Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КОРЧАГИНА РОЗА ПАВЛОВНА
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) И ГЕНА VKORC1 В ПОПУЛЯЦИЯХ КОРЕННЫХ ЭТНОСОВ СЕВЕРНОЙ СИБИРИ Генетика Ц
03.02.07
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2012
Работа выполнена в лаборатории популяционной этногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный консультант: кандидат биологических наук, Осипова Людмила Павловна
Официальные оппоненты: Захаров Илья Кузьмич доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией генетики популяций Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Гришанова Алевтина Юрьевна доктор биологических наук, профессор заведующая лабораторией биохимии чужеродных соединений Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа
Защита диссертации состоится л___ _______ 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН, в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д.10, т. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан л___ _____________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Хлебодарова Т. М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Организм человека постоянно подвергается воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе чужеродных соединений - ксенобиотиков. Естественные и синтезированные химические вещества, содержащиеся в воздухе, воде, пище, в лекарствах, в табачном дыме, являются потенциальными мутагенами, канцерогенами, тератогенами [Баранов и др., 2000]. В целом, токсическое действие ксенобиотиков на живые организмы определяется их способностью вмешиваться и нарушать процессы жизнедеятельности, что может быть причиной развития различных заболеваний [Курляндский, Филов, 2002].
Ведущую роль в защите организма от действия чужеродных веществ играет система биотрансформации ксенобиотиков (БК) [Саприн, 1991; Райс, Гуляева, 2003; Бочков, 2004]. Индивидуальные особенности работы системы биотрансформации определяются уникальным для каждого человека сочетанием полиморфных вариантов генов соответствующих ферментов, что ведет к различной адаптационной способности, то есть устойчивости или чувствительности индивидов к воздействию повреждающих внешних факторов [Жученко и др., 2006].
Наличие мутантных (функционально неполноценных) вариантов генов ферментов БК является причиной неблагоприятных ответных реакций организма человека на действие ксенобиотиков и предрасполагает к возникновению заболеваний, в том числе, онкологических [Баранов и др., 2000; Хуснутдинова, Боринская, 2002; Ляхович и др., 2006; Фрейдин и др., 2006; Shi et al., 2008], занимающих второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний [
В качестве маркеров чувствительности к онкологическим заболеваниям обоснованно рассматривают гены GSTM1, GSTT1 и CYP2D6. Например, показано, что нулевые генотипы GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0 в сочетании с вариантами CYP2D6*1/CYP2D6*3 или CYP2D6*1/CYP2D6*4 ассоциированы с повышенным риском развития базальных клеточных карцином [Yang, 2006].
Выявлено, что гомозиготный генотип по делеции гена GSTM1 связан с повышенным риском развития рака легких, желудка и мочевого пузыря [Seidegard et al., 1990; Alexandrie et al., 1994; Ford et al., 2000; Ляхович и др., 2004; Habdous et al., 2004; Shi et al., 2008; Economopoulos et al., 2010].
Ферменты БК также активно участвуют в метаболизме лекарственных препаратов в организме человека. Наличие полиморфных вариантов в генах ферментов системы БК, приводящих к изменению функции фермента, могут влиять на безопасность терапии и эффективность лечения заболеваний. Так, фермент CYP2D6 метаболизирует использующийся для лечения рака молочных желез тамоксифен, превращая его в активный метаболит. У носителей мутантного аллельного варианта CYP2D6*4, ответственного за развитие фенотипа медленный метаболизатор, снижена скорость образования активного метаболита, что приводит к снижению длительности периода ремиссии и выживаемости при раке молочной железы [Jordana, 2007; Ron, 2008].
У индивидов с гомозиготным генотипом CYP2D6*4/CYP2D6*4 при применении антидепрессанта флуоксетина возможно развитие нескольких побочных реакций, одной из которых является агрессивное поведение [Кукес, 2010].
Выявлено, что носительство полиморфных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 гена CYP2C9, наиболее распространенных среди европеоидов, приводит к значительному снижению активности фермента. В результате, индивиды с мутантными генотипами (как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии), являются чувствительными к терапии нестероидными противовоспалительными, противодиабетическими, антиэпилептическими препаратами и антикоагулянтами (варфарином), поэтому таким лицам требуются более низкие дозы лекарств по сравнению со средними терапевтическими дозами, иначе возможно развитие серьезных побочных реакций [Pirmohamed, Park, 2003; Сироткина и др., 2004; Pilotto et al., 2007;
Обжерина и др., 2009].
Кроме полиморфизма генов системы БК (CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, GSTM1, GSTT1), определяющего индивидуальные особенности ответа организма на лекарственные препараты, важно учитывать наличие полиморфизма генов, кодирующих белки-транспортеры лекарств, а также генов, кодирующих мишени для этих веществ. Одним из таких генов является ген К-эпоксидредуктазы (VKORC1), продукт которого играет важную роль в процессе метаболизма витамина K и является мишенью варфарина, антикоагулянта непрямого действия, применяемого для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, лидирующих по частоте возникновения, инвалидизации и летальности населения в разных странах [Константинов, 1999; Шевела и др., 2008]. Носительство различных мутаций в гене VKORC1 может повышать как риск развития тромбозов, так и риск кровотечений.
Полиморфизм VKORC1 C1173T определяет чувствительность индивидов к варфарину путем снижения активности фермента и увеличивает риск кровотечений. Носителям такого варианта следует уменьшать дозу варфарина, подбирая ее с предельной осторожностью [D`Andrea et al., 2005; Reitsma et al., 2005].
Еще одним геном, наличие полиморфизма по которому связано с чувствительностью индивидов к варфарину, кроме CYP2C9 и VKORC1, является CYP4F2. Предполагается, что фермент CYP4F2 участвует в инактивации витамина K путем гидроксилирования его боковой цепи. Установлено, что полиморфизм G1347A (аллель CYP4F2*3, Val433Met) в гене CYP4F2 приводит к снижению функции фермента, в связи с этим витамин К недостаточно инактивируется, и индивидам с мутантным вариантом CYP4F2*3 требуются, напротив, повышенные дозы антикоагулянта [Sontag, Parker, 2002; McDonald et al., 2009]. В этом контексте наличие мутантного аллеля CYP4F2*3 оказывает противоположный эффект по сравнению с вариантами CYP2C9*2, CYP2C9*3 и VKORC1 C1173T.
Представленность тех или иных аллельных вариантов генов БК в популяциях человека существенно зависит от их расовой и этнической принадлежности. Поэтому получение знаний об этнических/популяционных вариациях полиморфных генов БК может иметь решающее значение для выявления в конкретных этнических группах наличие риска развития побочных лекарственных реакций и патологических состояний, связанных с нарушением работы системы БК.
В настоящее время во многих популяциях человека изучен полиморфизм генов системы БК (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1 и GSTT1) и гена VKORC[Вахитова и др., 2001; Garte et al., 2001; Xie et al., 2002; Herman et al., 2003;
Ахматьянова и др., 2008; Федорова и др., 2009; Limdi et al., 2009]. Однако для популяций коренных самодийских этносов Северной Сибири имеются лишь единичные неполные исследования по данному вопросу [Duzhak et al., 2000;
2001]. На территории проживания нганасан, селькупов, лесных и тундровых ненцев, на Таймыре и в Ямало-Ненецком автономном округе, начиная с 1960-х годов, происходит бурное развитие промышленности, что ведет к резкому ухудшению экологической обстановки за счет проникновения новых химических веществ и загрязнителей в среду обитания коренных народов, изменению их традиционного уклада жизни. Без сомнений, устойчивость коренных этносов к этим неблагоприятным факторам во многом зависит от структуры их генофондов, от способности метаболизировать чужеродные вещества окружающей среды. Успешное развитие медицины ведет к тому, что значительно увеличивается лекарственная нагрузка на организмы северных жителей. К тому же, меняются стандарты лечения, требующие применения совершенно новых лекарств, с которыми представители коренных народов Севера раньше не сталкивались. Для достижения безопасной и эффективной терапии медикаментами необходимо знать особенности их метаболизма у коренных народов. Исследование самодийских этносов важно и потому, что в их популяциях увеличивается степень метисации с пришлым населением. Этот процесс может способствовать привнесению новых генных вариантов в генофонды этносов и изменению их приспособленности к проживанию в суровых условиях среды и устойчивости к другим неблагоприятным факторам.
Цель данного исследования - изучение полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) и гена VKORC1 в популяциях коренных самодийских этносов (селькупов, тундровых ненцев, лесных ненцев, нганасан), и у русских Северной Сибири в контексте выявления межпопуляционных различий и наличия генетических основ предрасположенности или устойчивости различных этносов к онкологическим заболеваниям, а также развитию побочных реакций на терапию лекарственными препаратам.
Согласно поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. изучить распределение полиморфных вариантов генов CYP2C(CYP2C9*2 и CYP2C9*3), CYP2D6 (CYP2D6*3 и CYP2D6*4), CYP4F(CYP4F2*3) и VKORC1 (VKORC1 С1173Т) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов в этнических выборках самодийских популяций и у русских Северной Сибири;
2. изучить распределение нулевых генотипов GSTM1 0/0 и GSTT0/0 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR Green I в этнических выборках самодийских популяций и у русских Северной Сибири;
3. выполнить межпопуляционный анализ по частотам восьми полиморфных вариантов изученных генов в пяти исследуемых этносах, и провести сравнение с европеоидными и монголоидными популяциями, используя современные статистические методы;
4. выявить наличие генетических основ предрасположенности или устойчивости к развитию побочных реакций на терапию лекарственными препаратами на основе полученных частот аллелей и генотипов генов CYP2C(CYP2C9*2 и CYP2C9*3), CYP4F2 (CYP4F2*3) и VKORC1 (VKORC1 С1173Т) в популяциях коренных самодийских этносов и русских Северной Сибири;
5. выявить генетические основы предрасположенности или устойчивости к онкологическим заболеваниям на основе полученных частот аллелей гена CYP2D6 (CYP2D6*3 и CYP2D6*4) и нулевых генотипов GSTM0/0 и GSTT10/0, вероятных маркеров риска развития онкопатологий, в популяциях самодийцев и русских Северной Сибири.
Научная новизна Впервые в четырех самодийских популяциях (селькупов, лесных и тундровых ненцев, нганасан) и у русских Северной Сибири (всего 1475 чел.) изучено распределение полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP4F2*3, GSTM1 0/0, GSTT1 0/0) и гена VKORC1 (VKORCС1173Т), имеющих важное значение в метаболизме лекарственных веществ и канцерогенов.
Впервые выявлено, что в изученных популяциях жителей Северной Сибири существует значимая доля лиц с мутантными аллельными вариантами генов CYP4F2, VKORC1 и лиц - медленных метаболизаторов по гену CYP2C9, что, с высокой вероятностью определяет чувствительность данных индивидов к терапии лекарственными препаратами, в метаболизме которых задействованы данные гены.
Впервые на основе пониженных частот мутантных вариантов генов CYP2D6, GSTM1 и GSTT1 выдвинуто предположение, что самодийские этносы по сравнению с русскими Сибири на популяционном уровне имеют более низкий риск развития онкологических заболеваний, связанных с полиморфизмом в данных генах.
На основании высокой распространенности у самодийцев мутантного аллеля VKORC1 1173Т, ассоциированного со снижением активностей витамин K-зависимых белков свертывания крови, впервые выдвинута гипотеза об адаптивном значении этого аллеля, вероятно, способствовующего снижению риска развития тромбозных инфарктов миокарда и инсультов у представителей самодийских этносов.
Научно-практическая ценность Результаты данного исследования расширяют знание о распределении частот полиморфных вариантов генов системы БК и гена VKORC1, имеющих большое значение в метаболизме ксенобиотиков, в человеческих популяциях;
могут быть использованы для выявления возможных ассоциаций между определенными заболеваниями и полиморфными вариантами в генах системы БК в изученных популяциях Северной Сибири;
имеют значение для превентивной медицины при прогнозировании вероятности осложнений на используемые лекарственные препараты, которые метаболизируются ферментами CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, VKORC1, в целях достижения безопасной и эффективной терапии, а также при проведении профилактических мер против заболеваний, с которыми могут быть ассоциированы мутантные варианты изученных генов;
вносят вклад в представление о роли генетического полиморфизма генов БК и гена VKORC1 в адаптации популяций к конкретным условиям окружающей среды.
Практические рекомендации Рекомендуется выявлять носительство аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3, CYP4F2*3 и VKORC1 1173T на индивидуальном уровне в популяциях коренных жителей Северной Сибири с целью достижения безопасного и эффективного лечения варфарином, НПВП и другими лекарственными препаратами, в метаболизме которых участвуют ферменты CYP2C9, VKORC1 и CYP4F2.
Положения, выносимые на защиту 1) Популяции коренных самодийских этносов существенно отличаются от популяций русских Северной Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая по частотам восьми полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, GSTM1, GSTT1 и VKORC1 и образуют отдельный самодийский кластер.
Наибольший вклад в генетическое разнообразие между этническими группами вносят полиморфные варианты VKORC1 1173Т, GSTT1 0/0, GSTM1 0/0, CYP2D6*4.
2) В популяциях коренных самодийских этносов и русских Северной Сибири у лиц - носителей мутантных вариантов генов CYP2C9, CYP4F2 и VKORC1 прогнозируется повышенная чувствительность к терапии лекарственными препаратами, метаболизируемыми соответствующими ферментами.
3) У коренных самодийских этносов, имеющих высокую частоту распространенности мутантного аллеля VKORC1 1173Т, прогнозируется сниженный популяционный риск развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов, по сравнению с русскими Северной Сибири.
4) Самодийские этносы, по сравнению с русскими Северной Сибири, на популяционном уровне имеют более низкий риск развития онкологических заболеваний, с которыми ассоциирован полиморфизм в генах CYP2D6, GSTM1 и GSTT1.
Апробация работы Результаты данной работы были представлены на: IX Российском конгрессе Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии (Москва, 2010 г.); VII международной конференции Bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology (Новосибирск, 2010 г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Медикобиологические аспекты мультифакториальной патологии (Курск, 2011 г.);
семинаре мастер - классе Актуальные вопросы генодиагностики в современной медицине (респ. Казахстан, г. Семей, 2011 г.); II международной научнопрактической конференции Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика (Новосибирск, 2011 г.).
Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них три статьи в отечественных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
ичный вклад автора Автор самостоятельно выполнил генотипирование однонуклеотидных замен в генах CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1 и делеций в генах GSTM1 и GSTT1, провел статистическую обработку полученных результатов, построил карты генетических дистанций. Автор также принял участие в выделении ДНК.
Структура и объем работы Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: список использованных сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы (267 наименований). В тексте представлено рисунков и 19 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В настоящем исследовании приняли участие этнические представители пяти популяций: селькупы, лесные ненцы, тундровые ненцы Ямало-Ненецкого автономного округа, нганасаны полуострова Таймыр и русские Северной Сибири, проживающие в Ямало-Ненецком автономном округе и Красноярском крае (всего 1475 человек).
Генетический материал собирался во время экспедиций в Ямало-Ненецкий АО и п-ов Таймыр сотрудниками лаборатории популяционной этногенетики ИЦиГ СО РАН под руководством к.б.н. Л.П. Осиповой. Выборки ДНК сформированы из общего банка коллекционного материала на основании изучения демографических и генеалогических данных этническими представителями селькупов (N=330), тундровых (N=310) и лесных (N=303) ненцев, нганасан (N=186), русских (N=346); последние использовались в качестве группы сравнения. В эти выборки не вошли метисы разных уровней от браков коренных жителей с русскими и представителями других пришлых этносов. Забор крови производился квалифицированными медицинскими работниками по международным правилам с использованием Информированного согласия от добровольцев, практически здоровых на момент исследования.
Генотипирование однонуклеотидных замен в генах CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1 проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (real-time PCR) с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Каждый образец амплифицировался с использованием пары праймеров и двух зондов, несущих гаситель на 3Т-конце и разные флуоресцентные красители (FAM или R6G) на 5Т-конце. Работа проводилась с использованием амплификатора iCycler iQ 4 (Bio-Rad, USA). Выявление распределениея генотипов проводилось с помощью программы Bio-Rad iQ5.
Выявление делеций в генах GSTM1 и GSTT1 проводилось с помощью метода real-time PCR с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR Green I. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были выбраны внутри области делеций в генах GSTM1 и GSTT1 таким образом, что это обуславливало отсутствие синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипом GSTM1 0/0 или GSTT1 0/0, соответственно. Для того чтобы различить присутствие гомозиготной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 от отсутствия ДНК-матрицы или же ингибирования реакции ПЦР, в амплификационную смесь вводили праймеры для амплификации короткого легкоплавкого A/T-богатого фрагмента ДНК (LTM - low temperature melting).
Полученные результаты интерпретировали, исходя из анализа графиков накопления флуоресценции; специфичность реакции оценивалась с помощью кривых плавления.
Статистическая обработка данных. Популяционные частоты аллельных вариантов генов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием критерия 2 (Пирсона), применяя on-line программу, которая доступна по адресу: (при
0,05 равновесие выполняется). Статистическую оценку достоверности различий в распределении частот полиморфных аллелей и генотипов между исследованными выборками проводили стандартным методом 2 с поправкой Йейтса на непрерывность (при p<0,05 результаты считались статистически значимыми). Для выявления генетических различий между исследованными популяциями мы использовали метод фиксированного индекса и метод главных компонент. Подсчет значений Fst между изучаемыми популяциями осуществлялся с помощью программы Arlequin 3.11. График многомерного шкалирования (MDS Plot), основанный на значениях Fst - матрицы, строился с использованием пакета XLStat (Addinsoft Inc. www.xlstat.com). Построение карт генетических дистанций проводили с использованием метода Харпендинга и Дженкинса [Harpending, Jenkins, 1973].РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На основании исследования частот генотипов полиморфных вариантов изученных генов (табл. 1) была проведена проверка на соответствие распределения данных генотипов равновесию Харди-Вайнберга с использованием критерия 2 (Пирсона). Данное равновесие выполняется в каждом случае, что указывает на репрезентативность популяционных выборок.
Частоты встречаемости мутантных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1, GSTM1 и GSTT1 для пяти популяций показаны в табл. 2.
Таблица 1. Частоты всех генотипов полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, VKORC1 в исследованных популяциях.
Частоты генотипов в популяциях, % Полиморфизм/ Русские Тундровые Лесные ген Генотипы Селькупы Нганасаны Северной ненцы ненцы Сибири C/C 90,30 (298) 94,19 (292) 86,47 (262) 93,01 (173) 74,49 (257) CYP2C9*2 C/T 9,70 (32) 5,81 (18) 13,53 (41) 6,99 (13) 23,48 (81) T/T 0 0 0 0 2,03 (7) A/A 83,94 (277) 92,26 (286) 98,02 (297) 91,94 (171) 80,87 (279) CYP2C9*3 A/C 15,76 (52) 7,42 (23) 1,98 (6) 7,53 (14) 18,84 (65) C/C 0,30 (1) 0,32 (1) 0 0,54 (1) 0,29 (1) A/A 99,10 (327) 100,00 (310) 100,00 (303) 99,46 (185) 96,53 (334) CYP2D6*3 A/Del 0,90 (3) 0 0 0,54 (1) 3,47 (12) Del/Del 0 0 0 0 G/G 91,19 (300) 87,10 (270) 93,31 (279) 85,48 (159) 69,10 (219) CYP2D6*4 G/A 9,35 (29) 12,26 (38) 6,69 (20) 13,98 (26) 27,40 (87) A/A 0 0,65 (2) 0 0,54 (1) 3,5 (11) G/G 35,45 (117) 60,00 (186) 65,78 (198) 29,57 (55) 49,71 (172) CYP4F2*3 G/A 49,70 (164) 33,55 (104) 30,90 (93) 50,54 (94) 43,06 (149) A/A 14,85 (49) 6,06 (20) 3,32 (10) 19,89 (37) 7,23 (25) C/C 2,73 (9) 7,74 (24) 11,88 (36) 1,08 (2) 39,88 (138) VKORC1 С1173Т C/T 25,45 (84) 35,16 (109) 41,58 (126) 9,68 (18) 46,53 (161) T/T 71,82 (237) 57,10 (177) 46,53 (141) 89,24 (166) 13,58 (47) 0/0 20,00 (66) 32,58 (101) 35,31 (107) 9,14 (17) 48,09 (164) GSTM+ 80,00 (270) 67,42 (209) 64,69 (196) 90,86 (169) 51,91 (177) 0/0 14,85 (49) 11,94 (37) 9,90 (30) 12,37 (23) 38,71 (132) GSTT+ 85,15 (281) 88,06 (273) 90,10 (273) 87,63 (163) 61,29 (209) Примечание: в скобках указано количество индивидов с конкретным генотипом;
жирным шрифтом обозначены гомозиготные мутантные генотипы.
Таблица 2. Частоты мутантных аллелей генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1 и нулевых генотипов GSTM1 и GSTT1 в исследованных популяциях, %.
Популяционные CYP2C9 CYP2D6 CYP4F2 VKORC1 GSTM1 GSTTвыборки (чел.) *2 T *3 C *3 del *4 A *3 A 1173T 0/0 0/Селькупы (330) 4,85 8,18 0,45 4,41 39,70 84,55 20,00 14,(32/660) (54/660) (3/660) (29/658) (262/660) (558/660) (66/330) (49/330) Тундровые ненцы 2,90 4,03 0 6,77 23,23 74,68 32,58 11,(310) (18/620) (25/620) (0/620) (42/620) (144/620) (463/620) (101/310) (37/310) Лесные ненцы 6,77 0,99 0 3,34 18,77 67,33 35,31 9,(303) (41/606) (6/606) (0/606) (20/298) (113/606) (408/606) (107/303) (30/303) Нганасаны (186) 3,49 4,30 0,27 7,53 45,16 94,09 9,14 12,(13/372) (16/372) (1/372) (28/372) (168/372) (350/372) (17/186) (23/186) Русские Северной 13,77 9,71 1,73 17,19 28,76 36,85 48,09 38,Сибири (346) (95/690) (67/690) (12/692) (109/634) (199/692) (255/692) (164/341) (132/341) Примечание: в скобках указано отношение количества мутантных аллелей или образцов ДНК с конкретным генотипом к общему количеству обследованных аллелей или образцов ДНК, в случае которых полимеразная цепная реакция прошла успешно.
Распределение полиморфных вариантов гена CYP2C9 и межпопуляционные различия. Исследование выявило, что в самодийских популяциях по сравнению с европеоидными популяциями русских Северной Сибири, шведов [Yasar et al., 2003], немцев [Ackermann et al., 1997] и словенцев [Herman et al., 2003] частоты мутантных аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 статистически значимо снижены (исключая селькупов, у которых эти различия не достоверны, р>0,05). Выявлены статистически значимые различия в частотах CYP2C9*2 между всеми самодийцами и монголоидами Китая, у которых этот аллель отсутствует [Xie et al., 2002], а по частотам CYP2C9*3 с монголоидами Китая значимо различаются селькупы (повышенной частотой) и лесные ненцы (пониженной частотой). В целом, в результате анализа CYP2C9фенотипов, сочетающих в себе наличие хотя бы одного или обоих мутантных CYP2C9*2- и CYP2C9*3-генотипов (в гомозиготном или гетерозиготном состоянии) - была выявлена значимая суммарная доля лиц - медленных метаболизаторов, как среди представителей коренных этносов, так и среди русских Северной Сибири. Данная величина варьирует от 13 % у тундровых ненцев до 25 % у селькупов и максимальна в популяции русских Сибири (40 %), что позволяет нам в данных популяциях прогнозировать наличие индивидуального риска развития побочных реакций на терапию лекарствами, метаболизируемыми CYP2C9.
Распределение полиморфных вариантов гена CYP2D6 и межпопуляционные различия. Частоты мутантного аллельного варианта CYP2D6*3 невысоки во всех исследованных популяциях, причем среди ненцев этот вариант не встречается вовсе, что характерно и для монголоидных популяций Китая и Японии. В популяции русских Сибири частота CYP2D6*достоверно выше, чем у самодийцев, и составляет 1,73 % (р<0,05). Эта частота сравнима с таковыми в других европеоидных популяциях: Эстонии [Marandi et al., 1997], Германии [Sachse et al., 1997], Швеции [Yamada et al., 1998] и США [London et al., 1997]. Можно предположить, что, либо существуют селективные механизмы, препятствующие накоплению этого варианта в популяциях, либо же этот аллель имеет сравнительно недавнее эволюционное происхождение, предположительно, в европеоидной ветви.
Частоты мутантного аллельного варианта CYP2D6*4 среди самодийцев статистически значимо различаются с таковыми для русских Северной Сибири, других европеоидов, монголоидов Китая, при этом самодийцы занимают промежуточное положение между европеоидами и монголоидами. В частотах CYP2D6*4 между самодийцами наблюдается как сходство, так и различия (табл.
1). В выборке русских Сибири частота аллеля CYP2D6*4 сходна с частотами для европеоидов Швеции (р=0,06) и США (р=0,76). В целом, частоты мутантных вариантов гена CYP2D6, первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, достоверно ниже в выборках коренных этносов, чем в выборке русских Сибири и в других европеоидных популяциях. Однако результаты исследования мутантных вариантов гена CYP2D6, ответственных за развитие фенотипа медленный метаболизатор, могут на индивидуальном уровне иметь значение при прогнозировании вероятности осложнений на используемые лекарственные препараты, которые метаболизируются ферментом CYP2D6.
Полиморфизм CYP4F2*3 (G1347A) гена CYP4F2 и межпопуляционные различия. В популяциях селькупов и нганасан выявлены самые высокие частоты мутантного варианта CYP4F2*3 (различия в частотах между этими выборками не являются статистически значимыми, р=0,30) по сравнению с ненцами (р=0,00), русскими Сибири, другими европеоидами (р=0,00) [Scott et al., 2010] и монголоидами Китая (р>0,05) [Deng et al., 2010]. У лесных ненцев частота этого аллеля минимальная (18,8 %) относительно частот в других популяциях, взятых для сравнения. Индивидам, несущим аллель CYP4F2*3 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии, вероятно, потребуются повышенные дозы варфарина. Однако при назначении терапии варфарином для подбора оптимальных доз препарата необходимо учитывать также носительство мутантных аллелей CYP2C9*2, CYP2C9*3 и VKORC1 1173Т, так как в случае их наличия требуются, наоборот, сниженные дозы антикоагулянта.
Распределение нулевых генотипов GSTM1 и GSTТ1 генов и межпопуляционные различия. Исследование показало, что частоты нулевых генотипов обоих генов существенно и статистически значимо ниже в самодийских выборках, по сравнению с русскими Северной Сибири, европеоидами США и Швеции [Garte et al., 2001], монголоидами Китая [Setiawan et al., 2000]. Между самодийскими популяциями наблюдается значительная вариабельность в частотах распределения GSTM1 0/0. Сходство выявлено только между лесными (35,3 %) и тундровыми ненцами (32,6 %;
р=0,67), у которых доля лиц с мутантным генотипом GSTM1 0/0 значимо выше, чем у селькупов (20 %) и нганасан (9,1 %). Частота GSTT1 0/0 в самодийских популяциях не проявляет вариабельности и практически одинакова (в среднем, около 12 %). Наибольшую суммарную частоту встречаемости сочетаний нулевых генотипов, GSTM1+ / GSTT10/0, GSTT1+ / GSTM1 0/0, GSTM1 0/0 / GSTT1 0/0, среди изученных популяций имеют русские Северной Сибири (почти 64 %), а наименьшую - нганасаны Таймыра (около 16 %). Ранее было показано, что среди тундровых ненцев, больных раком или имеющих хромосомные аномалии (N=28), частота нулевого генотипа GSTM1 0/0 оказалась гораздо выше и составила почти 63 %, по сравнению с частотой GSTM1 0/0, выявленной среди группы здоровых ненцев (N=102; 39,8%) [Duzhak et al., 2000, 2001]. На основании этих данных, а также выявленных существенно и статистически значимо сниженных частот встречаемости вариантов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, CYP2D6*4, известных маркеров онкологических заболеваний, среди самодийцев по сравнению с русскими Северной Сибири мы предполагаем, что селькупы, ненцы, нганасаны на популяционном уровне имеют пониженный популяционный риск развития онкопатологий.
Полиморфизм C1173T гена VKORC1 и межпопуляционные различия.
Выявлено широкое распространение мутантного аллеля VKORC1 1173Т в самодийских популяциях, при этом его частоты значимо варьируют. Частоты аллеля 1173Т в выборках селькупов (84,6 %) и нганасан (94,1 %) превышают таковые для лесных (67,3 %) и тундровых (74,7 %) ненцев и значимо не отличаются от частот в монголоидных популяциях Китая (92,0 %) и Японии (89,1 %) [Larramendy-Gozalo et al., 2006; Takahashi et al., 2006]. В изученных самодийских популяциях частоты аллеля 1173Т существенно и статистически значимо выше, чем у русских Северной Сибири, европеоидов Франции и Швеции (р=0,00) [Osman et al., 2006; Lacut et al., 2007]. Широкое распространение VKORC1 1173T в изученных популяциях, в особенности у самодийцев, может обуславливать повышенную чувствительность индивидов к антикоагулянтам типа варфарина. Высокая частота мутантного аллеля VKORC1173T, ассоциированного со снижением активности фермента VKORC1, а значит, и со снижением активности витамин K зависимых белков свертывания крови, может способствовать снижению риска развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов у представителей самодийских этносов.
Значения Fst, вычисленные на основе частот мутантных вариантов CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP4F2*3, CYP2D6*3, CYP2D6*4, VKORC1 1173T.
Метод фиксированного индекса используется для выявления степени гетерогенности между популяциями. В табл. 3 представлены значения Fst между самодийскими популяциями и русскими Северной Сибири. Метод подсчета Fst основан на различии частот однонуклеотидных полиморфизмов между популяциями, поэтому частоты нулевых GSTM1- и GSTT1-генотипов, обусловленных протяженными делециями в генах, не были включены в анализ.
Таблица 3. Значения Fst -матрицы между исследованными популяциями.
Популяционные выборки Селькупы Тундровые ненцы Лесные ненцы Нганасаны Селькупы Тундровые ненцы 0,035Лесные ненцы 0,07026 0,009Нганасаны 0,01241 0,08018 0,132Русские Северной Сибири 0,17020 0,12020 0,09559 0,225Примечание: каждое значение Fst - матрицы является статистически значимым (р=0.00000+-0.0000).
На основе значений Fst - матрицы был построен график многомерного шкалирования (MDS Plot) (рис. 1), позволяющий расположить в пространстве исследованные популяции относительно друг друга.
Мера качества отображения (С тресс Крушкаля (1) = 4.773E -5) 0,Русские 0,Северной Сибири 0,Лесные ненцы Тундровые 0,ненцы -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 -0,-0,Селькупы -0,Нганасаны -0,Измерение Рис. 1. График многомерного шкалирования, основанный на значениях Fst - матрицы по частотам аллелей CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP4F2*3, CYP2D6*3, CYP2D6*4, VKORC1 1173T для популяций ненцев, селькупов, нганасан и русских Северной Сибири.
Популяция нганасан оказалась в большей степени лудаленной от ненцев, в особенности, от лесных (Fst=0,132), проявив статистически значимые различия в частотах встречаемости 5 вариантов (CYP2C9*3, CYP2D6*4, CYP4F2*3, Измерение VKORC1 1173T, GSTМ1 0/0). Результаты исследования частот аллелей и гаплотипов пяти генетических систем крови показали, что нганасаны генетически удалены как от селькупов, так и от ненцев [Осипова и др., 2007].
Карты генетических дистанций. На рис. 2 представлена общая карта генетических дистанций, основанная на частотах всех 8 изученных полиморфных вариантов, показывающая взаимное расположение популяций самодийцев, русских Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая.
e22=20,7 % Нганасаны Европеоиды Лесные Швеции ненцы Тундровые Селькупы ненцы Европеоиды США e11=66,6 % Самодийцы Русские Северной Сибири Европеоиды Монголоиды Китая Рис. 2. Карта генетических дистанций, построенная на основании частот аллелей CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP4F2*3, CYP2D6*3, CYP2D6*4, VKORC1 1173T и генотипов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, показывающая расположение популяций самодийцев и русских Северной Сибири в сравнении с монголоидными популяциями Китая и европеоидными популяциями Швеции и США в пространстве двух главных компонент, извлекающих 87,3 % суммарной межпопуляционной изменчивости.
Показано, что селькупы, ненцы и нганасаны удалены как от европеоидных, так и монголоидных популяций, образуя отдельный кластер, указывающий на особый генетический профиль самодийских этносов, каждый из которых имеет свою генетическую основу.
Для того чтобы выяснить, какие полиморфные варианты вносят наибольший вклад в генетическую гетерогенность между сравниваемыми популяциями, было сделано графическое представление расположения изученных полиморфных вариантов в пространстве двух главных компонент (рис. 3). Видно, что наибольший вклад в генетическое разнообразие между популяциями вносят полиморфные варианты VKORC1 1173Т, GSTT1 0/0, GSTM0/0, CYP2D6*4.
e22=20,7 % CYP2C9*CYP2D6*CYP2D6*3 e11=66,6 % CYP2C9*CYP4F2*VKORC1 1173T GSTM1 0/GSTT1 0/Рис. 3. Расположение изученных полиморфных вариантов аллелей и генотипов в пространстве двух главных компонент относительно популяций селькупов, ненцев, нганасан, русских Северной Сибири, монголоидов Китая, европеоидов Швеции, США.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведено исследование полиморфизма генов системы БК и гена VKORCв четырех популяциях коренных этносов и у русских Северной Сибири. На основе полученных частот полиморфных вариантов изученных генов наибольшее генетическое сходство выявлено между лесными и тундровыми ненцами. Наибольшее генетическое различие обнаружено между нганасанами и лесными ненцами. Исследование показало также существенные, статистически значимые генетические различия между популяциями самодийцев и русских Северной Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая.
На основе выявленных частот мутантных вариантов генов CYP2D6, GSTMи GSTT1, ассоциированных с риском развития онкологических заболеваний в разных популяциях мира, можно прогнозировать пониженный популяционный риск онкологических заболеваний у самодийцев по сравнению с русскими Сибири. Наименьший риск, вероятно, имеют нганасаны, о чем свидетельствуют самые низкие частоты комбинированного сочетания нулевых генотипов GSTs в этой популяции. В связи с этим, предполагается, что увеличивающаяся в самодийских популяциях степень метисации с европеоидами может произвести отрицательный эффект на устойчивость самодийцев к развитию онкологической патологии.
В изученных популяциях выявлена высокая частота варианта VKORC1173T и значимые доли медленных метаболизаторов, несущих мутантные аллели CYP2C9*2 и CYP2C9*3. В связи с этим, у данных индивидов возможен риск развития побочных реакций на лекарственные препараты, которые метаболизируются через систему CYP2C9.
В популяциях лесных ненцев и нганасан выявлены заметные этнос - специфические особенности. Так, среди лесных ненцев наблюдаются минимальные частоты 5 (из 8 изученных) мутантных вариантов CYP2C9*3, CYP2D6*4, CYP4F2*3, GSTT1 0/0, VKORC1 1173T по сравнению с другими самодийскими популяциями. Нельзя исключить действие факторов микроэволюции (отбора, дрейфа генов) в этой изолированной популяции под влиянием высокого инбридинга, обусловленного высокой частотой родственных браков [Абанина, Сукерник, 1980]. У нганасан, напротив, наблюдаются максимальные частоты аллелей CYP2D6*4, VKORC1 1173T, CYP4F2*3 и минимальная доля носителей одновременно двух нулевых GSTs-генотипов относительно всех исследованных популяций. Возможно, такое распределение частот указанных полиморфных вариантов у нганасан может объясняться известным из истории резким колебанием численности популяции, что могло привести к дрейфу генов или действию отбора.
ВЫВОДЫ 1. Выявлена существенная вариабельность распределения частот полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, GSTM1, GSTT1 и VKORC1 в самодийских этносах и у русских северной Сибири. Наибольшее генетическое сходство обнаружено между лесными и тундровыми ненцами, а наибольшее генетическое различие - между нганасанами и лесными ненцами.
Статистически значимые генетические различия наблюдаются между самодийскими популяциями и русскими Северной Сибири.
2. С помощью метода главных компонент показано, что популяции коренных этносов Северной Сибири, будучи генетически удаленными от других европеоидных и монголоидных популяций, образуют отдельный самодийский кластер. При этом наибольший вклад в генетическое разнообразие между этническими группами вносят полиморфные варианты VKORC1 1173T, GSTT0/0, GSTM1 0/0, CYP2D6*4.
3. Выявлены значительные доли лиц - медленных метаболизаторов, (носители аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3), носителей мутантных аллелей VKORC1 1173Т и CYP4F2*3 в изученных популяциях, что может обуславливать риск развития побочных реакций на терапию лекарственными препаратами, в метаболизме которых принимают участие ферменты CYP2C9, VKORC1, CYP4F2, у исследованных лиц с данными полиморфными вариантами.
4. Обнаружена высокая частота мутантного аллеля 1173T гена VKORC1 в самодийских популяциях (варьирует от 67 % у лесных ненцев до 94 % - у нганасан) по сравнению с русскими Сибири и другими европеоидами (до 40 %).
Этот аллель ассоциирован со снижением активности витамин-К зависимых белков свертывания крови. На основании этого можно прогнозировать сниженный популяционный риск развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов у коренных самодийских этносов. Выдвинута гипотеза об адаптивном значении этого аллеля.
5. Установлено, что в самодийских популяциях частоты мутантных вариантов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, CYP2D6*3 и CYP2D6*4, известных как маркеры риска онкологических заболеваний, существенно и статистически значимо снижены, по сравнению с русскими Северной Сибири, что может обеспечивать самодийские этносы меньшим популяционным риском развития онкопатологий.
Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы 1. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Вавилова Н. А. и др. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6, вероятных маркеров риска онкологических заболеваний, в популяциях коренных этносов и русских Северной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. № 3. С. 448-461.
2. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Вавилова Н. А. и др. Генетический полиморфизм цитохрома P450 2C9, участвующего в метаболизме лекарственных препаратов, в популяциях коренных жителей Северной Сибири // Бюллетень СО РАМН. 2011. № 6. С. 39-46.
3. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Вавилова Н. А. и др. Генетический полиморфизм VKORC1 C1173T, определяющий индивидуальную чувствительность к непрямым антикоагулянтам, в популяциях селькупов, тундровых ненцев и у русских Северной Сибири // Вестник Кемеровского государственного университета. 2012. Т. 49. № 1. С. 19 - 23.
4. Korchagina R. P., Osipova L. P, Senkova N. A. et al. Study of polymorphisms in glutathione S-transferase M1 and T1 (GSTM1 and GSTT1) genes in Selkups and Tundra Nenets // Proc. of the seventh internat. conf. on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology, Novosibirsk, 2010. P. 146.
5. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Сенькова Н. А. и др. Распределение полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP4F2, VKORC1, ответственных за метаболизм антикоагулянтов в популяции тундровых ненцев // Материалы девятого Российского конгресса Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Москва, 2010. С. 95.
6. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Воронина Е. Н.и др. Распределение частот полиморфных вариантов генов CYP2D6, GSTM1, GSTT1 - вероятных маркеров предрасположенности к развитию онкопатологий в популяциях нганасан Таймыра // Материалы II Всероссийской научно-практич. конф. с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Курск, 2010. С. 68 - 69.
7. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Воронина Е. Н., Филипенко М. Л.
Генетический полиморфизм цитохрома Р450 2С9, ответственного за метаболизм варфарина, в популяциях лесных и тундровых ненцев // Тезисы II Международной научно-практич. конф. Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика. Новосибирск, 2011. С. 203.