Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное  

На правах рукописи

ПРОКОПЕНКО

ВАЛЕНТИНА МИХАЙЛОВНА

ПРО-  И  АНТИОКСИДАНТНАЯ  СИСТЕМЫ

ПРИ  ДИСФУНКЦИИ  ПЛАЦЕНТЫ

03. 01. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в Научно- исследовательском институте

акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта  Северо-Западного отделения

Российской академии медицинских наук

  Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Арутюнян А.В.

доктор медицинских наук, профессор  Павлова Н.Г.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Ещенко Наталья Дмитриевна

Доктор биологических наук, профессор  Зыбина Наталья Николаевна

Доктор медицинских наук, профессор  Галебская  Людвига Вячеславовна

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится  л____   ___________2011 в___часов на заседании Диссертационного совета  Д 001. 022. 03  при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

  С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН

  Автореферат разослан л__________________2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор Пучкова Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Плацента представляет собой орган, который играет динамичную роль в процессах взаимодействия  двух организмов - матери и плода.  Высокий темп развития плаценты, растущие потребности плода сопровождаются особыми требованиями к метаболическим процессам,  лежащим  в основе функциональной деятельности плаценты. Исследование особенностей метаболических процессов в развивающейся при физиологической беременности плаценте дает представление о путях их координации в функциональной системе мать-плацента-плод. Один  из  таких фундаментальных механизмов биохимической адаптации, наблюдаемым  в физиологических условиях и при акушерской патологии,  обеспечивающим  регуляцию метаболических процессов в плаценте, связан с системами генерации активных форм кислорода и функциональным состоянием многокомпонентной антиоксидантной защиты (М.В Федорова, 1986;  R. F.Del Maestro, 1980; C.V. Smith1, 1992; A. Van der Vliet, A. Bast, 1992). 

Физиологическая беременность характеризуется развитием  окислительного стресса,  являющегося одним из центральных механизмов общей системы адаптации к новым условиям организма женщины,  при  котором наблюдается сбалансированное состояние на более высоком уровне прооксидантной и антиоксидантной систем. При физиологически протекающей беременности состояние окислительного стресса  возникает в период формирования артериальной циркуляции и увеличения напряжения кислорода в плаценте. Окислительный стресс выполняет в этой ситуации важные физиологические функции, участвуя в запуске механизмов дифференцировки клеток (Ю.Э. Доброхотова и соавт., 2008). В кратковременный период относительного дисбаланса между генерацией и элиминированием активных форм кислорода (АФК) происходит адаптация механизмов системы антиоксидантной защиты  к нарушению физиологического равновесия.  Неспособность системы антиоксидантной защиты (АОЗ) противостоять усилению процессов свободнорадикального окисления приводит к значительному ослаблению метаболической и детоксицирующей функций плаценты.

В последнее время постоянно растет количество работ, посвященных роли систем генерации активных форм кислорода и антиоксидантной системы в формировании метаболических и детоксицирующих функций плаценты (Т.Н. Погорелова и соавт.,1998, 1999; И.И. Крукиер, 2003; А.В. Шестопалов, 2002; А.В. Арутюнян и соавт., 2010).  Наиболее полно представлены в литературе данные о соотношении антиоксидантной и прооксидантной систем в плаценте  женщин, беременность которых осложнена гестозом (A.C. Staff et al.,1999; R. Madazli et al., 2002; K.A. Boggess et al., 2003; M.T. Raijmakers et al., 2004). Тем не менее, многие вопросы, связанные с развитием дисфункции плаценты в условиях окислительного стресса на протяжении беременности, еще весьма далеки от разрешения.

В  литературе практически отсутствуют сведения  о соотношении систем образования АФК и их элиминации на этапах беременности  в  разных  участках плаценты  (центральный и периферический) при  акушерских и экстрагенитальных заболеваниях беременных. Центральная зона плаценты, по данным J.Hempstock et al. (2003), лучше оксигенирована, чем периферия, благодаря направлению потока материнской крови. Однако, по мнению авторов, центральные ворсины по сравнению с периферическими характеризуются  большей морфологической незрелостью, что может свидетельствовать о функциональных особенностях и значимости  центрального и периферического участков  плаценты при ее дисфункции. 

  Антиоксидантную систему организма  рассматривают как  многокомпонентную систему, проявляющую специфическую и неспецифическую активность (Н.К.Зенков, 2001), а также как единую, интегрируемую и регулируемую структуру, находящуюся под генетическим контролем (В.В. Соколовский, 1988; Е.Е. Дубинина, 2006;  E.M Berry, R. Kohen, 1999; X.L. Wang et al., 2001). Наиболее важным и эффективным звеном антиоксидантной защиты является система антиоксидантных ферментов:  супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза,  глутатионредуктаза,  глутатион-S-трансфераза.

  Глутатионзависимое звено антиоксидантной системы  осуществляет разрушение перекиси водорода, восстановление нестойких органических гидропероксидов в стабильные соединения - окси-кислоты, а также защищает клетки от продуктов перекисного окисления липидов посредством их восстановления. К этому звену относят глутатионпероксидазу (КФ 1.11.1.12), глутатионредуктазу (КФ 1.6.4.2), глутатион-S-трансферазу (КФ 2.5.1.18) и систему глутатиона. Глутатионзависимое звено антиоксидантной системы  является частью системы ферментов детоксикации ксенобиотиков.  Гены суперсемейства глутатион-S-трансфераз (М1, Т1 и Р1) контролируют синтез ферментов второй фазы детоксикации и характеризуются значительным популяционным полиморфизмом.

  Сведений об активности глутатионзависимой антиоксидантной системы  и  вкладе генетической составляющей в изменение буферной емкости глутатионзависимого звена антиоксидантной системы в плаценте при невынашивании беременности малочисленны и неоднозначны. Оценок генетической вариабельности полиморфных локусов генов, вовлеченных в формирование глутатионзависимого звена АОС при самопроизвольном прерывании беременности, явно недостаточно (О.Н.Беспалова, 2001, 2009;  А. Hirvonen et al., 1996).

  Каскад нарушений  метаболизма в плаценте при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности  может служить моделью для изучения универсальных механизмов, представляющих собой срыв адаптационно-гомеостатических реакций  поддержания адекватного обмена между организмами матери и плода  (Т.И. Погорелова и соавт., 1997; В.Е. Радзинский, П.Я.Смалько, 2001).

  Целью исследования явилась комплексная оценка состояния про- и антиоксидантной систем  плаценты  при физиологической беременности и акушерской патологии, сопровождающейся дисфункцией плаценты, приводящей к невынашиванию беременности, для  выявления значения  генерации активных кислородных метаболитов и ферментативного звена антиоксидантной защиты в развитии плацентарной недостаточности.

Задачи исследования:

1.  Провести сравнительную оценку  интенсивности свободнорадикального окисления  и ферментативного звена антиоксидантной  защиты  в  митохондриях  плаценты при физиологически  протекающей беременности  и  невынашивании беременности. 

2. Исследовать механизм генерации активных форм кислорода в постмитохондриальной фракции плаценты.

3. Провести  сравнительную оценку интенсивности хемилюминесценции, содержания продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в постмитохондриальной  фракции плаценты при физиологической беременности и  невынашивании.

4. Исследовать активность NO-cинтазы и миелопероксидазы в центральной и периферической областях  плаценты на протяжении физиологической беременности и при невынашивании.

5. Сопоставить величины общей антиокислительной активности, активности ферментативного звена антиоксидантной системы в центральной и периферической областях плаценты при физиологическом течении беременности и невынашивании.

6. Исследовать состояние глутатионзависимой антиоксидантной системы в центральной и периферической областях плаценты на протяжении физиологической беременности и при невынашивании.

7. Выявить  частоту встречаемости функционально ослабленных сочетаний генов семейства GST (GST P1, GST M, GST T) в плаценте женщин при невынашивании и выяснить зависимость  между вариантами генотипа GST P1 и уровнем активности ферментов глутатионзависимой антиоксидантной системы.

8.  Выявить значение системных нарушений  глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты плаценты в патогенезе невынашивания беременности.

9.  Оценить вклад прооксидантной и антиоксидантной систем плаценты в механизм патогенеза ее дисфункции, приводящего к акушерской патологии (невынашиванию беременности).

Научная новизна.

Установлены системные нарушения в функционировании антиоксидантной и прооксидантной систем плаценты при ее дисфункции.

  Впервые проведено комплексное исследование состояния прооксидантной и антиоксидантной  систем плаценты у женщин при физиологическом течении беременности и при  невынашивании. Показано, что спонтанное  преждевременное прерывание беременности происходит в условиях развития окислительного стресса в митохондриях и постмитохондриальной фракции периферийного участка плаценты, где на фоне повышения уровня интенсивности процессов пероксидации наблюдается  недостаточное увеличение общей  емкости антиоксидантной защиты и  ослабление вне зависимости от локализации ее глутатионзависимого звена.

Впервые  установлено, что  возникновение люминолзависимой хемилюминесценции в плацентах  женщин связано с  участием одновременно двух механизмов: СОД-зависимого (присутствие О2 и ОН  радикалов) и СОД-независимого (наличие гипохлоритного анион радикала). При самопроизвольном прерывании беременности отмечается существенное  уменьшение  реакций, протекающих по  СОД-независимому механизму, связанное с ограничением вовлеченности гипохлоритного анионрадикала в процессы свободнорадикального окисления в плаценте.

  Впервые выявлено  изменение содержания миелопероксидазы, катализирующей реакцию образования гипохлорита, в плацентах  при физиологически протекающей беременности и при невынашивании, возникшем на  разных сроках беременности.

  Показано, что снижение активности NO-синтазы в периферической части плацент женщин определяет снижение уровня защитно-приспособительных реакций, обеспечивающих течение беременности.

  Проведено комплексное исследование глутатионзависиной антиоксидантной системы при физиологическом течении беременности и при невынашивании. Впервые на основании определения активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты в плацентах и хорионах установлен  индекс преждевременного прерывания беременности, абсолютное значение  которого обратно пропорционально риску развития прерывания беременности.

Изучена встречаемость различных вариантов аллелей генов GST, кодирующих синтез глутатионзависимых ферментов в плацентах беременных женщин с самопроизвольным преждевременным прерыванием беременности, и впервые обнаружено, что невынашивание  беременности связано  с высокой частотой встречаемости функционально ослабленных сочетаний аллелей этих генов.

Впервые показано, что  на уровень активности глутатионпероксидазы в плаценте оказывает влияние наличие аллеля В в гене GST Р1, а активность  глутатион-S-трансферазы плаценты  имеет прямую зависимость с наличием аллеля А и отсутствием аллеля С в гене GST Р1. 

Научно-теоретическая и практическая значимость

Работа вносит существенный вклад в понимание патогенетических механизмов развития дисфункции плаценты и  дает углубленное представление о роли про - и антиоксидантных систем в особенностях ее формирования при невынашивании беременности. Проведенные исследования  позволяют оценить роль индивидуальных звеньев исследуемых систем в развитии дисфункции плаценты, сопровождающейся  усилением окислительного стресса и спонтанным преждевременным прерыванием беременности разных сроков.

  Представленная модель спонтанного преждевременного прерывания беременности позволяет оценить возможность исхода беременности от активности ферментов  глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты в центральной части плаценты: глутатионпероксидазы и  глутатион-S-трансферазы.

Полученные данные о снижении емкости глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты при невынашивании беременности являются основанием  для  научно обоснованной коррекции  метаболических и функциональных нарушений плаценты, что  позволит целенаправленно осуществлять профилактику осложнений у беременных.

Выявленные зависимости  активности глутатионзависимых ферментов от вариантов генотипа по гену GST Р1  предполагают дифференцированный подход при назначении  лечебных препаратов антиоксидантной терапии у женщин с угрозой прерывания беременности.

  Впервые предложено  использование быстрого, методически несложного метода хемилюминометрического анализа сыворотки крови  для  оценки эффективности лечения при угрозе прерывания беременности.  Показана диагностическая возможность использования показателей  хемилюминометрии в качестве дополнительных критериев для экспресс-диагностики дисфункции плаценты и контроля за эффективностью проводимого лечения при угрозе прерывания беременности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В митохондриях плаценты при самопроизвольном преждевременном прерывании  беременности наблюдается развитие окислительного стресса, который сопровождается усилением интенсивности прооксидантной системы и ослаблением функционирования  глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.
2. В постмитохондриальной фракции плаценты при неосложненном течении беременности и самопроизвольном досрочном ее прерывании наблюдается разная степень вовлеченности активных форм кислорода в процессы свободнорадикального окисления. При невынашивании беременности снижено участие гипохлоритного анионрадикала и оксида азота в процессах  СРО в плаценте.
3. Интенсификация  процессов липидной пероксидации в постмитохондриальной фракции периферического участка плаценты приводит к преждевременным родам.
4. Уровень миелопероксидазы и активности NO-синтазы в плаценте на протяжении беременности тесно связан с ослаблением защитной функции плаценты.
5. Развитие окислительного стресса в постмитохондриальной фракции плаценты при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности связано с изменением уровня активности глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты и нарушением сбалансированности про- и антиоксидантной систем.
6. Низкая активность глутатион-S-трансферазы в плаценте при невынашивании беременности обусловлена сочетанием функционально ослабленных аллелей генотипа  GST P1.

  Апробация работы и личный вклад автора.  Основные положения работы доложены и обсуждены на  следующих научных форумах:

• Научной сессии НИИ АИГ им. Д.О.Отта Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщин (Санкт-Петербург, 1993, 1994, 1999).
• Первом Северо-кавказском съезде акушеров-гинекологов (Ростов, 1994). 
• Международной конференции Clinical Chemiluminescence (Берлин, 1994).
• 5-th Annual mitting of the oxygen society (Сан-Франциско,  1994).
• 7-ом конгрессе Акушерство и гинекология стран Балтийского моря  (Санкт-Петербург, 1999).
• Российском форуме Мать и дитя (Москва, 2000; Казань,2007, Москва, 2010).
• Конференции с международным участием Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека (Смоленск, 2001, 2003).
• Научно-практической конференции Невынашивание беременности и недоношенный ребенок (Петрозаводск, 2002).
• Третьем съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
• Международном экологическом форуме Environment and human health (Санкт-Петербург,2003).
• Конференции Механизмы типовых патологических процессов (Санкт-Петербург, 2003, 2006).

Клинические наблюдения проводились в отделении патологии беременности НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель - проф., д.м.н. О.Н. Аржанова). Генетические исследования проводили в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней  НИИАГ им. Д.О. Отта  СЗО РАМН с участием автора (руководитель - член-кор. РАМН, проф. д.м.н. В.С. Баранов). Биохимические исследования были выполнены автором лично в лаборатории биохимии с клинико-диагностическим отделением НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель - проф., д.б.н. А.В. Арутюнян). Определение миелопероксидазы проводилось самостоятельно  на базе  лаборатории общей патологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (руководитель - проф., д.б.н. В.Н. Кокряков). Обработка, анализ и интерпретация полученных данных выполнены автором  лично.

Публикации.  По теме диссертации опубликовано  40 работ,  в том числе 15 статей - в изданиях, включенных в перечень  ВАК Минобрнауки РФ.

  Объем и структура диссертации. Текст  диссертации изложен  на  229  страницах  компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 422 источника, в том числе  134 отечественных и 288 зарубежных. Работа  иллюстрирована  24 таблицами и 30 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы  и методы исследования

В проспективное исследование были включены 192 беременные женщины.

  Группу сравнения составили 97 относительно здоровых  женщин, имевших физиологическую беременность.  У 10-ти из них беременность была прервана в I триместре беременности (до 13 недель) путем искусственного аборта по желанию женщины (I-я подгруппа), у 15 женщин - во II-ом триместре (до 28-ой недели) по социальным показаниям  методом интраамниального введения энзапроста (PG E2) (II -я подгруппа) и у 72 женщин беременность закончилась  срочными родами в 37-40 недель

( III-я подгруппа).

Основную группу составили 95 женщин, беременность которых прервалась самопроизвольно и преждевременно в сопоставимые сроки: 12 женщин - I-я подгруппа; 14 женщин - II -я подгруппа и 69 женщин - III-я подгрупп (28 - 36 недель).

  Средний возраст женщин основной группы составил 29,20,8 лет, группы сравнения  - 26,91,2 лет.

Все пациентки с урогенитальными инфекциями до наступления беременности получали специфическую антибактериальную терапию.

С угрозой прерывания беременности поздних сроков обследовано 95 пациенток в возрасте от 18 до 40 лет со сроком беременности от 24 до 36 недель и 12 небеременных женщин, которые составили 1-ую группу. Во 2-ю группу вошли 25 женщин с неосложненным течением беременности, 3-ью группу составили 20 женщин с угрозой прерывания беременности, получавших инфузии бриканила, 4-ую группу - 23 женщины, прошедшие курс лечения магне-В6 и 5-ую группу - 27 женщин, которым проводилось лечение электросном.

  Материалом для комплекса биохимических исследований служили гомогенаты хорионов (на ранних сроках беременности) и центрального и периферического участков плацент женщин выше представленных групп. В исследованиях  оценки степени риска невынашивания  при угрозе прерывания беременности поздних сроков использовали сыворотку крови.

Митохондриальная  фракция плаценты была получена методом дифференциального центрифугирования. Гомогенат ткани центрифугировали 15 минут при 750 g при 40С. Для осаждения митохондрий надосадочную жидкость центрифугировали при 10800 g  в  условиях соблюдения холодового режима.  В качестве среды выделения использовали 0.25 М раствор сахарозы, содержащий 1 мМ ЭДТА  (рН 7,4) (Johnson D., Lardy H, 1967).

Содержащая микросомы цитозольная фракция плаценты (постмитохондриальная фракция) была получена после последовательного центрифугирования гомогенезированной в ледяном буфере, содержащем 60мМ КН2РО и 105 мМ КСl (рН 7,4), ткани при 750 g и полученного супернатанта при 10800 g  в  условиях соблюдения холодового режима.

  Интенсивность ПОЛ оценивали по количеству ТБК-активных продуктов (малонового диальдегида - МДА), диеновых конъюгатов (ДК)  и по показателям Н2О2 - индуцируемой люминолзависимой хемилюминесценции (Л-ХЛ), измеряемой на хемилюминометре  Emilitte-1105 (Россия). В хемилюминометрических исследованиях регистрировали светосумму (СС) и высоту вспышки ХЛ (МВ), величины которых характеризуют интенсивность свободнорадикальных реакций и расходования свободных радикалов при их взаимодействии с эндогенными антиоксидантами биосубстрата (Арутюнян А.В. и соавт., 2000).  МДА определяли спектрофотометрически по интенсивности окраски комплекса, образующегося в результате взаимодействия малонового диацетальдегида с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты с максимум поглощения при 535 нм (Андреева Л.И. и соавт.,1988). Концентрацию ДК определяли в экстракте гептановой фазы спектрофотометрически при длине волны 232 нм (Путилина Ф.Е. и др., 2006).

  Уровень окислительной модификации белков оценивали по содержанию карбонильных производных аминокислот в белках. Метод основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков со специфическим  реагентом на карбонильные группы - 2,4-динитрофенилгидразином  -  с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически при длине волны  363 нм. Интенсивность окислительной модификации белков рассчитывали,  используя  коэффициент молярной экстинции 22 х 103 х М-1см -1(Levine R.L. et al., 1994, Дубинина Е.Е. и соавт., 1995).

Активность NO-синтазы (КФ 1.14.13.39)  определяли по количеству нитрита с помощью классической реакции Грисса  (Schmidt H.W., Kelm M., 1996). В качестве стандарта для калибровочной кривой использовался NaNO3 .

Содержание миелопероксидазы (МПО) определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.  Калибровочная кривая  строилась с использованием стандартного раствора МПО (Арутюнян А.В. и др., 2000; Mullane K.M. et al., 1985).

  Определение активности пероксидаз основано на измерении Н2О2 - зависимого окисления тетраметилбензидина. За единицу ферментативной  активности  (Е) принимали количество фермента, которое изменяет величину экстинции  на 1.0 в мин. (Кокряков В.Н. и соавт., 1982).

  Активность системы антиоксидантной защиты оценивали, определяя уровень антиоксидантной активности (АОА), содержание небелковых тиоловых групп и антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР) и глутатион-S-трансферазы (Г Т).

Для определения АОА использовали хемилюминесцентную реакцию рибофлавина в присутствии перекиси водорода и ионов двухвалентного железа. Измерение свечения осуществляли при 37о С в течение 2 мин. АОА выражали в относительных единицах (1 отн.ед. соответствует 1 мV) и рассчитывали по формуле  АОА=1-S1/S2 ,

где S - средняя величина светосуммы опытного (S1) или контрольного  (S2) образцов в относительных единицах  (Путилина Ф.Е. и соавт, 2006). Определение небелковых тиоловых групп осуществляли с помощью реактива Эллмана (Sedlak J., Lindsay R.H.,1968).  Активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы определяли с использованием системы, обеспечивающей восстановление нитросинего тетразолия (Чевари С. с соавт, 1985). Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена окрашенный комплекс (Королюк М.А.  и соавт.,1988). Активность глутатионпероксидазы определяли по методу Моина В.М. (1986), основанному на определении скорости окисления глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила, активность глутатионредуктазы определяли по убыли НАДФН в реакции с экзогенным окисленным глутатионом (Horn H.D., 1965). Определение активности глутатион-S-трансферазы основано на оценке скорости ферментативного образования  GS-2,4-динитробензола в реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (Арутюнян А.В. и соавт., 2000).

Уровень эндогенной интоксикации в плаценте оценивали по методу  Малаховой М.Я. (1995), определяя уровень веществ средней молекулярной массы (СММ) и содержание олигопептидов (ОП). Числовую величину веществ СММ представлял интегральный показатель оптической плотности, который рассчитывался как сумма экстинций на измеряемом отрезке длин волн и  равен площади под спектрограммой. Олигопептиды определяли в разбавленном центрифугате плаценты, используя метод  Lowry et al., 1951. Индекс интоксикации плаценты рассчитывали как произведение концентраций веществ СММ  и ОП и выражали в относительных единицах.

Для характеристики генов глутатион-S-трансферазы выделение ДНК проводили по стандартной методике Sambrook J. et al. (1989). Определение аллельных вариантов генов GSTT1 и GSTM1 проводили методом ПЦР. Определение аллельных вариантов генов GSTP1 проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом, используя специфические эндонуклеазы Bso MA1 (праймеры  GST p  1F и  GST p  2R) и BstFN1 (праймеры  GST p  3F и праймеры  GST p  4R)  согласно рекомендациям фирмы изготовителя эндонуклеаз (Сибэнзим, г.Новосибирск, Ферментас, Латвия). Продукты реакции после амплификации  и рестрикции разделяли в 7% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и анализировали в проходящем УФ свете  на трансиллюминаторе Macrovue (фирма Pharmacia LKB) с фиксацией посредством видео системы гель документации Gel Imager 2.

Статистическая обработка результатов исследования выполнялась с использованием стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica v.6.0, Microsoft Excel-2002). Для оценки статистической значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Стьюдента (t-критерий) после проверки характера распределения  с помощью теста Фишера, U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и Н-критерия Крускала-Уоллиса. Результаты оценивали как статистически значимые при р<0,05. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмэна с расчетом коэффициента ранговой корреляции. Использовались также методы факторного дисперсионного анализа (ANOVA) и множественного регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты в митохондриях плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах

В последние десятилетия одним из подходов для изучения изменений в процессах свободнорадикального окисления (СРО) биологических объектов, в частности митохондрий,  является измерение уровня интенсивности хемилюминесценции . Кинетика люминолзависимой ХЛ отражает кинетику образования и расходования АФК. Изменение интенсивности люминолзависимой ХЛ в митохондриях плаценты мы оценивали по интегральному показателю - светосумме вспышки.

  Результаты собственных исследований показали, что в митохондриях, выделенных из плацент женщин при поздних сроках невынашивания  (преждевременные роды), уровень интенсивности процессов свободнорадикального окисления в периферической части плаценты был выше на 24% (р<0,05), чем в митохондриях плацент женщин при физиологическом течении беременности, завершившейся родами в срок. Величина общей антиоксидантной активности (ОАА)  в митохондриях плацент центрального и периферического участков женщин при преждевременных родах превышала таковую в митохондриях плацент женщин с физиологически протекающей беременностью в 1,5 и 1,8 раз соответственно  (табл. 1).

  Вместе с тем, нами установлено, что уровень активности ГП в митохондриях плацент женщин при преждевременных родах  был ниже, чем таковой у пациенток с неосложненным течением беременности, завершившейся родами в срок (Рис. 1) Не выявлено изменений  в уровнях  активности СОД  в митохондриях плацент у женщин  обследованных групп.

  Таблица 1

Интенсивность хемилюминесценции и общей антиоксидантной активности в митохондриях плацент женщин при физиологической беременности, завершившейся родами в срок,  и при преждевременных родах

Подгруппы женщин	Интенсивность хемилюминесценции (отн. ед/мг белка)		Общая антиоксидантная активность (отн. ед)
	Центральный участок плаценты	Периферический участок плаценты	Центральный участок плаценты	Периферический участок плаценты
Преждевременные роды (n=8)	3500.1182.6^^	4514.8290.9*	1,6950,046*	2,164 0,114*^
Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок (n=8)	3429,6250,8	3652.2309.4	1,14 0,04	1,190,062

Примечание: * р<0,05  по отношению к  периферическому участку плацент женщин с

физиологической беременностью, завершившейся родами в срок;

^^р<0,01  по отношению к  периферическому участку плацент женщин с

преждевременными родами;

* р<0,05  по отношению к группе женщин с физиологической

  беременностью;

  ^ р<0.05  -  по отношению к центральной части плаценты

 

Рис.1. Активность глутатионпероксидазы в митохондриях плацент женщин  с физиологической беременностью, завершившейся родами в срок, и при преждевременных родах

Примечание: *р<0,05 дано по отношению к плаценте женщин с физиологическим течением беременности

Полученные данные свидетельствуют о том, что в митохондриях  плаценты при преждевременных родах наблюдается развитие окислительного стресса,  протекающее на фоне подъема активности прооксидантной системы митохондрий, выделенных из периферической части плаценты, и ослабления функционирования в них глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.

  Оценка  интенсивности процессов свободнорадикального окисления  в постмитохондриальной  фракции  плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах

  Механизмы появления АФК в клетке связаны не только с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей в митохондриях. Генерация АФК происходит при окислительно-восстановительных реакциях, протекающих с участием кислорода в различных субклеточных структурах клетки  (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006; Октябрьский О.Н., 2007). В микросомах наблюдается генерация АФК как результат функционирования гидроксилазной ферментативной системы с участием цитохрома Р-450 ( Арчаков А.И., 1975, 1998).

  Наши исследования показали, что величина Л-ХЛ в постмитохондриальной  фракции периферической части плацент у женщин с самопроизвольным преждевременным прерыванием беременности на 42% превышает интенсивность Л-ХЛ в плацентах женщин с неосложненным течением беременности, завершившейся родами в срок. В  центральной части плацент женщин обследованных подгрупп различий в интенсивности Л-ХЛ  не наблюдалось (табл.2).

Таблица 2.

Интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции в постмитохондриальной фракции плацент  женщин с физиологическим течением беременности и преждевременными родами

Подгруппы женщин	Область плаценты
	Центральная		Периферическая
	СС (отн. ед/мг белка)	МВ (отн.ед)	СС (отн. ед/мг белка)	МВ (отн.ед)
Преждевременные роды (n=20)	257.3525.84	3.50.5	102.2014.01**	3.00.4
Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок (n=16)	228.9837.12***	4.20.5*	59.714.09	2.60.4

Примечание: *р<0,05  по отношению к периферической части плаценты;

** р<0,01  по сравнению с физиологической беременностью

*** р<0,001  по отношению к  периферической части плаценты 

СС - светосумма,  МВ - максимальная вспышка.

  Интенсивность ХЛ, по данным ряда исследователей (Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Федорова Т.Н и соавт., 1991; Болдырев А.А., 2001), тесно связана с процессами развития перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификацией белков (ОМБ).

Как показали наши исследования при преждевременных родах в периферической области плацент отмечалось увеличение  на 62% (р<0.05) ТБК-активных компонентов (малонового диальдегида - МДА), представляющих промежуточные продукты процесса пероксидации липидов, по сравнению с таковыми в периферической области плацент женщин с неосложненной беременностью. Интенсивность окислительной модификации плацентарных белков в постмитохондриальной  фракции, определенная нами по уровню содержания карбонильных производных,  не отличалась как по периферии, так и по центру в плацентах женщин обследованных групп (табл.3).

Таблица 3.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и карбонильных производных белков в постмитохондриальной фракции плацент  женщин  с физиологическим течением  беременности  и при преждевременных родах

Подгруппы женщин	Участок плаценты	Содержание  МДА (нмоль/мг белка)	Содержание карбонильных производных (мкмоль/мг белка)
Преждевременные роды (n=20)	центр	4.180.52	1.960.34
	периферия	4.280.65*	2.220.28
Физиологическая беременность, завершившаяся родами (n=16)	центр	3.950.64	1.850.20
	периферия	2.640.3	1.740.13

Примечание: *р<0.05 дано по отношению к физиологической беременности

  Полученные нами результаты позволяют  полагать, что усиление процессов СРО в плацентах женщин при преждевременных родах в  28 - 36 недель связан преимущественно с  активацией процессов ПОЛ.

Механизм люминолзависимой хемилюминесценции в тканях плацент  женщин при преждевременных родах и физиологической беременности, завершившейся родами в срок

  Как известно, люминолзависимая хемилюминесценция (Л-ХЛ) связана с образованием супероксидного и гидроксильного и/или гипохлоритного радикалов (Владимиров Ю.А., 1989; 1998). Для того чтобы выяснить степень вовлеченности различных радикалов в процессы СРО в плацентах женщин, исследуемые с помощью ХЛ анализа, было изучено  влияние на интенсивность Л-ХЛ специфических ловушек АФК в экспериментах  in vitro: азида натрия, метионина, супероксиддисмутазы. Об участии в развитии Л-ХЛ гипохлорита - продукта окисления хлорида под влиянием миелопероксидазы (МПО) при взаимодействии с перекисью водорода, свидетельствует факт тушения ХЛ азидом натрия, который ингибирует активность МПО, и метионина, являющегося перехватчиком гипохлоритного анионрадикала (СОД - независимый механизм).  Развитие Л-ХЛ в присутствии О2 - и ОН радикалов ингибируется СОД (СОД-зависимый механизм) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние тушителей на люминолзависимую хемилюминесценцию в постмитохондриальной фракции плацент  женщин при физиологической беременности и преждевременных родах 

Подгруппы женщин	Участок плаценты	Ингибирующий эффект на Л-ХЛ, %
		СОД (250 мкг/мл)	Азид натрия (0.025 мМ)	Метионин (0,4 мкМ)
Преждевременные роды (n=8)	центр	52.54.5	15.61.9***	31.64.9*
	периферия	53.76.3	28.01.8***	33.63.2*
Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок ( n=8)	центр	49.44.6	59.58.2	50.2 3.4
	периферия	69.68.1	58.47.2	54.08.0

Примечание: *р<0.05, ***р<0.001  даны по сравнению с соответствующим  показателем в группе женщин с физиологической беременностью.

  Введение  СОД практически одинаково ингибировало интенсивность Л-ХЛ как в центральной, так и  периферической частях  плаценты женщин обследованных групп. Азид натрия ингибировал интенсивность  Л-ХЛ  в центральной и  периферической частях  плацент женщин с физиологическим течением беременности почти на 60%. У женщин, беременность которых окончилась преждевременными родами,  азид натрия ингибировал интенсивность ХЛ на 44 %  (р<0.001) в центральной части плаценты и на 30% (р<0.001) в периферическом участке слабее, чем в плацентах пациенток с неосложненной беременностью. Ингибирующий эффект метионина был выражен на 20% слабее в центральной и периферической областях плацент женщин при невынашивании.

  Для более полного представления о вкладе различных радикалов в процессы СРО в плацентах женщин, определяемые с помощью ХЛ анализа, исследовали влияние на интенсивность Л-ХЛ в плацентах женщин обследованных групп различных соединений, которые отличаются  между собой по структуре  и эффективности инактивации свободных радикалов (табл.5)

  Таблица 5

Величина I50  для низкомолекулярных ингибиторов люминолзависимой хемилюминесценции в постмитохондриальной фракции плацент  женщин  при физиологической беременности  и преждевременных родах

Соединение	Величина I50 (нмоль/мл)
	Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок (n=8)	Преждевременные роды (n=8)
Цистеин	290.091.0	340.075.0
Аскорбиновая кислота	300.065.0	250.060.0
НАДН	3.00.85	1.7 0.41
Таурин	23100.0930.0	18600721.0**
Мочевая кислота	0.0710.01	0.0280.009**
Глутатион восстановленный	1.00.3	1.00.5

Примечание: ** р<0.01 дано по отношению к физиологической беременности

  I50  -  концентрация, при которой происходит 50%-ное тушение Л-ХЛ

Исследуемые соединения  тушили Л-ХЛ  в постмитохондриальной  фракции плацент  женщин обеих  групп. Степень ингибирования интенсивности хемилюминесценции зависела от концентрации соединений.  Эффективность исследуемых веществ варьировала в пределах нескольких порядков.  Цистеин, аскорбиновая кислота, НАДН, глутатион восстановленный оказывали равнозначный ингибирующий эффект на Л-ХЛ постмитохондриальной фракции  плацент женщин обследованных групп. Величина  I50  мочевой кислоты, способной инактивировать пероксинитрит, образующийся в реакции взаимодействия  оксида азота с  супероксидным анионрадикалом (Зенков Н.К.и соавт., 2001), была выше в 2,5 раза в постмитохондриальной фракции плацент женщин с неосложненной беременностью.  Концентрация I50  таурина, инактивирующего гипохлоритный анион радикал с  образованием аминосоединений (Говорова Н.Ю. и соавт, 1988), в плацентах женщин при физиологической беременности 1,2 раза превышала таковую при преждевременных родах.

Полученные данные позволяют говорить об участии одновременно двух механизмов возникновения Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции плацент: СОД-зависимого, характеризующегося присутствием в среде радикалов О2 и ОН,  и СОД-независимого, когда свечение возникает в присутствии  радикалов СlO. Причем относительный вклад последнего механизма в возникновение Л-ХЛ был существенно ниже в плацентах женщин  при преждевременных родах.

  В организме человека гипохлоритный анионрадикал  образуется в результате реакции  взаимодействия перекиси водорода с ионами хлора. Реакцию катализирует фермент миелопероксидаза (МПО).

  Как показали собственные исследования, максимальное содержание МПО наблюдалось в первом триместре беременности. На протяжении беременности содержание фермента снижалось в плацентах  женщин обследованных групп. При невынашивании беременности содержание фермента в первом триместре беременности в 4,5 раза превышало уровень МПО в плацентах женщин с физиологическим течением беременности , во втором триместре  -  в 3 раза как в центральном участке плацент, так и по периферии. В третьем триместре беременности  содержание МПО было ниже в 3 и 2,2 раза соответственно в центральном и  периферическом участках плацент  женщин при преждевременных родах по сравнению с плацентами женщин с физиологической беременностью, завершившейся родами в срок (рис.2 а, б). Более низкое содержание МПО в плацентах женщин в третьем триместре при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности приводит к ослаблению микробицидной функции плаценты. 

 

  а

 

  б

Рис.2 а, б. Содержание миелопероксидазы в  постмитохондриальной фракции плацент  женщин при невынашивании и физиологической беременности на протяжении беременности.

Примечание: **р<0,01,  ***р<0,001  по отношению к соответствующим

  показателям группы женщин при физиологической беременности 

  Наряду с МПО в литературе уделяется  особое внимание антимикробным свойствам оксида азота (Melkova Z., Tsteban M., 1995). Цитотоксическое действие оксида азота во многом зависит от интенсивности образования NO и продуктов его метаболизма: нитрита, нитрата, пероксинитрита (Graziewicz M.A., 1996; Moriya R. et al, 2000). В плаценте обнаружено два изофермента  NO-синтазы: эндотелиальная (III тип) (Eis E.L. et al., 1995) и индуцибельная (II тип) (Myatt et al., 1997).

  Определение динамики активности NO-синтазы позволило установить, что на ранних сроках  беременности отличий в уровне активности фермента в плацентах женщин обследованных групп не наблюдалось. На протяжении беременности активность NO-синтазы в плацентах женщин при невынашивании не менялась  по центру, уменьшалась по периферии и в третьем триместре была ниже в периферическом участке, чем у женщин с физиологическим течением беременности (рис.3 а, б), что говорит о снижении образования оксида азота.

а

  б

Рис.3а, б. Уровень активности NO-синтазы  в постмитохондриальной  фракции плацент  женщин при невынашивании и физиологическом течении  на протяжении беременности

Примечание: *р<0.05, * *р<0.01 - по отношению к центральному участку

плаценты  женщин с невынашиванием;

  Анализ представленных результатов исследований  свидетельствует о том, что дисфункция плаценты характеризуется изменением вклада различных АФК в процессы СРО, что приводит к ослаблению ее защитных свойств.

Изучение антиоксидантной системы  в  постмитохондриальной фракции плацент  женщин с физиологическим течением  беременности  и при невынашивании

 

Содержание эндогенных АФК, образующихся  в клетках плаценты, поддерживается на определенном уровне для обеспечения основных метаболических функций плаценты. Это осуществляется за счет функционирования многокомпонентной АОС, разнообразной по механизмам действия и химической структуре. Вклад отдельных компонентов в общий антиокислительный потенциал плаценты различен, в связи с чем важным является  исследование  резервов антиокислительной защиты в плаценте при физиологической беременности, завершившейся родами в срок и при самопроизвольном прерывании беременности  в 28 - 36 недель (преждевременные роды).

Нами не выявлено различий в величине общей антиокислительной активности, в уровнях активностей СОД  и каталазы в постмитохондриальных фракциях плацент  женщин обследованных групп. Между тем,  содержание небелковых SH-групп в центральных и периферических участках плацент  женщин с преждевременными родами было меньше по сравнению с уровнем SH-групп в плацентах женщин с физиологической беременностью (рис.4).  Основным низкомолекулярным  SH-соединением в организме является глутатион, клеточный пул которого формируется в результате динамического равновесия процессов его биосинтеза и деградации.

  Уровень активности глутатионпероксидазы (ГП) в плаценте женщин при  самопроизвольном прерывании беременности был выше  более чем в 2 раза уже в 1 триместре беременности и оставался высоким во II и III триместрах. На протяжении всего срока беременности активность фермента в плаценте женщин при невынашивании превышала более чем в 1,5 раза величину  активности фермента в плацентах женщин при физиологическом течении беременности.  Активность ГП не зависела от локализации фермента в плацентах (центр - периферия) женщин  обследованных групп. Более высокую активность фермента во II триместре при физиологическом течении беременности мы связываем с применением интраамниального введения энзапроста (простагландин Е2 ) при прерывании беременности по социальным показаниям (рис. 5).

 

Рис.4. Содержание небелковых  SH-групп в постмитохондриальной фракции плацент  женщин  при физиологической беременности и преждевременных родах.

  Примечание: **p<0.01 по отношению к физиологической беременности 

а

а

б

Рис.5 а,б. Активность глутатионпероксидазы  в постмитохондриальной фракции плацент  женщин с физиологическим течением  беременности  и при невынашивании на протяжении беременности

Примечание: *** р< 0,001 по отношению группе женщин с физиологической

  беременностью.

Различий в уровне активности  ГР в плацентах  женщин  с невынашиванием и физиологическим течением не было выявлено на протяжении  всей беременности.

Таким образом, в плацентах женщин при невынашивании преобладает более интенсивное использование пула восстановленного глутатиона, чем его пополнение.

В тканях млекопитающих восстановленный  глутатион используется, кроме ГП, семейством многофункциональных белков глутатион - S -трансфераз (Г- S -Т), основной функцией которых является защита клеток от ксенобиотиков или их микросомальных метаболитов путем трансформации, нековалентного связывания и ковалентного присоединения.

  Активность Г- S -Т в плацентах  женщин при физиологической беременности увеличивалась в динамике развития беременности, а при невынашивании оставалась на уровне первого триместра в центральной и периферической областях (рис 6 а,б).

а  б

Рис 6 а,б. Активность глутатион-S-трансферазы  в постмитохондриальной фракции плацент  женщин с физиологическим течением  беременности  и при невынашивании на протяжении беременности

Примечание: *p<0.05 по отношению к группе женщин с физиологической беременностью; 

  ** p<0.05 по отношению к  значениям I-го  и  II-го триместров

Полученные данные позволяют заключить, что при невынашивании в постмитохондриальной  фракции плаценты наблюдается  дефицит активности глутатионзависимого звена антиокислительной системы.

  Следовательно,  при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности в постмитохондриальной фракции плаценты происходит развитие окислительного стресса, связанное, как и в  митохондриях плаценты, с нарушением сбалансированности между интенсивностью образования АФК и  активностью  глутатионзависимого звена антиокислительной системы.

  Для определения значимости активности ферментов глутатионзависимого звена АОЗ в плацентах обследованных женщин  при выявлении риска преждевременного прерывания беременности был проведен на основании ретроспективных данных многофакторный линейный дискриминантный анализ. При многофакторном линейном дискриминантном анализе в качестве переменных были использованы уровни активности ферментов глутатионзависимого звена АОЗ в  плаценте, а в качестве зависимой характеристики - факт спонтанного преждевременного прерывания беременности. На основании этого анализа разработана модель  расчета  индекса возможного преждевременного прерывания беременности (ИППБ), в которой  ключевая роль принадлежит функциональному состоянию ГП и Г- S -Т центрального участка плаценты:

ИППБ=0,093 Г-S-Т(ц) -  0,028 ГП(ц)

где: ИППБ Ц  индекс возможного преждевременного прерывания беременности

  Г-S-T(ц)  -  значение активности Г-S-Tц  в центральной части плаценты

  ГП(ц)  -  значение активности ГП в центральной части плаценты

Пороговое значение  индекса преждевременного прерывания беременности (ИППБ) равно  1,06.  Значения  индекса обратно пропорциональны риску развития прерывания беременности, т.е. чем меньше величина прогностического индекса, тем выше риск прерывания беременности. Метод расчета риска преждевременного прерывания беременности имеет чувствительность 73,7%, специфичность - 64,7% и точность 70,9% (2  = 5,80; р = 0,016; ТМФ : р<0,015), что свидетельствует о важной роли уровня активности ГП и Г- S - Т  для физиологического течения беременности.

  Изучение полиморфизма генов глутатион-S-трансфераз  в плацентах женщин при невынашивании и физиологической беременности. 

В настоящее время считается, что разный уровень ферментативной активности Г-S-Т в организме может быть связан с генетическим полиморфизмом соответствующих генов (Беспалова О.Н., 2001, 2009). Плацентарная  Г-S-Т детерминирована геном GST P1.

Известно, что полиморфизм гена GST P1, обусловленный заменой нуклеотидов в 313 или 341 положениях  ДНК последовательности, связан с наличием в плацентах и хорионах трех функционально значимых аллельных вариантов.  Аллели В и С кодируют ферменты с пониженной активностью, причем у гомозигот (В/В и С/С) активность фермента ниже, чем у соответствующих гетерозигот (А/В и А/С) (Беспалова О.Н. и соавт., 2001). Вариант А/А GST P1 гена кодирует синтез глутатион - S - трансферазы  с нормальной активностью (Lo Hui-Wen, F. Ali-Osman, 1997).

  Частота встречаемости генотипов по гену GST P1  в плацентах женщин при невынашивании не отличалась от таковых в плацентах группы женщин с физиологическим течением беременности. Сочетание генотипов GSTТ1 0/0+GSTМ1 0/0 у женщин с преждевременным прерыванием беременности  встречалось примерно в 4 - 5 раз чаще, чем у женщин с физиологическим течением беременности.  Частота встречаемости сочетаний генотипов GST Р1 D  + GSTТ1 0/0 и  GST Р1 D + GST М1 0/0 была у женщин с невынашиванием  в 5 - 9 раз и в 2 раза соответственно чаще, чем у женщин с неосложненным течением беременности. Следует отметить, что сочетание всех трех функционально ослабленных генотипов GSTТ1 0/0+ GST М1 0/0 + GST Р1 D, где D - функционально ослабленная аллель В или С, выявлено в 19% образцов плацент женщин с невынашиванием, тогда как в плацентах женщин с физиологическим течением беременности  оно не превышало 4% (рис.7)

Рис.7. Сочетание  трех функционально ослабленных генотипов GSTТ1 0/0+ GST М1 0/0 + GST Р1 D в плаценте женщин  при невынашивании  и  при физиологическом течении беременности.

Зависимость активности  ферментов глутатионзависимого звена от вариантов генотипа по гену GST Р1 в плацентах женщин при невынашивании.

При невынашивании беременности активность Г- S -Т при генотипе по гену GSTP1, несущем аллели А/С, была в 1,5 раза ниже, чем активность фермента при генотипе по гену GST Р1, несущем аллели А/А и А/В (рис.8).

 

Рис.8 Зависимость активности глутатион-S-трансферазы от генотипа  по гену GST Р1 в плацентах женщин с невынашиванием

  Примечание: * р < 0,05 по отношению к генотипу АА

  Проведенные исследования показали, что во II  и  III триместрах беременности  величина активности фермента в плацентах женщин при невынашивании была выше  при наличии аллелей АА (рис.9).

 

Рис. 9. Активность глутатион-S-трансферазы в плацентах женщин с невынашиванием при различных генотипах по гену GST Р1  на протяжении беременности.

  Примечание: * р < 0,05 по отношению к генотипу по гену GSTP1(АА)

  Анализ возможной связи глутатионпероксидазной активности в плацентах женщин и вариантами генотипа по гену GST Р1 показал, что ГП в плацентах женщин с невынашиванием зависела от наличия в гене GSTP1 аллеля В (рис.10).

Рис. 10. Зависимость  ГП активности от генотипа по гену GST Р1 в плацентах женщин с невынашиванием

Примечание:  ** р <0,01 по отношению к А/В генотипу GST Р1 гена.

  С целью выявления количественно выраженной зависимости между активностью ферментов глутатионзависимой системы плаценты и различных вариантов генотипа по гену GST Р1, был использован множественный регрессионный анализ.

  Разработанная математическая модель, отражающая зависимость уровня активности Г-S-Т от вариантов генотипа по гену  GST Р1 (наличие аллелей А, В, или С) может быть представлена следующим уравнением:

  Активность Г-S-Т = 3,89 + 9,66 (GST Р1 А) Ц 8,16 (GST Р1 С)

R2  = 0.10  F=3.89  p<0.027

где: GST Р1 А  - наличие аллеля А в генотипе GST Р1 гена

GST Р1 С  - наличие аллеля С в генотипе GST Р1 гена

  Т.е. величина активности Г-S-Т в плаценте  непосредственно зависит от  наличия аллеля А и отсутствия  аллеля С в генотипе GST Р1.

  Зависимость уровня  активности ГП  от вариантов генотипа по гену GST Р1 может быть представлена следующей математической моделью:

  Активность ГП =76,88+23,03 (GST Р1 В) Ц 0,725    (срок беременности)

  R2  = 0.26  F=9,72  p<0.0003

где:  GST Р1 В  - наличие или отсутствие аллеля В в генотипе по гену GST Р1

срок беременности -  в неделях

  Согласно разработанной модели,  активность ГП снижается с увеличением срока беременности и на каждом сроке беременности активность фермента выше при наличии аллеля В  в генотипе по гену  GST Р1.

  Исходя из выше представленных результатов, мы полагаем, что дисфункция плаценты, связанная с уровнем активности ферментов глутатионзависимого звена АОЗ,  может быть в ряде случаев генетически детерминирована.

  Использование метода хемилюминометрии для оценки риска невынашивания  при угрозе  прерывания  беременности  поздних сроков.

  В нашей работе объектом для изучения  механизма невынашивания служила плацента, исследование которой возможно лишь после завершения беременности. Для оценки степени риска невынашивания в динамике прогрессирующей беременности  целесообразно  было использовать регистрацию интенсивности процессов СРО в доступном материале и быстрым, простым методом. Мы попытались оценить возможность использования показателей хемилюминесцентного (ХЛ)  анализа для контроля за эффективностью проводимой терапии у женщин  с угрозой прерывания беременности.

Как показали результаты проведенного нами исследования, при  несложненном течении  беременности наблюдалось увеличение уровня интенсивности перекисной ХЛ  в сыворотке крови  женщин в среднем на  40%  по сравнению с величиной ХЛ в сыворотке крови небеременных женщин, что согласуется с данными литературы (Кошелева Н.Г. и соавт.,1980).  При угрозе прерывания беременности величина ХЛ в сыворотке крови пациенток достоверно превышала таковую сыворотки крови женщин с неосложненным течением беременности. Инфузии -миметика бриканила, сеансы электросна привели к снижению величины хемилюминесценции в сыворотке крови  женщин с угрозой прерывания беременности до уровня женщин с физиологической беременностью (рис.11).

Использование показателей ХЛ анализа позволило  выявить нормализацию процессов свободнорадикального окисления при терапии с использованием разных подходов и 

препаратов у 50 - 80% обследованных женщин с угрозой прерывания беременности.

  На основании полученных данных, можно заключить, что интегральные показатели  метода перекисной ХЛ  целесообразно использовать в акушерской практике для скрининговой экспресс-диагностики  дисфункции плаценты и  контроля за  эффективностью проводимого лечения  наряду с существующими подходами.

 

Рис.11. Изменение интенсивности ХЛ при лечении угрозы прерывания беременности Примечание: **р<0,02 по отношению к группе женщин с неосложненной беременностью

 

Заключение

  Результаты наших исследований позволяют обобщить совокупность основных процессов свободнорадикального окисления, приводящих к дисфункции плаценты. Мы полагаем, что окислительный стресс, обусловленный, главным образом, снижением буферной емкости глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты в  плаценте на фоне интенсификации процессов ПОЛ играет ключевую роль в качестве патогенетического фактора дисфункции плаценты. Он вызывает метаболические и регуляторные нарушения в плаценте, что в конечном итоге приводит к невынашиванию беременности и неблагоприятным  перинатальным  исходам. 

Окислительный стресс способствует также  ослаблению защитной функции плаценты, где главная роль принадлежит комплексу изменений, связанных с  низким уровнем содержания МПО, недостаточной активностью NO-синтазы и уровнем активности ГТ, детерминируемой функционально ослабленным генотипом GSTP1.

Итоги исследований представлены нами в виде схемы (рис.12),  которая наглядно отражает роль глутатионзависимого звена антиоксидантной системы плаценты в системном характере  метаболических нарушениий, развивающихся в плаценте и приводящих к ее дисфункции и невынашиванию.

Рис.12. Взаимосвязь метаболических и функциональных нарушений в плаценте при невынашивании беременности.

  В связи с вышеизложенным очевидно, что одним из ключевых моментов комплексной консервативной терапии и профилактики невынашивания беременности является коррекция окислительного стресса и поддержка глутатионзависимого звена АОЗ в плаценте женщин. При развитии невынашивания беременности для профилактики и терапии данного осложнения беременности вполне оправданным является длительное  применение витаминно-минеральных комплексов с антиоксидантным  действием.

Для контроля за эффективностью применения антиоксидантных препаратов в акушерской практике целесообразно использовать показатели  ХЛ анализа.  Применение хемилюминесцентного анализа в акушерской практике может быть ценным в качестве неспецифического, простого и быстрого метода для выявления нарушений и степени их тяжести на протяжении беременности и для оценки эффективности лечения при угрозе прерывания беременности поздних сроков наряду с другими диагностическими приемами.

ВЫВОДЫ

1. Дисфункция плаценты, приводящая к невынашиванию беременности, сопровождается нарушением  в ней равновесного состояния про- и антиоксидантных систем, развитием оксилительного стресса и эндогенной интоксикацией от периферической части к центральной.
2. В митохондриях плаценты при невынашивании  развитие окислительного стресса сопровождается усилением интенсивности прооксидантной системы и ослаблением функционирования  глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.
3. В постмитохондриальной фракции плаценты при физиологической беременности и невынашивании  наблюдается разная степень вовлеченности активных кислородных радикалов в процессы свободнорадикального окисления. В патогенезе преждевременных родов процессы СРО связаны с усилением  липидной пероксидации в периферическом участке плаценты.
4. При невынашивании беременности регистрируется снижение участия гипохлоритного анионрадикала в процессах свободнорадикального окисления  плаценты.
5. Максимальное содержание миелопероксидазы в постмитохондриальной фракции плаценты в динамике физиологической беременности наблюдается в I триместре беременности.  Центральная  часть плаценты обладает более высоким содержанием фермента по сравнению с периферией на протяжении всей беременности.  При самопроизвольном прерывании беременности  содержание миелопероксидазы в плаценте  в первом триместре в 4.5 раза, во втором - в 3 раза выше, чем  при физиологически протекающей беременности. В третьем триместре содержание фермента ниже по центру и по периферии плаценты в 3 и 2,2 раза  соответственно по сравнению  с таковым при физиологической беременности.
6. Уровень активности NO-синтазы центрального участка плаценты выше уровня активности фермента по  периферии плаценты как при физиологической беременности так и при невынашивании. Активность фермента периферического участка плаценты при преждевременных родах ниже на 40% по сравнению с активностью фермента  при физиологической беременности.
7. При невынашивании беременности  развитие окислительного стресса в постмитохондриальной  фракции плаценты связано с изменением  активности ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.  Активность глутатионпероксидазы при невынашивании беременности  в 1,5-2 раза выше, а активность глутатион-S-трансферазы в 2,3  раза ниже по сравнению с  физиологически протекающей беременностью.
8. Выявлена значимость определения активности  глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в плацентах женщин и рассчитан  индекс преждевременного прерывания беременности, пороговое значение которого равно 1,06.
9.   Уровень активности  глутатион-S-трансферазы в плаценте, согласно разработанной математической модели,  характеризуется  прямой  корреляцией с наличием аллеля А и обратной с  наличием аллеля С гена  GST P1.  Активность глутатионпероксидазы на каждом сроке беременности выше при наличии аллеля В  в генотипе по гену GST Р1.
10. Метод хемилюминесцентного анализа целесообразно использовать  в акушерской практике для скрининговой экспресс-диагностики  дисфункции плаценты и  контроля за  эффективностью проводимого лечения, наряду с существующими диагностическими приемами.

  ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью оценки эффективности терапии и прогноза течения осложненной беременности спектр  общепринятых обследований рекомендуется дополнить показателями состояния про- и антиоксидантной систем, используя информативный, простой и быстрый  метод хемилюминесцентного анализа.
2. Величины активности глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в плаценте женщин  имеют важное значение для прогноза  невынашивания. Информацию о состоянии глутатионзависимого звена плаценты может дать  разработанная математическая модель зависимости активности этих ферментов от наличия аллелей С и В в генотипе по гену  GST P1  беременных женщин.
3. Для коррекции окислительного стресса и  поддержки глутатионзависимого звена АОЗ в плаценте женщин при профилактике невынашивания беременности рекомендуется использование в комплексной консервативной терапии тиолсодержащих антиоксидантов. 

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах по перечню ВАК

Министерства образования и науки Российской Федерации

1. Генотипический и биохимический анализ плацент у женщин с самопроизвольным досрочным прерыванием беременности. /Т.Э. Иващенко, Г.К. Парцалис, В.М. Прокопенко,  Н.Г. Павлова,  А.В. Арутюнян, В.С.Баранов  //Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Т.LV, в.2. - С.58 - 63.
2. Глутатионзависимая система антиоксидантной защиты плаценты при преждевременных родах. / В.М.Прокопенко, Г.К.Парцалис, Н.Г.Павлова, С.О.Бурмистров, А.В.Арутюнян //Бюллетень  экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - №5. - С. 511 - 513.
3. Миелопероксидаза в плаценте при преждевременных родах. /В.М. Прокопенко, Г.М.Алешина, Е.В.Фролова, В.В.Ананьева, В.Н.Кокряков, А.В.Арутюнян.// Вопросы медицинской химии. - 2002. - Т. 48, вып. 4. - С. 378 - 380.
4. Павлова Н.Г. Прокопенко В.М., Парцалис Г.К. Значение ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты для прогноза невынашивания беременности. /Н.Г. Павлова,  В.М. Прокопенко, Г.К. Парцалис // Журнал акушерства и женских болезней. - 2010. - Т.LIX, вып 2 - С. 65 - 68.
5. Применение хемилюминометрии при угрозе прерывания беременности поздних сроков. /В.М. Прокопенко, Н.Г. Кошелева, Т.П. Вошева., Е.В. Фролова, Т.М. Кроль, П.С. Бузурукова  // Акушерство и гинекология. - 1999. -  №4. - С. 44 - 45.
6. Прокопенко В.М. Глутатионзависимая система антиоксидантной защиты в плаценте при невынашивании беременности./В.М. Прокопенко, Г.К. Парцалис, С.О. Бурмистров // Физиология человека. - 2006. - Т.32, №2. - С. 197 - 200.
7. Прокопенко В.М. Миелопероксидаза в плаценте человека при невынашивании беременности  / В.М. Прокопенко, Г.М. Алешина  // Физиология человека. - 2006. - Т.32, №4. - С. 486 - 488.
8. Прокопенко В.М. Роль окислительного стресса в патогенезе гестоза. /В.М. Прокопенко // Журналъ акушерства и женскихъ болезней. - 2007. - Т. .LVI, вып 4. - С. 31 - 36.
9. Прокопенко В.М. Селеносодержащие белки и беременность /В.М.Прокопенко //Акушерство и женские болезни. - 2002. - вып.4. - С. 73 - 76.
10. Прокопенко В.М. Эндогенная интоксикация в плаценте при преждевременных родах. /В.М. Прокопенко // Журнал акушерства и женских болезней. - 2011. - Т.LX, вып.1. - С. 53 - 56.
11. Прокопенко В.М.. Прооксидантная и антиоксидантная системы в митохондриях плаценты при ее дисфункции. /В.М. Прокопенко, Н.Г. Павлова,  А.В. Арутюнян  // Журнал акушерства и женских болезней. - 2010. - Т.LIX, вып.5. - С.56 - 63.
12. Прокопенко В.М.. Свободнорадикальные процессы в плаценте при преждевременных родах. /В.М. Прокопенко // Журнал акушерства и женских болезней. - 2000. - №2. - С. 37 - 40.
13. Свободнорадикальное окисление в тканях последа при недоношенной беременности. /В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян, Т.У. Кузьминых, Е.Е. Говорова, Е.В. Фролова  //Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, № 3. - С. 53 - 56.
14. Свободнорадикальное окисление и антиокислительная активность в тканях плаценты при преждевременных родах. /В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян, Е.В. Фролова, Т.У. Кузьминых, Э.К. Айламазян  // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1997. - Т. 124, № 12. - С. 632 - 634.
15. Уровень перекисной хемилюминесценции в сыворотке крови у здоровых и больных сахарным диабетом типа 1 женщин вне и в динамике беременности. /С.И. Назарова, В.М. Прокопенко, Н.Г. Кошелева, А.В. Арутюнян // Журнал акушерства и женских болезней. -  2006. - Т.LV, в.2. - С.14 - 19.

Статьи, изданные в других журналах, сборниках трудов конференций, симпозиумов и конгрессов

16. Арутюнян А.В.  Нарушение свободнорадикальных процессов при невынашивании беременности. /А.В. Арутюнян, В.М. Прокопенко, Н.Г. Павлова  //Российская н.-п. конференция Невынашивание беременности и недоношенный ребенок. -  Петрозаводск. - 2002. - С. 23 - 24.
17. Кузьминых Т.У. Новые подходы к лечению женщин с угрозой преждевременного прерывания беременности. /Т.У. Кузьминых, А.В. Арутюнян, В.М. Прокопенко // Вестник Российской Ассоциации акушеров-гинекологов. - 1997. -  №3. - С. 49 - 51.
18. Кузьминых Т.У. Свободнорадикальное окисление и иммуноморфология тканей после при недонашивании беременности. /Т.У. Кузьминых, В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщин. Мат. 22-ой научной сессии НИИ АИГ им. Д.О.Отта РАМН, 1993. - С.120 - 123.
19. Павлова Н.Г. Особенности антиоксидантного статуса в плаценте при невынашивании беременности. Материалы научной конференции. Механизмы типовых паталогических процессов. /Н.Г. Павлова, Г.К.Парцалис, В.М. Прокопенко // Медицинский Академический журнал. - 2003. - С. 165 -166.
20. Парцалис Г.К. Глутатионзависимая система антиоксидантной защиты при физиологической беременности и преждевременных родах. /Г.К. Парцалис, Н.Г. Павлова,  В.М. Прокопенко // Российская н.-п. конференция Невынашивание беременности и недоношенный ребенок. - Петрозаводск. - 2002. - С.88.
21. Прокопенко В.М.  Антиоксидантная активность в тканях плаценты женщин при невынашивании беременности. /В.М. Прокопенко,  Г.К. Парцалис, А.В. Арутюнян //Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. - Т. 90, №8. - С. 449.
22. Прокопенко В.М. Влияние низкомолекулярных соединений на люминолзависимую хемилюминесценцию, обусловленную действием продуктов миелопероксидазной реакции в ткани плаценты./В.М. Прокопенко, Е.В. Фролова, Т.У. Кузьминых  // Сб. трудов Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины Санкт-Петербург. - 1999. - С. 362 - 364.
23. Прокопенко В.М. О механизме люминолзависимой хемилюминесценции в тканях плаценты./В.М. Прокопенко, Е.В. Фролова, А.В. Арутюнян // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщин. Мат. 23 научной сессии НИИ АИГ им. Д.О. Отта РАМН. - 1994. - С.182.
24. Прокопенко В.М. Процессы свободнорадикального окисления в плаценте при преждевременных родах./В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян // Материалы 2 Российского Форума УМать и дитяФ. М. - 2000. - С. 126 - 127.
25. Прокопенко В.М. Свободнорадикальные процессы в плаценте при преждевременных родах. /В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян // Национальная. научно-практическая конференция с международным участием  Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека. - Смоленск, Россия. - 2001. - С. 253 - 254.
26. Прокопенко В.М. Содержание миелопероксидазы в плаценте человека при патологии беременности. /В.М. Прокопенко, Алешина Г.М.  // Тезисы научного форума Мать и дитя. - Казань. - 2007. - С. 130.
27. Прокопенко В.М. Хемилюминесцентное исследование процессов свободнорадикального окисления в плаценте и в плацентарных оболочах при преждевременном прерывании беременности./В.М. Прокопенко, Т.И. Кузьминых, А.В. Арутюнян // Современные проблемы диагностики и лечения нарушений репродуктивного здоровья женщин. Сб. трудов 1 Северо-Кавказского съезда акушеров-гинекологов. г. Ростов. - 1994. - С.168.
28. Прокопенко В.М.. Значение активности ферментов глутатионзависимой антиоксидантной системы плаценты для прогноза невынашивания беременности. /В.М. Прокопенко, Н.Г. Павлова, Г.К. Парцалис // Тезисы научного форума Мать и дитя. - Казань. - 2007. - С. 130 - 131.
29. Свободнорадикальные процессы и антиоксидантная система в плаценте при невынашивании беременности./В.М. Прокопенко,  А.В.Арутюнян, Г.К. Парцалис, С.О. Бурмистров, Н.Г. Павлова //3-ий съезд Биохимического общества. - СПб. - 2002. - С. 206.
30. Сравнение различных методов определения антиоксидантной активности сыворотки крови беременных и небеременных женщин./ С.О. Бурмистров, Т.И. Опарина, В.М. Прокопенко, А.В. Арутюнян // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 11. - С.14 - 17.
31. Участие миелопероксидазы и NO-синтетазы в процессах свободнорадикального окисления в плаценте человека./ А.В. Арутюнян, В.М. Прокопенко, Т.И. Опарина, Е.В. Фролова //Сборник Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии, Спб МУ им. И.П.Павлова. - 1998. - Т. 2. - С. 439 - 443.
32. Хемилюминесценция сыворотки крови у здоровых беременных при лечении угрозы прерывания беременности электросном. /Т.П. Вошева, В.М. Прокопенко В.М., А.В. Арутюнян, Т.М. Кроль, Е.Е.Смагина  // Сб. трудов 24 научной сессии НИИ АИГ им. Д.О. Отта РАМН. - 1995. - С. 55 - 56.
33. Arutjunyan A. On the mechanism of free redical oxidation in human placenta. /A. Arutjunyan, V. Prokopenko, E. Frolova  // 23 Цrd Metting of FEBS, Basel, Switzerland. - 1995. - Р.102.
34. Chemiluminescent stady of  free radicals oxidation in human placenta at preterm termination of pregnancy./A. Arutjunyan,  V. Prokopenko,  T. Kuzminikh , E. Frolova  // International Conf. on Clinical Chemiluminescence, Berlin. - 1994. - Р.105.
35. Kuzminikh T.U Free-radical oxidation in placental tissues in preterm delivery./T.U. Kuzminikh., V.M. Prokopenko // Baltic International Conf. of Obstetrics and Gynecology Turku, Finland. - 1993. - Р.50.
36. Prokopenko V. Free radical oxidation and antioxidant activity in placenta at premature delivery. /V. Prokopenko,  A. Arutjunyan  // 5 Цth Annual Meeting of the Oxygen Society, San-Francisco. - 1998. - Р.54.
37. Prokopenko V.M Processes of free redical oxidation in placenta at premature labor. /V.M. Prokopenko, E.V. Frolova, V.V. Ananieva, S.O. Burmistrov  // The 7-th Baltic Sea Congress on Obstetrics and Gynecology, Saint-Petersburg, 12-15 May. - 1999. - Р.127.
38. Prokopenko V.M. Effects of low molecular compounds on the intensity of luminol-dependent chemiluminescence in placenta at premature delivery./V.M. Prokopenko, E.V. Frolova, A.V. Arutjunyan  // Международная конференция "Свободнорадикальные процессы". - 1999. - С. 776.
39. Prokopenko V.M. Placental gluthatione S-transferase in prengnancy miscarriage. /V.M. Prokopenko,  G.K. Partsalis, N.G. Pavlova // International Conf. Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health, Smolensk, Russia. - 2003. - Р. 436 - 437.
40. Prokopenko V.M. Placental Gluthatione-dependent system of antioxidant defence in recurrent abortion. /V.M. Prokopenko,  G.K. Partsalis, S.O. Burmistrov, A.V. Arutjunyan,  N.G. Pavlova  // International Conf. Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health, Smolensk, Russia. - 2003. - P. 140 - 141.

Список сокращений, используемых в автореферате

АОС Ц  антиоксидантная система

АФК Ц  активные формы кислорода

Г - S - Т Ц  глутатион - S - трансфераза

ГП  - глутатиопероксидаза

ГР  - глутатионредуктаза

ИППБ Ц  индекс преждевременного  прерывания беременности

-ХЛ Ц  люминолзависимая хемилюминесценция

МВ  - максимальная вспышка

МДА - малоновый альдегид

МПО - миелопероксидаза

Н2О2  - перекись водорода

ОАА  - общая антиоксидантная активность

ОН-  - гидроксильный радикал

ПОЛ Ц  перекисное окисление липидов

СlO-  Ц  гипохлоритный анионрадикал

СОД Ц  супероксиддисмутаза

СРО Ц  свободнорадикальное окисление

СС Ц  светосумма

ХЛ  - хемилюминесценция

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное