Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Белова Наталья Александровна
ПЕРВИЧНЫЕ МИШЕНИ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ СЛАБЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ СИСТЕМАМИ
03.01.02 - Биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
ПУЩИНО - 2011
Работа выполнена в лаборатории биофизики внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор Леднев Валерий Васильевич
Официальные оппоненты: Доктор физико - математических наук Ризниченко Галина Юрьевна Доктор биологических наук Лобкаева Евгения Петровна Доктор биологических наук, профессор Шноль Симон Эльевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН
Защита диссертации состоится л26 января 2011 г. в 15-30 на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г.
Пущино по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат разослан л декабря 2010 г.
Ученый секретарь кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф.
Список сокращений МП - магнитное поле КМП - комбинированное магнитное поле КС ПеМП - крайне слабое переменное магнитное поле МПР - магнитный параметрический резонанс.
АФК - активные формы кислорода ХЛ - хемилюминесценция ФМА - форболовый эфир МИ - митотический индекс ЛЧ- Ларморовская частота
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучение вопроса о биологическом действии слабых магнитных полей, амплитуда которых сравнима или значительно меньше амплитуды геомагнитного поля, обусловлено необходимостью оценки последствия возможного воздействия на биосистемы антропогенных электромагнитных загрязнений биосферы (поля промышленных частот 50 и 60 Гц), а также естественных флюктуаций МП, возникающих, например, в периоды магнитных бурь. Согласно выводам рабочей группы научных экспертов Международного агентства по исследованию рака (МАИР, IACR) Всемирной Организацией здравоохранения, слабые низкочастотные электромагнитные поля можно рассматривать как фактор, обладающий канцерогенным действием. Эти выводы были сделаны на основе результатов широкомасштабных эпидемиологических исследований заболеваемости лейкемии в детском возрасте. Результаты других исследований свидетельствуют о наличии корреляции между числом вызовов скорой помощи по поводу инфаркта миокарда и гипертонического криза, а также смертностью людей с сердечно - сосудистыми заболеваниями и суммарной продолжительностью низкочастотных геомагнитных пульсаций типа Рс1 (pulsation continuous 1). С другой стороны, успешное использование слабых магнитных полей в медицине, например, для ускорения процессов регенерации мягких и костных тканей, ставит вопрос о создании новых эффективных методов магнитотерапии, в том числе, для лечения социально - значимых заболеваний.
К настоящему времени накоплено множество экспериментальных данных о влиянии слабых и крайне слабых постоянных, переменных и комбинированных магнитных полей (МП) на биологические системы. Эти исследования направлены на решение двух принципиально важных вопросов: (1) являются ли данные о влиянии слабых (с амплитудами 0-200 мкТл) магнитных полей на биологические системы достаточно убедительными; (2) каков механизм(ы) действия слабых магнитных полей на биологические системы. Следует отметить, что энергия, которую слабое МП могло бы передать субклеточным частицам, рецепторам или отдельным ионам на много порядков ниже энергии тепловых флуктуаций. Даже наиболее эффективные механорецепторы способны улавливать только сигналы, превышающие энергию теплового шума (kT, где k- постоянная Больцмана (1.3810-Дж/К), T - абсолютная температура, К). Это является причиной скептического отношения к сообщениям об эффектах слабых магнитных полей на биологические системы и до сих пор дискутируется в литературе. Таким образом, решение вопроса о природе первичных мишеней является наиболее актуальной задачей в исследовании механизмов действия слабых магнитных полей на биологические системы. Эти соображения определили основной подход настоящей работы, направленной на экспериментальную проверку, предложенной В.В. Ледневым модели параметрического резонанса, дающей количественные предсказания для зависимости величины биоэффекта от параметров поля, и построенной исходя из представлений о природе первичных мишеней действия слабых МП на биологические системы.
Цели и задачи работы.
Цель работы - экспериментальный поиск возможных первичных мишеней действия слабых магнитных полей с амплитудами 0-200 мкТл на биологические системы на основе модели магнитного параметрического резонанса (в биосистемах), предложенной В.В. Ледневым.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Показать принципиальную возможность действия слабых комбинированных магнитных полей (КМП) в режиме параметрического резонанса, а также КМП с крайне слабыми амплитудами переменной компоненты на регенерацию планарий, гравитропическую реакцию в отрезках стеблей растений, образование активных форм кислорода в нейтрофилах мышей.
2. Определить зависимость величин биологического эффекта от частоты и амплитуды переменной компоненты КМП в режиме параметрического резонанса, а также от величины постоянного поля (при отсутствии переменной компоненты) с использованием в качестве моделей регенерирующих планарий и гравитропической реакции в отрезках стеблей льна.
3. Показать принципиальную возможность влияния КМП, настроенных на ларморовскую частоту для спинов ядер биологически важных атомов, таких 23 39 31 63 55 14 59 35 как Na, K, P, Cu, Mn, N, Сo, Cl, Li на регенерацию планарий.
Определить зависимость величины биологического эффекта от частоты переменной компоненты КМП.
4. Определить зависимость величин биологических эффектов крайне слабых переменных магнитных полей с амплитудами < 10 мкТл от амплитуды и частоты переменной компоненты поля с использованием в качестве моделей регенерирующих планарий и гравитропической реакции в отрезках стеблей льна.
Научная новизна работы.
В работе показано, что комбинированные магнитные поля с различными параметрами могут активировать и ингибировать протекание таких процессов, как регенерация планарий, гравитропическая реакции растений, образование активных форм кислорода нейтрофилами. Величина биоэффекта (скорости регенерации планарий и скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна) действия КМП, сравнимых по амплитуде с земным полем, при настройке на резонансные условия для ионов Са2+, Mg2+ и К+ зависит от частоты переменной компоненты поля и от соотношения амплитуд переменной и постоянной компонент поля и имеет резонансный характер. Впервые показано биотропное действие КМП сравнимых по амплитуде с земным и с частотой переменной компоненты, соответствующей ларморовской частоте (ЛЧ) для спинов ядер биологически важных атомов, таких как 23 39 31 63 55 59 Na, K, P, Cu, Mn, Сo, Cl. Частотная зависимость величины биоэффекта имеет резонансный характер. Этот результат является основанием для дальнейшего развития модели В.В. Леднева, разработанной для случая когда в качестве первичной мишени действия КМП рассматривается ион Са2+ как заряженный изотропный осциллятор. Показано, что развитие гравитропической реакции в отрезках стеблей льна зависит от величины постоянного поля (при отсутствии переменной компоненты) и имеет полиэкстремальный характер в диапазоне амплитуд от 0 до 400 мкТл. В работе впервые показано, что величина биоэффекта (скорости регенерации планарий и скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна) действия КМП, с амплитудами менее 10 мкТл, зависит от соотношения амплитуда/частота, т.е. от параметра, и имеет B f AC полиэкстремальный характер: хорошо выраженные максимумы наблюдаются при = 0.9 и 2.75, минорные максимумы при B f = 4.5 и 6.1. Биологический B f AC AC эффект отсутствует при BAC f =1.8; 3.8; 5.3; 6.7. Эти данные позволяют рассчитать биотропные параметры полей в том числе для полей промышленных частот 50 и 60 Гц, а также для слабых магнитных полей, соответствующих геомагнитным пульсациям типа Рс1. В настоящей работе показано, что в качестве возможных физических первичных мишеней действия слабых магнитных полей можно рассматривать: ионы Са2+, Mg2+ и К+, входящие в соответствующие центры связывания ферментов, а также спины ядер биологически важных атомов (1Н, 23Na, 39 31 63 55 59 K, P, Cu, Mn, Сo, Cl) и орбитальные магнитные моменты электронов. В целом, полученные в работе экспериментальные данные создают основу для дальнейшего изучения физических и биологических механизмов действия слабых МП на биологические системы.
Научно-практическое значение. Полученные в данной работе результаты являются биофизическими основами для:
- оценки принципиальной возможности воздействия слабых переменных магнитных полей антропогенного и природного происхождения на человека и животных и проведения соответствующих эпидемиологических исследований;
- разработки санитарноЦгигиенических норм, связанных с воздействием антропогенных полей на человека и животных;
- создания нового поколения магнитотерапевтической аппаратуры;
- создания новых медицинских технологий при лечении социально - значимых заболеваний.
Положения, выносимые на защиту.
1. Слабые и крайне слабые переменные магнитные поля различных с амплитудами 0-200 мкТл модулируют (активируют и ингибируют) протекания таких биопроцессов как: регенерация планарий, гравитропическая реакции в стеблях растений, образования активных форм кислорода в нейтрофилах.
2. Зависимости величин биоэффектов от частоты и амплитуды переменной компоненты комбинированных магнитных полей в режиме параметрического резонанса и комбинированных магнитных полей с крайне слабой амплитудой переменной компоненты (<10 мкТл) имеют полиэкстремальный характер, предсказываемый моделью магнитного параметрического резонанса. Механизм действия таких полей идентичен для тест-систем животного и растительного происхождения.
3. Комбинированные магнитные поля с частотой переменной компоненты, равной 39 ларморовской частоте для спинов ядер биологически важных атомов 23Na, K, P, 63 55 59 Cu, Mn, Сo, Cl изменяет скорость регенерации планарий. Частотная зависимость величины биоэффекта имеет резонансный характер. Этот результат служит основанием для дальнейшего развития модели магнитного параметрического резонанса.
4. Экспериментальные данные позволяют рассматривать в качестве первичных мишеней биологического действия слабых магнитных полей:
- ионы Са2+, Mg2+, К+ в центрах связывания ферментов;
- спины ядер атомов, имеющихся в биологических системах, такие как 23Na, 39K, 31P, Cu, 55Mn, 1Н, 59Сo, 35Cl;
- орбитальные магнитные моменты электронов.
Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на:
Первом Международном симпозиуме Фундаментальные науки и альтернативная медицина (Пущино, 1997); III Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1998); II съезде биофизиков России (Москва, 1999); 2nd Alexander Gurwitsch Conference (Moscow, 2000); 23th Annual Meeting of BEMS (St. Paul, Minnesota, USA, 2001); III Международном симпозиуме Механизмы действия сверхмалых доз (Москва, 2002); III Международном Конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине (Санкт - Петербург, 2003); междисциплинарном семинаре Биологические эффекты солнечной активности (Пущино, 2004); 3d Alexander Gurwitsch Conference УBiophotons and coherent systems in biology, biophysics and biotechnologyФ (Partenit, Crimea, Ukraine, 2004); VI Международной конференции Космос и биосфера: Космическая погода и биологические процессы (Партенит, Крым, Украина, 2005); IV Международном Конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине (С-Петербург, 2006); 4th International Workshop "Biological effects of EMFs" (Crete, Greece, 2006); IV Международной научнотехнической конференции Медэлектроника-2006 (Минск, 2006); II Международной конференции "Человек и электромагнитные поля" (Саров, 2007); VII Международной конференции Космос и биосфера: Космическая погода и биологические процессы (Украина, Судак, 2007); V Международном Конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине (С-Петербург, 2009); III Международной конференции Человек и электромагнитные поля (Саров, 2010); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии Медицинская физика - 2010 (Москва, 2010); секции Ученого совета ИТЭБ РАН Биофизика сложных систем (Пущино, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ, в том числе 13 статей в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
В главе Обзор литературы представлен анализ экспериментальных работ, в которых исследовалось влияние слабых и крайне слабых переменных комбинированных магнитных полей на различные биологические системы. В одном из разделов этой главы изложены основные положения модели магнитного параметрического резонанса (Ledenv, 1991; Lednev, 1994; Леднев, 1996; Леднев, 2003), количественные предсказания которой стали основой для проведения соответствующих экспериментальных исследований. Ниже приводятся некоторые формулы необходимые для интерпретации и обсуждения экспериментальных результатов, приведенных в работе.
Модель МПР. Первичным звеном в цепи событий, запускаемых воздействием слабого магнитного поля на биосистему является ион Ca2+, специфически связанный с Ca2+-связывающим центром белка, который обладает Ca2+-зависимой ферментативной активностью. Связанный Ca2+ может рассматриваться, как изотропный, заряженный осциллятор. За момент возбуждения Ca2+-осциллятора принимается момент его входа в Ca2+-связывающий центр белка. После такого возбуждения Ca2+-осциллятор совершает незатухающие колебания, прерываемые лишь его диссоциацией из центра связывания. Магнитное поле (постоянное, переменное, комбинированное) вызывает прецессию оси вибраций Ca2+-осциллятора относительно направления магнитного поля. При определенных соотношениях между временем жизни Ca2+-осциллятора и параметрами магнитного поля, можно существенно изменить степень поляризации колебаний Ca2+осциллятора в плоскости, перпендикулярной направлению магнитного поля. Постулируется, что вероятность изменения структуры Ca2+-связывающих центров в каждом цикле Ca2+-зависимой биохимической реакции и, следовательно, вероятность изменения сродства Ca2+ к Ca2+-связывающим центрам зависит от степени средней по времени поляризации колебаний Ca2+-осциллятора. Указанная зависимость лежит в основе эффектов слабых магнитных полей на биосистемы.
Значения биологически эффективных частот переменной компоненты поля для иона данного типа определяются выражением (Liboff, 1985):
1 q f B (1) n DC n 2m где fn - резонансная частота, (Герц); q - заряд иона (Кулон); m - масса иона (килограмм); BDC - магнитная индукция постоянной компоненты КМП (Тесла), n - целое число, равное 1, 2, 3Е.
Величина биоэффекта ( p ), индуцируемого КМП в режиме параметрического резонанса, т.е.
при частотах переменной компоненты поля, близких к fn, определяется квадратом функции Бесселя n -го порядка (Леднев, 1996):
p J 2 fL f (2) n 1 nf fn где f (Гц) - частота переменной компоненты поля; fL (Гц) - частота Лармора, соответствующая пику амплитуды переменной компоненты поля; (сек-1) - полуширина (на половине высоты) пика частотной зависимости ответа биосистемы на воздействие КМП, = k/2 при этом, где k (сек-1) - константа скорости диссоциации данного иона из центра связывания Са2+ в белке. Второй сомножитель в правой части выражения (2) определяет зависимость величины биоэффекта от частоты переменной компоненты КМП. Наибольшая величина биоэффекта достигается при точной настройке КМП на основную, или лциклотронную, частоту для данного иона, т.е. при n=1 и, соответственно, f=f1. В этом случае (2) сводится к выражению:
2 p J 2 f f J B B (3), 1 L 1 AC DC которое принимает максимальное значение при ВАС/BDC =1.84.
При полном отсутствии переменной компоненты поля, биоэффект постоянного магнитного поля, BDC, определяется выражением (Леднев, 1996):
0,p =, (4), 0,3 1 fc2 где fc - лциклотронная частота иона с 0,2 зарядом q и массой m, а = k/2, где k (с-1) - константа скорости диссоциации данного иона из центра связывания Са2+ в Са2+ - зависимом 0,ферменте.
0,f Рис. 1 Вид функции описанный выражением (2) Вариант модели МПР для КС ПеМП. В основе биологического действия КС ПеМП лежит индуцированная им частотная модуляция электромагнитного поля, обусловленная прецессией соответствующих магнитных моментов в постоянном магнитном поле Земли. Появление биологических эффектов КС ПеМП, согласно предположению В.В. Леднева, возможно вследствие особенности частотной модуляции, когда при определенных соотношениях амплитуды и частоты переменной компоненты поля амплитуды ближайших к несущей частоте сателлитов могут быть большими даже при очень малых величинах магнитной индукции КС ПеМП (Леднев, 2003). Согласно классическим представлениям, в постоянном магнитном поле происходит равномерная прецессия магнитных моментов (например, ядерных спинов) вокруг оси поля с частотой Лармора:
0 BDC, (5), где - величина гиромагнитного отношения для данного магнитного момента. Добавление к постоянному полю коллинеарно направленной переменной компоненты приведет к частотной модуляции электромагнитного поля, генерируемого вращающимся спином. В реальной биосистеме имеется ансамбль магнитных моментов (например спинов атомов водорода), возбуждаемых с постоянной скоростью в различные моменты времени. Интенсивность электромагнитного поля, B A / B C D C излучаемого таким ансамблем на частоте модуляции, т.е. на частоте КС ПеМП, может быть аппроксимирована выражением (Леднев и др., 2003):
I kJ1( BAC f ) [ J2( BAC f ) J0 ( BAC f )] cos 2ft, (6), где k - константа. Фактически выражение (6) описывает интенсивность магнитного шума, создаваемого системой хаотически возбуждаемых магнитных моментов. Предложенная в работе модель, с одной стороны, позволяет рассчитать необходимые для достижения максимального эффекта параметры переменного магнитного поля, а с другой - при известных параметрах, благодаря тому, что в аргумент функции Бесселя входит гиромагнитное отношение - произвести идентификацию возможных первичных мишеней.
Согласно утверждению автора модели, некоторые из основных предположений, положенных в основу теории МПР, требуют дальнейшего обоснования. Прежде всего, это относится к постулату о возможности аппроксимации колебаний связанного иона идеальным заряженным изотропным осциллятором, т.е. возможности пренебречь влиянием теплового шума на прецессию атомов в Са2+связывающем центре белка (Леднев, 1996). Однако, количественные выводы, следующие из модели, дают возможность определять параметры биотропных МП и дают основу для постановки соответствующих экспериментов.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Техника получения МП. Комбинированные магнитные поля. В работе использовали комбинированные магнитные поля (КМП). КМП, состоящее из коллинеарно направленной постоянной, BDC, и переменной, BAC, создавали следующим способом. В качестве постоянной компоненты поля использовали локальное поле Земли в месте расположения тест-системы, а переменную компоненту, направленную параллельно земному полю, создавали с помощью катушечной пары Гельмгольца диаметром 39 см.
Величина постоянной компоненты поля BDC определялась с помощью феррозондового магнитометра типа СГК-64М (завод "Геологоразведка") с точностью 0.01 мкТл. Амплитуду и частоту переменной компоненты, задавали с помощью генератора ГЗ-112. Амплитуду переменной компоненты поля BAC, устанавливали с учетом величины передаточного коэффициента к (=10 мкТл/1В) катушки Гельмгольца.
КМП в режиме магнитного параметрического резонанса. Значения соотношения амплитуд постоянного и переменного компонентов поля BAC/BDC, а также частоты, f, переменной компоненты поля устанавливались в соответствии с теорией МПР.
Постоянные магнитные поля. Постоянные МП с величиной магнитной индукции в пределах от 0.5 до 350 мкТл получали, снижая или увеличивая величину локального постоянного МП Земли с помощью катушки Гельмгольца диаметром 39 см, продольная ось которой была направлена вдоль вектора МП Земли. Постоянное напряжение на катушку подавали от стабилизированного генератора напряжения С-23.
Крайне слабые переменные комбинированные магнитные поля. КМП с крайне слабой амплитудой переменной (синусоидальной) компоненты поля получали как описано выше. Амплитуду переменной компоненты поля задавали с учетом коэффициента передачи катушки Гельмгольца, равного 10мкТл/1В, где 1В - амплитуда (пик) синусоидального напряжения, подаваемого на катушку. Величина фонового переменного магнитного поля на частоте 50 Гц в месте постановки экспериментов составляла 15 нТл.
2.2. Сегменты надземных осевых органов проростков проса, клевера и льна.
Биопроцесс: гравитропический изгиб апикальных участков сегментов, сопровождающий поворот сегментов из вертикального в горизонтальное положение.
Метод регистрации эффектов МП: измерение среднего угла изгиба апикального конца сегмента относительно горизонтальной плоскости.
Подготовка сегментов растений. Проростки проса (Panicum miliaceum) и льна (Linum bienne) выращивали из семян в термостате при 26 0С в полной темноте в течение 3-дней в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной 5 мл дистиллированной воды (по 50 семян в чашке), а также в специальных растильнях. Через 3Ц4 дня стебли проса и льна достигали длины 3Ц4 см. От верхушки стеблей отрезали листья так, что отрезок содержал только апикальную часть стебля длиной 25 мм. В опытах использовали также полевые (дикорастущие) проростки клевера лугового (Trifolium prateuse). С этой целью нарезали примерно 100 стеблей одинаковой длины (около 10 см), которые до начала опыта помещали в вертикальном положении в цилиндры с водопроводной водой. Опыты начинали через 15Ц20 минут после сбора стеблей. От каждого из стеблей отрезали верхние части длиной 25 мм, с верхушек которых срезали листья.
Стимуляция гравитропического ответа. Отрезки стеблей проса, льна и клевера раскладывали в чашки Петри диаметром 90 мм на фильтровальной бумаге, смоченной 2 мл дистиллированной воды по 20 отрезков на чашку. Положение базальных концов отрезков фиксировали, накладывая на них силиконовые кольца. Как в лопыт, так и в контроль ставили по 2 чашки Петри. Примерно через 30 минут горизонтально расположенные отрезки начинают изгибаться, так что через 1.5-2 часа угол изгиба составляет несколько десятков градусов. Величину гравитропического ответа определяли путем измерения среднего по числу отрезков угла изгиба (отклонения конца отрезка от горизонтальной плоскости) , где стандартная ошибка средней величины. Измерения проводили через 1.5-2 часа после начала опыта с помощью транспортира. Величину эффекта МП выражали как относительную разницу (в %) между средними углами э и к гравитропического изгиба сегментов, измеренных, соответственно, в опытных, т.е. экспонированных в магнитном поле 100%, где э и к э к э к и в контрольных образцах, согласно выражению:
к - стандартные ошибки средних величин углов изгиба.
2.3. Тест-система 2: регенерирующие плоские черви - планарии Girardia tigrina.
Биопроцесс: скорость регенерации ампутированной головной части планарий.
Подготовка планарий к эксперименту. Планарий содержали в прудовой воде (смесь водопроводной и дистиллированной воды в пропорции 2:1) при комнатной температуре и кормили раз в неделю личинками двукрылых. Для экспериментов отбирали животных длиной около 10 мм и прекращали их кормление за 7 дней до опытов.
Регенерация вызывалась ампутацией 1/5 части тела планарий, содержащей головной ганглий, в области непосредственно под лушами. Регенерирующие планарии помещались в стеклянные стаканы (по 30 особей на стакан), содержащие по 20 мл прудовой воды. Один из стаканов (контроль) устанавливали в локальном геомагнитном поле, другой - в центре колец Гельмгольца, в которых создавалось требуемое МП. Температура воды в экспериментальном и контрольном стаканах поддерживалась одинаковой с точностью до 0.5оС. Эксперименты в каждой серии повторялись не менее 3-х раз.
Методы оценки эффектов магнитных полей.
1. Определение пролиферативной активности необластов. Митотическую активность клеток из постбластемы регенерирующих планарий определяли с помощью модифицированного метода Багуньи (Baguna & Salo, 1981). Сразу после ампутации в среду добавляли колхицин в конечной концентрации 0.05 %, который обеспечивал остановку митозов в метафазе и их накопление в течение опыта. Через 24 часа участки постбластемы ампутировали и помещали в диссоциирующую смесь, содержащую ледяную уксусную кислоту, 96% этиловый спирт, глицерин и воду в соотношении объемов 1:3:2:14. Каждый экспериментальный образец содержал 4 постбластемы в 70 мкл раствора. Через 20-минут образец подвергали трехминутному механическом встряхиванию, что приводило к образованию суспензии диссоциированных клеток. Для выявления метафазных фигур в каждый образец добавляли 20 мкл 0.05% раствора Hoechst-3342 ("Sigma") и фиксировали образец формалином.
Модификация метода Багуньи, который выявлял метафазные фигуры в фазовом контрасте, заключалась в применении витального ДНК-тропного флуоресцентного красителя Hoechst-3342 (2-2 4-оксифенил-6-бензимедазолил) (Тирас и др., 1996). Количество метафазных фигур определяли с помощью флуоресцентного микроскопа Fluoval ("Carl Zeiss", Jena). Каждое экспериментально полученное значение митотического индекса (МИ) является результатом усреднения по 7000 клеток.
Эффект КМП оценивали после 24 часов экспозиции по разнице величин митотического индекса МИ (% ) в опытных и контрольных образцах, по формуле:
(МИЭ МИК ) (Э ) К - где МИЭ - величина митотического индекса в МИ 100% МИК экспериментальных, а МИК - контрольных образцах, Э,К - стандартные ошибки измерений.
2. Метод прижизненной компьютерной морфометрии.
Метод оценки эффектов магнитных полей: метод прижизненной компьютерной морфометрии (Тирас, Сахарова, 1984; Тирас, Хачко, 1989). Для получения стандартных изображений регенерирующих планарий применяли комплекс оборудования, включающий видеокамеру Appro 7900, смонтированную на окуляре бинокулярного микроскопа МБС-10, и компьютера IBM PC 486 AT, состыкованными с помощью видеограббера DigitEye DE-15 ("Candela", Москва). Этот видео-компьютерный комплекс для получения и анализа изображений позволяет изучать любые геометрические характеристики тела планарий.
С помощью специального пакета программ Plana 4.4 определялась общая площадь тела животного и площадь бластемы. В качестве количественного критерия роста был использован индекс регенерации R=s/S, где s - площадь бластемы, S - площадь всего тела регенеранта в данный момент времени. Каждое из измеряемых значений R как в опыте, так и в контроле является результатом усреднения измерений на 30 животных. Изменение индекса регенерации в эксперименте по сравнению с контролем определялось по (RЭ RК ) (Э К ) формуле:, где R - разница (%) между величинами индекса R 100% RК регенерации в экспериментальных RЭ и контрольных RК образцах, Э,К - стандартные ошибки измерений в опыте и контроле. Ошибка в определении R в каждой выборке не превышала 3%.
2.4. Тест-система 3: перитонеальные нейтрофилы мышей.
Биопроцесс: скорость генерации активных форм кислорода (АФК) в нейтрофилах.
Метод регистрации эффектов магнитных полей: измерение интенсивности люминол - зависимой хемилюминесценции (ХЛ).
Получение нейтрофилов. Иcпользовали белыx лабоpатоpныx мышей линии NMRI.
Cpедняя маccа животного cоcтавляла 20Ц25 г. В пеpитонеальную полоcть мыши инъециpовали 150 мкл cуcпензии зимозана (5мг/мл). Чеpез 12 ч поcле декапитации животныx бpюшную полоcть пpомывали тpемя миллилитpами оxлажденного pаcтвоpа Xенкcа. Экccудатcобиpали пипеткой и центpифугиpовали в течение 4 мин пpи 600 g.
Cупеpнатант декантиpовали, а оcадок pазводили в 1 мл беcкальциевого pаcтвоpа Xенкcа и оcтавляли на 40 мин пpи 4C. Пpи xpанении клеток в уcловияx низкой темпеpатуpы (2Ц4C) в беcкальциевой cpеде cнижаетcя уpовень cпонтанной xемилюминеcценции (XЛ). Такие клетки мы cчитали интактными и иx физиологичеcкое cоcтояние пpинимали за иcxодное.
Количеcтво выделенныx клеток подcчитывали в камеpе Гоpяева. Жизнеcпоcобноcть опpеделяли иcпользуя витальный кpаcитель тpипановый cиний. Cодеpжание живыx клеток пpи этом было не менее 95%. Опытные и контpольные обpазцы получали, pазводя cуcпензии нейтpофилов cтандаpтной cpедой Xенкcа. Для pазвития XЛ и запуcка pеакции к обpазцам добавляли люминол (до концентpации 10Ц5 М) и один из активатоpов генеpации АФК: а) фоpбол-12-меpиcтат-13-ацетат (ФМА) (310Ц8 М); б) бактеpиальный пептид Nфоpмил L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин (FMLP) (10Ц6 М).
Измеpение xемилюминеcценции. Обpазование активныx фоpм киcлоpода опpеделяли по интенcивноcти люминоЦзавиcимой xемилюминеcценции. Pегиcтpацию XЛ пpоводили в пpобиpочном люминометpе Люцифеp 02М (Pоccия). Cуcпензию нейтpофилов поcле добавления активатоpов помещали в магнитное поле. XЛ-ответ pегиcтpиpовалcя на пpотяжении экcпозиции клеток в магнитном поле каждые две минуты. Вpемя измеpения XЛ одного обpазца cоcтавляло 10Ц15 c. Контpольные обpазцы наxодилиcь в магнитном поле Земли. Извеcтно, что пpи добавлении к нейтpофилам и макpофагам такиx активатоpов, как ФМА и FMLP, пpи 37C ответ на cтимулы pазвиваетcя в течение неcколькиx минут. Мы пpоводили экcпониpование клеток пpи комнатной темпеpатуpе, котоpая в pазные дни cоcтавляла 16Ц21C, но во вpемя пpоведения экcпеpимента оcтавалаcь поcтоянной.
Величину биологичеcкого эффекта pаccчитывали по фоpмуле: ((Iоп - Iкон)/Iкон)100%, где Iоп и Iкон значения интенcивноcти xемилюминеcценции опытныx и контpольныx обpазцов cоответcтвенно, измеpенные в макcимальной точке. Уcpеднение пpоводили по тpем опытным и тpем контpольным обpазцам.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выбор объектов исследования для индикации эффектов МП.
Согласно модели МПР, биологическое действие комбинированных магнитных полей может быть объяснено, исходя из представлений о воздействии таких полей на скорость некоторых Са2+-зависимых биохимических реакций,опосредуемых Са2+кальмодулин киназой и протеинкиназой С - зависимых реакций (Леднев, 1996). Это предположение было подтверждено экспериментально в работе Шуваловой, где было показано, что скорость Са2+-кальмодулин-зависимого фосфорилирования легких цепей миозина в растворе меняется при воздействии КМП, настроенного на резонанс для ионов Са2+(Шувалова и др., 1991). Исходя из этого, было необходимо подобрать тест-системы, которые удовлетворяли бы следующим требованиям: (1) биологическая реакция должна развиваться во времени; (2) в системе должна быть высокая активность Са2+-зависимых киназ. Такие условия реализуются, например, в культуре раковых клеток, а также в культурах клеток, находящихся в логарифмической стадии роста.
Тест-система 1 - регенерирующие планарии. Согласно литературным данным, представители класса Turbellaria, к которым относятся планарии, обладают уникальной системой стволовых клеток, необластов (Baguna, 1981). В подавляющем большинстве работ необласты планарий рассматриваются как основной источник клеточного материала при регенерации (Кричинская, 1980; Slack,1980; Baguna, 1981). Кроме того, эту модель использовали другие авторы для исследования влияние КМП, настроенных на лциклотронную частоту для ионов Са2+ (Jenrow et al., 1995). Механизмы активации клеточной пролиферации и дифференцировки при регенерации планарий через сигнальные молекулы, мембранные рецепторы и вторичные мессенджеры не отличаются от известных к настоящему времени для других клеточных систем (Villar & Schaeffer, 1993; Baguna et al., 1994). Согласно имеющимся данным, в регуляцию ранней стадии регенерации вовлечена протеинкиназа-С (ПК-С), наличие которой в планариях было показано Мартелли и др. (Martelly et al., 1987). Таким образом, имевшиеся к моменту начала нашей работы и появившиеся в ходе ее выполнения литературные данные показывают, что регенерация планарий представляет собой хорошо воспроизводимый и легко наблюдаемый процесс, который осуществляется за счет миграции, пролиферации и дифференцировки необластов. В работе использовалось два метода, которые описаны в разделе лОбъекты и методы исследования.
Тест-система 2 - гравитропическая реакция растений. Известно, что системы внутриклеточной Са2+- регуляции метаболизма в растениях близки к таковым в клетках животных (Bush, 1995; Sinclair, Trewavas, 1997). Установлено, что в сигнальной цепи, регулирующей гравитропический ответ, как в корнях, так и в надземных органах растений, определяющую роль играют Са2+- зависимые реакции фосфорилирования, осуществляемые киназами, подобными, хотя и не идентичными, кальмодулин-зависимым киназам в клетках животных (Satterlee, Sussman, 1998;
Snedden, Fromm, 1998). Эти данные позволили предположить, что гравитропическая реакция может служить удобной тест-системой для индикации эффектов МП при использовании КМП, настроенных на резонанс для ионов Са2+. Автором работы был разработан метод измерения углов гравитропического изгиба в проростках стеблей льна, клевера и проса, который описан в главе Объекты и методы исследования.
Тест-система 3 - перитонеальные нейтрофилы мышей. Известно, что генерация АФК в нейтрофилах осуществляется в результате работы мультиферментного комплекса - НАДФН-оксидазы, локализованного в плазматической мембране (Thelen et al., 1993; Shepard et al., 2005). Обязательным этапом в цепи реакций, приводящих к активации НАДФН-оксидазы, является ее ассоциация с цитозольными белками - p47phox, p40phox и p67phox (Shepard et al., 2005).
Указанная ассоциация происходит лишь после фосфорилирования белка р47phox, осуществляемого в большинстве случаев протеинкиназой С (ПКС) и в некоторых случаях сАМФ-зависимой киназой (Bey et al., 2004; Dang et al., 2001; Fontayne et al., 2002). Активированная ПКС фосфорилирует также ряд других белков нейтрофилов и, в том числе, G-белки, которые, в свою очередь, модулируют активацию НАДФНоксидазы через фосфолипаза С (ФЛС) - и фосфолипаза Д (ФЛД) - зависимые пути (Bellavite et al., 1988; Rossi et al., 1990; Gijon et al., 2000; Shiose and Sumimoto, 2000;
Palicz et al., 2001). Поэтому данная тест-система была выбрана для проверки возможного биотропного действия КМП, настроенного на параметрический резонанс для ионов Са2+. Недостатком этой модели является ее относительная техническая и методическая сложность. Поэтому в большинстве экспериментов были использованы две тест-системы: регенерирующие планарии и гравитропическая реакция растений, позволяющие получать легко измеряемые и хорошо воспроизводимые результаты.
3.2. Специфически связанные ионы как возможные первичные мишени для воздействия слабых КМП.
Согласно модели МПР, комбинированное МП может быть настроено на резонанс для некоторых ионов, находящихся в Са2+ - связывающих центрах ферментов (Леднев, 1996). К таким ионам относятся прежде всего Са2+, К+ и Мg2+ (КМП, настроенное на резонанс для этих ионов в дальнейшем обозначается как Са2+-КМП, К+-КМП и Мg2+-КМП). Поэтому, первым этапом работы было исследование принципиальной возможности получения эффектов действия КМП в режиме параметрического резонанса на биологические тест-системы.
3.2.1. Активация и ингибирование гравитропической реакции в стеблях растений и скорости пролиферации необластов в регенерирующих планариях при действии КМП.
Экспонирование отрезков проса, льна и клевера в КМП настроенном на параметрический резонанс для ионов Са2+ сопровождается стимуляцией гравитропической реакции, что проявляется в увеличении среднего угла изгиба на несколько десятков процентов по сравнению с таковым в контрольных отрезках, находившихся в локальном МП Земли (рис. 2а). Экспонирование отрезков проса, льна и клевера в К+-КМП приводит к статистически достоверному уменьшению среднего угла гравитропического изгиба отрезков (рис. 2б). В экспериментах частота переменной компоненты К+-КМП была выбрана равной третьей гармонике основной частоты для К+. Использование 3Цй гармоники основной частоты позволяет избежать наложения эффектов разного знака, возникающих из-за близости величин основной частоты для К+-КМП (18.25 Гц) и второй субгармоники (17.8 Гц) основной частоты для Са2+-КМП при значении ВDC = 46.5 мкТл (Леднев, 1996). Экспонирование отрезков проса и льна в Mg2+-КМП не приводило к статистически значимым результатам (2%6%).
опыт контроль а б просо клевер лен просо клевер лен Рис. 2. Влияние Са2+-КМП (а) и К+-КМП (б) на гравитропическую реакцию отрезков стеблей проса, клевера и льна. Параметры КМП приведены в Таблице 2. Каждый столбик результат усреднения по 5 независимым экспериментам.
Угол изгиба, градусы Угол изгиба, градусы При экспонировании регенерирующих планарий в Са2+ - и Mg2+-КМП наблюдалось увеличение пролиферации необластов (Таблица 1, представлены результаты усреднения по трем независимым экспериментам). Ингибирование регенерации при экспонировании планарий в К+-КМП было показано в работе Рождественской (Рождественская, 2003).
Обобщенные данные представлены в Таблице 1, параметры КМП для каждой серии экспериментов указаны в Таблице 2.
Таблица 1. Влияние КМП на скорость гравитропической реакции и скорость регенерации планарий.
Величина биоэффекта Тип поля Митотическая Гравитропическая активность необластов реакция в отрезках в регенерирующих стеблей льна планариях Са2+-КМП + 50% 9% + 42% 8% К+-КМП - 20% 6% (*) - 45% 6% Mg2+-КМП + 48% 9% + 2% 6% (*) по данным Рождественской, 2003.
Таблица 2. Параметры КМП, использовавшихся в экспериментах.
Тест - система Параметр Са2+-КМП К+-КМП Mg2+-КМП КМП Регенерирующие ВDC, мкТл 20.9 0.1 40.5 0.1 20.9 0.планарии BAC, мкТл 38.4 0.1 74.7 0.1 38.4 0.f, Гц 16.0 0.1 47.7 0.1 26.4 0.Гравитропическая ВDC, мкТл 46.5 0.1 46.5 0.1 46.5 0.реакция BAC, мкТл 85.6 0.1 85.6 0.1 85.6 0.f, Гц 35.8 0.1 54.7 0.1 58.7 0.Как видно из таблицы 1, КМП, настроенное на резонансные условия для Ca2+ и для Mg2+ вызывает биоэффекты одинакового знака - увеличение скорости пролиферации необластов, в то время как экспонирование проростков проса и льна в Mg2+-КМП не приводит к статистически достоверным результатам.
Известно, что для активации протеинкиназы С необходимо одновременное связывание Ca2+ и Mg2+, а для активации кальмодулин - зависимой киназы - требуются только Ca2+ (Lester and Blumfeld, 1991). Поэтому биоэффекты Са2+-КМП и Mg2+-КМП косвенно свидетельствуeт о том, что возможными мишенями действия КМП могут служить биохимические реакции фосфорилирования, опосредуемые в случае регенерирующих планарий, протеинкиназой С, а в случае гравитропической реакции - Са2+ - кальмодулин зависимой киназой. Противоположный знак эффектов Са2+-КМП и К+-КМП можно объяснить, исходя из следующих соображений. Известно, что К+ имеет относительно малое сродство (102Ц103 М-1) к Са2+ - связывающим центрам белков (Пермяков, 1985). Однако, поскольку внутриклеточная концентрация К+ весьма велика (~150 мМ), он способен конкурировать с Са2+ за специфические центры связывания Са2+ в кальмодулине (Haiech et al., 1981). Вместе с тем, замещая Са2+ в центрах связывания кальмодулина, К+ не способен активировать ферментативную активность соответствующей кальмодулин - зависимой киназы.
Если предположить, что экспонирование Са2+ - зависимой киназы в КМП любого типа сопровождается снижением сродства ионов к Са2+ - связывающим центрам, то в этом случае К+-КМП и Са2+-КМП будут соответственно ингибировать и активировать Са2+ - зависимую киназу. Полученные данные можно считать косвенным подтверждением того, что возможной мишенью действия КМП в регенерирующих планариях является протеинкиназа С, а в гравитропической реакции растений - Са2+-кальмодулин-зависимая киназа.
3.2.2. Активация и ингибирование скорости образования активных форм кислорода в перитонеальных нейтрофилах мышей при воздействии Са2+-КМП.
Пpи экcпониpовании в Cа2+-КПМ нейтpофилов, активиpованныx ФМА, наблюдали снижение максимальной интенcивноcти XЛ на 23 2%, что cвидетельcтвует об инигибиpовании уpовня генеpации АФК. В Таблице пpедcтавлены данные по пяти незавиcимым экcпеpиментам, а на pиc. 3 пpедcтавлен гpафик типичного экcпеpимента. Экcпеpименты пpоводили в шиpоком диапазоне концентpаций ФМА (510Ц9 - 10Ц7 М), однако, в табл. 3 пpедcтавлены более детально выполненные измеpения пpи концентpации ФМА 310Ц8 М. Данная концентpация оказалаcь наиболее лудобной для выявления эффектов МП. Cледует отметить, что во вcеx cлучаяx, незавиcимо от концентpации ФМА, наблюдалcя ингибиpующий эффект Cа2+-КМП на интенcивноcть XЛ, пpимеpно на 15Ц25% (данные не пpиводятcя). Пpи иcпользовании в экcпеpиментаx c Cа2+- КМП дpугого активатоpа - FMLP - воздейcтвие магнитного поля пpиводило к пpотивоположному pезультату - pоcту xемилюминеcценции в обpазцаx, что cоответcтвует увеличению пpодукции АФК на 21 3% (табл. 4, pиc. 4).
Активатоp нейтpофилов - ФМА - запуcкает отноcительно коpоткую цепочку биоxимичеcкиx pеакций, пpиводящиx к генеpации АФК. Извеcтно, что cкоpоcть генеpации АФК в ФМА-активиpованныx нейтpофилаx пpопоpциональна cтепени фоcфоpилиpования одного из компонентов НАДФН-окcидазы - белка p47phox (Thelen et al., 1993; Shepard et al., 2005). Можно предположить, что Cа2+-КМП ингибиpуя киназную активноcть пpотеинкиназы C, ингибирует, соответственно, степень фосфорилирования белка р47phox что пpиводит к cнижению cкоpоcти генеpации АФК нейтpофилами.
Пpи иcпользовании бактеpиального пептида FMLP в качеcтве активатоpа нейтpофилов чиcло pеакций, оcущеcтвляющиx пеpедачу cигнала от pецептоpа FMLP к НАДФН-окcидазе, cущеcтвенно увеличиваетcя. Неcмотpя на то, что и в этом cлучае пpедполагаемой пеpвичной мишенью воздейcтвия Cа2+-КМП оcтаетcя ПКC, знак эффекта меняетcя на пpотивоположный - воздейcтвие Cа2+-КМП на нейтpофилы cопpовождаетcя активацией cинтеза АФК (табл. 4, pиc. 3). Этот pезультат можно объяcнить существованием отpицательной обpатной cвязи между активноcтью фоcфолипазы C (ФЛC) и пpотеинкиназы C в FMLP-активиpованныx нейтpофилаx (Naccache et al., 1985; Smith et al., 1987), а также наличием ПКCнезавиcимыx путей активации НАДФН-окcидазы (Bellavite et al., 1988; Rossi et al., 1990; Gijon et al., 2000; Shiose and Sumimoto, 2000; Palicz et al., 2001).
14Б А 1210А Б 608406опыт 420контроль опыт контроль 20 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 Время, мин Время, мин Рис.3 Ингибиpующее влияние Cа2+-КМП Рис. 4. Активиpующее влияние Cа2+-КМП на на cкоpоcть генеpации АФК в cкоpоcть генеpации АФК в нейтpофилаx, нейтpофилаx, активиpованныx ФМА. активиpованныx FMLP. Пpедcтавлены Пpедcтавлены pезультаты типичного pезультаты типичного экcпеpимента (а) и экcпеpимента (а) и уcpеднение по уcpеднение по обpазцам (б), концентpация обpазцам (б), концентpация ФМА 10Ц8 М. FMLP 10Ц6М. Pезультаты измеpений в Cветлые кpужки - pезультаты опытныx обpазцаx - cветлые кpужки; в измеpений в опытныx обpазцаx; темные контpоле - темные кpужки. Темпеpатуpа кpужки - в контpольныx обpазцаx. 18C. По оcи оpдинат - интенcивноcть Темпеpатуpа 21C. По оcи оpдинат - xемилюминеcценции (Ixл, имп/мин).
интенcивноcть xемилюминеcценции (Ixл, имп/мин).
Интенсивность ХЛ, имп/мин Итнтенсивность ХЛ,имп/мин Таблица 3. Влияние Cа2+-КМП на интенcивноcть xемилюминеcценции в нейтpофилаx, cтимулиpованныx ФМА в концентpации 310Ц8 М условные единицы Номер Интенсивность ХЛ, Биоэффект, % Температура, опыта С в контроле в опыте 1 2664 133 3499 167 -24 2 3234 129 4130 175 -22 3 3995 177 4797 163 -25 4 4571 88 5641 120 -19 5 3894 145 5134 201 -23 Ср. 3671 735 4640 841 -23 2.знач.
Таблица 4. Влияние Cа2+-КМП на интенcивноcть xемилюминеcценции в нейтpофилаx, cтимулиpованныx FMLP в концентpации 10Ц6 М Интенсивность ХЛ, условные единицы Номер Биоэффект, % Температура, опыта С в опыте в контроле 1 1083 46 874 33 24 2 1865 74 1524 53 22 3 1655 54 1371 47 21 4 1558 61 1327 51 17 Ср. 1540 331 1274 280 21 2.знач.
Примечание. В табл. 3 и 4 пpедcтавлены значения интенcивноcти XЛ в макcимальной точке - cpедние значения cтандаpтное отклонение.
Получение эффектов разного знака при влиянии Са2+-КМП и действии различных химических стимулов было также показано в работах при использовании в качестве тест-системы регенерирующих планарий (Рождественская, 2003; Lednev et al., 2005). Приведенные результаты показывают, что КМП, настроенное на резонанс для ионов Са2+ может как активировать, так ингибировать образование активных форм нейтрофилами в зависимости от типа активатора.
Таким образом, результаты, представленные в пп. 3.2.1 и 3.2.2 показывают, что КМП, настроенные на резонанс для ионов Са2+, К+ и Mg2+ могут как ускорять, так и замедлять протекание таких биологических процессов, как скорость гравитропической реакции в отрезках стеблей льна, проса и клевера, скорость регенерации планарий, скорость генерации активных форм в нейтрофилах.
3.2.3. Зависимость величины биологического эффекта от частоты переменной компоненты КМП.
В данной серии экспериментов были выполнены измерения зависимости величины биоэффектов от частоты переменной компоненты Са2+-КМП и Mg2+-КМП при фиксированных амплитудах переменной и постоянной компонент КМП с использование двух тест-систем: регенерирующих планарий (определение митотического индекса) и гравитропической реакции растений (измерение угла гравитропического изгиба). Согласно модели, эксперименты проводились при ВАС /ВDC = 1.Зависимость скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна от частоты переменной компоненты Са2+-КМП, и скорости пролиферации необластов в регенерирующих планариях от частоты переменной компонент Са2+-КМП и Mg2+КМП, имеет резко выраженный резонансный характер (рис. 5). Полуширина, , на половине высоты пика частотной зависимости равна, ~ 1.6 Гц (при использовании Са2+-КМП для обеих тест-систем) и 2.6 Гц (при влиянии Mg2+-КМП на регенерацию планарий). Экспериментально полученные точки хорошо аппроксимируются теоретической кривой согласно выражению (2). При аппроксимации максимум теоретической кривой (лорентциана) совмещали с экспериментально найденным максимумом эффекта. Согласно модели = k/2 = 1/2, где k- эффективная константа скорости диссоциации Са2+ из центра связывания, - время жизни иона в центре связывания, получим k 10.0 с-1 и 16.2 с-1, т.е. величины, соответствующие сильным центрам связывания двухвалентных ионов в Са2+ - связывающих белках (Пермяков, 1985).
Резонансный характер зависимости величины биоэффекта - ингибирование скорости фосфорилирования легких цепей миозина в растворе при воздействии Са2+-КМП показан в работе Шуваловой (Шувалова и др., 1991). Полуширина на половине высоты характеризуется величиной =0.5 Гц, что соответствует диссоциации Ca2+ из кальмодулина с константой k=3.14 с-1. Найденная величина сравнима по порядку со значениями 1.38 и 12.1 с-1 для констант диссоциации Ca2+ из сильных мест связывания в комплексе кальмодулин - меллитин, который некоторые авторы рассматривают как аналог комплекса кальмодулин - киназа (Леднев, 1996 и ссылка в ней Suco et., 1986).
Экспериментальные гр_час vs гр_теор гр_час vs гр_экс данные, приведенные в этом гр_час vs пл_теор гр_час vs пл_эксп пл_теор_Mg разделе соответствуют пл_эксп_ Mg утверждению о том, что ионы Са2+ и Мg2+, входящие в соответствующие центры связывания таких ферментов как протеинкиназа С и Са2+кальмодулин - зависимая киназа + -6 -4 -2 +2 4 fр + могут служить первичными Отклонение от резонансной частоты, Гц мишенями действия слабых Рис. 5. Зависимость величин биоэффектов КМП. Полученные (гравитропической реакции сегментов стеблей льна и митотической активности необластов) от частоты экспериментальные данные по переменной компоненты КМП.
По оси абсцисс - отклонение от резонансной частоты.
характеру зависимости скорости (1 ) Параметры Са2+-КМП (гравитропическая реакция):
BDC =46.5 мкТл, ВАС = 85.6 мкТл, f=33.8, 34.8, 35.регенерации планарий и (резонансная частота), 36.8, 37.8 Гц.
(2 ) Параметры Са2+-КМП (регенерация планарий): BDC скорости гравитропической =20.9 мкТл, ВАС = 38.4 мкТл, f=12.0, 14.0, 16.0, 18.0, 20.реакции сегментов льна от Гц.
(3 ) Параметры Mg2+-КМП (регенерация планарий):
частоты переменной компоненты BDC =20.9 мкТл, ВАС = 38.4 мкТл, f=20.4, 22.4, 24.4, 26.(резонансная частота), 28.4, 30.4, 32.4 Гц Са2+-КМП свидетельствует о Каждая экспериментальная точка - результат усреднения трех независимых экспериментов.
подобии Са2+ - регуляторных процессов в клетках животных и растений.
3.1.4. Зависимость гравитропической реакции в сегментах стеблей льна и скорости регенерации планарий от соотношения амплитуд ВАС/BDC Са2+-КМП и Mg2+-КМП.
На рис. 6 представлена зависимость величин биоэффектов - скорости гравитропической реакции и митотической активности необластов в регенерирующих планариях от соотношения амплитуд переменной, ВAC, и постоянной, BDC, компонент КМП. Поскольку во всех экспериментах величина ВDC была фиксированной, величина наблюдаемого биоэффекта зависела от амплитуды переменной компоненты поля. Как видно из рис. 6, указанная зависимость имеет полиэкстремальный характер: при увеличении амплитуды, ВАС, до значения ВАС= 1.8ВDC эффект увеличивается, при дальнейшем увеличении амплитуды, ВАС, - эффект снижается. Экспериментальные точки аппроксимируются квадратом функции Бесселя первого порядка J (ВАС/BDC) (при аппроксимации теоретический Величина биоэффекта, % максимум функции совмещали с экспериментальной точкой) согласно выражению (3). Функция имеет ряд убывающих по амплитуде максимумов, разделенных нулевыми значениями: в частности нули - при значениях ВАС/BDC = 0.0, 3.8, 7.0, 10.2, а максимумы - при значениях ВАС/BDC = 1.8, 5.3, 8.5. Максимальные величины биоэффектов - достигаются при значении ВАС/BDC =1.8, а первые и вторые нули- при значениях ВАС/BDC равных 0.0 и 3.8. Именно такая зависимость биоэффектов от соотношения ВАС/BDC ожидается в том случае, когда взаимодействие КМП с биосистемой происходит по механизму параметрического резонанса.
Таким образом, гравитропическая реакция результаты, регенерация планарий Ca2+- КМП, грав. реакция Ca2+- КМП, реген. планарий представленные в пп. 3.1.Mg2+- КМП, реген. планарий и 3.1.4 показывают, что величина биологических эффектов МП зависит от 20 частоты переменной компоненты поля и от соотношения амплитуд 1.переменной и постоянной 0 1 2 3 BAC/BDC компонент поля.
Рис. 6. Зависимость гравитропической реакции сегментов Экспериментальные данные стеблей льна от cоотношения, ВАС/BDC, величин магнитной находятся в хорошем индукции переменной и постоянной компонент Са2+-КМП.
(1 )Параметры Са2+-КМП: BDC =46.5 мкТл, f=35.8, ВАС/BDC соответствии с =0.0; 0.7; 0.9; 1.3; 1.6; 1.8; 2.1; 2.8; 3.4. ВАС = 0; 32.5; 41.8;
60.5; 74.4; 85.6; 97.6; 130.2; 158.1 мкТл теоретическими (2 ) Параметры Са2+-КМП: BDC =10.4 мкТл, f=8.0, ВАС/BDC = 0.0; 0.8; 1.8; 2.7; 3.6, ВАС = 0; 8.3; 19.1; 22.1; 37.4 мкТл предсказаниями модели (3 ) Параметры Mg2+-КМП: BDC =20.9 мкТл, f=26.4, ВАС/BDC = магнитного 0.0; 0.8; 1.8; 2.7; 3.6, ВАС = 0.0; 8.3; 19.1; 22.1; 37.4 мкТл параметрического резонанса. Характер частотной и амплитудной зависимости показывает идентичность механизма действия слабых КМП для растительных и животных тест-систем. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что ионы Са2+, Mg2+ и К+, входящие в соответствующие центры связывания таких ферментов как протеинкиназа С и Са2+-кальмодулин-зависимая киназа, могут служить первичными мишенями действия слабых переменных магнитных полей.
Величина биоэффекта,% 3.3. Активация и ингибирование гравитропической реакции в сегментах стеблей льна при изменении величины магнитной индукции постоянного поля в пределах от 0 до 350 мкТл.
Как было показано в п. 3.1.4, величина биологического эффекта зависит от соотношения амплитуд переменной и постоянной компонент поля. В экспериментах, описанных в п. 3.1.4, величина постоянного магнитного поля являлась фиксированной величиной. Задачей данной части исследования являлось выяснить будет ли изменение (уменьшение или увеличение) величины постоянного поля в 2-раза относительно величины земного поля вызывать биологический эффект при отсутствии переменной компоненты.
Как видно из рис. 7 скорость гравитропического изгиба отрезков стеблей льна существенно зависит от величины магнитной индукции постоянного МП. Частичная компенсация локального поля Земли в 10 раз (от 46.5 до 4.5 мкТл) не приводит к заметным изменениям степени гравитропического изгиба отрезков льна. Однако при значении BDC 2.0 мкТл наблюдается статистически достоверная активация гравитропизма.
Напротив, увеличение магнитной индукции постоянного МП до значений 100 мкТл BDC 170мкТл сопровождается ингибированием гравитропической реакции.
-При дальнейшем увеличении магнитной индукции скорость -гравитропического изгиба -приближается к контрольной 0.5 2 4.5 11 46.5 100 128 170 190 200 3величине (при BDC 1Магнитная индукция, мкТл Рис. 7. Зависимость гравитропической реакции отрезков мкТл). В интервале амплитуд стеблей льна от величины постоянного магнитного поля.
от 200 до 347 мкТл вновь Контрольные образцы находились в поле с величиной магнитной индукции ВDC= 46.5 мкТл. Каждый столбик - наблюдается статистически результат усреднения трех независимых экспериментов.
достоверная активация гравитропической реакции.
Согласно модели МПР изменение амплитуды постоянного МП может влиять на активность некоторых Са2+-зависимых ферментативных реакций (Леднев, 1996).
Величина биоэффекта, % В рамках этой модели можно объяснить стимуляцию гравитропического изгиба в сегментах льна лишь при значениях 0 BDC 2.0 мкТл. Относительно сложный характер последовательной смены активации и ингибирования гравитропического изгиба, наблюдаемый при увеличении амплитуды МП от 0 до 350 мкТл, может быть обусловлен наличием нескольких качественно различных мишеней для воздействия постоянного МП и не может быть объяснен в рамках модели МПР. Очевидно, что интерпретация этих данных требует дальнейших исследований.
Полученные данные показывают, что вклад биоэффектов постоянного поля (при отсутствии переменного) необходимо учитывать при проведении исследований по влиянию МП на биосистемы: авторы ряда публикаций помещали контрольные образцы в нулевое МП, создаваемое магнитным экраном из мю-металла, исходя из предположения о независимости свойств биосистемы от величины постоянного МП. Этот факт является одной из причин расхождения результатов экспериментов, полученных разными авторами, а также затрудняет интерпретацию оценки возможных эффектов слабых МП.
Таким образом, показано, что изменение величины постоянного магнитного поля в диапазоне амплитуд от 0 до 347 мкТл может как активировать, так и ингибировать скорость гравитропической реакции в отрезках стеблей льна, при этом зависимость величины биоэффекта от амплитуды поля имеет полиэкстремальный характер. Полученные данные показывают необходимость учета величины постоянного магнитного поля при постановке экспериментов, механизм действия слабых постоянных МП является предметом дальнейших исследований.
3.4. Влияние КМП, настроенных на частоту ларморовской прецессии для ядерных спинов биологически важных элементов, на регенерацию планарий.
Раннее Ледневым и сотр. было показано, что КМП, с частотой переменной компоненты равной ларморовской частоте (ЛЧ) для спинов ядер атомов водорода в режиме магнитного параметрического резонанса, могут существенно менять митотическую активность необластов планарий (Леднев и др., 1996). Известно, что 23 39 31 63 55 14 59 35 такие атомы как Na, K, P, Cu, Mn, N, Сo, Cl, Li, входящие в состав биосистем, обладают ядерным спином. В той же работе было высказано предположение, что взаимодействие ядерных спинов атомов с КМП, настроенным на частоту, соответствующую разнице энергии спина при его ориентации по полю и против него, т.е. на частоту ларморовской прецессии спина в постоянном магнитном поле, также может привести к изменению свойств биосистемы (Леднев и др., 1996).
Для проверки этой гипотезы было выполнено две серии экспериментов. В первой серии было проведено сравнение скорости регенерации планарий у контрольных и экспериментальных животных методом прижизненной компьютерной морфометрии. Согласно модели МПР в биосистемах максимальный биологический эффект достигается при ВАС =1.84ВDC (Леднев, 1996). Частоту, f, переменной компоненты поля, равную ЛЧ вычисляли по формуле: f = BDC, где - гиромагнитное отношение для спина ядра конкретного атома (Гц/мкТл). На рис. 8 приведены экспериментальные результаты, показывающие, что КМП, настроенные на частоты 23 39 31 63 55 59 ларморовской прецессии ядерных спинов Na, K, P, Cu, Mn, Сo, Cl существенно меняют скорость регенерации планарий. При экспонировании регенерирующих планарий в КМП, частота переменной компоненты равна ЛЧ для 31 35 спинов ядер Р, Сl и Со наблюдается ингибирование скорости регенерации планарий, что сопровождается замедлением роста головной части планарий - бластемы. При настройке частоты переменной компоненты КМП на ЛЧ для спинов 23 63 ядер Na, Cu и Mn, напротив, наблюдается увеличение скорости регенерации планарий, что сопровождается ускорением роста бластемы.
Экспозиция в КМП с ЛЧ для 14 спинов ядер атомов N и Li, не приводила к изменению в росте Cu бластемы регенерирующих 39 Mn K Na планарий (рис. 8).
14 -N Li --P Co Cl -Рис. 8. Влияние КМП, настроенного на резонанс для спинов ядер атомов на регенерацию планарий.
Параметры КМП: ВDC= 48 мкТл, ВАС= 90 мкТл, значения резонансных частот приведены в таблице 3. Каждый столбик - результат усреднения по трем независимым экспериментам.
Величина биологического эффекта R, % Таблица 3. Значения гиромагнитных отношений для атомов и значения резонансных частот переменной компоненты КМП при ВDC= 48 мкТл.
39 14 35 59 55 23 63 7 Атом K N Cl Co Mn Na Cu Li P 1.98 3.08 4.17 10.11 10.56 11.28 11.31 16.55 17., Гц/мкТл f, Гц 95.0 147.8 200.1 485.2 506.8 541.4 542.8 794.4 827.Во второй серии экспериментов были определены зависимости величины биоэффекта (скорости регенерации планарий) от частоты переменной компоненты КМП.
Как видно из рисунка 9, частотная зависимость носит резонансный характер.
Модель не рассматривает вариант спинов ядер как возможных первичных мишеней действия КМП, сравнимых по амплитуде с земным полем. Тем не менее, экспериментальные точки могут быть аппроксимированы теоретической кривой согласно выражению (2). Как можно видеть на рис. 9 полуширина, , лорентциана, аппроксимирующего экспериментальные точки, равна соответственно 2.4 Гц при настройке ЛЧ КМП на спины ядер 31Р, 23Na, 63Cu, 55Mn, 59Co; 2.2 Гц при настройке ЛЧ 35 КМП на спины ядер Сl; 2.1 Гц при настройке ЛЧ КМП на спины ядер К (при аппроксимации максимум лорентциана совмещали с экспериментально найденным максимумом эффекта при резонансной частоте). Исходя из того, что = k/2=1/2, можно предположить, что k (с-1) будет являться константой скорости некоторого переходного процесса со средним временем жизни , в котором участвуют атомы, взаимодействующие с КМП. Согласно полученным данным, k= 2=15.1 с-1 и, соответственно = 66 мс для спинов ядер 31Р, 23Na, 63Cu, 55Mn, 59Co; k= 2= 13.8 с-1, 35 = 72 мс для спинов ядер Сl; k= 2=13.2 с-1, = 76 мс для спинов ядер К.
Очевидно, что для определения физического смысла параметра необходимо рассмотрение в модели МПР варианта для спинов ядер как возможных первичных мишеней действия КМП.
Можно допустить, что Mn эффекты КМП, настроенных на Na Cu спины ядер биологически К Со важных атомов, могут быть Р Сl обусловлены их воздействием на атомы, входящие в состав -- 4 +2 +ключевых ферментов, изменяя fр -4 -2 2 их активность. Это -предположение подтверждается работой Малышева и Леднева, -в которой показано, что КМП, -настроенное на спины ядер атомов водорода в режиме МПР, Рис. 9. Зависимость скорости регенерации планарий от частоты переменной компоненты КМП. По оси абсцисс ингибирует активность актоотложено отклонение от резонансной частоты (Гц).
Параметры КМП: BDC=48 мкТл, BAC=90 мкТл. Каждая миозиновой Mg2+ЦАТФазы в экспериментальная точка результат усреднения трех реакционной смеси, независимых экспериментов.
содержавшей чистый Ф-актин и миозиновые нити (Malyshev&Lednev, 2008). Также косвенным подтверждением высказанного предположения являются работы Бучаченко и др., в которых показано, что замещение атомов 24Mg и 26Mg, которые не имеют спина, на Mg, имеющий ядерный спин, позволяет получить 2-4 кратное изменение скорости биохимической реакции - синтеза АТФ АТФ-синтетазой (Buchachenko et al., 2005).
Следует обратить внимание, что при настройке КМП на ЛЧ для спинов ядер атомов К (рис. 8-10) наблюдалась активация 80 85 90 95 100 105 1скорости регенерации планарий.
f, Гц -При отклонении значений -частот на 2 Гц от резонансной частоты, величину биоэффекта Рис. 10. Зависимость скорости регенерации планарий от частоты переменной компоненты КМП, настроенного можно аппроксимировать на параметрический резонанс спинов ядер 39К (=1,9Гц/мкТл). Параметры КМП: BDC=48 мкТл, BAC=90 мкТл, теоретической кривой согласно fР=96 Гц.
выражению (2) (рис. 9,10).
Отклонение значения частоты от резонансной на 4 Гц (92 и 100 Гц) - приводит к Величина биоэффекта,% Величина биоэффекта R, % снижению величины биоэффекта практически до нулевых значений. При дальнейшем отклонении значений частот от резонансных на 8 Гц (88 и 104 Гц) и на 16 Гц (80 и 112 Гц) - знак эффекта меняется на противоположный, т.е. наблюдается ингибирование скорости регенерации планарий. Как показано в работе Рождественской, такой же знак эффекта наблюдался при экспонировании регенерирующих планарий в К+-КМП (Рождественская, 2003). Однако, нет основания полагать, что при частотах 80, 88, 104 и 112 Гц биоэффект также реализуется по механизму МПР. Эти данные позволяют предположить наличие других возможных первичных мишеней действия КМП на биологические системы и, возможно, других физических механизмов действия МП. Не исключено, что отклонения от резонансных частот для других атомов могут приводить к биологическим эффектам.
Кроме того, можно предположить, что при использовании КМП (сравнимых по амплитуде с земным полем) с частотой переменной компоненты равной ЛЧ для орбитальных магнитных моментов электронов (=14000 Гц/мкТл) может приводить к биологическим эффектам. Однако, эти утверждения требуют экспериментальной проверки. Таким образом, полученные результаты расширяют рамки модели В.В.
еднева, разработанной для случая ионного осциллятора и являются основанием для ее дальнейшего развития.
Представленные в этом разделе экспериментальные данные показывают, что комбинированные магнитные поля, настроенные на ларморовскую частоту для спинов ядер биологически важных атомов могут активировать и ингибировать скорость регенерации планарий. Величина биологического эффекта зависит от частоты переменной компоненты поля. Несмотря на то, что модель МПР не рассматривает спины ядер как возможные первичные мишени действия КМП, резонансный характер частотной зависимости может быть формально описан в рамках этой модели. Полученные результаты показывают возможность рассматривать спины ядер биологически важных элементов, таких 23 39 31 63 55 1 59 как Na, K, P, Cu, Mn, Н, Сo, Cl как потенциальные первичные мишени действия КМП на биологические системы, в частности на регенерацию планарий.
Таким образом, полученные результаты расширяют рамки модели В.В. Леднева, разработанной для случая, когда в качестве первичной мишени действия КМП рассматривается ион Са2+ как заряженный изотропный осциллятор и являются основанием для ее дальнейшего развития.
3.4. Влияние комбинированных магнитные поля с амплитудами < 10 мкТл на биологические системы.
Предпосылкой для исследований КМП с крайне слабыми амплитудами переменной компоненты МП (КС ПеМП - крайне слабые переменные магнитные поля) послужили экспериментальные данные, полученные разными авторами.
Анализ этих работ приведен в разделе Обзор литературы диссертации.
На рис. 11 показано, что КМП с J21(BAC/BDC) частотой 35.8 Гц и амплитудой 1 мкТл оказывает статистически достоверное увеличение скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна. Анализ этих результатов, а также 0.075 1 2 3 4 5 0 40 80 120 1Магнитная индукция, мкТл экспериментальных данных, полученных Рис. 11. Зависимость скорости другими авторами, показал, что гравитропической реакции в отрезках стеблей льна от амплитуды переменной биоэффекты КС ПеМП не могут быть комопненты.
Параметры КМП: ВDC = 46.5 мкТл, f =35.8 Гц.
объяснены в рамках модели МПР, Экспериментальные данные правой части графика описаны в разделе 3.1.4 и согласно которой, ионы Са2+, Mg2+ и К+ соответствуют данным, представленным на являются мишенями действия слабых рис. 3.
магнитных полей. Поэтому необходимо было проведение дальнейшего исследования влияния КС ПеМП на биосистемы.
Нанотесловые поля. Экспонирование отрезков стеблей льна в нанотесловых полях различных типов сопровождается увеличением скорости гравитропической реакции отрезков по сравнению с контролем при определенных соотношениях амплитуды и частоты (рис. 12 а,б,в).
а б в 25 37 3 4 5 9 12 Частота, Гц Рис. 12. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропическую реакцию в отрезках стеблей льна. Параметры КС ПеМП BDC=46.5 мкТл; (а) BAC= 134 нТл; (б) BAC= 402 нТл; (в) BAC= 1608 нТл.
Величина биоэффекта, % Величина биоэффекта, % В частности, в поле с амплитудой 134 нТл, биоэффекты наблюдаются на частотах 3 и 5 Гц, в то время как на частоте 4 Гц эффект отсутствует. При одновременном увеличении амплитуды и частоты поля в 3 раза (ВАС = 402 нТл, f = 9, 12, 15 Гц), характер зависимости величины биоэффекта от частоты поля не изменяется - эффект поля наблюдается на частотах 9 и 15 Гц и отсутствует на частоте 12 Гц. При дальнейшем увеличении амплитуды поля до микротесловых значений (ВАС = 1608 нТл) двугорбый характер зависимости величины биоэффекта от частоты поля сохраняется, однако, в этом случае наблюдается сдвиг положения минимума (лнулевого эффекта) от значения ВАС/f =33.5 (при амплитудах 134 402 нТл) до значения ВАС/f =44.7 (при амплитуде 1608 нТл). Такой же характер зависимости наблюдается при экспонировании регенерирующих планарий в соответствующих КС ПеМП (Леднев и др., 2003).
Результаты данных экспериментов показали, что величина биологического эффекта зависит не от абсолютных параметров переменной компоненты КС ПеМП, а определяется соотношением амплитуда/частота. Для объяснения этих эффектов Ледневым была предложена модель, описывающая зависимость величины биоэффектов от параметров КС ПеМП - частоты и амплитуды переменной компонент поля, согласно выражению (6). Предложенная в работе модель, с одной стороны, позволяет рассчитать необходимые для достижения максимального эффекта параметры переменного магнитного поля, а с другой - при известных параметрах, благодаря тому, что в аргумент функции Бесселя входит гиромагнитное отношение , - произвести идентификацию первичных мишеней (Леднев, 2003).
Исходя из модели было высказано предположение, что первичными мишенями нанотесловых и пикотесловых полей могут служить соответственно спины ядер атомов водорода и орбитальные магнитные моменты электронов (Леднев, 2003).
Для проверки этого утверждения необходимо было исследовать зависимости величин биоэффектов от амплитуды и частоты переменной компоненты КС ПеМП.
Как было показано выше, величина биоэффектов КС ПеМП описывается выражением (6). Максимумы этой функции наблюдаются при значении аргумента ВАС/f, равном 0.9 и 2.75, минорные максимумы - при ВАС/f = 4.5 и 6.1. Функция стремится к нулю при значениях ВАС/f, равных 1.8; 3.8; 5.3, 7.0.
На рис. 13 представлены зависимости величин биоэффектов - скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна и индекса регенерации планарий - от частоты при фиксированной амплитуде BAC=1.6 мкТл и амплитуде при фиксированных частотах 50 и 60 Гц переменной компоненты поля. Как видно из рис.
13 экспериментальные точки хорошо аппроксимируются теоретической кривой согласно выражению (6) при = 42.57 Гц/мкТл, что соответствует гиромагнитному отношению для спинов ядер атомов водорода. Максимумы биологических эффектов наблюдаются при значениях параметра ВАС/f = 0.9 и 2.75, минорные максимумы при ВАС/f = 4.5 и 6.1, биологический эффект не наблюдается при ВАС/f = 1.8, 3.8 и 5.3.
Однако следует отметить, что указанные зависимости наблюдаются в диапазоне амплитуд до 6-7 мкТл. Экспериментальные данные показывают, что при дальнейшем увеличении амплитуды КС ПеМП до значений равных примерно 8-мкТл происходит смена знака биоэффекта - вместо активации скорости регенерации планарий происходит ее ингибирование. На рис. 13 приведена лишь одна экспериментальная точка, при ВАС = 9,8 мкТл, характеризующая смену знака эффекта. Эффект ингибирования (снижение индекса регенерации примерно на 2030%) сохраняется при дальнейшем увеличении амплитуды - по крайней мере до 1мкТл. Это указывает на наличие другого механизма. Согласно некоторым теоретическим оценкам (Mullins et al., 1999) смена знака эффекта при увеличении амплитуды 60 Гц КС ПеМП до значений 8-10 мкТл и выше может быть обусловлена тем, что при относительно больших амплитудах поля его биологическое действие обусловлено, главным образом, индуцируемым переменным током в тест-системе.
Экспериментальные данные, представленные на рис.13 дают возможность оценить биотропное действие магнитных полей промышленных частот 50 и 60 Гц с крайне слабыми амплитудами переменной компоненты. Вопрос о действии таких полей промышленных частот широко обсуждается в литературе (см. раздел Обзор литературы диссертации), однако, поскольку выбор амплитуд МП является произвольным, это затрудняет воспроизводимость и интерпретацию результатов.
Данные, представленные в этом разделе показывают, что потенциальными первичными мишенями действия КС ПеМП могут служить спины ядер атомов водорода, а также показывают справедливость выражения (6) для расчета биологически активных параметров поля.
В данной работе для расчета параметров биотропных полей в выражении ВАС/f использовалось значение 10 =42.57 Гц/мкТл, что 2.75 соответствует 0.BAC / f гиромагнитному 0 2 4 -отношению для спинов -ядер атомов водорода.
Рис. 13. Зависимость скорости гравитропической реакции от Однако, наши пилотные индекса модуляции и скорости регенерации планарий от индекса B /f (B = 42 мкТл) AC DC эксперименты, показали, (1) - теоретически ожидаемая зависимость при = 42.57 Гц/мкТл (2) гравитропическая реакция растений: f= 76, 37, 25, 18, 15 Гц, что используя величину В =1.6 мкТл, В /f = 0.9, 1.5, 2.75, 3.8, 4.АС АС (3) гравитропическая реакция растений: f = 60 Гц, В = 1.3, 2.5, 3.9, 5.4, АС для спинов других атомов, мкТл, B /f 0.9, 1.8, 2.75, 3.AC AC= (4) регенерация планарий: f = 60 Гц, B = 0.7, 1.3, 2.1, 2.5, 3.9, 5.4, 6.3, AC например, марганца и 7.4, 8.6, 9.8 мкТл, BAC/fAC= 0.5, 0.9, 1.5, 1.8, 2.75, 3.8, 4.5, 5.25, 6.1.
(5) регенерация планарий: f = 50 Гц, B = 0.58, 1.1, 1.8, 2.2, 2.7, 3.2, 3.9, AC фосфора, можно получить 4.5 мкТл, BAC/fAC= 0.5, 0.9, 1.5, 1.8, 2.3, 2.75, 3.3, 3.(6) теоретически ожидаемая зависимость для экспериментальных точек КС ПеМП, которые также (5) Каждая экспериментальная точка - результат усреднения 3-будут оказывать независимых экспериментов.
биологический эффект. Очевидно, проведение такого рода экспериментальных исследований будет логическим продолжение данной работы.
Пикотесловые поля. Экспериментальные данные, представленные на рис. 14 (а), показывают, что КС ПеМП, имеющие амплитуду 64010-6 мкТл (=6пТл) и частоту 10 Гц стимулируют гравитропический изгиб в сегментах стеблей льна.
Биологический эффект (~30%) такого поля на регенерацию планарий показан в работе Леднева и сотр. (Леднев и др., 2003). При одновременном увеличении амплитуды и частоты КС ПеМП в 100 раз, т.е. при ВАС=64 нТл и f=1000 Гц (рис. б,в), величина биологического эффекта - скорости гравитропической реакции в отрезках стеблей льна (рис. 14 б) и скорости регенерации планарий (рис. 14 в) - соответствует значениям, полученными в КС ПеМП с параметрами ВАС=640 пТл и f=10 Гц.
Величина биоэффекта, а б в опыт опыт контроль контроль 0.0контроль опыт 0.00.0* 0.020 * * 0.020 0.00.00.01 2 3 4 5 Номер опыта 1 2 1 2 3 4 5 Номер эксперимента Номер опыта Рис. 14. Стимулирующее влияние КС ПеМП на гравитропический изгиб в отрезках стеблей льна (а,б) и регенерацию планарий (в). Параметры КС ПеМП: (а) BDC=46.5 мкТл; ВАС = 640 пТл, f =10 Гц; (б,в) ВАС = 64 нТл, f =1000 Гц Эти данные подтверждают предположение о том, что величина биологического эффекта КС ПеМП зависит от определенных соотношений амплитуда/частота.
Как было показано выше, величина биологического эффекта КС ПеМП определяется параметром ВАС/f. В работе Леднева было высказано предположение, что первичными мишенями данного типа полей могут служить магнитные моменты с гиромагнитным отношением =14000 Гц/мкТл, такая величина соответствует угловой скорости прецессии магнитного момента диамагнитных электронов в атомах и молекулах (Леднев, 2003). В этом случае для полей с указанными параметрами величина ВАС/f равняется значению 0.9, т.е. соответствует теоретически ожидаемому максимуму биологического эффекта. Для проверки этого предположения было выполнено две серии экспериментов с помощью одной тестсистемы - регенерирующих планарий. В первой серии была исследована зависимость величины биоэффекта (скорости регенерации планарий) от амплитуды при фиксированной частоте, равной 1000 Гц, а во второй - от частоты при фиксированной амплитуде 192 нТл переменной комопненты КС ПеМП.
На рис. 15 показано, что при f = 1000 Гц максимумы биоэффектов наблюдались при BAC = 64, 192, 321 и 426 нТл, а при амплитудах BAC = 128, 271 и 379 нТл - эффект отсутствовал. При амплитуде ВАС = 192 нТл максимумы биоэффектов наблюдались при значениях амплитуд 3000, 1000, 597 и 450 Гц, при 1500, 700 и 518 Гц эффект отсутствовал. Экспериментальные точки хорошо согласуются с теоретической зависимостью (рис. 16) согласно выражению (6) при = 14000 Гц. Максимумы биоэффекта наблюдаются при значении параметра ВАС/f = Угол изгиба, градусы Угол изгиба, градусы Индекс регенерации, R=s/S 0.9 и 2.75, минорные максимумы при ВАС/f = 4.5 и 6.1. Биоэффекты отсутствуют при ВАС/f = 1.8; 3.8; 5.3; 6.7.
Данные, представленные на рис. 15 показывают, что 25 3 экспериментально наблюдаемые положения 15 максимумов и минимумов биоэффектов совпадают с теоретическими предсказаниями при 0.9 2.0 2 4 значении =14000 Гц/мкТл.
BAC /f На основании Рис. 15. Зависимость скорости регенерации планарий от индекса модуляции B /f, (B = 42 мкТл).
AC DC вышеизложенного можно (1) - теоретически ожидаемая зависимость при =14000 Гц/мкТл (2) f=1000 Гц, В = 32, 64, 107, 128, 164, 192, 236, 271, 321, 379, 4АС предположить, что нТл, В /f 0.5, 0.9, 1.5, 1.8, 2.3, 2.75, 3.3, 3.8, 4.5, 5.25, 6.АС = (3) ВАС= 192 нТл, f = 5376, 3000, 1792, 1500, 1168, 1000, 832, 700, 597, потенциальными 518, 450 Гц, В /f 0.5, 0.9, 1.5, 1.8, 2.3, 2.75, 3.3, 3.8, 4.5, 5.25, 6.1.
АС = Каждая экспериментальная точка результат усреднения 3-первичными мишенями КС независимых экспериментов.
ПеМП данного типа являются орбитальные магнитные моменты электронов. Можно пpедположить, что такие закономеpноcти будут cпpаведливы и для дpугиx паpаметpов КC ПеМП, напpимеp BAC = 64 нТл, f = 1 Гц; BAC = 32 нТл, f = 0,5 Гц и pяда дpугиx величин амплитуд и чаcтот. Эти паpаметpы xаpактеpны для геомагнитныx пульcаций типа Pc1. Нетрудно видеть, что для этих типов полей величина параметра ВАС/f близка к значению 0.9 при величине гиромагнитного отношения = 14000 Гц/мкТл, т.е. при значениях, когда наблюдался максимальный биологический эффект. Данные, представленные в работе можно считать свидетельством биотропномго действия геомагнитных пульсаций.
Таким образом, данные, приведенные в этом разделе показывают, что величина биоэффектов КМП с амплитудами < 10 мкТл зависит от соотношения амплитуда/частота (т.е. от параметра BAC f ) и имеет полиэкстермальный характер. Экспериментально полученные результаты согласуются с теоретически предсказанной зависимостью при = 42.577 Гц/мкТл и = 14000 Гц/мкТл. Хорошо выраженные максимумы наблюдаются при BAC f = 0.9 и 2.75, минорные максимумы при BAC f = 4.5 и 6.1. Биологический эффект отсутствует при BAC f =1.8; 3.8; 5.3;
Величина биоэффекта, % 6.7. Указанные зависимости позволяют предположить, что возможными первичными мишенями действия КМП с амплитудами < 10 мкТл являются спины ядер атомов водорода и орбитальные моменты электронов.
Заключение к работе.
В работе показана возможность модуляции - активации и ингибирования - функционально - метаболических свойств биосистем (гравитропической реакции растений, регенерации планарий, генерации активных форм кислорода нейтрофилами) с помощью слабых и крайне слабых комбинированных магнитных полей. При этом, определены зависимости величины биоэффектов от параметров используемого поля. Соответственно, можно выделить биотропные магнитные поля следующих типов:
1. Комбинированные магнитные поля, настроенные на параметрический резонанс для ионов Са2+, Mg2+ и К+. Максимальный биологический эффект достигается при условиях, когда величина амплитуды переменной компоненты поля в 1.8 раз больше величины постоянной компоненты поля, а частота переменной компоненты поля формально соответствует циклотронной частоте вращения иона в постоянном МП в вакууме.
2. Комбинированные магнитные поля, настроенные на ларморовскую частоту для спинов ядер биологически важных элементов (водород, калий, марганец, фосфор, хлор, медь, натрий). Максимальный биологический эффект достигается при условиях, когда величина амплитуды переменной компоненты поля в 1.8 раз больше величины постоянной компоненты поля, а частота переменной компоненты поля равна Ларморовской частоте для данного типа ядерного спина.
3. Комбинированные магнитные поля с крайне слабой амплитудой переменной компоненты (<10 мкТл). Величина биоэффектов КМП зависит от параметра BAC f, где - величина гиромагнитного отношения для данного типа магнитного момента, а ВАС и f - соответственно, величины магнитной индукции и частоты переменной компоненты магнитного поля. Зависимость величины биоэффекта от параметра BAC f является полиэкстремальной: хорошо выраженные максимумы имеют место при BAC f = 0.9;
2.75 и менее выраженные - при 4.5 и 6.1; биоэффекты отсутствуют при значениях BAC f = 1.8; 3.8; 5.3; 6.7.
На основании вышеизложенного можно рассматривать несколько типов возможных первичных физических мишеней, воспринимающих воздействие магнитных полей на биопроцессы. Ими могут быть: (1) ионы Са2+, Mg2+ и К+, входящие в центры связывания соответствующих ферментов; (2) спины ядер биологически важных атомов, таких как водород, калий, марганец, фосфор, хлор, медь, натрий; (3) орбитальные магнитные моменты электронов.
Несмотря на то, что полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с количественными предсказаниями модели МПР, некоторые ее положения требуют дальнейшего теоретического и экспериментального исследования.
В частности, допущение о том, что ион Са2+ может рассматриваться как заряженный осциллятор в ферментах протеинкиназа С и Са2+-кальмодулин-зависимая киназа. Хотя данные, полученные в работе не противоречат этому утверждению, нельзя исключить, что другие Са2+-зависимые ферменты могут опосредовать действие КМП в режиме МПР. Это предположение требует дальнейшего экспериментального исследования.
Полученные впервые в данной работе экспериментальные данные относительно того, что одними из потенциальных мишеней действия КМП могут служить спины ядер биологически важных атомов, расширяют рамки модели В.В. Леднева, разработанной для случая ионного осциллятора и являются основанием для ее дальнейшего развития.
Кроме того, нельзя исключить, что КМП, настроенные на ларморовскую частоту для орбитальных магнитных моментов, будут вызывать биологические эффекты в случае использования амплитуд КМП, сравнимых по амплитуде с земным полем. Это предположение также требует экспериментальной проверки и теоретического анализа.
В целом, полученные в работе экспериментальные данные создают основу для дальнейшего изучения физических и биологических механизмов действия слабых МП на биологические системы. Результаты данной работы также являются основой для решения актуальной задачи - оценки принципиальной возможности воздействия слабых переменных магнитных полей антропогенного и природного происхождения на человека, проведения соответствующих эпидемиологических исследований, для разработки санитарноЦгигиенических норм, связанных с воздействием антропогенных полей на человека и животных, а также для разработки новых методов магнитотерапии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ № 04-04-97324р2004наукоград, № 08-04-00290 и программы Фундаментальные науки - медицине, 2006, 2007.
Выводы 1. Показано, что комбинированные магнитные поля, настроенные в режиме параметрического резонанса активируют и ингибируют скорость регенерации планарий, гравитропической реакции растений, образование активных форм кислорода нейтрофилами.
2. Показано, что скорость регенерации планарий и скорость гравитропической реакции в отрезках стеблей льна зависит от частоты переменной компоненты и от соотношения амплитуд переменной и постоянной компонент комбинированного магнитного поля, настроенного в режиме параметрического резонанса согласно предсказаниям модели магнитного параметрического резонанса, предложенной В.В. Ледневым.
3. Показано, что скорость гравитропической реакции в отрезках стеблей льна зависит от амплитуды постоянного поля (при отсутствии переменной компоненты) и имеет полиэкстремальный характер в диапазоне амплитуд от 0 до 400 мкТл.
4. Показано, что скорость регенерации планарий и скорость гравитропической реакции в отрезках стеблей льна действия КМП, с амплитудами менее мкТл зависит от соотношения амплитуда/частоты переменной компоненты поля. Амплитудная и частотная зависимости величин биоэффектов имеют полиэкстремальный характер и согласуются с теоретически ожидаемой зависимостью согласно модели В.В. Леднева.
5. Показано, на моделях регенерирующих планарий и гравитропической реакции стеблей льна, что зависимости величин биоэффектов от частоты и амплитуды переменной компоненты КМП, настроенных в режиме параметрического резонанса и для КМП с крайне слабой амплитудой переменной компоненты, идентичны в тест-системах животного и растительного происхождения.
6. Показано, что комбинированные магнитные поля с частотой переменной компоненты, равной ларморовской частоте для спинов ядер биологически 23 39 31 63 55 59 важных атомов Na, K, P, Cu, Mn, Сo, Cl изменяют скорость регенерации планарий. Частотная зависимость величины биоэффекта имеет резонансный характер. Этот результат расширяет рамки модели В.В.
еднева, разработанной для случая ионного осциллятора и является основанием для ее дальнейшего развития.
7. В целом, из полученных в работе экспериментальных данных следует, что первичными мишенями действия слабых магнитных полей на биологические системы можно рассматривать: ионы Са2+, Mg2+ и К+, входящие в соответствующие центры связывания ферментов, а также спины ядер биологически важных атомов (1Н, 23Na, 39K, 31P, 63Cu, 55Mn, 59Сo, Cl) и орбитальные магнитные моменты электронов.
Список публикаций по теме диссертации.
1. Статьи в рецензируемых журналах.
1. Белова Н.А. Ермаков А.М., Знобищева А.В., Сребницкая Л.К., Леднев В.В. Влияние кpайне cлабыx пеpеменныx магнитныx полей на pегенеpацию планаpий и гpавитационную pеакцию pаcтений. Биофизика. 2010, т.55, вып. 4, с. 704-709.
2. Белова Н.А., Панчелюга В.А. Модель В.В. Леднева: теоpия и экcпеpимент.
Биофизика. 2010, т.55, вып. 4, с. 750-766.
3. Белова Н.А., Поцелуева М.М., Сребницкая Л.К., Знобищева А.В., Леднев В.В.
Pегуляция cкоpоcти обpазования активныx фоpм киcлоpода в пеpитонеальныx нейтpофилаx мышей c помощью cлабыx магнитныx полей. Биофизика. 2010, т.55, вып. 4, с. 657-663.
4. Vorobyov V., Yurkov I., Belova N., Lednev V. Agroclavine potentiates hippocampal EEG effects of weak combined magnetic field in rats. Brain Research Bulletin, 2009, v. 80, p.
1Ц8.
5. Леднев В.В., Белова Н.А., Ермаков А.М., Акимов Е.Б., Тоневицкий А.Г. Регуляция вариабельности сердечного ритма человека с помощью крайне слабых переменных магнитных полей. Биофизика, 2008, т.53, вып. 6, с. 1129-1137.
6. Belova N.A., O.N. Ermakova, A.M. Ermakov, Z.Ye. Rojdestvenskaya, V.V. Lednev The bioeffects of extremely weak alternating magnetic fields. The Environmentalist. 2007, v.
27, №4, p. 411-416.
7. Lednev V.V., Tiras Kh.P., Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M. Biological Effect of Extremely Weak Industrial-Frequency Magnetic Fields// Biophysics, 2005, - 50(Suppl.1): S157-S18. Леднев В.В., Белова Н.А., Рождественская З.Е., Тирас Х.П. Биоэффекты слабых переменных магнитных полей и биологические предвестники землетрясений.
Геофизические процессы и биосфера. 2003. Т. 2(1), 3-11.
9. Белова Н.А., Леднев В.В. Активация и ингибирование гравитропической реакции в сегментах стеблей льна при изменении величины магнитной индукции слабого постоянного поля в пределах от 0 до 350 микроТесла. Биофизика. 2001. Т. 46, вып.
1. С. 118-121.
10. Белова Н.А., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропизм растений. Биофизика. 2001, вып. 1. С. 122-125.
11. Белова Н.А., Леднев В.В. Активация и ингибирование гравитропической реакции растений с помощью слабых комбинированных магнитных полей. Биофизика, 2000.
Т. 45, №6, с. 1102-1107.
12. Белова Н.А., Леднев В.В. Зависимость гравитропической реакции в сегментах стеблей льна от частоты и амплитуды переменной компоненты слабого комбинированного магнитного поля. Биофизика, 2000. Т. 45, №6, с. 1108-1111.
13. Леднев В.В., Сребницкая Л.К., Ильясова Е.Н., Рождественская З.Е., Климов А.А., Белова Н.А., Тирас Х.П. Магнитный параметрический резонанс в биосистемах:
экспериментальная проверка предсказаний теории с использованием регенерирующих планарий Dugesia tigrina в качестве тест-системы Биофизика, 1996, т. 41, № 4, с. 825-835.
2. Статьи в сборниках.
14. Белова Н.А., Ермакова О.Н., Ермаков А.М., Леднев В.В. Амплитудная зависимость биологических эффектов крайне слабых переменных магнитных полей с частотой 60 Герц.// Сборник избранных трудов IV Международного Конгресса Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине,- Санкт-Петербург, 2006, C.:21-15. Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M., Lednev V.V. The dependence of biological effects on the amplitude of extremely weak power-frequency magnetic field// Proceedings 4th International Workshop "Biological effects of EMFs",- Greece, Crete, 2006, - 1 C.:685-616. Белова Н.А., Рождественская З.Е., Ермаков А.М., Ермакова О.Н., Леднев В.В.
Механизмы влияния сверхслабых переменных магнитных полей на биосистемы// Сборник научных статей IV научно - технической конференции "Медэлектроника-2006. Средства медицинксой электроники и новые медицинские технологии",- Минск, 2006, C.:52-54.
17. Н.А. Белова, А.М. Ермаков, В.В. Леднев Биофизические основы применения слабых комбинированных магнитных полей в биологии и медицине. Вестник новых медицинских технологий, 2009, №1, с. 226-228. Сборник трудов XVII Международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 -9 июня 2009 года.
3. Тезисы конференций.
18. Поцелуева М.М., Белова Н.А., Юрков И.С., Леднев В.В. Влияние слабого комбинированного магнитного поля в режиме параметрического резонанса для кальция на дыхательную вспышку нейтрофилов крови крыс, индуцированную форболовым эфиром. Первый Международный симпозиум Фундаментальные науки и альтернативная медицина, Пущино, 1997, 22-25 сентября, Тезисы докладов, с.65-66.
19. Белова Н.А., Поцелуева М.М., Юрков И.С., Леднев В.В. Регуляция скорости дыхательной вспышки в нейтрофилах мышей с помощью слабых магнитных полей.
III Пущинская конференция молодых ученых. Пущино, 1998, 27-30 апреля. Тезисы докладов, с. 138.
20. Белова Н.А., Леднев В.В. Активация и ингибирование гравитропической реакции растений с помощью слабых комбинированных магнитных полей. II съезд биофизиков России. Москва, 1999, 23-27 августа. Тезисы докладов, с. 759-760.
21. Lednev V.V., Belova N.A., Potselueva M.M., Yurkov I.S. Regulation of the oxidative burst in mouse peritoneal neutrophils by application of weak magnetic fields. Biophotonics and Coherent Systems (Proceedings of the 2nd Alexander Gurwitsch Conference and Additional Contributions)/ edited by L. Beloussov, Fritz-Albert Popp, V. Voeikov, Roeland van Wijk. Moscow University Press, 2000, p.365-366.
22. Belova N.A., V.V. Lednev. Activation and inhibition of gravitropic response in plants by weak combined magnetic fields. Abstracts book of the 23th Annual Meeting of BEMS, St.
Paul, Minnesota, USA, 2001, p. 209.
23. Belova N.A., V.V. Lednev. Activation and inhibition of gravitropic response in the segments of flax stems exposed to the static magnetic field with magnetic flux density ranging from 0 to 350 microTesla. Abstracts book of the 23th Annual Meeting of BEMS, St. Paul, Minnesota, USA, 2001, p. 96.
24. Белова Н.А., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропизм растений. III Международный симпозиум Механизмы действия сверхмалых доз. Тезисы докладов. Москва, 2002, с.169.
25. Белова Н.А., Сребницкая Л.К., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на свойства некоторых водных систем. III Международный Конгресс Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине. Санкт - Петербург, 2003, 01-04 июля. Тезисы докладов, с. 5-6.
26. Белова Н.А., Сребницкая Л.К., Леднев В.В. Возможно ли влияние магнитных полей на процессы биоминерализации? Тезисы междисциплинарного семинара Биологические эффекты солнечной активности. Пущино, 2004, с. 62.
27. Belova N.A., Srebnitskaya L.K., Lednev V.V. Preliminary exposure of Na2CO3 and CaClsolutions to the ultra Цweak magnetic fields affects the calcium carbonate precipitation.
Abstract book of 3d Alexander Gurwitsch Conference УBiophotons and coherent systems in biology, biophysics and biotechnologyФ Partenit, Crimea, Ukraine. 2004, p. 20-21.
28. Белова Н.А., Леднев В.В. УБиологические эффекты слабых и сверхслабых магнитных полейФ. VI Международная конференция Космос и биосфера:
Космическая погода и биологические процессы. Партенит, Крым, Украина. 2005, с.
12.
29. Белова Н.А., Поцелуева М.М., Юрков И.С., Леднев В.В. Влияние слабых магнитных полей на скорость образования активных форм кислорода в перитонеальных нейтрофилах мышей. Материалы третьей международной конференции "Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского", Москва, 10-12 октября 2005 г, стр 355.
30. Леднев В.В., Белова Н.А., Сребницкая Л.К. Влияние парафинового экрана на электрофизиологические свойства некоторых водосодержащих систем. IV Международный Конгресс Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 2006, 03-07 июля. Тезисы, с.32.
31. Белова Н.А., Ермакова О.Н., Ермаков А.М., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей промышленной частоты на биосистемы. IV Международный Конгресс Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, Санкт-Петербург, 2006, 03-07 июля. Тезисы, с.46.
32. Белова Н.А. Влияние слабых и кранйе слабых переменных магнитных полей на биологические системы. Тезисы докладов. II Международная конференция "Человек и электромагнитные поля". Саров, 2007, с. 27-28.
33. Белова Н.А. Ермаков А.М., Леднев В.В. Первичные мишени действия сверхслабых магнитных полей на биосистемы. VII Международная конференция Космос и биосфера: Космическая погода и биологические процессы. Украина, Судак, 2007, с. 134.
34. Белова Н.А., Ермаков А.М., Леднев В.В.Первичные мишени действия слабых и сверхслабых комбинированных магнитных полей на биосистемы. Тезисы докладов V Международного конгресса Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине. Санкт - Петербург, 2009, с. 76.
35. Белова Н.А., Ермаков А.М., Знобищева А.В., Леднев В.В. Спины ядер биологически важных атомов как первичные мишени действия слабых комбинированных магнитных полей на биосистемы. Тезисы докладов III Международной конференции Человек и электромагнитные поля. Саров, 24-28 мая 2010, с. 36. Знобищева А.В., Сребницкая Л.К., Белова Н.А., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропическую реакцию в отрезках стеблей льна. Тезисы докладов III Международной конференции Человек и электромагнитные поля. Саров, 24-28 мая 2010, с. 37. Белова Н.А., Ермаков А.М., Знобищева А.В., Леднев В.В. Биофизические основы применения слабых комбинированных магнитных полей в биологии и медицине.
Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии Медицинская физика - 2010 Москва, 2010, т.1, с. 185.