Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ЛЕОПОЛЬД АННА ВЛАДИМИРОВНА
ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ЕГО ПЕРВОГО РАСТВОРИМОГО РЕЦЕПТОРА
03.01.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.
Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Чехонин Владимир Павлович.
Официальные оппоненты:
Иванов Алексей Сергеевич - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ ИМБХ РАМН, заведующий лабораторией межмолекулярных взаимодействий.
азарев Василий Николаевич - доктор биологических наук, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, заведующий лабораторией генной инженерии.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН.
Защита состоится л__ октября 2012 года в __ часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научно-исследовательский институт физикохимической медицины Федерального медико-биологического агентства по адресу: 119 435, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1А, 499-246-44-09.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России по адресу: 119 435, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1А.
Автореферат разослан л__ _______________2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор биологических наук М.А.Мурина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.
Актуальность исследования.
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является основным регулятором образования новых кровеносных сосудов как в норме, так и при патологии (Chung et Ferrara 2011). Клетки злокачественных опухолей легких, желудка, молочной железы, мозга активно синтезируют VEGF, стимулирующий образование сети кровеносных сосудов, необходимой для удовлетворения метаболических потребностей опухоли (Jain et al. 2006).
Таким образом, VEGF является привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии (Pourgholami et Morris 2008). Кроме того, повышение содержания VEGF в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, внутриглазной жидкости зачастую служит маркером заболеваний, связанных с патологическим ангиогенезом (Smerdel et al. 2010, Zhou et Wang 2012, Niizeki et al.2012). Следовательно, получение рекомбинантного высокоочищенного VEGF, иммунохимически идентичного нативному является необходимым начальным этапом как для получения моноклональных антител к нему, так и для разработки способов его количественного определения в биологических жидкостях. VEGF связывается с двумя тирозинкиназными рецепторами VEGFR-2 и VEGFR-1, причем последний связывает VEGF во много раз сильнее, чем VEGFR-(KdVEGFR-1=15pM, в то время как KdVEGFR-2=750pM) (Koch et al. 2011, Robinson et Stringer 2001). За счет альтернативного сплайсинга образуется растворимая изоформа VEGFR-1 (sVEGFR-1 или sFlt-1), аминокислотная последовательность которой соответствует части внеклеточного домена VEGFR-1 (Jebbink et al. 2011, Koch et al. 2011). Основную роль в связывании VEGF как с его первым, так и с его вторым рецептором играют 2-я и 3-я иммуноглобулин-подобные петли внеклеточного домена VEGFR-1 (Koch et al. 2011). Таким образом, функционально активный рекомбинантный белок, содержащий лиганд-связывающий участок внеклеточного VEGFсвязывающего домена VEGFR-1 сам по себе может являться альтернативой моноклональным антителам к VEGF и использоваться как для детекции содержания VEGF в биологических жидкостях, так и для подавления VEGFзависимой васкуляризации злокачественных опухолей (Gonsalves et al. 2007, Holash et al. 2002). Несмотря на возможность получения рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в различных эукариотических системах экспрессии (начиная от дрожжей и заканчивая клетками млекопитающих) разработка генетических конструкций, способных к эффективной экспрессии рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в E.coli продолжает оставаться весьма актуальной задачей, в силу таких преимуществ использования данной системы экспрессии как простота культивирования и короткий период генерации, упрощающий подбор оптимальных условий для экспрессии соответствующего рекомбинантного белка (Waegeman et Soetaert, 2011).
Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный VEGF иммунохимически идентичный нативному и также рекомбинантный лигандсвязывающий биологически активный фрагмент экстраклеточного домена его первого рецептора VEGFR-1 (Flt-1).
Задачи исследования:
1. Получить штамм E.coli эффективно продуцирующий рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов крысы VEGF.
2. Получить штаммы E.coli эффективно продуцирующие рекомбинантные, VEGF-связывающие фрагменты растворимого первого рецептора фактора роста эндотелия сосудов человека sVEGFR-1 (sFlt-1).
3. Разработать метод очистки рекомбинантного VEGF и рекомбинантных лиганд-связывающих фрагментов sFlt-1 из клеток E.coli.
4. Разработать метод ренатурации рекомбинантного, лиганд-связывающего фрагмента sFlt-1.
5. Разработать метод количественного лиганд-рецепторного анализа VEGF и sFlt-1на основе рекомбинантных растворимых VEGF и и sFlt-1.
6. Исследовать влияние рекомбинантного растворимого лигандсвязывающего фрагмента sFlt-1 на восстановление поврежденного монослоя глиомных клеток глиомы крысы С6.
Научная новизна исследования.
В ходе исследования впервые произведено сравнение эффективности использования различных экспрессирующих конструкций (произведено сравнение эффективности четырех плазмидных конструкций в обоих случаях) для наработки рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1 в E.coli.
Впервые показана возможность разработки высокочувствительного лигандрецепторного анализа для количественного определения VEGF и sVEGFR-на основе биотинилированных рекомбинантных VEGF и trx|sFlt-1(2-3).
Впервые показано, что trx|sFlt-1 ингибирует миграцию глиомных клеток глиомы С6 в монослойной культуре in vitro.
Практическое значение работы.
1. Полученные рекомбинантные белки могут использоваться для иммунизации животных с целью получения моноклональных и поликлональных анти-VEGF и анти-sVEGFR-1 антител.
2. Разработанный лиганд-рецепторный анализ на основе рекомбинантных биотинилированных VEGF и sVEGFR-1 может использоваться для определения концентрации VEGF и sVEGFR-1 в биологических жидкостях.
3. Растворимый VEGF-связывающий рекомбинантный фрагмент экстраклеточного домена VEGFR-1 c N-терминальным белком слияния тиоредоксином (trx|sFlt-1(2-3)) полученный в E.coli может использоваться для анти-VEGF терапии.
Положения выносимые на защиту.
1. Использование сконструированных в ходе работы экспрессирующих конструкций pQE80L/VEGF, pQE60/sFlt-1(1-3) и pET32a/sFlt-1(2-3) позволяет получать значительные количества рекомбинантных иммунохимически идентичных нативным белков фактора роста эндотелия сосудов VEGF и фрагментов внеклеточного домена его первого растворимого рецептора sVEGFR-1(sFlt-1(1-3) и sFlt-1(2-3)) в E.coli.
2. Лиганд-рецепторный анализ с использованием рекомбинантных VEGF и trx|sFlt-1(2-3), позволяет определять VEGF в диапазоне концентраций 1-125 нг/мл, а его рецептор (VEGFR-1) в диапазоне концентраций 2-2нг/мл.
3. Рекомбинантный trx|sFlt-1(2-3) ингибирует восстановление монослоя глиомных клеток глиомы С6.
Внедрение результатов исследования.
Полученные в ходе работы рекомбинантные белки активно использовались для иммунизации мышей с целью получения моноклональных анти-VEGF и анти-sFlt-1 антител в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ ССП им. В.П. Сербского.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011) и на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им. Пирогова и сотрудников отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ ССП им.
В.П. Сербского от 29 марта 2012 г.
Публикации.
По теме работы было опубликовано 3 статьи в рецензируемых ВАК журналах.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 9 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы включающего 153 источника, из которых 152 на английском и 1 на русском языке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Основные манипуляции для клонирования векторов производили в штамме E.coli XL Blue. Для изучения экспрессии полученных конструкций в E.coli использовали штаммы Rosetta(DE3) и BL21(DE3). Для изучения биологической активности рекомбинантных белков использовали культуру перевиваемых клеток глиомы крысы C6 и культуру клеток HUVEC.
Получение рекомбинантного фактора роста эндотелия сосудов VEGF крысы.
Клонирование VEGF в экспрессирующие векторы.
кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность изоформы VEGF164 крысы, амплифицировали из кДНК библиотеки мозга крысы (Invitrogen, США) с помощью соответствующих праймеров (Синтол, Россия).
Полученные кДНК были клонированы в экспрессирующие векторы pET28a, pET32a, pET21-2c и pQE80L по соответветствующим сайтам рестрикции (см.
рис 1). кДНК кодирующие соответствующие лиганд-связывающие фрагменты sVEGFR-1 амплифицировали с помощью соответствующих праймеров из кДНК библиотеки мозга человека (Invitrogen, США) и клонировали в векторы pET32a, pQE80L, pET28a, pQE60. Секвенирование (Синтол, Россия) полученных конструкций показало идентичность нуклеотидной последовательности клонированных кДНК последовательностям, известным из баз данных. Последовательность всех праймеров определялась с помощью программы VectorNTI Suite 9. Все праймеры содержали сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков VEGF и sVEGFR-1 в E.coli.
Штаммы E.coli Rosetta(DE3) и BL21(DE3) были трансформированы полученными конструкциями с помощью электропорации.
Трансформированные штаммы культивировались в среде Лурия-Бертани, с соответствующими антибиотиками (в случае использования штаммов, трансформированных конструкциями на основе плазмиды pET28a в среду добавляли канамицин, во всех остальных случаях - ампициллин; при использовании штамма Rosetta(DE3) в среду также добавляли хлорамфеникол). Индукцию экспрессии белка осуществляли с помощью добавления ИПТГ, а анализ интенсивности экспрессии рекомбинантных белков при использовании разных штаммов E.coli и разных экспрессирующих конструкций производили с помощью электрофореза в ПААГ. Очистку рекомбинантных белков производили с помощью металлафинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе. Бактериальную массу лизировали с помощью 3М тиоционата гуанидина или 8М мочевины, полученный лизат центрифугировали и супернатант наносили на колонку с Ni2+-NTA агарозой. Рефолдинг рекомбинантных белков VEGF и различных вариантов sVEGFR-1 осуществляли непосредственно на металлаффинной колонке, постепенно снижая концентрации гуанидин тиоционата с 3М до 0.М в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона в молярном соотношении 1:50. От примесей избавлялись промывая колонку буферами (50мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl) вначале с 20, затем с 50 мМ имидазола соответственно. Ренатурированный белок элюировали с помощью элюирующего буфера (300 мМ имидазол, 50мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl). В тех случаях, когда ренатурация белка не требовалась, последовательную промывку колонки производили с помощью буферов с 8М мочевиной и 20 и 50 мМ имидазолом, а элюцию осуществляли с помощью 8М мочевины с 3мМ имидазолом.
Иммунохимический анализ рекомбинантных VEGF и sVEGFR-1.
Анализ иммунохимической идентичности рекомбинантных белков соответствующим нативным производился как с помощью коммерческих, так и с помощью полученных при иммунизации мышей моноклональных антител (полученных в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ ССП им. В.П. Сербского). При иммунохимическом анализе использовались методы вестерн-блоттинга и иммуноцитохимии.
Исследование лиганд-связывающей активности sVEGFR-1.
Твердофазный лиганд-рецепторный анализ производился с изпользованием биотинилированных, ренатурированных рекомбинантных белков. При этом биотинилирование рекомбинантных белков осуществлялось при инкубации последних с натриевой солью биотинамид-3сульфо-N-гидроксисукцинимидного эфира в 0,1 М карбонатном буфере в молярном соотношении белок:эфир ~1:5. После завершения реакции производилось удаление избытка биотинилирующего агента с помощью диализа против 0,1 М карбонатного буфера. Исследуемые белки: в одном случае рецептор, в другом случае - лиганд (VEGF) иммобилизовались на поверхности высокоадгезивного пластика в лунках 96-луночного планшета для ИФА (SARSTEDT, США), в посадочном буфере (0.05 М Na2CO3, 0.М NaHCO3 pH=9.6 ). Инкубация планшета с соответствующими белками осуществлалась в течение ночи при температуре +4С. После этого планшеты промывались с помощью промывателя для планшетов (Bio-Rad, США) и в лунки планшета вносился раствор биотинилированного белка в PBS.
Планшеты инкубировались в термошейкере при 37С в течение часа, после чего опять промывались с помощью промывателя для планшетов и в ячейки вносился раствор. Количественный анализ биотинилированных белков, связавшихся с иммобилизованными на пластике белками, проводили с помощью конъюгированной с биотином пероксидазы и стрептавидина (ABC kit, Vector-Lab) и ECL реагента (Amersham) как субстрата.
Исследование активности полученных белков на культуре клеток глиомы С6 и на культуре клеток HUVEC.
Клетки глиомы С6 культивировались в 25X2 см культуральных пластиковых флаконах (Corning), при 37С, во влажной атмосфере с 5% CO2, в среде DMEM/F12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки.
Пассаж культур осуществлялся с использованием раствора трипсин (0.02%) и ЭДТА (0.01%). Для исследования активности полученных белков осуществлялся пассаж клеток глиомы в чашки Петри (60 мм), где клетки культивировались при 37С, во влажной атмосфере с 5% CO2, в среде DMEM/F12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки до образования ими монослоя. После образования монослоя последний нарушался с помощью наконечника для дозатора (до 10 мкл). Нарушение монослоя фиксировалось с помощью инвертированного микроскопа (Leica, Германия) при 10-кратном увеличении. После этого производилась замена среды в чашках Петри на новую и в среду в разных концентрациях (от 15 до 300 нмоль на мл) добавляли рекомбинантный растворимый белок trx|sFlt-1(23). Степень восстановления монослоя фиксировалась через 20 часов после внесения рекомбинантного белка в чашки Петри, при тех же параметрах. При определении биологической активности рекомбинантного VEGF с помощью MTT теста клетки HUVEC высаживали на 98-луночный планшет в концентрации 5103 клеток на лунку планшета. Клетки культивировали в течение 18 часов в среде DMEM/F12, после чего производилась замена среды на среду без сыворотки и факторов роста. Клетки культивировались в среде без сыворотки и факторов роста в течение 5 часов, после чего в лунки вносился VEGF в концентрациях 10, 100, 1000 нг/мл. Клетки инкубировались с VEGF в течение суток, после чего в лунки добавляли индикатор Alamar blue (резазурин, 7-гидрокси-3Н-феноксазин-3-он-10-оксид), инкубировали клетки с ним в течение 4 часов после чего осуществляли детекцию флуоресценции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного VEGF.
При клонировании кДНК в соответствующие экспрессирующие векторы было получено четыре экспрессирующих конструкции (см. рис 1).
Рисунок 1. Схематическое изображение экспрессирующих конструкций.
VEGF - ген, кодирующий фактор роста эндотелия сосудов, 6ХHIS - ген кодирующий последовательность из шести гистидинов, T7, T5 - промоторные последовательности, EcoRI, XhoI, NdeI, Hind III - сайты узнавания одноименных эндонуклеаз рестрикции.
Анализ интенсивности экспрессии рекомбинантных белков trx|VEGF и VEGF в штаммах BL21(DE3) и Rosetta(DE3) с помощью электрофореза в ПААГ показал, что во всех случаях наибольшая интенсивность экспрессии рекомбинантного VEGF наблюдается при использовании штамма Rosetta(DE3). Что касается экспрессирующих конструкций, то наибольший выход рекомбинантного белка наблюдался при использовании конструкций pET32a/VEGF и pQE80L/VEGF. Несмотря на высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, весь экспрессировавшийся VEGF был нерастворим и находился в тельцах включения, при этом было отмечено, что тельца включения плохо растворялись даже в 8М мочевине. Наибольшего выхода рекомбинантного VEGF во всех случаях удалось достичь при использовании для лизиса клеток и растворения телец включения 3М тиоционата гуанидина (см. таб 1). Анализ выделенных из бактериального лизата с помощью металлаффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе белков показал их высокую степень очистки и соответствие их молекулярной массы ожидаемой (см. рис 2).
Рисунок 2. Справа. Анализ очищенных с помощью металл-афинной хроматографии элюатов рекомбинантного trx|VEGF c помощью электрофореза в ПААГ. 1,2,3 - фракции элюций, M - маркеры молекулярной массы (Fermentas). Слева. Анализ очищенного с помощью металл-афинной хроматографии VEGF (при использовании штамма Rosetta(DEтрансформированного pQE80L/VEGF)). 1, 2, 3 - фракции элюций, М - маркеры молекулярной массы (Thermo scientific).
Таблица 1. Выход рекомбинантного VEGF (в мг на литр культуры E.coli).
белок 8М мочевина 6М 3М гидрохлорид тиоционат гуанидина гуанидина VEGF (pET28|VEGF) 0.5 мг/литр 0.6мг/литр 2 мг/литр trx|VEGF 3 мг/литр 5.1 мг/литр 10 мг/литр VEGF (pET21- 2 мг/литр 5 мг/литр 6 мг/литр 2c|VEGF) VEGF 2 мг/литр 5 мг/литр 12 мг/литр (pQE80L|VEGF) В силу того, что эффективность экспрессии VEGF в клетках E.coli была наиболее высока в штаммах, трансформированных плазмидами pET32aVEGF и pQE80L-VEGF, было принято решение для дальнейшей наработки рекомбинантного VEGF использовать штаммы, трансформированные плазмидой pQE80L, поскольку в случае использования pET32a у рекомбинантного VEGF наличествовал достаточно большой Nтерминальный белок слияния тиоредоксин, в то время как у VEGF, синтезированного при использовании штамма Rosetta(DE3)/pQE80L-VEGF c N-терминального конца имелся лишь короткий фрагмент из шести гистидинов. Кроме того, использование конструкции, на основе плазмиды pQE80L обладает определенным удобством: ведь кодируемый этой плазмидой репрессор lac-оперона позволяет использовать для ее контролируемой экспрессии как хозяина любой штамм E.coli, в то время как Т5 промотор, распознаваемый Т5 РНК-полимеразой E.coli также позволяет при необходимости экспрессировать клонированный в pQE80L ген в любых, а не только в экспрессирующих Т7 РНК полимеразу (т.е. DE3), штаммах E.coli.
Иммунохимический анализ рекомбинантного VEGF.
Анализ иммунохимической идентичности рекомбинантного VEGF нативному производился как с помощью коммерческих антител, так и с помощью моноклональных антител, полученных в отделе в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ ССП им. В.П.
Сербского при иммунизации мышей рекомбинантным VEGF (см. рис 3).
Рисунок 3 А. Иммунохимический анализ нативного VEGF в лизате клеток глиомы С6 с помощью моноклональных антител полученных с помощью иммунизации мышей рекомбинантным VEGF 1. Иммуноблоттинг с помощью коммерческих антител к VEGF (Abcam) 2. Иммуноблоттинг с помощью антител, полученных с помощью иммунизации мышей рекомбинантным VEGF. 3. Маркеры молекулярной массы (Chemichrome) Б.
Иммунохимический анализ рекомбинантного VEGF с помощью коммерческих антител (Abcam).
Рисунок 4. Иммуноцитохимический анализ клеток глиомы С6 с помощью моноклональных антител к рекомбинантному VEGF Вторичные антитела Goat antimouse Alexa Fluor 488 (УInvitrogenФ). ядра клеток докрашены TOTO 633 (УInvitrogenФ).
Исследование влияния рекомбинантного VEGF на жизнеспособность клеток культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).
Было, также, показано, что добавление к клеткам культуры HUVEC (после инкубации последних в бессывороточной среде в течение 12 часов) рекомбинантного растворимого и ренатурированного в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона VEGF (продуцировавшегося штаммом E.coli, трансформированным плазмидой pQE80L-VEGF) способно увеличивать их жизнеспособность в сравнении с контролем (см. рис 5).
Рисунок 5. Влияние рекомбинантного VEGF на жизнеспособность клеток HUVEC. К клеткам HUVEC инкубировавшимся с рекомбинантным VEGF и в концентрациях от 0 нг до 1000 нг добавляли флуоресцентный краситель Alamar Blue; интенсивность флуоресценции детектировали через четыре часа после добавления красителя ( p < 0.05, n = 13).
Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного sVEGFR-1.
Растворимая изоформа первого рецептора VEGF состоит из шести иммуноглобулин-подобных доменов, из которых решающую роль в связывании VEGF играют 2-й и 3-й Ig-подобные домены. кДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие лиганд-связывающим доменам sFlt-1 были клонированы в различные векторы (см. рис 6 ).
Рисунок 6. Схематическое изображение экспрессирующих конструкций.
2, 3 - нуклеотидные последовательности, кодирующие 2-й и 3-й Ig-подобные домены sFlt-1; 6ХHIS - ген кодирующий последовательность из шести гистидинов, T7, T5 - промоторные последовательности, EcoRI, XhoI, NdeI, Hind III, BamHI, BglII - сайты узнавания одноименных эндонуклеаз рестрикции.
Анализ интенсивности экспрессии рекомбинантных белков, синтезировавшихся в E.coli после трансформации клеток созданными конструкциями показал, что наименьший выход рекомбинантного белка наблюдается при использовании экспрессирующей конструкции pET28a/sFlt1(1-3). Анализ выделенных из бактериального лизата с помощью металлаффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе рекомбинантных белков показал высокую степень их очистки и соответствие их молекулярной массы ожидаемой (см. рис 7).
Рисунок 7. Диск-электрофорез в 12% ПААГ с SDS рекомбинантных sFlt1(1-3), trx|sFlt-1(2-3), sFlt-1(2-3). А. 1,2,3 - фракции элюций рекомбинантного sFlt-1(1-3), M - маркеры молекулярной массы (Fermentas), 1Т,2Т,3Т - фракции элюций рекомбинантного trx|Flt-1(2-3) Б. 1, 2 - фракции элюций sFlt-1(2-3), М - маркеры молекулярной массы (Thermo scientific).
При ренатурации рекомбинантных белков наибольший выход растворимого рекомбинантного белка наблюдался при использовании штамма, трансформированного плазмидой pET32a/sFlt-1(2-3), и составил 7.5 мг на литр, в то время как выход других белков при ренатурации не превышал 1 мг на литр, что вероятно объясняется тем, что при использовании конструкции pET32a/sFlt-1(2-3) рекомбинантный белок (trx|sFlt-1(2-3)) синтезируется с Nтерминальным белком слияния тиоредоксином, улучшающим в ряде случаев растворимость белка.
Иммунохимический анализ рекомбинантного sFlt-1.
Анализ иммунохимической идентичности рекомбинантных белков trx|sFlt1(2-3), sFlt-1(2-3) и sFlt-1(1-3) нативному производился как с помощью коммерческих антител, так и с помощью моноклональных антител, полученных при иммунизации мышей рекомбинантным sFlt-1(1-3) в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ ССП им. В.П.
Сербского. Все очищенные препараты в иммуноблоттинге с хемилюминесцентной детекцией визуализировались как одиночные четкие полосы соответствующей молекулярной массы (см. рис 8).
Рисунок 8. Иммуноблоттинг рекомбинантных sFlt-1(1-3) и trx|sFlt(2-3) c помощью коммерческих и полученных с помощью иммунизации мышей моноклональных антител. M - маркеры молекулярной массы (Chemichrome) 1, 2 - иммунохимический анализ рекомбинантных sFlt-1(1-3), trx|sFlt-1(2-3) c помощью коммерческих моноклональных антител к VEGFR-(Sigma); 3,4,5 - иммунохимический анализ рекомбинантных sFlt-1(1-3), trx|sFlt-1(2-3), sFlt-1(2-3) с помощью антител полученных путем иммунизации мышей рекомбинантным sFlt-1(1-3).
Иммунохимический анализ клеток глиомы С6 и клеток HEK293 с помощью антител к рекомбинантному sFlt-1(1-3) показал, что антитела полученные с помощью иммунизации животных рекомбинантным sFlt-1(1-3) взаимодействуют с нативным Flt-1 (см. рис 9).
Рисунок 9. Результаты иммуноцитохимического анализа. А. клетки глиомы С6 Б. клетки HEK 293.
иганд-рецепторный анализ взаимодействия рекомбинантного sFlt-1 с рекомбинантным VEGF Лиганд-рецепторный анализ с иммобилизацией одного из компонентов на полистироле и добавлением второго в последовательных разведениях позволил количественно охарактеризовать взаимодействие рекомбинантных trx|sFlt-1(2-3) и VEGF (см. рис 10) Рисунок 10. Лиганд-рецепторный анализ полученных белков. А.
взаимодействие биотинилизованного VEGF с иммобилизованным на поверхности высокоадгезивного пластика рекомбинантным Flt-1(1-3). Б.
взаимодействие биотинилированных Flt-1(1-3) и trx|Flt-1(2-3) с иммобилизованным на поверхности высокоадгезивного пластика рекомбинантным VEGF.
Таким образом, лиганд-рецепторный анализ показал, что ренатурированный и биотинилированный рекомбинантный VEGF специфически связывается с иммобилизованным на полистироле sFlt-1 (1-3), и, наоборот, Ч растворимые trx|sFlt-1(2-3) и sFlt-1(1-3) специфически связываются с иммобилизованным на поверхности пластика VEGF. Рабочий отрезок калибровочной кривой определения VEGF соответствовал диапазону концентрации 1 Ч 125 нг/мл. Учитывая ресурс чувствительности хемилюминесцентной детекции, есть все основания предполагать, что оптимизация этого анализа в варианте с применением высокоаффинных моноклональных антител к sFlt-1 может позволить сделать его пригодным для диагностического применения (детекция концентраций от 0,1 нг/мл и ниже).
Ингибирование растворимым trx|sFlt-1(2-3) восстановления поврежденного монослоя глиомных клеток глиомы СВ силу того, что при ренатурации удавалось ренатурировать значительно большее количество слитного белка trx|sFlt-1(2-3), чем белков sFlt-1(1-3) и sFlt-1(2-3), а способность trx|sFlt-1(2-3) связывать VEGF практически не отличалась от таковой sFlt-1(1-3) (см. рис 10), было принято решение использовать в дальнейших экспериментах in vitro именно trx|sFlt1(2-3) (см. рис 11 ).
Рисунок 11. Ингибирование восстановления монослоя клеток глиомы Сгибридным растворимым белком trx|sFlt-1(2-3). А. По оси ординат:
площадь поврежденного монослоя клеток глиомы С6 (условные единицы).
Синие столбцы: площадь поврежденного монослоя клеток глиомы С6 до внесения в среду trx|sFlt-1(2-3). красные столбцы: площадь поврежденного монослоя клеток глиомы С6 после 20 часов инкубации в среде с растворимым trx|sFlt-1(2-3) (p<0.05, n=10) Б. trx|sFlt-1(2-3) ингибирует восстановление монослоя клеток глиомы С6. Слева: микрофотографии монослоя клеток глиомы С6 сразу после его повреждения. Справа:
микрофотографии монослоя клеток глиомы С6 через 20 часов после повреждения монослоя клеток глиомы С6. Показаны результаты внесения в культуральную среду trx|sFlt-1(2-3) в концентрации 30 нмоль/мл культуральной среды.
Таким образом, было показано, что растворимый белок trx|sFlt-1(2-3), аминокислотная последовательность которого включает 2-й и 3-й Igподобные домены внеклеточного участка VEGFR-1, отвечающие за связывание VEGF, ингибирует восстановление монослоя глиомных клеток глиомы C6 будучи добавлен в культуральную среду.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Во время работы, во-первых, было произведено сравнение интенсивности экспрессии рекомбинантных белков в различных штаммах E.coli и при использовании различных экспрессирующих конструкций, что позволило отобрать для дальнейшей работы наиболее эффективные экспрессирующие конструкции (pQE80L|VEGF, pET32a|sFlt-1(2-3)), позволяющие осуществлять наработку иммунохимически идентичных нативным, а в случае pET32a|sFlt-1(2-3) биологически активных белков, в количествах достаточных, для проведения дальнейших экспериментов. В ходе работы была также показана возможность создания лигандрецепторного анализа на основе рекомбинантных биотинилированных белков, что обладает определенной практической ценностью, ведь повышенное содержание sFlt-1 в сыворотке крови является маркером гестоза, в то время как содержание самого VEGF в биологических жидкостях повышается при ряде заболеваний, связанных с патологическим ангиогенезом. В свою очередь, отдельный интерес представляет возможность ингибирования миграции и пролиферации клеток глиомы С6 с помощью рекомбинантного trx|sFlt-1(2-3). Имеется по крайней мере одна работа, в которой было показано, что миграция и пролиферация клеток С6 глиомы в культуре подавляются низкомолекулярным ингибитором тирозинкиназной активности VEGFR-2 SU1496 (Parthymou et al. 2008), что также позволяет предполагать, что явление блокировки восстановления монослоя клеток глиомы С6 растворимым рекомбинантным trx|sFlt-(2-3) вызвано уменьшением интенсивности VEGF/VEGFR-2 сигналлинга, за счёт конкурирования рекомбинантного trx|sFlt-1(2-3) с нативным VEGFR-2 за связвание нативного VEGF. Таким образом, можно ожидать, что растворимый рекомбинантный trx|sFlt-1(2-3) может быть эффективно использован также и для анти-VEGF терапии глиобластом in vivo.
Выводы.
1. Клонирование в плазмиду pQE80L кДНК VEGF и трансформация полученной конструкцией штамма E.coli Rosetta(DE3) позволяет получить штамм Rosetta(DE3)/pQE80L-VEGF эффективно продуцирующий фактор роста эндотелия сосудов крысы VEGF.
2. Клонирование кДНК, кодирующей аминокислотную последовательность соответствующую 1-3 Ig-подобным петлям sFlt-1, в плазмиду pQE60 и кДНК, кодирующей аминокислотную последовательность соответствующую 2-3 Ig-подобным петлям sFlt-1, в плазмиду pET32a и трансформация полученными конструкциями штамма E.coli Rosetta(DE3) позволяет получить штаммы Rosetta(DE3)/pQE60-sFlt-1(1-3) и Rosetta(DE3)/pET32a-sFlt-1(2-3) эффективно продуцирующие sFlt-1(1-3) и trx|sFlt-1(2-3) соответственно.
3. Применение металл-аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе позволяет получать из лизатов клеток Rosetta(DE3)/pQE80L-VEGF, Rosetta(DE3)/pQE60-sFlt-1(1-3) и Rosetta(DE3)/pET32a-sFlt-1(2-3) очищенные от примесей, препараты VEGF, sFlt-1(1-3) и trx|sFlt-1(2-3) иммунохимически идентичные соответствующим нативным белкам с выходом до 12 мг, 10 мг и 15 мг на литр культуры E.coli соответственно.
4. Рефолдинг trx|sFlt-1(2-3) на металл-аффинной колонке позволяет осуществить ренатурацию 50% синтезированного в клетках E.coli белка trx|sFlt-1(2-3).
5. Лиганд-рецепторный анализ на основе биотинилированных растворимых рекомбинантных sFlt-1(2-3) и VEGF позволяет определять VEGF в диапазоне концентраций 1-125 нг/мл, а sFlt-1 в диапазоне концентраций 2-250 нг/мл.
6. Рекомбинантный белок trx|sFlt-1(2-3) в концентрациях от 15 до 1нмоль/мл ингибирует восстановление поврежденного монослоя глиомных клеток глиомы С6 на 40 и 65 % соответственно.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Статьи в рецензируемых журналах 1. Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функциональной активности рекомбинантных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR-1// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011, №12, стр.641-651.
2. Леопольд А.В., Павлов К.А. Баклаушев В.П., Чехонин В.П.// Получение рекомбинантного экстраклеточного фрагмента фактора роста эндотелия сосудов VEGFR-1 человека в E.coli Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011№ 3 стр.322-327.
3. Шеин С.А., Гурина О.И., Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Корчагина А.А., Гриненко Н.Ф. Иванова Н.В., Волгина Н.Е., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Получение моноклональных антител к рекомбинантному фактору роста эндотелия сосудов // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2012 №1, стр. 24-29.
Тезисы конференций 1. Леопольд А.В., Кошкин Ф.А., Павлов К.А., Оккельман И.А.
Экспрессия, очистка и иммунохимический анализ рекомбинантного фактора роста эндотелия сосудов в клетках E.coli. V Международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2010, с. 509.
2. Леопольд А.В., Баклаушев В.П., Павлов К.А., Корчагина А.А.
Экспрессия биологически активного экстраклеточного домена рецептора фактора роста эндотелия сосудов Flt-1 в Escherichia coli.
VI Международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых. Москва, Россия. Тезисы докладов, 2011, с. 230.
3. Шеин С.А., Леопольд А.В. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. VI Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых.
Москва, Россия. Тезисы докладов, 2011, с. 230.