Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
РУКАВЦОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ НОВЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
03.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино - 2009
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Музафаров Евгений Назибович доктор биологических наук, профессор Сулимова Галина Ефимовна доктор биологических наук Камзолова Светлана Григорьевна
Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н.
Белозерского при Московском государственном университете им. М.В.
омоносова, г. Москва
Защита состоится 2009 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01. при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г. Пущино, ул. Институтская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г. Пущино
Автореферат разослан ______________________________________
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из важных задач молекулярной биологии и генноинженерной экспериментальной биологии растений является получение растений с новыми заданными свойствами. В настоящее время с помощью методов метаболической инженерии и стратегии РНК-интерференции получены и исследуются трансгенные растения с измененным метаболизмом и устойчивостью к фитопатогенам, отличающиеся синтезом новых ценных биологически активных соединений для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.
Экспрессия в трансгенных растениях генов, кодирующих ключевые ферменты биохимических путей, позволяет получить информацию о механизмах, регулирующих тот или иной метаболический путь. Направленное ингибирование таких генов предоставляет не менее ценную информацию о функции гена и позволяет изучить роль связанной с ним стадии метаболического пути. Трансформация растений генами, ответственными за синтез клеточных метаболитов, позволяет получать растения со сверхэкспрессией важных биологически активных соединений. С другой стороны, подавление экспрессии этих генов с использованием антисмысловых и интерферирующих РНК предоставляет возможность получать растения с измененными физиолого-биохимическими характеристиками и создавать растения, устойчивые к фитопатогенам.
Получение трансгенных растений - продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. В 1990 году Всемирная Организация Здравоохранения выступила с предложением о необходимости создания вакцин нового поколения. Новые вакцины должны быть безопасны, недороги, удобны в использовании и не требовать особых условий хранения. В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений.
Трансгенные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ. Показано, что растения, синтезирующие вирусные и бактериальные антигены, имеют перспективы применения в качестве съедобных вакцин. В настоящее время в мире создаются и исследуются трансгенные растения в качестве продуцентов вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и вакцины против вируса гепатита В. Однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы и на этом пути предстоит еще решение задач фундаментальной и прикладной генетической инженерии.
На пути применения трансгенных растений для сельского хозяйства, промышленных технологий и медицины стоят задачи получения биологически и экологически безопасных трансгенных растений. Получение биологически безопасных трансгенных растений, не содержащих селективных или репортерных генов, является одной из актуальных задач современной биотехнологии растений.
Разработка векторных конструкций, методов трансформации растений и экспериментальных моделей для системного анализа трансгенных растений с новыми биологически активными соединениями имеет важное значение как для молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, так и для применения таких растений в сельском хозяйстве и фармакологии.
Цель и задачи исследования. Цель работы - получение и анализ трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения, для повышения устойчивости растений к патогенам, получения растений с новыми физиолого-биохимическими признаками, а также для получения растений - продуцентов вакцин.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
1) получение и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям;
2) использование стратегии РНК-интерференции для получения растений с новыми свойствами;
3) получение растений - продуцентов вакцин против гепатита В;
4) особое внимание уделено разработке приемов получения трансгенных растений с повышенной биологической безопасностью.
Научная новизна работы. Разработаны и получены новые векторные генетические конструкции для трансформации растений генами, кодирующими синтез различных биологически активных соединений, а также антисмысловых и двуцепочечных РНК под контролем конститутивных, индуцибельных и тканеспецифичных промоторов. Впервые проведен комплексный анализ полученных трансгенных растений. Исследована устойчивость трансгенных растений с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryAI(b), экспрессируемым под индуцибельным промотором TR1' агробактериальной маннопинсинтазы, к ряду насекомых-вредителей. Впервые показана устойчивость Bt-растений к действию табачного трипса Thrips tobaci и паутинного клеща Tetranychus urticae. Проанализированы прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptII и bt под контролем индуцибельных промоторов TR1Т и TR2Т представлял только привой или подвой.
Показано, что особенности индукции и экспрессии этих генов в трансгенной части растений не отличаются от своей специфичности в целых трансгенных растениях. Установлено, что продукты чужеродных генов локализованы только в трансгенной части растений.
Показана эффективность применения антисмысловых РНК и РНК-интерференции для полного ингибирования активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах и растениях Nicotiana tabacum.
Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmg1 из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидов 3-окси-3метилглутарил-КоА редуктазу. Впервые показано, что введение в растения антисмысловой формы гена приводит к замедлению их роста in vivo, изменению окраски и морфологии цветков, а также мужской стерильности.
Исследованы физиолого-биохимические характеристики трансгенных растений с агробактериальными генами биосинтеза цитокининов ipt и ауксинов iaaM. Повышенный синтез цитокининов изменял морфологию и биохимию растений, а также положительно влиял на фотосинтез ipt-растений и устойчивость к стрессовым факторам (холоду, пониженной освещенности, засоленности, условиям фотоингибирования). Растения с повышенным синтезом ауксинов претерпевали значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств.
С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. При заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, вирулентными штаммами A. tumefaciens C58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное вплоть до полного ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. Проведенные исследования являются предпосылкой для получения сельскохозяйственно важных растений (виноград, плодовые культуры), невосприимчивых к агробактериальному раку.
Проанализирована возможность применения растений и культуры клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем различных промоторов в качестве продуцентов вакцины против гепатита В. Оптимизирована экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из клеток трансгенных растений.
С помощью сконструированного специализированного вектора и разработанного метода отбора трансформантов созданы растения табака и томата с повышенной экспрессией гена HBsAg без дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам (без генетического мусора).
Теоретическая и практическая значимость.
Разработанные и изученные экспериментальные модели перспективны для исследования механизмов подавления экспрессии генов в растениях с помощью антисмысловых РНК и РНКинтерференции.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых способов защиты растений от насекомых-вредителей и фитопатогенных бактерий.
Полученные результаты расширяют и углубляют представление о регуляторной роли фитогормонов (цитокининов и ауксинов) в растениях. Положительное влияние повышенного синтеза цитокининов может найти применение в биотехнологии растений.
Показана возможность использования трансгенных растений и клеточных культур для биосинтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Уровень синтеза HBs-антигена в полученных растениях табака, картофеля и томатов достаточен для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из растений, что поможет в создании препарата вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.
Сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томатов с повышенной экспрессией гена HBsAg, не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам.
Использованные методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого "генетического мусора".
Результаты проведенного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им.
академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Результаты исследований могут быть использованы различными сельскохозяйственными институтами, а также МГУ им. М.В.
омоносова, Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Институтом фундаментальных проблем биологии РАН, Институтом общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, НПО Табак (г. Краснодар).
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на международных конференциях Биология культивируемых клеток и биотехнология (1988, 1997, 2008), всесоюзных конференциях Новые направления биотехнологии (Пущино, 1988, 1990), Международной конференции УProblems and Methods in Molecular and Cell Biology and BiotechnologyФ (Болгария, Каварна, 1990), всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению ФГенная и клеточная инженерияФ (Москва, 1992, 1993), II и III всесоюзных симпозиумах УНовые методы биотехнологии растенийФ (Пущино, 1993, 1995), IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), международном симпозиуме УMolecular Responses of Plants to Biotic and Abiotic StressesФ (Хельсинки, 1996), Международном симпозиумеУMolecular Mechanisms of Stress Responses in PlantsФ (Москва, 1998), Международной конференции УФизиология растений - наука III тысячелетияФ (Москва, 1999), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), cимпозиумах Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности (Москва, 2004, 2007), Международной научно-практической конференции Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества (Минск-Нарочь, 2005), X Международном съезде Фитофарм2006 (С.-Петербург, 2006), IV Съезде Общества биотехнологов России имени Ю.А.
Овчинникова (Пущино, 2006), VI Съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной научной конференции Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии (Минск, 2008).
Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985Ц2008 гг. в лабораториях молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями (ИБФМ РАН) и биотехнологии растений (ФИБХ РАН). На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, ГНТП Новейшие методы биоинженерии, Министерством науки и образования РФ (№ ЦФ 26-2002-8), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН Динамика генофондов растений, животных и человека, Программой Президиума РАН Поддержка инноваций и разработок.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Благодарю всех соавторов по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН.
ичный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 122 печатные работы, из них 17 статей в рецензируемых журналах (одна из них принята в печать) и 8 статей в научных сборниках и других изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 4 глав собственных исследований, выводов, библиографического списка, включающего источника, из них иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Создание и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений с различными вариантами гена bt. Для клонирования в векторы для трансформации растений использовали ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. berliner 1715 (Север и др., 1990). Этот ген кодирует полипептид CryIA(b), токсичный для личинок некоторых чешуекрылых насекомых-вредителей. Первоначально полноразмерный ген bt был встроен в вектор рАР2034 под контроль промотора TR1Т гена маннопинсинтазы (Velten a.
Schell, 1985). В результате была получена плазмида pBTP38 (рис. 1). Поскольку известно, что для проявления инсектицидной активности CryIA(b) важен в основном N-концевой домен белка (Hofte et al., 1986), были проведены зксперименты по созданию делеционных вариантов гена bt. Плазмиды рВТРи pBTP40 содержали делетированный с 3Т-конца ген bt (рис. 1). Полученные плазмиды рВТР38, рВТ39 и рВТР40 перенесли из клеток Е. coli в Agrobacterium tumefaciens C58 (pGV3850) (Zambryski et al., 1983). В результате трансформации агробактериями листовых эксплантов табака получено по несколько линий трансгенных растений для каждого варианта гена bt.
Анализ ДНК трансформированных растений блот-гибридизацией по Саузерну показал интеграцию как полного гена bt, так и его укороченных вариантов в растительный геном в количестве 1-5 копий. Экспрессия гена bt в растениях подтверждена радиоиммунологическим анализом с поликлональными антителами против белка CryIA(b) (рис. 2). В клетках различных линий трансгенных растений синтез дельта-эндотоксина происходил на уровне 0.002-0.02% от суммарного растворимого белка. Не удалось обнаружить дельта-эндотоксин в растениях с полноразмерным геном bt. Полученные нами трансформанты растений с полноразмерным геном токсина погибли через месяц после укоренения. Причиной их гибели может быть токсичность для растительных клеток продукта полного гена (Barton et al., 1987).
Рис. 1. Схема рекомбинантных плазмид с геном дельтаэндотоксина CryIA(b) (bt) Bacillus thuringiensis var. berliner. 1Т-2Т - промотор гена маннопинсинтазы;
nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; pAg7 и pAocs - сигналы полиаденилирования агробактериальных генов 7 и октопинсинтазы, соответственно.
Рис. 2. Радиоиммунологический анализ белковых экстрактов листьев трансгенных растений с поликлональными антителами против белка CryIA(b). В каждой лунке по 25-50 мкг общего растворимого белка. 1-Ц экстракты растений табака, трансформированных pGV3850::pBTP39; 6-9 - экстракты растений табака, трансформированных pGV3850::pBTP40; 10 - 50 нг белка CryIA(b); 11 - 100 нг белка CryIA(b); 12 - экстракт нетрансгенного растения табака.
Анализ инсектицидной активности полученных трансгенных растений. Для проведения опытов по определению инсектицидной активности трансгенные растения табака были пересажены в закрытый грунт. Личинок насекомых помещали на листья и наблюдали интенсивность питания, подсчитывали живых и погибших особей ежесуточно. Контролем служили нетрансформированные растения (рис. 3). В первоначальных опытах использовали листья двухмесячных растений поколения F0, на которые сажали по 15 личинок непарного шелкопряда.
истья поддерживали в условиях, оптимальных для жизни и роста насекомых (влажность, температура). Личинки почти не питались на листьях трансгенных растений, трансформированных плазмидами рBTP39 и 40.
Поедаемость листовой пластины составляла не более 4-6 мм2. Количество погибших гусениц через трое суток после начала эксперимента различалось у разных вариантов растений. Через пять суток наблюдали гибель насекомых при питании на всех проанализированных трансгенных растениях. Листья контрольных нетрансформированных растений были полностью съедены и гибели личинок не происходило. Уровень инсектицидной активности коррелировал с содержанием токсина в клетках трансгенных растений. Обычно растения с уровнем синтеза токсина более 0.002% от общего растворимого белка были полностью токсичны для личинок непарного шелкопряда через сут после начала экспериментов.
А Б Рис 3. Устойчивость трансгенных растений табака с геном bt к личинкам непарного шелкопряда Porthetria dispar. А - лист нетрансгенного растения, Б - лист трансгенного растения. Лист контрольного растения полностью съеден за 5 сут, личинки живы. Лист трансгенного растения почти неповрежден, личинки погибли.
В последующих экспериментах по определению инсектицидной активности использовали растения только одного варианта (pBTP40, линия 14), содержащие в своем геноме наиболее укороченный ген bt. Результаты анализа представлены в табл. 1. Из всех проанализированных видов вредителей три вида насекомых и один вид клещей оказались наиболее восприимчивыми к действию токсина, синтезируемого растениями.
Наибольший эффект был получен для табачного трипса. Высокая интенсивность питания сопровождалась значительной гибелью насекомых, составившей 80-85% на третьи сутки питания. Личинки непарного шелкопряда при поедании листьев молодого трансгенного растения погибали почти все (7080% особей). В процессе развития растения его токсичность для насекомых падала и в возрасте 3-4 месяцев не отличалась от контроля. Личинки колорадского жука очень слабо питались на листьях как трансгенных, так и контрольных растений. При этом наблюдался эффект паралича при поедании трансгенного табака. Взрослые жуки почти не питались и гибели среди них не было. Паутинные клещи показали высокую чувствительность на молодых листьях трансгенного табака. После посадки взрослых клещей на листья табака через 1015 ч наблюдали гибель клещей (100% особей). Однако на растениях возраста 2-месяца паутинные клещи нормально питались и не погибали.
Таблица 1.
Анализ устойчивости трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих укороченный вариант гена bt (растения pBTP40, линия 14), к различным вредителям Виды вредителей Интенсивность Реакция питания вредителей Равнокрылые хоботные:
Белокрылка Trialeurodes vaporariorum нормальная гибели нет Тли Aphis pomi нормальная гибели нет Ложнощитовка нормальная гибели нет Таракановые:
высокая гибели нет Рыжий таракан Blattella germanica Бахромчатокрылые:
высокая 80-85% гибели Трипс Trips tobaci Жесткокрылые:
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata низкая паралич, гибель молодые личинки некоторых особей низкая гибели нет взрослые жуки низкая гибели нет Листоед халтика Chaltica sp.
Чешуекрылые:
нормальная гибель на молодых Непарный шелкопряд растениях Porthetria dispar нормальная гибели нет Совка-гамма Autographa gamma нормальная гибели нет Черемуховая моль Yponomeuta evonymellus Клещи паутинные нормальная гибель на молодых Tetranychus urticae растениях Моллюски нормальная гибели нет Голый слизень Примечание. На контрольных нетрансформированных растениях гибели всех видов исследованных вредителей не обнаружено. Приведены результаты трех независимых экспериментов.
Остальные виды насекомых, использованные для проверки инсектицидной активности трансгенного табака, а также голый слизень, оказались невосприимчивыми к действию дельта-эндотоксина.
В дальнейших экспериментах было проанализировано поколение F1 пяти линий полученных растений - № 10, 11 (pGV3850::рВТР39), 14, 15, (pGV3850::рВТР40). В экспериментах использовали 45 растений в возрасте 2-месяца. Испытания проводили на пяти видах насекомых: тепличной белокрылке Trialeurodes vaporariorum, непарном шелкопряде Porthetria dispar, табачном трипсе Thrips tobaci, клеверной совке Discestra trifolii, люцерновой совке Heliotis viriplaca. Регистрировали интенсивность питания и гибель насекомых.
Использовали по 20 личинок на каждое растение. Показано, что белокрылка питалась и развивалась на всех вариантах растений, гибели насекомых не наблюдали. Личинки непарного шелкопряда практически не питались на трансгенных растениях в отличие от контроля. Насекомые табачного трипса питались очень слабо, но гибель была отмечена только при питании на одном из вариантов растений (№ 14-3) на шестые сутки. Клеверная и люцерновая совки оказались более устойчивы к действию токсина CryIA(b) В. thuringiensis var.
berliner. Скорее всего, данный белок менее специфичен для этих вредителей.
Итак, наши эксперименты показали возможность создания растений, устойчивых к ряду насекомых-вредителей, в частности к непарному шелкопряду Porthetria dispar и табачному трипсу Thrips tobaci, а также к паутинному клещу, что показано нами впервые.
Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях. Очень высокая степень защиты полученных нами трансгенных растений от повреждения некоторыми насекомыми повидимому связана с использованием индуцибельного промотора TR1Т. С целью характеристики маннопинсинтазного промотора был проведен анализ экспрессии гена nptII в различных органах растений без индукции, а также в условиях индукции промотора в листьях с помощью их механического повреждения.
Проанализировано четыре линии трансгенных растений табака c геном bt на содержание неомицинфосфотрансферазы (NPTII) в неповрежденных листьях, стеблях и корнях (табл. 2). Уровень синтеза NPTII в корнях был в 10-17 раз выше, чем в интактных листьях. Активность NPTII значительно возрастала в экстрактах из поврежденных листьев через 24 ч после повреждения (в 6-15 раз по сравнению с контролем) (табл. 2; рис. 4).
Особенность локальной индукции промоторов некоторых специфических генов может оказаться важным и полезным свойством при создании трансгенных растений, в которых конститутивный синтез белка нежелателен. При повреждении листьев насекомыми индукция промотора TR1Т будет приводить к резкому возрастанию синтеза инсектицидного белка в области поврежденной ткани и вызывать гибель вредителей.
C помощью применения тканеспецифических и индуцибельных промоторов для экспрессии чужеродных генов можно отчасти решить проблему наличия чужеродных белков в трансгенных растениях, употребляемых в пищу человеком и животными. Наряду с этим можно использовать трансгенные растения в качестве только подвойной или привойной части (Рукавцова и др., 1996). Сочетание этих двух подходов перспективно для биотехнологии растений.
Полученные трансгенные растения с геном bt прививали на обычные растения либо их использовали в качестве подвоя. Через 4-6 недель после прививки проводили анализ активности NPTII в листьях и корнях растений (рис.
5).
Таблица 2.
Раневая стимуляция и тканевая специфичность экспрессии гена TR2'-nptII в трансгенных растениях табака через 24 ч (относительная активность NPTII, число распадов/мин/10 мкг белка) Листья Поврежденные Поврежденные Стебли Корни Корни/ листья листья/ листья интактные листья 38042 3895310 10.25 101296 4152320 10.36335 5626454 15.49 76065 6160546 16.26226 1834205 7 102898 3550282 13.71968 4458386 6.2 1946153 7293653 10.Рис. 4. Индуцирование экспрессии химерного гена TR2Т-nptII в поврежденных листьях трансгенного табака. B, C, D, E, G - экстракты из листьев трансгенных растений; 1 - активность NPTII в листьях, не подвергавшихся раневому повреждению; 2 - активность NPTII через 24 ч после механического повреждения листьев. На каждую дорожку нанесено по 10 мкг общего растворимого белка.
Рис. 5. Активность NPTII в привитых растениях табака.
1-5 - вариант с трансгенным привоем, 6-10 - вариант с трансгенным подвоем.
Трансгенный привой: 1 - листья без индукции, 2 - листья через 24 ч после повреждения. Нетрансгенный подвой: 3 - листья без индукции, 4 - листья после индукции, 5 - корни. Трансгенный подвой: 6 - листья без индукции, 7 - листья после индукции, 10 - корни. Нетрансгенный привой: 8 - листья без индукции, 9 - листья после индукции. В лунки нанесено по 20 мкг общего растворимого белка.
Синтез белка значительно возрастал в листьях трансгенной части растения после их механического повреждения (дорожки 2, 7). В то же время активность NPTII отсутствовала в нормальной, нетрансгенной части растений - как в корнях (дорожка 5), так и в листьях (дорожки 3, 4, 8, 9). В корнях трансгенных подвоев наблюдали конститутивный синтез NPTII (дорожка 10). Активность фермента не зависела от подвойного или привойного положения трансгенной части растений, причем миграции NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружено. Таким образом, в трансгенных привитых растениях для ряда чужеродных белков может отсутствовать их транспорт в нетрансгенную часть.
Исследованный подход может быть применен в тех случаях, когда требуется синтезировать в определенной части растения какой-либо не транспортируемый чужеродный белок, не влияющий на изменение вторичного метаболизма растения (как в случае с дельта-эндотоксином В. thuringiensis). В тех же случаях, когда продуктами введенных генов являются ферменты, участвующие в биосинтезе низкомолекулярных соединений, следует учитывать возможность транспорта этих соединений из трансгенной части растения в нетрансгенную.
Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о возможности сочетания генно-инженерных подходов с традиционными методами прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные гены в определенных органах и тканях.
Конструирование плазмид с геном CryIA(b), пригодных для трансформации широкого круга хозяев. Нами получены плазмиды и штаммы агробактерий для трансформации широкого круга хозяев с геном bt под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S. Этот промотор является конститутивным и наиболее сильным по сравнению с другими известными растительными промоторами (Odell et al., 1985; Benfey a. Chua, 1989).
Он в 30-100 раз сильнее промоторов Т-ДНК агробактерий (Sanders et al., 1987). В результате клонирования получена плазмида рВТР41, которую перенесли в супервирулентный штамм A. tumefaciens A281, содержащий плазмиду pTiBo5(Hood et al., 1984).
Полученные штаммы были использованы для проведения экспериментов по трансформации хризантем в лаборатории комплекса Биотрон ФИБХ РАН (зав.
Долгов С.В.). Получены трансгенные растения хризантем Chrysanthemum morifolium Ramat, устойчивые к паутинному клещу Tetranychus urticae и сподоптере Spodoptera exigua (Dolgov et al., 1995; Митюшкина, 2003). Степень экспрессии гена bt в этих растениях необязательно выше, чем в растениях табака с этим геном под контролем промотора TR1Т. Необходимо иметь в виду данные, полученные при изучении экспрессии генов lacZ и nptII под контролем разных промоторов (Teeri et al., 1989). В неповрежденных клетках растений промотор CaMV 35S обеспечивал значительно более высокую экспрессию генов, чем промоторы TR1Т и TR2Т. В то же время при механическом повреждении клеток активность NPTII была практически одинакова, как при использовании промотора 35S, так и TR1Т. Использование конструкций, содержащих ген bt под промотором TR1Т, представляется нам более целесообразным, поскольку этот промотор индуцируется при повреждении растений насекомыми. Этим фактом можно объяснить высокий уровень устойчивости полученных нами растений Nicotiana tabacum к действию некоторых вредителей.
2. Подавление экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК и РНК-интерференции Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum L. с помощью антисмысловых РНК.
Антисмысловые РНК (asРНК) в работах с растениями начали применять в середине 80-х годов и нами в числе первых была опубликована работа о негативном эффекте asРНК на экспрессию гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах табака (Зинкевич и др., 1988). Неомицинфосфотрансфераза II (NPTII) фосфорилирует аминогликозидные антибиотики неомицинового ряда, в том числе и канамицин, и тем самым обеспечивает устойчивость растений к данному антибиотику. Стабильность этого фермента, возможность сравнительно легко качественно и количественно определять его активность, делают ген nptII ценным селективным маркером и геном-репортером в генетической инженерии растений.
Нами разработана модельная система для проверки возможности подавления экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах табака с помощью антисмысловой конструкции этого гена. Конструирование плазмид, содержащих ген nptII в смысловой и антисмысловой ориентациях по отношению к промотору гена нопалинсинтазы (nos) показано на рис. 6. В качестве источника гена nptII использовали плазмиду pMON129 (Fraley et al., 1983). Эта плазмида содержит ген nptII, ограниченный промотором и терминатором гена nos из плазмиды pTiT37. Ген nptII вырезали из pMON129 и клонировали в вектор pLGV2382 (Herrera-Estrella et al., 1983) в разных ориентациях по отношению к промотору гена nos. В результате были получены плазмиды pVIL35 и pB4, содержащие ген nptII в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. Эти плазмиды использовали для трансформации протопластов табака с помощью электропорации. Смысловую (Pnos-nptII-polyAnos) и антисмысловую (Pnos-asnptII-polyAnos) плазмиды вводили в протопласты табака в соотношении 1:1, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, принимая за единицу 10 мкг ДНК. В качестве положительного контроля использовали смысловую ДНК pVIL35, а также протопласты из листьев трансгенного табака, экспрессирующего NPTII.
Активность NPTII в трансформированных протопластах определяли через 36 ч (рис. 7). Показано, что даже при соотношении смысловой и антисмысловой ДНК 1:1 происходило эффективное ингибирование экспрессии гена nptII (дорожки 1, 2).
Рис. 6. Конструирование плазмид, содержащих ген неомицинфосфотрансферазы II в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; polyA - сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II.
Рис. 7. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum с помощью антисмысловой РНК. 1 - протопласты + плазмида с nptII + плазмида с as-nptII (1:1); 2 - протопласты + плазмида с nptII + плазмида с as-nptII (1:10); 3 - протопласты + плазмида с nptII; 4 - протопласты из Kmr табака.
О необходимости использования больших количеств asРНК для достижения значительного подавления экспрессии генов сообщалось многими исследователями (Izant a. Weintraub, 1984, 1985; Ecker a. Davis, 1986). Однако нами достигнуто практически полное ингибирование экспрессии гена nptII при соотношении смысловой и антисмысловой конструкций 1:1. Это указывает на то, что степень подавления активности гена с помощью asРНК может определяться особенностями первичной структуры гена (Швед и др., 1987).
Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК. Для достижения эффективного подавления экспрессии гена nptII в трансгенных растениях мы использовали стратегию РНК-интерференции. Нами получена генетическая конструкция, способная к образованию двуцепочечных РНК (dsРНК) в клетках растений. Внутренние гомологичные фрагменты гена nptII клонированы в прямой и обратной ориентациях по отношению друг к другу под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S. Схема клонирования представлена на рис. 8. Полученную плазмиду перенесли в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404), которым трансформировали листовые экспланты табака.
A Б Рис. 8. Схема клонирования димерного внутреннего участка гена nptII под контроль промотора CaMV 35S (А). Схема встраивания кассеты 35S- dsnptII в бинарный вектор pBIBHyg (Б). PCaMV35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; pACaMV и pAg7 - сигналы полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и гена 7 Ti-плазмиды агробактерий, соответственно; hpt - ген гигромицинфосфотрансферазы; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.
В экпериментах по агробактериальной трансформации использовали две группы растений: 1 - нетранформированные растения табака, 2 - трансгенные растения, трансформированные плазмидой pGA482, содержащие в своем геноме ген nptII и способные к росту на среде с канамицином (Km). Регенеранты обеих групп после трансфомации отбирали на среде MSD4x2 с селективным агентом гигромицином (30 мг/л). Полученные таким образом трансформанты в дальнейшем подвергали молекулярно-биологическому анализу и проверке их способности к регенерации на среде с канамицином.
Молекулярно-генетическими методами анализировали растения четырех линий: 1) растения, трансформированные плазмидой pGA482 с геном nptII; 2) растения, содержащие конструкцию 35S-dsnptII-polyA в векторе pBIB-Hyg; 3) двойные трансформанты (pGA482 + dsnptII); 4) контрольные нетрансгенные растения. Наличие гена гигромицинфосфотрансферазы hpt в трансгенных растениях табака 2 и 3 групп подтверждено методом ПЦР. Наличие гена nptII и фрагмента dsnptII в растениях 1-3 групп показано блот-гибридизацией ДНК по Саузерну. Экспрессия гена nptII в трансгенных растениях показана с помощью РНК-ДНК гибридизации. Синтез мРНК, соответствующей по размерам гену nptII, происходил только в исходных трансгенных растениях, трансформированных бинарным вектором pGA482. РНК, выделенная из двойных трансформантов (pGA482 + dsnptII), не дала гибридизации с меченным 32P фрагментом гена nptII.
Вероятно, это связано с образованием в этих растениях двуспиральных РНК, подавляющих экспрессию гена nptII.
Для подтверждения способности dsРНК к ингибированию экспрессии гена nptII в трансгенных растениях, были поставлены следующие эксперименты.
истовые экспланты контрольных и трансгенных растений были помещены на чашки со средой MSD4x2 для регенерации, содержащие Km (50 мг/л), либо без него. В среде содержался цефотаксим (Сf) во избежание возможного роста агробактерий.
Через 4 нед оказалось, что регенерация побегов на среде с Km происходит только на эксплантах трансгенных растений с плазмидой pGA482. В случае растений, содержащих только dsnptII или в сочетании с pGA482, регенерации из листовых эксплантов не происходило (рис. 9).
Таким образом, показано полное отсутствие способности к росту на среде с канамицином у трансгенных растений, содержащих димерный фрагмент делетированного гена nptII, что доказывает специфическое подавление экспрессии указанного гена с помощью гомологичной ему двуцепочечной РНК.
А Б 1 2 Рис. 9. (1) А - Нетрансформированные растения табака на среде MSD4x2 c Km (50 мг/л), регенерации нет; Б - регенерация из листовых эксплантов трансгенных растений (pGA482) на среде с канамицином. (2) А - Регенерация трансгенных растений (dsnptII) на среде без канамицина; Б - отсутствие регенерации на среде с канамицином. (3) А - Регенерация двойных трансформантов (dsnptII + pGA482) на среде без канамицина; Б - полное подавление регенерации этих же растений на среде с канамицином.
Фенотипические изменения трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих антисмысловую форму гена hmg1. Целью наших экспериментов явилось создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген 3-окси-3метилглутарил-КоА редуктазы (hmg1) из Arabidopsis thaliana в прямой и обратной ориентациях по отношению к двойному промотору CaMV 35S. Анализ трансгенных растений с измененным синтезом мевалоновой кислоты позволит прояснить значение цитоплазматического (мевалонатного) и хлоропластного (метилэритритолфосфатного) путей биосинтеза изопреноидов.
Ген hmg1 арабидопсиса клонировали в вектор рSS (Voss et al., 1995) в двух ориентациях по отношению к двойному промотору 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S (рис. 10). Полученные плазмиды перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK), который использовали в экспериментах по трансформации растений табака. Первичные трансформанты (по 5-7 для каждого типа использованной генетической конструкции) были отобраны по способности расти на среде с канамицином, с последующим анализом их методом ПЦР. Для дальнейшей работы использовали по четыре растения каждого типа, давшие положительный результат при ПЦР-анализе.
Анализ ДНК трансформированных растений блот-гибридизацией по Саузерну подтвердил наличие в их геноме 1-5 копий гена hmg1. Экспрессия гена hmg1 в трансгенных растениях показана с помощью РНК-ДНК гибридизации (рис.
11). Менее выраженные сигналы гибридизации в случае анализа трансгенных растений с антисмысловой формой гена hmg1, по-видимому, указывают на подавление экспрессии гена путем образования двухцепочечной РНК (мРНКasРНК) и ее последующей быстрой деградации.
Рис. 10. Схема генетических конструкций pSS-hmg1 и pSSashmg1, содержащих ген hmgв прямой и обратной ориентациях по отношению к двойному промотору 35S.
Обозначения: PCaMV35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; pACaMV и pAocs - сигналы полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и гена октопинсинтазы, соответственно; hmg1 - ген 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазы; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.
Рис. 11. Анализ мРНК hmg1 в трансгенных растениях табака с помощью РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченный Р ген hmg1. 1 - мРНК из нетрансформированного табака; 2, 3 - мРНК из трансгенных растений, трансформированных плазмидой pSS-hmg1; 4, 5 - мРНК из трансгенных растений, трансформированных плазмидой pSS-ashmg1; 6 - фрагмент ДНК, соответствующий структурной части гена hmg1 Arabidopsis thaliana. Стрелкой обозначен фрагмент, соответствующий гену hmg1.
Трансгенные растения (по 4 трансформанта каждого типа) были высажены в грунт в оранжерее станции искусственного климата УБиотронФ (ФИБХ РАН). В первые 10 нед после высадки в грунт растения табака, трансформированные конструкциями pSS и pSS-hmg1 развивались быстрее и превосходили по высоте (до 50%) растения, содержащие антисмысловую копию гена hmg1 (рис. 12).
Цветение растений, трансформированных pSS и pSS-hmg1, началось на десятой неделе, в то время как лантисмысловые растения зацвели на три недели позже. К этому времени все растения не отличались по высоте. Заметный эффект экспрессии антисмыслового гена hmg1 проявился в изменении окраски и формы цветков трансгенных растений. Если нетрансформированные растения и растения с геном hmg1 в смысловой ориентации имели цветки темно-розового цвета, то трансгенные растения с антисмысловой формой гена имели цветки бледнорозовой окраски. Венчики этих цветков также отличались своей формой (рис. 13).
Рис. 12. Различия в размерах растений табака, экспрессирующих гетерологичный ген hmg1, в условиях закрытого грунта. 1 - контрольные растения, трансформированные вектором pSS, 2 - растения со смысловой копией гена hmg1, 3 - растения с антисмысловой копией гена hmg1.
Рис. 13. Цветки трансгенных растений табака, содержащих различные формы гена hmg1. 1 - растения, трансформированные плазмидой pSS; 2 - растения, трансформированные плазмидой pSS-hmg1. 3 - растения, трансформированные плазмидой pSS-ashmg1.
До настоящего времени изменение окраски цветков трансгенных растений достигалось введением в растения антисмысловых форм генов, непосредственно детерминирующих пути биосинтеза пигментов - дигидрофлавонолредуктазы (Meyer et al., 1987) и халконсинтазы (van der Krol et al., 1990). Нами подобный эффект впервые достигнут за счет экспрессии антисмысловой формы гена hmg1.
Посредством самоопыления были получены семена всех линий растений, высаженных в грунт. Полностью созревшие табачные коробочки с семенами были взвешены. Обнаружено, что в растениях, экспрессирующих антисмысловую копию гена hmg1, масса плода была в 2.5-3 раза меньше, чем у других групп растений. Всхожесть семян составила в случае лантисмысловых растений 5.2%, тогда как в других группах - 81-95%. Таким образом, экспрессия антисмысловой формы гена hmg1 оказывала негативное влияние на процессы репродукции растений.
У растений со смысловой копией гена hmg1, выращенных в закрытом грунте, наблюдали повышение количества стеринов на 21% по отношению к контролю. Количество хлорофиллов a и b, а также каротиноидов не изменилось ни в одной группе растений, что свидетельствует о том, что предшественники хлоропластных изопреноидов не синтезируются на мевалонатном пути.
Проведена световая микроскопия препаратов листьев растений, растущих в закрытом грунте (рис. 14). При сравнении фотографий срезов листьев оказалось, что листья контрольных растений имели рыхлую структуру, более крупные клетки, наличие воздушных полостей. Листья трансформантов с антисмысловой копией гена hmg1 отличались более плотной структурой ткани, клетки близко прилегали друг к другу. Трансформанты со смысловой ориентацией гена занимали промежуточное положение. Таким образом, в клетках растений с антисмысловой формой гена происходило нарушение процессов клеточной элонгации.
Полученные нами данные были подтверждены в работе по исследованию мутанта арабидопсиса по гену hmg1 (Suzuki et al., 2004). У этих растений также отмечены показанные нами изменения в структуре тканей растений. Авторами предполагалось, что они могут быть связаны с нарушением экспрессии генов, регулируемых брассиностероидами, однако экспрессия таких генов не менялась.
Возможно, наблюдаемые изменения связаны с нарушением синтеза других стероидов, в частности тритерпеноидов и атипичных стероидов.
Рис. 14. Световая микроскопия срезов листьев нетрансгенного табака (А), табака, трансформированного конструкциями pSS-ashmg1 (Б) и pSS-hmg1 (В). В.э. - верхняя эпидерма, п.м. - палисадный мезофилл, г.м. - губчатый мезофилл, н.э. - нижняя эпидерма.
Таким образом, эффекты антисмысловой формы гена hmg1 ярко проявились в полученных нами растениях, культивируемых в грунте (задержка роста, задержка цветения, изменение окраски венчиков, стерильность). Важно отметить, что наблюдаемые нами изменения проявились и в экспериментах по повторной трансформации табака. Дальнейший анализ различных метаболитов ацетатномевалонатного пути в полученных трансгенных растениях позволит установить биохимическую природу установленных нами эффектов антисмысловой формы гена hmg1.
3. Создание и исследование трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих агробактериальные гены биосинтеза фитогормонов Физиолого-биохимические особенности растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген изопентенилтрансферазы ipt. Введение в растения агробактериального гена ipt, кодирующего ключевой фермент биосинтеза цитокининов (изопентенилтрансферазу), открывает новые возможности для изучения функциональной роли цитокининов в различных физиологических и биохимических процессах, протекающих в клетках растений. В качестве источника гена ipt использовали Ti-плазмиду pTiBo542 из супервирулентного штамма A. tumefaciens A281 (Strabala, 1989). Схема конструирования плазмид для трансформации растений, содержащих ген ipt, показана на рис. 15. Полученные плазмиды перенесли в штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака.
Рис. 15. Схема конструирования рекомбинантных плазмид для трансформации растений, содержащих ген ipt в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. CaMV 35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты;
polyA - сигнал полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.
Для отбора трансгенных растений с антисмысловой формой гена ipt была использована среда МС с добавлением гормонов, стимулирующих образование побегов (1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК). Получение растений со смысловой ориентацией гена проводили на среде без гормонов, что создавало дополнительную селекцию. На безгормональной среде МС происходило бурное образование побегов. Через 1-1.5 месяца побеги отделяли от листовых эксплантов и укореняли на селективной среде МС без гормонов. Трансгенные растения с геном ipt в антисмысловой ориентации формировали нормальные листья и корни и фенотипически не отличались от контрольных растений табака. Растения со смысловой формой гена ipt (ipt-растения) приобретали кустистый, карликовый вид и корней не образовывали. У этих растений отсутствовало апикальное доминирование, имелось множество боковых побегов, сильно укороченный стебель, мелкие листья (рис. 16).
Рис. 16. Фенотип трангенных растений с геном ipt (справа) в условиях in vitro. Слева - нетрансгенное растение. Возраст 4 нед.
Наличие генов ipt и nptII в трансгенных растениях табака показано методом ПЦР. Проведен иммуноферментный анализ экстрактов листьев с использованием антител к транс-зеатинрибозиду. Содержание транс-зеатинрибозида в ipt-растениях в три раза превышало уровень цитокининов в нетрансгенных растениях (400 нг/г сырого веса по сравнению со 130 нг/г в контроле). Листовые экспланты молодых iptрастений инкубировали на селективной среде МС с гормонами для побегообразования (1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК). При этом небольшая часть новообразованных побегов давала корни. Кроме того, наблюдалось увеличение размеров листовых пластинок и некоторое удлинение стебля у вновь регенерированных трансгенных растений. Данные свойства указывали на снижение уровня экспрессии гена ipt в ipt-растениях с корнями. Для подтверждения этого предположения был проведен анализ мРНК, выделенных из листьев фенотипически различающихся ipt-растений, с помощью РНК-ДНК гибридизации (рис. 17).
Рис. 17. Анализ мРНК различных линий iptрастений табака c помощью РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченный Р фрагмент гена ipt. На дорожку наносили по 20 мкг РНК. 1, - трансгенные растения без корней; 2 - контрольное растение; 4-8 - трансгенные растения с корнями; 9 - ПЦР-продукт гена ipt (10 нг ДНК).
Уровень синтеза мРНК, соответствующей гену ipt, в ipt-растениях исходных линий с ярко выраженным трансгенным фенотипом (низкие растения без корней, с мелкими листьями и множеством боковых побегов) оказался самым высоким (дорожки 1 и 3). Он был понижен в ipt-растениях тех же линий при наличии корней (дорожки 4, 5, 8), а также в растениях линий, полученных методом вторичной регенерации на средах с гормонами и способных к образованию корней (дорожки 6 и 7).
Ipt-растения, высаженные в закрытый грунт, сохраняли свои аномальные свойства: ингибирование роста стебля, уменьшенные размеры и морщинистость листовых пластинок. Эти растения не переходили к репродуктивной стадии развития, не цвели и рано погибали. Таким образом, гормональный дисбаланс у ipt-растений приводил к их аномальному развитию при всех условиях выращивания.
Известно, что ассоциативные микроорганизмы могут оказывать положительное влияние на различные физиолого-биохимические характеристики растений. Как показали наши эксперименты, колонизация черенков ipt-растений метилотрофными бактериями Methylovorus mays ВКМ В-2221 (Иванова и др., 2000, 2001) стимулировала у них процесс корнеобразования на среде МС без витаминов и фитогормонов (Каляева и др., 2001). По-видимому, синтез метилотрофными бактериями ауксинов и, возможно, витаминов и других ростовых факторов, способствовал восстановлению нарушенных процессов ризогенеза у трансгенных растений с повышенным синтезом цитокининов.
Известна способность цитокининов повышать устойчивость растений к действию различных неблагоприятных факторов. Нами исследованы влияние пониженной температуры и освещенности, а также засоленности среды на физиологические и биохимические характеристики ipt-растений. Анализ проводили на ipt-растениях, растущих in vitro. Влияние цитокининов на процесс фотосинтеза определяли по фотосинтетической активности хлоропластов, выделенных из листьев контрольных и ipt-растений. Показано снижение скорости фотосинтетического выделения кислорода изолированными хлоропластами с увеличением возраста растений (рис. 18). Хлоропласты, полученные из листьев трансгенных и контрольных растений молодого возраста (20-35 сут) имели практически сходный показатель скорости выделения О2, в то время как скорость выделения кислорода хлоропластами ipt-растений зрелого возраста (50-60 сут) была на 20-30% ниже, чем у контрольных растений. Вероятно, преждевременное снижение активности процесса фотосинтеза в ipt- растениях связано со стрессовым влиянием на них высоких концентраций эндогенных цитокининов.
Рис. 18. Скорость фотосинтетического выделения кислорода 1изолированными хлоропластами листьев контрольных и трансгенных растений табака с геном ipt, выращенных в условиях in vitro. 1 - хлоропласты контрольных растений; 2 - хлоропласты ipt-растений.
60 Исследование влияния цитокининов на процесс фотосинтеза ipt-растений в условиях пониженных температур проводили при длительном воздействии холода (40С) и пониженной 20 30 40 50 60 Возраст, сут освещенности (700 к). При росте ipt-растений в этих условиях в течение 10 сут происходило незначительное уменьшение кислородвыделяющей активности хлоропластов (2.51%), а скорость выделения кислорода хлоропластами контрольных растений снижалась на 202% (рис. 19).
Одинаковое уменьшение кислородвыделяющей активности хлоропластов контрольных и ipt-растений наблюдали через 20 сут, за это время она снижалась на 416% и 377%, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии цитокининов на фотосинтез ipt-растений в условиях данного стресса.
Рис. 19. Влияние пониженных температуры (40С) и освещенности 1(700 к) на скорость фотосинтетического выделения кислорода хлоропластами листьев контрольных и ipt-растений, выращенных в условиях in vitro. 0, 10, 20 - время выращивания (сут) при стрессовых условиях.
Влияние цитокининов на рост и развитие iptрастений в условиях засоленности исследовали на средах 0 10 20 0 10 20 Время, сут с повышенным содержанием NaCl. Нами показано, что на Контрольное Трансгенное растение растение среде МС, содержащей 150 мМ NaCl, наблюдается ингибирование роста черенков контрольных, но не iptрастений. Положительное влияние цитокининов на ipt-растения в условиях осмотического стресса подтверждалось в экспериментах по исследованию способности листовых эксплантов контрольных и ipt-растений к морфогенезу на средах с повышенным содержанием NaCl (рис. 20). Ipt-экспланты на среде со 1мМ NaCl эффективно формировали побеги (рис. 20а), и сохраняли зеленую окраску на среде со 150 мМ NaCl (рис. 20б). В то же время значительное разрушение хлорофиллов у контрольных эксплантов наблюдалось уже в присутствии 100 мМ NaCl в среде (рис. 20а). Таким образом, показано ингибирующее действие многократного увеличения эндогенных цитокининов на Выделение кислорода, мкмоль О /(мг хлорофилла в час) Скорость выделения кислорода, % рост, цветение и репродуктивное развитие ipt-растений. Однако при действии стрессовых факторов (пониженная температура и освещенность, засоленность) проявляется защитное действие цитокининов на эти растения.
Рис. 20. Морфогенез на листовых эксплантах растений табака, помещенных на среду МС с добавлением NaCl: A - 100 мМ NaCl; Б - 150 мМ NaCl. Слева - листовые экспланты контрольных растений, справа - листовые экспланты трансгенных ipt-растений.
Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы iaaM. Ауксины - одни из ключевых гормонов растений. Они участвуют в регуляции роста, цветения, фото- и геотропизма, вторичного роста стебля в толщину, стимулируют образование придаточных корней, тормозят рост боковых почек, ускоряют рост плодов, влияют на клубнеобразование. Трансгенные растения с агробактериальным геном синтеза ауксинов представляют собой удобную модель для изучения роли ауксинов в различных физиологических и биохимических процессах.
Ген триптофанмонооксигеназы iaaM из A.tumefaciens клонировали в вектор для трансформации растений pSS (рис. 21). Источником гена iaaM служила плазмида pDQ14, содержащая его последовательность размером 2270 п.н. из октопиновой Ti-плазмиды pTiA6NC (Klee et al., 1984). В результате клонирования получены плазмиды, содержащие ген iaaM в обеих ориентациях по отношению к промотору CaMV 35SS. Эти плазмидные конструкции, а также плазмиду pSS без вставки, перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK), который использовали для трансформации растений.
После трансформации плазмидой pSS и плазмидной конструкцией с геном iaaM в антисмысловой ориентации трансгенные побеги отделяли через один месяц. Регенерация трансгенных побегов астенического фенотипа после трансформации вектором с геном iaaM в смысловой ориентации происходила только спустя два месяца. Такое ингибирование процессов образования побегов и стимулирование процессов растяжения в клетках растений может указывать на увеличение в них уровня ауксинов.
Трансгенные растения со смысловой копией гена iaaM (iaaM-растения) приобрели аномальный фенотип (рис. 22). Они характеризовались скручиванием листьев, повышенным корнеобразованием и появлением адвентивных корней на стеблях.
Рис. 21. Схема конструирования рекомбинантных плазмид для трансформации растений, содержащих ген iaaM в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. P 35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; polyA - сигнал полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.
Наличие генов iaaM и nptII в геноме полученных растений было доказано методом ПЦР.
Экспрессия агробактериального гена биосинтеза ауксинов в полученных трансгенных растениях табака показана с помощью РНК-ДНК гибридизации. Во всех суммарных РНК исследованных линий iaaM-растений обнаружен продукт транскрипции гена iaaM. По результатам анализов было отобрано по пять линий трансгенных растений табака с геном iaaM с наилучшими ростовыми характеристиками.
Рис. 22. Изменение фенотипа трансгенных растений табака с агробактериальным геном iaaM, растущих в условиях in vitro. 1 - нетрансгенное растение; 2 - трансгенное растение с геном iaaM.
Все линии iaaM-растений при росте in vitro не различались между собой и имели одинаково аномальный фенотип, что косвенно указывает на возрастание эндогенного уровня ауксинов. Растения всех независимых линий были высажены в почву для изучения влияния экспрессии гена iaaM на дальнейшее развитие iaaM-растений.
Следует отметить, что в отличие от морфологического сходства всех линий iaaM-растений in vitro, при их культивировании in vivo наблюдалось несколько фенотипов. Три линии iaaM-растений и в почве имели аномальный фенотип (линии Т1, Т8 и Т12). Эти растения отставали в росте от контрольных на 34% (рис.
23а), что сопровождалось соответствующим укорачиванием междоузлий (табл. 3).
На стеблях iaaM-растений аномального фенотипа формировались зачаточные адвентивные корни в виде небольших бугорков. У таких растений сохранился неравномерный рост клеток листа, приводящий к скручиванию листьев. Размер листовых пластинок был значительно меньше, чем у контрольных растений (рис.
23б). По краям листьев наблюдали вздутия и пожелтевшие участки. Количество устьиц на единицу площади листа уменьшилось в 2-2.5 раза по сравнению с контролем, одновременно с этим возросла доля открытых устьиц (в 1.5-2.9 раз).
Растения двух линий iaaM-растений (Т5 и Т6) развивались in vivo различным образом. Часть растений мало отличалась по росту, размерам и форме листьев от контрольных растений (табл. 4). Некоторые растения проявляли более выраженные отклонения от контроля и имели черты промежуточного характера.
Остальные растения развивались в растения аномального фенотипа. Исходя из этого, все iaaM-растения были разделены на три группы согласно морфологическим признакам: аномального, промежуточного или нормального фенотипа.
Таблица 3.
Характеристики трансгенных растений с геном iaaM в условиях in vivo Количество Высота Вес семенной семенных Всхожесть Растения Фенотип растений, коробочки, семян, % см* коробочек, мг шт аномальный 819 133 1139 промежуточный 1026 639 987 87Трансгенные нормальный 1255 18514 1048 90Контрольные нормальный 1226 30832 824 98* Возраст растений 14 недель после высадки в грунт.
В контрольных и iaaM-растениях, выращенных в течение 10 нед. в условиях закрытого грунта, проведен анализ содержания ауксинов. Результаты этих экспериментов представлены в эквивалентах ИУК (табл. 4). Концентрация ауксинов в листьях контрольных растений находилась за пределами чувствительности определения концентрации ИУК биотестом (менее 5х10-9 моль/г сырого веса). В экстрактах из листьев разных линий iaaM-растений ауксиновая активность составила 114-130% от контроля (вытягивание отрезков колеоптилей пшеницы в воде). Содержание свободных ауксинов в iaaM-растениях нормального фенотипа (линия Т6) было наиболее низким (35.9 мкг/г сухого веса). В листьях iaaM-растений аномального фенотипа (линии Т5 и Т12) количество свободных ауксинов эквивалентно концентрации ИУК 43.7 и 51.7 мкг/г сухого веса, соответственно. Таким образом, фенотип iaaM-растений табака в условиях in vivo коррелировал с концентрацией в них ИУК.
1 2 1 а б Рис. 23. Ингибирование роста стебля (а) и уменьшение размеров листовой пластинки (б) у трансгенных iaaM-растений табака аномального фенотипа в условиях закрытого грунта (недель). 1 - iaaM-растения аномального фенотипа; 2 - нетрансформированные растения табака.
Таблица 4.
Содержание сухого вещества и свободных ауксинов в листьях трансгенных растений табака с геном iaaM в условиях in vivo Содержание сухого Эквивалент ИУК Линии вещества iaaM- Фенотип моль/г мкг/г мкг/г мг/г % от растений сырого сырого сухого сырого веса контроля веса веса веса Т12 аномальный 27.11.8 68 8х10-9 1.4 51.Т5 аномальный 24.81.4 62 6х10-9 1.1 43.Т6 нормальный 41.52.6 104 8.5х10-9 1.5 35.менее Контроль нормальный 39.83.3 15х10-9 менее 0.8 менее 23.Примечание. Возраст растений 10 нед. после высадки в почву.
Физиологические и биохимические характеристики iaaM-растений in vivo были взаимосвязаны с их морфологическими признаками и наиболее значимые различия между контрольными и трансгенными растениями отмечались для iaaMрастений аномального фенотипа. Так, количество фотосинтетических пигментов в них было снижено: хлорофиллов - на 12-18%, а каротиноидов - на 17-24%. В iaaMрастениях с промежуточным фенотипом изменения были менее заметными.
Обводненность листьев iaaM-растений in vivo также коррелировала с их фенотипом. Чем фенотип iaaM-растений был ближе к нормальному, тем меньше были обводнены листья трансгенных растений. Наибольшие различия наблюдались в листьях iaaM-растений аномального фенотипа, снижение сухого веса в которых составило 32-38% (табл. 4).
Возрастание уровня эндогенных ауксинов вызвало запаздывание в цветении iaaM-растений аномального фенотипа по сравнению с контрольными растениями, что соответствует данным о роли ауксинов в регуляции цветения растений разного возраста (Баврина и др., 1999). Контрольные растения табака зацвели через 13-нед. выращивания в почве, а цветение iaaM-растений началось лишь на 17-18-ой неделе. Растения аномального фенотипа имели мелкие верхушечные соцветия с небольшим количеством цветков. Контрольные растения сформировали по нескольку сотен семенных коробочек, а iaaM-растения аномального фенотипа образовали от 7 до 17 крупных коробочек. Влияние повышенного синтеза ауксинов привело к увеличению среднего веса семенных коробочек (113 мг против 82 мг в контроле), однако при этом сами семена были очень мелкими и нежизнеспособными (табл. 3).
IaaM-растения нормального фенотипа цвели одновременно с контрольными растениями и, в сравнении с растениями аномального фенотипа, формировали более мощные соцветия с большим количеством семенных коробочек. Только iaaM-растения нормального и промежуточного фенотипа образовали семена с высокой всхожестью (табл. 3).
Стимулирующее влияние ауксинов на процессы корнеобразования у iaaMрастений сохранялось и при их росте в условиях закрытого грунта. Корневая система iaaM-растений с высоким содержанием ауксинов была более мощной за счет увеличения количества придаточных корней и удлинения боковых корней. В результате эти растения обладали более длительным периодом вегетации, цветения и созревания семян.
Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на фотосинтез, рост и развитие трансгенных растений табака. С целью изучения влияния повышенного содержания эндогенных цитокининов и ауксинов на фотосинтез трансгенных растений с генами ipt и iaaM, проведено сравнительное исследование различных параметров роста и развития растений табака, выращенных in vitro и in vivo. Были исследованы параметры флуоресценции хлорофилла а фотосистемы II листьев, СО2-газообмен и устойчивость к фотоингибированию трансгенных растений табака. Показано уменьшение длины, веса и площади листьев у трансгенных растений. Содержание растворимого белка и углеводов в расчете на сырой вес листьев в iaaM-растениях уменьшилось на 20%. У ipt-растений содержание растворимого белка увеличилось на 44% по сравнению с диким типом. Содержание хлорофилла у трансгенных растений обоих типов снизилось на 15-20%.
Одним из наиболее важных свойств молекул хлорофилла является их способность флуоресцировать. Основными параметрами измерения флуоресценции хлорофилла а являются максимальный (Fv/Fm) и эффективный квантовый выход. Наблюдалось несущественное снижение максимального квантового выхода у трансгенных растений обоих типов. Для растений дикого типа, iaaM- и ipt-растений он составил 0.815, 0.785 и 0.770, соответственно.
Эффективный квантовый выход снизился на 10% для iaaM-растений и на 29% у ipt-растений по сравнению с контролем, в то время как снижение скорости нетфотосинтеза (PN) в расчете на хлорофилл было более значительным - на 40% и 65%, соответственно. Ингибирование роста корней, вызванное сверхсинтезом цитокининов, привело к нарушению водного режима ipt-растений. Это явилось одной из причин снижения фотосинтеза в этих растениях. У трансгенных растений увеличилась скорость темнового дыхания (50% для iaaM-растений и 36% для iptрастений в расчете от нет-фотосинтеза). У iaaM-растений это было вызвано появлением многочисленных придаточных корней на стеблях, связанным с повышенным содержанием ауксинов.
Значительное изменение скорости фотосинтеза у ipt-растений не соответствовало снижению квантового выхода. Возможно, у этих растений альтернативные пути электронного транспорта стали играть большую роль, в частности, увеличился перенос электронов на кислород и уменьшился - в цикл Кальвина.
Влияние увеличенных количеств эндогенных гормонов у трансгенных растений на устойчивость их к стрессам изучали на примере воздействия света высокой интенсивности на фотосинтез. Растения освещали в течение 30 мин светом интенсивности 3000 и 6000 мкмоль м-2с-1. Соотношение Fv/Fm, измеренное сразу после выключения ингибирующего света, позволяет оценить обратимую и необратимую составляющие фотоингибирования.
При интенсивности света 3000 мкмоль м-2с-1 соотношение Fv/Fm было одинаковым для всех вариантов растений. После 30 мин темновой адаптации у всех растений квантовый выход восстанавливался до уровня 80%. После 30минутной обработки растений повреждающим светом PFD 6000 мкмоль м-2с-1 и последующей 30-минутной темновой адаптации необратимое фотоингибирование у iaaM-растений было больше, чем в контроле - 68% против 55%. Таким образом, iaaM-растения плохо восстанавливались после стресса. Предположительно, это связано с образованием активных форм кислорода, оказывающих повреждающее действие на липиды. Необратимое фотоингибирование в этих условиях у iptрастений было ниже (45%), чем у контрольных растений (55%), что подтверждает защитное действие цитокининов в стрессовых условиях. Таким образом, обнаружены различия в действии ауксинов и цитокининов на фотосинтез в исследуемых трансгенных растениях. Кроме того, влияние гормонов зависело от условий роста и питания растений. При выращивании растений в закрытом грунте наиболее заметно проявилось стимулирующее влияние цитокининов и ингибирующее действие ауксинов.
Подавление экпрессии агробактериальных онкогенов в трансгенных растениях с помощью антисмысловых РНК. Почвенные патогенные бактерии Agrobacterium tumefaciens индуцируют развитие опухолей (корончатых галлов) у многих растений. Около тысячи видов двудольных растений подвержены агробактериальному раку (DeCleene a. DeLey, 1976), но особенно сильно от этого заболевания страдают виноград, плодовые культуры и некоторые декоративные растения. Онкогены агробактерий находятся в составе Т-ДНК Ti-плазмиды бактерий. Основными среди них считаются гены iaaM и ipt. Подавление экспрессии этих генов в растениях могло бы предотвратить процесс образования опухолей. Применение антисмысловых РНК и РНК-интерференции представляется достаточно эффективным и безопасным подходом к направленному подавлению экспрессии агробактериальных онкогенов.
Нами были использованы трансгенные растения табака с антисмысловыми копиями агробактериальных генов синтеза цитокининов и ауксинов под контролем сильных вирусных промоторов СaMV 35S и СaMV 35SS (рис. 15, 21).
Двойные трансформанты, содержащие одновременно антисмысловые копии генов ipt и iaaM, получены в результате скрещивания трансгенных растений - одинарных трансформантов (as-ipt-растений и as-iaaМ-растений). Шесть линий двойных антисмысловых трансформантов табака (as-ipt:as-iaaM-растения) и по пять линий одинарных трансформантов отобрали для дальнейших опытов.
Антисмысловое подавление экспрессии онкогенов анализировали на контрольных и трансгенных растениях табака всех трех типов. Листовые экспланты и декапитированные растения заражали вирулентными штаммами A.
tumefaciens C58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) и наблюдали образование опухолей различной морфологии и побегов на таких растениях.
На контрольных растениях и их листовых эксплантах формировались неорганизованные опухоли (рис. 24а). При заражении декапитированных растений и листовых эксплантов as-ipt-растений всех трех линий образовывались неорганизованные опухоли (рис. 24б,д). Такие опухоли при дальнейшем пассировании на безгормональной селективной среде проявляли сниженную способность к росту. Вероятно, в них снижался уровень цитокининов и, как следствие, нарушалось деление клеток. Подобный ожидаемый эффект может быть связан с подавлением экспрессии гена ipt и указывает на ингибирующее влияние антисмысловой формы гена изопентенилтрансферазы.
На листовых эксплантах и декапитированных растениях с антисмысловой копией гена биосинтеза ауксинов (as-iaaM-растения) образовывались морфогенные опухоли, способные к формированию побегов (рис. 24е,и,к). У растений одной линии сформировалась тератомная опухоль (рис. 24в). Это указывало на высокую экспрессию антисмысловой формы гена iaaM, находящейся под контролем двойного промотора CaMV 35SS, что приводило к подавлению синтеза ауксинов в опухолевых линиях. Как известно, снижение уровня экспрессии гена iaaM вызывает изменение соотношения цитокининов и ауксинов в опухолях в сторону повышения содержания цитокининов и стимулирует образование побегов (Akiyoshi et al., 1983). Опухоли, образующиеся при заражении двойных трансформантов (as-ipt:as-iaaM-растения) штаммом С58, также имели тенденцию к формированию побегов, а в одной линии образовалась тератомная опухоль (рис. 24г,ж). Можно предположить, что в этом случае подавлена экспрессия обоих онкогенов, в результате чего в опухолевых клетках одновременно снижается концентрация и цитокининов, и ауксинов. При заражении двойных трансформантов штаммом А6 также наблюдали повышенное образование побегов в опухолях.
а б в г д е ж з и к Рис. 24. Заражение листовых эксплантов (верхний и нижний ряд) и декапитированных (средний ряд) контрольных и трансгенных растений табака, содержащих антисмысловые копии генов биосинтеза цитокининов (as-ipt) и ауксинов (as-iaaM), вирулентным штаммом Agrobacterium tumefaciens С58(pTiC58). Верхний ряд (а-г) - рост опухолей, полученных на листовых эксплантах (4 мес после заражения); средний ряд (д-ж) - формирование опухолей и побегов на декапитированных трансгенных растениях (1.5 мес после заражения); нижний ряд (зк) - формирование опухолей и побегов на эксплантах контрольных и as-iaaM-растений (1.5 мес после заражения).
Антисмысловое ингибирование экспрессии онкогенов в некоторых растениях, полученных из опухолевых тканей при заражении штаммом С58, анализировали с помощью РНК-ДНК-гибридизации (рис. 25). С этой целью культивировали побеги, появившиеся на опухолевых тканях as-iaaM- и as-ipt:asiaaM-растений, выделяли из них РНК и гибридизовали ее последовательно с ДНК генов ipt и iaaM. Обнаружено, что уровень мРНК гена ipt и в обеих группах растений снижается меньше, чем уровень мРНК гена iaaM.
Более высокая степень ингибирования гена iaaM может объясняться силой двойного промотора CaMV 35SS, а также более высокой гомологией генов, которое составляет 95%. Подавление экспрессии гена биосинтеза ауксина сместило гормональный баланс в опухолевых клетках трансгенных растений в сторону цитокининов, что и привело к образованию побегов. Таким образом, при заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, вирулентными штаммами A. tumefaciens C58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. В процессе агробактериальной трансформации трансгенных растений формировались только лослабленные опухоли различной морфологии или на месте инфекции развивались нормальные растения.
Рис. 25. Анализ мРНК с помощью РНК-ДНК гибридизации. Побеги, сформированные на опухолях после заражения Agrobacterium tumefaciens С58 (pTiC58) листовых эксплантов as-iaaM-растений и as-ipt:asiaaM-растений, отделяли и размножали. На дорожку наносили по 30 мкг РНК. В качестве зонда использовали меченный Р ПЦР-продукт: а) гена ipt; б) гена iaaM. 1 - опухоль контрольного растения; 2-6 - побеги, полученные на опухолевых тканях as-iaaM-растений; 7, 8 - побеги, регенерированные из опухолей as-ipt:as-iaaM-растений; 9 - ДНК гена ipt; 10 - ДНК гена iaaM.
4. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений.
Трансгенные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению с их традиционными продуцентами.
Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ (Mason a. Arntzen, 1995).
В НПК УКомбиотехФ (Москва) создана улучшенная экспрессирующая система для производства белка HBsAg в дрожжах в промышленных масштабах, с использованием синтетического гена полипептида HBsAg/mayw, составленного с учетом кодонов аминокислот, наиболее часто используемых в интенсивно экспрессируемых генах Saсcharomyces cerevisiae (Друца и др., 1997). Этот ген предоставлен нам для работы над созданием трансгенных растений - продуцентов HBs-антигена. Аминокислотная последовательность продукта гена HBsAg/mayw исследована нами с помощью компьютерных программ для предсказания вероятных сайтов локализации белков в клетке УiPSORTФ и УPSORTФ ( Обнаружено, что анализируемый HBs-антиген имеет Nконцевой сигнальный пептид (29 аминокислотных остатков, подчеркнут черной линией) и четыре трансмембранные области для его локализации в цитоплазматической мембране, тельцах Гольджи и мембране эндоплазматического ретикулума растительной клетки (выделены цветом):
MENITSAFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSP TSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGS STTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWAS ARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCL WVYI.
Связь HBs-антигена с мембранными структурами предполагает его стабильное сохранение в клетках растений.
Создание и молекулярно-биологический анализ растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. В качестве источника гена использовали рекомбинантную плазмиду pDES20, содержащую синтетический ген полипептида HBsAg/mayw, используемый в клетках дрожжей для получения рекомбинантной вакцины против гепатита В (Друца и др., 1997).
Вначале ген HBsAg был встроен под промотор CaMV 35S. Полученную плазмиду pGA-HBsAg (рис. 26) перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404). В дальнейших экспериментах ген HBsAg клонировали в бинарный вектор для трансформации растений pSS (Voss et al., 1995), который содержит промотор с двойным энхансером CaMV 35SS. Полученную конструкцию pSS-HBsAg (рис. 26) перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK). Агробактериями, содержащими ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S, трансформировали листовые экспланты табака.
Наличие гена HBsAg в трансгенных растениях табака подтверждено методом ПЦР. Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Cинтез соответствующей мРНК установлен во всех линиях полученных трансгенных растений табака (рис. 27).
Количественное содержание поверхностного антигена НВsАg в тканях полученных трансгенных растений исследовали с помощью тест-систем для иммуноферментного выявления НВsАg. Экспрессия антигена в трансгенных растениях табака, выращенных в культуре in vitro и содержащих ген HBsAg под контролем одинарного промотора CaMV 35S, не превышала 0.001% от общего количества белка, тогда как в растениях с геном HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS синтез продукта составил до 0.002-0.02%. Контрольные, нетрансформированные растения не обладали антигенной активностью.
Рис. 26. Схема плазмид, содержащих ген HBsAg под разными промоторами. P 35S - одинарный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; P 35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты;
Pnos - промотор гена нопалинсинтазы;
PpatatinB33 - промотор гена пататина Вкартофеля; pACaMV, pAnos, pAosc - сигналы полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, гена нопалинсинтазы и гена октопинсинтазы, соответственно; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.
Рис. 27. Анализ мРНК HBsAg в листьях трансгенных растений табака, с помощью РНК-ДНК гибридизации.
В качестве зонда использовали меченный Р ген HBsAg. А - Трансгенные растения с геном HBsAg под контролем одинарного промотора CaMV 35S. 1 - фрагмент ДНК, соответствующий структурной части гена НВsAg (положительный контроль); 2 - тотальная РНК из нетрансформированного табака; 3-6 - тотальная РНК из трансгенных растений табака. Б - Трансгенные растения с геном HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS. 1 - положительный контроль, ген НВsAg; 2, 4, 5, 7- мРНК из трансгенных растений (линии растений 1, 7, 10, 17, соответственно); 3, 6 - мРНК из нетрансформированных растений табака.
Таким образом, использование двойного промотора позволило увеличить экспрессию HBsAg в трансгенных растениях табака по крайней мере в десять раз.
Однако синтез антигена в растениях различных линий был неодинаков, что может быть связано с количеством копий гена HBsAg и особенностями его встраивания в геном. При анализе трансгенных растений не отмечено корреляции между данными иммуноферментного анализа и РНК-ДНК-гибридизации. При этом не выявлено прямой зависимости между количеством мРНК и антигена: невысокий синтез транскриптов HBsAg не всегда означал низкий уровень синтеза белка.
Были получены растения поколения F1 и некоторые из них проанализированы на наличие HBs-антигена. Максимальное количество HBsантигена в разных линиях трансгенных растений табака поколения F1 в условиях in vitro достигало 0.05% от общего растворимого белка листьев.
Получение и анализ растений картофеля Solanum tuberosum L., содержащих ген HBsAg под контролем промоторов CaMV 35SS и гена пататина B33. Получены две группы растений с геном HBsAg под контролем конститутивного двойного промотора CaMV 35SS и тканеспецифического промотора гена пататина клубней картофеля В33 (Rocha-Sosa et al., 1989). Пататин является одним из главных запасных белков клубней картофеля. Ген HBsAg, экспрессируемый под контролем промотора пататина, должен проявлять в трансгенных растениях картофеля тканеспецифическую экспрессию и синтезироваться преимущественно в клубнях. Ген HBsAg был встроен в плазмиду для трансформации растений pBin-B33 (Rocha-Sosa et al., 1989). Структура плазмид pSS-HBsAg и pB33-HBsAg, сконструированных нами для трансформации растений картофеля, представлена на рис. 26. Для получения трансгенных растений были использованы штаммы A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) с плазмидой pSS-HBsAg и LBA4404 (pAL4404) с плазмидой pB33-HBsAg.
Наличие гена HBsAg и маркерного гена nptII в геноме трансгенных растений было детектировано методом ПЦР. Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Для этого выделяли тотальную РНК из листьев и микроклубней картофеля и гибридизовали ее с меченным 32Р геном HBsAg в качестве зонда. Присутствие транскриптов этого гена установлено в клетках всех линий исследованных трансгенных растений картофеля.
Количество антигена в листьях или клубнях различных линий двух групп трансгенных растений картофеля, растущих в условиях in vitro и in vivo, составило 0.005-0.035% от общего растворимого белка. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало 1.5 мкг/г массы клубня и было наибольшим в растениях, экспрессирующих антиген под контролем двойного промотора CaMV 35SS.
В соответствии со специфичностью генетической экспрессии под клубнеспецифическим пататиновым промотором, HBs-антиген был обнаружен исключительно в клубнях и отсутствовал в листьях трансгенных растений картофеля. Количество антигена в клубнях различных линий этого трансгенного картофеля, растущего в условиях in vitro и in vivo, составило от 0.005 до 0.018% от общего содержания растворимого белка клубней растений (200-400 нг/г сырого веса клубня).
Выделение и характеристика HBs-антигена, синтезируемого трансгенными растениями табака и картофеля. Нами получен очищенный концентрированный препарат HBs-антигена из растений. Для этого проведена иммунопреципитация HBsAg из экстрактов растений на белок А-сефарозе с помощью мышиных моноклональных антител к HBs-антигену. Для иммуноблоттинга использовали специально полученные кроличьи поликлональные антитела к мономерной форме HBs-антигена. Данные иммуноблотинга HBs-антигена из трансгенных растений картофеля и табака, экспрессирующих ген HВsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, представлены на рис 28. В этом анализе помимо мономерных форм HBs-антигена выявляются также его димерные формы, что может быть связано с неполной деградацией мультимерного комплекса HBsантигена в условиях наших экспериментов.
Рис. 28. Иммуноферментный блот анализ поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) после его осаждения из белковых экстрактов растений табака (А) и картофеля (Б) с помощью реакции иммунопреципитации на сорбенте белокА-сефароза CL-4B. А: 1, 2 - экстракт из листьев нетрансформированного табака; 3, 4 - экстракт из листьев трансгенного табака; 5, 6 - экстракт из дрожжей-продуцентов HBsAg; 7 - отрицательный контроль (белокА-сефароза CL4B); 8 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации). Б: 1 - белковый экстракт из листьев нетрансформированного картофеля; - экстракт из листьев трансгенного картофеля; 3 - экстракт из рекомбинантных дрожжейпродуцентов HBsAg; 4 - отрицательный контроль (белокА-сефароза CL-4B); 5 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации).
Использовали поликлональные антитела к мономеру HBsAg в разведении 1:5000. Для визуализации связывания антител с антигеном использовали набор ECL (Pierce, США).
В проведенном анализе молекулярная масса мономерной формы HBsантигена из синтезирующих его растений и дрожжей определена равной 24 кДа, что соответствует молекулярной массе белковой части мономерной формы HBsантигена вируса гепатита В (Sunil Kumar et al., 2003). Эти результаты вместе с возможностью прямого иммуноферментного определения нативного НВsантигена в бесклеточных экстрактах трансгенных растений указывают на то, что синтезируемый в растениях картофеля НВs-антиген способен агрегировать в олигомеры, которые, как известно, обладают существенно большей иммуногенной и антигенной активностью, чем отдельные НВs-полипептиды (Mason et al., 1992).
На это указывает и стабильность продукта гена НВsAg в трансгенных растениях: в экстрактах растений НВsAg сохранял антигенную активность до семи дней при 40С без ее заметного падения. Эти предположения были проверены в экспериментах по аналитической гельфильтрации HBs-антигена, выделенного из трансгенных растений.
Для экспериментов по аналитической гельфильтрации использовали фракцию гомогената из листьев табака и листьев и микроклубней трансгенных растений картофеля, очищенную от пигментов и низкомолекулярных белковых веществ. Бесклеточный экстракт наносили на HPLC-колонку Superose-6 (HR10/30) (Pharmacia Biotech, Швеция). HBs-антиген обнаружен в зоне элюции высокомолекулярных соединений с молекулярной массой около 2000 кДа (рис.
29). Учитывая молекулярную массу мономерной формы HBs-антигена равной кДа (без гликозилирования), можно сделать вывод, что в клетках трансгенных растений продукт экспрессии гена HВsAg образует мультимерные формы и в агрегации HBs-мономеров в мультимерные формы участвует не менее 70-мономеров. Наши данные по аналитической гельфильтрации синтезированного трансгенными клетками табака и картофеля HBs-антигена соответствуют седиментационной и электронно-микроскопической характеристике HBsантигена, выделенного другими авторами из трансгенных клеток табака (Mason et al., 1992). Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках рекомбинантных дрожжей-продуцентов HBs-антигена идет его сборка в мультимерные агрегаты, которые обладают значительно повышенной иммуногенной и антигенной активностью по сравнению с исходной мономерной формой и поэтому могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.
Рис. 29. Высокоэффективная гель-фильтрация HBs-антигена, выделенного из листьев трансгенного картофеля, на колонке Superose-6 (HR 10/30).
Элюция 0.05 М Na-фосфатным буфером (рН 7.5), содержащим 0.15 М NaCl, 60 мин со скоростью 0.4 мл/мин. Жирная линия - регистрация оптической плотности. Тонкая красная линия - детекция HBsантигена. D2000 - декстран голубой (2000 кДа), TG - тироглобулин (669 кДа), F - ферритин (443 кДа).
Элюция HBs-антигена на колонке с Superose-6 (HR10/30) происходит в зоне, практически свободной от присутствия других белков, что позволяет рассматривать препаративный вариант гельфильтрации на этом носителе как эффективную стадию очистки в технологии промышленного получения вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений-продуцентов.
Совместно с НПК Комбиотех проведены исследования по созданию технологии переработки биомассы трансгенных растений и выделения очищенных препаратов HBs-антигена вируса гепатита В.
Количество поверхностного HBs-антигена в трансгенных растениях табака и картофеля, экспрессирующих ген HBsAg, составляет от 0.002 до 0.05% от общего растворимого белка растительной ткани, что гораздо ниже, чем уровень экспрессии HBs-антигена в дрожжевых продуцентах. Учитывая это, для повышения эффективности извлечения HBsAg было решено использовать выделение на аффинных сорбентах. Проанализированы сорбенты, приготовленные на основе различных полимерных матриц AffiGel-701, AffiGel-10, Sepharose-4B, Sepharose-2B с ковалентно связанными моноклональными и поликлональными антителами, полученными иммунизацией мышей и кроликов рекомбинантным HBs-антигеном. Наилучшие результаты показал сорбент на основе матрицы Sepharose-2B и очищенной IgG фракции поликлональных кроличьих антител.
Кроликов иммунизировали промышленной рекомбинантной вакциной HBsAg (НПК Комбиотех, Москва). Обогащенную фракцию иммуноглобулинов G из сыворотки крови выделяли высаливанием 33%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой от альбумина ионообменной (DEAE) хроматографией.
Полученные антитела связывали с полимерной матрицей Sepharose-2B, активированной 0.5% CNBr. Оставшиеся активированные группы блокировали мМ раствором глицина. Количество связанных антител определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм.
Осветленный гомогенат листьев трансгенного табака или клубней трансгенного картофеля наносили на аффинную колонку в несколько циклов.
Неспецифически-связанные белки отмывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween-20. HBs-антиген элюировали 1 М раствором аммиака в PBS, содержащем 1% тритон Х100. Элюат сразу нейтрализовали 1 М раствором трисHCl до рН 7.5.
Содержание HBs-антигена определяли методом РПГА (реакция пассивной гемагглютинации). Фракции, содержащие HBsAg, объединяли и диализовали в фосфатном буфере с низкой концентрацией соли, после чего концентрировали в лиофилизаторе с низким вакуумом без замораживания.
Таким образом, разработана методика выделения рекомбинантного HBsантигена из экстрактов трансгенных растений-продуцентов HBsAg.
Использование разработанного аффинного сорбента позволяет выделить до 50% HBs-антигена в высокоочищенной концентрированной форме.
Тканеспецифическая экспрессия гена HBsAg в клетках трансгенных растений и культуры тканей Nicotiana tabacum L. Для получения растенийпродуцентов вакцины против гепатита В с тканеспецифической экспрессией этого гена в целых растениях и культуре тканей, может быть перспективным использование агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas. Эти промоторы состоят из регуляторных элементов генов октопинсинтазы (ocs) и маннопинсинтазы (mas), выделенных из A. tumefaciens. Схема рекомбинантных плазмид, сконструированных и использованных нами для трансформации растений, представлена на рис. 30. Эти плазмиды получены на основе векторов для трансформации растений pE1802 и pE1945, содержащих промотор (Aocs)3AmasPmas (Ni et al., 1995). Вектор pE1945 отличается от вектора рЕ18наличием интрона гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adh1 и отсутствием энхансера TL. Полученные конструкции перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404), который использовали для заражения листовых эксплантов табака. Было отобрано по 15-20 линий трансформантов для дальнейшего молекулярно-генетического и биохимического анализа.
Наличие гена HBsAg в трансгенных растениях подтверждено методом ПЦР.
Иммуноферментный анализ показал, что HBs-антиген присутствует на различном количественном уровне во всех исследованных линиях трансгенного табака.
Экспрессия антигена в трансгенных растениях табака, растущих in vitro, достигала 0.01% от общего растворимого белка. При этом синтез поверхностного антигена HBsAg был максимальным в корнях растений. Конструкция pE1945-Ag содержала интрон гена алкогольдегидрогеназы. Известно, что включение интронов в состав трансгенов может усиливать их экспрессию в клетках растений (Rose, 2004), однако в наших экспериментах наличие интрона гена adh1 не привело к повышению экспрессии целевого трансгена. По-видимому, эффект усиления экспрессии трансгена с помощью вставки интрона зависит от локализации интрона в экспрессирующей генно-инженерной конструкции.
Рис. 30. Схема рекомбинантных плазмид, содержащих ген HBsAg в составе бинарных векторов для трансформации растений pE1802 и pE1945. Aocs - активатор гена ocs;
Amas - активатор гена mas; TL - энхансер; Pmas - промотор гена mas;
Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; ags-ter и pAg7 - сигналы полиаденилирования и терминации генов агропинсинтазы и Ag7, соответственно; ADH - интрон гена алкогольдегидрогеназы кукурузы; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptII - ген неомицинфосфотрансферазы II; RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК.
На основе 8 линий трансгенных растений с наиболее высокой экспрессией HBs-антигена нами получены культуры так называемых косматых корней путем трансформации листовых дисков трансгенных растений клетками штамма Agrobacterium rhizogenes A4. Культуры косматых корней являются удобной системой для продуцирования вторичных метаболитов и рекомбинантных белков, так как они отличаются генетической стабильностью и быстрым ростом на безгормональной среде. Уровень синтеза HBs-антигена в различных линиях культур косматых корней оставался на уровне исходных трансгенных растений и достигал 0.01% от общего растворимого белка клеток.
Из листовых эксплантов трансгенных растений, синтезирующих HBs-антиген под контролем промоторов (Aocs)3AmasPmas, получены каллусные культуры. В них также показан синтез HBs-антигена, что можно объяснить регуляцией маннопинсинтазного и октопинсинтазного промоторов с помощью ауксинов, количество которых повышено в каллусной культуре, культивируемой на ауксинсодержащей среде (Langridge et al., 1989).
Следует отметить, что результаты нашей работы не подтверждают повышенную эффективность экспрессии трангенов под контролем гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas по сравнению с эффективностью двойного промотора CaMV 35SS (Ni et al., 1995).
Использование гибридного промотора (Aocs)3AmasPmas может быть перспективным для тканеспецифической экспрессии различных белков, важных для фармакологии и медицины, а также для получения продуцентов на основе культуры клеток трансгенных растений.
Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Все генетические конструкции, использованные нами ранее, содержали ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII), придающий растениям устойчивость к антибиотику канамицину. Существует опасность случайного попадания гена устойчивости к канамицину в окружающую среду при выращивании трансгенных растений в открытом грунте. Возможен горизонтальный перенос генов между трансгенными растениями и микроорганизмами, в том числе обитающими в пищеварительном тракте животных и человека. При создании оральных вакцин следует учитывать этот риск и создавать трансгенные растения, не содержащие селективных генов. С этой целью нами была создана генетическая конструкция с геном HBsAg, не содержащая селективных генов для отбора трансгенных растений, а также разработана технология трансформации и отбора трансгенных растений на бесселективных средах.
Для получения трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) без дополнительных селективных генов или генов-репортеров нами получен вектор pBM без таких маркерных генов и в нем клонирован ген HBsAg (рис. 31). Плазмида рВМ c ori широкого круга хозяев RKполучена на основе вектора pBIN19 (Frisch et al., 1995). Из этого вектора нами удален маркерный ген устойчивости к канамицину nptII вместе с промотором и сигналом полиаденилирования агробактериального гена нопалинсинтазы.
Плазмида рВМ содержит практически полностью сохранившийся полилинкер вектора pBIN19 с различными сайтами для клонирования генов и последовательности LB и RB агробактериальной Т-ДНК, необходимые для ее интеграции в растительный геном. В плазмиде рВМ присутствует ген устойчивости к канамицину nptIII для отбора бактериальных клеток (Trieu-Cuot a.
Courvalin, 1983), однако он расположен вне области Т-ДНК и не включается в геном растений. В эту плазмиду по сайту SphI встраивали ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (рис.
31). Полученную плазмиду pBM-Ag перенесли в штамм A. tumefaciens LBA44(pAL4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака.
Для отбора трансгенных растений с геном HBsAg применяли метод иммуноферментного анализа, позволяющий определять в экстрактах трансгенных растений HBs-антиген в концентрации 0.5 нг/мл. Полученные нами ранее трансгенные растения табака и картофеля с селективным геном nptII синтезировали HBs-антиген на среднем уровне около 0.02% от общего растворимого белка клетки, соответствующем его содержанию около 1 мкг/г сырого веса растений. Это позволяет детектировать наличие HBs-антигена даже при 2000-кратном его разбавлении экстрактами нетрансформированных растений.
Для анализа отбирали приблизительно равные по весу (около 0.5 г) экспланты проростков, которые объединяли, разрушали и определяли в их экстрактах присутствие HBsантигена.
Рис. 31. Схема плазмиды pBM-Ag. Обозначения: ori V - начало репликации; ColE1 - начало репликации из плазмиды ColE1; KmR - ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий; TL, TR - левая и правая границы ТДНК; CaMV35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; pACaMV - сигнал полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты; R, K, Sm, B, Sl - сайты рестрикции EcoRI, KpnI, SmaI, BamHI, SalI.
В выборках из 600 регенерантов табака, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20-проростков, присутствие HBs-антигена постоянно выявлялось в нескольких группах. Дальнейшее дробление каждой группы по принципу "поиска фальшивой монеты" или прямое тестирование всех присутствующих в группе регенерантов делает возможным нахождение индивидуальных трансформантов, синтезирующих HBs-антиген. В некоторых случаях в положительно детектируемой HBs-группе было выявлено до 3-5 индивидуальных трансформированных растений.
Эффективность трансформации определяли как процентную долю HBsположительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам (табл. 5). С помощью проведенного иммуноферментного анализа отобраны 15 линий трансгенных растений табака без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка.
Таблица 5.
Эффективность трансформации эксплантов табака генетической конструкцией pBM-Ag Номер эксперимента Число HBs-позитивных побегов/ число тестируемых побегов (%) 1 1/138 (0.7) 2 3/128 (2.3) 3 5/120 (4.1) 4 3/117 (2.5) 5 3/97 (3.1) Общее число HBs-позитивных побегов/ общее число тестируемых побегов (%) 15/600 (2.5) Все обнаруженные таким способом трансформанты показали присутствие у них гена HBsAg, детектируемого методом ПЦР. Эффективность трансформации составила 2.5%. Наблюдаемая в наших экспериментах достаточная для практической селекции частота трансформации может быть результатом положительного влияния двух новых факторов примененного метода. Во-первых, отбор трансгенных растений на среде без антибиотиков создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома и при сохранении его эпигенетического статуса. Вовторых, в примененном методе трансформации растений был использован сконструированный нами вектор с Т-ДНК, укороченной на 2600 п.н., что снижает нежелательный эффект длинных вспомогательных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена.
В дальнейшем для трансформации растений томата и табака безмаркерной генетической конструкцией pBM-Ag нами был применен метод вакуумной инфильтрации семян в суспензии агробактерий. После трансформации семена проращивали на среде МС с цефотаксимом и через 10-14 дней в проростках определяли наличие HBs-антигена с помощью ИФА. В результате получено по нескольку линий растений табака и томата, синтезирующих HBsAg на уровне до 0.05% от общего растворимого белка. Метод трансформации семян оказался экономичным по времени отбора трансформантов и позволил нам повысить частоту агробактериальной трансформации до 15-20%.
Таким образом, нами создан вектор для трансформации растений без селективных генов устойчивости к антибиотикам и разработан новый метод отбора трансгенных растений нового поколения. Такие растения удовлетворяют требованиям повышенной безопасности при применении их в качестве вакцины против гепатита В. Достигнутый уровень синтеза HBs-антигена в клетках томата достаточен для проведения доклинических испытаний полученных растений в качестве безопасной УсъедобнойФ вакцины нового поколения. Разработанный метод отбора трансформантов является основой общей стратегии получения безопасных растений без селективных маркеров.
С применением сконструированного нами вектора pBM в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН разработаны методы получения безмаркерных трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1 (Захарченко и др., 2005, 2007, 2008). Использованные в настоящей работе методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого генетического мусора.
ВЫВОДЫ 1. Получены и исследованы трансгенные растения с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis (bt), экспрессируемым под индуцибельным промотором TR1Т агробактериальной маннопинсинтазы. Впервые показано, что полученные растения устойчивы к личинкам табачного трипса и к паутинному клещу.
2. Получены прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptII и bt представлял только привой или подвой. Миграция фермента NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружена. Предложенная стратегия сочетания индуцибельных промоторов и прививок перспективна для создания трансгенных растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях.
3. С помощью антисмысловых РНК впервые показано подавление активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum. Получены растения, в которых экспрессия гена nptII ингибирована с помощью интерферирующих РНК.
4. Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmg1 из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидных соединений 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазу. Показано, что трансгенные растения с антисмысловой копией гена hmg1 характеризуются мужской стерильностью и отличаются измененной окраской и морфологией цветков.
5. Получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией агробактериальных генов изопентенилтрансферазы ipt и триптофанмонооксигеназы iaaM. Повышенный синтез цитокининов в ipt-растениях приводил к изменениям в их морфологии и биохимии, а также положительно влиял на фотосинтез этих растений и их устойчивость к стрессовым факторам.
Повышенный синтез ауксинов вызывал значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств iaaMрастений.
6. С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt. При заражении этих растений вирулентными штаммами Agrobacterium tumefaciens C58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM.
7. Получены растения табака и картофеля, а также культуры тканей и клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем конститутивных и тканеспецифичных промоторов. Содержание HBs-антигена в полученных растениях составило до 0.05% от суммарного растворимого белка.
Показано, что в клетках трансгенных растений происходит сборка мономерных форм HBs-антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.
8. С целью создания растений без генетического мусора сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томатов, экспрессирующих ген HBsAg и не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОБЗОРЫ 1. Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. Трансгенные растения для фармакологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.
2006. № 2. С. 3-12.
СТАТЬИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ 2. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum с помощью антисмысловой РНК // ДАН СССР. 1988. Т. 300. № 3. С.
727-730.
3. Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Шматченко В.В., Зинкевич В.Е., Север И.С., Асланян Е.М., Исангалин Ф.Ш., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum // ДАН СССР. 1990. Т.
315. № 6. С. 1489-1492.
4. Pукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э., Каляева М.А., Муpенец Л.Ю., Буpьянов Я.И. Комбиниpованное использование pегулиpуемых пpомотоpов и пpививок в генноинженеpной биотехнологии pастений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.
5. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Борисова В.Н., Мельников В.А.
Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. C. 42-45.
6. Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmg1 // Генетика.
2000. Т. 36. № 9. С. 1200-1205.
7. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Шутова Т.В., Хоробрых А.А., Бурьянов Я.И.
Физиолого-биохимические особенности растений табака с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 408-415.
8. Kаляева М.А., Захарченко Н.С., Доронина Н.В., Рукавцова Е.Б., Иванова Е.Г., Алексеева В.В., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений.
2001. Т. 48. № 4. С. 596-599.
9. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита B // Генетика. 2003. Т. 39. № 1. С. 51-56.
10. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бобрешова М.Е., Ложникова В.Н., Бурьянов Я.И.
Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы // Физиология растений. 2004. Т. 51. № 4. С. 600-606.
11. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А., Борисова В.Н., Мельников В.А., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. № 10.
С. 1422-1430.
12. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Повышенная устойчивость к фитопатогенным бактериям у трансгенных растений табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина Р1 // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1445-1452.
13. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Юхманова А.А., Школьная Л.А., Кадо К.И., Бурьянов Я.И. Экспрессия искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к фитофторозу и белой гнили // Доклады РАН. 2007. Т. 415. № 1. С. 129-131.
14. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я., Быков В.А., Бурьянов Я.И.
Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 6. С.
864-869.
15. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Ширшикова Г.Н., Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Семенова Г.А, Бутанаев А.М., Тарасевич Н. Ю. Фенотипические и физиологические изменения у фототрофной пурпурной несерной бактерии Rhodopseudomonas palustris, трансформированной бинарным вектором pGA 482 с геном биосинтеза цитокининов, ipt // Доклады РАН. 2007. Т. 415. № 4. С. 556-558.
16. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Голубчикова Ю.С., Бурьянов Я.И. Подавление экспрессии агробактериальных онкогенов с помощью антисмысловых РНК // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 172-183.
17. Рукавцова Е.Б., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я.И. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2009. Т. 45 (принята в печать).
СТАТЬИ В НАУЧНЫХ СБОРНИКАХ И ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ 18. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И.
Антисмысловые РНК ингибируют экспрессию гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum // Сборник научных трудов Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. Пущино.
1989. С. 82-86.
19. Dolgov S.V., Mityshkina T.I., Rukavtsova E.B., Buryanov Ya.I. Production of transgenic plants of Chrysanthemum morifolium Ramat with the gene of Bac. thuringiensis d-endotoxin // Acta Horticulturae. 1995. V. 420. P. 46-47.
20. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я. И., Быков В.А. Получение трансгенных растений - перспективных продуцентов вакцины против гепатита В // Сборник материалов X Международного съезда Фитофарм-2006. С.-Петербург. 2006. С. 383387.
21. Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И. Анализ экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях и клеточных культурах // Сборник материалов Школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Биомедицинская инженерия-2007. Пущино. 2007. С. 41-44.
22. Гапеева Т.А., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д.
Получение и характеристика трансгенных растений картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В // Доклады НАН Беларуси. 2008. Т. 52. № 1.
С. 84-87.
23. Гапеева Т.А., Захарченко Н.С., Юхманова А.А., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген антибактериального пептида цекропина Р1 // Вести НАН Беларуси. 2008. № 4. С.
24. Алексеева В.В., Мудрик В.А., Голубчикова Ю.С., Рукавцова Е.Б., Иванов Б.Н.
Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на регуляцию фотосинтеза, роста и развития трансгенных растений табака // Сборник материалов Международной научнопрактической конференции Актуальные проблемы экологии. Москва. 2008. С. 78-80.
25. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Юхманова А.А., Алексеева В.В., Шульга Н.Я., Дьяченко О.В., Шевчук Т.В., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н. Создание биологически безопасных трансгенных растений нового поколения с полезными свойствами // Сборник научных трудов по Программе Президиума РАН Динамика генофондов растений, животных и человека. Москва. 2008. С.