Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
СЕДЫХ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ
ПОЛИРЕАКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА КАК РЕЗУЛЬТАТ ОБМЕНА ИХ СТРУКТУРНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Новосибирск - 2012
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный консультант:
д.х.н., профессор Невинский Георгий Александрович
Официальные оппоненты:
Таранин Александр Владимирович, д.б.н.
Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, зав. лабораторией Попова Нэлли Александровна, к.б.н., доцент Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.
Ведущая организация:
Институт клинической иммунологии СО РАМН
Защита состоится л 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 6300Новосибирск, проспект академика Лаврентьева,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан л 2012 г.
Учный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Полиреактивность иммуноглобулинов является широко известным явлением, характерным как для естественных, так и для искусственно полученных антител. Многие моноклональные антитела при исследовании с неродственными антигенами оказываются олиго- и даже полиспецифичными. Описано несколько механизмов полиреактивности иммуноглобулинов - лабильность антигенсвязывающих центров, образование димеров в случае смесей антител, полученных от тысяч доноров, действие факторов, дестабилизирующих белки, и обмен IgG4 HLфрагментами. Получение биспецифичных моноклональных терапевтических иммуноглобулинов является актуальной задачей молекулярной иммунологии. Полиреактивность также описана и для искусственно полученного мультикаталитического антитела, гидролизующего ДНК, РНК и казеин.
Полиреактивность природных абзимов к настоящему времени изучена недостаточно. Молоко человека представляет собой уникальный источник каталитически активных антител (абзимов), которые гидролизуют разнообразные субстраты и обладают уникальными синтетическими активностями.
Целью настоящей работы было изучение природы полифункциональности иммуноглобулинов классов G и A молока человека. Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать каталитические активности IgG и sIgA молока человека, обладающих различным сродством к ДНК, АТР, казеину, липидам молока, а также различной гидрофобностью, в гидролизе ДНК, олигосахаридов, АТР, фосфорилировании казеина и прочно связанных с иммуноглобулинами липидов и олигосахаридов.
2. Выяснить, присутствуют ли в молоке человека каталитически активные IgG и sIgA, содержащие не только легкие цепи одного типа (лямбда или каппа), но и химерные иммуноглобулины (Ig), содержащие одновременно легкие цепи двух типов. Выяснить возможность обмена HL-фрагментами (половинами молекул) среди подклассов IgG (IgG1ЦIgG4).
3. Исследовать in vitro возможность обмена HL-фрагментами или другими структурными компонентами между различными молекулами IgG, а также между молекулами sIgA молока человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые показана каталитическая полифункциональность Ig молока человека, обладающих высоким сродством к ДНК, АТР, казеину и липидам молока, активных гидролизе ДНК, АТР, олигосахаридов, фосфорилировании казеина, липидов и олигосахаридов. Впервые показано, что в молоке человека существуют химерные АТ, содержащие одновременно легкие цепи типа каппа () и лямбда (), причем такие IgG представлены всеми подклассами (IgG1ЦIgG4). Показано, что в присутствии плазмы молока, лишенной АТ и восстановленного глютатиона (GSH) IgG молока обмениваются HLфрагментами, a sIgA HL- и/или (HL)2-компонентами, но не свободными легкими (L) или тяжелыми (H) цепями.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты были представлены на конференциях - Студент и научно-технический прогресс (НГУ, Новосибирск, 2007, 2008, 2010), XII Всероссийская медико-биологическая конференция Фундаментальная наука и клиническая медицина (СанктПетербург, 2009), Медицинская геномика и протеомика (Новосибирск, 2009), Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, 2010).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 1страницах, содержит 31 рисунок, 1 таблицу. Библиография включает 2литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Выделение иммуноглобулинов. Препараты иммуноглобулинов класса А и G были выделены из молока здоровых по медицинским показаниям доноров на сорбентах protein A- и protein G-Sepharose (в отличие от антигенов белки A и G специфически взаимодействуют с Fс фрагментами Ig).
После нанесения антител (АТ) для разрушения неспецифических комплексов колонку промывали 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, содержащим 0,2 % Тритон Х-1и 0,3 NaCl. Затем колонку промывали TBS и элюировали АТ 0,1 М Gly-HCl pH 2,6. Далее АТ были дополнительно очищены ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацией на Superdex 2(для разрушения неспецифических комплексов АТ перед гель-фильтрацией инкубировали с 2 М МgCl2). Ранее было показано, что выделение АТ с помощью использованной методики приводит к получению препаратов, не содержащих примесей каких-либо канонических белков или ферментов (Kanyshkova et al., 1997; Odinsova et al., 2005, 2011), что подтверждено в настоящем исследовании. Выделенные препараты АТ были гомогенны по данным SDS-электрофореза в полиакриламидном геле при окраске серебром и иммуноблоттинге. С помощью тестирования ДНКазной активности in situ в геле, содержащем сополимеризованную ДНК, а также анализа других активностей, соответствующих фрагментам геля после SDS-электрофореза было показано, что все исследованные активности являются собственным свойством IgG и sIgA.
2. Разделение иммуноглобулинов на аффинных сорбентах. Ранее было показано, что реакции гидролиза ДНК, АТР, олигосахаридов, а также фосфорилирования казеина и прочно связанных с АТ липидов и олигосахаридов катализируют не только интактные IgG и sIgA молока человека, но также изолированные легкие цепи или, по крайней мере, их изолированные HL-фрагменты (диссертац. работы: Кит, Ю. Я., 1996;
Канышкова Т. Г., 1999; Семенов, Д. В., 1998; Каратаева, Н. А., 2007). Кроме того в этих работах было показано, что способностью связываться с субстратом и каталитической активностью обладают Fab и/или Fab2 IgG и sIgA. Эти данные свидетельствуют о том, что основную роль в комплексообразовании и катализе играют активные центры таких абзимов, сформированные их вариабельными участками легких и тяжелых цепей. При этом активный центр почти всегда расположен на легкой цепи (в случае sIgA с АТРазной активностью на стыке Н- и L-цепей), а тяжелая цепь в большей степени важна для увеличения сродства АТ к субстрату. Таким образом, очевидно, что связывание абзимов с различными аффинными сорбентами обусловлено взаимодействием иммобилизованных субстратов с активными центрами вариабельных участков АТ.
IgG и sIgA последовательно разделяли аффинной хроматографией на сорбентах, содержащих иммобилизованные ДНК, аналог АТР, казеин и липиды. Фракцию антител, обладающих сродством к ДНК-целлюлозе, наносили на АТР-сефарозу (рис. 1А). Затем фракцию, обладающую высоким сродством к ДНК и АТР (рис. 1Б), наносили на казеин-сефарозу, а фракцию, обладающую высоким сродством к этим трем лигандам (рис. 1В) наносили на сорбент, содержащий липиды молока. Далее в работе анализировали каталитические активности фракций IgG и sIgA, отличающихся по сродству к ДНК, АТР, казеину и липидам молока.
Рис. 1. Профили последовательных аффинных хроматографий IgG. А - хроматография на ДНК-целлюлозе. Б - хроматография IgG, обладающих высоким сродством к ДНК-целлюлозе, на АТР-сефарозе. В - хроматография IgG, обладающих высоким сродством к ДНК-целлюлозе и АТР-сефарозе, на казеин-сефарозе. Г - хроматография IgG, обладающих высоким сродством к трем предыдущим на сорбенте, содержащем липиды. - помечены фракции, обладающие высоким сродством к аффинному сорбенту, элюированные 3 М NaCl и 3 М MgCl2; () - оптическая плотность (А280).
3. Анализ каталитических активностей абзимов. Каталитическая полиреактивность. При последовательной хроматографии IgG на ДНКцеллюлозе, АТР-, казеин-сефарозе и сорбенте, содержащем липиды, не удалось получить фракции АТ, обладающие только одной из шести исследованных активностей. Все полученные фракции, отличающиеся сродством к аффинным сорбентам, обладали всеми исследованными каталитическими активностями (гидролиз ДНК, АТР, олигосахарида, фосфорилирование казеина, липидов и олигосахаридов молока человека, прочно связанных с антителами). Следует отметить, что высокие уровни активностей проявляли фракции, обладающие высоким сродством ко всем аффинным сорбентам, элюированные в условиях разрушения прочных иммунных комплексов (3 М NaCl, 3M MgCl2) (рис. 2Црис. 4).
Рис. 2. Профили относительных каталитических активностей IgG, последовательно разделенных на ДНК-целлюлозе (А), АТР-сефарозе (Б), казеин-сефарозе (В), липидсорбенте (Г). () - оптическая плотность (А280), УА - относительная удельная активность, () - гидролиз плазмидной ДНК, () - фосфорилирование липидов, () - фосфорилирование казеина.
sIgA молока также последовательно разделяли по сродству к ДНК, АТР, казеину и липидам, были получены фракции антител, обладающие высоким и низким сродством к сорбентам. Высоким сродством к ДНК-, АТР-, казеин- и липид-сорбенту обладали соответственно 52%, 21%, 12%, 4% от общего количества АТ, нанесенных на первый сорбент - ДНК-целлюлозу. Во всех случаях фракции, обладающие высоким сродством к любому из этих сорбентов (элюция 3М NaCl и MgCl2) проявляли все исследованные каталитические активности (рис. 3).
Рис. 3. Профили относительных каталитических активностей sIgA, последовательно разделенных на ДНК-целлюлозе (А), АТР-сефарозе (Б), казеин-сефарозе (В) и липидсорбенте (Г). () - оптическая плотность (А280), УА - относительная удельная активность, () - гидролиз плазмидной ДНК, () - фосфорилирование липидов () - фосфорилирование казеина.
В другой серии экспериментов АТ выделяли из эквимолярной смеси АТ молока пяти доноров и затем независимо наносили на ДНК-целлюлозу и АТР-сефарозу (рис. 4). Анализировали каталитические активности полученных фракций: антитела, обладающие высоким сродством к ДНК, гидролизовали не только ДНК, но и другие субстраты (рис. 4А, Б). АТ, обладающие высоким сродством к АТР, также катализировали все изученные реакции (рис. 4В, Г). Подобные результаты получены и при последовательном разделении иммуноглобулинов по гидрофобности на фенил-сефарозе, а затем на ДНК целлюлозе.
Известно, что канонические ферменты и моноклональные АТ могут взаимодействовать с неспецифическими лигандами, но обычно сродство к специфическим лигандам на 1Ц3 порядка выше, чем к неспецифическим.
Слабое неспецифическое взаимодействие ферментов (и некоторых моноклональных АТ) с чужеродными лигандами является достаточно широко распространенным явлением, однако в литературе пока нет данных о ДНКазах (или о других ферментах), способных с заметной эффективностью катализировать превращение чужеродных субстратов.
Рис. 4. Профили относительных каталитических активностей IgG (А, В) и sIgA (Б, Г), разделенных аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе (А, Б) и АТР-сефарозе (В, Г). () - оптическая плотность (А280), (Ц Ц) - концентрация NaCl, УА - относительная удельная активность, () - гидролиз плазмидной ДНК, () - гидролиз олигосахарида, () - гидролиз АТР, () - фосфорилирование липидов, () - фосфорилирование олигосахаридов.
Исходя из современных представлений о моновалентности АТ и данных о более низком сродстве АТ к чужеродным лигандам, а также катализе ферментами только одной реакции, следовало ожидать, что для каждого из использованных аффинных сорбентов фракции, элюируемые в условиях разрушения прочных иммунных комплексов (3М NaCl и MgCl2), будут содержать АТ только к одному - конкретному иммобилизованному антигену и катализировать только одну из реакций. Однако получить фракции, катализирующие только одну реакцию не удалось; все фракции, элюированные с сорбентов при последовательных хроматографиях в условиях разрушения прочных иммунных комплексов обладали шестью каталитическими активностями: гидролиз ДНК, АТР, олигосахаридов, а также фосфорилирование казеина, липидов и олигосахаридов.
Полученные результаты невозможно объяснить на основе классических представлений о природе полиспецифичности моновалентных АТ. Согласно литературным данным, полиспецифичность связывания может быть обусловлена конформационной лабильностью антигенсвязывающего центра (Notkins, A. L., 2004). Кроме того, разные антигены могут быть связаны разными участками одного антигенсвязывающего центра (Edwards, B. D. et al., 2003). Нельзя исключить возможность некоторых лособых молекул АТ связывать с сопоставимым сродством специфический антиген и один (или даже два) неспецифических антигена. Возможно, высокое сродство некоторых IgG и sIgA молока ко всем использованным аффинным сорбентам обусловлено именно этими механизмами полиреактивности связывания.
Однако данные механизмы полиспецифичности не могут объяснить, каким образом в активном центре каталитически полиреактивного монофункционального антитела могут появиться нескольких наборов аминокислотных остатков, катализирующих шесть различных химических реакций, которые в случае канонических ферментов соответствуют шести разным ферментам.
Одним из возможных объяснений полученных результатов может быть то, что некоторые фракции АТ действительно взаимодействуют с высоким сродством со специфическим и неспецифическими сорбентами за счет полиреактивности связывания. В то же время некоторые фракции АТ, обладающие высоким сродством к различным аффинным сорбентам и проявляющие каталитические активности в отношении шести неродственных субстратов, могут быть биспецифичными - содержать одновременно два разных антигенсвязывающих каталитических центра - один со сродством к одному из субстратов, а другой - ко второму субстрату. Образование биспецифичных АТ может происходить в результате обмена HLфрагментами между молекулами различных АТ, что может привести к образованию большого числа самых разных вариантов химерных иммуноглобулинов. Таким образом, в работе впервые показана каталитическая полиреактивность АТ молока человека, которая может быть следствием наличия в составе одной молекулы IgG и sIgA как минимум двух разных антигенсвязывающих центров.
4. Иммуноглобулины, содержащие легкие цепи различных типов.
Известно, что все классы иммуноглобулинов содержат легкие цепи только двух типов ( и ). Иммуноглобулины класса G и А молока человека сначала разделяли на сорбентах (в условиях недостатка сорбента), содержащих АТ против легких цепей - анти--L- и анти--L-сефарозе (рис. 5А и В). Затем фракцию АТ со сродством к анти--L-сефарозе подвергали хроматографии анти--L-сефарозе, а IgG со сродством к анти--L-сефарозе- хроматографии анти--L-сефарозе (рис. 5Б и Г). В обоих случаях повторная хроматография приводила к получению фракции химерных -IgG, имеющих сродство к обоим сорбентам (рис. 5Б и Г). При повторной хроматографии чистых препаратов -IgG и -IgG (после удаления химерных -IgG) соответственно на анти--L-сефарозе и анти--L-сефарозе достоверно определяемых количеств АТ, элюируемых кислым буфером не обнаружено (рис. 6А, Б). В то же время, химерные IgG элюировались кислым буфером как с анти--L-, так и анти--L-сефарозы (рис. 6В, Г). Эти данные свидетельствовали в пользу обмена HL-фрагментами между -IgG и -IgG.
Рис. 5. Профили аффинных хроматографий IgG (А, Б) и sIgA (В, Г) на сорбентах, содержащих иммобилизованные антитела против легких цепей разных типов. А, В - хроматография на анти--L-сефарозе. Б, Г - хроматография на анти--L-сефарозе антител, обладающих сродством к анти--L-сефарозе (пики 2, 4). () - оптическая плотность (А280).
Чтобы исключить такой обмен в процессе выделения АТ из молока смешивали -IgG и -IgG (лишенные химерных -IgG) и после инкубации (24 ч) смеси провели выделение АТ согласно стандартной методике.
Полученные препараты IgG были использованы для выделения - и -IgG на анти--L-сефарозе и анти--L-сефарозе соответственно. При последующей рехроматографии очищенных - и -IgG соответственно на анти--Lсефарозе и анти--L-сефарозе химерных -IgG, элюируемых кислым буфером обнаружено не было. Аналогичный результат был получен в случае такого же анализа смеси чистых - и -sIgA. Это свидетельствовало, как об отсутствии заметного обмена в процессе стандартного выделения IgG и sIgA, так и о связывании в использованных условиях c анти--L-сефарозой только -Ig, а c анти--L-сефарозoй - только -Ig. Отсутствие в препаратах -Ig (и -Ig) заметных примесей -Ig (и -Ig) или химерных -Ig было также показано с помощью вестерн-блот.
Рис. 6. Профили аффинных хроматографий -IgG (А), -IgG (Б) и -Ig (В, Г) на анти--L-сефарозе (А, В) и анти--L-сефарозе (Б, Г). () - оптическая плотность (А280).
Отношение относительных каталитических активностей в катализе пяти различных реакций было различным для IgG и sIgA, содержащих легкие цепи только - или -типа, а также -Ig (рис. 7).
Рис. 7. Относительные активности АТ, содержащих легкие цепи разных типов: уу - гидролиз плазмидной ДНК, уу - гидролиз олигосахарида, уу - гидролиз АТР, уу - фосфорилирование липидов, уу - фосфорилирование олигосахаридов.
5. Иммуноферментный анализ (ИФА). Препараты -, - и -(IgG и sIgA) анализировали с помощью прямого и сэндвич-ИФА, используя конъюгаты моноклональных антител анти-L- и анти-L- с пероксидазой хрена (HRP).
При прямом анализе -IgG давали положительный ответ только на анти-L-HRP конъюгаты, а -IgG - только на анти-L--HRP. Химерные -IgG давали положительный ответ при использовании обоих конъюгатов (рис. 8А, Б).
Аналогичные результаты были получены и в случае -, - и -sIgA (рис.
8В, Г).
При сэндвич-ИФА в лунку планшета сначала вносили первичные антитела против легких цепей, затем анализируемые иммуноглобулины, а затем различные конъюгаты. В комбинациях анти-L--первичные АТ и конъюгаты анти-L--HRP, а также анти-L--первичные АТ и конъюгаты анти-L--HRP положительный ответ давали только химерные -IgG. В комбинациях, когда и первичные АТ и конъюгаты были анти-L- или анти-L, положительный ответ давали соответственно только -IgG и -IgG (рис. 9).
Положительный ответ в случае соответствующих комбинаций первичных антител и конъюгатов наблюдается при концентрации порядка 0,5 мкг/мл АТ и он отсутствует в контрольных экспериментах при использовании АТ в концентрации 40 мкг/мл (рис. 7). Следовательно, если -АТ и содержат примесь -АТ и наоборот, то количество примеси составляет менее 1%.
На основании данных, полученных при хроматографии АТ на анти-L-- или анти-L--сефарозе и ИФА было оценено относительное содержание -, - и -Ig в суммарных препаратах IgG и sIgA антител (средние значения для АТ из молока пяти доноров): 33 5% -IgG, 13 5% -IgG и 54 10% IgG; 487% -sIgA, 355% -sIgA и 174 % -sIgA.
Рис. 8. Прямой ИФА препаратов IgG (А, Б) и sIgA (В, Г), содержащих легкие цепи типа (), типа (), типа и типа (). Конъюгаты против легких цепей (А, В) и (Б, Г). - контроль.
Рис. 9. Сэндвич-ИФА IgG, содержащих легкие цепи различных типов. А - первичные антитела анти-, конъюгат - анти-. Б - первичные антитела - анти-, конъюгат - анти-.
- IgG, содержащие легкие цепи типа , - IgG, содержащие легкие цепи типа , - IgG, содержащие легкие цепи типа и типа , - контроль.
В литературе описан обмен НL-фрагментами, который in vivo и in vtiro приводит к биспецифичности только IgG4. C помощью прямого ИФА было оценено относительное содержание IgG четырех подклассов (IgG1ЦIgG4).
Согласно полученным данным химерные -IgG содержали HL-фрагменты всех четырех подклассов, причем распределение по подклассам примерно соответствовало распределению четырех подклассов тяжелых цепей в крови человека (рис. 10).
Рис. 10. Относительное содержание подклассов IgG в препаратах, содержащих легкие цепи разных типов при помощи прямого ИФА. уу - IgG1, уу - IgG2, уу - IgG3, уу - IgG4.
Таким образом, в работе впервые показано, что препараты IgG и sIgA молока человека, представлены антителами, содержащими в своем составе легкие цепи типа , , а также -Ig, при этом -IgG представлены всеми подклассами.
6. Обмен иммуноглобулинов молока человека HL-фрагментами.
В работах, посвященных обмену IgG4, иммуноглобулины обменивались HLфрагментами in vitro в присутствии восстановленного глютатиона и лизата клеток крови (Kolfschoten et al., Science, 2007). В настоящей работе проведен анализ обмена различными структурными компонентами IgG и sIgA человека (эквимолярные смеси АТ от пяти доноров) in vitro в различных условиях.
Сначала были получены фракции немодифицированных АТ, отличающиеся по сродству к ДНК-целлюлозе, а затем фракции АТ, модифицированных радиоактивным фосфором и флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) с помощью аффинной хроматографии на ДНК-целлюлозе (рис. 11).
Фракции, отличающиеся по сродству к ДНК, элюировали ступенчатым градиентом NaCl. В случае sIgA-FITC также была использована 8 М мочевина.
Рис. 11. Профили аффинных хроматографий IgG (А, Б) и sIgA (В), модифицированных FITC (А, В) и Р (Б) на ДНК-целлюлозе. - профиль хроматографии модифицированных Ig (А280), - профиль хроматографии немодифицированных AT (А280), - относительная радиоактивность (флюоресценция).
Немодифицированные IgG (или sIgA) инкубировали с соответствующими модифицированными АТ в различных условиях, затем смеси диализовали против буфера, содержащего окисленный глутатион и подвергали хроматографии на ДНК-целлюлозе. После инкубации немодифицированных IgG, элюированных с ДНК-целлюлозы 0,15 M NaCl (0,15М-IgG), с [32P]IgG, элюированными 0,6 M NaCl (0,6М-IgG) в присутствии только TBS, а также этого буфера, содержащего только GSH или плазму молока, лишенную жиров, липидов и АТ, образования меченых АТ с низким сродством к сорбенту не происходило (рис. 12), также не наблюдали образования АТ с более высоким сродством при инкубации 0,15M-[32P]IgG с 0,6M-IgG.
После инкубации 0,15M-IgG и 0,6M-[32P]IgG (рис. 13Г) или 0,15M[32P]IgG и 0,6M-IgG (рис. 13В) в присутствии одновременно плазмы молока и GSH, примерно 31 2% и 41 3% общей P-метки переходило в пик исходно нерадиоактивного IgG. Аналогичные результаты были получены после инкубации в указанных условиях интакного IgG с IgG-FITC. Только при одновременном присутствии плазмы и GSH в зависимости от использованных комбинаций АТ наблюдалось изменение сродства к ДНКцеллюлозе 25Ц60 % IgG-FITC (рис. 13А, Б).
Рис. 12 Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей немодифицированных и модифицированных IgG с помощью Р после инкубации в различных условиях. А - смесь содержала 0,6М-[32P]IgG (рис. 11Б), 0,15М-IgG, GSH и не содержала плазмы молока. Б - смесь содержала 0,6М-[32P]IgG (рис. 11Б), 0,15М-IgG, плазму молока, но не содержала GSH. - профиль оптической плотности при повторной хроматографии на ДНК-целлюлозе, - относительная радиоактивность (cpm).
Как и в случае IgG, обмен структурными компонентами между sIgA - sIgA-FITC в присутствии TBS, а также буфера содержащего только GSH или плазму молока не наблюдали (рис. 14Б). После инкубации 0,6M-sIgA с sIgAFITC, элюированными 8 М мочевиной, в присутствии плазмы и GSH примерно 14 3% флюоресцентной метки перешло во фракции sIgA, элюированные 0,6, 1,5 и 3 M NaCl (рис. 14А). При смешивании 0,15M-sIgA и 0,6M-sIgA-FITC примерно 164% флюоресцентной метки было обнаружено в пике АТ, элюированных 0,15 M NaCl.
Таким образом, переход радиоактивной (флюоресцентной) метки при хроматографии реакционных смесей на ДНК-целлюлозе во фракции с большим (или меньшим) сродством только после инкубации при одновременном присутствии GSH и плазмы молока указывает в пользу возможности обмена структурными компонентами IgG и sIgA непосредственно в молоке, которое также содержит восстанавливающие соединения.
Рис. 13. Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей немодифицированных и модифицированных IgG с помощью FITC (А, Б) или 32Р (В, Г) (рис. 11Б) после их инкубации в присутствии одновременно GSH и плазмы молока. А - смесь содержала 0,15М-IgG-FITC и 0,5М-IgG. Б - 0,5М-IgG-FITC и 1,5М-IgG. - профиль оптической плотности (А280), - относительная флюоресценция (ОФ). В - смесь содержала 0,15М-[32P]IgG и 0,6М-IgG. Г - 0,6-М-[32P]IgG и 0,15М-IgG. - относительная радиоактивность (cpm).
Рис. 14. Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей 0.6M-sIgA и 8M-мочевина-FITC-sIgA после инкубации в присутствии одновременно GSH и плазмы молока (А) и только плазмы молока (Б); - профиль оптической плотности, - относительная флюоресценция (ОФ).
Чтобы выяснить, могут ли АТ обмениваться свободными легкими или тяжелыми цепями, модифицированные свободные легкие и тяжелые цепи смешивали с немечеными интактными IgG в присутствии плазмы молока и, GSH. Перехода флюоресцентной метки в область интактного IgG (150 кДа) не происходило (рис. 15).
Рис. 15. Электрофоретический анализ продуктов обмена IgG со свободными тяжелыми и легкими цепями, мечеными FITC. 1, 2 - легкие и тяжелые цепи, меченые FITC, 3 - IgG, 4 - маркеры молекулярной массы, 5, 6 - смесь IgG и легких (тяжелых) цепей, меченых FITC в присутствии GSH и плазмы молока.
Таким образом, АТ молока человека могут обмениваться только HLфрагментами, что приводит к образованию химерных -Ig, а также молекул АТ, содержащих самые разные варианты комбинаций из HL-фрагментов к различным антигенам. Это обуславливает высокое сродство IgG к ДНК, АТР, казеину, липидам и гидрофобным сорбентам и катализ такими антителами всех исследованных химических реакций. Однако in vitro обмен sIgA в присутствии GSH и плазмы молока примерно в 1,5Ц3 раза менее эффективен, чем для IgG. Кроме того, суммарные препараты соответствующих АТ содержат меньше -sIgA (174 %), чем -IgG (54 10%) Это может быть связано с тем, что секреторный компонент и J-цепь молекул sIgA затрудняют in vitro и in vivo такой обмен между - и -sIgA.
Согласно данным последовательных аффинных хроматографий на нескольких сорбентах относительное количество иммуноглобулинов (и их каталитических активностей в исследуемых реакциях) с высоким сродством к различным сорбентам для IgG и sIgA в определенной степени сопоставимо.
Как и IgG, IgA крови существуют в виде мономеров - (HL)2-молекул.
Секреторные IgA поступают в молоко в виде тетрамеров (HL)4JS, в которых IgG связаны с J-цепью и секреторным компонентом. Нельзя исключить, что при прохождении через эпителиальные клетки молочной железы соединение двух IgA в sIgA может иметь в той или иной степени случайный характер. В случае реализации этого механизма и последующего обмена HL- или (HL)2фрагментами уже непосредственно в молоке, не исключена возможность образования (HL)4JS молекул, содержащих HL-фрагменты против трех или даже четырех различных антигенов.
Согласно данным работы (Kolfschoten et al, Science, 2007), обмен HLфрагментами в присутствии природных компонентов крови, GSH или других агентов, восстанавливающих дисульфидные связи (DTT, меркаптоэтанола) в случае IgG4 может катализировать протеиндисульфидизомераза и/или неонатальный Fc-рецептор (FcRn). Поскольку интенсивный обмен фрагментами в настоящем исследовании происходит только при одновременном присутствии GSH и молочной плазмы, следует полагать, что молоко человека содержит белки и/или ферменты (возможно их комплексы), катализирующие обмен HL-компонентами после образования восстановленных форм АТ. Не исключено, что, как и в случае IgG4, такой обмен могут катализировать протеиндисульфидизомераза и/или FcRn. В тоже время возможно, что молоко содержит какие-то другие ферменты или факторы, катализирующие такой обмен.
Совокупность полученных данных свидетельствует о возможной реализации для IgG и sIgA молока человека классических механизмов полиреактивности связывания, обусловленных конформационной лабильностью антигенсвязывающих центров и потенциальной возможностью связывания разных антигенов в пределах одного центра. В то же время, возможен еще один механизм реализации полиреактивности связывания и продемонстрированной в работе каталитической полифункциональности абзимов, которые возникают в результате обмена структурными компонентами между молекулами как IgG, так и sIgA, с образованием самых разных вариантов химерных антител.
ВЫВОДЫ 1. Впервые показана каталитическая полифункциональность IgG и sIgA молока человека. Анализ сродства и каталитической активности IgG и sIgA, проведенный с помощью последовательных аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе, АТР-, казеин- и фенил-сефарозе, а также липид-сорбенте, показал, что фракции с высоким сродством к каждому из предыдущих сорбентов распределяются по всему профилю каждой из последующих хроматографий. При этом фракции, элюируемые с каждого из сорбентов в условиях разрушения прочных иммунных комплексов, обладают шестью каталитическими активностями: гидролиз ДНК, АТР и олигосахаридов, а также в фосфорилирование казеина и прочно связанных с иммуноглобулинами липидов и олигосахаридов.
2. В молоке человека, наряду с IgG и sIgA с легкой цепью только типа лямбда или каппа, обнаружены химерные иммуноглобулины, содержащие одновременно легкие цепи типа лямбда и каппа. Химерные IgG представлены всеми подклассами: 74,0 7,0% IgG1, 16,0 1,5% IgG2, 5,0 0,4% IgG3 и 5,0 0,5% IgG4.
3. Показано, что IgG молока человека in vitro при одновременном присутствии восстановленного глютатиона и молочной плазмы, лишенной антител, обмениваются HL-фрагментами, но не легкими или тяжелыми цепями. В этих условиях sIgA также подвергаются обмену, который может быть отнесен как к HL-, так и (HL)2-фрагментам этих антител. Такой обмен приводит к формированию би- и полифункциональных АТ, которые могут проявлять полиреактивность в связывании антигенов и полиспецифичность в катализе химических реакций.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А. Каталитическая полиспецифичность IgG молока лактирующих женщин // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - №. 3. - С. 22-32.
2. Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А. Каталитическая полиспецифичность sIgA абзимов из молока лактирующих женщин // Российский иммунологический журнал. - 2009. - Т. 3. - С. 147-157.
3. Тарасенко, К. Л., Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А.
Каталитическая полиреактивность абзимов молока человека // Вестник НГУ.
Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9. - С. 30-36.
4. Sedykh, S. E., Buneva, V. N., Nevinsky, G. A. Human milk IgGs contain various combinations of different antigen-binding sites resulting in multiple variants of their bispecificity // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. - e42942.