Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии

На правах рукописи

Чаусова Виктория Евгеньевна

Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН Научный руководители: доктор химических наук, старший научный сотрудник Монастырная Маргарита Михайловна кандидат медицинских наук, доцент Исаева Марина Петровна

Официальные оппоненты: Булгаков Виктор Павлович д.б.н., член-корреспондент РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт ДВО РАН заведующий отделом биотехнологии Новикова Ольга Даниловна д.х.н., с.н.с.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, г. Москва

Защита состоится л28 июня 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан л мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди структурно разнообразных ингибиторов сериновых протеиназ, описанных на сегодняшний день, наиболее интенсивно исследуются представители семейства Кунитца, обнаруженные во всех живых организмах и обладающие широким спектром биологической активности. Для них характерно наличие шести консервативно расположенных остатков цистеина, которые стабилизируют пространственную структуру, названную Кунитц-фолдом.

Установлено, что полипептиды Кунитц-типа имеют два функциональных участка (реактивный сайт и сайт слабых взаимодействий), непосредственно взаимодействующих с активным центром сериновых протеиназ и определяющих их ингибиторную специфичность.

Интерес к изучению структурно-функциональных особенностей полипептидов Кунитц-типа связан с обнаружением у некоторых из них способности модулировать функциональную активность различных типов ионных каналов (Nav-, Cav-, Kv- и TRPV1-каналы). В этой связи их принято называть токсинами Кунитц-типа. Морские кишечнополостные, актинии, продуцируют яд, содержащий полипептиды Кунитцтипа в виде ряда изоформ, которые функционально представлены как ингибиторами сериновых протеиназ, так и токсинами ионных каналов. Следует отметить, что яд исследуемой нами тропической актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) является источником новых представителей полипептидов Кунитц-типа, обладающих также антигистаминной и модулирующей TRPV1-каналы активностями.

Соединения белковой природы, выделяемые из яда актиний различных видов, интенсивно исследуются на протяжении последних десятилетий, но, несмотря на значительное количество публикаций, практически ничего не известно о природе разнообразия продуцируемых изоформ полипептидов Кунитц-типа, а также структуре кодирующих их генов. В связи с этим изучение полиморфизма полипептидов Кунитц-типа актиний представляет научный и практический интерес, поскольку обеспечивает понимание взаимосвязи между их структурными особенностями и полифункциональностью. Необходимо отметить, что способность взаимодействовать с различными мишенями указывает на возможный терапевтический потенциал полипептидов Кунитц-типа при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеиназ или дисфункцией ионных каналов. Полипептиды Кунитц-типа также могут рассматриваться в качестве потенциальных инструментов исследования молекулярных механизмов функционирования ионных каналов.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью настоящего исследования являлось получение, структурно-функциональный анализ и изучение природы разнообразия полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать новые полипептиды, проявляющие трипсинингибирующую активность, установить полноразмерные последовательности кодирующих их кДНК.

2. Установить первичные структуры зрелых HCGS-, HCRG- и HCTXполипептидов, провести их структурно-функциональный и филогенетический анализ.

3. Установить структурную организацию генов полипептидов Кунитц-типа.

4. Создать экспрессионные конструкции некоторых полипептидов и провести их гетерологичную экспрессию в Escherichia coli. Получить функционально активный рекомбинантный полипептид.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бифункциональный полипептид HCPG из H. crispa обладает помимо трипсинингибирующей активности анальгетическим действием на тепловой модели in vivo.

2. Полипептиды HCPR1 и HCPR2 проявляют более высокую трипсинингибирующую активность по сравнению с активностью ранее выделенных из H. crispa изоформ ингибиторов сериновых протеиназ.

3. Полипептиды Кунитц-типа, присутствующие в ядовитом секрете щупалец актинии H. crispa, образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам соединений.

4. HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептиды Кунитц-типа кодируются разными мультигенными семействами. Гены этих полипептидов содержат интрон, который разделяет области последовательности с высокой и низкой консервативностью.

5. Рекомбинантный полипептид идентичен по функциональной активности нативному ингибитору протеиназ InhVJ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы выделены и охарактеризованы новые представители полипептидов Кунитц-типа из актинии H. crispa, один из которых является бифункциональным полипептидом.

Впервые установлены нуклеотидные последовательности и на их основе выведены аминокислотные последовательности HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам полипептидов. Показано, что представители комбинаторной библиотеки кодируются генами разных мультигенных HCGS-/HCRG- и HCTX семейств. Впервые установлено, что гены полипептидов Кунитц-типа актиний имеют экзон-интронную организацию и характеризуются наличием одного интрона в области, соответствующей C-концевому участку сигнального пептида. Выделен и охарактеризован функционально-активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам нативному ингибитору протеиназ InhVJ.

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, имеют как теоретическое, так и практическое значение. Установленные первичные структуры значительно расширяют существующую базу последовательностей полипептидов Кунитц-типа и создают молекулярную основу для получения новых фармакологических агентов направленного действия, а также инструментов исследования структуры и функциональной активности ионных каналов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: III Международной конференции Химия, структура и функция биомолекул, г. Минск, 2008; XII и XIII Всероссийской молодежной школе-конференции Актуальные проблемы химии и биологии, г. Владивосток, 2009, 2010; Международном семинаре по морским природным ресурсам, г. Ханой, 2010; V Российском симпозиуме Белки и пептиды, г. Петрозаводск, 2011; 9-ом Международном конгрессе по токсинологии Токсины животного, растительного и микробного происхождения, г. Владивосток, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей, из них 3 в журналах, определенных списком ВАК, 2 в сборниках научных трудов по материалам конференций, 8 тезисов докладов и получен один патент Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 1публикаций. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 14 таблиц и 63 рисунка.

Благодарности. Автор выражает благодарность научным руководителям д.х.н.

Монастырной М.М. и к.м.н. Исаевой М.П. за помощь, поддержку и ценные советы при выполнении и оформлении данной работы. Автор глубоко признателен за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов работы к.х.н. Гладких И.Н. и к.фм.н. Зелепуга Е.А., а также м.н.с. Гузеву К.В., к.х.н. Лейченко Е.В., м.н.с. Ли И.А., к.х.н. Анастюку С.Д., к.х.н. Дмитренку П.С., к.б.н. Черникову О.В., аспиранту Табакмахеру В.М. и студентке Фокиной И. Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией д.х.н. Козловской Э.П. за ценные замечания и рекомендации при выполнении данной работы.

Используемые сокращения: а.о. - аминокислотный остаток, АП - аминокислотная последовательность, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, МЭП - молекулярный электростатический потенциал, НП - нуклеотидная последовательность, п.н. - пар нуклеотидов, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ТФУ - трифторуксусная кислота, BPTI - бычий панкреатический ингибитор трипсина, DTX - дендротоксин, классический лиганд Kv-каналов, Kv - потенциалзависимый калиевый канал, TRX - тиоредоксин, белок бактериального происхождения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение и характеристика природных полипептидов Кунитц-типа из H. crispa 1.1. Выделение бифункционального полипептида Кунитц-типа Ранее из экстрактов актинии H. crispa были выделены традиционными методами белковой химии ингибиторы сериновых протеиназ: Jn-IV, InhVJ, бифункциональные RmIn I, RmIn II и модуляторы функциональной активности TRPV1-канала APHC1APHC3.

В данной работе для получения новых природных представителей полипептидов Кунитц-типа из этанольного экстракта H. crispa была использована схема выделения, включающая гидрофобную хроматографию полипептидов на полихроме-1 в статическом варианте, ионообменную хроматографию на Cellulose CМ-32 и обращенно фазовую ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18. Полипептиды, проявляющие трипсинингибирующую активность, элюировали с полихрома-1 20%-ным этанолом (после элюции балластных белков и полипептидов 15%-ным этанолом). После хроматографического разделения полипептидов на Cellulose CМ-32 (не показано) дальнейшую очистку активной фракции полипептидов проводили обращеннофазовой ВЭЖХ (рис. 1, А) и последующей рехроматографией (рис. 1, Б), в результате которой был получен бифункциональный полипептид Кунитц-типа, названный HCPG (первые две буквы обозначают вид H. crispa). Полипептид проявлял как трипсинингибирующую активность, так и анальгетическое действие на тепловой модели in vivo (в дозе 0,1 мг/кг). Полипептиды остальных белковых фракций (пики 2Ц 5) обладали только трипсинингибирующей активностью (рис. 1, А).

Рис. 1. Профили элюции и масс-спектры ингибиторов протеиназ. А. ВЭЖХ полипептидов активной фракции, полученной в результате ионообменной хроматографии, на обращенной фазе носителя Nucleosil C18 (4,6250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (5Ц60%) в присутствии 0,1% ТФУ.

Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Б. Рехроматография белковой фракции (1 пик) в тех же условиях.

Отмечены границы объединения фракций, проявляющих трипсинингибирующую активность (сплошная линия) и анальгетическое действие (звездочки). В, Г, Д, Е. Масс-спектры полипептидных фракций пиков 1, 2, 3 (рис. 1, А) и HCPG (рис. 1, Б, пик 1) соответственно.

Гомогенность HCPG подтверждена масс-спектрометрическим анализом и установлением АП N-концевого фрагмента. Согласно данным MALDI TOF MS молекулярная масса полипептида составила 6085,6 Да (рис. 1, Е), в то время как белковые фракции (рис. 1, А, пики 2 и 3) содержали от 2-х до 3-х мажорных изоформ, значения молекулярных масс которых варьировали от 6084 до 6201 Да (рис. 1, Г, Д).

Показано, что фракции, проявляющие трипсинингибирующую активность, представляют собой смеси изоформ полипептидов Кунитц-типа с близкими физикохимическими характеристиками, что значительно осложняет их хроматографическое разделение и получение в индивидуальном состоянии. Таким образом, модифицированная в данной работе схема выделения позволила получить бифункциональный полипептид HCPG Кунитц-типа, N-концевая последовательность которого высоко гомологична последовательностям анальгетических полипептидов APHC1-APHC3, ранее выделенных из H. crispa.

1.2. Выделение HCRG-полипептидов Кунитц-типа из H. crispa Ранее было обнаружено, что водный экстракт H. crispa, используемый для выделения -пороформирующих токсинов (актинопоринов), показывает наличие значительной трипсинингибирующей активности и при ацетоновом осаждении, наряду с цитолитическими полипептидами, в осадок переходят ингибиторы протеиназ Кунитц-типа. Для выделения этих полипептидов была использована схема, включающая ацетоновое осаждение, хроматографию на Akrilex P-4, Cellulose CМ-(не показаны) и Nucleosil C18. В результате хроматографии на Cellulose CМ-32 была получена фракция полипептидов, обладавших помимо гемолитической активности и трипсинингибирующей. При дальнейшем разделении полипептидов этой фракции обращенно-фазовой ВЭЖХ было получено два полипептида, названные HCPR1 (пик 1) и HCPR2 (пик 2), проявляющие только трипсинингибирующую активность (рис. 2, А). По данным масс-спектрометрического анализа молекулярная масса ингибиторов HCPR1 и HCPR2 составила 6196,0 и 6148,7 Да соответственно (рис. 2, В, Г).

Рис. 2. Профили элюции и масс-спектры ингибиторов протеиназ. А. ВЭЖХ ингибиторов протеиназ активной фракции, полученной в результате ионообменной хроматографии, на обращенной фазе носителя Nucleosil C18 (4,6250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (10-70%) в 0,1% TФУ. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Отмечены границы объединения белковых фракций, проявивших трипсинингибирующую активность. В, Г. Масс-спектры полипептидов HCPR1 (В) и HCPR2 (Г) (пики 1 и 2 соответственно).

Показано, что степень сродства выделенных полипептидов HCPR1 и HCPR2 к трипсину (IC50 = 0,25 и 0,12 мкг соответственно) выше в 12 и 25 раз, чем у ингибитора протеиназ InhVJ (IC50 = 3 мкг), ранее выделенного из H. crispa.

1.3. Установление N-концевых последовательностей HCPG, HCPR1 и HCPRДля установления N-концевых фрагментов трех выделенных полипептидов Кунитц-типа, HCPG, HCPR1 и HCPR2, было проведено восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом и алкилирование образовавшихся сульфгидрильных групп 4-винилпиридином. Модифицированные полипептиды выделяли из реакционной смеси с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18. N-концевая АП выделенных ингибиторов протеиназ (по 20 а.о.) была установлена методом автоматической деградации по Эдману и соответствовала для HCPG - GSICLEPKVVGPCTAYFRRF-, HCPR1 - RGICSEPKVVGPCKARIRRF- и HCPR2 - RGICLEPKVVGPCKARIRRF-. Интересной особенностью полипептидов HCPR1 и HCPR2, не характерной для представителей ингибиторов из других видов актиний, является наличие на N-конце остатка Arg. В соответствие с этой особенностью полипептиды, имеющие N-концевые остатки Gly-Ser, были названы HCGS-полипептидами, а Arg-Gly - HCRG-полипептидами. Сравнительный анализ Nконцевых фрагментов новых полипептидов и ингибиторов протеиназ, выделенных из этой же актинии ранее, показал, что они высоко гомологичны друг другу (от 85% до 100%), и, следовательно, являются изоформами полипептидов Кунитц-типа H. crispa.

2. Структурно-функциональная характеристика представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа H. crispa Близкие значения физико-химических характеристик нативных полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa создают серьезную проблему при получении данных соединений в индивидуальном состоянии. Кроме того, поиск и установление первичной структуры минорных изоформ полипептидов Кунитц-типа сложно осуществить методами белковой химии, которые требуют значительного количества исходного сырья. В то же время применение методов молекулярной биологии позволяет получить полную генетическую информацию о многообразии существующих изоформ, а использование небольших количеств биологического материала способствует сохранению численности популяций морских гидробионтов.

2.1. Установление полноразмерных последовательностей, кодирующих HCGS- и HCRG-полипептиды H. crispa Для идентификации полноразмерных последовательностей кДНК полученных в данной работе полипептидов H. crispa была применена разновидность технологии быстрой амплификации 3`- и 5`-концов кДНК - Step-Out RACE. В качестве матрицы была использована амплифицированная кДНК, ранее синтезированная на основе тотальной РНК, выделенной из щупалец актинии H. crispa. Для проведения 3`-RACE были сконструированы вырожденные прямые праймеры на основе консервативных N-концевых фрагментов природных ингибиторов протеиназ HCPG, InhVJ, Jn-IV и APHC1 из H. crispa. В результате были установлены НП 13 изоформ. Все 3`-RACE фрагменты имели стоп-кодоны (TAA), сайты полиаденилирования (AATAAA) и поли(А)-тракты. Для транслированных последовательностей обнаружена высокая степень гомологии как между собой (80-98%), так и с последовательностями природных полипептидов (64-84%). Сравнительный анализ 3`-RACE последовательностей показал, что в основном аминокислотные замены локализованы в области реактивного сайта и сайта слабых взаимодействий.

Далее на основе 3`-RACE последовательностей были сконструированы прямые ген-специфичные праймеры для проведения 5`-RACE. На каждом шаге проведения амплификации использовали несколько таких праймеров с целью идентификации максимального количества изоформ. В результате установлены НП 14 изоформ (рис.

3). Все 5`-RACE последовательности содержали 5`-нетранслируемые области и участки, кодирующие сигнальные пептиды и N-концевые фрагменты зрелых полипептидов, АП которых отличались высокой вариабельностью в области реактивного сайта (рис. 3). Уровень гомологии 5`-RACE последовательностей составил 56Ц98%, при этом первые 15 кодируемых остатков в сигнальных пептидах являлись высококонсервативными. Как видно из рисунка 3, N-концевые фрагменты зрелых полипептидов отличаются первыми а.о., согласно которым они были названы HCGS-, HCRG-, HCGG- и HCGN-полипептидами. Представители GG- и GN-групп ранее не были выделены из H. crispa в нативном состоянии, в отличие от HCGS- и впервые полученных в данной работе HCRG-полипептидов. Сигнальные пептиды представителей GS- и GG-групп отличались от представителей RG-группы только одной заменой - Ser19 на Thr. Группа GN была представлена всего одной НП - S14, уникальность которой заключается в кодировании вставки из 7 а.о. в конце сигнального пептида. Эта дополнительная последовательность может рассматриваться как прочасть полипептида ввиду присутствия двух положительно заряженных а.о. Lys и Arg, служащих потенциальным сайтом расщепления субтилизиноподобными протеиназами в процессе созревания токсина.

Рис. 3. Множественное выравнивание 5`-RACE последовательностей полипептидов Кунитц-типа H. crispa. Вариабельные а.о. показаны на сером фоне, а остатки Cys - на темно-сером. Области сигнального пептида и реактивного сайта выделены рамками.

Для установления полноразмерных последовательностей было проведено множественное выравнивание 3`- и 5`-RACE кДНК. В результате были получены полноразмерные кДНК всего лишь для трех HCGS- (GSP1-GSP3) и трех HCRGполипептидов (RGP1-RGP3) (рис. 4). Полноразмерные кДНК содержали 427Ц435 п.н.

с открытой рамкой считывания из 234 п.н., кодирующих белок-предшественник длиной 78 а.о. Все выведенные АП состояли из сигнального пептида (22 а.о.) и зрелой части (56 а.о.). Степень идентичности полноразмерных НП внутри GS-группы составила 95-97%, RG - 95-99%, а между группами - 91-98%. На основании идентичности АП установлено, что НП GSP3 кодирует природный ингибитор InhVJ из H. crispa. Показано, что АП зрелых HCGS- и HCRG-полипептидов имеют высокую степень гомологии (70Ц95%) с полипептидами APHC1 (Swiss-prot B2G331) и Jn-IV (Swiss-prot P16344) из H. crispa, а также с SHPI-1 (Swiss-prot P31713), SHPI-2 (Swissprot P81129) из Stichodactyla helianthus. Выведенные АП зрелых HCGS-полипептидов имели в положении P1 остатки Lys (GSP1 и GSP2) и Thr (GSP3), а АП зрелых HCRGполипептидов - только Lys. Следует отметить, что GSP1 и RGP1-RGP3 полипептиды характеризовались идентичной BPTI (Swiss-prot P00974) последовательностью в области реактивного сайта (-PCKARI-).

Рис. 4. Множественное выравнивание полноразмерных последовательностей, кодирующих полипептиды GSP1-GSP3, RGP1-RGP3 и APHC1 (Swiss-prot B2G331). Область сигнального пептида, реактивного сайта и сайта слабых взаимодействий с сериновыми протеиназами выделена рамками. Сайт полиаденилирования и поли (А)-тракт выделены курсивом и подчеркиванием.

Консенсусная АП представлена над НП для HCGS-полипептидов, под НП - для HCRGполипептидов, где знаком X отмечены вариабельные а.о. Для HCGS-полипептидов: Xсоответствует P1 а.о. Lys (GSP1, 2) и Thr (GSP3, APHC1), X2 - Arg (GSP1), Gly (GSP2) и Tyr (GSP3, APHC1), X3 - Ile (GSP1, 2) и Phe (GSP3, APHC1), X4 - Arg (GSP1, 2, APHC1) и Pro (GSP3), X5 - Pro (GSP1, 3) Leu (GSP2), Val (APHC1), X6 - Ile (GSP1, 3, APHC1) и Leu (GSP2), X7 - Gly (GSP1), Lys (GSP2) и Glu (GSP3, APHC1); X8 - His (GSP1-GSP3) и Arg (APHC1). Для HCRG-полипептидов: XЦ Ser (RGP3) и Leu (RGP1, 2), X2 - Lys (RGP1) и Glu (RGP2, 3); X3 - Thr (RGP1) и Lys (RGP2, 3);

X4 и X5 - Gly (RGP1) и Lys (RGP2, 3), X6 - Ala (RGP1) и Gln (RGP2, 3).

2.2. Установление первичных структур зрелых HCGS-полипептидов Для амплификации зрелых форм HCGS-полипептидов использовали генспецифичные праймеры, сконструированные на основе установленных полноразмерных последовательностей кДНК. Полученные ПЦР фрагменты длиной около 180 п.н. выделяли из геля, клонировали и секвенировали. В результате были выведены 33 АП изоформ НСGS-полипептидов (рис. 5), десять из которых были представлены несколькими копиями НП (от 2 (2,5%) до 17 копий (18,5%)) (рис. 6).

Наиболее представленные последовательности HCGS 1.20 (18,5%), HCGS 1.(13,5%) и HCGS 2.2 (8,6%) были идентичны зрелым полипептидам полноразмерных кДНК GSP1-GSP3 (рис. 4). Для всех HCGS-полипептидов характерна высокая степень гомологии как между собой (78-98%), так и с известными полипептидами Кунитцтипа актиний - 43-93%.

Рис. 5. Множественное выравнивание HCGS-полипептидов и природных ингибиторов протеиназ Jn-IV (P16344) и APHC1ЦAPHC3 из H. crispa, BPTI (Swiss-prot P00974) из B. taurus.

Идентичные и консервативные а.о. показаны на сером фоне, остатки Cys - на желтом. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий. Ниже показана топология элементов вторичной структуры.

С целью выполнения структурно-функционального анализа для HCGSполипептидов методом гомологичного моделирования были построены 3D-модели.

Показано, что HCGS-полипептиды, подобно структуре BPTI, имеют Кунитц-фолд:

содержат две спирали, расположенные на N- и C-концах молекулы, два антипараллельных -стренда и две протяженные петли. Как видно из рисунка 5, в НСGS-полипептидах основные замены приходятся на участки двух сайтов, отвечающих за специфичность взаимодействия с сериновыми протеиназами.

Известно, что P1 остаток, расположенный в центре реактивного сайта, взаимодействует с S1 остатком активного центра сериновых протеиназ и вносит основной вклад в энергию ассоциации комплекса ингибитор-фермент (отвечает за 50% специфического связывания). На мутантных формах BPTI ранее было показано, что положительно заряженные P1 остатки Arg или Lys отвечают за высокое аффинное связывание с трипсином и трипсиноподобными протеиназами, в то время как полярный P1 остаток Thr снижает сродство полипептидов к этим протеиназам, но повышает специфичность к эластазе нейтрофилов человека. В соответствии с химической природой P1 остатка все HCGS-полипептиды были разделены на три группы: I (P1 Lys), II (P1 Thr) и III (P1 Arg) (рис. 5). Среди HCGS-полипептидов также наблюдалась вариабельность в отношении остатка 38, расположенного в сайте слабых взаимодействий с сериновыми протеиназами. Так, представители всех трех групп имели отрицательно заряженный Glu и нейтральный Gly, а среди представителей I группы в этом положении дополнительно встречался положительно заряженный Lys.

Установлено, что НСGS-полипептиды этих групп различаются между собой представленностью транскриптов, числом кодируемых ими основных и минорных изоформ, а также формой их молекулярного электростатического потенциала (рис. 6).

Молекулярный электростатический потенциал (МЭП) является важной характеристикой белковой молекулы и определяет ее специфичность и кинетику молекулярного связывания. Как правило, полипептиды с близкими электростатическими свойствами имеют сходный механизм связывания с мишенями и, возможно, одинаковую биологическую активность. Мы предполагаем, что НСGSполипептиды образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa (рис. 6). Наиболее многочисленной и структурно разнообразной является I (P1 Lys) группа. На ее долю приходится 66,1% уникальных АП с 82Ц98% гомологии. Для всех полипептидов этой группы характерно несколько типов МЭП (рис. 6). Общий заряд молекул варьирует от +2,03 до +6,02. Присутствие положительно заряженных остатков, Lys14, Arg18 и Arg19, приводит к формированию большого положительного заряда в области реактивного сайта полипептидов, а Arg16, Lys28, Lys30, Lys38 и Lys41 - к разнообразию форм эквипотенциальных поверхностей (рис. 6). Поскольку из H. crispa полипептиды I группы еще не выделены, можно только предположить, что они будут более эффективными ингибиторами сериновых протеиназ, чем ранее исследованные Jn-IV, InhVJ и APHC1ЦAPHC3, ввиду присутствия у них в позиции P1 остатка Lys, а также наличия идентичной с BPTI последовательности реактивного сайта (-PCKARI-).

Возможно, полипептиды HCGS 2.2, HCGS 1.20, HCGS 1.13 и HCGS 1.30 являются гомологами природного ингибитора сериновых протеиназ RmIn II из H. crispa, проявляющего антигистаминную активность, на это указывает высокая степень гомологии их N-концевых последовательностей, включая Lys в положении P1.

Второй по представленности АП (24%) является группа II (P1 Thr), члены которой имеют высокую гомологию (84Ц98%) с природными ингибиторами протеиназ Jn-IV, InhVJ и APHC1ЦAPHC3. Представители этой группы характеризуются точечным распределением МЭП, а общий заряд молекул варьирует от +0,02 до +2,15. Замены Pro18 и His48 на аргинин приводят к формированию протяженного положительного заряда у лоснования молекулы и в области 1-стренда (рис. 6). В отличие от BPTI, наличие Thr в позиции P1 и Glu в положении 38 снимает положительный заряд в области сайта слабых взаимодействий. На уровне третичной структуры у полипептидов существует отрицательно заряженная область, образованная остатками Glu6, Asp23 и Glu25. Предполагается, что НСGS-полипептиды этой группы способны не только ингибировать сериновые протеиназы (подобно Jn-IV и InhVJ), но и модулировать функциональную активность TRPV1-канала (подобно APHC1ЦAPHC3).

АП полипептида HCGS 2.5 соответствует последовательности APHC2, а HCGS 1.27 - InhVJ, которые являются природными НСGS-изоформами H. crispa.

Рис. 6. Диаграмма представленности HCGS-транскриптов в щупальцах H. crispa. Минорные изоформы представлены оранжевым цветом на диаграмме. Для основных изоформ показана форма молекулярного электростатического потенциала. Модели пространственных структур полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм (обозначены зеленым цветом) с эквипотенциальными поверхностями (положительный потенциал обозначен синим цветом, отрицательный - красным).

Визуализация выполнена с помощью SPDBV программы. Круговая диаграмма отражает распределение HCGS-полипептидов на группы согласно P1 остатку.

Наименьшее число изоформ наблюдается в III (P1 Arg) группе - 9,9% (рис. 6), АП которых высоко гомологичны последовательностям полифункциональных ингибиторов протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 из актинии S. helianthus. В отличие от НСGSполипептидов, АП этих ингибиторов имеют в центре реактивного сайта Lys. Степень гомологии последовательностей III группы составляет 86Ц96%, значение суммарного заряда для них варьирует от +3,03 до +4,06. Характерными особенностями представителей этой группы является наличие остатков Gly в 15 и 38 и Pro в положениях (рис. 6). Распределение МЭП определяется положительной триадой - Lys9, Arg12 и Arg14, которая формирует высоко заряженную положительную область вокруг связывающей петли, включая N-концевой участок молекулы (с 1 по 10 а.о.).

Последовательности полипептидов HCGS 2.1, HCGS 1.19 и HCGS 1.61 содержат остатки Arg12, Ser16 и Phe17, которые, как установлено для ингибитора HWTX-XI (GenBank ABY77743) из паука Haplopelma schmidti, играют ключевую роль в его эффективном связывании с трипсином. По-видимому, эти HCGS-полипептиды, подобно ингибиторам протеиназ SHPI-1 и SHPI-2, должны ингибировать широкий спектр протеиназ и, подобно HWTX-XI, более эффективно, чем BPTI, ингибировать трипсин.

Сравнительный анализ расчетных физико-химических характеристик НСGSполипептидов показал, что они имеют близкие, а в некоторых случаях и равные значения молекулярной массы (5702,2 - 6386,9 Да), но различаются значениями заряда молекулы (+0,01 - +6,02) и изоэлектрической точки (07,01 - 11,49), а также количеством заряженных (20 - 27) и гидрофобных (13 - 18) остатков. Обнаружено, что для представителей комбинаторной библиотеки наблюдается следующая закономерность: общий заряд сгруппированных НСGS-полипептидов, в целом, отражает их разделение в соответствии с химической природой P1 остатка.

Таким образом, установлены первичные структуры тридцати трех зрелых изоформ HCGS-полипептидов (из них тридцать одна - новая), некоторые из которых являются минорными. Показано, что первичные структуры HCGS-полипептидов характеризуются высоким полиморфизмом, отличаются электростатическими свойствами и величиной заряда молекул.

2.3. Установление первичных структур зрелых HCRG-полипептидов Первичные структуры HCRG-полипептидов были установлены методом гнездовой ПЦР (nested PCR) с использованием ген-специфичных праймеров, сконструированных с учетом высокой гомологии НП HCGS- и HCRG-полипептидов.

В результате проведения двух раундов ПЦР были получены специфичные фрагменты длиной 180 п.н., которые затем клонировали и секвенировали. Первичные структуры 33 изоформ HCRG-полипептидов были выведены на основе анализа их НП (рис. 7).

Процентное содержание некоторых изоформ варьировало от 2,5 (2 копии) до 17,5% (14 копий). Для всех первичных структур HCRG-полипептидов наблюдалась высокая степень гомологии как между собой (79Ц98%), так и с известными ингибиторами протеиназ Кунитц-типа других видов актиний (67Ц86%). Следует отметить, что Nконцевые фрагменты большинства HCRG-полипептидов высоко гомологичны природным ингибиторам HCPR1 и HCPR2, выделенным в данной работе.

Обнаружено, что HCRG-полипептиды различаются по окружению первого остатка Cys, а именно а.о. в пятом положении. На этом основании выделены две группы:

первую группу образуют HCRL-полипептиды с Leu5, а вторую - HCRS-полипептиды с Ser5. Наиболее многочисленной по числу изоформ является HCRS-группа (полипептида), а HCRL-группа образована одиннадцатью изоформами. Среди HCRGполипептидов наиболее представленными были HCRL 1 (17,5%) и HCRS 2 (11,3%), идентичные зрелым полипептидам полноразмерных кДНК RGP1 и RGPсоответственно. У всех HCRG-полипептидов основные отличия наблюдаются в сайте слабых взаимодействий, главным образом, в 38 положении: в обеих группах в основном встречаются остатки Lys и Gly, тогда как в HCRS-группе дополнительно появляются Glu и Arg. В то же время высокая консервативность остатков обнаружена в области реактивного сайта, включая Р1 остаток. В 97% случаев в позиции Pприсутствовал Lys и только в 3% - Thr (HCRS 21). Практически все HCRGполипептиды имели идентичную с BPTI последовательность реактивного сайта (-PCKARI-).

С целью выполнения структурно-функционального анализа для HCRGполипептидов методом гомологичного моделирования были построены 3D-модели.

Показано, что подобно структурам HCGS-полипептидов и BPTI, они имеют Кунитцфолд. Установлено, что между N-концевым остатком Arg1 и Ile53, расположенным в C-концевом участке молекулы, образуется водородная связь, которая вносит дополнительный вклад в стабильность молекулы и способствует формированию взаимодействий между спиралями N- и C-концевых участков молекулы, что также характерно для BPTI, но не для HCGS-полипептидов. Для всех HCRG-полипептидов были рассчитаны физико-химические характеристики: значения молекулярной массы варьировали от 6055,6 до 6399,85 Да, значения изоэлектрической точки - от 8,56 до 9,54, а величины заряда молекулы - от 2,71 до 7,79.

Рис. 7. Множественное выравнивание HCRG-полипептидов и BPTI (Swiss-prot P00974).

Идентичные и консервативные а.о. показаны на сером фоне, остатки Cys - на желтом фоне. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий.

Таким образом, установлены первичные структуры тридцати трех зрелых изоформ HCRG-полипептидов, N-концевые фрагменты которых высоко гомологичны новым природным ингибиторам HCPR1 и HCPR2. Первичные структуры изоформ HCRGполипептидов характеризуются меньшим полиморфизмом, чем таковые HCGSполипептидов.

2.4. Установление первичных структур зрелых HCTX-полипептидов Недавно из актинии Stichodactyla haddoni был выделен бифункциональный полипептид Кунитц-типа, SHTX III, который относится к токсинам Kv-каналов II типа. Для этого токсина наряду с трипсинингибирующей активностью характерно 1блокирование связывания I--DTX с Kv-каналом. Мы полагаем, что актиния H. crispa также может быть источником новых полипептидов Кунитц-типа с Kvблокирующей активностью, т.к. она принадлежит к тому же семейству Stichodactylidae, что и S. haddoni. Для идентификации новых полипептидов, мы использовали генетический материал актинии H. crispa, яд которой был недоступен в препаративном количестве.

Для установления последовательностей, кодирующих HCTX-полипептиды (первые две буквы в аббревиатуре обозначают вид, последние буквы - токсин), были сконструированы ген-специфичные праймеры на основе последовательности SHTX III (Swiss-prot B1B5I8). Генетический материал из актинии Stichodactyla mertensii был использован в качестве контроля. В результате только для кДНК H. crispa получены ПЦР-фрагменты длиной около 250 п.н. Изменение условий ПЦР на кДНК S. mertensii не привело к появлению специфичного продукта реакции. В то же время на геномных ДНК H. crispa и S. mertensii были амплифицированы специфичные фрагменты длиной около 1000 п.н. Наблюдаемая разница (около 7п.н.) в длине фрагментов свидетельствует о наличии интрона/ов в структуре генов, кодирующих HCTX-полипептиды. Тот факт, что нам не удалось получить фрагменты на кДНК S. mertensii, может указывать на отсутствие транскрипции мРНК этих полипептидов в щупальцах данного организма на момент выделения генетического материала. Все ПЦР фрагменты были выделены из геля, клонированы и секвенированы.

В результате были установлены НП шести изоформ зрелых полипептидов Кунитцтипа H. crispa (рис. 8). Наиболее представлена была НП, кодирующая полипептид HCTX1. На ее долю приходилось 67,7% (42 НП) от общего числа клонов. НП только этой изоформы встречалась и на геномном, и на транскриптомном уровнях. Второй по частоте встречаемости была НП, кодирующая HCTX5 (15 копий, 24,2%), представленная только на геномном уровне. Секвенирование 20 клонов геномной ДНК S. mertensii позволило установить НП, кодирующие 3 изоформы зрелых полипептидов, обозначенных как - SMTX1-SMTX3 (рис. 8). Наиболее представленной была SMTX1 (90%, 18 копий).

Рис. 8. Множественное выравнивание полипептидов Кунитц-типа актиний H. crispa и S. mertensii.

Ингибиторы протеиназ Jn-IV (Swiss-prot P16344) и HCRL 1 из H. crispa, BPTI (Swiss-prot P00974) из B. taurus. Токсины Kv-каналов: DTX K (Swiss-prot P00981) из змеи Dendroaspis polylepis, APEKTx1 (Swiss-prot P86862) из актинии Anthopleura elegantissima, AsKC1ЦAsKC3 (Swiss-prot:

Q9TWG0, Q9TWF9 и Q9TWF8 соответственно) из актинии Anemonia sulcata, SHTX III (Swissprot B1B5I8) из актинии S. haddoni. Консервативные а.о. выделены серым фоном, а остатки Cys - желтым. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий. Остатки, отвечающие за Kv-блокирующую активность, выделены красным цветом.

Следует отметить, что HCTX- и SMTX-полипептиды имеют высокую степень гомологии с SHTX III (от 90 до 98%), но крайне низкую - с токсинами актиний семейства Actiniidae (от 38 до 54%), величина которой сравнима с таковой для токсина DTX K (от 34 до 37%) из змеи D. polylepis. Следует отметить, что степень гомологии HCTX-полипептидов с представителями HCGS- и HCRG-полипептидов составляет лишь 42Ц48%, что указывает на существование разных кодирующих их мультигенных семейств.

Проведенный сравнительный анализ полипептидов HCTX1ЦHCTX6 и SMTX1Ц SMTX3, и токсинов Kv-каналов II типа из других видов актиний и DTX K из змеи D. polylepis позволил установить наличие в N-концевом участке молекул функционально важных для проявления Kv-блокирующей активности остатков, входящих в главный сайт связывания с Kv-каналами. Обнаружено, что остатки Leu7 и Leu10 идентичны таковым SHTX III и гомологичны остаткам Ile4 и Leu7 APEKTx1, в то время как Arg9 гомологичен Lys6 DTX K и менее заряженному His9 SHTX III (рис.

8). Возможно, что эти полипептиды будут проявлять и трипсинингибирующую активность, поскольку подобно SHTX III имеют P1 остаток Arg (рис. 8).

Сравнительный анализ расчетных физико-химических характеристик HCTX- и SMTX-полипептидов показал, что значение молекулярной массы варьирует от 6916,до 7062,3 Да, величина заряда молекулы - от -0,29 до +2,71 и значение изоэлектрической точки - от 6,35 до 8,62. Для большинства полипептидов-гомологов H. crispa и S. mertensii характерно наличие одинакового количества отрицательно и положительно заряженных остатков и, в отличие от токсинов Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae и HCGS- и HCRG-полипептидов H. crispa, они являются менее заряженными молекулами (рис. 8).

Таким образом, впервые идентифицированы первичные структуры высокогомологичных изоформ зрелых HCTX-полипептидов, которые характеризуются меньшим значением заряда молекулы и крайне низкой степенью полиморфизма в сравнении с HCGS- и HCRG-полипептидами.

Итак, при анализе кДНК библиотеки из щупалец H. crispa обнаружено множество транскриптов, кодирующих гомологичные изоформы, что указывает на существование комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и, очевидно, функциональной активностью. Полученные данные свидетельствуют о наличии двух отдельных мультигенных семейств (HCGS/HCRG и HCTX), кодирующих полипептиды Кунитц-типа. Судя по разнообразию и представленности транскриптов, их экспрессия не только по-разному регулируется, но и их гены эволюционируют с разной скоростью.

2.5. Филогенетический анализ и молекулярная эволюция полипептидов Кунитц-типа актиний С целью идентификации эволюционных взаимоотношений между представителями комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа H. crispa и филогенетических связей с известными полипептидами Кунитц-типа других актиний было построено филогенетическое дерево по методу минимальной эволюции (ME), где последовательность BPTI использовалась в качестве внешней группы (рис. 9).

Анализ полученного дерева показал, что представители комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa группируются в четыре кластера.

Пятый кластер образован только полипептидами актиний семейства Actiniidae.

Кластер I состоит из HCRG- и HCGS-полипептидов (только представители I группы) H. crispa, для которых характерно наличие P1 остатка Lys. Большинство членов кластера имеет идентичную BPTI последовательность реактивного сайта (-PCKARI-) и остаток Lys в 38 положении сайта слабых взаимодействий.

Кластер II сформирован только HCGS-полипептидами II группы (в которую входят также природные ингибиторы InhVJ и Jn-IV и бифункциональные полипептиды APHC1ЦAPHC3 H. crispa), а также одним HCRG-полипептидом - HCRS 21. Отличительной особенностью является наличие в P1 положении полярного Thr и отрицательно заряженного Glu в 38 позиции.

Кластер III образован HCGS-полипептидами III группы, а также природными полифункциональными ингибиторами протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 актинии S. helianthus. Представители этого кластера отличаются остатком в P1 положении: АП HCGS-полипептидов H. crispa имеют Arg, в то время как их гомологи в актинии S. helianthus - Lys. У всех представителей этого кластера в 38 положении находится Gly.

Кластер IV содержит бифункциональные полипептиды актиний семейства Stichodactylidae (HCTX- и SMTX-полипептиды образуют отдельную группу с бутстреп-поддержкой 100%) и ингибиторы сериновых протеиназ актиний семейства Actiniidae. Все представители этого кластера, несмотря на принадлежность к разным семействам и функциональную гетерогенность, имеют идентичные остатки в P(положительно заряженный Arg) и 38 (нейтральный Gly) положениях.

Кластер V образован ингибиторами сериновых протеиназ и бифункциональными полипептидами Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae. В P1 положении АП всех представителей располагается Arg, в то время как остаток в 38 положении представлен как Gly, так и положительно (Arg и His) и отрицательно (Asp) заряженными остатками.

Обращает на себя внимание тот факт, что у представителей семейства Actiniidae в положении P1 АП полипептидов расположен только положительный остаток Arg, а у представителей семейства Stichodactylidae, наряду с Arg и Lys, встречается также полярный остаток Thr (рис. 9). По-видимому, в последовательностях полипептидов Кунитц-типа актиний семейства Stichodactylidae происходит функциональная диверсификация по P1 остатку.

На основании анализа полученного филогенетического дерева нами предположен следующий сценарий ключевых событий в эволюции полипептидов Кунитц-типа актиний: (1) происхождение от общего предкового гена, кодирующего в Pположении реактивного сайта Arg, а в сайте слабых взаимодействий в позиции 38 - Gly; данное утверждение основано на присутствии этих функционально важных остатков у представителей IIIЦV кластеров; (2) дупликация анцестрального гена и его дальнейшая дивергенция сопровождалась появлением двух паралогичных семейств, - ингибиторов сериновых протеиназ и бифункциональных полипептидов (токсинов);

данное предположение основывается на присутствии практически во всех родах актиний (Heteractis, Stichodactyla, Anthopleura и Actinia) двух групп полипептидов Кунитц-типа, степень гомологии между которыми не превышает 40-45%; (3) появление положительно заряженного остатка Lys и полярного Thr в положении Pспособствовало субфункционализации и неофункционализации молекул;

субфункционализация проявляется у полифункциональных ингибиторов SHPI-1 и SHPI-2 (с P1 остатком Lys), которые ингибируют не только сериновые, но цистеиновые и аспарагиновые протеиназы. Неофункционализация заключается в возникновении нового вида биологической активности - модулирование функциональной активности TRPV1-канала у APHC1ЦAPHC3 полипептидов H. crispa, являющихся представителями II кластера (P1 Thr); (4) действие ускоренной эволюции в рамках отдельного вида привело к появлению комбинаторной библиотеки полипептидов. Молекулярное разнообразие HCGS- и HCRG-полипептидов, составляющих основу этой библиотеки, является серьезным доказательством вышеприведенного постулата. Мы считаем, что появление комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа у актинии H. crispa произошло в результате замены P1 остатка Arg в реактивном сайте, и, как следствие, лослабления действия очистительной селекции на эти ген(ы).

I Кластер HCGS 1.HCGS 1.II Кластер HCRS III Кластер V Кластер IV Кластер 0.Рис. 9. Филогенетическое дерево АП полипептидов Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae и Stichodactylidae, построенное методом минимальной эволюции. HCGS-полипептиды на дереве обозначены красными кругами, HCRG-полипептиды - зелеными и HCTX/SMTX-полипептиды - голубыми. Ингибиторы протеиназ актиний: AEAPI, AEPI-I, AEPI-II из Actinia equina; AFAPI-I, AFAPI-III из Anthopleura fuscoviridis; AXPI-I, AXPI-II, AXPI-III из Anthopleura aff. xanthogrammica; APEKTx1 из A. elegantissima; AsKC1ЦAsKC3 и SA5 II из A. sulcata; Jn-IV, APHC1ЦAPHC3 из H. crispa; SHPI-1, SHPI-из S. helianthus; SHTX III из S. haddoni. АП полипептидов, имеющих в P1 положении остаток Lys, представлены на синем фоне, остаток Thr - на розовом фоне, остаток Arg - на зеленом фоне.

BPTI HCGS 1.HCRS AsKCAsKCHCRL HCRL HCRL 1.HCRL RHCL HCRL S 1.1.S HCRL 1.1.HCRS S HCRL 2.2.S S HCG S 1.S 2.1.S S HCG HCG HCG HCRS S 2.HCG HCRS HCG HCG S 2.HCG S HCG HCG 2.S HCRL HCG HCG S HCG 1.HCG HCG HCG 2.S HCRS HCG 1.S S HCG S 1.APHCS 1.HCG 1.HCG 1.APHCS S 1.HCG HCG S 1.HCG HCRL HCG L R C H Jn-I S APHCV S 1.1.S R C HCG H S R C H S S R S C SHPI R S H R S S -C 2.R C R C H C H H SHPI S HCG S S H R S R -S R S HCG C R HCG S S 2.R C C C R H C R HCG H S H C H S S H C R S H 1.R H C S 1.HCG C H 1.H S 1.AEP AEP I -I I -I I AXP I -I II I I I I I I SMTXI SMTXx I I I P T P I A P I HCTXA X K X HCTXS SMTXI F A A E P HCTXA P A HCTXA SHTX I F HCTXA HCTXI P II A C E K A s A Таким образом, комбинаторная библиотека H. crispa имеет полифилетическое происхождение. Она состоит не только из HCGS-, HCRG-полипептидов, но также и из HCTX-полипептидов, проявляющих, как мы полагаем, и ингибиторную, и каналоблокирующую активности. Молекулярное разнообразие и функциональная диверсификация представителей комбинаторной библиотеки H. crispa свидетельствуют о том, что полипептиды Кунитц-типа могут обеспечивать взаимодействие с широким спектром биологических мишеней, обусловленным экологической нишей тропической актинии H. crispa.

3. Установление структуры генов, кодирующих полипептиды Кунитц-типа Для исследования структуры генов полипептидов Кунитц-типа были сконструированы праймеры, фланкирующие границы белок-кодирующих частей генов HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептидов. ПЦР выполняли параллельно, используя в качестве матриц геномную ДНК и кДНК актинии H. crispa. В ходе ПЦРамплификации были получены фрагменты, отличающиеся по длине: около 200 п.н.

для кДНК и около 800 п.н. для геномной ДНК (рис. 10, А). Разница в длинах фрагментов свидетельствует о присутствии интрона/ов в изучаемых группах генов.

Все ПЦР фрагменты были клонированы и секвенированы. Сравнительный анализ НП, полученных с кДНК и геномной ДНК, показал, что белок-кодирующая часть содержит только один интрон в области, соответствующей C-концевому участку сигнального пептида. Установлено, что все гены HCGS-, HCRG- и HCTXполипептидов имеют одинаковую экзон-интронную организацию (рис. 10, Б).

Рис. 10. А. Электрофореграмма продуктов амплификации генов, кодирующих HCGS- и HCRG-полипептиды, на кДНК и геномной ДНК H. crispa. 1 - ДНК маркер 100 п.н.; 2 - продукт амплификации на кДНК; 3 - продукт амплификации на геномной ДНК. Б. Схематическое изображение экзонинтронной структуры генов, кодирующих полипептиды Кунитц-типа. Область сигнального пептида обозначена блоком серого цвета, а область зрелого пептида - темно-серого цвета.

Для всех экзон-интронных границ НП выполнялось правило GT/AG. Во всех генах интрон условно разделял высоко и менее консервативные области сигнального пептида, включая высоковариабельную область зрелого белка. Данная особенность характерна для генов, кодирующих разные токсины ядовитых животных, таких как гены токсинов скорпионов и конусов. Известно, что участки генов, разделенные интроном, эволюционируют с различной скоростью. Высокий уровень гомологии последовательностей, как между интронами, так и между сигнальными пептидами, может указывать на принадлежность генов к одному мультигенному семейству.

Следует отметить, что интроны генов HCGS- и HCRG-полипептидов имеют низкую гомологию с интронами HCTX-полипептидов Кунитц-типа (31%), что еще раз подтверждает принадлежность этих генов к разным мультигенным семействам.

Известно, что молекулы полипептидов Кунитц-типа содержат шесть консервативно расположенных остатков Cys, которые стабилизируют Кунитц-фолд.

Поэтому был выполнен анализ использования кодонов для остатков Cys в последовательностях зрелых HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептидов. Установлено, что все остатки Cys в последовательностях полипептидов комбинаторной библиотеки H. crispa характеризуются высокой позиционно-специфичной консервативностью, а их кодоны сохраняют инвариантность. Несмотря на высокий полиморфизм зрелых HCGS- и HCRG-полипептидов, остатки Cys в их последовательностях сохраняют одинаковое использование кодонов, за исключением полиморфного остатка Cys IV (у некоторых HCGS-полипептидов). Кодоны цистеинов в последовательностях HCTXполипептидов инвариантны, но не идентичны таковым у HCGS- и HCRGполипептидов. Полученные данные свидетельствуют о защите цистеиновых кодонов от мутационного процесса при ускоренной эволюции полипептидов Кунитцтипа и хорошо согласуются с литературными данными - кодоны цистеинов в гипервариабельных последовательностях зрелых полипептидов, являющихся представителями одного мультигенного семейства, высоко консервативны и сохраняют строгую инвариантность. Эти результаты еще раз подтверждают существование двух отдельных мультигенных семейств, кодирующих HCGS- и HCRG-полипептиды и HCTX-полипептиды H. crispa.

4. Гетерологичная экспрессия и выделение рекомбинантного полипептида Кунитц-типа При выборе системы экспрессии мы отдали предпочтение вектору pET32b(+), который предназначен для получения гибридных белков в составе с белком TRX в E. coli. Преимущество данной экспрессионной конструкции заключается в том, что вектор обеспечивает высокий выход целевого белка, а TRX - правильность замыкания дисульфидных связей, необходимых для формирования биологически активной структуры дисульфид-содержащих белков, к которым относятся полипептиды Кунитц-типа. С целью дальнейшего структурно-функционального исследования рекомбинантных аналогов HCGS-полипептидов были созданы генноинженерные конструкции на основе четырех НП наиболее представленных в комбинаторной библиотеке HCGS-полипептидов (HCGS 1.27 (соответствует природному InhVJ), HCGS 1.20, HCGS 1.3 и HCGS 1.19), отличающихся расчетными физико-химическими характеристиками и остатками в P1 и 38 положениях. Все НП уже содержали на 5`-конце сайт для EcoRI и метиониновый кодон, а на 3`-конце - стоп-кодон TAA и сайт для XhoI, необходимые для субклонирования в вектор pET32b(+). Фрагменты HCGS-полипептидов встраивали после trx и His6-tag (для аффинного связывания с Ni2+-содержащей смолой). Остаток Met был введен перед последовательностью целевого продукта для эффективного гидролиза бромцианом гибридного белка и отщепления белка-носителя TRX. Затем полученными конструкциями, обозначенными как pET32ЦHCGS1.27 (InhVJ), pET32ЦHCGS1.20, pET32ЦHCGS1.3 и pET32ЦHCGS1.19, трансформировали штамм E. coli BL21(DE3).

Для проведения аналитической экспрессии наработку целевых слитных белков индуцировали добавлением ИПТГ. Электрофоретическое разделение компонентов клеточных лизатов в ДСН-ПААГ показало, что молекулярные массы рекомбинантных гибридных полипептидов соответствовали расчетным данным (рис. 11). В результате анализа фракций бактериальных лизатов обнаружено, что рекомбинантные HCGSполипептиды содержатся только в растворимых фракциях.

Для оптимизации условий проведения гетерологичной экспрессии рекомбинантных HCGS-полипептидов был выбран штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)pET32-rInhVJ. В результате проведения серии экспериментов были подобраны оптимальные условия для экспрессии рекомбинантного полипептида rInhVJ в растворимом виде и с высоким выходом: концентрация индуктора составила 0,2 мМ, температура инкубации культуры - 25 С, время инкубации - 12-14 часов.

Установлено, что понижение температуры культивирования (до 25 С) позволило достичь большего выхода растворимого белка.

Рис. 11. Анализ экспрессии гибридных белков в ДСН-ПААГ. Клеточные лизаты BL21(DE3) штаммов-продуцентов E. coli: 1 - TRX-rInhVJ;

2 - TRX-rHCGS1.20; 3 - TRX-rHCGS1.3; 4 - TRX-rHCGS1.19; 5 - контроль (pET32b(+)TRX без добавления ИПТГ); 6 - белкистандарты молекулярной массы; 7 - контроль rTRX.

Общий выход гибридного белка составил 16 мг/л клеточной культуры, что соответствует средней продуктивности pET-систем. Гибридный белок TRX-rInhVJ выделяли при помощи аффинной хроматографии на Ni2+-сорбенте в нативных условиях, далее расщепляли по метиониновому остатку бромцианом на TRX и rInhVJ. Целевой полипептид rInhVJ выделяли из гидролизата при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 12, А).

Рис. 12. Профиль элюции и масс-спектр рекомбинантного полипептида rInhVJ. А. Обращеннофазовая ВЭЖХ гидролизата химерного белка TRX-rInhVJ на колонке Nucleosil C18 (4,6250 мм), уравновешенной 10%-ным ацетонитрилом в 0,1% ТФУ. Элюцию осуществляли в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 70% в 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мин в течение 60 минут.

Б. Масс-спектр рекомбинантного полипептида rInhVJ.

Чистоту и молекулярную массу rInhVJ определяли с помощью MALDI TOF MS (рис. 12, Б). Нативный и рекомбинантный полипептиды имели одинаковую хроматографическую подвижность и значение молекулярной массы (6117,23 Да).

Выход целевого rInhVJ составил 8 мг/л клеточной культуры.

Определение ингибиторной активности rInhVJ проводили по отношению к трипсину, используя в качестве контроля нативный ингибитор InhVJ. Установлено, что значение Кi rInhVJ составило 0,7310-9 M, а нативного InhVJ - 0,6510-9 М.

Таким образом, созданы генетические конструкции для экспрессии представителей разных групп HCGS-полипептидов. Получен функционально активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и величине активности природному ингибитору протеиназ Кунитцтипа актинии H. crispa.

Заключение Проведенное исследование на транскриптомном и геномном уровнях показало, что актиния H. crispa является богатым и перспективным источником новых структурно и функционально разнообразных полипептидов Кунитц-типа, образующих комбинаторную библиотеку соединений, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и, очевидно, функциональной активностью. Разработанные подходы для получения рекомбинантных полипептидов позволяют изучить функциональную активность, в том числе и минорных компонентов комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа, и создают основу для их дальнейшего использования в качестве инструментов исследования функциональной активности протеолитических ферментов и ионных каналов (Kv1- и TRPV1-каналов) и разработки лекарственных препаратов нового поколения.

ВЫВОДЫ 1. Выделены и функционально охарактеризованы три новых полипептида Кунитцтипа актинии H. crispa, HCPG, HCPR1 и HCPR2. На основе N-концевых аминокислотных последовательностей полипептиды отнесены к группе ранее исследованных HCGS-полипептидов, а также новой группе HCRG-полипептидов актинии. Установлены полноразмерные последовательности HCGS- и HCRGполипептидов, характеризующиеся высокой степенью гомологии.

2. Установлено, что ингибитор HCPG является бифункциональным полипептидом, проявляющим, наряду с трипсинингибирующей активностью, анальгетическое действие на тепловой модели in vivo. Показано, что трипсинингибирующая активность полипептидов HCPR1 и HCPR2 на порядок выше активности ранее изученных ингибиторов протеиназ H. crispa.

3. Установлена первичная структура зрелых 33-х HCGS-, 33-х HCRG- и шести HCTX-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и функциональной активностью. Комбинаторная библиотека представлена десятью мажорными и 23-мя минорными изоформами HCGS, двумя основными и 31-й минорной изоформами HCRG и двумя мажорными и четырьмя минорными изоформами HCTX.

4. Впервые установлено, что HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептиды кодируются разными мультигенными семействами, и доказано, что их гены имеют экзонинтронную организацию: интрон разделяет высококонсервативную и вариабельную области гена.

5. Показано, что представители комбинаторной библиотеки H. crispa формируют на филогенетическом дереве четыре кластера: три из них представлены HCGS-/ HCRG- полипептидами и один - HCTX.

6. Установлено, что появление положительно заряженного P1 Lys и полярного PThr в реактивном сайте способствовало субфункционализации и неофункционализации полипептидов Кунитц-типа, а действие ускоренной эволюции на их гены в рамках отдельного вида H. crispa привело к появлению комбинаторной библиотеки.

7. Созданы генетические конструкции для экспрессии представителей разных групп HCGS-полипептидов. Получен функционально активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и величине активности природному ингибитору протеиназ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa // Peptides. 2012. V. 34. P. 88-97.

2. Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1: in silico исследование // Биоорганическая химия. 2012. Т. 38, N 2. С. 185-198.

3. Чаусова В.Е., Табакмахер В.М. Функциональная экспрессия ингибитора сериновых протеиназ Кунитц-типа InhVJ из тропической актинии Heteractis crispa // Актуальные проблемы биологии, химии, физики: материалы международной заочной научно-практической конференции. г. Новосибирск: Изд. ЭКОР-книга, 2011. С. 17-22.

4. Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П. Способ получения полипептида из актинии Heteractis crispa, обладающего анальгетическим действием // Патент РФ №2415866. БИ. №10. 10.04.2011.

5. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Eskov A.A., Chausova V.E., Tkacheva E.S., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from sea anemones:

prospects of investigation // Intern.workshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi: Inst. Nat.

Prod. Chem.,Vietnam Acad. Sci. Technol. 2011. P. 101-110.

6. Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Зелепуга Е.А., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. In silico исследование взаимодействия полипептидов Кунитц-типа комбинаторной библиотеки актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1 // V Российский симпозиум Белки и пептиды: сб. тез. докл. г. Петрозаводск:

Карельский науч. центр РАН. 2011. C. 332.

7. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya M.M., Chausova V.E., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Likhatskaya G.N., Kozlovskaya E.P. Multifunctional group of P1 Thr Kunitz-type inhibitors from the sea anemone Heteractis crispa // 9th IST Asia Pacific meet. on animal, plant and microbial toxins:

proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 49.

8. Isaeva M.P., Chausova V.E., Stenkova A.M., Kozlovskaya E.P. Molecular evolution of Kunitztype toxin genes in sea anemones // 9th IST Asia Pacific meet. on animal, plant and microbial toxins:

proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 50.

9. Chausova V.E., Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Kozlovskaya E.P. Gene families of Kunitz-type toxins from Stichodactylidae sea anemones // 9th IST Asia Pacific meet. on animal, plant and microbial toxins: proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 55.

10. Чаусова В.Е. Получение полноразмерной последовательности гена hcp_G3, кодирующего ингибитор протеиназ из актинии Heteractis crispa // Вестник ДВО РАН. 2010. № 4. С. 138-142.

11. Leychenko E.V., Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Eskov A.A., Tkacheva E.S., Chausova V.E., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from sea anemones:

prospects of investigation // Intern. workshop on marine living resources of Vietnam. Hanoi. 2010. P.

34.

12. Чаусова В.Е., Гузев К.В., Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Исаева М.П. Комбинаторная библиотека RG-полипептидов со структурой Кунитц-типа из актинии Heteractis crispa // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 2010. С. 78.

13. Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Гузев К.В., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Исаева М.П. Клонирование генов, кодирующих ингибиторы сериновых протеиназ из актинии Heteractis crispa // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 2009. С. 81.

14. Гладких И.Н., Лейченко Е. В., Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Исаева М.П., Вакорина Т.И., Козловская Э.П. Ингибиторы сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus:

структура и механизм действия // III Международная конференция Химия, структура и функция биомолекул. Минск. 2008. С. 67.

Соискатель: Чаусова В.Е.

Чаусова Виктория Евгеньевна Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Подписано в печать 23.05.12.

Формат 60х84/16. Тираж 120 экз.

Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 9Отпечатано в печатном салоне Оперативная полиграфия.

ИП Матусевич Ю.И.

690013, г. Владивосток, ул. Трамвайная 14Б, тел. (423)26949 Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии