК - индолилуксусная кислота; ЦКО - цитокининоксидаза;
ОСВ - относительное содержание воды; Z - зеатин; ZN - зеатиннуклеотид; ZR - зеатинрибозид
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии