Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине

На правах рукописи

Малхасян Карен Альбертович

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В КЛЕТКАХ ПЕРВИЧНОЙ УРОТЕЛИАЛЬНОЙ КАРЦИНОМЫ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ У ПАЦИЕНТОВ ДО И ПОСЛЕ ТРАНСУРЕТРАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Приволжском филиале Федерального государственного бюджетного учреждения Российский онкологический научный центр имени Н.Н.

Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

(директор - д.м.н., профессор Хасанов Рустем Шамильевич)

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Хасанов Рустем Шамильевич

Официальные оппоненты:

Пожарисский Казимир Марианович доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммуногистохимии ФГУ "Российский научный центр радиологии и хирургических технологий" МЗ и СР РФ Фигурин Константин Михайлович доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник урологического отделения ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ и СР РФ

Защита диссертации состоится л 2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.001.017.01 при ФБГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан ______________________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор Шишкин Юрий Владимирович ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы Рак мочевого пузыря в структуре урологической онкопатологии составляет треть от всех случаев (Stenzl A., Babjuk M., 2012). Заболеваемость раком мочевого пузыря неуклонно растет, в среднем на 1,5% за 1 год. В 2010 году в России было зарегистрированно более 13 тыс. новых случаев рака мочевого пузыря (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2012).

Более 90% всех опухолей мочевого пузыря в мире составляет переходноклеточный, или уротелиальный рак (Fleshner NE, Herr HW, Stewart AK et al., 1996). В 75Ц80% вновь выявленных случаев рака мочевого пузыря диагностируется поверхностный (немышечно-инвазивный) рак (Матвеев Б.П., Кудашев Б.В., Бухаркин Б.В. и др., 2000). Казалось бы, это должно давать широкие возможности для органосохраняющего эффективного лечения. Но рак мочевого пузыря склонен к рецидивированию и вариабелен по степени злокачественности. Несмотря на то, что большинство диагностированных урокарцином являются немышечно-инвазивными, до 70% из них рецидивируют после лечения (Проничев В.В., 2002; Durek C., Wagner S., Zeylemaker B. et al., 2004). От 2% (Ta G1-2) до 15% (Ta G3) поверхностных опухолей прогрессируют и имеют достаточно скромный прогноз выживаемости, несмотря на остающуюся в запасе у уролога спасительную цистэктомию (Chin J.L., 2010).

Основой для прогнозирования течения заболевания уже много десятилетий является морфологическое заключение патолога. Два критических по важности параметра подобного заключения - это стадия (stage) и степень дифференцировки (grade) опухоли. Однако признанным также является утверждение, что заключение патолога не может быть полностью объективным (Gonul I.I, Poyraz A., Unsal C. et al., 2007). К тому же стадия и степень дифференцировки опухоли не являются исчерпывающей информацией, о чем говорят лишь относительные успехи в попытках построить предсказательную модель только по этим признакам (Fernandez-Gomez J, Madero R, Solsona E, et al., 2011).

В настоящий момент внимание исследователей обращено к дополнительным методам исследования генетических и фенотипических признаков опухоли. В ранних исследованиях (Pycha A, Mian C, Haitel A. et al., 1997; Zellweger T, Benz G, Cathomas G. et al., 2006), посвященых FISH диагностике урокарциномы, уже указывалось на возможную предсказательную значимость этого теста в отношении характера течения заболевания. Однако по настоящий момент нет окончательного согласия о значении положительного результата FISH теста в послеоперационном наблюдении за пациентами и о роли этого метода в диагностике урокарциномы (Pycha A., 2007). Также не изученным остается влияние отдельных хромосомных нарушений на морфологическую характеристику и риск рецидивирования опухоли.

Для фенотипирования же опухоли на настоящий момент наиболее часто используют иммуногистохимическое исследование (ИГХ). Однако в изученных нами литературных источниках мы не встретили попыток комплексного изучения независимого влияния различных маркеров на риск рецидивирования у самой многочисленной группы пациентов - пациентов после органосохраняющего лечения с помощью трансуретральной резекции (ТУР).

Цель и задачи работы Цель работы: установление прогностической значимости дополнительных цитогенетических, генетических и молекулярных маркеров у пациентов с урокарциномой мочевого пузыря, перенесших органосохраняющее лечение с помощью ТУР.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность цитологической и морфологической диагностики как элементов традиционного плана предоперационного обследования и наблюдения после операции ТУР опухоли мочевого пузыря.

2. Оценить эффективность формализованного FISH теста с помощью набора UroVysionо на промывных водах от пациентов с различной стадией и степенью злокачественности опухоли. Выявить характер хромосомных аномалий (анеуплоидия по 3,7 и 17 хромосомам и локусу 9p21) в клетках урокарциномы мочевого пузыря до и после операции, а также в зависимости от морфологических свойств опухоли 3. Оценить характер экспрессии широкого набора иммуногистохимических маркеров и амплификации гена c-ERB-B2 в клетках урокарциномы, его связь с традиционными клинико-морфологическими параметрами опухоли.

4. Установить независимое влияние генетических и молекулярных маркеров на безрецидивную выживаемость пациентов с урокарциномой мочевого пузыря.

5. Разработать предсказательную модель с объективными критериями на основании изученных генетических аномалий и молекулярных маркеров в отношении риска рецидивирования урокарциномы.

Научная новизна В работе получены новые данные об эффективности метода FISH диагностики рака мочевого пузыря. Впервые выявлен и статистически проверен критерий для FISH диагностики (более 40% опухолевых клеток с генетическими нарушениями), позволяющий предсказать клинико-морфологические параметры опухоли на дооперационном этапе.

Выявлена независимая предсказательная значимость гиперплоидии по 7 и хромосомам и потери 3 хромосомы и локуса 9р21 в опухолевых клетках в отношении риска рецидивирования урокарциномы мочевого пузыря после ТУР.

Впервые на одной группе пациентов проведен анализ экспрессии широкой панели онкомаркеров. Продемонстрирован характер связи гиперэкспрессии Her2/neu и амплификации гена c-ERB-B2, а также выявлена значимая ассоциация этих событий с увеличением частоты клеток аномальных по 17 хромосоме, а также с ростом среднего числа копий 17 хромосомы.

Впервые выявлена независимая предсказательная значимость экспрессии топоизомеразы-II-a, Ki-67 и цитокератина №20. На основании этих данных разработан и статистически проверен объективный числовой предсказательный индекс риска рецидивирования урокарциномы мочевого пузыря после ТУР.

Практическая значимость Выявлены закономерности роста частоты и изменения характера генетических аномалий для различных клинических подгрупп пациентов. На основании полученных данных разработан и статистически проверен цитогенетический критерий (менее 40% генетически аномальных клеток), позволяющий с достоверностью более 90% исключить до операции инвазию опухоли в мышечный слой (стадия Т2а) и высокозлокачественный (grade G3) характер опухоли. Эти данные дают дополнительное основание для сохранения мочевого пузыря ряду пациентов с опухолью большого размера на широком основании при условии технической возможности для ТУР. Также результаты FISH исследования помогут более дифференцированно отказаться от ранней повторной ТУР и обосновать проведение интраоперационной внутрипузырной химиотерапии.

Показана важность использования гистологических срезов с тканевых мультиблоков, выполненных по технологии Tissue Microarray (TMA), при проведении исследования экспрессии ИГХ маркеров и CISH проб.

Полученные данные о характере экспрессии белка Her2/neu, амплификации гена с-ERB-B2 и изменения числа копий 17 хромосомы для урокарциномы мочевого пузыря дают представление о значимой роли и механизме реализации этого звена канцерогенеза для этой патологии. Данные по HER2 особенно важны в свете только начавшегося в ряде стран клинического исследования эффективности таргетной терапии рака мочевого пузыря препаратом трастузумаб.

Разработанный объективный числовой индекс основан на ИГХ исследовании трех маркеров и обладает независимой значимой предсказательной силой в прогнозировании рецидивирования урокарциномы мочевого пузыря после ТУР. С помощью данного индекса можно обоснованно индивидуализировать схему послеоперационного наблюдения за пациентами, отказавшись от проведения первой контрольной цистоскопии на сроке 3 месяца для пациентов со значением индекса 11 баллов и менее. Также представляется оправданным проведение адъювантной внутрипузырной иммунотерапии пациентам со значением индекса более 11 баллов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Использование FISH теста (Urovysionо) до операции ТУР дает достоверную информацию о стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли, а также о рецидивирующем потенциале урокарциномы мочевого пузыря. Это достижимо только с учетом и использованием дополнительных параметров теста (числа аномальных клеток и количества копий отдельных хромосом).

2. Результаты совместного использования ИГХ исследования материала опухоли на маркеры Ki-67, топоизомераза-II-a и цитокератин №достоверно предсказывают поведение опухоли после трансуретральной резекции в отношении развития рецидива. Это обосновывает уменьшение количества контрольных цистоскопий для отдельной группы пациентов в послеоперационном наблюдении.

Апробация работы Результаты исследований были представлены в докладах на:

1. IV Конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, Россия, 2009);

2. Всероссийской конференции с международным участием Патологоанатомическая служба XXI века (Санкт-Петербург, Россия, 2010);

3. Всероссийской научной конференции Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний (Стерлитамак, Россия, 2010);

4. 7-й Всероссийской конференции по фундаментальной онкологии Петровские Чтения - 2011 (Санкт-Петербург, Россия, 2011);

5. 23-м Европейском Конгрессе по патологии ESP (Helsinki, Finland, 2011);

6. IX Всероссийском съезде клинических цитологов (Казань, Россия, 2011).

Публикации Материалы диссертации отражены в 8 опубликованных работах, в том числе в 1 за рубежом.

ичный вклад автора Автор участвовал во всех этапах диагностики и лечения большинства пациентов из групп 2 и 3. Автором лично выполнены сбор, статистическая обработка и анализ полученных результатов, изучена выживаемость в зависимости от изученных клинико-морфологических и молекулярногенетических факторов, предложены практические рекомендации по тактике диагностики и лечения. Автору принадлежит наибольший вклад среди соавторов в написании опубликованных научных работ.

Соответствие диссертации паспорту специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.12 - Онкология (медицинские науки). Результаты проведенного исследования соответствуют областям данной специальности, пунктам 2 и паспорта научной специальности.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 165 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы результатов собственного исследования, обсуждения полученных данных и выводов. Текст иллюстрирован 23 таблицами, 28 рисунками. Список литературы содержит 2наименований, из которых 19 отечественных и 233 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы Были изучены 328 случаев рака мочевого пузыря у пациентов Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства здравоохранения Республики Татарстан (РКОД МЗ РТ), г. Казань. Все пациенты разделены по методам исследования на 3 группы:

1-я группа - 225 пациентов с первичным уротелиальным раком мочевого пузыря, прошедших лечение в РКОД МЗ РТ за период с 2003 по 2007 год. В этой группе проведен ретроспективный анализ результатов трансуретральной резекции (ТУР) опухоли мочевого пузыря, гистологического исследования операционного материала и результатов дооперационного цитологического исследования мочи.

Также в этой группе пациентов была оценена частота рецидивирования заболевания после ТУР.

2-я группа - 51 пациент с первичным раком мочевого пузыря, перенесший операцию ТУР мочевого пузыря в РКОД за период с 2009 по 2010 год. В случаях была проведена внутрипузырная химиотерапия путем однократного введения в просвет мочевого пузыря раствора доксорубицина не позднее чем через 6 часов после операции. В 33 случаях операция ТУР применялась как единственный специальный метод лечения. Ни в одном случае адьювантной терапии не проводилось. Эта группа вошла в состав проспективного когортного исследования.

Пациентам из этой группы в дополнение к стандартному предоперационному протоколу диагностических анализов было проведено исследование промывных вод из мочевого пузыря методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием диагностического набора UroVysionо (Abbott Laboratories, США) (данный этап работы выполнен в лаборатории иммуногистохимической диагностики РКОД МЗ РТ при неоценимой помощи заведующего, профессора Петрова С.В.). Двадцати шести пациентам из состава этой группы также было проведено повторное FISH исследование по той же методике, с забором промывных вод при контрольной цистоскопии в период времени 1-3 месяца после операции ТУР.

3-я группа - 103 пациента с первичным раком мочевого пузыря, перенесших операцию ТУР в РКОД МЗ РТ за период с 2007 по 2010 год. В состав этой группы вошл и 51 пациент из 2-й группы. Из операционного материала всех 1пациентов были составлены 3 парафиновых тканевых мультиблока по технологии Tissue Microarray (TMA). На срезах с этих мультиблоков проведено ИГХ исследование на молекулы p53, p63, Е-кадгерина, Бета-катенина, топоизомеразыII-а, CD44v6, цитокератина №20, Ki-67 и рецептора Her2/neu. В каждом случае из этой группы также было проведено методом хромогенной гибридизации in situ (CISH) исследование амплификации гена с-ERB-B2, локализованного на хромосоме и кодирующего рецептор Her2/neu (данный этап работы выполнен в лаборатории иммуногистохимической диагностики РКОД МЗ РТ при неоценимой помощи заведующего, профессора Петрова С.В.).

Рутинное гистологическое исследование проводилось во всех случаях сертифицированными патоморфологами РКОД МЗ РТ. В каждом случае выставлялось заключение, содержащее информацию о стадии опухоли (Stage) (классификация TNM, 7-я редакция, 2009) и степени дифференцировки (Grade) (классификация ВОЗ, 1973).

Выполнение FISH исследования У 51 пациента (2 группа) непосредственно перед операцией ТУР были взяты образцы промывных вод из мочевого пузыря. Из полученного материала выполнялись мазки с круглой областью отложения клеток 6 мм в диаметре с помощью центрифуги CytoSpin 4 (Thermo Fisher Scientific Inc., CША).

Полученные мазки далее подвергались специальной обработке, гибридизации с ДНК пробой и окрашиванию согласно протоколу производителя с некоторыми изменениями.

В состав ДНК пробы входят меченые флюорохромами зонды, комплементарные центромерным участкам 3 хромосомы (красная метка SpectrumRed), 7 хромосомы (зеленая метка SpectrumGreen) и 17 хромосомы (синяя метка SpectrumAqua), а также зонд к локусу 9p21 на 9 хромосоме (желтая метка SpectrumGold). Флюоресцентное микроскопирование выполнялось в тот же день по приготовлении мазка в затемненном помещении с помощью микроскопа Leica DM 5000B с предустановленными светофильтрами DAPI single, Aqua single, Yellow single и Red/Green dual. Исследование каждого препарата выполнялось до обнаружения 100 клеток уротелия с визуально аномальным ядром, которое характеризовалось увеличенными размерами, неровными контурами и неравномерной окраской DAPI. Для каждого случая фиксировалось количество сигналов по каждой метке в аномальном ядре. В каждом случае оценивались несколько дополнительных параметров: общее число опухолевых клеток с генетическими аномалиями, число клеток с аномалией по каждой метке в отдельности и среднее число сигналов от каждой метки. Выставление формального заключения о наличии рака проводилось по критериям от производителя набора. А именно положительным результатом считалось обнаружение 4-х и более клеток с гиперплоидией по 2 и более центромерным меткам, или 12 и более клеток с гомозиготной делецией локуса 9p21.

Выполнение гистологических мультиблоков по технологии Tissue Microarray (TMA) Всего было изготовлено 3 мультиблока TMA из гистологического материала от 103 пациентов с первичным раком мочевого пузыря, перенесших операцию ТУР в РКОД МЗ РТ с 2008 по 2010 год. Для каждого опухолевого образца были выбраны как минимум 2 точки, ткань из которых была перемещена в мультиблок.

Для технического выполнения мультиблока был использован программноаппаратный комплекс TMA Master (3DHISTECH Ltd, Венгрия). Был выполнен забор образцов из донорских блоков (в виде столбиков ткани диаметром 1,6 мм) и имплантация их в 3 реципиентных мультиблока, рассверленных под 104 образца (по формуле 8x13).

Интерпретация результатов ИГХ и CISH исследования Все окрашенные слайды проходили автоматизированное сканирование на сканере для гистологических препаратов Mirax MIDI (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). Полученные цифровые графические образы препаратов хранились на серверной станции Fujitsu Celsius R570-2. Для просмотра и анализа использовалась компьютерная программа Pannoramic Viewer 1.14.50 (3DHISTECH Ltd, Венгрия).

Для маркеров Ki-67 и топоизомераза-II-а результат записывался в виде числа позитивно окрашенных ядер на 100 опухолевых клеток (в процентах). Далее при статистической обработке полученные проценты были переведены в дихотомическую оценку с пороговым уровнем позитивного заключения в >10%.

Оценка реакции на маркер цитокератин №20 (CK20) проводилась с помощью общепринятых критериев (Desai S., Lim S.D., Jimenez R.E. et al., 2000).

Для последующей статистической обработки случаи с окрашиванием клеток, отличных от зонтичных, считались положительной реакцией, а остальные - отрицательной.

Реакция на Е-кадгерин, CD44V6 и Бета-катенин расценивалась как негативная (- нет реакции, отдельные позитивные клетки c секторальной мембранной реакцией), гетерогенная (до 25% с циркулярной мембранной реакцией или любое количество клеток с частичной, секторальной мембранной реакцией), позитивная реакция (более 25% клеток с циркулярной мембранной реакцией, визуально не отличающейся от реакции в нормальном уротелии). При дальнейшем анализе и статистической обработки результатов случаи с гетерогенной реакцией и негативной реакцией были объединены в одну подгруппу со сниженной экспрессей указанных маркеров.

При анализе реакции на белки p53 и p63 нами использовались критерии с дихотомической системой оценки. Позитивной реакцией считалась в случае интенсивного окрашивания ядер в более чем 25% клеток.

ИГХ оценка экспрессии HER2 осуществлялась согласно критериям DAKO HercepTestЩ (Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Рязанцева А.А., Франк Г.А., 2011). При проведении CISH реакции ген c-ERB-B2 считался амплифицированным, если среднее число меток превышало 6 при их подсчете в 60 ядрах опухолевых клеток.

Статистическая обработка полученных данных Статистическая обработка проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ SPSS Statistics 17.0. При сравнении величин использовались статистические критерии Кси-Квадрат и Фишера, тесты МаннаУитни, Краскела-Уоллиса, Спирмена. Сравнение безрецидивной выживаемости проводилось с помощью кривых Каплана-Майера с тестом Log-Rank.

Многофакторный анализ проводился с помощью регрессионного анализа по Коксу. Во всех сравнениях пограничный уровень значимости установлен при p=0,05. Графический анализ и представление данных проводились с помощью программы Microsoft Office Excel 2003 и SPSS Statistics 17.0.

Результаты исследования и их обсуждение В процессе исследования проанализированы 328 случаев урокарциномы мочевого пузыря у пациентов, оперированных в РКОД МЗ РТ в 2003 - 2010 годах.

Чувствительность цитологического исследования в 1-й группе пациентов оказалась крайне низкой. Результат в 17,8% оказался значительно ниже, чем в среднем по литературным данным (30-50%) (Van Rhijn B., van der Poel H., van der Kwast T., 2005; Mishriki S., Molokwu C., Sweeney C. et al., 2010). Имея результат чувствительности в 38%, эти авторы делают выводы о возможности отказа от этого метода в диагностике первичного рака мочевого пузыря (Mishriki S., Molokwu C., Sweeney C. et al., 2010).

Анализ рецидивирования заболевания в 1-й группе пациентов не показал однозначной связи между стадией и степенью анаплазии опухоли и частотой рецидивирования. В среднем рецидив развился в 24,5% пациентов, со средним сроком до рецидива 13,83 месяца. В литературе значимым фактором более плохого прогноза рецидивирования являлся минимально-инвазивный рак Т(Sylvester R.J., van der Meijden A.P., Oosterlinck W. et al., 2006). По нашим результатам, ни стадия Т1, ни даже Т2, не ассоциированы с более высокой частотой рецидивирования.

В одной из недавних публикаций (Fernandez-Gomez J., Madero R., Solsona E. et al., 2011) используемая шкала оценки риска для немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (EORTC risk tables) (Sylvester R.J., van der Meijden A.P., Oosterlinck W. et al., 2006) не прошла проверку. Авторы признали, что, по крайней мере, для некоторых пациентов данная шкала завышает предполагаемый риск рецидивирования. Наши наблюдения также ставят под сомнение возможность безоговорочного глобального применения этой шкалы и подтверждают актуальность поиска других признаков урокарциномы, обладающих предсказательной значимостью для рецидивирования в реальных условиях.

Результаты цитогенетического исследования (FISH метод) и их обсуждение В нашем исследовании FISH диагностика продемонстрировала высокую чувствительность (88%). Выявлено однозначное увеличение чувствительности с ростом стадии и степени анаплазии опухоли. Значимые различия выявлены при изменении степени дифференцировки опухоли. В целом формализованная оценка метода UroVysionо показала высокую чувствительность диагностики рака мочевого пузыря даже при самых начальных формах Ta и G1 (минимум 70%).

При анализе дополнительных параметров FISH диагностики в настоящей работе выявлен рост частоты (среднего число клеток с мутациями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий с увеличением стадии и степени дифференцировки опухоли. Обращает на себя внимание ступенчатое увеличение частоты аномалий при переходе от поверхностного рака Ta, T1 к мышечно-инвазивному раку Т2, а также от степени анаплазии G1, G2 к степени G3.

Отмеченные в результатах различия в характере изменений локуса 9р21 могут свидетельствовать о переходе мутаций этого локуса от преимущественной потери (для клеток опухолей Та, Т1 и G1, G2) к увеличению числа копий этого локуса (в опухолях T2 и G3). Следовательно, наличие клеток с потерей одного или двух локусов 9р21 может отражать неинвазивный характер опухоли с низкой степенью анаплазии клеток. Наши данные соотносятся с результатами других исследователей (Richter J., Jiang F., Gorog J.P. et al., 1997), где выявлены статистически значимые различия. Этот факт, в свою очередь, позволяет предположить низкий риск прогрессирования у этих пациентов. В других исследованиях (Бабаян А.Ю., Башкатов С.В., Карякин О.Б. и др., 2009; Degtyar P., Neulander E., Zirkin H. et al., 2004) было показано, что потеря локуса 9ркоррелирует с развитием ранних рецидивов в течение первого года наблюдения. В локусе 9р21 кодируются несколько белков, однако основную роль в механизмах канцерогенеза в уротелии отводят белку P16, являющемуся белком супрессором и одним из регуляторов контрольной точки G1 клеточного цикла.

В ходе обработки полученных результатов нами предпринята попытка выяснить предсказательную значимость определения числа клеток с абберациями хотя бы по одной метке по отношению к стадии и степени анаплазии опухоли. А именно за неблагоприятный прогноз были выбраны наличие инвазии опухоли в мышечный слой (стадия T2) и наличие опухоли G3. Согласно результатам вычислений порог в 40% мутированных клеток обладает наибольшей отрицательной предсказательной значимостью по обоим критериям. На практике это позволит с вероятностью более 90% исключить инвазию в мышечный слой и низкодифференцированный характер опухоли у пациентов, имеющих менее 40% клеток с мутациями хотя бы по одной метке по результатам FISH диагностики.

Подобный подход к оценке результатов FISH теста был описан ранее (Севанькаев А.В., Лушников Е.Ф., Карякин О.Б. и др., 2008), где все пациенты с наличием более 25% клеток с полисомией по 3, 7 и 17 хромосомам относились к опухолям высокой степени злокачественности (классификация ВОЗ 2004). Однако авторами не проведена проверка статистической значимости их наблюдения.

Забор промывных вод возможен при первой цистоскопии до операции.

Поэтому крайне заманчивой является возможность выявить пациентов с опухолями высокого риска рецидивирования и прогрессирования уже на этом этапе. Это поможет более дифференцированно и обоснованно провести интраоперационную внутрипузырную химиотерапию, раннюю повторную ТУР и адьювантную внутрипузырную терапию.

Части пациентам из FISH группы было проведено цитогенетическое исследование на этапе послеоперационного наблюдения (26 пациентам из 51).

Рецидив в этой группе был зафиксирован в 14/51 случаях (27,5%), в то время как послеоперационный FISH тест дал положительный результат в 16/26 случаев (61,5%). Этому находится как минимум два объяснения. Во-первых, нам кажется возможным наличие у некоторых пациентов резидуальных мелких опухолей, которые могут оставаться клинически незначимыми долгое время после операции, либо вообще со временем элиминироваться собственной иммунной системой. Вовторых, воспалительные явления и процессы интенсивной регенерации и активной пролиферации в уротелии могут стать причиной появления клеток с генетическими отклонениями от нормы.

В целом согласно результатам нашего исследования отрицательный результат FISH после операции не исключает развития рецидива, также как и положительный результат не ассоциирован с бльшим риском развития рецидива после операции.

При прямом сравнении параметров FISH исследования промывных вод, взятых до и после операции, нами выявлено значимое уменьшение числа клеток с абберацией по каждой метке в отдельности и всем меткам вместе. Также значимым оказалось увеличение среднего числа сигналов от локуса 9p21 после операции, в то время как все остальные метки (центромерные) показали незначимое уменьшение среднего числа сигналов в одной клетке. Это наблюдение также может указывать на различную природу клеток с мутациями до и после удаления опухоли.

В FISH группе пациентов мы также проследили безрецидивную выживаемость. Частота рецидивирования составила 27,5% (14/51 случаев). Это соотносится с результатами по 1-й группе. При сравнении безрецидивной выживаемости пациентов с разными результатами FISH исследования достоверных различий не выявлено. Однако общий вид кривых указывает на более благоприятный прогноз по рецидивированию для пациентов с отрицательным результатом FISH теста перед операцией и с количеством мутантных клеток в промывных водах 40%. Причем в последнем случае уровень значимости приблизился к порогу устойчивой тенденции (p=0,132).

Результаты молекулярно-генетического исследования (методы ИГХ и CISH) и их обсуждение В целом в 3-й группе пациентов рецидив был зафиксирован в 34 случаях из 103 (33%). Сводные данные по безрецидивной выживаемости пациентов этой группы в зависимости от результата молекулярного исследования представлены в таблице 1.

Результаты исследования молекулярных маркеров описаны согласно локализации типичной реакции и роли маркера в канцерогенезе. Ядерная экспрессия белков Ki-67, топоизомераза-II-a и мутантного белка р53 в целом увеличивалась с ростом стадии и степени злокачественности опухоли. Для всех этих маркеров оказалось характерным значимое увеличение экспрессии при переходе от неинвазивных опухолей Та к минимально инвазивным Т1. Для белков Ki-67 и топоизомераза-II-a проявилась четкая тенденция к увеличению экспрессии с ростом стадии и степени анаплазии со значимыми отличиями стадии Т2а от поверхностных опухолей Та и Т1. Несмотря на схожие результаты ранее проведенных исследований (Casetta G., Gontero P., Russo R. et al., 1997; Gontero Р., Casetta G., Zitella A. et al., 2000), при их обобщении в ходе крупных мета-анализов пока нет убедительных доказательств предсказательной значимости этих маркеров (Malats N., Bustos А., Nascimento С.М. et al., 2005). Объективными причинами этому могут служить различия в критериях оценки иммуногистохимической реакции: от 10 до 50% окрашенных ядер для р53, от 10 до 50% клеток с позитивной ядерной реакции для Ki-67.

Таблица Сравнение среднего времени безрецидивного выживания по подгруппам в зависимости от результатов ИГХ и CISH исследования. Значимость приведена для Log-Rank теста Маркер л- результат, л+ результат, Значимость, среднее время, среднее время, p месяцы месяцы Her2 - ИГХ 19,59 0,92 15,50 1,78 0,0Her2 - CISH 19,67 0,95 15,76 1,86 0,0P53 17,42 1,04 20,36 1,70 0,3Топоизомераза-II-a 21,37 0,87 13,64 1,35 <0,0Ki-67 22,00 1,33 17,44 1,01 0,0P63 13,00 1,97 18,86 0,89 0,0CK20 21,83 1,08 15,81 1,00 0,0E-кадгерин 18,71 1,00 17,93 1,60 0,9Бета-катенин 16,14 1,15 19,16 1,21 0,2CD44v6 18,72 1,12 18,40 1,48 0,8В ходе анализа результатов послеоперационного наблюдения за пациентами 3-й группы не выявлено значимых различий во времени развития рецидива между пациентами с позитивной и негативной реакцией на белок p53. Это соотносится c результатами крупного мета-анализа 117 исследований за 10 лет (Malats N., Bustos А., Nascimento С.М. et al., 2005).

Белок топоизомераза-II-a является ферментом и кодируется геном на хромосоме в непосредственной близости от гена с-ERB-B2. Этот белок контролирует изменение топологического состояния ДНК в течение транскрипции и является мишенью химиопрепаратов группы антрациклинов (доксорубицин, эпирубицин и др.). Результаты нашего исследования продемонстрировали значимую ассоциацию гиперэкспрессии этого белка (при количественной и качественной оценке - порог 10%) c повышенным риском раннего развития рецидива, даже после исключения влияния других факторов, таких, как Grade, стадия заболевания и экспрессия белка Her2/neu и амплификация гена Her2.

Результаты предыдущих исследований маркера Ki-67 оказались неоднозначными. Согласно одним источникам (Shariat S.F., Ashfaq R., Sagalowsky A.I. et al. 2007) его сверхэкспрессия ассоциирована с укорочением безрецидивного периода у пациентов, перенесших радикальную цистэктомию. В других работах (Сафиуллин К.Н., Горбань Н.А., Карякин О.Б. и др., 2010) значимой зависимости безрецидивной выживаемости пациентов после ТУР от экспрессии Ki-67 выявлено не было. По нашим результатам, гиперэкспрессия Ki-67 значимо ассоциирована с укорочением времени до рецидива, как при количественной оценке этого параметра, так и при качественной (порог 10%).

Следующие два белка, р63 и цитокератин 20, являются примерами дифференцировочных маркеров. Интересными являются результаты исследования (Koga F., Kawakami S., Fujii Y. et al., 2003), свидетельствующие об уменьшении экспрессии белка p63 с ростом стадии урокарциномы, а отсутствие экспрессии является слабым предиктором плохого прогноза выживаемости. Согласно нашим результатам потеря экспрессии р63 во всех случаях происходила в инвазивных опухолях (Т1 и Т2) и в опухолях G3. Также при изолированной оценке экспрессии P63 пациенты с позитивной реакцией имели значимо более позднее развитие рецидива, чем пациенты с негативной реакцией. Однако при многофакторном анализе значимого различия в безрецидивной выживаемости выявлено не было, что может свидетельствовать о зависимости экспрессии P63 от степени дифференцировки опухоли.

Цитокератин 20 (CK20) выполняет функцию структурного белка цитоплазмы и участвует опосредовано в процессах регуляции клеточного цикла. Причем на экспрессию CK20 практически не влияет воспаление, лишь малигнизация меняет характер экспрессии этого белка (Morsi M.I., Youssef A.I., Hassouna M.E. et al., 2006). Согласно одному зарубежному исследованию (Barbisan F., Santinelli A., Mazzucchelli R. et al., 2008) позитивная реакция на CK20 ассоциирована с высокими величинами Grade и повышенным риском рецидивирования. Эта закономерность подтвердилась и в нашем исследовании. Частота экспрессии CKзначимо увеличивалась с ростом стадии заболевания и степени злокачественности опухоли. При многофакторном анализе безрецидивной выживаемости после исключения влияния других факторов пациенты с гиперэкспрессией CKпоказали значимо более раннее развитие рецидива.

В следующей группе маркеров, участвующих в процессах межклеточного взаимодействия, только мембранная экспрессия Бета-катенина показала различия в подгруппах пациентов с разной стадией и степенью анаплазии опухоли. Все три маркера Е-кадгерин, В-катенин и CD44v6 не показали связи между характером их экспрессии и временем до развития рецидива.

Интерес исследователей к самому изученному белку семейства рецепторов эпидермального фактора роста Her2 обусловлен в первую очередь успехами таргетной терапии рака молочной железы с помощью трастузумаба. В настоящее время проходят клинические исследования этого препарата при урокарциноме мочевого пузыря. Первые результаты показали ответ на лечение в 70% случаев распространенного рака мочевого пузыря: 11% - полное исчезновение ракового очага и 59% - частичное исчезновение ракового очага (Hussain M.H.A., MacVicar G.R., Petrylak D.P. et al., 2007). Оценка активности этого белка в нашем исследовании проведена несколькими методами, освещающими различные уровни регуляции его синтеза. При анализе экспрессии Her2 методом ИГХ и теста на выявление амплификации гена ERBB2 методом CISH выявлено ожидаемое увеличение интенсивности реакции (ИГХ) и частоты амплификации (CISH) с ростом стадии и степени анаплазии опухоли. И хотя значимые различия выявлены только для подгрупп с разной степенью анаплазии (Grade), оба теста показали скачкообразное повышение частоты позитивного результата с переходом опухоли к стадии Т2 и степени анаплазии G3. Это в целом соотносится с данными предыдущих исследований по этой теме (А. Gkhan, A. Serdar, D. Ayhan, 2007).

Согласно результатам одного исследования (Simonetti S., Russo R., Ciancia G., et al., 2009) гиперэкспрессия Her2 при ИГХ исследовании почти всегда ассоциирована с наличием амплификации гена c-ERB-B2 по результатам FISH исследования. Совершенно противоположные результаты приводят в своей статье другие авторы (Caner V., Turk N.S., Duzcan F. et al., 2008). При сопоставлении случаев с гиперэкспрессией Her2 (метод ИГХ) и амплификацией гена c-ERB-B(метод CISH) нами не выявлена четкая связь между этими событиями.

Также проведено сравнение результатов FISH исследования по центромерной метке 17 хромосомы и результатов тестов на Her2. Гиперэкспрессия Her2 и амплификация c-ERB-B2 ассоциированы с увеличением числа клеток с гиперплоидией по 17 хромосоме и числа копий хромосом 17 в одной клетке.

Такой результат может говорить как о плохой достоверности метода CISH при раке мочевого пузыря, так и о более важном значении в реализации гиперэкспрессии Her2 высоких уровней транскрипционных факторов (Latif Z., Watters A.D., Dunn I. et al., 2004), по сравнению с ролью амплификации самого гена c-ERB-B2 (Kruger S., Weitsch G., Buttner H. et al., 2002).

Данные о влиянии гиперэкспрессии Her2 и амплификации гена c-ERB-B2 на риск рецидивирования и прогрессирования противоречивы. По результатам нашего исследования позитивный результат на Her2 (ИГХ) без учета влияния других факторов значимо ассоциирован с более ранним развитием рецидива рака мочевого пузыря. Амплификация гена ERBB2 также ассоциирована с более ранним развитием рецидива, хотя значимость различий при однофакторном анализе находится на уровне тенденции (p=0,063).

Результаты многофакторного анализа безрецидивной выживаемости При проведении многофакторного анализа исследуемых клинических параметров опухоли значимое влияние на безрецидивную выживаемость выявлено только для степени анаплазии Grade (таблица 2).

Результаты формализованного FISH теста до операции не показали влияния на время до развития рецидива. При анализе отдельных параметров FISH теста как независимых факторов значимые ассоциации были выявлены для 6 параметров:

число клеток с анеуплоидией по 3 и 17 хромосоме и число копий каждой из меток. Однако только для параметров числа копий каждой из меток величина относительного риска отличалась от 1 (единицы) более чем на 10%, делая эти факторы клинически значимыми.

Таблица Регрессионный анализ влияния клинических факторов рака мочевого пузыря на рецидивирование заболевания 95,0% CI для RR Стат. Значимость, Относ.

Фактор Вальд p риск, RR * Нижняя Верхняя Локализация опухоли 1,952 0,162 1,274 0,907 1,7Максимальный размер 1,047 0,306 0,781 0,486 1,2Стадия T 2,064 0,151 1,696 0,825 3,4Grade 13,848 <0,001 4,879 2,117 11,2Интраопер. химиотерапия 0,220 0,639 0,803 0,320 2,0FISH (до операции) +/- 0,360 0,549 1,785 0,269 11,8Примечание: * Здесь и в таблице 3 RR - величина, отражающая относительный риск развития рецидива раньше в одной группе в сравнении с другой группой по данному фактору. <1 - снижение риска, >1 - увеличение риска.

Число сигналов по каждой из меток значимо ассоциировано со значительным изменением относительного риска рецидивирования (от 0,255 до 9,5). Причем увеличение числа 7 и 17 хромосомы приводило к значимому увеличению риска рецидива, а увеличение числа 3 хромосомы и локуса 9р21 - к значимому снижению риска рецидивирования. Согласно раннему исследованию по этой теме (Watters A.D., Ballantyne S.A., Going J.J. et al., 2000) анеуплоидия по 7 и хромосомам обладает предсказательной значимостью по отношению к рецидивированию урокарциномы мочевого пузыря. Относительный риск для рецидивирования в этой работе составил 3,62, что в целом соотносится с нашими результатами (9,5 для 7-й и 4,7 для 17-й хромосомы), однако надо отметить, что авторы не нашли связи Grade или Stage с риском рецидивирования для их выборки пациентов. Выявленная нами зависимость может быть объяснена генами, расположенными на этих хромосомах. На 7 хромосоме расположен известный проонкоген EGF-R (ген рецепторов эпидермального фактора роста), а хромосома 17 несет другой онкоген c-ERB-B2 (Her2/neu). Некоторые авторы (Watters A.D., Ballantyne S.A., Going J.J. et al., 2000) связывают повышение риска рецидивирования с гиперактивностью именно этих генов, что может быть следствием гиперплоидии по хромосомам 7 и 17. Однако полного согласия касательно связи полисомии по 17 хромосоме с риском рецидивирования нет (Thgersen V., Srensen B., Poulsen S. et al., 2001).

Обратная зависимость относительного риска рецидивирования и числа копий 3 и 9 хромосомы (локуса 9р21) можно объяснить наличием большого числа генов супрессоров опухолевого роста на них. Так, на хромосоме 3 находятся сразу несколько таких генов: VHL, RIITGFB, RASSF1, CATNB, MLH1 и FHIT.

Применительно к раку мочевого пузыря большинство исследований выявили связь развития урокарциномы с потерей генов RASSF1 (Chan M.W., Chan L.W., Tang N.L. et al., 2003) и FHIT (Wada T., Louhelainen J., Hemminki K. et al., 2001). В локусе 9р21 локализуются гены нескольких белков-супрессоров p16, pи p15, однако главную роль в развитии ранних форм урокарциномы отводят потере именно p16.

По результатам многофакторного анализа с включением ИГХ маркеров, ассоциированных согласно предварительному анализу с риском рецидивирования, значимым осталось влияние лишь трех из них (CK20, топоизомераза-II-а и Ki-67) (таблица 3).

Таблица Влияние некоторых молекулярно-генетических маркеров по результатам CISH и ИГХ исследования на время до рецидивирования заболевания Ст.

Стат. Значимость, Относ.

Фактор ошибка Вальд p риск, RR Her2 - CISH 2,5387 0,5459 0,1111 2,38Her2/neu - ИГХ 0,5134 0,4332 0,4737 1,36Топоизомераза-II-a 8,5744 0,0143 0,0034 1,14P63 2,5425 0,6176 0,1108 0,37Ki-67 4,5682 0,0099 0,0326 1,17CK20 3,5815 0,3604 0,0484 2,99Примечание: Значения р <0,05 выделены жирным шрифтом.

Для отражения удельного вклада в формирование риска рецидивирования для каждого пациента были использованы величины статистики Вальда. В случае положительного заключения по Ki-67, топоизомеразе-II-a и CK20 данному случаю присваивалось 4,57, 8,57 или 3,58 условных баллов соответственно. Далее подсчитывалась сумма полученных баллов для каждого случая, которая и соответствовала предсказательному индексу (ПИ). Максимально возможное количество баллов (16,72) было разделено на 3 равных отрезка. Таким образом, сформированы 3 подгруппы пациентов с суммарным ПИ в пределах 0 - 5,(подгруппа 1), 5,51 - 11 (подгруппа 2) и 11,01 - 16,72 (подгруппа 3). Графики безрецидивной выживаемости для подгрупп пациентов с различными величинами ПИ представлены на рис. 1.

Рис. 1. Безрецидивное выживание для групп пациентов с различным уровнем ПИ.

Метод Каплана-Майера. Значение p дано для Log Rank теста.

Разработанная нами модель индекса показала значимую независимую предсказательную силу. Использование всего 3 иммуногистохимических маркеров позволяет стратифицировать риски раннего развития рецидива у пациента после ТУР. Пациенты из 1 и 2 подгруппы по ИГХ индексу не имели рецидива заболевания в течение первых 6 месяцев после операции. Это позволяет предположить возможность изменения плана послеоперационного наблюдения за этими пациентами с отсрочкой в выполнении первой контрольной цистоскопии до срока 6 месяцев. Для окончательного подтверждения такого подхода необходимо дальнейшее исследование с включением группы проспективного сравнительного наблюдения.

ВЫВОДЫ 1. FISH диагностика промывных вод с помощью набора UroVysionо и критериев оценки, рекомендуемых производителем, обладает высокой чувствительностью при различной стадии и степени анаплазии урокарциномы мочевого пузыря.

2. Частота и глубина хромосомных аномалий значимо возрастает с увеличением стадии и степени анаплазии опухоли. Для поверхностных опухолей повреждение локуса 9р21 чаще происходит в виде потери одного или двух его аллелей, в то время как для инвазивных опухолей более характерна гиперплоидия по этому локусу.

3. Результат формализованного FISH теста до и после операции не обладает предсказательной значимостью по отношению к рецидивированию урокарциномы мочевого пузыря после ТУР. Однако при многофакторном анализе увеличение числа копий 7 и 17 хромосом было значимо ассоциировано с увеличением риска рецидивирования, а хромосом 3 и локуса 9р21 - со снижением риска рецидивирования.

4. Гиперэкспрессия белка Her2/neu и амплификация гена c-ERB-B2 являются частыми событиями при раке мочевого пузыря (до 42% и 70% при опухолях Ти G3 соответственно). Оба этих события значимо ассоциированы с ростом частоты анеуплоидии по 17 хромосоме и числа копий 17 хромосомы.

5. Гиперэкспрессия белков топоизомераза-II-a, Ki-67 и цитокератин №20 является независимым значимым предиктором рецидивирования урокарциномы мочевого пузыря после ТУР. Использование этих ИГХ маркеров позволяет точнее стратифицировать риск рецидивирования и индивидуализировать лечебный подход и схему наблюдения за пациентами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Традиционная холодная щипковая биопсия не дает полной информации о морфологическом характере всей опухоли и всех участков опухолевого роста.

При выявлении в ходе первичной цистоскопии опухоли больших размеров, на широком основании, с мультифокальным ростом или непапиллярной структуры рекомендуется проведение FISH диагностики. При выявлении менее 40% генетически аномальных клеток инвазия в мышечный слой и низкодифференцированный характер опухоли крайне маловероятны. Также в этой группе пациентов представляется оправданным отказ от проведения ранней повторной ТУР при условии удовлетворительного качества операционного гистологического материала (наличие мышечного основания в материале).

2. Схему послеоперационного наблюдения за пациентами после ТУР следует индивидуализировать с помощью предсказательной модели, основанной на ИГХ маркерах топоизомераза-II-a, Ki-67 и цитокератин №20. У пациентов со значением предсказательного индекса 11 баллов или менее представляется оправданным отказ от проведения первой контрольной цистоскопии на сроке месяца. Значение предсказательного индекса более 11 баллов является дополнительным показанием для проведения адъювантной внутрипузырной иммунотерапии.

3. В практике онкоморфолога дополнительные молекулярные и генетические исследования маркеров при опухолях разной локализации должны проводиться с использованием технологии тканевых мультиблоков (технология Tissue Microarray). Это особенно важно при проведении научных клинических исследований.

4. Полученные данные о характере экспрессии белка Her2/neu, амплификации гена c-ERB-B2 и изменения числа копий 17 хромосомы в урокарциноме необходимо применять в будущем для планирования таргетной терапии при уротелиальном раке различной локализации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Малхасян, К.А. Наш опыт FISH диагностики рака мочевого пузыря / К.А.

Малхасян, М.Ю. Ульянин, Э.Ф. Абдрахманов, С.В. Петров, Р.Ш. Хасанов // Креативная Хирургия и Онкология. - 2010. - №4. - C. 60-62.

2. Малхасян, К.А. Использование метода флюоресцентной in situ гибридизации в цитогенетической диагностике уротелиальной карциномы мочевого пузыря / К.А. Малхасян, С.В. Петров, М.Ю. Ульянин, Э.Ф. Абдрахманов, Р.Ш. Хасанов // Вопросы онкологии. - 2011. - Т.57. - №4. - С.462-469.

3. Малхасян, К.А. Использование системы UroVysionо для оценки цитогенетических аномалий в клетках урокарциномы / К.А. Малхасян, М.Ю. Ульянин, Э.Ф. Абдрахманов, С.В. Петров, Р.Ш. Хасанов // Вопросы онкологии. - 2011. - №57(57). - Приложение 1. - С.45-46.

4. Малхасян, К.А. Значение иммуногистохимических маркеров в прогнозировании рецидивирования первичного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции / К.А. Малхасян // Врач-аспирант. - 2011. - T.49. - №6.1. - С.185-194.

5. Petrov, S. Cytogenetic Diagnosing of Bladder Urothelial Carcinoma using Fluorescent in situ Hybridization / S. Petrov, K. Malkhasyan, R. Khasanov // Virchows Archiv. - 2011. - Vol.459. - Supp.1. - p.S291.

6. Малхасян, К.А. Цитологическая диагностика поверхностного рака мочевого пузыря в современной практике / К.А. Малхасян, Р.Ш. Хасанов, С.В.

Петров, Э.Ф. Абдрахманов, М.Ю. Ульянин, Р.С. Гилязов // Материалы IV Конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2009. - С. 101102.

7. Малхасян, К.А. Оценка точности гистологического исследования и использования некоторых иммуногистохимических маркеров при раке мочевого пузыря после трансуретральной резекции / К.А. Малхасян, С.В.

Петров, М.Ю. Ульянин, Э.Ф. Абдрахманов, Р.Ш. Хасанов // Материалы VI Конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2011. - С. 179180.

8. Малхасян, К.А. Анализ параметров генетических нарушений клеток уротелиального рака методом флюоресцентной гибридизации in situ / К.А.

Малхасян, С.В. Петров, М.Ю. Ульянин, Э.Ф. Абдрахманов, Р.Ш. Хасанов // Новости клинической цитологии. - 2011. - Т.15. - №1-2. - С.17-23.

______________________________________________________ Подписано в печать 16.04.2012. Форм. бум. 60х80 1/16.

Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ № 1604/4.

Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии Вестфалика (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-______________________________________________________ Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине