Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ИНДУТНЫЙ

Антон Васильевич

ПАТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ФАКТОРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЦА ПРИ СОЧЕТАНИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА С ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ АЛКОГОЛЕМ

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Челябинск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

а

Научный консультант Заслуженный работник высшей школы РФ,

доктор медицинских наук, профессор

Высокогорский Валерий Евгеньевич

Официальные оппоненты:  член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Терентьев Александр Александрович

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор

Камилов Феликс Хусаинович

доктор медицинских наук, профессор

ьвовская Елена Ивановна

Ведущая организация:аа Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов

а

Защита состоится "____" ____________ 2010 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитиюа(454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "____" ____________ 2010 г.

а

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессора  Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Медико-социальная значимость исследуемой проблемы во многом обусловлена значительным уровнем инвалидности и смертности вследствие развития поздних осложнений сахарного диабета 2 типа, которым страдает в пределах 3% населения Российской Федерации (А. Г. Обрезан, 2008). Сердечно-сосудистая патология лидирует среди осложнений сахарного диабета 2 типа практически во всех странах мира (D. J. Betteridge, 2001). Нарушения липопротеинового спектра крови в комплексе с провоспалительной иммунологической перестройкой при сахарном диабете способствуют атерогенезу в коронарных сосудах и последующему развитию ишемических поражений (И. И. Дедов, 2004). Некоронарогенный механизм повреждения миокарда при сахарном диабете типа 2 связан с явлениями глюкозотоксичности и липотоксичности, а также с развитием окислительного стресса на фоне дефицита энергии и антиокислительных механизмов защиты сердца (M. Aragno, 2006). Инактивация оксида азота вследствие образования при гиперпродукции активных форм кислорода приводит к дефициту вазодилятации (J. E. Wright, 2006), способствует ишемии миокарда и является важным звеном механизма повреждения сердца при сахарном диабете (Y. Xia, 2007).

Сахарный диабет 2 типа нередко сочетается с другими заболеваниями, также способствующими поражению сердечно-сосудистой системы (Т. Melchior, 2000), что является фактором прогредиентности кардиальных осложнений и увеличивает риск развития сосудистых катастроф. С высокой частотой в формировании широкого круга подобной коморбидной патологии принимают участие различные аддиктивные состояния, среди которых по распространенности лидирует злоупотребление алкоголем (В. Я. Cемке, 2008). Хроническая алкогольная интоксикация сопутствует сахарному диабету 2 типа, по крайней мере, у 8,3% больных (П. И. Сидоров, 2002). Это сочетание повышает вероятность возникновения и способствует прогрессированию сосудистых осложнений сахарного диабета, а при длительном употреблении высоких доз алкоголя - ассоциировано с увеличением смертности вследствие сердечно-сосудистых нарушений (P. Diem, 2003).  Наряду с прямыми повреждающими эффектами алкоголя, процессы и продукты его биотрансформации способствуют развитию окислительного стресса в кардиомиоцитах (V. R. Preedy, 1999) с реализацией цитоксического действия на уровне модификации биомолекул, мебранотропных эффектов и вмешательства в работу сигнальных механизмов, включая NO-зависимые каскады (X. Deng, 2007).

Биохимические аспекты развития структурных нарушений при алкогольном и диабетическом поражении сердца, как следует из анализа литературных  данных, имеют некоторые общие черты. Тем не менее, не определены молекулярные механизмы и последствия влияния на сердце хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа.

Цель исследования

Установить патохимические механизмы формирования повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать патохимические признаки повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической интоксикации алкоголем.
2. Проанализировать уровень белков острофазового ответа, как возможных показателей активности течения кардиальной патологии при сахарном диабете 2 типа в сочетании с хронической алкогольной интоксикацией.
3. Исследовать воздействие хронической алкогольной интоксикации на качество гликемического контроля и липидный спектр крови при сахарном диабете 2 типа.
4. Изучить влияние хронической алкогольной интоксикации на антирадикальную и антиперекисную защиту в сердце при сахарном диабете 2 типа.
5. Определить интенсивность процессов липопероксидации и окислительной модификации протеинов как факторов повреждения миокарда при сахарном диабете 2 типа на фоне хронической алкогольной интоксикации.
6. Исследовать значение оксида азота (II) в развитии миокардиодеструкции при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической интоксикацией алкоголем.
7. Выяснить роль процессов апоптоза и некроза в формировании повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.
8. Оценить наличие особенностей патохимических механизмов и последствий кардиотропного влияния хронической алкогольной интоксикации на различных этапах развития сахарного диабета.

Научная новизна

В результате проведенных исследований, впервые, на основе применения современных методов, получены сведения о характере патохимических нарушений в сердце и системных метаболических сдвигах при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Установлено влияние хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа на комплекс биохимических характеристик, отражающих механизмы развития кардиальных повреждений, включающий: биомаркеры повреждения миокарда и острофазовой реакции, показатели состояния углеводного, липидного и белкового обмена; параметры интенсивности свободнорадикальных процессов, антиокислительной защиты и активности апоптоза в сердце; уровень оксида азота (II). Получено клинико-экспериментальное биомаркерное подтверждение развития деструкции кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Выявлено, что при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации углубляется нарушение гликемического контроля. Обнаружено выраженное повышение содержания продуктов липопероксидации, окислительной модификации белков в крови и сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Определено, что в условиях сахарного диабета, под влиянием алкогольной интоксикации формируется существенный дефицит активности супероксиддисмутазы и каталазы в сердце. Идентифицированы проапоптотически направленные изменения в сердце в виде значительного увеличения активности каспазы-3 при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Установлено повышенное содержание конечных стабильных производных оксида азота (II) в плазме крови и сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Представлена интегральная характеристика уровня пероксид-зависимой инициации свободнорадикальных процессов в плазме крови и сердце при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Выяснено, что в зависимости от этапа развития сахарного диабета отмечаются особенности патохимических последствий влияния хронической алкогольной интоксикации и различная выраженность кардиальных повреждений.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования представляют новые знания о патохимических механизмах развития повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией и создают теоретические предпосылки для создания соответствующих методов профилактики, диагностики и терапии.

Практический интерес представляют полученные данные о некротическом характере развивающегося поражения миокарда при сахарном диабете 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Это свидетельствуют о целесообразности активного выявления хронического злоупотребления алкоголем среди больных сахарным диабетом 2 типа, с последующим скрининговым биомаркерным обследованием, направленным на обеспечение дальнейшей адекватной лечебно-диагностической тактики. Сведения о неблагоприятном влиянии хронической интоксикации алкоголем при сахарном диабете 2 типа на гликемический контроль и интенсивность свободнорадикальных процессов, представленные в настоящем исследовании, могут быть учтены при разработке способов патогенетически обоснованной профилактики и коррекции миокардиодеструкции у таких пациентов. Данные об отличиях в выраженности миокардиального повреждения при воздействии алкоголя на различных этапах развития сахарного диабета и о сопряжении этих различий с установленными патохимическими особенностями, могут иметь перспективное прогностическое и диагностическое значение. Фактически обоснованные выводы о взаимосвязи развивающегося повреждения сердца с гиперпродукцией оксида азота ставят вопрос о необходимости оценки возможности безопасного использования ряда лекарственных препаратов - доноров оксида азота (II) - у больных сахарным диабетом 2 типа, хронически злоупотребляющих алкоголем.

Внедрение результатов исследования

Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии Тюменской государственной медицинской академии; на кафедре биохимии и лабораторной медицины, на кафедре госпитальной терапии, а также на курсах клинической биохимии и клинической лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии. 

Апробация работы

Материалы исследования представлены на межрегиональной научной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003), на V межрегиональной научной конференции Актуальные вопросы наркологии (Омск, 2003), на III конференции молодых ученых России Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины (Москва, 2004), на межрегиональной научной конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2005), на юбилейной научной сессии, посвященной 85-летию ОмГМА (Омск, 2006), на заседании Омского отделения общества биохимиков и молекулярных биологов РАН (Омск, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов СО РАН (Новосибирск, 2008), на заседании Омского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики России (Омск, 2009), на межрегиональной научной конференции, посвященной памяти профессора Р. И. Лифшица (Челябинск, 2009), на совместном заседании кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО; кафедры психиатрии, наркологии и клинической психологии, кафедры  общей и биоорганической химии ОмГМА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая алкогольная интоксикация при сахарном диабете типа 2 способствует развитию некротического и апоптотического повреждения кардиомиоцитов в течение алкоголизации  и в послеалкоголизационном периоде.
2. Углубление нарушения качества гликемического контроля,  снижение обеспечения миокарда свободными жирными кислотами, окислительный стресс и активация каспазы-3 в сердце являются важными патохимическими факторами повреждения кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.
3. Высокое содержание оксида азота (II) и нитритивный стресс выступают ключевым звеном некротического повреждения миокарда при сочетании сахарного диабета 2 типа и злоупотребления алкоголем.
4. Выраженность повреждения и патохимических нарушений в сердце, развивающихся при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации, достигает максимального уровня в условиях постинтоксикационного состояния, а в период алкоголизации - становится более значительной с увеличением продолжительности воздействия этанола.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, Из них 13 - в рецензируемых периодических изданиях по перечню ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа содержит 34 таблицы, 14 рисунков и 1 схему. Список цитированной литературы включает 338 источников, в том числе 51 Ц  на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с целью и задачами, исследование было выполнено как простое, одномоментное контролируемое. В разделе работы, сопряженном с изучением клинического биоматериала объектами исследования стали образцы плазмы венозной крови  мужчин в возрасте от 40 до 60 лет, из числа пациентов, находивших на лечении в специализированных эндокринологических отделениях (Омской областной клинической больницы, городской больницы №2, больницы скорой медицинской помощи №2) и в 3-ем наркологическом отделении областного наркологического диспансера г. Омска в период с 2002 г. по 2003 г. Аналогичный биоматериал от клинически и лабораторно здоровых доноров данной возрастной группы, полученный в Омском областном центре крови, использовали для анализа контрольного уровня исследуемых показателей. Взятие венозной крови производили в условиях процедурного кабинета, утром натощак, после 12-часового голодания. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта использовали 5 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), который добавляли в количестве 0,1 мл на 5 мл цельной крови.

Исследование, в котором приняло участие 92 человека, было одобрено локальным этическим комитетом Государственного образовательного учреждения Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. От обследуемых лиц получено информированное согласие на их участие в проведении исследования.

Диагноз сахарного диабета типа 2 был установлен эндокринологом на основании общепринятых принципов диагностики  (МКБ-10: Е.11.0 - Е.11.9). Для формирования выборки больных сахарным диабетом были разработаны критерии включения (информированное согласие пациента на участие в исследовании; установленный диагноз сахарного диабета 2 типа; мужской пол; возраст от 40 до 60 лет) и исключения (отказ пациента от участия в исследовании; терапия сахарного диабета препаратами, которые не относятся к группе II генерации производных сульфонилмочевины; приём лекарственных препаратов, отсутствующих в стандартах лечения сахарного диабета, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; наличие других тяжелых хронических заболеваний, эндокринопатий, наследственных форм дислипопротеинемии, декомпенсации сахарного диабета с явлениями кетоацидоза на момент обследования; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед  взятием крови). Применение указанных критериев в сочетании с оценкой  признаков злоупотребления алкоголем методом П. П. Огурцова и соавт. (1997) по результатам физикального обследования и анкетирования 115 пациентов с сахарным диабетом 2 типа (совместно с врачами-эндокринологами) позволило выделить для дальнейшего участия в исследовании 48 человек, которые составили следующие выборочные группы: СД Ц пациенты с сахарным диабетом 2 типа без признаков злоупотребления алкоголем (25 человек); СД+АЛК Ц пациенты с сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем (23 человека).

Сведения о состоянии здоровья доноров, вошедших в группу контроля  (ГК, 20 человек), получены из результатов диспансерного медицинского осмотра и лабораторного обследования. Группа сформирована после применения заданных отборочных критериев включения (информированное согласие на участие в исследовании; отсутствие клинических и лабораторных проявлений патологии; мужской пол; возраст от 40 до 60 лет) и  исключения (отказ от участия в исследовании; наличие признаков хронического злоупотребления алкоголем; приём лекарственных препаратов, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед взятием крови).

Диагноз хронического алкоголизма у лиц, составивших группу сравнения (АЛК, 24 человека) был установлен наркологами Омского областного наркологического диспансера на основании отраслевых стандартов. Для формирования выборки больных хроническим алкоголизмом после предварительно проведенной простой рандомизации были использованы следующие критерии включения: информированное согласие пациента на участие в исследовании; установленный диагноз хронического алкоголизма, 2 стадии, с синдромом активной зависимости (F 10. 302, F 10. 242; МКБ-10), мужской пол; возраст от 40 до 60 лет. Критериями исключения из числа обследуемых явились: отказ пациента от участия в исследовании; приём лекарственных препаратов, отсутствующих в стандартах лечения хронического алкоголизма, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; наличие других тяжелых хронических заболеваний, эндокринопатий, наследственных форм дислипопротеинемии; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед взятием крови.

Объекты экспериментальной части исследования были представлены образцами плазмы крови и гомогенатов сердца половозрелых белых крыс-самцов породы Wistar массой 220-240 г. Животных, выращенных в виварии ОмГМА, содержали в условиях постоянной температуры и влажности при 12-ти часовом цикле день/ночь и использовали для исследования в соответсвии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также с положениями регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными и выводу их из эксперимента. Лабораторных животных содержали на сухом твердом корме. Стандартный сухой твердый корм включал 60% углеводов, 22% белка, 10% жиров (преимущественно растительные), 8% пищевых волокон и других ингредиентов. Сухой рацион с высоким содержанием жира включал 50% углеводов, 13% белка, 30% жира (преимущественно зоостеролы), 7% пищевых волокон и энергетически балластных веществ. Питание и жидкость были доступны ad libitum.

Экспериментальный сахарный диабет, эквивалентный сахарному диабету 2 типа, моделировали по методике предложенной Zhang F.et al. (2003). Согласно рекомендациям авторов метода, на фоне вызванной алиментарным ожирением инсулинорезистентности производили однократное внутривенное введение стрептозотоцина (15 мг/кг массы тела) в боковую вену хвоста. Регулярный динамический контроль за развитием сахарного диабета проводили, определяя уровень глюкозы крови при помощи глюкометра OneTouchо UltraЩ (Johnson&Johnson, США), а также - регистрируя глюкозурию и кетонурию с использованием индикаторных полосок БИОСКАНтм. Для формирования хронической алкогольной интоксикации крысам предоставляли свободный доступ к этанолу в качестве единственного источника жидкости C. Cascales (1983) в течение 2-х, а в пролонгированном варианте - 4-х месяцев.  Суточное потребление составляло 5,35 +0,27 мл⋅кг-1 абсолютного этанола в составе водного раствора концентрации 15 об.%.

Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя, экспериментально были смоделированы основные варианты сочетания сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, наиболее приближенные к ситуациям, встречающимся в клинической практике. Для оценки возможного влияния алкогольной интоксикации на этапе возникновения сахарного диабета были созданы экспериментальные условия, при которых алкоголизацию крыс осуществляли в 2-х месячном периоде развития инсулинорезистентности и прекращали после введения стрептозотоцина. С целью выяснения характера воздействия алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете моделировали 2-х месячную интоксикацию этанолом на вторые сутки после введения стрептозотоцина. Эффекты сочетания воздействия алкоголя на этапе развития инсулинорезистентности с его влиянием при уже сформированном сахарном диабете  оценивали, производя хроническую интоксикацию этанолом в течение всех 4-х месяцев экспериментального моделирования сахарного диабета. Таким образом, в соответствии с поставленными задачами нами были образованы группы  лабораторных животных, сведения о которых  представлены в таблице 1. Лабораторных крыс выводили из эксперимента с соблюдением правил эвтаназии. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта использовали натриевую соль ЭДТА. Гомогенаты сердца готовили на 0,15 М растворе KCl в соотношении 1:5 (масса ткани/объем среды выделения), центрифугировали (4000 g, 10 мин) и полученный супернатант использовали для определения исследуемых биохимических параметров. Все процедуры выделения биоматериала проводили при температуре +4С. Пробы плазмы крови и гомогенатов сердца помещали в пластиковые контейнеры и хранили в жидком азоте до момента исследования.

Таблица 1 Характеристика экспериментальных групп
Наименование группы	Количество наблюдений	Сокращённое обозначение
Группа контроля (интактные особи)	24	ГК
Алкогольная интоксикация в течение 2-х  месяцев с последующей 2-х месячной отменой алкоголя	21	А2ОА2
Алкогольная интоксикация в течение 2-х месяцев	24	А2
Алкогольная интоксикация в течение 4-х месяцев	27	А4
Сахарный диабет	29	СД
Алкогольная интоксикация в течение 2-х месяцев до возникновения сахарного диабета	21	А2СД
Алкогольная интоксикация в течение 2-х месяцев после возникновения сахарного диабета	22	СД+А2
Алкогольная интоксикация в течение 2-х месяцев до возникновения сахарного диабета и продолжающаяся в последующие 2 месяца после начала заболевания	25	А2СД+А2

Уровень кардиального тропонина I в экспериментальном разделе исследования определяли иммуноферментным методом (тест-система УRat Cardiac Tn-I ELISAФ, Life Diagnostics, West Chester, PA) с детекцией результатов анализа на планшетном фотометре УMultiscan EXФ (Финляндия).  В клиническом биоматериале оценку уровня данного кардиоспецифичного тропонина проводили с помощью иммунохроматографической системы BIOCARD TROPONIN I  (ANI BIOTECH OY)  полуколичественным методом.  Положительными считали значения, равные или превосходящие 1,5 нг/мл, что соответствует лабораторно-диагностическому критерию миокардиального некроза. Определение содержания общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов сыворотки крови проводили с использованием тест-систем фирмы HOSPITEX DIAGNOSTICS. Концентрацию общего белка в плазме крови определяли при помощи коммерческого набора УПротеин-НОВОФ (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ, г. Новосибирск). Определение фруктозаминов в плазме крови проводили при помощи тест-системы FRUCTOSAMINE (Modified NBT Method) фирмы HOSPITEX DIAGNOSTICS. Содержание тиобарбитурат-реактивных соединений (ТБК-РС) оценивали колориметрическим методом (Н. О. Стальная и соавт. 1977). Содержание ТБК-РС выражали в мкмоль⋅л-1 плазмы крови и в мкмоль⋅мг-1 белка ткани.

Окислительную модификацию белков оценивали спектрофотометрическим методом, предложенным Е. Е. Дубининой (1995). Содержание окисленных белковых производных выражали в нмоль.мг-1 белка гомогената сердца и в ммоль.л-1  плазмы крови. Концентрацию конечных производных оксида азота изучали по методу, предложенному Green L.C. et al. (1982) в модификации П. П. Голикова (2004).

Содержание свободных жирных кислот определяли энзиматическим методом в микропланшетном формате с помощью набора реактивов Free Fatty Acid Quantification Kit фирмы BIOVISION и выражали в мг-эквивалентах пальмитиновой кислоты на литр плазмы крови. Уровень С-реактивного белка изучали с использованием иммуноферментных систем высокочувствительного анализа: C-reactive protein производства ALPCO Immunoassays (клиническая часть) и Rat C-reactive protein компании Immunology Consultants Laboratory (экспериментальная часть). Альфа-1-кислый гликопротеин в клиническом биоматериале определяли иммунотурбидиметрически при помощи набора фирмы Sentinel (Италия) а в экспериментальном - иммуноферментным методом Rat Alpha-1-Acid Glycoprotein EIA Kit производства Alpco Diagnostic. Концентрацию фибронектина изучали иммуноферментным методом с использованием  коммерческих наборов: Human Fibronectin EIA Kit компании American Diagnostica (клинический биоматериал) и Rat Fibronectin  фирмы Immunology Consultants Laboratory (экспериментальный биоматериал).

Измерение активности супероксиддисмутазы проводили по методике, предложенной Сирота Т. В. (1999), основанной на ингибировании реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии супероксиддисмутазы.  За единицу активности СОД принимали уровень 50%-го ингибирования реакции окисления адреналина и выражали в данных принятых условных единицах на 1 мг белка. Об активности каталазы судили по убыли перекиси водорода при =230 нм (R. F. Beers, 1952) и выражали в международных единицах.

Активность каспазы-3 в гомогенатах сердца определяли колориметрическим методом с помощью набора реактивов Caspase-3/CPP32 фирмы BIOVISION и выражали в рекомендованных разработчиками условных единицах оптической плотности. Активность МВ-фракции креатинкиназы определяли в условиях иммуноингибирования других изоферментов с помощью коммерческой тест-системы фирмы Human и представляли в международных единицах.

С целью определения уровня антиперекисной защиты проводили анализ пероксид-зависимой хемилюминесценции изучаемых объектов. Н2О2-индуцированную хемилюминесценцию плазмы крови и гомогенатов сердца регистрировали по предложенной методике (А. К. Журавлев, 1985) и оценивали по величине светосуммы за 1 мин (S) в расчёте на 1 мл плазмы крови или гомогената сердца (имп103мин-1мл-1).

Иммунохимический и колориметрический анализ с детекцией результатов на планшетном фотометре УMultiscan EXФ (Финляндия), проводили в центральной научно-исследовательской лаборатории (зав. лабораторией, доктор медицинских наук, профессор Т. И. Долгих) Омской государственной медицинской академии. Спектрофотометрические, колориметрические, иммунотурбидиметрические и хемилюминесцентные исследования выполняли в лаборатории кафедры биохимии и лабораторной медицины ОмГМА с использованием хемилюминометра БХЛ-06 и спектрофотометра UNICO 2802S UV/VIS.

При анализе результатов исследования использованы методы описательной и вариационной статистики с применением корреляционного анализа. Данные представлены как minЦMe(LQ-HQ)Цmax, где min Ц наименьшее значение, Me - медиана, LQ - нижний (25-й) квантиль, HQ - верхний (75-й) квантиль, max - наибольшее значение. Численность выборок обозначена n. Различия между значениями показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни и -квадрат теста. Нулевой считали гипотезу о совпадении медианных значений двух независимых выборок. Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принимали pU=0,05. При корреляционном анализе использовали определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением пакета статистических программ SPSS 11.5 (SPSS Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В проведенном исследовании получено биомаркерное свидетельство о более высокой степени выраженности деструкции кардиомиоцитов у больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем. От умеренного повышения проницаемости кардиомиоцитарных биомембран, отмеченного при течении диабета у лиц без признаков хронической алкогольной интоксикации (табл. 2), почти у половины пациентов, злоупотребляющих алкоголем, процесс достиг уровня некротического характера поражения, что отражают сведения о распространенности позитивных результатов определения уровня кардиального тропонина I (cTnI) в плазме крови таких больных (табл. 3).

Таблица 2  Активность МВ-изофермента креатинфосфокиназы в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем (МЕл-1)
Группы обследованных	n	min	LQ	Me	HQ	max	pU
ГК	21	4,00	5,45	10,00	16,10	19,00	-
АЛК	14	4,80	6,75	9,20	13,00	20,00	pUГК=0,813
СД	15	12,20	13,20	17,40	22,80	24,20	pUГК=0,002
СД+АЛК	12	5,00	15,18	18,35	32,20	47,80	pUГК=0,002 pUАЛК=0,002 pUСД=0,221
Примечание: n - численность выборки, pU - статистический уровень значимости отличий по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом (UЦтест Манна-Уитни).

cTnI-манифестное повреждение кардиомиоцитов, в соответствии с полученными результатами, происходит на фоне выраженного острофазового ответа, что характеризуется увеличением концентрации С-реактивного белка (С-РБ) в 2,03 раза (p<0,001) и 1-кислого гликопротеина (1-КГП) - в 1,7 раза (p=0,001). Выявленная напряженность острофазовых механизмов может являться дополнительным аргументом в пользу некротического генеза наблюдаемой биомаркерной реакции. Вместе с тем, повышение уровня С-РБ непосредственно способствует поражению сердца, а также потенцирует увеличение некротической зоны, активируя каскады системы комплемента. А рост концентрации 1-КГП, в свою очередь, может быть проявлением декомпенсации сахарного диабета при его сочетании со злоупотреблением алкоголем. Кроме того, повышение уровня 1-КГП может быть обусловлено прямым влиянием хронической алкогольной интоксикации на процессы синтеза сиалированных белков. Важен и тот факт, что с активацией провоспалительных гуморальных механизмов связано усугубление инсулинорезистентности, что также можно рассматривать в ряду причин обнаруженного более выраженного повреждения кардиомиоцитов. Таким образом, при сахарном диабете 2 типа под влиянием хронической алкогольной интоксикации формируются агрессивные в отношении миокарда тенденции со стороны гуморальных механизмов неспецифической резистентности.

Таблица 3  Доля значений концентрации кардиального тропонина I в крови, превосходящих диагностический порог миокардиального некроза, у больных сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем
Показатели	Группы обследованных
	ГК	АЛК	СД	СД+АЛК
Численность группы	20	24	25	23
Доля значений, превышающих 1,5 нг/мл	0	0	0	0,48 *
Примечание. Общее количество наблюдений в группе принято за 1,0 * - статистический уровень значимости отличий при  p<0,05 (-квадрат тест) по отношению к группам:  ГК, АЛК, CД

Хроническое злоупотребление алкоголем оказывает, согласно полученным нами данным, определенное влияние на ключевые характеристики компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа. Выявленные сдвиги по отношению к лицам, отрицающим злоупотребление алкоголем, касаются уровня глюкозы крови натощак (рис. 1). Это заключается в более значительной гипергликемии, отражающей углубление нарушений препрандиального гликемического контроля. В связи с этим,  вероятна гиперактивация процессов гликирования, что способствует образованию большого количества поперечных сшивок между макромолекулами межклеточного матрикса, нарушает внутриматриксные и матрикс-клеточные взаимоотношения и повышает чувствительность миокарда к неблагоприятным воздействиям. Кроме того, к числу возможных последствий более высокой гипергликемии можно отнести подавление вазодилятационного эффекта NO продуктами гликирования, что значительно повышает риск развития ишемии миокарда.

Рисунок 1. Содержание глюкозы и фруктозаминов в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем

Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: У**Ф - p<0,01; У***Ф - p<0,001; по сравнению с группой СД: У#Ф - p<0,05 (U - тест Манна-Уитни).

Аутоокисление возросших количеств неиспользуемой  глюкозы сопровождается гиперпродукцией активных форм кислорода и развитием окислительного стресса, имеющего прямое отношение к цитодеструкции. В рамках метаболического синдрома имеется устойчивая связь между нарушением углеводного обмена и развитием атерогенных вариантов дислипопротеинемий. Однако наши результаты не обнаружили неблагоприятного влияния хронической алкогольной интоксикации на липидный состав крови при сахарном диабете 2 типа. Известно, что дислипопротеинемия не является основным патогенетическим фактором развития диабетической кардиомиопатии. Вместе с тем, отмеченное нами повышение уровня С-РБ может оказывать проатерогенное действие, независимое от нарушений липидного спектра крови. Этот факт, несмотря на условия нормолипидемии, предполагает существование возможности влияния коронарогенных механизмов на развитие зарегистрированного повреждения миокарда.

Нарушение гликемического контроля патохимически сопряжено с развитием окислительного стресса и свободнорадикальным повреждением сердечной мышцы.  В дополнительную интенсификацию свободнорадикальных процессов у больных сахарным диабетом 2 типа, злоупотребляющих алкоголем, могут вносить свой вклад и прооксидантные эффекты, обусловленные биотрансформацией этанола. Однако при хемилюминесцентном анализе нами показано, что возникающее при диабете нарушение баланса между уровнем катализаторов плазмы крови, разлагающих перекись водорода по радикальному и нерадикальному путям, в сторону преобладания радикал-генерирующих процессов не подвержено влиянию хронической алкогольной интоксикации (табл. 3).

Таблица 3  Светосумма Н2О2-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови у больных сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем (имп103минмл-1)
Группы обследованных	n	min	LQ	Me	HQ	max	pU
ГК	11	1,38	1,85	2,42	6,22	6,40	-
АЛК	12	2,22	2,87	3,73	5,05	11,09	pUГК=0,569
СД	11	3,46	6,81	7,39	11,44	11,95	pUГК=0,012
СД+АЛК	18	3,92	5,51	7,44	9,65	13,75	pUГК=0,010 pUАЛК=0,050 pUСД=0,809
Примечание: n - численность выборки, pU - статистический уровень значимости отличий по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом (UЦтест Манна-Уитни).

Это касается и обусловленной диабетом интенсификации процессов перекисного окисления липидов, которая практически не изменяется вследствие сочетания сахарного диабета со злоупотреблением алкоголем (уровень ТБК-РС,  рис. 2). Следовательно, данные сдвиги находятся, в большей степени, в причинно-следственных взаимоотношениях с наличием диабета и, поэтому, не могут рассматриваться в аспекте механизма формирования выявленного повреждения сердца у больных сахарным диабетом 2 типа, злоупотребляющих алкоголем.

Особенностью сочетания сахарного диабета 2 типа и хронического злоупотребления алкоголем стало более выраженное накопление в крови окисленных белковых производных (рис. 2), чего не наблюдалось у пациентов без признаков  хронической алкоголизации. Отсутствие сдвигов в антиперекисной защите плазмы, оцениваемой с помощью хемилюминесцентного анализа, позволяет предполагать наличие абсолютного или относительного дефицита антирадикальной активности. С учетом этого, к вероятным причинам роста концентрации ОБП в плазме крови можно отнести как избыточную генерацию активных форм кислорода, так и снижение антиокислительных резервов.

Рисунок 2. Уровень тиобарбитурат-реактивных соединений (ТБК-РС) и окисленных белковых производных (ОБП) в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем

Примечание. Обозначения - см. рис. 1.

Истощение антиоксидантной системы и генерация свободных радикалов вследствие алкоголизации может быть следствием индукции минорных путей детоксикации этанола и, в частности, цитохром-Р450-зависимой окислительной системы. Вероятно, что по этой причине, при равной степени липопероксидации (уровень ТБК-РС) и сходного уровня нарушения антиперекисной защиты (светосумма Н2О2-ХЛ), у данных пациентов более интенсивно протекает окислительное повреждение белков плазмы крови.

Полученные результаты позволяют считать актуальной гипотезу о важной роли свободнорадикальной агрессии в развитии повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа под влиянием злоупотребления алкоголем. Потенцирование окислительного стресса может быть обусловлено непосредственными эффектами алкогольной интоксикации, а также - находиться во взаимосвязи с обнаруженным нами более значительным нарушением гликемического контроля. Последнее может происходить, в том числе, и при участии выявленного напряжения гуморальных механизмов неспецифической резистентности, способствующего углублению дефицита эффектов инсулина.

Известно, что неблагоприятные явления в сердце при хронической алкогольной интоксикации связаны не только с процессами катаболизма этанола, они регистрируются и в постинтоксикационном периоде, сопровождая течение синдрома отмены алкоголя (В.С. Моисеев, 2009). Возникновение таких состояний на фоне сахарного диабета может повлечь за собой резкое снижение энергоподдержки миокарда в условиях диабетогенного повышения его чувствительности к ишемии и быть другой возможной причиной выявленного нами повреждения миокарда.

Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя, в экспериментальном разделе нами проведено изучение влияния алкогольной интоксикации на этапе возникновения сахарного диабета и проанализированы патохимические особенности его течения в условиях постинтоксикационного состояния. Также, охарактеризовано воздействие алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете и эффекты сочетания воздействия алкоголя на этапе развития инсулинорезистентности с его влиянием при уже сформированном сахарном диабете. Распространение исследования на уровень соответствующих биохимических процессов в сердце позволило провести оценку характера локальных патохимических нарушений и их возможной роли в развитии повреждения кардиомиоцитов.

Хроническая интоксикация этанолом при сформированном вне алкоголизации экспериментальном сахарном диабете (группа СД+А2), согласно полученным нами данным, характеризуется резким проявлением нарушения целостности кардиомиоцитов. Уровень cTnI  в плазме крови таких особей в 19,7 раза (pUСД=0,008) превышает соответствующее значение при диабете вне алкоголизации (рис. 3). О наличии реактивного воспалительного процесса свидетельствует выраженный острофазовый ответ (рис. 4): содержание С-РБ и 1-КГП в плазме крови становится повышенным по сравнению с течением диабета без воздействия алкоголя. При этом обнаруженное умеренное снижение уровня фибронектина может отражать его усиленное потребление при развитии тканевой деструкции. Развитие острофазового ответа при данном варианте сочетания сахарного диабета и алкогольной интоксикации может иметь патобиологическое значение в контексте усиления инсулинорезистентности под влиянием провоспалительных цитокинов, способствующей декомпенсации заболевания.

Действительно, биохимические проявления деструктивных процессов в сердце наблюдаются в условиях углубления патологии контроля гликемии, о чем свидетельствовала более высокая концентрация фруктозаминов в плазме крови (рис. 5). Это может отражать потенцирование дефицита эффектов инсулина вследствие воздействия алкоголя. Вместе с тем, по концентрации свободных жирных кислот (СЖК) в крови сделать такое заключение не представляется возможным, поскольку уровень данного показателя был снижен при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией (табл. 4). Такой эффект может быть следствием фермент-зависимого формирование этиловых эфиров  жирных кислот при неокислительном катаболизме этанола. Данные производные из крови поступают в ткани, что снижает плазменный уровень СЖК, и оказывают мембранопатологическое действие, способствуя развитию повреждения. Кроме того, снижение уровня СЖК может способствовать углублению нарушений энергетического обмена в кардиомиоцитах, учитывая невозможность адекватного использования углеводных субстратов при дефиците эффектов инсулина. В связи с этим, наблюдаемое уменьшение содержания СЖК, вероятно, не вполне пропорционально и адекватно отражает степень инсулинорезистентности при хронической интоксикации этанолом. Но, с другой стороны, обнаруженное различие может быть косвенной характеристикой работы одного из звеньев возможного механизма наблюдаемого нами повреждения сердца. Нарушение сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях под влиянием высоких концентраций этиловых эфиров жирных кислот в условиях энергетического коллапса может способствовать гиперпродукции активных форм кислорода и развитию окислительного стресса в кардиомиоцитах.

Таблица 4 Содержание свободных жирных кислот в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (мгл-1)
Группы эксперимен-тальных животных	n	min	LQ	Me	HQ	max	pU
ГК	12	25,38	64,79	124,73	186,23	266,55	-
А2ОА2	11	23,69	51,91	127,93	176,57	248,78	pUГК=0,712 pUА2<0,001 pUА4<0,001
А2	20	12,72	15,69	24,68	29,34	77,58	pUГК<0,001 pUА4=0,329
А4	20	12,08	14,91	23,44	27,87	73,70	pUГК<0,001
СД	15	60,51	118,77	217,05	241,89	531,12	pUГК=0,031
А2СД	12	26,01	35,76	60,38	75,14	128,37	pUГК=0,021 pUА2ОА2=0,064 pUСД<0,001 pUСД+А2=0,090 pUА2СД+А2=0,023
СД+А2	18	37,68	59,27	88,04	92,31	115,74	pUГК=0,050 pUА2<0,001 pUСД<0,001 pUА2СД+А2=0,481
А2СД+А2	20	49,00	69,03	89,85	103,10	103,10	pUГК=0,060 pUА4<0,001 pUСД<0,001
Примечание: Обозначения указаны в табл. 1.

Рисунок 3. Уровень кардиоспецифичного тропонина I в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

 

Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: У*Ф - p<0,05; У**Ф - p<0,01; У***Ф - p<0,001; по сравнению с группой СД: У#Ф - p<0,05; У##Ф - p<0,01; У###Ф - p<0,001  (U - тест Манна-Уитни).

Рисунок 4. Медианы уровня С-реактивного белка (С-РБ, мгл-1), 1-кислого гликопротеина (АКГП, мгл-1), фибронектина (ФН, мгл-1) и общего белка (ОБ, гл-1) в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3..

Рисунок 5. Медианы уровня глюкозы (ГЛ, ммольл-1) и фруктозаминов (ФА, мкмольл-1) в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3.

Рисунок 6. Светосумма Н2О2-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови (ПК) и гомогенатов сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3..

Рисунок 7. Содержание тиобарбитурат-рективных соединений в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3.

Рисунок 8. Активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в гомогенатах сердца при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3.

Рисунок 9. Уровень окисленных белковых производных в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3.

Рисунок 10. Содержание конечных стабильных продуктов NO в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см.  рис. 3.

Схема  1. Патохимические факторы миокардиодеструкции при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией

Результаты нашего исследования показали, что при сформированном сахарном диабете хроническая алкогольная интоксикация оказывает своё неблагоприятное воздействие непосредственно в сердце, блокируя диабетогенную компенсаторную активацию антиперекисной защиты, и не влияет на антиперекисную защиту плазмы крови (рис. 6). Подобные сдвиги зафиксированы в отношении содержания продуктов липопероксидации в сердце и крови особей данной экспериментальной группы: концентрация ТБК-РС возрастала в сердце и сохранялась на прежнем уровне в плазме крови (рис. 7). Хроническое потребление алкоголя, как показано D. S. Jaya, (1993) и S. M. Bailey (2001), вызывает дефицит антиокислительных резервов тканей, что проявляется снижением активности глутатионпероксидазы и содержания восстановленного глутатиона, а также уменьшением активности каталазы в сердце.

С учетом этого, обнаруженные нами сдвиги могут отражать связь усиления липопероксидации в сердце при хронической алкогольной интоксикации в условиях сформированного сахарного диабета с блокирующим действием алкоголя в отношении реактивной активации системы антирадикальных и антиперекисных факторов защиты. Выполненное нами исследование активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в гомогенатах сердца показало справедливость такого предположения. Повышение активности СОД и КАТ при сахарном диабете, в аспекте полученных нами данных об интенсификации свободнорадикальных процессов, можно рассматривать как отражение компенсаторно-приспособительной реакции антиокислительной направленности. Однако если при изолированном течении экспериментального сахарного диабета активность ферментов повышалась, то с присоединением к нему алкогольной интоксикации этого увеличения не происходило, или оно происходило, но в значительно меньшей степени (рис. 8). Таким образом, нами показано, что хроническая алкогольная интоксикация при сформированном сахарном диабете ингибирует важные ферментативные звенья антиокислительной защиты сердца.

Другой деструктивный фактор свободнорадикального генеза, способный находиться среди причин обнаруженного повреждения миокарда, - окислительная модификация белков.  При хронической алкогольной интоксикации на фоне сформированного в отсутствии алкоголизации сахарного диабета повышение уровня окисленных белков происходит параллельно: в плазме крови и сердце (рис. 9) при практически равном уровне белка в исследуемом биологическом материале. Это указывает на более активную продукцию свободных радикалов и/или более выраженное снижение антирадикальной устойчивости белковых молекул. Окислительная структурная модификация тканевых и плазменных белков приводит к нарушению их функции, а накопление окисленных белков в ткани сердца является инициатором апоптоза, что определяет потенциальное патогенетическое значение выявленных сдвигов.

В условиях обнаруженного ингибирования адаптационных антиокислительных процессов и нарастания явлений оксидативного стресса при хроническом воздействии алкоголя на фоне развившегося сахарного диабета нами показан рост концентрации конечных стабильных производных оксида азота (NOx) в сердце и плазме крови (рис. 10). При этом, уровень NOx в сердце данных особей на 25,8% превысил значение при сахарном диабете вне алкоголизации (p=0,015). Это создает предпосылки к усиленному образованию токсичных продуктов взаимодействия оксида азота с активными формами кислорода. С другой стороны, это может отражать активацию синтеза NO в ответ на дефицит биологического действия, обусловленный его потреблением в данных реакциях, что вызывает повышение активности NO-синтазы и гиперпродукцию NO. Цитотоксический эффект NO, как правило, регистрируется при его повышенном уровне и обусловлен его свободнорадикальной химической природой. Показано, что NO ингибирует окислительное фосфорилирование в митохондриях, связываясь с цитохромоксидазой. При гиперпродукции супероксида и образовании высоких концентраций продукта его взаимодействия с NO - пероксинитрита угнетаются ферменты дыхательной цепи.

В совокупности с нашими данными о содержании NOx, это позволяет предположить определенную роль нитритивного стресса в возникновении повреждения миокарда при хроническом воздействии алкоголя в течение сформированного сахарного диабета. Повреждающие эффекты пероксинитрита связаны с реализацией некротического и апоптотического путей клеточной смерти. Данные об активности каспазы-3 свидетельствуют о том, что под влиянием хронической алкогольной интоксикации в условиях сформированного сахарного диабета повышается активность апоптотического процесса в сердце (табл. 5). В то время как, при развитии и течении сахарного  диабета вне  алкоголизации такие изменения отсутствуют. Возможно, что рост активности фермента обусловлен суммацией и взаимным потенцирование проапоптотических влияний, характерных для сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации в отдельности,  поскольку отсутствует статистически значимое  повышение активности каспазы-3 по сравнению изолированным течением сахарного диабета. Активация программы апоптоза и утрата определенной части миокарда уменьшает его функциональные возможности, что может предопределить и его высокую чувствительность к ишемическому повреждению.

Обобщение установленных нами фактов позволяет следующим образом представить патохимические звенья механизма развития миокардиодеструкции при хронической алкогольной интоксикации на фоне сформированного сахарного диабета:

• углубление нарушений гликемического контроля;
• блокирование компенсаторных антирадикальных и антиперекисных реакций;
• гиперактивация свободнорадикальных процессов с окислительным повреждением белков и реализацией некротических эффектов производных NO;
• относительный дефицит кардиопротекторного биологического действия NO вследствие его инактивации;
• активация апоптоза, способствующего гиперфункции сохранной части миокарда и развитию несоответствия между его потребностью и существующей возможностью энергетического обеспечения;
• миокардиопатогенное действие этиловых эфиров свободных жирных кислот, образующихся при алкогольной интоксикации;
• реакция со стороны острофазовых белков, потенцирующая инсулинорезистентность и повреждение кардиомиоцитов.

Таблица 5 Активность каспазы-3 в гомогенатах сердца при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (усл.ед.Хмг-1 белка)
Группы экспериментальных животных	n	min	LQ	Me	HQ	max	pU
ГК	12	0,47	0,36	1,26	2,76	3,91	-
А2ОА2	19	1,59	1,59	2,04	3,70	5,79	pUГК=0,059 pUА2=0,383 pUА4=0,113
А2	10	1,65	1,59	2,87	5,08	6,99	pUГК=0,032 pUА4=0,624
А4	22	1,55	1,91	3,70	4,85	7,09	pUГК=0,005
СД	11	0,30	0,63	2,04	4,73	6,07	pUГК=0,255
А2СД	16	1,50	2,41	4,00	4,12	6,52	pUГК=0,001 pUА2ОА2=0,005 pUСД=0,166 pUСД+А2=0,812 pUА2СД+А2=0,476
СД+А2	13	1,48	2,30	3,59	5,30	6,54	pUГК=0,003 pUА2=0,474 pUСД=0,155 pUА2СД+А2=0,607
А2СД+А2	22	1,40	1,59	2,97	6,22	6,22	pUГК=0,007 pUА4=0,814 pUСД=0,084
Примечание: Обозначения указаны в табл. 1.

В случае хронического воздействия этанола, начинающегося в период моделирования инсулинорезистентности и продолжающегося в течение развившегося экспериментального сахарного диабета (группа А2СД+А2) биомаркерное проявление повреждения миокарда и свидетельство напряжения острофазовых механизмов были аналогичны и статистически не отличались от отмеченных при действии этанола, ограниченном этапом уже сформированного диабета (группа СД+А2).  На фоне выраженной острофазовой реакции со стороны белковых реактантов (рис. 4) уровень cTnI  в плазме крови  (рис. 3) был многократно повышен (в 29 раз, pUСД<0,001) по сравнению с соответствующим значением при диабете вне алкоголизации. Отмеченная аналогичность проявлений деструктивных и реактивных изменений позволяет полагать, что при таких различных вариантах сочетания сахарного диабета и алкогольной интоксикации неблагоприятное кардиотропное воздействие имеет общий генез и определяется, в большей степени, эффектами происходящей биотрансформации алкоголя, чем отдаленными последствиями алкоголизации. Это также относится и к обнаруженному характеру нарушений гликемического контроля (рис. 5), снижению уровня свободных жирных кислот в плазме крови (табл. 4) и к хемилюминесцентным проявлениям ингибирования диабетогенной компенсаторной активации антиперекисной защиты в отсутствии влияния на антиперекисную защиту плазмы крови (рис. 6).

Однако обнаруженные сдвиги в отношении содержания продуктов липопероксидации и уровня снижения активности антиокислительных ферментов сердца у особей данной экспериментальной группы были выражены в большей степени. Так, концентрация ТБК-РС возрастала не только в сердце, но и в плазме крови (рис. 7), отмечалась некоторая тенденция роста содержания окисленных белковых производных в сердце (рис. 9), а значения активности супероксиддисмутазы и каталазы в сердце были существенно более низкими (соответственно, p=0,001 и p=0,004; рис. 8) по сравнению с воздействием алкоголя, ограниченным этапом уже сформированного диабета (группа СД+А2). Следовательно, длительная алкогольная интоксикация, захватывающая начальный этап развития сахарного диабета и продолжающаяся в течение сформированного заболевания характеризуется более выраженным ингибированием ферментативных звеньев антиокислительной защиты сердца и более значительным усилением свободнорадикальных процессов повреждения биомолекул, чем воздействие алкоголя только в периоде развившегося заболевания. На этом фоне, в условиях также более значительно возросшего содержания NOх увеличивается риск избыточной продукции пероксинитрита и других продуктов взаимодействия NO с активными формами кислорода, обладающих миокардиопатогенными свойствами. Вместе с тем, активность каспазы-3 в сердце превышает величину в контрольной группе, но остается на уровне значений, зафиксированных при развитии и течении диабета вне алкоголизации (группа СД).

Сравнительный анализ выявленных биохимических нарушений показывает, что повреждение миокарда при хронической интоксикации этанолом, начинающейся в начальный (лпреддиабетический) период и продолжающейся в течение сахарного диабета характеризуется патохимическим механизмом, аналогичным описанному для воздействия алкоголя, ограниченного периодом уже сформированного заболевания. Однако дополнительное воздействие алкоголя на этапе формирования инсулинорезистентности характеризуются появлением особенностей биохимических сдвигов, которые заключаются в более значительном влиянии в отношении: ингибирования компенсаторных антирадикальных и антиперекисных защитных реакций; интенсификации свободнорадикальных процессов с окислительным повреждением белков, гиперпродукции NO и реализации цитотоксических эффектов производных оксида азота; возможности развития дефицита кардиопротекторного биологического действия NO вследствие его инактивации супероксидом.

Селективное воздействие алкоголя на этапе развития инсулинорезистентности (группа А2СД), как следует из результатов нашей работы, характеризуется крайне выраженным повреждающим влиянием на сердце, которое проявляется после возникновения сахарного диабета.  При этом деструкция кардиомиоцитов, оцениваемая по концентрации cTnI, достигает максимального из зарегистрированного в нашем исследования уровня. Содержание данного маркера статистически значимо превышает величины, отмеченные для других исследуемых вариантов сочетания сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации: в 2,6 раза  - по сравнению с группой А2СД+А и 3,9 раза - по сравнению с группой СД+А (p<0,001), в 75,8 раза увеличиваясь по сравнению уровнем, характерным для диабета вне алкоголизации (рис. 3). Это сопровождалось острофазовой реакцией со стороны белкового состава крови, несущественно отличающейся от других вариантов сочетания сахарного диабета и воздействия алкоголя (рис. 4).

Просматривается определенный парадокс в представленных результатах: при воздействии алкоголя только на этапе формирования инсулинорезистентности манифестация миокардиального некроза многократно выше, чем при интоксикации этанолом на всем протяжении экспериментального моделирования сахарного диабета. Таким образом, при меньшей продолжительности воздействия отмечается более выраженный патогенный эффект. Следовательно, кардиотропное неблагоприятное влияние реализуется не только во время поступления и биотрансформации алкоголя, но и формирует высокую подверженность диабетогенному повреждению в отдаленном периоде после прекращения алкоголизации. В связи с этим и согласно нашим данным, крайне опасными в отношении развития повреждения миокарда при сахарном диабете являются постинтоксикационные и абстинентные периоды алкоголизации.

Причинами развития миокардиодеструкции, в данном случае, может быть развитие более тяжелой формы сахарного диабета вследствие алкоголизации на стадии предболезни. Анализ результатов оценки гликемического контроля показывает правомочность такого предположения (рис. 5), поскольку у животных данной группы наблюдается наибольшая выраженность гипергликемии среди всех изучаемых вариантов сочетания сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем. Высокий уровень повреждения миокарда может быть обусловлен и повышением чувствительности клеток к неблагоприятным диабетогенным воздействиям вследствие развития посталкоголизационного состояния, сопровождающегося выраженными нарушениями метаболический процессов и биоэнергетики. Отмеченное нами снижение плазменного уровня СЖК, когда в условиях диабета они являются практически безальтернативным источником энергии, может способствовать прогрессированию нарушений метаболических процессов (табл. 4).

Воздействие алкоголя, перенесенное на этапе развития инсулинорезистентности, не влияет на выраженность обусловленной сахарным диабетом активации процессов липопероксидации и окислительной модификации белков в сердце, но характеризуется возрастанием уровня тиобарбитурат-реактивных соединений в плазме крови особей данной экспериментальной группы (рис. 7, 9) по сравнению  с группой СД. На уровне антиокислительной защиты плазмы крови и сердца рассматриваемые послеалкоголизационные эффекты проявляются принципиально аналогично формирующимся в течение интоксикации при сахарном диабете (рис. 6). Однако по сравнению с другими вариантами сочетания воздействия алкоголя и сахарного диабета, при рассматриваемой ситуации в сердце преобладают нарушения антиперекисной защиты. Это характеризуется наиболее низкой активностью каталазы при отсутствии сдвигов со стороны супероксиддисмутазы по отношению к экспериментальному сахарному диабету вне воздействия алкоголя (рис. 8). Обнаруженное нарушение элиминации Н2О2 при неизменной активности СОД может способствовать генерации гидроксильного радикала, который способен вызывать разрывы связей в ДНК, что является одним из инициаторов реализации механизмов клеточной смерти.

В данной группе, в условиях неэффективности антиперекисной защиты нами выявлен наивысший рост концентрации NOx в сердце и плазме крови (рис. 10). Высокая концентрация оксида азота при наличии окислительного стресса способствует резкому увеличению продукции пероксинитрита. Цитотоксическое действие избытка NO в крови на -клетки поджелудочной железы может выступать причиной обнаруженного нами ухудшения гликемического контроля при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, а декомпенсация диабета нередко сопряжена с миокардиодеструкцией. Следовательно, один из потенциальных путей наблюдаемого снижения эффектов действия инсулина под влиянием интоксикации алкоголем может иметь NO-зависимое происхождение.

Известно, что резко повышенные концентрации пероксинитрита обладают некротическим действием (L. Virag et al., 2003). Показано, что в сердце пероксинитрит инактивирует аконитазу, что угнетает цитратный цикл и способствует углублению дефицита интрацеллюлярного пула НАД+ и АТФ, наблюдающегося вследствие диабета. Повреждение ДНК пероксинитритом способствует активации в миокарде поли(АДФ)-рибозилирования, что сопровождается дополнительными затратами энергии и в условиях изначально низкого уровня АТФ, влечет за собой развитие некроза (P. Pacher et al., 2002). С этих позиций, мощный рост содержания NOx, наблюдаемый в сердце и плазме крови, можно расценивать как патохимический фактор развития обнаруженного нами ярко выраженного некротического процесса в миокарде при сахарном диабете, возникшем в периоде после прекращения хронической алкогольной интоксикации. Данные об активности каспазы-3 свидетельствуют о том, что перенесенная в периоде формирования инсулинорезистентности алкогольная интоксикация оказывает свое проапоптотическое влияние в сердце в виде некоторого патохимического следа, который в дальнейшем сопровождает течение сахарного диабета (табл. 5).

Таким образом, зарегистрированные нами наивысшие проявления некротического процесса в миокарде при сахарном диабете, возникшем в периоде после прекращения хронической алкогольной интоксикации, сочетаются с определенными особенностями нарушений биохимических процессов. Среди таких отличительных сдвигов: преимущественное ингибирование антиперекисных защитных механизмов, многократное увеличение содержания NOx в сердце и наиболее значительный рост концентрации продуктов липопероксидации в плазме крови.

Полученные результаты показывают, что различные варианты сочетания экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией сопровождаются повреждением миокарда и характеризуются наличием общих закономерностей метаболических нарушений, а также их особенностями, отражающими степень повреждения кардиомиоцитов и отличительные черты его механизма.

ВЫВОДЫ

1. Хроническая алкогольная интоксикация на фоне сахарного диабета способствует деструкции кардиомиоцитов, что получило клинико-экспериментальное биомаркерное подтверждение в форме повышения уровня кардиоспецифичного тропонина I.
2. Под влиянием хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете углубляются нарушения качества гликемического контроля.
3. Процессы липопероксидации, окислительной модификации белков в крови и сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией интенсифицированы.
4. В условиях сахарного диабета, под влиянием алкогольной интоксикации формируется существенный дефицит антирадикальной и антиперекисной защиты, во многом обусловленный снижением активности ферментативного звена (супероксиддисмутазы и каталазы) в сердце.
5. Степень ингибирования ферментативных звеньев антиокислительной защиты сердца и активность свободнорадикальных механизмов повреждения биомолекул увеличиваются с возрастанием продолжительности хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете.
6. Хроническая алкогольная интоксикация при сахарном диабете способствует проапоптотически направленным изменениям в сердце, проявляющимся в виде значительного увеличения активности каспазы-3.
7. Выраженность биомаркерного проявления некротического процесса в миокарде при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации сопряжена с ростом концентрации стабильных конечных производных оксида азота (II) в сердце (r=0,765; p<0,01) и плазме крови (r=0,598; p<0,01).
8. В зависимости от этапа развития сахарного диабета, отмечаются особенности патохимических механизмов влияния хронической алкогольной интоксикации на формирование миокардиального повреждения и различная степень его выраженности.
9. Наиболее значительные проявления миокардиодеструкции характерны для сахарного диабета, возникшего в периоде после прекращения хронического воздействия этанолом, что указывает на высокую подверженность повреждению миокарда при алкогольном постинтоксикационном состоянии в условиях сахарного диабета.
10. При сочетании сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем развивается острофазовая реакция со стороны белков плазмы крови, способствующая потенцированию инсулинорезистентности и повреждения кардиомиоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Высокогорский, В.Е. Патохимические аспекты алкоголизации/ В.Е. Высокогорский, А.В. Индутный // Омский научный вестник. - 2001. - №16. - С. 25-27.
2. Колбина, Н.В. Клинико-лабораторные показатели, характеризующие инсулинорезистентность при ишемической болезни сердца, сахарном диабете 2 типа и абдоминальном ожирении / Н.В. Колбина, Д.А. Поташов, В.Е. Высокогорский, А.В. Индутный, А.В.Казакова // Омский научный вестник. - 2002. - №21. - С. 98-101.
3. Индутный, А.В. Интенсивность свободно-радикальных процессов в печени при алкоголизации в условиях действия различных стресс-факторов / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский // Омский научный вестник. - 2002. - №21. - С. 129-131.
4. Индутный, А.В. Активность алкоголь-метаболизирующих энзимов печени и содержание половых стероидов в плазме крови при интоксикации этанолом в условиях эмоционально-болевого стресса А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Г.А. Лопухов // Омский научный вестник. - 2002. - №21. - С. 131-134.
5. Индутный, А.В. Метаболические механизмы алкогольной интоксикации / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Э.Ю. Рыжковская, Н.Л. Самусева // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2002. - №3 (25). - С. 13-18.
6. Индутная, Л.Н. Уровень некоторых предикторов сердечно-сосудистой патологии в сыворотке крови больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / Л.Н. Индутная, Т.В. Притыкина, А.В. Аксенов, А.В. Индутный // Медицинский академический журнал. - 2003.  - №3 (Приложение 4). - С. 26-27.
7. Индутный, А.В. Характеристика проявлений окислительного стресса у больных сахарным диабетом типа 2, злоупотребляющих алкоголем / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Л.Н. Индутная // Биомедицинская химия. Ц2004. - №1(30). - С. 100-103.
8. Индутный, А.В. Особенности метаболических нарушений у больных сахарным диабетом при злоупотреблении алкоголем / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков, Т.В. Притыкина, А.В. Аксёнов // Сибирский медицинский журнал. Ц2005. - №1(20). - С. 41-45.
9. Индутный, А.В. Сигнальные функции свободных радикалов / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков // Омский научный вестник. - 2006. - № 3. - C. 37-39.
10. Индутный, А.В. Биохимические факторы и критерии повреждения миокарда у больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / А.В. Индутный, Д.Е. Быков // Омский научный вестник. - 2006. - № 3. - C. 39-42.
11. Индутный, А.В. Патохимические проявления кардинальных осложнений у больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / А.В. Индутный, Л.Ф. Панченко, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - № 3 . - С. 42-45.
12. Индутный, А.В. Манифестация и патохимические предпосылки повреждения миокарда при сочетании хронической интоксикации алкоголем и сахарного диабета / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков // Наркология. - 2009. - № 2 . - С. 57-61.
13. Indutny, A.V.  The level of free radical oxidation products in heart and blood plasma in diabetes mellitus combined with chronic alcohol intoxication / A.V.  Indutny, D.E. Bykov,  V.E. Vysokogorsky // Biochemistry (Moscow) Supplemental Series B: Biomedical Chemistry. - 2009. - Vol. 3, №4. - P. 372-376.

Статьи, опубликованные в других изданиях

14. Высокогорский, В.Е. Биохимические механизмы взаимодействия  алкоголя и стресса / В.Е. Высокогорский, А.В. Индутный, О. Г. Фонякова, Э.Ю. Рыжковская  // Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии : мат. конф. биохимиков Урала и Зап. Сибири. - Уфа, 1998. - С. 31-32.
15. Высокогорский, В.Е. Стресс и алкоголь: молекулярно-биологические основы / В.Е. Высокогорский, А.В. Индутный // Омский научный вестник. Ц1998. - № 2. - С. 76-78.
16. Высокогорский, В.Е. Алкоголизация - реальная угроза безопасности здоровью населения / В.Е. Высокогорский, Э.Ю. Рыжковская, А.В. Индутный // Стратегические направления регионального развития Российской Федерации: мат. Всероссийской научно-практ. конф. - Омск: ИА УКурьерФ, 1999. - С. 53-54.
17. Высокогорский, В.Е. Морфо-метаболические корреляции в печени при алкоголизации / В.Е. Высокогорский, О.З. Мкртчан, Е.И. Антонова, А.В. Индутный  //Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. - Челябинск, 1999. Ц  С. 33-35.
18. Высокогорский, В.Е. Метаболические аспекты алкоголизации / В.Е. Высокогорский, О.З. Мкртчан, А.В. Индутный, О.Г. Фонякова //Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. - Омск, 1999. - С. 10-13.
19. Высокогорский, В.Е. Биохимические механизмы интолерантности к алкоголю в условиях стресса / В.Е. Высокогорский, А.В. Индутный //Второй российский конгресс по патофизиологии : сб. научн. тр. - Москва, 2000. - С. 208.
20. Индутный, А.В. Метаболические факторы повышения токсичности алкоголя в условиях стресса / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Г.А. Лопухов // Актуальные вопросы общественного здоровья и здравоохранения в Омской области : сб. научн. тр. - Омск, 2000. - С. 116-117.
21. Высокогорский, В.Е. Нарушение активности ферментов метаболизма глутатиона в печени пренатально алкоголизированных крыс / В.Е. Высокогорский, Н.Л. Самусева, Н.М. Курч, А.В. Индутный //Труды Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии". - Москва, 2002. - С. 56-57.
22. Индутный, А.В. Метаболические факторы интолерантности к алкоголю в условиях термального стресса / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский // Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии : сб. научн. тр. - Томск, 2003. - С. 95-98. 
23. Притыкина, Т.В. Уровень компонентов межклеточного матрикса в сыворотке крови больных сахарным диабетом при злоупотреблении алкоголем / Т.В. Притыкина, В.Е. Высокогорский, А.В. Аксёнов, А.В. Индутный //Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. Ц  Оренбург, 2003. - С. 71-74.
24. Индутная, Л.Н. Активность свободно-радикальных процессов у больных сахарным диабетом типа 2, злоупотребляющих алкоголем / Л.Н. Индутная, Д.Е. Быков, А.В. Индутный, Е.С. Ефременко, А.К. Качур // Актуальные вопросы наркологии: сборник трудов V межрегиональной научно-практической конференции. - Омск, 2004. - С. 38-39.
25. Высокогорский, В.Е. Алкоголь-индуцированное изменение андрогенного статуса у мужчин / В.Е. Высокогорский, А.В. Аксёнов, А.В. Казакова, А.В Индутный //Межрегиональная научно-практическая конференция Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины : сб. научн. тр. - Самара, 2005. ЦС. 77-80.
26. Индутный, А.В. Активность свободнорадикальных процессов у больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков, Г.А. Лопухов // Межрегиональная научно-практическая конференция Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины : сб. научн. тр. - Самара, 2005. - С. 158-162.

На правах рукописи

ИНДУТНЫЙ

Антон Васильевич

ПАТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ФАКТОРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЦА ПРИ СОЧЕТАНИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА С ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ АЛКОГОЛЕМ

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Челябинск - 2010

Подписано в печать. Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе.

Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз.

Типография ОмГМА, 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии