Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ФИРСОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ПРОТИВОДИФТЕРИЙНЫЕ АНТИТОКСИЧЕСКИЕ И

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ КРОВИ

ЮДЕЙ

03.02.03 - микробиология

03.01.06 Ч биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Шмелева Елена Александровна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Волкова Рауза Асхатовна

доктор биологических наук, начальник лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний Испытательного центра экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов Федерального государственного бюджетного учреждения Научный центр экспертизы средств медицинского применения Министерства здравоохранения Российской Федерации

Шемякин Игорь Георгиевич

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией молекулярной биологии Федерального бюджетного научного учреждения Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение  Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской Академии Медицинских Наук (г. Москва)

Защита состоится  л ___  ___________ 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Автореферат разослан  л___  _____________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время благодаря широкому охвату населения профилактическими прививками как в России, так и в других странах мира, регистрируются спорадические случаи заболевания дифтерией (Маркина С.С., Максимова Н.М., ВОЗ, 2011). Для сохранения эпидемиологического благополучия требуется не только соблюдение правил и схем национальных календарей профилактических прививок, но и постоянный мониторинг за состоянием коллективного противодифтерийного иммунитета (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011).

Напряженность антитоксического иммунитета в Российской Федерации определяют с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011). В мировой практике для определения поствакцинальных антитоксических антител в сыворотках крови людей используются иммуноферментные тест-системы и реакция нейтрализации в культуре клеток Vero (Miyamura K., 1974). При этом результаты определения  содержания антитоксина в крови выражают в международных единицах МЕ/мл (Di Giovine P., Pinto A., 2009).

Вместе с тем антитоксический иммунитет защищает от заболевания дифтерией, но не препятствует свободной циркуляции возбудителя C. diphtheriae tox+ в иммунных коллективах, что обуславливает скрытое течение эпидемиологического процесса (Сухорукова Н.Л., Фаворова Л.А., 1979). Следовательно, антитоксический иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются противодифтерийные антибактериальные антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с коринебактериями дифтерии. В этой связи очевидна необходимость изучения не только антитоксических, но и антибактериальных противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиагностических методов (Шмелева Е.А., 1991).

Цель исследования

Выявить и определить количественное содержание противодифтерийных АТ IgG и АБ IgG, IgM, IgA антител в сыворотках крови различных групп людей с помощью иммуноферментных тест-систем.

Задачи исследования

1. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения АТ IgG в сыворотках крови людей;
2. Создать иммуноферментную тест-систему для определения АБ IgG, IgM, IgA в абсолютных единицах в сыворотках крови людей;
3. С помощью разработанной тест-системы на основе ИФА определить содержание АТ IgG в сыворотках крови взрослых людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и ряде стран Европы;
4. С помощью биометрического анализа охарактеризовать напряженность АТ противодифтерийного иммунитета в исследованных популяциях людей;
5. Используя разработанные тест-системы выявить содержание АБ антител изотипов G, M, A в сыворотках крови людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и других странах Европы;
6. С помощью биометрического анализа показать напряженность АБ противодифтерийного иммунитета в популяциях взрослых людей из Российской Федерации и ряда стран Европы.

Научная новизна

Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе ИФА для выявления противодифтерийных АТ IgG и IgG, IgM, IgA антител к бактериальным антигенам коринебактерий дифтерии в абсолютных единицах.

Показано, что во всех изученных сыворотках крови взрослых людей содержатся противодифтерийные АТ IgG антитела в концентрациях от 8,0 1,5 до 384,5 74,0 мкг/мл и наряду с ними противодифтерийные АБ антитела изотипов G, M, A в концентрациях от 19,0 1,8  до 161,2 19,5 мкг/мл, от 3,1 0,9 до 90,6 12,0 мкг/мл и от 3,4 0,4 до 29,2 3,6 мкг/мл  соответственно.

Определено, что существует прямая корреляционная связь между показателями АТ антител, выявленных в одних и тех же сыворотках взрослых людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы  (показатели содержания в мкг/мл) и коммерческой тест-системы на основе ИФА (показатели содержания в МЕ/мл).

Выявлено, что самое высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках людей, проживающих в России и Финляндии, где согласно национальным календарям профилактических прививок проводится вакцинация взрослого населения, а также в Латвии, где в 90-е годы отмечались вспышки заболевания дифтерией, сопровождающиеся высоким уровнем носительства (от 14,5 3,0 до 89,0 8,0, от  8,0 1,5  до 384,5 74,0 и от 32,5 7,0  до 184,2 32,5 мкг/мл соответственно). В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях (от 14,0 1,5 до 32,5 6,0 и от  14,5 3,0  до 51,5 16,0 мкг/мл соответственно).

Определено, что с увеличением возраста содержание АТ IgG и АБ антител G, M изотипов уменьшается, а содержание АБ IgA увеличивается, что подтверждает изменение синтеза иммуноглобулинов этих изотипов в онтогенезе.

Впервые использование биометрического метода биномиального распределения уровней концентрации АТ и АБ антител в сыворотках крови взрослых людей из разных стран позволило оценить напряженность популяционного противодифтерийного иммунитета. Показано, что  оптимальная напряженность противодифтерийного иммунитета характеризуется содержанием в сыворотках крови большего количества людей невысоких концентраций АТ и АБ антител и в сыворотках меньшего количества людей - высоких концентраций (1-й и 2-й модальные пики).

Практическая значимость

Разработанные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять в сыворотках крови людей поствакцинальные АТ и образующиеся естественным путем АБ антитела и определять напряженность популяционного противодифтерийного АТ иммунитета, мониторинг которого входит в систему эпиднадзора.

По результатам работы составлены и утверждены пособия (Определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа, Определение антибактериальных противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа, 2012) для сотрудников научных учреждений по использованию ИФА для количественного выявления противодифтерийных антител.

В 2013 году будут проведены лабораторные испытания разработанных тест-систем на основе ИФА.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанные иммуноферментные тест-системы используются в работе Научной группы по изучению противодифтерийного иммунитета в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для оценки напряженности противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета у людей.

После проведения лабораторных испытаний планируется коммерческий выпуск тест-системы на основе ИФА для количественного выявления противодифтерийных АТ антител с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии, проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2009; 2010 гг.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять концентрацию АТ IgG в абсолютных единицах, которые коррелируют с показателями содержания антитоксина в международных условных единицах МЕ/мл, выявленных с помощью коммерческой тест-системы на основе

ИФА.

2. Созданная тест-система на основе ИФА позволяет определять концентрацию образующихся естественным путем АБ антител изотипов G, M, A в сыворотках крови людей в абсолютных единицах.
3. Использование биометрического анализа дает возможность изучить напряженность противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета в популяциях людей.

  Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 4 от 07 июня 2012 г.

Результаты диссертационной работы были представлены на  IV Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, (2-4 июня 2008 г., Санкт-Петербург), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Биологическая безопасность в современном мире (21-22 апреля 2009 г., Оболенск), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения (15-17 июня 2009 г., Нижний Новгород,), Second Annual Meeting of Dipnet and Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (5-7 November 2008, Larnaca, Cyprus), Third Annual Meeting of Dipnet and Eleventh  International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (7-9 October 2009, Riga, Latvia), Международной конференции Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями (18-20 мая 2010 г., Санкт-Петербург,), X Всероссийской научно-практической конференции "Дни иммунологии в Сибири" (5-6 июля 2012 г., Иркутск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, 6 - в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов:  введение, обзор литературы (глава 1 и 2), материалы и методы (глава 3), собственные исследования (главы 4, 5, 6, 7), заключение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация снабжена 32 рисунками и 17 таблицами. В библиографическом указателе приведены 235 источников, из них 151 - на русском и 84 - на иностранном языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы исследования

В исследовании использовали:

- анатоксин дифтерийный очищенный несорбированный, служащий антигеном в разработанной иммуноферментной тест-системе для определения противодифтерийных АТ IgG;

  - бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки C. diphtheriae tox - пептидополисахаридной природы, служащий антигеном в иммуноферментной тест-системе для определения противодифтерийных АБ антител. Одна ампула препарата содержит 3000 мкг антигенов клеточных стенок. Бактериальный препарат был получен по методике, предложенной Шмелевой Е.А. (Шмелева Е.А., 1991);

- конъюгаты моноклональных антител к -, - и Ццепям иммуноглобулина человека, меченные пероксидазой хрена, для количественного определения  антител изотипов G, M и A, приготовленные методом периодатного окисления (Сорбент Лтд., Россия);

- сыворотки крови людей: исследовали сыворотки крови доноров из шести стран Европы: Латвии, России, Литвы, Италии, Англии, Финляндии. Всего определено содержание АТ IgG антител в 411 пробах сывороток крови; АБ антител IgM - в 547, IgG - в 559, IgA - в 549 пробах сывороток крови. Образцы сывороток крови предоставлены Европейской лабораторной рабочей группой по дифтерии в рамках совместной работы с сектором микробных иммуномодуляторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

Для выделения противодифтерийных АТ и АБ антител с помощью аффинной хроматографии в качестве сорбента использовали сефарозу, активированную бромцианом (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). В качестве лигандов использовали очищенный дифтерийный анатоксин и бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки C. diphtheriae tox - пептидополисахаридной природы.

Методы исследования

Гамма-глобулиновую фракцию получали из пула 100 сывороток крови здоровых взрослых людей в возрасте 18-20 лет методом ступенчатого высаливания. Освобождение растворов высокомолекулярных веществ от  низкомолекулярных соединений проводили с помощью диализа (Остерман Л.А., 1983).

Выделение противодифтерийных АТ IgG и АБ IgG, IgM, IgA из гамма-глобулиновой фракции пула сывороток крови проводили с помощью метода аффинной хроматографии (Остерман Л.А, 1983, 1985).

Определение концентрации противодифтерийных АТ и АБ антител проводили с использованием неконкурентного метода иммуноферментного анализа, вариант сэндвич (Фримель Г., 1987, Нго Т.Т., 1988).

Статистические методы и программное обеспечение.

Для расчета количества антител в исследуемых сыворотках крови применяли компьютерную программу для ИФА MSFL ELA.exe, разработанную ТОО Микрофлора при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Козлов Л.В., 1985).

Количество общих иммуноглобулинов изотипов G, M, A в референс-сыворотке определяли с помощью коммерческого набора (Вектор-БЕСТ) в соответствии с инструкцией производителя. В работе применялись разведения исследуемых образцов 1:10, 1:20 (Фирсова Т.Н., 2009).

Значения средней арифметической и среднеквадратического отклонения показателей концентрации АТ и АБ антител рассчитывали по общепринятым формулам (Иванова В.М., 1981).

Для выявления  связи между переменными величинами по их абсолютным значениям использовали корреляционный анализ (Иванова В.М., 1981). Для метрических величин применяется коэффициент корреляции Пирсона, который задается формулой

где X,YаЧ две случайные величины, определённые на одном вероятностном пространстве, - значения, принимаемые переменной X, - значения, принимаемые переменой Y, - средняя по X, - средняя по Y.

Для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета в коллективах был использован метод популяционного анализа, позволяющий охарактеризовать и сравнить обследованные группы людей по распределению показателей концентрации АТ и АБ антител в популяции. Расчет осуществляли с помощью метода биномиального распределения показателей количественного содержания противодифтерийных АТ и АБ антител в сыворотках крови взрослых людей (Плохинский Н.А., 1961, Зайцев Г.Н., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления противодифтерийных АТ антител

Для выявления поствакцинальных АТ антител в сыворотках крови детей и взрослых в мировой практике используется иммуноферментный анализ, с помощью которого идентифицированные антитела характеризуются в относительных показателях МЕ/мл (Di Giovine P, Pinto A, 2009). Целью данного исследования была разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения противодифтерийных АТ IgG в абсолютных показателях. На первом этапе необходимо было получить стандартный образец с известным содержанием антитоксина в мкг/мл.

Получение стандарта АТ антител

Методом дробного высаливания была  получена - глобулиновая фракция из пула сывороток крови от 100 доноров в возрасте 18-20 лет. Далее проводили выделение из неё  противодифтерийных АТ антител с помощью метода аффинной хроматографии. На рис. 1 приведена схема выделения АТ антител.

В качестве матрицы была использована активированная бромцианом сефароза. На неё сорбировали лиганд, в качестве которого использовали очищенный дифтерийный анатоксин. Наносили на колонку Цглобулиновую фракцию. Затем отмывали не связавшиеся с антигеном антитела. После этого проводили элюцию специфических антител, связавшихся с лигандами-антигенами. Собирали фракции объемом 3 мл каждая. Сбор фракций прекращали, когда кривая оптической плотности выходила на постоянное минимальное значение.

Рисунок 1. Схема выделения специфических антител с помощью аффинной хроматографии

Для определения количественного содержания выделенных из Цфракции АТ IgG в полученных при проведении аффинной хроматографии фракциях провели иммуноферментный анализ с помощью коммерческого набора IgG общий - ИФА - БЕСТ (фирмы Вектор-Бест). Используемый в данном наборе твердофазный метод иммуноанализа основан на принципе сэндвича. Определение проводили в соответствии с инструкцией производителя. По результатам анализа для последующей работы отбирали фракции с наибольшей концентрацией АТ IgG. Они служили стандартом для разрабатываемой тест-системы.

Дальнейшие эксперименты были направлены на подбор оптимальных условий проведения ИФА, а именно: выбор концентрации специфического антигена и концентрации конъюгатов, рН используемых буферных растворов, время и температуру, при которой протекала сорбция специфического антигена на полистироловых планшетах.

Выбор рабочей концентрации антигена и оптимального разведения конъюгатов

Целью данного этапа работы явился выбор минимальной концентрации раствора антигена (дифтерийного анатоксина), используемого для сенсибилизации планшета, и максимального разведения конъюгатов моноклональных антител к -цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена. За рабочее разведение препаратов принимали разведение, при котором отмечается максимальное значение оптической плотности образцов на фоне минимального значения оптической плотности отрицательного контроля (оптическая плотность меньше 0,2).

Для определения рабочей концентрации антигена использовали различные разведения дифтерийного анатоксина (20, 10, 5, 2 мкг/мл). По результатам данного теста была выбрана оптимальная рабочая концентрация антигена, которая составила 10 мкг/мл.

Для определения оптимального разведения конъюгата использовали двенадцать различных разведений в диапазоне от 1:500 до 1:32000. Анализ результатов показал, что оптимальный титр конъюгата для данной тест-системы составляет 1:20000.

Выбор оптимальных значений рН буферных растворов, температурного режима и времени инкубации

В ходе оптимизации методики варьировали значения рН буферных растворов, использующихся для сорбции антигена (карбонатного буфера) и для отмывки планшетов (фосфатного буфера): 9,2нннннннннннн9,8 и 7,2нннннннннннн7,5 соответственно. Результаты показали, что сенсибилизирующая активность антигена и интенсивность реакции практически не зависели от рН использованных растворов. В качестве рабочих были выбраны буферные растворы с рН, наиболее часто используемыми в ИФА: фосфатный буферный раствор с рН = 7,4 и карбонатный буферный раствор с рН = 9,6.

Изучение влияния температуры и времени сорбции антигена на чувствительность реакции показало, что она достигает максимума после инкубации планшетов при 37С в течение 1 часа или при 4С в течение 14 часов.

Характеристика разработанной иммуноферментной тест-системы

В качестве контролей в разработанном ИФА использовали лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором содержались АТ антитела, и отрицательным контрольным образцом, не содержащим исследуемых антител. Разработанная иммуноферментная тест-система характеризуется высокой чувствительностью. Воспроизводимость метода показана пятикратным титрованием 10 контрольных образцов сывороток здоровых людей. Зарегистрировано четкое повторение результатов показателей содержания специфических антител в этих сыворотках. Установлен коэффициент вариации для воспроизводимости результатов 8,9%  при норме не более 10% (Таранов А.Г., 2002).

Сравнение концентрации противодифтерийных АТ антител, выявляемых с помощью разработанной и коммерческой тест-систем

Для сравнения показателей уровня АТ антител, определенных с помощью разработанной и коммерческой иммуноферментных тест-систем,  использовали корреляционный анализ, включающий определение коэффициента корреляции Пирсона и построение диаграммы рассеяния.

Диаграмма рассеяния выявленных показателей содержания АТ антител в сыворотках крови людей графически отражает корреляционную зависимость между показателями концентрации антител в мкг/мл и показателями в МЕ/мл.

Рисунок 2. Диаграмма рассеяния показателей АТ антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей

Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,873, что говорит о наличии сильной корреляции между двумя системами (рис. 2).

Следовательно, разработанная иммуноферментная тест-система определяет достоверное содержание специфических антител в мкг/мл в сыворотках крови и может быть использована для выявления противодифтерийных АТ IgG.

Определение концентрации АТ антител в сыворотках крови людей

с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы

Изучение АТ антител проводили для сывороток крови доноров из 6 стран Европы. Всего изучено 411 проб сывороток крови здоровых взрослых людей разных возрастных групп из 6-ти стран (табл. 1).

Наибольшие значения концентрации АТ антител были зарегистрированы в сыворотках людей в возрасте 20-30 лет из Латвии, России, Литвы и Финляндии (184,232,5, 89,08,0, 78,512,0 и 384,574,0 мкг/мл соответственно, табл. 1).

Для сывороток людей той же возрастной группы из Италии и Англии содержание антитоксина составляло 51,516,0 и 32,56,0 мкг/мл соответственно, что существенно ниже. У старших возрастных групп определённые уровни антитоксина ниже. Наименьшая концентрация АТ антител наблюдалась в сыворотках доноров из Финляндии, России и Италии в возрасте 51 года и старше (8,01,5, 14,53,0, 14,53,0 мкг/мл соответственно).

Таблица 1 Противодифтерийные АТ антитела в сыворотках здоровых взрослых людей различных возрастных групп
Страна	возраст	концентрация, мкг/мл			кол-во сывороток
атвия	20-30	184,2		32,5	14	85
	31-40	138,0		14,5	28
	41-50	94,5		14,0	20
	51 и старше	32,5		7,0	23
Россия	20-30	89,0		8,0	25	67
	31-40	79,5		9,0	25
	41-50	13,0		5,5	7
	51 и старше	14,5		3,0	10
итва	20-30	78,5		12,0	33	88
	31-40	75,5		13,0	28
	41-50	62,5		11,0	27
	51 и старше	а	а	а	а
Италия	20-30	51,5		16,0	10	41
	31-40	30,0		5,5	10
	41-50	24,5		3,5	11
	51 и старше	14,5		3,0	10
Англия	20-30	32,5		6,0	33	88
	31-40	25,5		6,5	25
	41-50	14,0		1,5	30
	51 и старше	а	а	а	а
Финляндия	20-30	384,5		74,0	7	42
	31-40	22,0		13,5	4
	41-50	36,5		13,0	20
	51 и старше	8,0		1,5	11

Рисунок 3. Уровень  противодифтерийных АТ антител (мкг/мл) в сыворотках крови взрослых людей

Таким образом, с увеличением возраста концентрация антитоксина в крови здоровых взрослых людей, проживающих в разных странах, уменьшается (рис. 3). Необходимо отметить, что самые низкие уровни антитоксина в крови выявлены в сыворотках крови людей, проживающих в Англии (рис. 3). В сыворотках взрослых из России и стран Прибалтики в этот же период регистрируется значительно более высокое содержание АТ антител. Только к 41-50 годам уровень антитоксина в крови людей из этих стран приближается к аналогичным возрастным показателям антитоксина у взрослых людей из Италии, Англии, Финляндии.

Высокая концентрация АТ антител в крови доноров 20-30 лет, отмечающаяся для людей из России, Финляндии, Латвии и Литвы может быть вызвана интенсивным антигенным раздражением: в частности, вакцинацией взрослых людей, проводящейся в России и Финляндии (согласно национальным календарям прививок), или плотной циркуляцией возбудителя среди населения в виде транзиторного или длительного носительства (Латвия, Литва).

Возрастная динамика снижения концентрации антитоксина в крови взрослых людей от 20 до 51 года и старше объясняется особенностями иммунного ответа в онтогенезе. Высокие концентрации антитоксина в крови привитых взрослых, так же как и у носителей,  не препятствуя персистенции возбудителя С.diphtheriae tox+ на поверхности слизистых оболочек, отражают повышенный синтез специфических антител и большую напряженность гуморального специфического иммунного ответа.

Напряженность противодифтерийного АТ иммунитета в популяции людей

Для оценки напряженности АТ иммунитета в исследуемых коллективах людей был использован метод биометрического распределения биологического признака в популяции. Известно, что нормальное распределение любого признака в природе должно соответствовать бимодальному. Так, известно, что большее количество людей в популяции обладает оптимальным иммунным ответом на любое антигенное воздействие, то есть у большего процента людей в популяции иммунный ответ должен быть умеренным (1-й модальный пик), а у меньшего процента - показатели концентрации индуцированных антител должны быть выше оптимальной нормы (2-й модальный пик). Расчет осуществлялся с помощью биномиального вариационного ряда распределения признака (в данном случае по концентрации АТ антител в популяции из той или иной страны).

Анализ показал, что большее количество здоровых взрослых людей (от 46 до 75%) из таких стран как Италия, Англия, Финляндия содержали в крови более низкую концентрацию АТ антител (от 10 до 65 мкг/мл, рис. 4; 1-й модальный пик). У меньшего процента лиц содержание АТ антител регистрировалось в более высоких концентрациях (рис. 4; 2-й модальный пик).

Рисунок 4. Профили распределения в популяции показателей концентрации противодифтерийных АТ антител, содержащихся в сыворотках взрослых людей из разных стран Европы

Полученные профили распределения показателей концентрации АТ антител выбранных контингентов из Италии, Англии, Финляндии практически соответствуют нормальному бимодальному вариационному ряду.

В группах из Латвии, России и Литвы процент людей с лумеренно низкими концентрациями (от 10 до 220 мкг/мл) АТ антител в крови составил около 30% (1-й модальный пик). Остальные обследованные лица содержали АТ антитела в очень высоких концентрациях (от 225 до 450 мкг/мл, 2-й модальный пик). Показатели концентрации 2-го модального пика сливаются с показателями 1-го. Нормальное бимодальное распределение признака в этих группах отсутствует и носит аномальный характер. Иммунная структура выбранных контингентов из Латвии, России и Литвы характеризуется значительной долей взрослых людей с гипертитрами антитоксина.

Итак, использование метода бимодального распределения в популяции показало, что люди, вне зависимости от возраста, с оптимально низкими концентрациями антитоксина в крови составляют в коллективах из Италии, Англии, Финляндии большинство, в то время как в коллективах из Латвии, России и Литвы, наоборот, они составляют меньшинство. Влияние большей доли индивидуумов с гипертитрами антитоксина в крови на иммунную структуру коллектива неблагоприятно. Для таких индивидуумов повышенный синтез АТ антител сопровождается изменением иммунной реактивности, формированием вторичного иммунодефицита и носительством. Увеличение количества носителей повышает плотность циркуляции возбудителя среди населения. В целом, для популяции, где выявлены отклонения от нормального бимодального распределения концентрации АТ антител, изменение ее иммунной структуры сопровождается снижением уровня специфической коллективной защиты.

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления

противодифтерийных АБ антител

АТ иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются АБ антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с циркулирующими среди населения коринебактериями дифтерии. Поэтому очевидна необходимость изучения не только АТ, но и АБ противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиагностических методов.

Получение стандарта АБ антител

На первом этапе был приготовлен стандартный образец, содержащий АБ антитела к C. diphtheriae. Для этого сначала из пула сывороток крови доноров была получена -фракция. Далее из неё методом аффинной хроматографии были выделены АБ антитела (аналогично выделению АТ IgG) (рис.1). В качестве лиганда использовали полученный нами бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки C. diphtheriae tox - пептидополисахаридной природы (Шмелева Е.А., 1991).

Для определения количественного содержания (мкг/мл) в полученных фракциях антител изотипов G, М, А проводили иммуноферментный анализ с использованием коммерческих наборов фирмы Вектор-Бест (лIgG общий-ИФА-БЕСТ, IgM общий-ИФА-БЕСТ, IgA общий-ИФА-БЕСТ). Фракции с известной концентрацией АБ антител и использовались в дальнейших экспериментах в качестве стандарта.

Выбор рабочей концентрации антигена и оптимального разведения

конъюгатов

За рабочее разведение бактериального препарата принимали разведение, при котором отмечается максимальное значение оптической плотности исследуемых образцов на фоне минимального значения оптической плотности отрицательного контроля (оптическая плотность меньше 0,2).

Для определения рабочей дозы антигена готовили разведения бактериального препарата в концентрациях 100; 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,55, 0,77, 0,38, 0,19, 0,095 и 0,047 мкг/мл.

  По результатам данного теста были выбраны следующие оптимальные рабочие концентрации антигена для выявления антител: при определении АБ IgG и IgM концентрация антигена составляет 12 мкг/мл; IgA  - 6 мкг/мл.

Для определения оптимального разведения конъюгата использовали двенадцать различных разведений в диапазоне от 1:500 до 1:32000. Анализ показал, что титры конъюгатов для данной тест-системы составляют для: IgG - 1:20000, IgM - 1:20000, IgA - 1:16000.

Характеристика разработанной иммуноферментной тест-системы

В качестве контролей в разработанном ИФА использовали лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором содержались АБ антитела, и отрицательным контрольным образцом, не содержащим исследуемых антител. Тест-система специфична и характеризуется высокой чувствительностью. Для разработанной тест-системы ИФА установлен коэффициент вариации для воспроизводимости результатов 8,2%  при  норме не более 10% (Таранов А.Г., 2002).

Таким образом, разработанная иммуноферментная тест-система может быть использована для выявления противодифтерийных АБ IgG, IgM, IgA в абсолютных показателях в сыворотках крови людей.

Определение концентрации противодифтерийных АБ антител в

сыворотках крови людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы

Известно, что в сыворотках крови людей наряду с АТ антителами содержатся и образующиеся естественным путем АБ антитела в результате циркуляции в популяции людей коринебактерий дифтерии. Изучение АБ антител проводили в сыворотках крови здоровых взрослых людей-доноров из шести стран Европы: Латвии, России, Литвы, Италии, Англии, Финляндии. Всего изучено IgG - в 559, IgM - в 547, IgA - в 549 пробах сывороток крови.

Высокие концентрации АБ IgG определялись в сыворотках взрослых в 20-30 лет из Латвии (157,227,8 мкг/мл), Литвы (63,87,0 мкг/мл), Англии (90,29,9 мкг/мл) и Финляндии (157,318,9 мкг/мл, табл. 2, рис. 5). В сыворотках взрослых (20-30 лет) из России и Италии АБ IgG содержались в меньших концентрациях: 38,53,6 и 33,63,8 мкг/мл. Показатели концентрации АБ IgG в сыворотках лиц из всех стран на протяжении 30 лет (от 20 до 51 года и старше) практически не изменялись.

Таблица 2

Противодифтерийные АБ антитела в сыворотках крови людей

Страна	Возраст	IgМ		IgG		IgA
		конц-ция, мкг/мл	кол-во человек	конц-ция, мкг/мл	кол-во человек	конц-ция, мкг/мл			кол-во человек
атвия	20-30	90,6 12,0	17	157,2 27,8	16	8,0 1,2			15
	31-40	88,5 13,4	29	135,1 18,1	25	5,6 0,6			28
	41-50	27,3 5,2	15	173,2 15,4	17	8,0 1,0			18
	51 и старше	34,2 2,9	18	161,2 19,5	21	7,4 1,2			23
Россия	20-30	17,1 1,6	91	38,5 3,6	87	21,8 1,6			89
	31-40	21,0 2,4	28	82,0 8,0	27	19,0 3,0			27
	41-50	29,5 6,2	19	47,4 8,6	20	18,4 3,4			15
	51 и старше	19,8 3,2	9	38,6 4,8	10	13,6 2,4			8
итва	20-30	45,6 6,2	29	63,8 7,0	30	16,2 1,8			33
	31-40	32,1 4,1	31	67,8 6,9	31	22,0 2,2			30
	41-50	21,9 2,9	28	86,9 9,7	27				28
	51 и старше
Италия	20-30	18,5 2,3	20	33,6 3,8	18	23,8 2,6			18
	31-40	17,2 1,4	31	55,9 6,3	36	22,8 2,4			36
	41-50	17,9 1,5	37	19,0 1,8	37	28,4 3,2			37
	51 и старше	11,3 1,2	27	63,8 8,7	27	29,2 3,6			22
Англия	20-30	21,2 3,5	27	90,2 9,9	33	3,4 0,4			39
	31-40	55,9 10,3	24	109,8 1,6	24	6,6 1,8			23
	41-50	22,0 3,6	27	79,3 10,4	28	7,4 1,4			27
	51 и старше
Финляндия	20-30	33,3   5,3	8	157,3 18,9	10	8,0 1,2			8
	31-40	14,2 2,2	5	122,2 41,5	4	6,2 1,0			4
	41-50	10,9 1,7	17	147,4 7,1	22	9,0 1,4			14
	51 и старше	3,1 0,9	10	115,0 15,9	9	3,6 1,0			7

Рисунок 5. Уровень  противодифтерийных АБ IgG (мкг/мл) в сыворотках крови взрослых людей

Рисунок 6. Уровень  противодифтерийных АБ IgМ (мкг/мл) в сыворотках крови взрослых людей

Рисунок 7. Уровень  противодифтерийных АБ IgА (мкг/мл) в сыворотках крови взрослых людей

В исследованных сыворотках взрослых людей в возрасте 20-30 и 31-40 лет высокие концентрации АБ IgM определялись в сыворотках из Латвии (90,612,0, 88,513,4 мкг/мл), Литвы (45,66,2, 32,14,1 мкг/мл) и в 30-40 лет -

из Англии (55,910,3 мкг/мл). В сыворотках из Финляндии, Италии, России АБ IgM в возрасте 20-30 лет выявлялись в меньших концентрациях: 33,35,3, 18,52,3, 17,11,6 мкг/мл соответственно. Самый низкий уровень АБ IgM в возрасте от 20 до 51 года и старше регистрировался в сыворотках из Италии (табл. 2, рис.6).

Изучение АБ IgA в тех же сыворотках показало, что самые высокие их концентрации содержатся в крови индивидуумов из России, Литвы и Италии (табл. 2, рис. 7). В сыворотках взрослых (20-30 лет) они выявляются в концентрации 21,81,6, 16,21,8 и 23,82,6 мкг/мл соответственно. Самые низкие концентрации АБ IgA в этом же возрасте определялись в сыворотках лиц из Латвии, Англии, Финляндии (8,01,2, 3,40,4, 8,01,2 мкг/мл соответственно). С увеличением возраста прослеживается тенденция к увеличению концентрации АБ IgA только для жителей Италии и Англии, а для контингентов из России и Финляндии, наоборот, отмечается снижение. Показатели концентрации АБ IgA для жителей Латвии и Литвы практически не изменяются.

Напряженность противодифтерийного АБ иммунитета в популяции людей

Для оценки напряженности АБ иммунитета в исследуемых коллективах людей был использован метод биометрического распределения биологического признака в популяции. Профили распределения показателей АБ IgG соответствовали бимодальному для контингентов из России, Англии и Италии (рис. 8), то есть у большего количества индивидуумов из этих стран в сыворотках крови содержатся оптимально низкие концентрации АБ IgG (1-й модальный пик распределения), а у небольшого количества лиц - в высоких концентрациях (2-й модальный пик). Профили распределения концентраций АБ IgG в коллективах из Латвии, Финляндии, Литвы не соответствуют бимодальным. Высокие концентрации АБ IgG, характерные для индивидуумов этих стран, распределяются единым массивным пиком, продолжающимся длинным плато высоких и гипервысоких показателей (рис. 8).

Рисунок 8. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ IgG, содержащихся в сыворотках взрослых

Профили распределения показателей концентрации АБ IgM в коллективах из России, Италии, Англии и Финляндии соответствовали бимодальному (рис. 9). Наличие высоких концентраций АБ IgM в крови лиц в возрасте 31-40 лет из Англии изменяет профиль распределения, смещая показатели 1-го модального пика в сторону концентраций 2-го модального пика. Для взрослых из Латвии и Литвы бимодальные распределения концентраций АБ IgM отсутствуют. Профили распределения высоких концентраций АБ IgM, содержащихся в крови лиц из этих стран, выглядят одномодальными плато (рис. 9).

Рисунок 9. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ IgМ, содержащихся в сыворотках взрослых

Бимодальное распределение показателей концентрации  АБ IgA в популяциях соответствовало контингентам из Англии и Финляндии (рис. 10). Профиль бимодального распределения совпадал и для коллектива из Латвии, но в 1-й модальный пик с низкими показателями концентраций АБ IgA охватывал незначительное количество людей. Следует обратить внимание на высокие показатели концентрации АБ IgA в сыворотках крови из Италии. Бимодальное распределение показателей концентрации АБ IgA для этого контингента отсутствует, концентрации сливаются в сплошное плато высоких показателей

Бимодальное распределение показателей АБ IgA отсутствует и для контингентов взрослых лиц из России (рис. 10).

Рисунок 10. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ IgА, содержащихся в сыворотках взрослых

Таким образом, АБ антитела изотипов G, M, A содержатся в сыворотках людей в возрасте от 20 до 51 года и старше в широком диапазоне концентраций, показатели распределения которых в отдельных странах разные, то есть их распределение в популяции не всегда соответствует бимодальному. При этом существующее кооперативное взаимодействие клеток иммунной системы отражается на биосинтезе отдельных изотипов АБ иммуноглобулинов. Так, большие концентрации АБ IgM в сыворотках из Латвии, Литвы, Англии свидетельствуют об усиленной продукции иммуноглобулинов под воздействием АБ антигенов коринебактерий дифтерии, следствием чего является отсутствие их бимодального распределения в коллективе.

Известно, что в процессе эволюции IgM появились первыми. Они же первыми синтезируются в ответ на антигенную стимуляцию и быстро связываются с бактериальными антигенами. IgG появляются в сыворотке вслед за IgM и вместе с белками системы комплемента вносят существенный вклад в элиминацию возбудителя из макроорганизма.

Функциональная роль  АБ IgG подтверждается полученными данными. Так, в сыворотках взрослых лиц из тех стран, в коллективах которых определяется высокая концентрация АБ IgM (Латвия, Литва, Англия) выявляются и высокие концентрации АБ IgG. Исключение составляют сыворотки от взрослых из Финляндии, где выявленные низкие показатели АБ IgM по-видимому свидетельствуют о незначительном бессимптомной носительстве C. diphtheriae, которое не учитывается.  Выявление в сыворотках взрослых из Латвии, Англии, Финляндии высоких концентраций АБ IgG сопровождается выявлением в них же низких показателей  АБ IgA. Умеренные концентрации АБ IgG, определяемые в сыворотках из Литвы,  соответствуют умеренным  концентрациям в них же АБ IgA.

IgА играют большую роль в колонизационной и антибактериальной резистентности детского и взрослого организма. Основная функция IgА - предотвращение проникновения бактериальных антигенов, передающимся воздушно-капельным путем с внешней поверхности слизистых оболочек внутрь макроорганизма. Высокие концентрации АБ IgА, выявленные в сыворотках взрослых из Италии, свидетельствуют о высокой устойчивости к адгезии C. diphtheriae.

Таким образом, разработанные иммуноферментные тест-системы позволили углубленно изучить противодифтерийный иммунитет и оценить в абсолютных единицах уровень не только АТ, но и АБ антител в крови людей.

ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления в сыворотках крови людей противодифтерийных АТ антител в абсолютных единицах (мкг/мл), концентрация которых коррелирует с показателями этих же АТ антител, выявляемых с помощью коммерческой тест-системы на основе ИФА в относительных показателях МЕ/мл.
2. Разработана диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления в сыворотках крови людей противодифтерийных АБ антител в абсолютных единицах (мкг/мл).
3. В сыворотках крови здоровых взрослых людей в возрасте от 20 до 51 года и старше противодифтерийные АТ антитела с помощью разработанного ИФА определяются в концентрациях от 8,0 1,5 до 384,5 74,0 мкг/мл. Наиболее высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках взрослых людей, проживающих в России и Финляндии, что является отражением проводимой в этих странах ревакцинации взрослого населения, а также в Латвии и Литве, где в период взятия сывороток зафиксированы заболевания дифтерией и носительство возбудителя. В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях.
4. Напряженность противодифтерийного АТ иммунитета в популяциях людей из Италии, Англии, Финляндии соответствует нормальному бимодальному распределению концентрации АТ антител: большее количество индивидуумов содержит в крови довольно низкие концентрации антитоксина (1-й модальный пик), а меньшее число людей - более высокие концентрации (2-й модальный пик).
5. В сыворотках крови здоровых взрослых людей содержатся противодифтерийные АБ антитела G, M, A изотипов в концентрациях IgG - от 19,01,8 до 173,215,4 мкг/мл, IgM - от 3,10,9 до 90,612,0 мкг/мл, IgA - от 3,61,0 до 29,23,6 мкг/мл соответственно. При этом синтез АБ антител изменяется с возрастом: количество АБ IgG и IgM уменьшается, а IgA - увеличивается. Наибольший уровень АБ IgG содержится в сыворотках крови людей из Латвии и Финляндии, АБ IgM - из Латвии, Литвы, Финляндии, АБ IgA - из Италии, России, Литвы.
6. Распределение АБ IgG, IgM, IgA антител в популяции взрослых людей из Италии, Англии, Финляндии имеет тенденцию к нормальному бимодальному, что соответствует оптимальной напряженности противодифтерийного АБ иммунитета в популяциях людей из этих стран.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная и апробированная иммуноферментная тест-система для определения противодифтерийных АТ антител планируется к производственному коммерческому выпуску на базе ФБУН ГН - ПМБ Роспотребнадзора, что позволит проводить слежение за поствакцинальным противодифтерийным АТ иммунитетом среди населения в научных,  лечебных и профилактических учреждениях здравоохранения (Методические указания, МУ, 3.1.1082-01, 2002 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шмелева Е.А. Экологические и иммунологические аспекты носительства возбудителя дифтерийной инфекции / Шмелева Е.А., Попкова С.М., Парамонова Ю.А., Фирсова Т.Н., Батурина И.Г. // Материалы IV Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, 2-4 июня 2008 г. (г. Санкт-Петербург). - 2008. - . С. 87.
2. Фирсова Т.Н. Разработка тест-системы ИФА для выявления антибактериальных противодифтерийных антител / Фирсова Т.Н., Шмелева Е.А., Новикова Л.И., Булыгина Г.С. // Тезисы материалов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Биологическая безопасность в современном мире 21-22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). - 2009. - С. 145-147.
3. Шмелева Е.А. Содержание антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках взрослых людей из разных регионов Европы. Сообщение 1 / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С. и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2009. -  №4. - С. 49-56.
4. Шмелева Е.А.  Антибактериальные противодифтерийные антитела в сыворотках крови взрослых людей. Сообщение 2 / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С. и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2009. - №5. - С. 66-75.
5. Фирсова Т.Н. Использование ИФА для диагностики противодифтерийных антитоксических и антибактериальных антител / Фирсова Т.Н., Шмелева Е.А., Парамонова Ю.А., Булыгина Г.С., Новикова Л.И., Батурина И.Г. // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Академика И.Н. Блохиной, 15-17 июня 2009 г. (г. Нижний Новгород). - 2009. - С. 197-199.
6. Шмелева Е.А. Оптимальная структура популяционного антитоксического противодифтерийного иммунитета / Шмелева Е.А., Булыгина Г.С., Фирсова Т.Н., C. von Hunolstein,  Di Giovine P.., Pinto A., Efstratiou A., Neal S., Vuopio-Varkila J,  Lucenko I., Paberza R., Vingre I.,  Dauksiene S.,  Kupreviciene N. // /Материалы международной конференции Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями, 18-20 мая 2010 г. (г. Санкт-Петербург). - 2010. - С. 84.
7. Фирсова Т.Н.  Показатели уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью двух иммуноферментных тест-систем / Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С., Шмелева Е.А. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - №3(58). - С. 53-56.
8. Шмелева Е.А.  Антитоксические противодифтерийные антитела в сыворотках крови людей / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Попкова С.М., Губин М.М. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - № 5 (87), Часть 1. - С. 87-92.
9. Шмелева Е.А.  Антитоксические противодифтерийные антитела в сыворотках крови людей / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Попкова С.М., Ракова Е. Б., Сердюк Л. В., Губин М.М. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - №3 (185). - Часть 2. - С. 241-248.
10. Firsova T.N. Development of ELISA for quantitative determination of antibacterial antidiphtheritic antibodies in human blood sera / Firsova T.N., Shmeleva E.A., Baturina I.G., Paramonova Y.A. // Programme and Abstracts Book Second Annual Meeting of Dipnet and Tenth  International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 5-7 November 2008, (Larnaca, Cyprus). - 2008. - P. 49
11. Shmeleva E.A. Anti Corynebacterium diphtheriae antibodies in the sera of healthy adults from European countries / Shmeleva E.A., Firsova T.N., Buligina G.S. at all. // Programme and Abstracts Book Third Annual Meeting of Dipnet and Eleventh  International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 7-9 October 2009, (Riga, Latvia). -  2009. -  P. 26.

Список сокращений

АБ - антибактериальный (-ые)

АТ - антитоксический (-ие)

ИФА - иммуноферментный анализ

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

С. diphtheriae tox- - Corynebacterium diphtheriae нетоксигенные

С. diphtheriae tox+ - Corynebacterium diphtheriae токсигенные

-фракция - гамма-фракция

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии