Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии Учреждение Российской академии наук

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

На правах рукописи

Турова Татьяна Павловна

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ГЕНОСИСТЕМАТИКИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ВОПРОСОВ ТАКСОНОМИИ И ИЗУЧЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ ПРОКАРИОТ

03.00.07 - микробиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Дедыш Светлана Николаевна доктор биологических наук, профессор, Синеокий Сергей Павлович доктор биологических наук, Троицкий Алексей Викторович

Ведущая организация: Институт физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится У У 2009 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н.

Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.

7, корп. 2.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана У___Ф 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Геносистематика (или молекулярная систематика) в отличие от традиционной систематики (феносистематики) оценивает родство организмов, исходя из сходства или различия их геномов, т.е. ее можно назвать наукой о разнообразии генотипов организмов. Развитие геносистематики происходило параллельно с развитием биохимии, а затем молекулярной биологии и было связано с прогрессом в понимании процессов изменчивости информационных макромолекул (семантид) и влияния этих процессов на фенотипические признаки организмов. Основы молекулярной cистематики были заложены в конце 50-х годов прошлого века независимо двумя группами ученых под руководством А.Н.Белозерского и К.Ли, обнаружившими корреляцию нуклеотидного состава ДНК с положением организмов в системе, - сначала у бактерий, а затем и у эукариот. В начале 60-х годов Э. Цукеркандлем и Л. Полингом было впервые заявлено о возможности использования анализа последовательностей, т. е. первичной структуры клеточных макромолекул - носителей информации, для филогенетической классификации живых организмов. Значительную роль в развитии теоретических основ молекулярной филогенетики сыграла концепция молекулярных часов, выдвинутая этими же авторами в 1965 г., и теория нейтральности молекулярной эволюции, разработанная в конце 60-х годов М.Кимурой, а также Дж. Кингом и Т.Джуксом. В конце 70х - начале 80-х годов работы ученых группы К.Везе дали начало направлению, которое впоследствии получило название рибосомной филогенетики и сыграло особую роль в систематике микроорганизмов.

Применение молекулярно-биологического подхода для изучения эволюции живых организмов выявило его принципиальное преимущество по сравнению с традиционным фенотипическим подходом: оно открыло возможность сравнения отдаленных организмов, которые могут совсем не иметь общих фенотипических признаков. Таким образом, появилась возможность с помощью единой методологии осуществлять построение всеобъемлющих филогенетических схем, что, несомненно, приближает исследователей к созданию наиболее естественной системы живых организмов, т.е. опирающейся на их филогенетические взаимоотношения, возникшие в процессе их эволюции.

Развитие молекулярной систематики в микробиологии оказалось особенно успешным в силу ряда особенностей прокариотных организмов. С одной стороны, по сравнению с систематикой эукариот, успехи микробиологов в филогенетике нельзя было назвать значительными. Последовательное введение в систематику эукариот эволюционных принципов позволило создать стройные непротиворечивые системы, опирающиеся на реальные филогенетические взаимоотношения организмов, и в этом смысле являющиеся естественными. Вместе с тем, все попытки конструирования сколько-нибудь детализованной эволюционной схемы прокариот, исходя из которой можно было бы приблизиться к созданию их естественной системы, в рамках традиционной фенотипической систематики оставались безуспешными, в результате чего даже была поставлена под сомнение сама такая возможность.

Это заставляло микробиологов стремиться воспользоваться теми принципиально новыми возможностями решения таксономических проблем, которые предоставляла молекулярная систематика. С другой стороны, менее сложная по сравнению с эукариотами организация генома прокариот позволяла использовать их в качестве преимущественных объектов геносистематики.

Уже первые попытки использования молекулярно-биологических методов позволили решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов. С развитием геносистематики, расширением круга используемых ею методов и накоплением экспериментальных данных, касающихся различных таксономических групп бактерий, вклад ее в решение общих кардинальных проблем систематики прокариот начал быстро возрастать.

Вместе с тем появились и новые проблемы, связанные главным образом с противоречиями, иногда весьма значительными, между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа. В некоторых случаях эти противоречия объяснялись несовершенством знаний, как в отношении фенотипа, так и в отношении генотипа, поэтому в результате более тщательных исследований удавалось устранить их причины. Однако, по-видимому, существуют не только случайные, но и объективные противоречия, обусловленные естественными закономерностями эволюционных взаимоотношений микроорганизмов.

Изучение этих закономерностей, а также степени их влияния на построение естественной системы прокариот является ключевой проблемой современной молекулярной систематики.

Целью работы являлось проведение сравнительного анализа генетических структур различных групп прокариот c помощью комплекса молекулярно-биологических методов и использование результатов этого анализа для решения частных и общих проблем таксономии, филогении и экологии прокариот.

Задачи работы.

1) Определить сходство тотальных геномов бактерий с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации, а также провести статистический анализ полученных результатов и литературных данных;

2) Оценить возможность создания универсальной системы формальных (количественных) критериев родства бактерий и ее использования в таксономии прокариот;

3) Провести сравнительный анализ первичной и вторичной структуры генов 16S рибосомных РНК представителей различных таксономических групп прокариот и определение филогенетического положения изучаемых микроорганизмов на общем дереве прокариот;

4) Применить результаты филогенетического анализа генов 16S рРНК для решения конкретных проблем идентификации вновь выделенных штаммов бактерий, описания новых таксонов бактерий, а также изучения биоразнообразия прокариотных сообществ различного происхождения;

5) Определить нуклеотидные и транслированные белковые последовательности некоторых структурных функциональных генов, детерминирующих различные процессы метаболизма прокариот, и изучить возможность использования сравнительного анализа полученных данных для решения проблем таксономии, эволюции и экологии прокариот;

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В данной работе на основании обобщения обширного экспериментального материала, касающегося изучения сходства генетических структур представителей различных групп прокариот, осуществлен анализ возможностей, предоставляемых молекулярной систематикой для решения кардинальных проблем таксономии и эволюции прокариот. Для этого в рамках работы:

- проведен анализ распределения уровней сходства геномов (определенных с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации) бактерий, представляющих практически весь таксономический спектр, что позволило установить бимодальный характер соответствующих графиков распределения.

Обсуждено значение результатов анализа для создания концепции вида у бактерий.

- предложено использование порядка Haloanaerobiales в качестве эталонного таксона при проведении таксономических исследований бактерий.

На основании изучения филогенетического положения всего порядка и родственных взаимоотношений внутри него представлены ориентировочные количественные критерии определения рангов таксонов бактерий от вида до семейства.

- разработаны новые сиcтемы олигонуклеотидных праймеров для избирательной амплификации генов 16S рРНК архей, а также новые системы специфических праймеров для амплификации структурных генов нитрогеназы (nifH) и генов больших субъединиц (cbbL и cbbM) рибулезо-1,5биcфосфаткарбоксилазы (РБФК).

- с использованием сиквенсЦанализа генов 16S рРНК проведено описание новых таксонов бактерий и архей, в том числе, 3 порядков, 4 семейств, 35 родов и 96 видов.

- в геноме сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii впервые у бактерий выявлено существование двух копий генов 16S рРНК, значительно (более 8% дивергенции) различающихся между собой за счет сверхдлинных вставок в концевых вариабельных участках последовательностей, и обсуждена возможность влияния обнаруженного феномена на проведение исследований по рибосомной филогенетике.

- в геномах ряда бактерий выявлены, отсеквенированы и проанализированы структурные гены, детерминирующие различные особенности метаболизма. Обсуждена возможность использования результатов этого анализа для решения проблем таксономии и эволюции исследованных физиологических групп бактерий.

- с применением сиквенс-анализа как рибосомных, так и функциональных генов осуществлены молекулярно-экологические исследования филогенетического разнообразия прокариот в ряде природных мест обитания.

Практическая значимость работы.

Разработан и применен в конкретных исследованиях метод ускоренной идентификации бактерий с помощью молекулярной гибридизации ДНК, защищенный авторским свидетельством № 649751 (1979 год).

Для выявления генов 16S рРНК у архебактерий, структурных нитрогеназных генов у архебактерий и бактерий, а также генов рибулозобисфосфаткарбоксилазы у бактерий разработаны новые системы олигонуклеотидных праймеров, пригодных для использования в экспериментальных филогенетических исследованиях;

С помощью комплекса методов геносистематики проведена идентификация ряда новых штаммов бактерий, относящихся к различным таксономическим группам, в том числе, возбудителей заболеваний человека и животных, имеющих большое значение для медицинской микробиологии, а также штаммов, перспективных для использования в промышленности и сельском хозяйстве.

ичный вклад соискателя.

В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в формировании тематики и направления конкретных молекулярно-биологических исследований; в выборе конкретных объектов и планировании экспериментальных подходов по их изучению; в поиске и разработке необходимых для проведения исследований методологических приемов; в получении экспериментальных данных с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации; в проведении компьютерного анализа результатов секвенирования последовательностей различных генов; в анализе, обсуждении и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад соискателя заключался в непосредственном участии в молекулярно-биологической части исследования - постановке задачи, проведении анализа полученных экспериментальных результатов, их обсуждении и окончательном литературном оформлении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании использования комплекса молекулярнобиологических методов возможно создание системы объективных количественных критериев родства прокариотных микроорганизмов.

2. Порядок Haloanaerobiales может быть использован в систематике бактерий в качестве эталонного таксона.

3. Несоответствие результатов фенотипического и филогенетического анализов может быть обусловлено особенностями эволюции прокариот.

4. Мультикопийность рибосомных генов в геноме одного прокариотного микроорганизма может влиять на результаты рибосомной филогенетики.

5. Филогенетический анализ последовательностей структурных генов, детерминирующих процессы метаболизма прокариот, может быть успешно использован в качестве дополнительного подхода к изучению таксономии и эволюции прокариот, уточняющего результаты рибосомной филогенетики.

Публикация материалов работы. По теме диссертации опубликовано 173 статьи в реферируемых российских и международных журналах, в том числе, 166 экспериментальных работ и 7 научных обзоров, а также получено авторское свидетельство.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на следующих научных мероприятиях:

FEMS Symposium УEvolution of ProkaryotesФ, Munich, Germany, 1984; VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985;

International Conference УThermophilesТ98Ф Le Quartz -Brest, France, 1998; IXth International Congress of bacteriology, 1999, Sydney, Australia; III Internacional Congress УExtremophiles -2000Ф, Hamburg, Germany 2000; Halophiles 2001, Sevilla, Spain, 2001; Конференция Биотехнологии - 2001. Пущино, Россия, 2001; Всероссийская конференция Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках. Санкт-Петербург, Россия, 2001; 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, 2002; 1-я Международная научно-практическая конференция Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона, Кызыл, Россия, 2002; 1st FEMS Congress of European microbiologist, Ljubljana, Slovenia, 2003; International Conference Thermophiles 2003. Exeter, UK, 2003; 8th International Symposium on Biogeochemistry of Wetlands. Gent, Belgium, 2003;

Всероссийский симпозиум Автотрофные микроорганизмы. Москва, Россия, 2005; 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005; 3-й Московский Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития".

Москва, Россия, 2005; 11th International Symposium on Microbial Ecology (ISME11), Vienna, Austria, 2006; 11th IWA World Congress jn Anaerobic Digestion, Queensland, Austraila, 2007, 7th International. Symposium for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, 2008.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа в форме научного доклада изложена на __ страницах и включает общую характеристику работы и экспериментальную часть, состоящую из описания основных результатов в трех частях, заключения и выводов. Работа содержит __ рисунков и __ таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования.

Объектами исследования служили культуры микроорганизмов, выделенные российскими исследователями и полученные нами из различных учреждений микробиологического профиля, а также пробы, полученные из природных источников.

Выделение ДНК. Для выделения и очистки препаратов суммарной клеточной ДНК, используемых в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации, применяли стандартные методики: для живых культур микроорганизмов по Marmur (1962), для фиксированных спиртом культур по Arrighi et al. (1968). Для выделения препаратов ДНК, используемых в сиквенс-анализе, применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Birnboim & Doly (1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США) (Булыгина и соавт., 2002).

Анализ ДНК. Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре плавления ДНК и рассчитывали по формуле Owen et al. (1969). Молекулярную гибридизацию тотальной ДНК на нитроцеллюлезных мембранных фильтрах проводили по методике Denhardt (1966).

Выбор олигонуклеотидных праймеров и амплификация ДНК. Для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена 16S рРНК в большинстве экспериментов была использована универсальная праймерная система и соответствующие условия реакции (Edwards et al., 1989). Однако для избирательной амплификации генов 16S рРНК архей была использована специально разработанная нами праймерная система [76]. Кроме того, нами были специально разработаны универсальные праймерные системы и соответствующие условия реакции для амплификации структурных генов нитрогеназы (nifH) [65], генов больших субъединиц (cbbL и cbbM) рибулезобисфосфаткарбоксилазы [101] и генов алкан-монооксигеназы (AlkB) [157].

Поиск нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих соответствующие функции метаболизма прокариот различных таксономических групп, был проведен в международном банке данных GenBank ( Процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW v 1.(Thompson et al., 1994). Построение консенсусной последовательности и поиск в ней консервативных участков осуществляли с помощью специально разработанной компьютерной программы Consens (Марусина А.И., неопубликованные данные).

Для амплификации генов FMO-белка (fmo) использовали ранее разработанные праймерную систему и условия реакции (Alexander et al., 2002).

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование полученных данных проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII, производство Biometra, Германия.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps Promega, США, согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование ДНК. Продукты ПЦР либо клонировали в клетках Escherichia coli с последующим секвенированием, либо сразу использовали для циклического секвенирования. Реакции секвенирования проводили в обоих направлениях с использованием прямых и обратных праймеров. Первоначально секвенирование проводили по методу Sanger et al. (1977) с использованием набора Silver Sequencing (Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборах Macrophore, (Pharmacia, Швеция) и SQ3 Sequencer, (Hoefer, США), при толщине полиакриламидного геля 0,19 мм. В последующем секвенирование проводили с помощью автоматического прибора (Applied Biosystems), в этом случае использовали набор DyeDeoxy Terminator cycle sequencing согласно рекомендациям производителя.

Методы филогенетического анализа (построение деревьев). Для предварительного анализа секвенированных последовательностей анализируемых генов использовали данные и программное обеспечение баз данных GenBank ( и Ribosomal Database Project (RDP) ( Редактирование, множественное выравнивание и трансляцию нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью редактора последовательностей BIOEDIT ( построения филогенетических деревьев использовали различные методы:

невзвешенный парно-груповой метод с арифметическим усреднением (UPGMA) (Sokal, Sneath, 1963); метод максимальной экономии (maximal parsimony) (Felsenstein, 1985), метод максимального правдоподобия (maximum likelihood) (Felsenstein, 1981), метод ближайшего связывания (neighbor-joining) (Saitou & Nei, 1987), метод максимального топологического подобия (Чумаков, Юшманов, 1988). Для построения деревьев использовали пакеты программ GeneBee (Бродский и соавт., 1991), TREECON (Van de Peer & De Watcher, 1994) и PHYLIP (Felsenshtein, 1990). Значимость филогенетических реконструкций оценивали методом бутстрэпа (bootstrap) (Felsenshtein, 1985), обычно с использованием 100 репликаций для анализа последовательностей генов 16S рРНК и 1000 репликаций для анализа последовательностей структурных генов.

Расчет относительных частот использования кодонов (RSCU) для структурных генов и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ CodonW (John Peden, < вновь полученные последовательности различных генов были депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей (GenBank) c присвоением им индивидуальных номеров доступа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЧАСТЬ I. ФОРМАЛИЗАЦИЯ КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ РОДСТВА БАКТЕРИЙ Молекулярная филогенетика определяет сложившиеся в процессе эволюции родственные взаимоотношения организмов, исходя из сравнения генетических текстов (генотипов) и их физических носителей (ДНК, РНК и белков). Она дает возможность исследователям при решении проблем эволюции и систематики организмов исходить не из гипотетических и в значительной степени субъективных представлений о возможных путях возникновения новых форм, а опираться на строго формализованные критерии, сводящиеся к количеству нуклеотидных замен. Для получения таких объективных (количественных) критериев в арсенале геносистематики существует постоянно расширяемый и совершенствуемый набор косвенных и прямых методов оценки сходства генетического материала организмов. К первым относятся определение нуклеотидного состава ДНК, гибридизационный анализ, а также анализ различных электрофоретических профилей (белковых, рестрикции и амплификации ДНК). Ко вторым непосредственное сравнение расшифрованных (секвенированных) аминокислотных последовательностей белков, а также нуклеотидных последовательностей как отдельных генов (главным образом, рибосомных), так и тотального генома (хромосомной и плазмидной ДНК).

1. Концепция вида у бактерий.

В микробиологии не существует общепринятой концепции биологического вида, аналогичной используемой зоологами и ботаниками. Согласно классическому определению Э.Майра (называемому также нео-Дарвиновским) "виды представляют собой группы скрещивающихся популяций, которые репродуктивно изолированы от других таких групп" или, иными словами, "вид есть защищенный генофонд" (Майр, 1971, с.40). Трудность применения этой концепции в микробиологии связана с тем, что прокариоты и многие эукариотические микроорганизмы не обладают полом в традиционном смысле и критерий репродуктивной изоляции к ним неприменим. Поэтому выделение видов из общей совокупности бактериальных штаммов в традиционной систематике прокариот оказывается в значительной степени субъективным.

Геносистематика предлагает определять вид, исходя из уровня сходства генетического материала сравниваемых микроорганизмов. В настоящее время принято, что штаммы прокариот относятся к одному виду в том случае, когда нуклеотидные последовательности их геномов гибридизуются, по меньшей мере, на 70% (сходство ДНК), а температуры плавления (Tm(e)) гомодуплексов и гетеродуплексов этих штаммов различаются между собой не более чем на 5% (Wayne et al., 1987; Stackebrandt et al., 2002). Крайнее значение 70%-го сходства выбрано по той причине, что штаммы, родственные на таком уровне и выше, обычно оказываются сходными и фенотипически по тем признакам, которые используются для идентификации на уровне вида. Несмотря на широкое распространение генотипического определения вида в практических таксономических исследованиях, относительно конкретного значения сходства последовательностей ДНК существует мнение, что оно является случайно выбранным и не должно употребляться догматически (Vandamme et al., 1996;

Rosello-Mora, 2006).

Проведенные в данной работе исследования позволяют прояснить вопрос, действительно ли выбор количественного критерия выделения вида является произвольной, субъективной операцией или отражает какие-либо закономерности процесса генетической дивергенции прокариот? Эти исследования опирались на статистический анализ распределения уровней сходства генетического материала, определенных с помощью количественных показателей одного из наиболее распространенных методов геносистематики - молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (тотальных геномов) с использованием собственных [1-31] и литературных данных. На результаты сравнительного статистического анализа может существенно влиять эффект неслучайности выборки объектов, связанный с предварительной сортировкой штаммов согласно номенклатурному принципу сходства с первоначально выбранным объектом - типовым штаммом, обозначенным в соответствии с принципом приоритета. Вовлечение в анализ значительного количества независимых определений, касающихся штаммов из многих родов различных таксономических групп бактерий, а также неидентифицированных штаммов (атипичных по фенотипическим свойствам либо новых, свежевыделенных из природной среды изолятов) позволяло в значительной степени избежать этого эффекта.

Полученный в результате анализа график распределения значений уровня гибридизации был бимодальным, с выраженным минимумом в области средних значений шкалы геномного сходства, т.е. примерно от 50% до 70% гибридизации (рис.1а). Аналогичный график распределения значений другого показателя - Tm(e) или уровня дивергенции последовательностей ДНК, также был бимодальным, с основным минимумом в области примерно от 4% до 8% (рис.1б). Данные статистической обработки полученных распределений свидетельствуют о достоверности существования отрицательного эксцесса в + + указанных областях (показатели эксцессии составляли -1.38 0.2 и -1.27 0.103000 59425400 8350 720300 61500 2524101312510 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Уровень гибридизации (%) Уровень дивергенции (%) б a вид род семейство и выше вид род семейство и выше Рис. 1. Распределение а) уровней гибридизации ДНК-ДНК (анализированы результаты 1научных публикаций, полученные при исследовании 54 родов бактерий) и б) уровней дивергенции последовательностей ДНК (анализированы результаты 57 научных публикаций, полученные при исследовании 40 родов бактерий). Верхние графики - общее распределение значений, нижние графики - распределение значений с учетом таксономической принадлежности сравниваемых микроорганизмов соответственно, т.е. превышали ошибку репрезентативности более чем в три раза). При этом было показано, что в область значений выше основного минимума по шкале геномного сходства и, соответственно, ниже основного минимума по шкале дивергенции последовательностей попадают, главным образом, пары организмов, относящиеся к одному виду, а в оставшиеся области на графиках - пары из разных видов, родов и т.д. Проведенный статистический Частота встречаемости Частота встречаемости анализ свидетельствовал о том, что степени сходства геномов бактерий дискретны на видовом уровне. При этом генотипическая дискретность соответствует наблюдаемой в природе фенотипической дискретности, позволяющей выделять из спектра эволюционирующих бактериальных форм ограниченные группировки - виды. Таким образом, используемое в таксономии бактерий генотипическое определение вида не является субъективным и произвольным, но, опираясь на естественные закономерности эволюционного процесса прокариот, имеет биологический смысл.

В то же время, статистический анализ распределения значений уровней гибридизации ДНК-ДНК свидетельствует о том, что величины конкретных значений критерия вида, предлагаемые его количественным генотипическим определением, действительно являются произвольно выбранными. Об этом можно судить по трансгрессирующему характеру графика распределения, выражающемся в отсутствии области абсолютного разрыва в распределении и существовании только области минимума значений с относительно широкими границами. Таким образом, несмотря на существование эволюционных закономерностей, поддерживающих границы между видами бактерий, точно обозначить эту границу с помощью количественных критериев сходства геномов, по-видимому, невозможно. Поэтому следует признать, что принятые в генотипическом определении конкретные количественные значения сходства геномов, характеризующие пределы дивергенции вида, имеют не эволюционный, а только таксономический номенклатурный смысл, давая таксономистам официальный, общепринятый операционный критерий в практических исследованиях. Применяя этот критерий в каждом конкретном случае, и соответственно, идентифицируя новый организм как представителя уже существующего вида или выделяя его в новый вид, необходимо учитывать не только имеющиеся в распоряжении таксономиста сведения о фенотипических особенностях организма, но и избегать возможных недоразумений (особенно в медицинской микробиологии), обусловленных требованием функциональности предлагаемой классификации.

1.2. Проблема эквивалентности таксонов бактерий Теория вопроса об эквивалентности таксонов в различных филогенетических группах живых организмов и возможностей решения этого вопроса с помощью методов геносистематики, главным образом, применительно к эукариотам, рассматривалась еще в середине 70-х годов (Антонов, 1974). Решение этой проблемы связывалось с созданием системы количественных критериев оценки рангов таксонов живых организмов, основанных на результатах различных методов сравнения их генетического материала.

Применение такого подхода оказалось особенно плодотворным в систематике прокариот. Результаты, полученные с помощью трех основных методов сравнения генетического материала: определения нуклеотидного состава ДНК, ДНК-ДНК гибридизации и анализа последовательностей 16S рРНК позволили количественно оценить степень генетической дивергенции большинства таксонов прокариот различного ранга. Эти результаты свидетельствовали о неэквивалентности многих традиционных таксонов прокариот, поскольку степень варьирования количественных критериев родства для таксонов одного ранга в различных физиологических группах значительно различалась. Следствием этого явилось начало эры кардинального пересмотра традиционной фенотипической систематики прокариот, которая продолжается до сих пор. При этом все сильнее проявлялось желание систематиков значительно упростить и формализовать проведение таксономических операций на основе использования количественных критериев сходства геномов прокариот.

1.2.1. Cопоставление данных ДНК-ДНК гибридизации и сиквенсанализа генов 16S рибосомных РНК на примере порядка Halanaerobiales (эталонного таксона) Вследствие технических особенностей метода ДНК-ДНК гибридизации степень информативности его результатов очень быстро падает по мере уменьшения степени родства организмов. Поэтому использование этих результатов в таксономии бактерий на внутриродовом уровне уже не является общепринятым.

Рибосомные гены более консервативны по сравнению с основной массой генома, поэтому методы их сравнительного анализа информативны на более высоком таксономическом уровне, чем метод гибридизации ДНК-ДНК. Однако высказывались сомнения в правомерности использования результатов сравнительного анализа данного молекулярного объекта для выявления процессов таксонообразования, и, следовательно, проведения с использованием этих результатов таких таксономических операций, как выделение таксонов и определения их ранга (Головлев, 1987, 1998). Кроме того, для большинства филогенетических групп прокариот было выявлено более или менее резко выраженное расхождение между данными генотипического и фенотипического анализов (полифилетичность высших таксонов), которое, как правило, увеличивалось по мере повышения таксономического ранга, что практически не позволяло провести статистический анализ количественных показателей, аналогичный таковому для метода гибридизации ДНК-ДНК.

На практике оказалось возможным получать количественные оценки сходства рибосомных генов для значительной части таксономического спектра, начиная с высших уровней родства - доменов, примерно до уровня видов со средней степенью родства, что соответствует области значений уровней гомологий последовательностей 16S рРНК ниже 97-98% (Stackebrandt, Goebel, 1994; Stackebrandt, Ebers, 2006). Однако уже многие виды прокариот невозможно различить с помощью этого метода, поскольку они могут иметь практически идентичные последовательности 16S рРНК, но низкий уровень сходства ДНК (до 25%) (Fox et al., 1992; Stackebrandt, Goebel, 1994).

В данной ситуации правомерно употребление в практических таксономических исследованиях бактерий подхода, использующего результаты изучения таксономии наиболее хорошо изученных (эталонных) таксонов.

Безусловно, выбор конкретных эталонных таксонов для интерпретации количественных результатов сходства геномов различных групп прокариот является весьма субъективным, поскольку систематику ни одного из существующих бактериальных таксонов нельзя признать полностью изученной.

Поскольку наиболее совершенной в настоящее время считается схема классификации семейства Enterobacteriaceae, оно наиболее часто предлагается в качестве эталонного таксона при определении схем взаимоотношений родов внутри других семейств.

На основании суммирования собственных [34-36, 43, 70, обзор 5] и литературных данных нам представляется весьма интересным рассмотрение в качестве эталона для составления классификационных схем прокариот такого таксономического подразделения бактерий как порядок Halanaerobiales (Rainey et al., 1995), объединяющего анаэробных органотрофных бактерий, являющихся обитателями различных суперсоленых экосистем.

В результате анализа генов 16S рРНК было установлено, что галоанаэробы имеют единое происхождение, составляя отдельную филогенетическую ветвь, точка ответвления которой находилась у основания основной филогенетической линии грамположительных бактерий. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК галоанаэробов с другими представителями линии грамположительных бактерий составлял всего лишь 75-80%. Следствием этих исследований и явилось создание нового порядка Halanaerobiales, в результате чего сложилась довольно редкая в бактериальной систематике ситуация, когда при описании таксона столь высокого ранга совпали данные фенотипического и генотипического анализов.

Для построения филогенетических схем и соответственно исследования таксономической структуры порядка Halanaerobiales использовали два основных метода сравнения нуклеотидных последовательностей - тотального генома (молекулярная гибридизация ДНК-ДНК) и генов 16S рибосомной РНК.

Сравнительный анализ филогенетических схем, основанных на данных ДНКДНК гибридизации и анализа генов 16S рРНК (рис. 2) показал отсутствие принципиальных различий между ними. Принципиальная корреляция между а б Рис. 2. Дендрограммы родственных взаимоотношений представителей порядка Halanaerobiales, основанные на (а) данных ДНК-ДНК гибридизации (шкала показывает % гибридизации ДНК-ДНК) и (б) на данных анализа генов 16S рРНК (для построения деревьев использован UPGMA алгоритм, масштаб соответствует 10 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью УbootstrapФ анализа 100 альтернативных деревьев; значения менее 95% не указаны).

обоими типами схем демонстрировалась неоднократно и при изучении других таксономических групп бактерий. Основные отличия схем были связаны с несовпадением областей информативности обоих методов. При этом обе схемы продемонстрировали значительное филогенетическое разнообразие галоанаэробов, соответствующее их функциональному разнообразию. Данные филогенетического анализа о родственных взаимоотношениях галоанаэробов в основном совпадали с таксономической структурой порядка Halanaerobiales, определенной с помощью фенотипического анализа.

Рибосомная филогенетическая схема свидетельствовала о том, что внутри порядка Haloanaerobiales существует два четко различимых кластера (рис.2б). Первый из них включал роды Halanaerobium, Halothermotrix и Halocella, второй - Halobacteroides, Halanaerobacter, Acetohalobium, Sporohalobacter, Orenia и Natroniella. Эти филогенетические кластеры соответствуют таксономическому разделению порядка Halanaerobiales на два семейства, соответственно, Halanarobiaceae и Halobacteroidaceae, основным фенотипическим различием которых является способность к спорообразованию (рис. 2б).

На внутриродовом уровне значительно повышается степень соответствия между данными определения сходства ДНК и сходства генов 16S рРНК. Это можно продемонстрировать на примере самого многочисленного таксона галоанаэробов - типового для семейства Halanaerobiaceae рода Halanaerobium, объединяющего 8 видов, для которых схемы взаимоотношений, основанных на результатах обоих методов, в значительной степени коррелируют (рис. 2а и рис. 2б).

Определение таксономической структуры описанных в настоящее представителей порядка Halanaerobiales дает возможность представить количественные генотипические характеристики, позволяющие устанавливать ранги таксонов в этой группе бактерий (Таблица 1).

Таблица 1. Количественные характеристики таксонов различного ранга внутри порядка Halanaerobiales.

Таксономический уровень Уровень сходства последовательностей (%) Тотальной ДНК Генов 16S рРНК Между семействами Менее 10 79 - Между родами одного семейства 5 - 27 83 - Между видами одного рода 8 - 67 91 -1Между штаммами одного вида 71 - 98 99 Ц1Используя порядок Halanaerobiales в качестве эталонного таксона, эти характеристики предлагается применять для определения рангов таксонов и в других группах бактерий.

1.2.2. Корреляция между результатами фенотипического и генотипического определения рангов таксонов бактерий Фенотипическая систематика основана на постулате, что сходство организмов отражает их родственные взаимоотношения, поэтому, чем теснее родство, тем выше степень сходства. Логично предположить, что результаты генотипической систематики, методы которой позволяют непосредственно оценивать сходство генетического материала, а, следовательно, родства организмов, должны, в значительной степени, соответствовать традиционным представлением, основанным на анализе сходства организмов.

Однако в систематике прокариот это оказалось относительно верным лишь на низшем таксономическом уровне (внутри- и межвидовом), поскольку результаты многочисленных экспериментальных исследований с применением различных методов геносистематики свидетельствовали о том, что около 90% традиционно классифицируемых родов прокариот имеют единое происхождение, и в этом смысле являются естественными. Естественность же традиционных таксонов более высокого ранга была подтверждена только в единичных случаях.

В то же время, уже на низших таксономических уровнях, начиная с видового, существуют примеры несоответствия данных фенотипического и генотипического анализов, используемых для проведения таксономических операций. Это обстоятельство привело к довольно широкому использованию в практике таксономических исследований терминов номенвид (nomenspeciesноменклатурный вид) и геновид (genospecies) - понимаемый как группа родственных штаммов, по данным генотипических методов (главным образом, ДНК-ДНК гибридизации) имеющих высокую степень сходства геномов. С введением генотипического количественного определения вида эту степень сходства стали определять как 70%-й уровень гибридизуемости ДНК.

К первой серии конфликтных ситуаций, имеющих большое практическое значение, относятся исследования, согласно результатам которых, в отдельных группах бактерий (главным образом, патогенных для человека и животных, и, следовательно, детально изученных) хорошо дифференцируемые с помощью фенотипических диагностических тестов номенвиды согласно результатам метода ДНК-ДНК гибридизации оказались единым геновидом.

Такая ситуация сложилась, например, для номенвидов родов Brucella (Verger et al., 1985); Bordetella (Kloos et al., 1981); Treponema (Miao, Fieldsteel, 1980); Mycobacterium (Baess, 1979) и Yersinia (Bercovier et al., 1980). Результаты аналогичного собственного исследования [18] представителей последнего рода представлены в таблице 2.

Таблица 2. Уровень ДНК-ДНК гибридизации видов рода Yersinia, вызывающих различные заболевания человека.

Исследуемые штаммы Уровень гибридизации с Y. pestis EV (вакцинный штамм) (%) 92-Y. pseudotuberculosis (10 эталонных вирулентных штаммов) 87-Y. pseudotuberculosis (15 вновь выделенных штаммов различной вирулентности) Y. enterocolityca (3 эталонных вирулентных штамма) В отдельных случаях подобные противоречия снимались посредством изменения классификации, т.е. описанием нового объединенного вида с составлением его уточненного фенотипического диагноза, из которого исключались не имеющие таксономического значения дифференциальные признаки. Однако в большинстве случаев вступает в действие требование приоритета фенотипических данных над генотипическим критерием выделения вида во избежание нарушения функциональности существующей классификации и возможной путаницы в номенклатуре столь важных (как в случае с возбудителями чумы) в медицинском отношении видов. Такой подход может быть оправдан и с эволюционной точки зрения, поскольку вполне вероятно быстрое видообразование при адаптации к принципиально новой экологической нише при незначительном уровне дивергенции геномов, обнаруживаемом с помощью приближенного метода ДНК-ДНК гибридизации.

Вторая довольно обширная серия несовпадения данных фенотипического и генотипического анализов объединяет альтернативные случаи, в которых обнаруживалась значительная генотипическая гетерогенность таксонов, которые в феносистематике признавались гомогенными. Обнаружение таких случаев уже на уровне вида на основании данных ДНК-ДНК гибридизации выражалось в существовании внутри номенвида групп с уровнем гибридизуемости, соответствующим количественному генотипическому определению вида. Такие группы в различных исследованиях обозначались как геномные группы, геномные виды, геномовиды, геновиды или геномовары (Ursing et al., 1995). Существование геномоваров внутри многих видов бактерий различных таксономических групп показано как с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации, так и других методов геносистематики. Исследования такого рода могут быть весьма значимыми для изучения микроэволюционных (происходящих на уровне вида) процессов в бактериальном мире.

К подобным исследованиям относится проведенное нами изучение генотипической гетерогенности вида Acidithiobacillus ferrooxidans [86]. В результате применения полифазного генотипического анализа штаммов вида Acidithiobacillus ferrooxidans различного происхождения (выделенных из различных типов руд и концентратов многих районов мира), с использованием методов пульс-электрофореза хромосомной ДНК, ДНК-ДНК гибридизации и сиквенс-анализа генов 16S рРНК было обнаружено их значительное генетическое разнообразие. Профили рестрикции хромосомной ДНК, полученные с помощью пульс-электрофореза, были строго индивидуальными для каждого штамма, но при этом не позволяли получить адекватных оценок геномного сходства изучаемых штаммов. По уровню гибридизации ДНК-ДНК изученные штаммы разделились на 4 геномовара и 6 значительно дивергировавших штаммов, не вошедших в геномовары (рис 3а). Для штаммов (включая типовой вида A. ferrooxidans), представляющих каждый из обнаруженных геномоваров и отдельных ветвей, были определены почти полные последовательности генов 16S рРНК. Эти последовательности были использованы в сравнительном анализе, включающем аналогичные последовательности всех представителей рода Acidithiobacillus, доступные из базы данных GenBank. В результате проведенного анализа было установлено (рис.3б), что большинство изученных штаммов A. ferrooxidans составляют монофилетический кластер с максимальным уровнем поддержки бутстрэпом (100). К этому же кластеру относился кластер штаммов (включая типовой) другого вида данного рода - A. thiooxidans, что свидетельствовало об общности их происхождения и близком родстве. В то же время, согласно анализу генов 16S рРНК штаммы A. ferrooxidans разделились на 4 филогенетические группы, эквидистантные аналогичной группе, образованной штаммами A. thiooxidans.

Распределение штаммов по филогенетическим группам в общем коррелировало с разделением на геномовары, однако, в одном случае представители двух различных геномоваров вошли в одну филогенетическую группу. Таким образом, была обнаружена значительная, составляющая несколько уровней, филогенетическая гетерогенность штаммов A. ferrooxidans, не проявляющаяся на уровне фенотипа.

При изучении A. ferrooxidans, как и при изучении других генотипически гетерогенных видов, возникает вопрос, является ли это разнообразие штаммов проявлением внутривидовой изменчивости, т.е. результатом микроэволюционных процессов, либо вид A. ferrooxidans представляет собой совокупность нескольких видов? На данном этапе исследований нельзя дать однозначного ответа. Если считать изученные изоляты представителями вида A.

ferrooxidans, то придется признать, что этот вид включает в себя несколько уровней внутривидовых образований, имеющих сходные фенотипы, но различающиеся по уровням сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и тотального генома. В таком случае, несоответствие этого и аналогичного номенвидов бактерий стандартному количественному определению вида является отражением действующих в этих случаях микроэволюционных закономерностей и, следовательно, обнаруживаемое при этом несоответствие данных фенотипического и генотипического анализов не является артефактом, а имеет биологический смысл. Существование генетически гетерогенных, содержащих фенотипически неразличимые геномовары видов бактерий можно предположительно объяснить особенностями процесса видообразования в случаях эволюционно длительного существования их представителей в специфической экологической нише. В таких случаях, нейтральные изменения в нуклеотидных последовательностях, обнаруживаемые с помощью методов геносистематики, не сопровождаются аналогичными изменениями на уровне фенотипа.

С другой стороны, в результате адаптации к изменению условий обитания в экологической нише или освоения новой экологической ниши (для отдельных геномоваров) могут начать накапливаться фенотипические различия, достаточно заметные для присвоения геномовару статуса отдельного вида.

Следовательно, не исключено таксономическое разделение (и уменьшение вследствие этого степени несоответствия данных) гетерогенных видов и придание геномоварам статуса самостоятельных видов, что обычно и происходит по мере обнаружения дифференциальных фенотипических различий между ними. Это может произойти и для некоторых геномоваров и/или филогенетических групп A. ferrooxidans в случае заметного изменения их фенотипических характеристик, аналогично ситуации с видом A. thiooxidans.

Такое изменение статуса геномоваров было произведено, например, в наших более ранних исследованиях, касающихся изучения генетической гетерогенности вида Kurthia zopfii [13]. Внутри данного вида было обнаружено 3 геномовара (уровень ДНК-ДНК гибридизации внутри геномоваров был 60100%, между геномоварами - 17-42%). В результате только за одним из них (содержащим типовой штамм вида) было оставлено название K. zopfii. Два других были выделены в качестве самостоятельных видов K. gibsonii и K.

sibirica вследствие применения нетрадиционных диагностических тестов, в частности, данных хемосистематики и выявления в результате этого дифференциальных фенотипических признаков для каждого из геномоваров.

Как уже указывалось, в большинстве случаев (до 90%) на родовом уровне Рис. 3. Дендрограммы родственных взаимоотношений штаммов вида A. ferrooxidans основанные на данных а) ДНК-ДНК гибридизации (дерево построено с помощью UPGMA алгоритма, шкала соответсвует уровням геномного сходства) и б) сиквенс-анализа генов 16S рРНК (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 85).

наблюдается корреляция между данными генотипического и фенотипического анализов. Однако и на этом уровне в экспериментальных исследованиях были обнаружены несоответствия, аналогичные описанным выше для видового уровня. Классическим примером служит ситуация с бактериями родов Escherichia и Shigella, уровень сходства геномов которых соответствует внутривидовому, но номенклатура не изменена по соображениям, аналогичным приведенным для иерсиний. В наших исследованиях случай значительных фенотипических различий при высоком уровне геномного сходства был обнаружен при таксономическом анализе двух штаммов сульфатобразующих бактерий из содовых озер. Один из них, штамм ALG 1, оказался представителем эритробактерий - облигатно аэробных бактерий, синтезирующих бактериохлорофилл a, а другой, штамм AHO 1, - факультативно-автотрофной водород-использующей бактерией.

Филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показал принадлежность обоих штаммов к одному подразделению альфа-протеобактерий. Неожиданно оказалось, что оба штамма образуют единый монофилетический кластер с высоким уровнем гомологии последовательностей - 96.5%, занимающий промежуточное положение между родами Rhodobacter и Rhodovulum (рис.4а).

Этот результат затруднил определение таксономического статуса обоих штаммов. С одной стороны - высокий уровень генотипического родства (соответствующий межвидовому, как для других представителей данного подразделения, так и для эталонного порядка Halanaerobiales), а с другой - значительные фенотипические различия, поскольку такие свойства, как водородзависимая автотрофия и наличие бактериохлорофилла, традиционно являются дескрипторами родового уровня, формально не позволяющие отнести данные штаммы к одному роду. Поскольку штамм ALG 1 был описан первым, по совокупности фенотипических и генотипических свойств он был выделен в новый род и вид Roseinatronbacter thiooxidans [46]. Штамм AHO 1, хотя и близкородственный генотипически к R. thiooxidans, вряд ли может быть отнесен к тому же роду согласно требованию приоритета фенотипических данных, позволяющему сохранить функциональность классификации, поэтому его таксономический статус так и остался неопределенным [56]. Объяснением этому и другим подобным случаям (в том числе, и на видовом уровне) могут быть действительно существующие эволюционные закономерности:

ускоренное приобретение представителями близкородственных таксонов новых фенотипических свойств, при сохранении стандартных темпов накопления нейтральных замен в нуклеотидных последовательностях.

Противоположная ситуация наблюдается для таких родов, как Clostridium и Bacillus. Выделение этих родов и определение их таксономического статуса во многом было основано на морфологических (таких, как спорообразование) и физиолого-биохимических (таких, как отношение к кислороду) признаках.

Между тем, такие характеристики могут иметь неопределенное таксономическое значение или быть весьма консервативными на фенотипическом уровне [обзор 4] при значительной дивергенции как детерминирующих их молекулярных структур, так и всего генома.

Неудивительно, что в результате применения различных методов геносистематики была обнаружена более значительная степень генетической дивергенции этих родов по сравнению с большинством других родов бактерий.

Первоначально, на основании применения метода каталогов олигонуклеотидов 16S рРНК было предложено признать обнаруженную неэквивалентность этих и большинства других бактериальных родов как свидетельство их различного эволюционного возраста (Stackebrandt, 1988). Однако впоследствии оказалось, что согласно сиквенс-анализу генов 16S рРНК оба этих рода разделились на некоторое количество филогенетических кластеров, причем уровень гомологий последовательностей между представителями каждого из кластеров был относительно невысоким, соответствующим межродовому уровню для других филогенетических групп бактерий (Ash et al., 1991; Collins et al., 1994). При тщательном анализе фенотипических характеристик представителей обнаруженных кластеров в некоторых случаях удавалось создать комплекс дифференциальных тестов, позволяющих описать тот или иной кластер как самостоятельный род. В качестве примера подобного исследования можно привести проведенное нами изучение таксономии рода Geobacillus [71].

Согласно анализу последовательностей генов 16S рРНК многие термофильные бациллы оказались объединенными в филогенетический кластер 5 (Ash et al., 1991). Кроме близкородственных (уровень гомологий 98.5-99.2%) термофильных бацилл к этому же кластеру, но на более низком уровне родства, относились вид B. thermoglucosidasius и термофильный аспорогенный вид Saccharococcus thermophilus. При исследовании различных высокотемпературных экосистем был выделен ряд новых штаммов термофильных бацилл, которые согласно предварительным фенотипическим исследованиям были близки к видам кластера 5. В результате сравнительного генотипического анализа, включающего определение уровня сходства тотальных ДНК и последовательностей генов 16S рРНК (рис 4б), были описаны несколько новых видов бацилл, принадлежащих к кластеру 5. На основании всего комплекса данных было предложено изменить таксономию рода Bacillus, выделив из него виды (включая вновь описанные) филогенетического кластера 5 в состав нового рода Geobacillus.

Таким образом, и на родовом уровне возможно уменьшение степени несоответствия данных фенотипического и генотипического анализов а б Рис. 4. Альтернативные случаи несоответствия данных фенотипического и генотипического (на основании сиквенса генов 16S рРНК) анализов на родовом уровне. а) Филогенетическое положение алкалофильных сульфат-образующих гетеротрофов Roseinatronobacter thiooxidans ALG 1 и факультативно автотрофного штамма AHO 1 в системе альфа- Proteobacteria и б) Филогенетическая дивергенция рода Bacillus и пересмотр его классификации на примере выделения нового рода Geobacillus (деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 85).

посредством изменения классификации.

В то же время, поскольку различия в степени генетической дивергенции таксонов одного ранга в различных филогенетических линиях, могут быть обусловлены закономерностями эволюции бактерий, систему количественных критериев оценки родства бактерий не следует рассматривать как жестко заданные рамки, ограничивающие таксон. Поэтому применять эту систему для определения рангов таксонов в практических таксономических исследованиях конкретных групп бактерий необходимо только в комплексе с результатами фенотипического анализа, добиваясь маскимального соответствия данных.

ЧАСТЬ 2. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РИБОСОМНОЙ ФИЛОГЕНЕТИКЕ Наиболее дискуссионным в молекулярной филогенетике остается вопрос, насколько адекватно эволюция структур исследуемых макромолекул отражает эволюцию организмов. Выбор конкретного вида биополимера, на анализе структуры которого будут основаны построения эволюционных схем, является критическим моментом филогенетических исследований. Безусловно, что наиболее полную информацию о филогенезе организмов можно получить при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей всего генома, особенно в том смысле, что на этом уровне суммируются и усредняются скорости всех моногенных "молекулярных часов". Такими исследованиями занимается быстро развивающаяся новая наука геномика. Однако поскольку эти исследования технически слишком сложны и трудоемки, в настоящее время в молекулярной филогенетике преимущественно используются методы сравнительного анализа отдельных генов и/или их генопродуктов (моногенные).

Для определения родственных взаимоотношений живых организмов, а в особенности прокариот, наиболее широко распространено использование сравнительного анализа рибосомных генов, кратко называемое рибосомной филогенетикой. Основополагающей идеологией рибосомной филогенетики является признание рибосомных генов в качестве идеального молекулярного хронометра для реконструкции эволюционной истории и построения луниверсального дерева живых организмов (Woese, 1987; 1998). Выбору рибосомных генов в качестве молекулярных хронометров способствовал и тот факт, что для них давление естественного отбора осуществляется не на белок, ими кодируемый, а непосредственно на первичную структуру самого гена, поскольку его конечным продуктом является РНК-копия. Кроме того, преимущественное использование рибосомных генов в качестве филогенетических маркеров обусловлено их универсальностью, высокой степенью консервативности первичной структуры, функциональной стабильностью, сравнительной легкостью определения их последовательностей (секвенирования) и, наконец, особенностями первичной и вторичной структур, связанными с присутствием в их нуклеотидных последовательностях участков с различной степенью вариабельности.

Рибосомная филогенетика предоставила микробиологам чрезвычайно удобный экспериментальный подход - возможность с помощью единой, универсальной методики определять филогенетическое положение любого микроорганизма. Уже расшифровано несколько сотен тысяч последовательностей преимущественного филогенетического маркера рибосомных генов малой субъединицы рибосомы 16S рРНК прокариот, на основании чего созданы постоянно пополняющиеся международные банки данных, доступные через мировую сеть Интернета каждому исследователю.

Неудивительно поэтому, что сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК уже настолько широко используется для идентификации и классификации прокариот, что стал в настоящее время своего рода скелетом систематики прокариот и обязательной стадией в конкретных таксономических исследованиях по описанию новых таксонов.

2.1. Использование результатов рибосомной филогенетики для описания новых таксонов прокариот Филогенетический анализ, использующий сравнение последовательностей генов 16S рРНК, являясь в настоящее время обязательной частью описания новых таксонов прокариот, в каждом конкретном случае имеет свои индивидуальные особенности. При этом общими для всех исследований этапами процесса является определение положения нового микроорганизма (или группы близкородственных микроорганизмов) на филогенетическом дереве прокариот, а также определение уровня генетической дистанции между новым организмом и представителями известных таксонов с применением количественных критериев оценки степени родства. В качестве дополнительных этапов анализа, подтверждающих монофилетичность и естественность предполагаемых новых таксонов (что для таксонов ранга семейства и выше становится обязательным), проводится определение особенностей вторичной структуры и поиск специфических (сигнатурных) позиций в последовательностях генов 16S рРНК.

Результаты проведенных в данной работе исследований [35-37, 39-40, 43, 46, 49-51, 53-55, 57, 59-61, 63, 68-73, 75, 80-84, 88-90, 92-93, 95-99, 102, 104, 106, 109-111, 113-114, 117-119, 122-124, 130-132-133, 135, 137-140, 142-143, 146, 148, 150-151, 153-156, 158-165] по применению результатов филогенетического анализа генов 16S рРНК для описания новых таксонов прокариот суммированы в таблице 3.

Таблица 3. Новые таксоны, описанные при участии автора с использованием филогенетического анализа генов 16S рРНК.

Филогенетическо Описание новых таксонов е подразделение Порядок (3), Вид (96) Cемейство (5) Род (35) Альфа- Roseinatronobacter R. thiooxidans,R. monicus протеобактерии Methylopila Mp. capsulata, Mp. helvetica Methylarcula M. marina, M. terricola Albibacter А. methylovorans Thelmatospirillum T. siberiense Thioclava T. pacifica Citreicella C. thiooxidans Methylobacterium suomiense,M.

lusitanum, M. dichloromethanicum Paracoccus kondratievae Roseococcus subuntuyensis Бета- Methylobacillus pratensis протеобактерии Spirillum winogradskii, Spirillum kriegii Гамма- Thioalkalimicrobium Tm. aerophilum, Tm. sibericum, Tm.

протеобактерии Thioalkalivibrio cyclicum Tv. versutus, Tv. nitratis, Tv. paradoxus, Tv. denitrificancs,, Tv. thiocyanoxidans, Tv. jannaschii, Tv. nitratireducens, Tv.

Thioalkalispira hiocyanodenitrificans Ectothiorhodosinus Т. microaerophila Halospina E. mongolicum H. denitrificans Halovibrio denitrificans Thioalkalibacter Thiomicrospira halophila Thiohalospira T. halophilus, T. halophila Thiohalorhabdus Ths. alkaliphila Thr. denitrificans Ectothiorhodospira variabilis Дельта- Desulfovermiculus D. halophilus протеобактерии Geoalkalibacter G. ferrigidriticum Desulfonatronospira D. thiodismutans, D. delicata Desulfacinum subterraneum Desulfurivibrio alkaliphilus Грамположитель Haloanaerobiales, ные бактерии Halanaerobiaceae (клостридиальна Halobacteroidaceae я линия) Halonatronum H. saccharophilum Orenia O. sivashensis Halobacteroides elegans Geobacillus G. subterraneus, G. uzenensis, G.

uralicus, G. gargensis, G. jurassicus Thermovenabulum T. ferriorganovorum Carboxydobrachium C. pacificum Carboxydocella С. thermautotrophica, C.

Anoxynatronum sporoproducens Tepidibacter A. sibiricum Anaerobranca T. thalassicus Alkalibacter A. californiensis Thermincola A. saccharofermentans Tepidimicrobium T. carboxydiphila, T. ferriacetica Natronobacillus Tp. ferriphilum N. azotifigens Thermoanaerobacter siderophilus Thermanaerovibrio velox Desulfotomaculum alkaliphila Heliobacterium sulfidophilum, H.

undosum Heliorestis baculata Amphibacillus fermentum, A. tropicus Bacillus edaphicus, B. mucilaginosus, B.

alkalidiazotrophicus, B. alkalinitrilicus Sulfobacillus sibiricus, S. thermotolerans Alicyclobacillus tolerans Desulfotomaculum salinum Clostridium alkalicellum Thermoanaerobacterium acidotolerans Bacillus alkalidiazotrophicus Clostridium tepidiprofundi Caldicellulosiruptor kronotskyensis, C.

hydrothermalis Carboxydothermus siderophilus Ammonifex thiophilus Грамположитель Nitriliruptorales ные бактерии Nitriliruptoraceae (актиномицетная Nitriliruptor Nitriliruptor alkaliphilus линия) Зеленые Oscillochloridaceae несерные бактерии Зеленые серные Chlorobaculum macestae бактерии Новая Caldithrix C. abyssi филогенетическа я линия бактерий Кренархеи Acidilobales Acidilobaceae Acidilobus А. aceticus, A. saccharovorans Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus fermentans Эвриархеи Methanosarcina lacustris В качестве примера исследований данного раздела можно привести описание новых порядков в доменах бактерий и архей.

2.1.1. Описание нового порядка Nitriliruptorales в актиномицетной линии грамположительных бактерий Из содовых озер была получена стабильная культура бинарного прокариотного консорциума, способного разрушать изобутиронитрил, токсическое органическое соединение, с трудом поддающееся биодеградации.

Хотя доминантным компонентом в этом консорциуме оказался спирилловидный морфотип (идентифицированный впоследствии как представитель относящегося к гамма-протеобактериям рода Marinospirillum), главную роль в разрушении изобутиронитрила играл другой морфотип:

короткие грамположительные неподвижные палочки, выделенные впоследствии в чистую культуру.

Филогенетический анализ, основанный на сравнении генов 16S рРНК [165], позволил поместить использующий нитрилы микроорганизм в класс Actinobacteria в качестве новой независимой линии (рис.5). При этом он формировал единый независимый кластер с несколькими некультивируемыми актинобактериями, найденными в различных природных экосистемах, включая содовые озера. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК внутри этого кластера варьировал от 93.1% до 95.9%. Отметим, что к некоторым группам актинобактерий, таким как родококки, Arthrobacter, Nocardia и Gordonia относятся многие высокоактивные нитрил-гидролизующие штаммы, включая используемые в промышленности. Однако у представителей известных таксонов актинобактерий не было обнаружено последовательностей генов 16S рРНК, сходных с последовательностью нового штамма более чем на 85%. Кроме того, в последовательностях генов 16S нового штамма и близких к Рис. 5. Филогенетическое дерево актинобактерий, основанное на сиквенс-анализе генов 16S рРНК с положением на нем нового микроорганизма (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 70).

нему клонов были обнаружены сигнатурные позиции, специфически отличающие их от других представителей класса Actinobacteria. В настоящее время класс Actinobacteria состоит из 6 порядков, самым многочисленным и разнообразным из которых является порядок Actinomycetales. Новый организм, являясь по морфологии типичной актинобактерией, филогенетически, повидимому, является потомком примитивных (предковых) актинобактерий, составляя среди современных представителей этого класса независимую линию происхождения.

Таким образом, вновь выделенный штамм может быть признан в качестве первого галоалкалофильного разрушающего нитрилы микроорганизма, составляющего новую линию внутри класса Actinobacteria. Основываясь на уникальных фенотипических особенностях этого организма и его необычном филогенетическом положении на дереве актинобактерий, было предложено описать его как новый род и вид Nitriliruptor alkaliphilus, являющийся типовым для нового семейства Nitriliruptoraceae и нового порядка Nitriliruptorales внутри класса Actinobacteria.

2.1.2. Описание нового порядка Acidilobales в линии кренархей Из кислых термальных озер Камчатки были выделены несколько новых штаммов анаэробных гипертермофильных органотрофных архей, два из которых были описаны в качестве типовых для новых видов нового рода Acidolobus aceticus и A. saccharovorans [59, 105, 166]. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК показал (рис. 6), что новые изоляты составляют единый кластер (с уровнем сходства около 98%) внутри линии Crenarchaeota домена Archaea. Этот кластер был филогенетически связан с другим кластером, объединяющим органотрофых, экстермально термофильных архей рода Caldisphaera. К обоим кластерам, кроме выделенных в чистую культуру штаммов, относились также некультивируемые клоны кренархей (с уровнем сходства 93-97%), представленные в кислых горячих озерах различных географических зон. В последовательностях генов 16S рРНК штаммов и клонов, составляющих оба кластера, были обнаружены специфические сигнатурные позиции, которые отличали как представителей каждого из кластеров, так и их обоих от остальных кренархей (Таблица 4).

Принимая во внимание обособленное положение группы Acidilobus - Caldisphaera на филогенетическом дереве, присутствие общих специфических сигнатурных нуклеотидов в последовательностях генов 16S рРНК, общих фенотипических характеристик, отличающих эту группу от видов порядка Desulfurococcales и других Crenarchaeota, а также их широкое распространение в природных экосистемах было предложено объединить их в новый порядок Acidilobales. Однако, учитывая разделение на два кластера внутри общей группы, существование специфических для каждого кластера сигнатурных Таблица 4. Специфические сигнатурные позиции, отличающие Acidilobus и Caldisphaera от других Crenarchaeota и друг от друга.

Сигнатурные Соответствующие нуклеотиды позиции* Acidilobus Caldisphaera Desulfurococcales, Crenarahaeota Thermoproteales, Sulfolobales 62 U C U U 321:332 C:G C:G A:G A:G 678 C U U U 1056 U C U U 1310-1327 G:C A:U A:U A:U 1335 C C G A,C,G 1393 U U C C * - Нумерация по E.coli Сигнатуры определены по выравниванию 623 последовательностей кренархей и составляют не менее 97% соответствующих нуклеотидов на позиции.

позиций, а также различный интервал оптимальных для роста температур, было предложено описать в новом порядке два семейства: Acidilobaceae, представляющее гипертермофилов рода Acidilobus и близких к ним некультивируемых архей, и Caldisphaeraceae, представляющее экстремальных термофилов рода Caldisphaera, а также близких к ним некультивируемых архей.

2.2. Использование рибосомной филогенетики в экологических исследованиях В современной биологии происходит постепенный поворот от преимущественного изучения отдельных организмов к изучению организмов в сообществах, всевозможных связей между членами сообщества и взаимодействия сообщества с окружающей средой. В микробиологии это выражается в значительном увеличении количества исследований биоразнообразия прокариот в различных природных местах обитания, особенно характеризующихся экстремальными условиями. В современных экологических исследованиях сохранился как традиционный подход к изучению микробных сообществ, который был основан на классическом микробиологическом принципе, требующем обязательного выделения и культивирования на специальных питательных средах в лабораторных условиях чистой культуры микроорганизмов, так и принципиально новый подход, называемый молекулярной экологией и не требующий выделения микроорганизмов в чистую культуру. Для обоих подходов преимущественным инструментом является рибосомная филогенетика.

Рис. 6. Филогенетическое дерево кренархей, основанное на сиквенс-анализе генов 16S рРНК с положением на нем новых микроорганизмов (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 70).

2.2.1. Филогенетический скрининг микробных изолятов различного происхождения В результате упрощения и ускорения техники сиквенса нуклеиновых кислот и вследствие накопления значительного массива общедоступных данных по структуре последовательностей генов 16S рРНК произошло изменение в методологии традиционного подхода. Это изменение заключается в том, что в настоящее время предварительное исследование выделенных из природных мест обитания чистых культур микроорганизмов различных функциональных групп, производят с помощью сиквенса и анализа генов их 16S рибосомной РНК (Jones, 1998). Такой предварительный филогенетический скрининг позволяет определить направление дальнейших трудоемких микробиологических исследований. Результаты филогенетического скрининга могут варьировать от точной видовой идентификации всех изолятов до обнаружения уникального положения каждого изолята на филогенетическом дереве, что впоследствии может привести к описанию их в качестве первых представителей новых таксонов, как демонстрируется на представленных примерах.

2.2.1.1. Филогенетическое разнообразие органотрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацин Из пластовых вод изучаемого месторождения было выделено более чистых культур аэробных сапротрофных бактерий и на основании сравнения последовательностей 16S рРНК проведен их филогенетический анализ [85].

Согласно результатам этого анализа (рис.7а), оказалось, что культивируемое в аэробных условиях сообщество преимущественно включает представителей двух ветвей линии грамположительных бактерий. Грамположительные изоляты относились к родам Bacillus, Brevibacillus, Rhodococcus, Dietzia, Kocuria, Gordonia, Cellulomonas и Clavibacter. Таким образом, проведенный филогенетический скрининг выделенных штаммов позволил идентифицировать различных коринеформных бактерий (Rhodococcus ruber, Dietzia maris, Kocuria rosea), широко распространенных и в других нефтяных месторождениях, а также бактерий, которых ранее в нефтяных пластах не обнаруживали - Clavibacter michiganansis и Gordonia aichiensis. Это позволило расширить представление о метаболических возможностях и биоразнообразии аэробных микроорганизмов в изучаемой экосистеме.

2.2.1.2. Алкалофильные сахаролитические бактерии Была изучена группа из 13 штаммов сахаролитических алкалофильных облигатно- и факультативно анаэробных бактерий, выделенных из содовых озер Нижнее Белое (Юго-восточное Забайкалье) и Магади (Кения). Согласно анализу генов 16S рибосомной РНК [45] все алкалофилы изучаемой группы б а Рис. 7. Филогенетический скрининг бактериальных изолятов различного происхождения на основе сиквенс анализа генов 16S рРНК а) аэробных грамположительных органотрофов из пластовых вод нефтяного месторождения Дацин (КНР); б) сахаролитических алкалофильных анаэробных бактерий, выделенных из содовых озер (деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов).

относились к филогенетическому подразделению грамположительных бактерий с низким содержанием ГЦ-пар в ДНК. Вместе с тем, внутри этого подразделения изучаемая группа оказалась филогенетически неоднородной и разделилась на 5 подгрупп, относящихся к различным ветвям грамположительных бактерий (рис. 7б). Организмы первой и второй подгрупп (облигатные анаэробы) оказались близки представителям различных кластеров гетерогенного рода Clostridium (Collins et al., 1994); третьей и четвертой (факультативные анаэробы) - к представителям подгруппы Bacillus panthotenicus группы 1 филогенетического спектра бацилл (Ash et al., 1991), а пятой (факультативный анаэроб) - к представителям порядка Halanaerobiales (Rainey et al., 1995). Все исследуемые алкалофильные бактерии впоследствии были описаны как новые таксоны. Следует отметить также, что исследованные нами новые организмы не были близки ни к одной из ранее обнаруженных в содовых озерах групп алкалофильных организмов. Таким образом, проведенные нами исследования подтвердили мнение о функциональном и филогенетическом многообразии алкалофильных прокариот, обитающих в содовых озерах. Тот факт, что все изученные алкалофилы, оказались новыми формами микроорганизмов свидетельствует о том, что изучение этого многообразия еще только начинается.

2.2.2. Использование результатов рибосомной филогенетики в молекулярной экологии прокариот Принципиальным отличием методов молекулярной экологии является их способность непосредственно изучать генотипическое разнообразие всех представителей определенного природного сообщества без выделения членов сообщества в чистую культуру (Pace, 1996; Amann, 2000). К настоящему времени в чиcтую культуру выделено и описано около 8000 видов прокариот.

Между тем эксперименты последних лет в области микробной экологии привели к двум взаимосвязанным заключениям: в исходном природном сообществе каждой конкретной экосистемы а) культивируемые микроорганизмы составляют лишь незначительную часть и б) разнообразие культивируемых микроорганизмов не отражает действительного биоразнообразия.

Появление и усовершенствование различных методов молекулярной биологии - гибридизационного анализа, секвенирования, молекулярного клонирования и полимеразной цепной реакции (ПЦР) привело к созданию методологии молекулярной экологии. Эта методология объединена единым принципом - изучение биоразнообразия осуществляется на основании анализа отдельных элементов геномов членов изучаемого сообщества. Поскольку молекулярно-экологический подход не ограничен обязательным принципом чистой культуры, полученные с его применением результаты могут существенно дополнить и расширить представления о микробном разнообразии, а во многих случаях даже изменить их на основании обнаружения новых, некультивируемых организмов.

Специфическая амплификация и сиквенс-анализ генов 16S рРНК (лрибосомная филогенетика) является наиболее распространенным инструментом молекулярной экологии. Для того чтобы подчеркнуть, что молекулярная экология изучает природные сообщества не на уровне целых организмов, а на уровне отдельных элементов их геномов, предложен термин филотип. Выявление филотипов в природном сообществе не зависит от возможности или невозможности культивирования представленных этими филотипами организмов. Таким образом, использование молекулярных методов в экологических исследованиях позволяет получить филогенетическую информацию об отдельных членах сообщества, даже если они еще не известны микробиологам (Уmicrobiota incognitaФ). Особенно интересные результаты с применением такого подхода можно получить при изучении микробного биоразнообразия необычных, экстремальных мест обитания.

2.2.2.1. Филогенетическое разнообразие архейного компонента микробных обрастаний на коралловидных постройках в зонах выхода метана в Черном море При изучении некоторых экосистем складывается парадоксальная ситуация, когда известно о протекании в этой системе определенного процесса, доказано, что этот процесс имеет биологическую природу, но остаются неизвестными организмы, осуществляющие этот процесс. Примером такой ситуации является изучение процессов микробного окисления метана (метанотрофии). Микроорганизмы, осуществляющие аэробное окисление метана (аэробные метанотрофы), их видовой состав, метаболизм и экология достаточно хорошо изучены. Однако при изучении морских глубоководных экосистем оказалось, что значительная часть метана потребляется еще в анаэробной зоне, не доходя до слоев воды, обогащенных кислородом. В настоящее время подсчитано, что в этот процесс вовлекается 5-20% от общего количества метана, поступающего в атмосферу. Однако процесс анаэробного окисления метана оказался классическим черным ящиком - организм(ы), его осуществляющий(ие), и, соответственно, механизм самого процесса оставались и, несмотря на интенсивные исследования, до сих пор остаются неизвестными.

Согласно одному из гипотетических сценариев этого процесса, он является сопряженным и включает транспорт электронов от метана к сульфату и, возможно, осуществляется несколькими организмами, включая метаногенов (с обратным метаболизмом) и сульфат-восстанавливающих бактерий. В настоящее время наиболее строгим доказательством данной гипотезы является обнаружение с помощью одного из методов молекулярной экологии, FISHтехнологии, микроконсорциумов, состоящих из архей-метанотрофов (близких к Methanosarcinales) и бактерий-сульфатредукторов, в некоторых обогащенных метаном морских анаэробных экосистемах (Boetius et al., 2000), В нашем исследовании молекулярно-экологический подход был впервые применен для исследования архейного компонента бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных построек в зоне выхода газовых струй (метановых сипов) на глубинах около 200 м в Черном море.

Предварительно была разработана и протестирована система олигонуклеотидных праймеров, позволяющая избирательно амплифицировать и секвенировать гены 16S рРНК архей из природных микробных сообществ [76]. В результате применения этой системы были выявлены и анализированы филотипы архей, представленные в суммарной ДНК изучаемого сообщества [77]. Результаты проведенного нами исследования (рис. 8) свидетельствовали о том, что архейный компонент в исследуемом сообществе представлен только одним филотипом, относящимся к Euryarchaeota, и двумя - к Crenarchaeota.

Филотип эвриархей являлся представителем группы ANME-1, периферически связанной с метаногенами порядков Methanosarcinales и Methanomicrobiales, и составляющей, по мнению описавших ее впервые исследователей (Hinrichs et al., 1999), новый порядок. Исходя из их филогенетического положения, археи группы ANME-1 относят к метаногенам, однако судить об особенностях их метаболизма можно лишь предположительно, поскольку пока эта группа представлена только филотипами, и для нее не выделено ни одного культивируемого вида.

Представители группы ANME-1 до сих пор были обнаружены только в обогащенных метаном анаэробных экосистемах. Следовательно, можно предположить, что именно эти археи являются специфическими обитателями подобных экосистем и играют существенную роль в протекающих в них процессах. Это предположение предположительно распростаранялось и на обнаруженный в нашем исследовании единственный филотип эвриархей группы ANME-1, который, возможно, ассоциируется с преобладающим в данном сообществе морфотипом. Впоследствии это предположение было подтверждено экспериментами с использованием FISH-технологии, показавшими, что в обнаруженных в исследуемой природной экосистеме микроконсорциумах, осуществляющих анаэробное окисление метана, действительно присутствуют представители группы ANME-1 (Michaelis et al., 2002).

Роль архей, принадлежащих к Crenarchaeota и близких к группе морских некультивируемых кренархей Marine Benthic Group B, 2 филотипа которых выявлены в изучаемой экосистеме, в происходящих в ней метаболитических процессах пока остается неизвестной.

Рис. 8. Филогенетический анализ архебактериального компонента бактериального обрастания коралловидных построек в местах выхода метана в Черном море. Дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются только максимальные значения 100). Масштаб представляет собой эволюционные расстояния (5 нуклеотидных замен на каждые 100 нуклеотидов). Некультивируемый клон, ранее обнаруженный в метаноокисляющих микроконсорциумах подчернут.

2.2.2.2. Филогенетический анализ ацидотолерантного микробного метаногенного сообщества из торфяных болот В последние 10-15 лет начался интенсивный процесс изучения северных болот, как возможных источников значительной эмиссии метана в атмосферу.

Последние достижения в области изучения микрофлоры сфагновых торфяных болот связаны с выделением двух новых родов ацидофильных метанотрофов Methylocella и Methylocapsa (Dedysh et al., 2000; 2002). Однако выделить в чистую культуру и описать ацидофильные метаногены, обитающие в тех же природных условиях, все еще не удалось. На стадии проведенного исследования удалось получить относительно простые (1-2 метаногена + несколько бактериальных сателлитов) и стабильные к регулярным пересевам высоко обогащенные смешанные культуры ацидотолерантных метаногенов.

Наряду с применением микроскопических и культуральных методов исследования, для исследования этих культур были использованы молекулярно-экологические методы, включающие сиквенс-анализ генов 16S рРНК и in situ гибридизацию со специфическими олигонуклеотидными зондами.

Исследовали два стабильных ацидотолернатных микробных сообщества, л26 и К, происходящие из двух вариантов сфагновых болот. Оба сообщества образовывали метан из газовой смеси СО2:Н2 при оптимуме рН=4.5-5.5.

Проведенный в результате амплификации и клонирования сиквенс-анализ генов 16S рРНК [94] свидетельствовал о том, что в обоих изучаемых сообществах присутствовал как архейный, так и бактериальный компоненты. В обоих сообществах было обнаружено всего три филотипа архей, при этом два из них ассоциировались с известными группами метаногенов (рис. 9а).

Единственный архейный филотип из сообщества л26 принадлежал к роду Methanobacterium, в котором он мог, однако, составлять новый вид. Один из двух филотипов сообщества К принадлежал к порядку Methanomicrobiales, однако внутри этого порядка он был близок только к некультивируемым организмам из разных природных экосистем. Оставшийся архейный филотип сообщества К относился к новой филогенетической линии метаногенов, названной ранее Rice cluster I и содержащей только некультивируемые организмы (Grokopf et al., 1998).

Бактериальный компонент изучаемых сообществ был более разнообразным, составляя в общем 8 филотипов, принадлежащих к 5 основным линиям эволюции бактерий (рис. 9б). Три филотипа, присутствовавшие в обоих сообществах, составляли единый филогенетический кластер, близкий к альфапротеобактериальным родам Magnetospirillum и Phaeospirillum. Единственный выделенный в чистую культуру член сообщества л26 по структуре последовательностей 16S рРНК оказался идентичным б а Рис. 9. Филогенетические деревья представителей ацидотолерантного микробного метаногенного сообщества из торфяных болот (а) архебактерии; (б) бактерии. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 нуклеотидным/аминокислотным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 95).

одному из филотипов этого сообщества, что свидетельствует о том, что выявленные филотипы не являются артефактами, а действительно представляют присутствующие в изучаемом сообществе микроорганизмы.

Впоследствии бактерии этого кластера были описаны как новый род Thelmatospirillum [140]. Остальные бактериальные сателлиты распределились следующим образом: в сообществе л26 еще один филотип относился к линии Flavobacterium-Bacteroides-Cytophaga, в которой был близок к новому роду Tannerella (ранее Bacteroides forsytus); в сообществе К один филотип относился к линии зеленых несерных бактерии, два других - к линии Acidobacterium-Fibrobacter и последний - к дельта-протеобактериальному роду Syntrophobacter.

Для дальнейшего исследования метаногенов в сообществе К был использован другой молекулярно-экологический метод - FISH-технология, результаты которого сравнивались с данными прямой флуоресцентной микроскопии данного сообщества. В гибридизации in situ применялись два олигонуклеотидных зонда: предложенный ранее для детекции метаногенов порядка Methanomicrobiales, и de novo сконструированный нами на основании сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК для детекции некультивируемых метаногенов новой филогенетической линии Rice cluster I.

Флуоресцентная микроскопия исследуемого сообщества свидетельствовала о присутствии там трех морфотипов: а) преобладающие прямые палочки с прямоугольными краями; б) сравнительно редкие длинные нити; в) редкие мелкие изогнутые клетки. Согласно результатам in situ гибридизации длинные тонкие изогнутые нити оказались представителями порядка Methanomicrobiales, а преобладающие в сообществе прямые палочки - представителями Rice cluster I. Третий морфотип, по-видимому, принадлежал доминантному в сообществе бактериальному сателлиту. Совпадение результатов обоих типов молекулярноэкологических методов продемонстрировало, что обнаруженные в данном сообществе филотипы не являются лабораторными артефактами, а соответствуют составляющим это сообщество микроорганизмам.

Таким образом, по крайней мере, 11-12 компонентов изучаемых ацидотелерантных сообществ сфагновых болот представляют новые таксоны прокариот различных рангов, причем их обнаружение стало возможным только в результате применения молекулярно-биологических методов.

2.3. Мультикопийность генов 16S рРНК в геноме одного прокариотного микроорганизма При использовании результатов рибосомной филогенетики в таксономии и экологии прокариот признается, что каждый отдельный штамм (культивируемый организм) и каждый член сообщества (некультивируемый организм) представлен уникальным типом последовательности гена 16S рРНК (филотипом). Такой принцип реализуется, если ген 16S рРНК существует в геноме каждого организма в единственной копии. Для многих прокариот это действительно так, однако существует заметное количество микроорганизмов, в геноме которых данный ген может быть представлен и в нескольких копиях (максимально до 15 на геном). В связи с обнаружением явления мультикопийности генов 16S рРНК у прокариот возникла необходимость определения степени гетерогенности отдельных копий в геноме одного организма. Проведение специальных исследований показало, что у большинства видов прокариот множественные копии генов 16S рРНК идентичны или близки к идентичности. Именно это обстоятельство позволяет широко использовать сиквенс-анализ данных генов в филогенетических исследованиях [обзор 6].

В то же время, существуют, хотя и немногочисленные, данные о значительной гетерогенности (до 5-6%) отдельных копий генов 16S рРНК у некоторых прокариот, например, у археи Haloarcula marismortui. Между тем, уже 1.0-3.0% замен (примерно до 50 нуклеотидов на ген) в последовательностях генов 16S рРНК считаются достаточными для утверждения о принадлежности сравниваемых прокариотных организмов к различным видам (Stackebrandt, Ebers, 2006).

Для бактерий аналогичная ситуация была впервые обнаружена нами у грамположительной сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii [62]. Определение полной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК у типового штамма этого вида с помощью обычной методики ПЦР амплификации с универсальными олигонуклеотидными праймерами оказалось невозможным из-за неоднозначности сиквенса на концевых участках последовательности. Поэтому было выполнено специальное исследование для выявления возможного присутствия нескольких копий гена 16S рРНК в геноме этого организма. Выделение ДНК при этом было проведено из единичной колонии, а затем полученные с помощью универсальных концевых праймеров амплификаты длиной около 1700 нуклеотидов были использованы для создания библиотеки клонов. Анализ полученной библиотеки выявил присутствие в геноме изучаемого микроорганизма двух копий гена 16S рРНК, обнаруживающих значительную гетерогенность. Основные различия были сосредоточены в 5Т- и 3Т- концевых вариабельных регионах последовательностей на позициях, соответствующих 68 - 101 и 1445 - 1457 по номенклатуре E. coli, где были выявлены вставки, существенно различающиеся по длине и по первичной структуре (рис. 10). Длина 5Т- концевых вставок составляла 109 и 106 нуклеотидов для генов rrnA и rrnB, а 3Т- концевых вставок - 109 и 118 нуклеотидов, соответственно. Менее значительные различия между генами (9 нуклеотидных замен) были найдены в вариабельной области, Рис. 10. Выравнивание 5Т- и 3Т- концевых вариабельных регионов двух копий гена 16S рРНК D. kuznetsovii 17T с последовательностями, аналогичными последовательностям некоторых близких видов рода Desulfotomaculum. Вставки впоследовательностях двух генов 16S рРНК ( rrnA и rrnB) D. kuznetsovii 17T выдлены серым; обозначения -- D. luc - D. luciae SLTT; D. tbz - D. thermobenzoicun DSM 6193T; D. tac - D.

thermoacetoxidans DSM 5813T; 7475 - Desulfotomaculum sp. DSM 7475; D. aus - D. australicum ACM 3917T; D. tsp - D. thermosapovorans DSM 6562T; D.

geo - D. geothermicum DSM 3669T.

соответствующей 178-198 позициям по номенклатуре E. coli, а в остальной части последовательностей была обнаружена только одна замена - T или C на 264 позиции по номенклатуре E. coli. Общий уровень дивергенции последовательностей двух копий гена 16S рРНК у D. kuznetsovii 17T был весьма значительным и достигал 8.3%. Обнаруженные вставки формировали адекватную вторичную структуру в виде удлиненных по сравнению со стандартным вариантом (E. coli) шпилек (рис. 11), что позволяло предположить возможность их экспрессии при образовании рРНК.

Рис.11.

Предполагаемая вторичная структура сверхдлинных шпилек на 3'- и 5'- концах последовательностей двух копий гена 16S рРНК из D. kuznetsovii 17T.

Для выявления возможного влияния обнаруженного феномена гетерогенности копий гена 16S рРНК на филогенетические заключения были построены два различных филогенетических дерева нескольких близких видов термофильных сульфатвосстанавливающих бактерий рода Desulfotomaculum.

Для построения первого дерева (Рис. 12а) использовали полные последовательности сравниваемых генов 16S рРНК, в том числе, и двух копий данного гена из D. kuznetsovii 17T. Второе дерево (Рис. 12б) было построено на основании варианта анализа, проведенного с исключением 5Т и 3ТЦконцевых вариабельных участков последовательностей, содержащих сверхдлинные вставки.

Из сравнения двух деревьев видно, что филогенетическое положение на них двух копий гена D. kuznetsovii 17T различно. Согласно положению на Рис. 12. Филогенетическое положение генов rrnA и rrnB D. kuznetsovii 17T. а) - дерево, построенное на основании сравнения полных последовательностей генов 16S рРНК; б) - дерево, построенное после исключения из анализа вариабельных 5Т и 3Т Цконцевых участков генов 16S рРНК. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 90).

дереве полных генов, каждый из них образует отдельную ветвь, в то время как при исключении из анализа вариабельных участков, оба гена значительно ближе располагаются на филогенетическом дереве, образуя монофилетический кластер, а уровень различий последовательностей в этом случае не превышает 0.8% (что находится в пределах экспериментальной ошибки).

Как следует из полученных нами данных, существование в геноме одного микроорганизма двух (возможно и более) существенно различающихся копий гена 16S рРНК, может существенно затруднить таксономическую интерпретацию полученных филогенетических данных. Чтобы уменьшить вероятность искажения филогенетических данных и их таксономической интерпретации, можно рекомендовать обязательно исключать из анализа гипервариабельные участки последовательности гена 16S рРНК, особенно содержащие длинные вставки.

Мультикопийность рибосомных генов и возможная гетерогенность различных копий в геноме одного организма заставляет сомневаться, действительно ли выявленные при изучении генотипического разнообразия прокариот в молекулярно-экологических исследованиях филотипы представляют отдельные организмы, или часть из них считается таковыми за счет различий в первичной последовательности разных копий генов 16S рРНК.

Приходится признать возможность того, что группы некультивируемых природных клонов с высокой степенью сходства последовательностей генов 16S рРНК, которые очень часто обнаруживаются при проведении молекулярноэкологических исследований, представляют не отдельные, близкородственные штаммы организмов, а скорее, гетерогенные копии данных генов внутри одного штамма. Исключение из филогенетического анализа вариабельных участков последовательностей гена 16S рРНК также может способствовать уменьшению количества подобных ошибок.

ЧАСТЬ 3. ФИЛОГЕНЕТИКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГЕНОВ Несмотря на то, что рибосомная филогенетика стала одним из наиболее используемых способов определения родственных взаимоотношений прокариот, вопрос о том, отражает ли эволюция этого гена (как и любого другого единичного гена) эволюцию всего генома все еще остается дискуссионным. Разрешения этого вопроса, по-видимому, следует ожидать на основании сравнения рибосомных филогенетических схем с аналогичными схемами, построенными по результатам анализа последовательностей полных геномов организмов. Однако поскольку из-за технических сложностей такие схемы все еще остаются приблизительными и мало детализованными, в настоящее время применяется паллиативный подход, заключающийся в сравнении рибосомных схем с другими моногенными построениями, основанными на анализе генов, функционально не связанных с рибосомными.

Поскольку основной целью молекулярной филогенетики следует признать реконструкцию филогенеза организмов, а не макромолекул, наибольшего приближения к истине можно ожидать при использовании сравнительного анализа индивидуальных дендрограмм, иначе - смешения филогений. Смешение филогений позволяет выявить основные тенденции эволюции живых организмов. При этом используются следующие постулаты:

совпадение эволюционных заключений, вытекающих из схем, основанных на результатах различных подходов, со значительной долей вероятности можно признать как отражение действительных событий эволюционной истории организмов; совпадение топологий эволюционных схем указывает на наиболее вероятную последовательность эволюционных событий. С другой стороны, несовпадение дендрограмм может свидетельствовать об особенностях эволюционного процесса организмов: т.е. о возможном различии скоростей эволюции, например, в результате смены функций макромолекул, существования функционально обусловленного предела вариабельности макромолекул и, особенно, возможного участия в эволюционной истории организмов событий горизонтального переноса генов между отдельными филогенетическими линиями.

Таким образом, сравнительный анализ различных филогенетических построений, по большей части включающий и обязательное использование традиционных уже рибосомных генов-маркеров, может привести к наиболее полной реконструкции событий эволюционной истории организмов, поскольку позволяет существенно дополнить данные и взаимно устранить недостатки и ограничения каждого из индивидуальных подходов. В данном разделе будут приведены примеры таких комплексных филогенетических исследований некоторых групп микроорганизмов, используемые для уточнения таксономии и эволюции этих групп.

3.1. Филогения зеленых серных бактерий на основании сиквенсанализов рибосомных генов и генов FMO-белка (fmo) В роли особо успешных филогенетических маркеров, способных дополнить или даже заменить в этом качестве рибосомные гены, предполагается использовать так называемые гены домашнего хозяйства (housekeeping genes). Это термин подразумевает гены, функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма и необходимые для его жизнедеятельности. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п. Универсальность распространения, консервативность в эволюции, малая вероятность вовлечения в горизонтальный перенос генов - все эти, аналогичные рибосомным генам характеристики, позволяют использовать филогенетику этих генов в таксономических исследованиях, дополняя и уточняя результаты рибосомной филогенетики.

FMO-белок (Fenna-Mattews-Olson protein) является уникальным филогенетическим маркером для филогенетической линии зеленых серных бактерий (фила Chlorobi). Он представляет собой необычный водорастворимый белок, связанный с бактериохлорофиллом а и располагающийся между цитоплазматической мембраной и хлоросомами. Ген, детерминирующий этот белок, присутствует у всех известных бактерий этой линии. Поэтому хотя этот ген и не является универсальным для всех бактерий геном домашнего хозяйства, для данной группы его можно рассматривать в качестве такового.

Именно это обстоятельство способствует его использованию в качестве альтернативного маркера для изучения филогении этих бактерий.

Традиционная систематика зеленых серных бактерий была основана на легко определяемых фенотипических признаках. Характерные особенности, использованные для их фенотипической классификации, включали морфологию клеток и их организацию, состав пигментов и спектры поглощения, наличие газовых вакуолей, используемые источники углерода и азота, доноры электронов, но, как оказалось, не имели столь большого значения, которое им ранее придавали. Это заключение было обусловлено тем обстоятельством, что фенотипическое дифференцирование зеленых серных бактерий не соответствовало их филогении, основанной на анализе последовательности генов 16S рРНК (Imhoff, 2003). Применение анализа специфичных исключительно для зеленых серных бактерий генов fmo (Alexander et al., 2002; Imhoff, 2003), в том числе, и в наших исследованиях новых организмов этой группы [147-148], полностью подтвердили результаты анализа генов 16S рРНК, что обычно характерно для анализа генов домашнего хозяйства.

Топологии филогенетических деревьев (Рис.13а, б), основанные на двух типах данных, в значительной степени конгруэнтны, что, в частности, позволило нам провести точную видовую идентификацию новых организмов этой группы - штаммов C, X и L. В то же время, результаты анализа генов fmo позволили прояснить таксономический статус нового штамма М. Согласно анализу генов 16S рРНК, этот штамм занимал промежуточное положение между кластерами представителей родов Chlorobaculum и Chlorobium, что не позволяло точно определить его родовую таксономическую принадлежность.

Анализ генов fmo однозначно свидетельствовал о принадлежности его к кластеру видов рода Chlorobaculum, что и позволило предложить отнести его этому роду в качестве самостоятельного нового вида. Хотя в настоящее время не существует практических рекомендаций по использованию сведений о филогении альтернативных генам 16S рРНК молекулярных маркеров в таксономии бактерий, использование дополнительных филогенетических данных, касающихся генов, обязательных для жизнедеятельности конкретной группы или бактерий в целом, может помочь прояснить сомнительные в эволюционном и таксономическом аспекте случаи.

3.2. Филогения метанотрофных бактерий на основании сиквенсанализа рибосомных и нитрогеназных (nifH) генов Следующая группа потенциальных филогенетических маркеров - это гены, детерминирующие различные процессы метаболизма бактерий. Эти гены не являются универсальными как гены домашнего хозяйства или облигатно необходимыми для определенной филогенетической группы, как FMO-гены.

При этом детерминируемые ими функции могут иметь разную значимость для организмов, их осуществляющих: для одних они облигатные, для других - факультативные, зависящие от особенностей местообитания или условий культивирования. Кроме того, для многих подобных генов существует возможность горизонтального переноса между микроорганизмами. Этим определяется то обстоятельство, что хотя такие гены и допустимо использовать в качестве филогенетических маркеров, значимость результатов их анализа а б Рис. 13. Филогенетическое дерево семейства Chlorobiaceae, построенное на основании анализа (а) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК; (б) аминокислотных последовательностей гена fmo. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным/аминослотным заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислотных остатков.

Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 90).

может значительно варьировать как для разных генов, так и для разных групп прокариот. Среди таких функциональных структурных генов особое место принадлежит нитрогеназному комплексу, ответственному за трансформацию молекулярного азота в минеральные и органические вещества, доступные для микроорганизмов и растений. Несмотря на большую экологическую и практическую значимость процесса азотфиксации, особенности его эволюции, а также вопросы филогении и разнообразия азотфиксирующих бактерий в природных сообществах все еще являются дискуссионными.

Ферментный комплекс нитрогеназы состоит из двух субъединиц: FeMoбелка, кодируемого генами nifD и nifK, и Fe-белка, который кодируется геном nifH. Ген nifH является одним из наиболее консервативных функциональных генов, причем филогения бактерий, основанная на анализе последовательностей этого гена, в целом коррелирует с данными, полученными при анализе 16S рРНК (Achouak et al., 1999, [121]), что подтверждает коэволюцию этих функционально не связанных генов и позволяет использовать результаты анализа нитрогеназных генов в качестве дополнительных маркеров в таксономических исследованиях. Однако при сопоставлении дендрограмм, полученных на основании результатов сиквенс-анализа обоих типов, в отдельных группах прокариот можно обнаружить и их несоответствия, на основании которых удается проследить некоторые особенности эволюции нитрогеназного ферментного комплекса. В наших исследованиях [65] была разработана система из дополняющих друг друга трех олигонуклеотидных праймеров (один прямой и два обратных), позволяющих амплифицировать достаточно протяженные фрагменты nifHЦгенов у широкого таксономического спектра прокариот. Разработанные праймеры были применены для амплификации и севенирования фрагментов nifHЦгенов у представителей различных филогенетических линий прокариот, в том числе, группы штаммов, относящихся к различным типам метанотрофных бактерий [78].

В результате проведения филогенетического анализа определенных de novo транслированных (аминокислотных) последовательностей nifHЦгенов метанотрофных бактерий было построено филогенетическое дерево (рис.14б), топология которого в значительной степени коррелировала с результатами филогенетического анализа генов 16S рРНК (рис.14а), что не противоречило имеющимся в литературе данным, полученных ранее для данной группы бактерий (Auman et al, 2001). Это позволяет использовать нитрогеназные построения, как в таксономических, так и в экологических исследованиях. В частности, представленные в банке данных последовательности nifH генов некультивируемых азотфиксирующих бактерий NR1624 и NR1620 из пресноводных водоемов, по результатам проведенного анализа оказались Рис. 14. Филогенетическое дерево метанотрофных бактерий, построенное на основании анализа (а) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (организмы, для которых последовательности генов 16S рРНК определены в данном исследовании - выделены жирным; организмы, для которых в данном исследовании определены последовательности генов nifH - подчеркнуты; (б) аминокислотных последовательностей гена nifH. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее нуклеотидным/аминкиослотным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 85).

филогенетически очень близкими к метанотрофам родов Methylomonas и Methylobacter.

В то же время, существовали и некоторые расхождения между рибосомным и нитрогеназным деревьями. В частности, наиболее заметным отклонением от корреляции оказалась ситуация с метанотрофом Methylococcus capsulatus, который согласно данным фенотипического анализа и сиквенсанализа генов 16S рРНК относится к метанотрофам I типа, принадлежащим к гамма-протеобактериям (рис. 12а). В то же время, согласно данным сиквенсанализа nifHЦгенов представители вида Methylococcus capsulatus оказались филогенетически ближе к метанотрофам второго типа, хотя и образовали самостоятельный кластер внутри альфа-протеобактерий. Этот факт заставил вернуться к неоднократно обсуждавшемуся в научной литературе вопросу о роли горизонтального переноса нитрогеназных генов в процессе эволюции азотфиксаторов. Одно время гипотеза о распространении способности к азотфиксации в различных группах диазотрофных бактерий с помощью латерального (межвидового) переноса генов была весьма популярной. Однако обнаружение значительной корреляции между топологиями рибосомных и нитрогеназных деревьев, в общем подтверждающей коэволюцию данных генов, свидетельствовало против этой гипотезы. В то же время, обнаруженное нами локальное несовпадение дедрограмм позволяет предположить, что в случае Methylococcus capsulatus ген nifH в этом организме мог появиться вследствие горизонтального переноса нитрогеназных генов от метанотрофов II типа. Следует отметить, что хотя формально этот микроорганизм и относится к метанотрофам первой группы, многие авторы на основании целого ряда физиолого-биохимических особенностей выделяют его в отдельную группу X (Hanson&Hanson, 1996). Именно у этого вида, наряду с метанотрофами второй группы, была ранее установлена способность к диазотрофии, в отличие от остальных представителей метанотрофов первого типа, которые ранее не считались азотфиксаторами.

Таким образом, сопоставление рибосомной и нитрогеназной дендрограмм не только позволяют проследить особенности эволюции азотфиксирующей способности у различных прокариот, но и может указывать направление дальнейших исследований для интенсивного изучения биохимии этого процесса. В то же время, возможное участие в эволюции диазотрофии процессов горизонтального переноса нитрогеназных генов несколько ограничивает возможность их использования в качестве филогенетических маркеров.

3.3. Филогения алкалофильных облигатно автотрофных сероокисляющих бактерий на основании сиквенс-анализа генов 16S рРНК и рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК) К группе структурных функциональных генов, детерминирующих важные признаки метаболизма прокариот, относится также рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК), которая является ключевым ферментом автотрофной фиксации СО2 в цикле Кальвина, наиболее широко распространенном механизме автотрофного метаболизма. Хотя свойства РБФК были обстоятельно исследованы классическими биохимическими методами, данные о происхождении и эволюции этого фермента ограничены (Watson & Tabita, 1997). Известно, что автотрофные организмы, ассимилирующие СОчерез цикл Кальвина, принадлежат к различным и удаленным друг от друга эволюционным ветвям. Поэтому вопрос о моно- или полифилетическом происхождении РБФК остается открытым.

По структурным и функциональным свойствам различают 4 формы фермента. Первая (включающая зеленый и красный типы) и вторая формы свойственны бактериям и хлоропластам растений и водорослей. Форма III недавно обнаружена у архей. К форме IV относятся РБФК-подобные белки зеленых серных бактерий.

Ген большой субъединицы РБФК и его аминокислотная последовательность хорошо подходят для филогенетического анализа, поскольку молекула является достаточно длинной (приблизительно 4аминокислотных остатков) и высоко консервативной. Однако, хотя сравнительный анализ последовательностей генов РБФК различных представителей бактерий и архей свидетельствовал об их гомологичности, филогения РБФК в целом не соответствует данным рибосомной филогенетики. Поэтому в данном случае сравнение филогений может быть довольно ограниченным для целей таксономии, но весьма существенным для изучения эволюции прокариотных автотрофных организмов, а также пластид водорослей и высших растений.

В результате проведения компьютерного анализа имеющихся в современных банках данных первичных последовательностей генов РБФК бактерий различных филогенетических групп в них были выбраны наиболее консервативные участки. На основании этих данных нами были подобраны соответствующие универсальные олигонуклеотидные праймеры, которые впоследствии были использованы для обнаружения и секвенирования генов РБФК красного и зеленого типов формы I, а также формы II у представителей различных физиологических и таксономических групп автотрофных бактерий [101].

Примером проведенных исследований с использованием РБФК в качестве дополнительного филогенетического маркера может служить изучение филогении новых, алкалофильных облигатно хемолитоавтотрофных представителей сероокисляющих бактерий, выделенных из содовых озер. Хотя все эти бактерии, согласно данным филогенетического анализа относились к гамма-протеобактериям, по результатам фенотипического анализа они разделились на две основные группы, различающиеся по многим признакам [68].

3.3.1. Филогения группы Thiomicrospira Представители одной группы, обозначенные как быстрорастущие штаммы (характеризующиеся также низким содержанием ГЦ-пар в ДНК) образовали по данным анализа генов 16S рРНК новый филогенетический кластер, разделивший кластер нейтрофильных тионовых бактерий рода Thiomicrospira. Таким образом, оказалось, что этот род генетически гетерогенен и содержит, по крайней мере, два отдельных таксона надвидового уровня, объединяющихся либо вокруг Tms. crunogena (Кластер 1), к которому относились и водород-окисляющие бактерии рода Hydrogenovibrio, либо Tms. pelophila (Кластер 2), к которому относились также и новые алкалофильные бактерии (рис.15а).

Значительные фенотипические и генотипические отличия новых алкалофильных сероокисляющих бактерий от представителей обоих кластеров Thiomicrospira, свидетельствовали о невозможности отнесения их к этому роду.

Кроме того, значительный уровень фенотипической и генотипической дивергенции между новыми штаммами указывал на то, что они не могут быть объединены на видовом уровне. Таким образом, было сделано заключение о выделении этого кластера штаммов алкалофильных сероокисляющих бактерий в новый род Thioalkalimicrobium [68, 82], объединяющий 3 новых вида. Это заключение, в свою очередь, указывало на необходимость пересмотра таксономии рода Thiomicrospira.

Облигатная автотрофия представителей всей группы бактерий, условно обозначенной как Thiomicrospira, свидетельствовала о возможность использования для уточнения таксономии и эволюции этой группы филогенетического анализа генов РБФК. В результате проведения такого анализа [128, 132] уже на первой его стадии оказалось, что полученные результаты хорошо коррелируют с рибосомной филогенией этой группы. У всех представителей кластера 2 был выявлен множественный набор генов РБФК (два гена cbbL зеленого типа и один ген cbbM), в то время как у представителей рода Thiomicrospira, относящихся к кластеру 1, было выявлено два гена РБФК (cbbL зеленого типа и ген cbbM), а у бактерий нового рода Thioalkalimicrobium - только один ген cbbL зеленого типа.

Кроме того, топология филогенетического дерева РБФК в той его а б Рис. 15. Филогенетическое дерево алкалофильных автотрофных бактерий группы УThiomicrospira, построенное на основании анализа а) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (организмы, для которых последовательности генов 16S рРНК определены в данном исследовании - подчеркнуты; организмы, для которых в данном исследовании определены последовательности генов cbbL - подчеркнуты пунктиром; б) аминокислотных последовательностей гена cbbL. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5/10 нуклеотидным/аминокислотным заменам на каждые 1нуклеотидов/аминокислотных остатков. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 70).

области, которая относилась к одному из генов cbbL, представленному у всех представителей группы Thiomicrospira (рис.15б), практически совпадала с топологией рибосомного дерева. Анализ этих генов, во-первых, подтвердил монофилетичность всей группы, предполагаемую на основании анализа генов 16S рРНК, а во-вторых, - разделение представителей группы на филогенетических кластера. Таким образом, результаты проведенного нами комплексного филогенетического анализа свидетельствуют в пользу необходимости таксономической ревизии этой группы; более конкретно - разделения ее на четыре рода внутри нового монофилетического семейства Thiomicrospiraceae. Роды Thioalkalimicrobium и Hydrogenovibrio достаточно отделены от рода Thiomicrospira физиологически и генетически, чтобы сохранить за ними исходный родовой статус. Род Thiomicrospira целесообразно в будущем разделить на два рода, основанных на кластерах 1 (лTms.

crunogena) и 2 (лTms. pelophila). Следовательно, в исследуемой филогенетической группе ген РБФК (cbbL) может быть успешно использован в качестве дополнительного филогенетического маркера в таксономических исследованиях.

Полученные нами данные расширяют круг микроорганизмов, обладающих множественными наборами генов РБФК. Причинами мультикопийности генов в настоящее время считаются либо их дупликация (с возможной избирательной потерей одной из копий в процессе эволюции), либо горизонтальный перенос генов. Эти эволюционные механизмы возможны и для объяснения результатов изучения группы Thiomicrospira, что не противоречит предложенной ранее гипотезе происхождения трех наборов генов, кодирующих РБФК, в геноме относящейся к исследуемой группе водородокисляющей бактерии H. marinus (Yoshizawa et al., 2004).

3.3.2. Филогения рода Thioalkalivibrio В противоположность предыдущему исследованию, при изучении другой группы алкалофильных автотрофных бактерий были обнаружены значительные отклонения от корреляции двух типов филогений. Согласно данным сиквенсанализа генов 16S рРНК штаммы этой группы алкалофилов, обозначенные как медленно растущие (с высоким уровнем ГЦ-пар в ДНК), составили новый отдельный кластер внутри семейства Ectothiorhodospiraceae (рис.16а).

Обособленное филогенетическое положение этого кластера, а также значительные фенотипические различия новых организмов и представителей описанных родов этого семейства не вызывают сомнений в родовом статусе изучаемой группы, вследствие чего ее было предложено выделить в новый род Thioalkalivibrio, включающий в настоящее время 9 эффективно описанных видов [68, 82, 83, 93, 97, Banciu et al., 2004]. В то же время, внутри единого филогенетического кластера эти виды разделяются на 3 филогенетические подкластера (1, 2 и 3). Кроме того, данный род чрезвычайно разнообразен и по морфо-физиологическим критериям. Поэтому для уточнения таксономии и эволюции автотрофных бактерий этого рода был проведен анализ генов РБФК.

У всех изученных видов этого рода было обнаружено по одному гену cbbL зеленого типа [112, 145]. Однако топология построенного на основании анализа этого гена филогенетического дерева заметно отличалась от топологии рибосомного дерева. Прежде всего, на РБФК-дереве (рис.16б), в отличие от рибосомного дерева, род Thioalkalivibrio не являлся монофилетичным, хотя его разделение на независимые кластеры отчасти коррелировало с внутренней филогенетической дивергенцией, выявляемой по результатам анализа рибосомных генов.

Из сравнения результатов анализа двух типов данных следовало, что к наиболее обширному подкластеру 1, объединяющему виды Tv. versutus, Tv.

jannaschii, Tv. nitratis и Tv. thiocyanoxidans, относятся, безусловно, родственные организмы, имеющие единое происхождение. Представители этой группы, несмотря на физиолого-биохимические различия, позволяющие разделить их на самостоятельные виды, имеют типичную для данного рода вибрионоподобную форму клеток c полярным жгутиком. Виды подкластера 3, Tv. denitrificans и Tv.

thiocyanodenitrificans, с палочковидной формой клеток и способностью к денитрификации, относятся к отдельной филогенетической подгруппе, которая согласно результатам анализа последовательностей генов 16S рРНК, расположена на дереве ближе всего к точке ответвления всего кластера рода Thioalkalivibrio. Согласно филогенетическому анализу генов cbbL, эта пара видов также значительно дивергировала от основной группы облигатно аэробных видов, настолько, что даже межвидовое родство в ней не прослеживается, поскольку каждый из видов образует самостоятельные ветви с неопределенным положением на дереве.

Особенно интересно филогенетическое положение подкластера 2, объединяющего виды Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus. Согласно результатам анализа генов 16S рРНК, они составляют единую филогенетическую группу внутри исследуемого рода. Общность происхождения этой группы видов подтверждаются также весьма необычной для рода Thiоalkalivibrio морфологией клеток (оба вида имеют крупные, неподвижные, кокковидные клетки с крупными включениями серы) [83]. Согласно результатам проведенного анализа, гены cbbL этой группы видов также имеют общее происхождение и значительно дивергировали по сравнению с остальными видами исследуемого рода и, кроме того, на РБФК-дереве эти два вида достоверно объединяются с представителями другого семейства гаммапротеобактерий - Chromatiaceae: пурпурными серными бактериями Thiocapsa roseopersicina и Allochromatium vinosum. С высокой степенью вероятности это Рис. 16. Филогенетическое дерево алкалофильных автотрофных бактерий рода Thioallivibrio, построенное на основании анализа (а) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (б) аминокислотных последовательностей гена cbbL. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным/аминокислотным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 80).

свидетельствует об общности происхождения генов cbbL у этих различающихся по филогенетическому положению и физиологобиохимическим особенностям групп микроорганизмов. Одним из вероятных эволюционных механизмов в данном случае также мог быть горизонтальный перенос генов. Этот процесс, возможно, осуществлялся на уровне общего предка всех бактерий этого кластера, причем, судя по наличию общих морфофизиологических характеристик для обеих групп бактерий, в этот процесс могли вовлекаться не один, а целые блоки генов.

Данный случай - яркий пример из многих, накопившихся к настоящему времени, когда таксономическое положение бактерии, определяемое только на основе анализа последовательностей генов 16S рРНК, не совпадает с комплексом других признаков. И хотя обычно преимущество отдается результатам рибосомной филогенетики, такой подход, по всей видимости, не совсем оправдан. В случае с парой Tv. paradoxus/Tv. nitratireducens наиболее естественным решением стало бы их выделение за пределы рода Thiоalkalivibrio в самостоятельный род.

Можно заключить, что признание возможности горизонтального переноса в процессе эволюции обширных блоков генетической информации может сильно осложнить создание естественной системы бактерий, из чего вытекает необходимость выработки новых подходов в таксономии.

3.4. Детекция и сиквенс-анализ генов биодеградации углеводородов (alkB) у бактерий рода Geobacillus Кроме генов, обеспечивающих жизненно важные функции, в геноме прокариот в значительном количестве присутствуют, так называемые, адаптационные гены, т.е. связанные с приспособлением к меняющимся условиям среды (гены устойчивости к антибиотикам, гены биодеградации, гены патогенности и т.д.). Адаптационные гены не являются обязательными для всех представителей бактериальной популяции, они часто располагаются на плазмидах, что значительно повышает возможность их переноса между членами популяции, даже если эти члены не являются близкородственными. К этой группе принадлежат и гены, обеспечивающие способность к деградации углеводородов и, в частности, n-алканов, которая широко распространена среди бактерий. Окисление n-алканов проходит в несколько этапов и осуществляется многокомпонентной ферментной системой, основой которой является алканмонооксигеназа, генетически детерминируемая alkB-генами. Информация о генетических структурах, ответственных за биодеградацию n-алканов, ограничена и в основном касается нескольких родов мезофильных грамотрицательных и грамположительных бактерий. В наших исследованиях [157] анализировались alkB-гены, представленные в геномах группы термофильных штаммов, относящихся к роду Geobacillus (см. раздел 1.2.2.).

Способность всех исследованных штаммов геобацилл к биодеградации nалканов была подтверждена обнаружением у всех исследованных штаммов генов alkB. При этом оказалось, что в геноме каждого штамма присутствует не один такой ген, а набор из 3-6 гомологов, различный для каждого из исследуемых штаммов. Различия эти касались как общего состава гомологов, так и их количественного соотношения у каждого штамма. При этом состав набора гомологов у исследуемых штаммов не коррелировал с их таксономической принадлежностью, поскольку мог быть похожим у штаммов различных видов (например, у G. uzenensis VKM B-2228 и G. subterraneus DSM 13552T) и существенно отличаться у штаммов одного вида (например, у G.

uzenensis DSM 13551T и G. uzenensis DSM 13551T). В общем, обнаруженное разнообразие alkBЦгомологов геобацилл составляло 8 различных сиквенс-типов (ST-1-8), из которых универсальными для всех исследованных штаммов геобацилл были только два alkB -гомолога: ST-1 и ST-4 (Таблица 5).

Таблица 5. Детекция генов-гомологов alkB и распределение их по штаммам геобацилл.

Штаммы Сиквенс-типы и количество клонов ST- ST- ST- ST- ST- ST- ST- ST1 2 3 4 5 6 7 (47) (75) (31) (55) (12) (3) (2) (1) G. stearothermophilus DSM 22T 3 11 2 3 G. thermocatenulatus VKM B- 4 15 1 1259T G. thermoglucosidasius 3Feng 3 13 1 1 G. thermoleovorans 3 9 4 3 1 DSM 5366T G. gargensis DSM 15378T 4 3 7 G. uzenensis DSM 13551T 3 7 7 1 1 G. uzenensis VKM B-2228 5 3 13 G. subterraneus 12 2 DSM 13552T G. jurassicus DSM 15726T 7 4 7 1 G. toebii B1024 1 7 2 2 G. toebii vw3-1n 2 5 3 7 1 Топология филогенетического дерева, построенного на основании анализа последовательностей фрагментов alkB генов (Рис.17), практически не Рис. 17. Филогенетическое дерево, основанное на сравнении транслированных амиокислотных последовательностей alkB-генов различных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, и положение на нем генов-гомологов Geobacillus (ST18). Дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 аминокислотным заменам на каждые 1аминокислотных остатков. Ранее определенные последовательности alkB-генов геобацилл выделены серым. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 80).

коррелировала с аналогичным деревом, основанным на анализе рибосомных генов. При этом оказалось, что из общего набора обнаруженных нами у геобацилл сиквенс-типов 3 были практически идентичными, соответственно, с alkB4-, alkB3- и alkB2-гомологами, обнаруженным ранее у Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 и Q15 (White et al. 2002), 3 других были близки к ним, и только 2 наиболее редких сиквенс-типа были уникальными для геобацилл. Анализ ГЦ-состава всех alkB-гомологов геобацилл показал, что он также гораздо ближе к ГЦ-составу хромосомной ДНК родококков, чем к ГЦсоставу хромосомной ДНК геобацилл. Это может свидетельствовать о том, что гены alkB появились в геноме геобацилл в результате горизонтального межвидового переноса, при этом донором этих генов являлись родококки либо другие представители филума актиномицетов.

Подтверждением этому могут быть результаты анализа частоты использования синонимических кодонов в последовательностях alkB-генов (Рис.18). Этот анализ показал, что выявленные у геобацилл alkB-гомологи группируются вместе с грамположительными и частью грамотрицательных бактерий, что позволяет предположить существование для организмов этой Рис. 18. Сравнительный анализ относительного использования синонимичных кодонов для фрагментов-гомологов alkB генов грамположительных и грамотрицательных бактерий (alkB-geo1-8). Ось инерции 1 - встречаемость GC3 (GC в третьей позиции кодонов) в последовательностях генов alkB; ось инерции 2 - частота встречаемости кодонов, оканчивающихся на C или U против A или T. Обозначения: () фрагменты-гомологи alkB генов бактерий рода Geobacillus; () alkB гены грамположительных бактерий (alkB1, alkB2, alkB3 и alkB4, alkB-гомологи Rhodococcus sp. Q15); () alkB гены грамотрицательных бактерий.

группы общего пула alkB-генов. Формирование множественного набора генов alkB в геноме одного организма может быть результатом свободного обмена генами внутри этого пула. Мультикопийность генов деградации n-алканов имеет физиологический смысл: они избирательно экспрессируются либо в зависимости от стадии роста культура, либо согласно субстратной специфичности (использованию n-алканов с различной длиной цепи атомов углерода) (Marin et al., 2003). Можно предположить, что в зависимости от условий природного обитания или лабораторного культивирования и, соответственно, изменения состава n-алканов может изменяться не только экспрессия, но и состав alkB-гомологов в геноме различных штаммовдеградантов. Тогда обнаруженное нами значительное разнообразие alkB-генов у различных штаммов геобацилл может быть связано с их способностью к деградации широкого спектра алкано-содержащих субстратов. В то же время, в некоторых условиях не исключена возможность и полной потери alkB-генов и способности к деградации алканов.

Таким образом, вовлечение генов биодеградации алканов в интенсивный межвидовой обмен весьма ограничивает или даже исключает их использование в качестве филогенетических маркеров, аналогично многим адаптационным генам. Однако изучение их филогенетических взаимоотношений может быть весьма полезно, как для изучения эволюции этого процесса метаболизма, так и в практическом отношении.

3.5. Использование комплексного сиквенс-анализа различных филогенетических маркеров для исследования разнообразия эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus Хотя сиквенс-анализ рибосомных генов все еще остается предпочтительным инструментом в молекулярно-биологических исследованиях, в настоящее время для изучения функциональных особенностей природных сообществ используется и сравнительный анализ других, не связанных с рибосомами, молекулярных маркеров. В качестве таких маркеров используют функциональные гены, т.е. гены, которые детерминируют у членов изучаемого сообщества осуществление какой-либо специфичной функции.

Примером такого исследования является проведенный нами анализ разнообразия прокариотного эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus [134].

Глубоководные двустворчатые моллюски рода Bathymodiolus являются доминантными организмами в составе сообществ глубоководных гидротерм и холодных сипов. Все известные на сегодняшний день батимодиолы отличаются присутствием в жаберной ткани эндосимбионтных бактерий, относящихся к гамма-протеобактериям. Для вида B. puteoserpentis было доказано, в том числе, и молекулярно-биологическими методами, наличие двойного симбиоза (т.е.

стабильное сосуществование тиоавто- и метанотрофных бактерий в одной клетке (бактериоците) жаберной ткани) (Distel et al., 1995). Для B. azoricus наличие двойного симбиоза было показано только на основании результатов ультраструктурных, биохимических и иммунологических исследований (FialaMedioni et al., 2002; Пименов и соавт. 2002). Однако филогенетический анализ симбиотического прокариотного сообщества этого организма, как на основании генов 16S рРНК, так и функциональных генов еще не проводился. В то же время, данных только морфологических и энзиматических исследований для строгого доказательства присутствия в клетках моллюсков двух различных видов бактериальных симбионтов не достаточно, поскольку такие результаты могут быть равновероятно объяснены присутствием единственного полиморфного бактериального вида, подобного метанотрофам типа X, представители которого содержат ключевые ферменты как метанотрофии, так и автотрофной фиксации СО2.

Проведенный нами анализ генов 16S рРНК (рис.19а) свидетельствовал о присутствии только одного симбионта, идентичного тиоавтотрофным симбионтам, обнаруженным ранее в жаберной ткани B. puteoserpentis, что противоречило ранее полученным данным о наличии двойного бактериального симбиоза у этого моллюска. Поэтому была проведена ПЦР-детекция генов pmoA, с целью идентификации возможного метанотрофного симбионта. В результате был обнаружен единственный сиквенс-тип данного гена, близкий к имеющемуся в базе данных аналогичному гену метанотрофного симбионта другого вида Bathymodiolus (рис.19б). В свою очередь метанотрофные симбионты Bathymodiolus, безусловно, относились к метанотрофам типа I. Из описанных метанотрофов этой группы они были филогенетически наиболее близки к бактерии Methylobacter psychrophilus (последовательность генов pmoA которого также была определена в данном исследовании).

Неспособность обнаружить присутствие метанотрофного симбионта в исследуемом образце при стандартном анализе генов 16S рРНК может быть связана с различной эффективностью амплификации на различных ДНКматрицах, но более вероятно - со сравнительно низким количеством метанотрофного симбионта, так как исследуемые образцы были собраны сравнительно далеко от зоны высокой концентрации метана. Ранее было показано, что интенсивность процессов фиксации СО2 и метаноокисления, а также количественное соотношение обоих типов симбионтов меняется в зависимости от условий местообитания (Пименов и соавт. 2002). Между тем, низкая концентрация матричной ДНК в некоторых случаях может приводить к случайным отклонениям в проведении ПЦР, в результате чего происходит Рис. 19. Филогенетические деревья представителей эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus на основании сиквенс анализа а) нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК; б) аминокислотных последовательностей генов pmoA; в) аминокислотных последовательностей генов cbbL. Деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее нуклеотидным/аминокислотным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью УbootstrapФ - анализа (значащими признаются значения больше 95).

преимущественная амплификация 16S рДНК только количественно преобладающих компонентов сообщества.

Для более детального исследования автотрофного симбионта B. azoricus нами был проведен дополнительный филогенетический анализ транслированных последовательностей генов cbbL. Согласно полученным нами данным (рис.19в) в исследуемых образцах жабр, в отличие от данных по анализу генов 16S рРНК, присутствуют не один, а два сиквенс-типа cbbL генов, детерминирующих форму I РБФК у симбиотических автотрофов. Наши данные могут быть объяснены следующим образом: а) существованием минорного тиоавтотрофного симбионта, неотличимого ультраструктурным цитологическим исследованием и не определяемого с помощью анализа 16S рДНК; б) существованием двух копий генов cbbL в геноме единственного тиоавтотрофного симбионта, аналогично другим свободноживущим тиоавтотрофам, таким как Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Hydrogenovibrio marinus и Thiomicrospira; в) наличием двух копий генов cbbL, принадлежащих к различным тиоавтотрофному и метанотрофному (способному осуществлять оба пути использования С1-соединений) симбионтам.

Данная работа показала, что проведение анализа разнообразия функциональных генов может существенно дополнить данные стандартного филогенетического анализа генов 16S рРНК и дать более точное представление о микробных сообществах. Кроме того, подобные работы обеспечивают базу для разработки специфических проб для гибридизации in situ и дальнейшего исследования различных сообществ, включая эндосимбионтов беспозвоночных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящее время в молекулярной биологии выработан целый ряд экспериментальных подходов, позволяющих устанавливать степень генетического родства организмов для таксонов самого разного ранга - от отдельных индивидуумов (в микробиологии - штаммов) до доменов. Тем самым систематикам, в том числе, и в микробиологии, была предоставлена возможность установления филогенетических связей по объективным критериям и создания естественных систем, основанных на степени генетического родства.

Оценивая достижения хотя и сравнительно молодой, но уже достаточно зарекомендовавшей себя области систематики прокариот - молекулярной (или гено-) систематики следует подчеркнуть, что они дают возможность взглянуть на решение проблем изучения разнообразия форм бактерий с новой точки зрения. Несомненно, что многие конкретные эволюционные и таксономические заключения, вытекающие из результатов методов геносистематики, в настоящее время не являются бесспорными и, возможно, впоследствии будут опровергнуты, изменены или дополнены, но сама возможность выдвижения таких заключений на принципиально новой основе чрезвычайно важна.

Современный этап развития геносистематики бактерий можно охарактеризовать следующим образом. В настоящее время полностью определены возможности использования в таксономии бактерий результатов метода ДНК-ДНК гибридизации. Необходимость получения таксономических заключений с помощью этого метода на видовом уровне закреплена в Правилах номенклатуры бактерий. В значительной степени определена значимость рибосомной филогенетики, результаты которой стали своего рода филогенетическим скелетом в таксономии бактерий. В то же время, ограничения в использовании результатов этих, ставших уже традиционными, методов диктуют необходимость поиска дополнительных или даже альтернативных молекулярно-биологических подходов. Одним из таких подходов может стать введение в практику таксономических исследований методов сравнительного анализа структурных функциональных генов.

Этот подход, как и основанный на сравнении рибосомных генов, подвергается критике на том основании, что представляя лишь незначительную часть генома, индивидуальные гены не могут служить индикаторами степени родства всего организма. Это отчасти справедливо: чем более протяженные участки генома анализируются, тем надежнее филогенетические выводы, которые делаются на этом основании. Однако комплексный анализ моногенных филогенетических построений, включающий сравнение как рибосомных, так и различных структурных генов, детермирующих независимые друг от друга метаболистические функции (лсмешение филогений), свидетельствует о том, что такой подход может в достаточной степени отражать филогению организмов. Дальнейший прогресс в этом направлении связан с новым, интенсивно развивающимся подходом - геномикой, т.е. сравнительным анализом полностью расшифрованных геномов организмов. При этом становится возможным не только простое сравнение нуклеотидных последовательностей по количеству нуклеотидных замен, но и сопоставление конкретных особенностей организации различных геномов, приобретаемых в процессе эволюции и включающих возможные масштабные перестройки.

ВЫВОДЫ 1. Анализ распределения значений показателей гибридизации ДНКДНК, свидетельствующий о дискретности степеней родства бактерий, а также изучение с помощью общеупотребимых методов геносистематики родственных взаимоотношений представителей порядка Haloanaerobiales (как эталонного таксона) позволили предложить ориентировочные количественные критерии определения рангов таксонов бактерий от вида до семейства.

2. На примерах изучения некоторых таксонов бактерий проанализированы возможные причины несоответствия данных генотипического и фенотипического анализов. Показано, что часть таких несоответствий может быть снята при изменении классификации, однако не исключена возможность их объективного существования, объясняемая особенностями эволюции фенотипа и генотипа.

3. Включены в международную базу данных Genbank и проанализированы 415 нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомных РНК, которые были использованы в описании 3 новых порядков, новых семейств, 35 новых родов и 96 новых видов прокариот. Эти исследования подтверждают необходимость использования в современной таксономии бактерий результатов рибосомной филогенетики, как наиболее технологичного в настоящее время метода определения родственных взаимоотношений прокариот.

4. В геноме типового штамма термофильной сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii впервые было обнаружено существование двух копий гена 16S рРНК, между которыми была выявлена значительная степень различий (до 8.3%) за счет сверхдлинных вставок, расположенных в вариабельных 5Т- и 3Т-концевых областях последовательностей генов. Показано, что гетерогенность двух вариабельных копий генов 16S рРНК может искажать положение исследуемого организма на филогенетическом дереве и предложены рекомендации для коррекции результатов филогенетического анализа.

5. В рамках комплексного филогенетического анализа проведены исследования структурных функциональных генов, детерминирующих различные функции метаболизма бактерий:

а) Включены в международную базу данных GenBank нуклеотидных последовательности фрагментов генов FMO-белка, результаты анализа которых совпадают с данными рибосомной филогенетики зеленых серных бактерий, но позволяют в сомнительных случаях дополнить и уточнить эти данные. Это подтверждает необходимость использования анализа данных генов в таксономии зеленых серных бактерий филы Chlorobi.

б) Включены в международную базу данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов нитрогеназы, результаты анализа которых в значительной степени совпадают с данными рибосомной филогенетики. Это свидетельствует о возможности использования нитрогеназных генов в качестве дополнительных филогенетических маркеров при изучении таксономии азотфиксирующих бактерий, а также при изучении биоразнообразия этих бактерий в природных экосистемах.

в) Включены в международную базу данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов РБФК, результаты анализа которых позволили выявить особенности эволюции различных групп автотрофных бактерий. Сравнение этих результатов с результатами рибосомной филогенетики свидетельствует о значительном вкладе в эволюцию автотрофов дупликации генов РБФК, а также процессов их горизонтального переноса, что во многих случаях ограничивает использование данных генов в качестве молекулярных маркеров.

г) Включены в международную базу данных GenBank нуклеотидные последовательности генов биодеградации н-алканов геобацилл, анализ которых показал множественность этих генов в геномах штаммов геобацилл, а также отсутствие видовой специфичности этих генов, что не позволяет использовать их как для таксономических целей, так и для оценки разнообразия геобацилл в природных экосистемах. Однако полученные результаты могут быть полезными для изучения эволюции функции биодеградации алканов у бактерий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные работы:

1. Антонов А.С., Леванова Г.Ф., Попов Л.С., Турова Т.П., Урюпина Н.В. Об уточнении систематического положения некоторых морских бактерий методом гибридизации ДНК-ДНК. Ж. микробиол. эпидемиол. иммунол.

1975, 1, 94-96.

2. Леванова Г.Ф., Турова Т.П. Попытка установления геномного сходства Alcaligenes faecalis с некоторыми грамотрицательными бактериями с помощью метода молекулярно гибридизации ДНК-ДНК. Микробиология.

1977, 46, 1, 92-95.

3. Турова Т.П., Антонов А.С. Сходство полинуклеотидных последовательностей ДНК холерных и так называемых неагглютинирующихся вибрионов. Ж. микробиол. эпидемиол. иммунол.

1977, 7, 47-50.

4. Антонов А.С., Белоусова А.А., Лысенко А.М., Турова Т.П. Экспрессметоды идентификации микроорганизмов, основанные на гибридизации ДНК. Микробиология. 1978, 47, 6, 1049-1054.

5. Медников Б.М., Турова Т.П. Анализ термостабильности гибридных молекул ДНК микроорганизмов как средство повышения разрешающей способности метода молекулярной гибридизации. Молекулярная биология. 1978, 12, 4, 853-856.

6. Турова Т.П.. Сходство нуклеотидных последовательностей ДНК некоторых вибрионов. Ж. микробиол. эпидемиол. иммунол. 1979, 12, 2528.

7. Турова Т.П.. Определение таксономического положения Vibrio parahaemolyticus с помощью метода молекулярной гибридизации ДНК.

Биологические науки. 1980, 2, 26-28.

8. Турова Т.П.. Дивергенция геномов близкородственных штаммов вибрионов. Биологические науки. 1980, 6, 29-32.

9. Турова Т.П., Леванова Г.Ф. Геномная характеристика новой группы микроорганизмов семейства Vibrionaceae. Ж. микробиол. эпидемиол.

вирусол. 1980, 3, 27-29.

10. Турова Т.П., Иванова Т.Л., Антонов А.С. Гибридизация ДНК пурпурных фототрофных бактерий. Известия АН СССР, серия биологическая. 1982, 5, 763-767.

11. Бондаренко В.М., Афанасьева С.М., Турова Т.П. Нуклеотидный состав и степень гомологии ДНК штаммов трибы Klebsielleae. Молекул. генетика.

микробиол. вирусол. 1983, 1, 43-46.

12. Примакова Г.А., Турова Т.П., Заворуев В.В., Воробьева Т.И. Определение таксономического положения Photobacterium belozerskii. Микробиология.

1983, 52, 1, 98-101.

13. Cherevach N.V., Tourova T.P., Belikova V.L. DNA-DNA homology studies among strains of Kurthia zopfii. FEMS Microbiol. Lett. 1983, 19, 243-245.

14. Турова Т.П., Графова Т.И., Бодалов И.М. Алломонады - новая группа микроорганизмов cемейства Vibrionaceae. Сообщение V. Таксономическое положение алломонад на основе изучения их ДНК. Ж. микробиол.

эпидемиол. иммунол. 1983, 1, 22-24.

15. Воробьева Л.И., Турова Т.П., Краева Н.И., Алексеева М.А.

Пропионовокислые кокки и их систематическое положение.

Микробиология. 1983, 52, 3, 465-471.

16. Иванова Т.Л., Турова Т.П., Антонов А.С. Определение родственных связей бактерий рода Ectothiorhodospira. Микробиология. 1983, 52, 4, 538542.

17. Примакова Г.А., Турова Т.П., Воробьева Т.И., Фиш А.М., Антонов А.С.

Определение таксономического положения культур психрофильных светящихся бактерий путем молекулярной гибридизации ДНК-ДНК.

Микробиология. 1983, 52, 2, 290-293.

18. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Турова Т.П. Нуклеотидный остав и степень гомологии ДНК Y. рseudotuberculosis различных патоваров.

Молекул. генетика, микробиол. вирусол. 1983, 3, 23-26.

19. Kalina G.P., Antonov A.S., Tourova T.P., Grafova T.I. Allomonas enterica gen.nov., sp.nov.: deoxiribonucleid acid homology between Allomonas and some other members of the Vibrionaceae. Int. J. Syst. Bacteriol., 1984, 34, 2, 150-154.

20. Иванова Т.Л., Турова Т.П., Антонов А.С. Определение родственных связей пурпурных серных бактерий семейства Chromatiaceae.

Микробиология. 1984, 53, 4, 762-764.

21. Турова Т.П., Родионова И.В. Гомология ДНК и таксономия рода Francisella. Молекул. генетика, микробиол. вирусол. 1984, 11, 45-47.

22. Турова Т.П., Иванова Т.Л. Родственные взаимоотношения пурпурных бактерий рода Rhodopseudomonas. Микробиология. 1984, 53, 2, 313-317.

23. Ogarkova O.A., Tourova T.P., Balayeva N.M. The use of molecular hybridization to evaluate the divergence of some altered Rickettsia prowazekii strains. Acta virol., 1985, 29, 329-333.

24. Компанцева Е.И., Иванова Т.Л., Турова Т.П. О таксономическом статусе новых галофильных бактерий семейства Rhodospirillaceae.

Микробиология. 1985, 54, 2, 227-228.

25. Компанцева Е.И., Иванова Т.Л., Турова Т.П. О таксономическом значении фенотипических признаков бактерий рода Ectothiorhodospira.

Микробиология. 1985, 54, 3, 499-501.

26. Ivanova T.L., Tourova T.P., Antonov A.S. DNA-DNA and rRNA-DNA hybridization studies in the genus Ectothiorhodospira and other purple sulfur bacteria. Arch. Microbiol. 1985, 143, 154-156.

27. Хальчицкий А.Е., Турова Т.П. Изучение таксономического положения азотфиксирующих спирилл. Микробиология. 1986, 55, 2, 301-304.

28. Примакова Г.А., Турова Т.П., Иванова Т.Л. Дивергенция геномов культур психрофильных светящихся бактерий рода Photobacterium.

Микробиология. 1986, 55, 2, 344-346.

29. Бакулов И.А., Котляров В.М., Турова Т.П., Бакалдина Н.Б., Иванова Т.Л.

Идентификация листерий с помощью метода молекулярной ДНК-ДНК гибридизации. Молекул. генетика, микробиол. вирусол. 1988, 7, 31-35.

30. Ivanova T.L., Tourova T.P., Antonov A.S. DNA-DNA hybridization studies on some purple nonsulfur bacteria. System. Appl. Microbiol. 1988, 10, 259-263.

31. Филиппова С.Н., Кузнецов В.Д., Турова Т.П., Иванова Т.Л. Анализ сходcтва геномов стрептомицетов флуоресцирующей подгруппы как подтверждение их таксономической ревизии популяционным методом.

Микробиология. 1989, 58, 1, 87-90.

32. Tourova T.P., Poltaraus A B.,.Lebedeva I. A., Tsaplina I A., Bogdanova T.I., Karavaiko G.I. 16S ribosomal RNA (rDNA) sequence analysis and phylogenetic position of Sulfobacillus thermosulfidooxidans. System. Appl.

Microbiol. 1994, 17, 509-512.

33. Турова Т.П., Полтараус А.Б., Лебедева И.А., Булыгина Е.С., Цаплина И.А., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Определение филогенетического положения Sulfobacillus thermosulfidooxidans на основании анализа 5S и 16S рибосомной РНК. Микробиология. 1995, 64, 3, 366-374.

34. Tourova T.P., Boulygina E.S., Zhilina T.N., Hanson R.S., Zavarzin G.A. The phylogenetic study of haloanaerobic bacteria by 16S ribosomal RNA sequence analysis. System. Appl. Microbiol., 1995, 18, 2. 189-195.

35. Rainey F.A., Zhilina T.N., Boulygina E.S., Stackebrandt E., Tourova T.P., Zavarzin G.A. The taxonomic status of the fermentative halophilic anaerobic bacteria: description of Haloanaerobiales ord.nov., Halobacteroidaceae fam nov., Orenia gen. nov., and further taxonomic rearrangements at the genus and species level. Anaerob, 1995, 1, 185-199.

36. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Лысенко А.М.: Кевбрин В.В. Реклассификация штамма Halobacteroides halobius Z- 7287 на основе филогенетического анализа в качестве нового вида Halobacteroides elegans sp.nov.

Микробиология. 1997, 66, 1, 114-121.

37. Шелоболина Е.С., Булыгина Е.С., Турова Т.П., Авакян З.А., Каравайко Г.И. Описание нового вида слизеобразующих бактерий Bacillus edaphicus sp.nov. и подтверждение таксономического статуса Bacillus mucilaginosus с использованием данных генотипического и фенотипического анализов.

Микробиология. 1997, 66, 6, 836-845.

38. Турова Т.П., Назина Т.Н., Полтараус А.Б., Осипов Г.А. Филогенетическое положение и хемотаксономические характеристики сульфатвосстанавливающих бактерий рода Desulfomicrobium.

Микробиология. 1998, 67, 6,.799-806.

39. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Krausova V.I., Bouligina E.S., Tourova T.P.

Methylopila, a new genus of non-pigmented facultatively methylothrophic bacteria. Int. J. Syst.Bacteriol. 1998.48, 4, 1313-1321.

40. Slobodkin A.I., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Kostrikina N. A., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermoanaerobacter siderophilus sp. nov., a novel dissimilatoryFe(III)-reducing anaerobic thermophilic bacterium. Int. J.

Syst.Bacteriol. 1999; 49, 4, 1471-1478.

41. Назина Т.Н., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Грядунов Д.А., Иванова А.Е., Осипов Г.А., Беляев С.С. Филогенетическое положение и хемотаксономическая характеристика термофильной сульфатвосстанавливаюей бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii.

Микробиология. 1999, 68, 1, 92-99.

42. Турова Т.П., Омельченко М.В., Фегединг К.В., Васильева Л.В.

Филогенетическое положение Methylobacter psychrophilus sp.nov.

Микробиология. 1999, 68, 4, 568-570.

43. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Кострикина Н.А., Лысенко А.М. Orenia sivashensis sp.nov. - новая умеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша. Микробиология. 1999, 68, 4, 529-537.

44. Григорьева Н.В., Авакян З.А., Турова Т.П., Кондратьева Т.В., Каравайко Г.И. Скрининг и изучение микроорганизмов, деструктирующих цианиды и тиоцианаты. Микробиология. 1999. 68. 4. 453-460.

45. Турова Т.П., Гарнова Е.С., Жилина Т.Н. Филогенетическое разнообразие алкалофильных анаэробных сахаролитических бактерий, выделенных из содовых озер. Микробиология. 1999, 68, 5, 701-709.

46. Сорокин Д.Ю., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Брянцева И., Горленко В.М.

Roseinatronobacter thiooxidans gen. nov., sp. nov., новая алкалофильная аэробная бактериохлорофилл а-содержащая бактерия из содового озера.

Микробиология. 2000, 69, 1, 89-97.

47. Назина Т.Н., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Новикова Е.В., Иванова А.Е., Григорьян А.А., Лысенко А.М., Беляев С.С. Филогенетическое разнообразие термофильных спорообразующих углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов. Микробиология. 2000, 69, 1, 113-119.

48. Назина Т.Н., Косарева И.М., Давыдов А.С., Турова Т.П., Новикова Е.В., Хафизов Р.Р., Полтараус А.Б. Физико-химическая и микробиологическая характеристика подземных вод из наблюдательных скважин глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов. Микробиология. 2000, 69, 1, 105-112.

49. Zavarzina D.G., Zhilina T.N., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermanaerovibrio velox sp. nov., a new anaerobic, thermophilic, organotrophic bacterium that reduces elemental sulfur, and emended description of the genus Thermanaerovibrio. Int J Syst Evol Microbiol. 2000, 50, 3, 1287-95.

50. Keppen O.I., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Ivanovsky R.N., Gorlenko V.M.

Proposal of Oscillochloridaceae fam. nov. on the basis of a phylogenetic analysis of the filamentous anoxygenic phototrophic bacteria, and emended description of Oscillochloris and Oscillochloris trichoides in comparison with further new isolates. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000, 50, 4, 1529-37.

51. Pikuta E., Lysenko A., Suzina N., Osipov G., Kuznetsov B, Tourova T., Akimenko V., Laurinavichius K. Desulfotomaculum alkaliphilum sp. nov., a new alkaliphilic, moderately thermophilic, sulfate-reducing bacterium. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 2000 50, 1, 25-33.

52. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Колганова Т.В., Бонч-Осмоловская Е.А..

Филогенетическое положение Desulfurococcus amylolyticus.

Микробиология. 2000, 69, 3, 447-448.

53. Брянцева И.А., Горленко В.М., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Лысенко А.М., Быкова С.А., Гальченко В.Ф., Митюшина Л.Л., Осипов Г.А..

Heliobacterium sulfidophilum sp. nov. и Heliobacterium undosum sp. nov.:

сульфидокисляющие гелиобактерии из термальных сероводородных источников. Микробиология. 2000, 69, 3, 396-406.

54. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T.

Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp.

nov.-novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane. Syst. Appl. Microbiol. 2000, 23, 2, 210-218.

55. Doronina N.V., Trotsenko Yu.A., Tourova T.P. Methylarcula marina gen.

nov., sp. nov. and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria from coastal saline environments. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000, 50, 5, 1849-1859.

56. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Kuenen J.G. A new facultatively autotrophic hydrogen- and sulfur-oxidizing bacterium from an alkaline environment.

Extremophiles. 2000, 4, 4, 237-45.

57. Bryantseva I.A., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Osipov G.A. Alkaliphilic heliobacterium Heliorestis baculata sp. nov. and emended description of the genus Heliorestis. Arch. Microbiol. 2000, 174, 4, 283-291.

58. Каравайко Г.И., Турова Т.П., Цаплина И.А., Богданова Т.И.

Филогенетическое положение аэробных умеренно-термофильных бактерий вида Sulfobacillus, окисляющих Fe2+, S(0) и сульфидные минералы. Микробиология. 2000, 69, 6, 857-860.

59. Prokofeva M.I., Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Kuznetsov B.B., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Acidilobus aceticus gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermoacidophilic archaeon from continental hot vents in Kamchatka. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000, 50, 6, 2001-2008.

60. Розанова Е.П., Турова Т.П., Колганова Т.В., Лысенко А.М., Митюшина Л.Л., Юсупов С.К., Беляев С.С. Desulfacinum subterraneum sp. nov. - новая термофильная сульфатвосстанавливающая бактерия, выделенная из высокотемпературного нефтяного пласта. Микробиология. 2001. 70, 4, 536-542.

61. Simankova M.V., Parshina S.N., Tourova T.P., Kolganova T.V., Zehnder A.J.B., Nozhevnikova A.N. Methanosarcina lacustris sp.nov., а new psychrotolerant methanogenic archaeon from anoxic lake sedimrnts. Syst. Appl.

Microbiol. 2001, 24, 362-367.

62. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Новикова Е.В., Полтараус А.Б., Назина Т.Н.

Гетерогенность нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомной РНК типового штамма Desulfotomaculum kuznetsovii.

Микробиология. 2001, 70. 6. 788-795.

63. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T.

Albibacter methylovorans gen. nov., sp. nov., a novel aerobic, facultatively autotrophic and methylotrophic bacterium that utilizes dichloromethane. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51, 3,1051-1058.

64. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Доронина Н.В., Троценко Ю.А.

Филогенетический анализ аэробных метилотрофных бактерий, использующих дихлорметан. Микробиология. 2001, 70, 1, 92-97.

65. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот.

Микробиология. 2001; 70, 1, 86-91.

66. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Lysenko A.M., Kuenen J.G. Microbial thiocyanate utilization under highly alkaline conditions. Appl. Environ.

Microbiol. 2001, 67, 2, 528-538.

67. Sorokin D., Tourova T., Schmid M.C., Wagner M., Koops H.P., Kuenen J.G., Jetten M. Isolation and properties of obligately chemolithoautotrophic and extremely alkali-tolerant ammonia-oxidizing bacteria from Mongolian soda lakes. Arch. Microbiol. 2001, 176, 3, 170-177.

68. Sorokin D.Yu., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Tourova T.P., Jones B.E., Rainey F.A., Robertson L.A., Kuenen G.J. Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov. and Thioalkalimicrobium sibericum sp. nov., and Thioalkalivibrio versutus gen. nov., sp. nov., Thioalkalivibrio nitratis sp.nov., novel and Thioalkalivibrio denitrificancs sp. nov., novel obligately alkaliphilic and obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes.

Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51, 2, 565-80.

69. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А.

Amphibacillus fermentum sp.nov., Amphibacillus tropicus sp.nov. - новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. Микробиология. 2001, 70, 6, 825-837.

70. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А.

Halonatronum saccharophilum gen. nov. sp. nov-новая галоалкалофильная бактерия порядка Haloanaerobialis из озера Магади. Микробиология. 2001, 70, 1, 77-85.

71. Nazina T.N., Tourova T.P., Poltaraus A.B., Novikova E.V., Grigoryan A.A., Ivanova A.E., Lysenko A.M., Petrunyaka V.V., Osipov G.A., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli: descriptions of Geobacillus subterraneus gen. nov., sp. nov. and Geobacillus uzenensis sp. nov.

from petroleum reservoirs and transfer of Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermocatenulatus, Bacillus thermoleovorans, Bacillus kaustophilus, Bacillus thermodenitrificans to Geobacillus as the new combinations G.

stearothermophilus, G. thermocatenulatus, G. thermoleovorans, G.

kaustophilus, G. thermoglucosidasius and G. thermodenitrificans. Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2001, 51, 2, 433-446.

72. Sokolova T.G., Gonzalez J.M., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kato C., Bonch-Osmolovskaya E.A., Robb F.T. Carboxydobrachium pacificum gen. nov., sp. nov., a new anaerobic, thermophilic, CO-utilizing marine bacterium from Okinawa Trough. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51, 1, 141-149.

73. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kolganova T.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Carboxydocella thermautotrophica gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, CO-utilizing thermophile from a Kamchatkan hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 6, 1961-1967.

74. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Kuznetzov B.B., Tourova T.P. Emended description of Paracoccus kondratievae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 2, 679-682.

75. Doronina N.V., Trotsenko Yu.A., Kuznetsov B.B., Tourova T.P., SalkinojaSalonen M.S. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 3, 773-776.

76. Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей. Микробиология. 2002, 71, 2, 283-286.

77. Турова Т.П., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В.

Филогенетическое разнообразие архейного компонента бактериальных обрастаний на коралловидных постройках в зонах выхода метана в Черном море. Микробиология. 2002, 71, 2, 230-236.

78. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий Микробиология. 2002, 71, 4, 500-508.

79. Muntyan M. S., Tourova T.P., Lysenko A. M., Kolganova T. V., Fritze D., Skulachev V. P. Molecular identification of alkaliphilic and halotolerant strain Bacillus sp. FTU as Bacillus pseudofirmus FTU. Extremophiles, 2002, 6, 3, 195-199.

80. Sorokin D.Yu, Tourova T.P., Kolganova T.V., Sjollema K.A., Kuenen J.G.

Thioalkalispira microaerophila gen. nov., sp. nov., a novel lithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from a soda lake. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 6, 2175-2182.

81. Zavarzina D.G., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Bonch-Osmolovskaya E.A., Slobodkin A.I. Thermovenabulum ferriorganovorum gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic, endospore-forming bacterium. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 2002, 52, 5, 1737-1743.

82. Sorokin D.Yu., Gorlenko V.M., Tourova T.P., Tsapin A.I., Nealson K.H., Kuenen G.J. Thioalkalimicrobium cyclicum sp. nov. and Thioalkalivibrio jannaschii sp. nov., novel species of haloalkaliphilic, obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from hypersaline alkaline Mono Lake (California). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 3, 913-920.

83. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Kuenen J.G.

Thioalkalivibrio thiocyanoxidans sp. nov. and Thioalkalivibrio paradoxus sp.

nov., novel alkaliphilic, obligately autotrophic, sulfur-oxidizing bacteria capable of growth on thiocyanate, from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 2, 657-664.

84. Попова Н.А., Николаев Ю.А., Турова Т.П., Лысенко А.М, Осипов Г.А., Верховцева Н.В., Паников Н.С. Geobacillus uralicus - новый вид термофильных микрооргaнизмов. Микробиология. 2002 71, 3, 391-398.

85. Назина Т. Н.,.Григорьян А. А, Сюэ Ян-Фен, Полтараус А. Б., Новикова Е.

В., Турова Т.П.,.Беляев С. С. Физиологическое и филогенетическое разнообразие аэробных сапротрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацин. Микробиология. 2002, 71, 1, 103-110.

86. Karavaiko G.I., Kondrat'eva T.F., Tourova T.P., Lysenko A.M., Kolganova T.V., Ageeva S.N., Muntyan L.N., Pivovarova T.A. Phylogenetic heterogeneity of the species Acidithiobacillus ferrooxidans. Int J Syst Evol Microbiol. 2003, 53, 1,113-119.

87. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Васильева Н.А., Турова Т.П., Колганова Т.В., Скрябин К.Г.

Идентификация нового штамма трансформирующих стероиды микобактерий как Mycobacterium neoaurum. Прикладная биохимия и микробиология. 2003, 39, 2, 173-179.

88. Garnova E.S., Zhilina T.N., Tourova T.P., Lysenko A.M. Anoxynatronum sibiricum gen.nov., sp.nov. alkaliphilic saccharolytic anaerobe from cellulolytic community of Nizhnee Beloe (Transbaikal region). Extremophiles. 2003, 7, 3, 213-220.

89. Slobodkin A.I., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., BonchOsmolovskaya E.A., Jeanthon C., Jones B.E. Tepidibacter thalassicus gen.

nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic, anaerobic, fermentative bacterium from a deep-sea hydrothermal vent. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

2003, 53, 4, 1131-1134.

90. Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Pimenov N.V., Tourova T.P., Antipov A.N., Spring S., Stackebrandt E., Bonch-Osmolovskaya E.A. Caldithrix abyssi gen. nov., sp. nov., a nitrate-reducing, thermophilic, anaerobic bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent, represents a novel bacterial lineage. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003, 53, 1, 323-329.

91. Ушакова Н.А., Белов Л.П., Варшавский А.А., Козлова А.А., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. Расщепление целлюлозы при дефиците азота бактериями, выделенными из кишечника растительноядных позвоночных. Микробиология. 2003, 72, 3, 400-406.

92. Меламуд В.С., Пивоварова Т.А., Турова Т.П., Колганова Т.В., Осипов Г.А., Лысенко А.М., Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И. Sulfobacillus sibiricus sp. nov., новая умеренно термофильная бактерия.

Микробиология. 2003, 72, 5, 681-688.

93. Sorokin D. Yu., Tourova T.P., Sjollema K. A., Kuenen J. G. Thialkalivibrio nitratireducens sp. nov., a nitrate-reducing member of an autotrophic denitrifying consortium from a soda lake. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003, 53, 6, 1779-1783.

94. Sizova M.V., Panikov N.S., Tourova T.P., Flanagan P.W. Isolation and Characterization of Oligotrophic Acido-Tolerant Methanogenic Consortia from Sphagnum Peat Bog. FEMS Microbial.Ecol. 2003. 45, 301-315.

95. Doronina N. V., Trotsenko Y. A., Kolganova T. V., Tourova T. P., SalkinojaSalonen M. S. Methylobacillus pratensis sp. nov., a novel non-pigmented aerobic obligately methylotrophic bacterium isolated from meadow grass. Int.

J. Syst. Evol Microbiol. 2004, 54, 5, 1453-1457.

96. Gorlenko V., Tsapin A., Namsaraev Z., Teal T., Tourova T., Engler D., Mielke R., Nealson K. Anaerobranca californiensis sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic, fermentative bacterium isolated from a hot spring on Mono Lake. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004, 54, 739 - 743.

97. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Antipov A.N., Muyzer G., Kuenen J.G.

Anaerobic growth of the haloalkaliphilic denitrifying sulfur-oxidizing bacterium Thialkalivibrio thiocyanodenitrificans sp. nov. with thiocyanate. Microbiology (UK). 2004, 150, 7, 2435-2442.

98. Garnova E.S., Zhilina T.N., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A.

Anaerobic, alkaliphilic, saccharolytic bacterium Alkalibacter saccharofermentans gen. nov., sp. nov. from a soda lake in the Transbaikal region of Russia. Extremophiles. 2004, 8, 4, 309-316.

99. Горленко В.М., Брянцева И.А., Пантелеева Е. Е., Турова Т.П., Колганова Т.В., Махнева З.К., Москаленко А.А. Ectothiorhodosinus mongolicum gen.

nov., sp. nov. новая пурпурная серная бактерия из содового озера Монголии. Микробиология. 2004, 73, 1, 80-88.

100. Ушакова Н.А., Феоктистова Н.Ю., Колганова Т.В., Турова Т.П.

Microbacterium oxydans - симбионт хомячка Кэмпбелла, обладающий пробиотическими свойствами. Прикладная биохимия и микробиология.

2004, 40, 6, 639-644.

101. Спиридонова Е.М., Берг И.А., Колганова Т.В., Ивановский Р.Н., Кузнецов Б.Б. Турова Т.П. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у бактерий различных таксономических групп. Микробиология. 2004, (3), 377-387.

102. Nazina T. N., Lebedeva E. V., Poltaraus A. B., Tourova T. P., Grigoryan A.

A., Sokolova D. Sh., Lysenko A. M., Osipov G. A. Geobacillus gargensis sp.

nov., a novel thermophile from a hot spring, and the reclassification of Bacillus vulcani as Geobacillus vulcani comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004, 54, 6, 2019-2024.

103. Слободкина Г.В., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., БончОсмоловская Е.А. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи р. Sulfophobococcus в термофильном метанотенке, перерабатывающем муниципальные стоки. Микробиология. 2004, 73:716720.

104. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermincola carboxydiphila gen. nov., sp.

nov., a novel anaerobic, carboxydotrophic, hydrogenogenic bacterium from a hot spring of the Lake Baikal area. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005, 55, 5, 2069-2073.

105. Prokofeva M.I., Kublanov I.V., Nercessian O., Tourova T.P., Kolganova T.V., Lebedinsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Spring S., Jeanthon C. Cultivated anaerobic acidophilic/acidotolerant thermophiles from terrestrial and deep-sea hydrothermal habitats. Extremophiles. 2005, 9, 6, 437-448.

106. Perevalova A.A., Svetlichny V.A., Kublanov I.V., Chernyh N.A., Kostrikina N.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Bonch-Osmolovskaya E.A.

Desulfurococcus fermentans sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeon from a Kamchatka hot spring, and emended description of the genus Desulfurococcus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005, 55, 3, 995-999.

107. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Muyzer G. Oxidation of thiosulfate to tetrathionate by an haloarchaeon isolated from hypersaline habitat.

Extremophiles. 2005, 9, 6, 501-504.

108. Karavaiko G.I., Bogdanova T.I., Tourova T.P., Kondrat'eva T.F., Tsaplina I.A., Egorova M.A., Krasil'nikova E.N., Zakharchuk L.M.. Reclassification of 'Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. thermotolerans' strain K1 as Alicyclobacillus tolerans sp. nov. and Sulfobacillus disulfidooxidans Dufresne et al. 1996 as Alicyclobacillus disulfidooxidans comb. nov., and emended description of the genus Alicyclobacillus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005, 55, 2, 941-947.

109. Nazina T.N., Sokolova D.Sh., Grigoryan A.A., Shestakova N.M., Mikhailova E.M., Poltaraus A.B., Tourova T.P., Lysenko A.M., Osipov G.A., Belyaev S.S.

Geobacillus jurassicus sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a high-temperature petroleum reservoir, and the validation of the Geobacillus species. Syst. Appl. Microbiol. 2005, 28, 1, 43-53.

110. Sorokin, D.Yu., Tourova, T.P., Spiridonova, Е.M., Rainey, F.A., Muyzer, G.

Thioclava pacifica gen. nov., sp. nov., a novel facultatively autotrophic, marine, sulfur-oxidizing bacterium from a near-shore sulfidic hydrothermal area. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 2005, 55, 3, 1069-1077.

111. Sorokin, D.Yu., Tourova, T.P., Muyzer, G. Citreicella thiooxidans gen. nov., sp. nov., a novel lithoheterotrophic sulfur-oxidizing bacterium from the Black Sea. Syst. Appl. Microbiol. 2005, 28, 8, 679-687.

112. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Берг И.А., Кузнецов Б.Б., Сорокин Д.Ю.

Филогения генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у облигатно автотрофных галоалкалофильных сероокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio. Микробиология. 2005, 74, 3, 378-386.

113. Назина Т.Н., Розанова Е.П., Белякова Е.В., Лысенко А.М., Полтараус А.Б., Турова Т.П., Осипов Г.А., Беляев С.С. Описание Desulfotomaculum nigrificans subsp. salinus в качестве нового вида Desulfotomaculum salinum sp. nov. Микробиология. 2005, 74, 5, 654-562.

114. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Турова Т.П., Лысенко А.М., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Clostridium alkalicellum sp. nov. - облигатно алкалофильный целлюлозолитик из содового озера Прибайкалья.

Микробиология. 2005, 74, 642-653.

115. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Шестакова Н.М., Григорьян А.А., Михайлова Е.М., Бабич Т.М., Лысенко А.М., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Циньсян Фенг, Фангтиан Ни, Беляев С.С.. Филогенетическое разнообразие аэробных органотрофных бактерий из высокотемпературного нефтяного месторождения Даган. Микробиология.

2005, 74, 401-409.

116. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Турова Т.П., Заварзин Г.А.

"Candidatus contubernalis alkalaceticum," облигатно синтрофная алкалофильная бактерия, способная к анаэробному окислению ацетата в кокультуре с Desulfonatronum cooperativum. Mикробиология. 2005, 74, 6, 800-809.

117. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Galinski E.A., Belloch C., Tindall B.J.

Extremely halophilic denitrifying bacteria from hypersaline inland lakes, Halovibrio denitrificans sp. nov. and Halospina denitrificans gen. nov., sp.

nov., and evidence that the genus name Halovibrio Fendrich 1989 with the type species Halovibrio variabilis should be associated with DSM 3050. Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2006, 56, 2, 379-388.

118. Slobodkin A.I., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Lysenko A.M., German K.E., Bonch-Osmolovskaya E.A., Birkeland N.K. Tepidimicrobium ferriphilum gen.

nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic, Fe(III)-reducing bacterium of the order Clostridiales. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006, 56, 2, 369-372.

119. Slepova T.V., Sokolova T.G., Lysenko A.M., Tourova T.P., Kolganova T.V., Kamzolkina O.V., Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Carboxydocella sporoproducens sp. nov., a novel anaerobic CO-utilizing/H2-producing thermophilic bacterium from a Kamchatka hot spring. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 2006, 56, 4, 797-800.

120. Назина Т.Н., Шестакова Н.М., Григорян А.А., Михайлова Е.М., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Фенг Ц., Ни Ф., Беляев С.С. Филогенетическое разнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган.

(Китай). Микробиология. 2006, 75, 1, 70Ц81.

121. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кеппен О.И., Кузнецов Б.Б., Ивановский Р.Н. Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и nifH. Микробиология. 2006, 75, 2, 235Ц244.

122. Белякова Е.В., Розанова Е.П., Борзенков И.А., Турова Т.П., Пушева М.А., Лысенко А.М., Беляев С.С. Новая литоавтотрофная умеренно-галофильная сульфатвосстанавливающая бактерия Desulfovermiculus halophilus gen.

nov., sp. nov., выделенная из нефтяного месторождения. Микробиология.

2006, 75, 2, 201Ц211.

123. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Лысенко А.М., Турова Т.П., Колганова Т.В. Два новых вида микроаэрофильных серных спирилл, Spirillum winogradskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov. Mикробиология.

2006, 75, 2, 212Ц220.

124. Bogdanova T.I., Tsaplina I.A., Kondrat'eva T.F., Duda V.I., Suzina N.E., Melamud V.S., Tourova T.P., Karavaiko G.I. Sulfobacillus thermotolerans sp.

nov., a thermotolerant, chemolithotrophic bacterium. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 2006, 56, 5, 1039-1042.

125. Н.В. Жарикова, Т.В. Маркушева, Е.Г. Галкин, В.В. Коробов, Е.Ю.

Журенко, Л.Р. Ситдикова, Т.В. Колганова, Б.Б. Кузнецов, Т.П.Турова.

Raoultella planticola, новый штамм-деструктор 2,4,5трихлорфеноксиуксусной кислоты. Прикладная биохимия и микробиология. 2006, 42, 3, 258Ц262.

126. Берестовская Ю.Ю., Лысенко А.М., Турова Т.П., Васильева Л.В.

Психротолерантный Caulobacter sp. из почв российской полярной тундры.

Mикробиология. 2006, 75, 3, 377Ц382.

127. Слободова Н.В., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К. Сравнительная характеристика метанотрофных накопительных культур с помощью серологических и молекулярных методов. Микробиология. 2006, 75, 3, 397Ц403.

128. Tourova T. P., Spiridonova E. M., Berg I. A., Kuznetsov B. B. and Sorokin D.

Yu.. Occurrence, phylogeny and evolution of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes in obligately chemolithoautotrophic sulfuroxidizing bacteria of the genera Thiomicrospira and Thioalkalimicrobium.

Microbiology (UK). 2006, 152, 2159-2169.

129. Sorokin D.Yu., Zhilina T.N., Lysenko A.M., Tourova T.P., Spiridonova E.M.

Metabolic versatility of haloalkaliphilic bacteria from soda lakes belonging to the Alkalispirillum-Alkalilimnicola group. Extremophiles. 2006, 10, 3, 213-220.

130. Дульцева Н.М., Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Колганова Т.В., Осипов Г.А., Горленко В.М. Thiobacillus sajanensis sp.nov.Цновая облигатно автотрофная сероокисляющая бактерия, выделенная из сероводородных источников Хойто-Гол, Бурятия. Микробиология. 2006, 75, 5, 670-681.

131. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Lysenko A.M., Muyzer G. Diversity of culturable halophilic sulfur-oxidizing bacteria in hypersaline habitats.

Microbiology (UK). 2006, 152, 10, 3013- 3023.

132. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Kolganova T.V., Spiridonova E.M., Berg I.A., Muyzer G. Thiomicrospira halophila sp. nov., a moderately halophilic, obligately chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from hypersaline lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006, 56, 10, 2375-2380.

133. Заварзина Д.Г, Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кострикина Н.А., Турова Т.П., Заварзин Г.А. Geoalkalibacter ferrihydriticus gen. nov. sp. nov., первый алкалофильный представитель семейства Geobacteraceae, выделенный из содового озера. Микробиология. 2006, 75, 6, 775Ц785.

134. Спиридонова Е.М., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В., Турова Т.П.

Определение филогенетического разнообразия эндосимбионтов моллюска Bathymodiolus azoricus на основании анализа генов 16S рРНК, cbbL и pmoA. Микробиология. 2006, 75, 6, 798-806.

135. Болтянская Ю.В., Кевбрин В.В., Колганова Т.В., Турова Т.П., Осипов Г.А., Лысенко А.М., Жилина Т.Н.. Halomonas natronophila sp.nov. - и Halomonas kenyensis sp.nov. - новые галоалкалофильные денитрификаторы из содовых озер, способные к восстановлению N2O. Микробиология. 2007, 76, 6, 834-843.

136. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота. Микробиология. 2007, 76, 1, 107-115.

137. Болдарева Е.Н., Брянцева И.А., Цапин А., Нильсон К., Сорокин Д.Ю., Турова Т.П., Бойченко В.А., Стадничук И.Н., Горленко В.М. Новые галоалкалофильные бактериохлорофилл а содержащие бактериии Roseinatronobacter monicus sp. nov. из гиперсолоеного содового озера Моно Лейк (Калифорния, США). Микробиология. 2007, 76, 1, 95-106.

138. Zavarzina D.G., Sokolova T.G., Tourova T.P., Chernyh N.A., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermincola ferriacetica sp. nov., a new anaerobic, thermophilic, facultatively chemolithoautotrophic bacterium capable of dissimilatory Fe(III) reduction. Extremophiles. 2007, 11, 1, 1-7.

139. Kublanov I.V., Prokofeva M.I., Kostrikina N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Wiegel, J., Bonch-Osmolovskaya E.A. Thermoanaerobacterium aciditolerans sp. nov., a moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007, 57, 2, 260-264.

140. Sizova M.V., Panikov N.S., Spiridonova E.M., Slobodova N.V., Tourova T.P.

Novel facultative anaerobic acidotolerant Telmatospirillum siberiense gen. nov.

sp. nov. isolated from mesotrophic fen. Syst. Appl. Microbiol. 2007, 30, 3, 213220.

141. Sorokin D. Yu., van Pelt S., Tourova T. P., Takaichi S., and Muyzer G.

Acetonitrile degradation under haloalkaline conditions by Natronocella acetinitrilica gen. nov., sp. nov. Microbiology (UK). 2007, 153, 1157Ц1164.

142. Sorokin D. Yu. Tourova T. P., Bezsoudnova E. Y. Pol A., Muyzer G.

Denitrification in a binary culture and thiocyanate metabolism in Thiohalophilus thiocyanoxidans gen. nov. sp. nov. - a moderately halophilic chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing Gammaproteobacterium from hypersaline lakes Arch. Microbiol. 2007, 187, 441Ц450.

143. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Braker G., Muyzer G. Thiohalomonas denitrificans gen. nov., sp. nov. and Thiohalomonas nitratireducens sp. nov., novel obligately chemolithoautotrophic, moderately halophilic, thiodenitrifying Gammaproteobacteria from hypersaline habitats. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

2007, 57, 7, 1582-1589.

144. Sorokin D.Y., van Pelt S., Tourova T.P., Muyzer G. Microbial isobutyronitrile utilization under haloalkaline conditions. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 17, 5574-5579.

145.Tourova T.P., Spiridonova E.M., Berg I.A., Slobodova N.V., Boulygina E.S., Sorokin D.Y. Phylogeny and evolution of the family Ectothiorhodospiraceae based on comparison of 16S rRNA, cbbL and nifH gene sequences. Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2007, 57, 10, 2387-2398.

146. Sorokin D.Yu., Trotsenko Yu.A., Doronina N.V., Tourova T.P., Galinski E.A.,. Kolganova T.V and Muyzer G.. Methylohalomonas lacus gen. nov., sp.

nov. And Methylonatrum kenyense gen. nov., sp. nov., methylotrophic gammaproteobacteria from hypersaline lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

2007, 57, 12, 2762Ц2769.

147. Кеппен О.И., Турова Т.П., Ивановский Р.Н., Лебедева Н.В., Баслеров Р.В., Берг И.А. Филогенетическое положение трех штаммов зеленых серных бактерий. Микробиология. 2008, 77, 2, 282-285.

148. Кеппен О.И., Берг И.А., Лебедева Н.В., Таисова А.С., Колганова Т.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П., Ивановский Р.Н. Новая зеленая серная бактерия Chlorobium macestae sp.nov. Микробиология.

2008, 77, 1, 79-88.

149. Sorokin I.D., Kravchenko I.K., Doroshenko E.V., Boulygina E.S., Zadorina E.V., Tourova T.P., Sorokin D.Y. Haloalkaliphilic diazotrophs in soda solonchak soils. FEMS Microbiol Ecol. 2008, 65, 425-433.

150. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Muyzer G., Kuenen G.J. Thiohalospira halophila gen. nov., sp. nov. and Thiohalospira alkaliphila sp. nov., novel obligately chemolithoautotrophic, halophilic, sulfur-oxidizing gammaproteobacteria from hypersaline habitats. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008, 58, 7, 1685-1692.

151. Miroshnichenko M.L., Kublanov I.V., Kostrikina N.A., Tourova T.P., Kolganova T.V., Birkeland N.K., Bonch-Osmolovskaya E.A.

Caldicellulosiruptor kronotskyensis sp. nov. and Caldicellulosiruptor hydrothermalis sp. nov., two extremely thermophilic, cellulolytic, anaerobic bacteria from Kamchatka thermal springs. Int J Syst Evol Microbiol. 2008, 58, 6,1492-1496.

152. Shapovalova A.A., Khijniak T.V., Tourova T.P., Muyzer G., Sorokin D.Y.

Heterotrophic denitrification at extremely high salt and pH by haloalkaliphilic Gammaproteobacteria from hypersaline soda lakes. Extremophiles. 2008, 12, 619-625.

153. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Henstra A.M., Stams A.J., Galinski E.A., Muyzer G. Sulfidogenesis under extremely haloalkaline conditions by Desulfonatronospira thiodismutans gen. nov., sp. nov., and Desulfonatronospira delicata sp. nov. - a novel lineage of Deltaproteobacteria from hypersaline soda lakes. Microbiology (UK). 2008, 154, 5, 1444-1453.

154. Slobodkina G.B., Kolganova T.V., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Jeanthon C., Bonch-Osmolovskaya E.A., Slobodkin A.I. Clostridium tepidiprofundi sp.

nov., a moderately thermophilic bacterium from a deep-sea hydrothermal vent.

Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008, 58, 4, 852-855.

155. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Mumann M., Muyzer G. Dethiobacter alkaliphilus gen. nov. sp. nov., and Desulfurivibrio alkaliphilus gen. nov. sp.

nov.: two novel representatives of reductive sulfur cycle from soda lakes.

Extremophiles. 2008,12, 3, 431-439.

156. Banciu H.L., Sorokin D.Y., Tourova T.P., Galinski E.A., Muntyan M.S., Kuenen J.G., Muyzer G. Influence of salts and pH on growth and activity of a novel facultatively alkaliphilic, extremely salt-tolerant, obligately chemolithoautotrophic sufur-oxidizing Gammaproteobacterium Thioalkalibacter halophilus gen. nov., sp. nov. from South-Western Siberian soda lakes. Extremophiles. 2008, 12, 3, 391-404.

157. Турова Т. П., Назина Т. Н., Михайлова Е. М., Родионова Т.А.,. Екимов А.

Н, Машукова А. В., Полтараус А. Б. Гомологи alkB термофильных бактерий рода Geobacillus. Молекулярная биология. 2008, 42, 2, 47-57.

158. Sorokin I.D., Kravchenko I.K., Tourova T.P., Kolganova T.V., Boulygina E.S., Sorokin DY. Bacillus alkalidiazotrophicus sp. nov., a diazotrophic, low salttolerant alkaliphile isolated from Mongolian soda soil. Int J Syst Evol Microbiol. 2008, 58, 2459-2464.

159. Sorokin D.Y., van Pelt S., Tourova T.P. Utilization of aliphatic nitriles under haloalkaline conditions by Bacillus alkalinitrilicus sp. nov. isolated from soda solonchak soil. FEMS Microbiol Lett. 2008, 288, 2, 235-240.

160. Chmura A., Shapovalova A.A., van Pelt S., van Rantwijk F., Tourova T.P., Muyzer G., Sorokin D.Y. Utilization of arylaliphatic nitriles by haloalkaliphilic Halomonas nitrilicus sp. nov. isolated from soda soils. Appl Microbiol Biotechnol. 2008 81, 2, 371-318.

161. Sorokin I.D., Zadorina E.V., Kravchenko I.K., Boulygina E.S., Tourova T.P., Sorokin D.Y. Natronobacillus azotifigens gen. nov., sp. nov., an anaerobic diazotrophic haloalkaliphile from soda-rich habitats. Extremophiles. 2008.12, 6, 819-827.

162. Miroshnichenko M.L., Tourova T.P., Kolganova T.V., Kostrikina N.A., Chernych N., Bonch-Osmolovskaya E.A. Ammonifex thiophilus sp. nov., a hyperthermophilic anaerobic bacterium from a Kamchatka hot spring. Int J Syst Evol Microbiol. 2008, 58, 2935-2938.

163. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Galinski E.A., Muyzer G., Kuenen J.G.

Thiohalorhabdus denitrificans gen. nov., sp. nov., an extremely halophilic, sulfur-oxidizing, deep-lineage gammaproteobacterium from hypersaline habitats. Int J Syst Evol Microbiol. 2008, 58, 12, 2890-2897.

164. Болдарева Е.Н., Турова Т.П., Колганова Т.В., Москваленко А.А., Махнева З.К., Горленко В.М. Новая аэробная бактериохлорофилл а содержащая бактерия Roseococcus suduntuyensis sp. nov., выделенная из слабоминерализованного содового озера Восточной Сибири.

Микробиология. 2009, 78б 1б 106-116.

165. Sorokin D.Yu., van Pelt S., Tourova T.P. and Evtushenko L.I.. Nitriliruptor alkaliphilus gen. nov., sp. nov., a deep-lineage haloalkaliphilic actinobacterium from soda lakes capable of growth on aliphatic nitriles, and proposal of Nitriliruptoraceae fam. nov. and Nitriliruptorales ord. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 2009, 59, 248-253.

166. Prokofeva M.I., Kostrikina N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Lysenko A.M., Lebedinsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Isolation of the anaerobic thermoacidophilic crenarchaeote Acidilobus saccharovorans sp. nov. and proposal of Acidilobales ord. nov., including Acidilobaceae fam. nov. and Caldisphaeraceae fam. nov. Int J Syst Evol Microbiol. (In press).

Научные обзоры:

167. Т.П.Турова. Филогения прокариот на основании анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. Успехи микробиологии. 1983, 18, 92-112.

168. Tourova T.P., Antonov A.S. Identification of microorganisms by rapid DNADNA hybrisization. Methods in Microbiology. 1987, 19, 333-355.

169. Турова Т.П. Использование гибридизационного анализа нуклеиновых кислот для идентификации бактерий. Успехи микробиологии. 1992, 27, 185-209.

170. Турова Т.П. Изучение происхождения двух типов строения клеточной стенки эубактерий и способности к спорообразованию с помощью молекулярно-биологических методов. Микробиология. 1995,.64, 3, 301309.

171. Турова Т.П. Применение данных ДНК-ДНК гибридизации и анализа генов 16S рРНК для решения таксономических проблем на примере порядка Haloanaerobiales. Микробиология. 2000, 69, 6. 741-752.

172. Турова Т.П. Мультикопийность рибосомных оперонов прокариот и ее влияние на проведение филогенетического анализа. Микробиология. 2003, 72, 4, 437-452.

173. Турова Т.П.. Молекулярная экология микроорганизмов. Глава 6. В:

Экология микроорганизмов. Учебник для вузов (под ред. Нетрусова А.И.), М: Академия, 2004, 246-256.

Авторское свидетельство:

1. Антонов А.С., Белоусова А.А., Лысенко А.М., Турова Т.П. Способ идентификации микроорганизмов. № 649751, 1979.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии