Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Кочнева Галина Вадимовна
Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России
03.01.03 - молекулярная биология
03.02.02 - вирусология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово-2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научные консультанты | член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, Сергей Викторович Нетесов |
доктор биологических наук, профессор Валерий Борисович Локтев | |
Официальные оппоненты: | доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич |
доктор биологических наук Мордвинов Вячеслав Алексеевич | |
доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна | |
Ведущая организация | Учреждение российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН |
Защита состоится л 24 декабря 2010 г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии Вектор по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ Вектор
Автореферат разослан л_____________________2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г.П. Трошкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучению вопросов молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов основывалось на данных официальной статистики, полученных без использования принятых в развитых странах и рекомендованных ВОЗ методов, таких как: подтверждающие серологические тесты и ПЦР анализ - в диагностике; филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей - в генотипировании образцов; использование программ EpiInfo и SPSS - для статистически значимой оценки факторов риска инфицирования вирусами гепатитов. Проведённые к 2001 году работы по молекулярной эпидемиологии гепатитов В, С и G были единичными в России и охватывали в основном население европейской части страны, тогда как популяции регионов, расположенных за Уралом, были изучены совершенно недостаточно. Крупномасштабных исследований по генотипированию HBV и HGV до публикации результатов наших работ в 2003 году в Российской Федерации не проводилось. В связи с вышесказанным в 2001г нами был начат цикл комплексных молекулярно-эпидемиологических исследований парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории трех сибирских регионов России - Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.
Знание особенностей молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов на определенной территории имеет важное социальное значение и способствует разработке продуманной стратегии борьбы с этими инфекциями. Особое место в этой борьбе занимает вакцинопрофилактика. Среди исследованных нами трех парентеральных вирусных гепатитов B, C и G вакцина разработана только в случае HBV инфекции.
Для вакцинации против гепатита В в настоящее время повсеместно используется рекомбинантный поверхностный белок HBV (HBsAg), выделенный из культуры клеток дрожжей. Эффективность вакцинации определяется путем измерения концентрации анти-HBs IgG в сыворотке крови (протективный уровень >10 МЕ/л). Однако в течение 5-7 лет после полного курса прививок от 30 до 50 % лиц утрачивают антитела, что ставит вопрос о необходимости ревакцинации [Акимкин, 2004; Yuen et al., 2004]. Вместе с тем установлено, что вакцинация ведет к индукции эффективной и продолжительной иммунологической памяти, которая обеспечивает защиту от инфекции и после утраты антител [Селиашвили и др., 2006; Yuen et al., 2004], но этот критерий защищенности практически не исследован у вакцинированных против гепатита В. Методом его оценки может стать определение индекса HBsAg-специфической стимуляции лимфоцитов периферической крови в ELISPOT анализе.
Создание вакцины против гепатита С - одна из самых насущных задач мирового здравоохранения. Ее решение сдерживается рядом факторов, в числе которых высокий уровень изменчивости вируса. Наибольшая вариабельность наблюдается в поверхностных белках Е1 и Е2 HCV [Simmonds et al., 2005], однако антитела именно к этим белкам обладают вируснейтрализующей активностью [Yu et al., 2004]. В настоящее время идет накопление данных о том, какие районы поверхностных белков вируса гепатита С индуцируют синтез антител с широким спектром действия, способных нейтрализовать различные генотипы и субтипы вируса. Пептиды, имитирующие структуру таких районов, рассматриваются в качестве перспективных компонентов анти - HCV вакцин.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение комплексного молекулярно-эпидемиологического исследования парентеральных вирусных гепатитов на территории сибирских регионов России, а также оценка протективных свойств поверхностных белков вирусов гепатитов В и С.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1) Организация и проведение молекулярно-эпидемиологических исследований гепатитов В, С и G в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае:
- постановка методов молекулярно-эпидемиологического анализа в соответствии с рекомендованными ВОЗ и принятыми в развитых странах стандартами (
- анализ сывороток крови с обязательным использованием двух типов ИФА - скринингового и подтверждающего;
- генотипирование изолятов HBV, HCV и HGV с использованием наиболее репрезентативных районов вирусного генома;
- создание баз данных в формате EpiInfo, включающее перенос информации со всех бумажных и инструментальных носителей - результаты анкетирования, ИФА, ПЦР и генотипирования изолятов; данные выписки из истории болезни в случае пациентов стационаров - в структурированный электронный формат;
- выявление статистически значимых факторов риска инфицирования HBV, HCV и HGV.
2) Оценка напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета методом ELISPOT через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В:
- формирование группы участников исследования из сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ Вектор, вакцинированных против вирусного гепатита В как группы риска инфицирования;
- выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix;
- оценка применяемой схемы вакцинации и ревакцинации против гепатита В на основе полученных данных.
3) Сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных нативными (у инфицированных людей) и рекомбинантными (у иммунизированных мышей) гликопротеинами Е1 и Е2 вируса гепатита С:
- пептидное сканирование антигенного профиля нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV и выявление межгенотиповых различий;
- получение рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих систем - вирусов Синдбис и осповакцины, сравнение их иммунохимических свойств и антигенного профиля;
- картирование вируснейтрализующих линейных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV и оценка их перекрестной активности.
Научная новизна. В данной работе в соответствии с международными стандартами впервые проведено крупномасштабное молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.
Созданы три уникальные электронные базы данных в формате EpiInfo, содержащие эпиданамнез и результаты иммуно- и генодиагностики гепатитов В, С и G среди 5605 представителей разных групп населения Сибирского региона России. В исследование были вовлечены пациенты инфекционных больниц и наркологической клиники; медицинские работники ряда крупных городских и сельских больниц; группы, сформированные по принципу места проживания или места работы.
Впервые получены данные по встречаемости маркеров HBV, HCV и HGV среди представителей разных групп населения трех регионов Сибири. Оценена роль HBV и HCV в этиологии острых и хронических гепатитов на обследованной территории.
С использованием созданных электронных баз данных и статистических мощностей программы EpiInfo-2007 впервые проведена количественная оценка факторов риска инфицирования гепатитами В, С и G в период с 2001 по 2003 гг. Силу статистической связи между каждым фактором риска и статусом по инфекции выражали с помощью отношения шансов (OR, odds ratio).
Впервые проведен анализ генотипического разнообразия сибирских изолятов HBV и HGV, а в случае HCV показано, что встречаемость генотипов существенно различается в разных возрастных и популяционных группах.
Получены новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В. Показано, что клеточное звено вносит существенный вклад в развитие поствакцинального иммунного ответа.
С использованием панели из 76-ти перекрывающихся синтетических пептидов впервые проведен сравнительный полноразмерный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита C трех генотипов 1b, 2a/2c и 3а. Показано, что общие для всех генотипов HCV высокоиммуногенные пептидные эпитопы белков Е1 и Е2 расположены в позициях аминокислот 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440 и 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. В районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена новая антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с генотипа HCV.
С использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 и культуры клеток гепатомы человека Huh-7.5 выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1 белок) и 496-515 (Е2 белок), первый из которых является генотип-специфическим, а второй - консервативным.
В рамках работы по созданию белковых вакцин против гепатита C был проведен сравнительный анализ двух эукариотических систем экспрессии генов поверхностных гликопротеинов HCV с целью получения белков, наиболее адекватных природным аналогам. Впервые показано, что в одних и тех же клетках млекопитающих (BHK-F) рекомбинантные белки Е1 и Е2 HCV, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины (VV), существенно отличаются от аналогичных белков, полученных в системе вируса Синдбис (SIN). Хотя оба препарата белков индуцируют синтез антител к поверхностным гликопротеинам HCV, иммунный ответ к VV-экспрессированным белкам был выше и обладал большей универсальностью в отношении разных генотипов HCV, чем иммунный ответ к SIN-экспрессированным белкам.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного крупномасштабного молекулярно-эпидемиологического исследования получены статистически значимые количественные оценки дифференцированной встречаемости маркёров парентеральных вирусных гепатитов в различных популяционных группах, заболеваемости острыми и хроническими формами гепатитов, факторов риска и параметров интенсивности циркуляции генотипов HBV, HCV и HGV в период 2001-2003 гг на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края. Результаты исследований были доведены до сведения региональных медицинских служб и главных врачей крупных инфекционных больниц и использовались ими для разработки стратегии борьбы с распространением вирусных гепатитов в регионах Сибири.
В связи с тем, что общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и С+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков, оценки путей заражения и распространения разных типов психотропных препаратов оказались полезны при проведении адресных превентивных программ в сфере контроля за оборотом наркотиков.
Созданные электронные базы данных представляют отдельную как научную, так и практическую ценность. Они могут использоваться для комплексной динамической оценки ситуации по вирусным гепатитам в исследованных регионах России в любом временном периоде.
Показана важность проведения ПЦР-анализа для диагностики наиболее распространенных вирусных гепатитов в случаях наличия клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры.
Полученные новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В позволили предложить ряд рекомендаций по проведению ревакцинации в гетерогенных по возрасту, состоянию здоровья, привычкам и степени опасности группах риска инфицирования HBV.
Проведенный сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV показал, что иммунохимические свойства этих белков могут существенно зависеть от системы экспрессии. Причем эффективность продукции, на которую, обычно, исследователи обращают внимание в первую очередь, может быть одинаковой, а свойства белков разные. Данный факт необходимо учитывать при планировании экспериментальных работ с аналогичными мембран-связанными гликозилированными белками.
Картирование позиций высокоиммуногенных линейных эпитопов поверхностных белков Е1 и Е2 сибирских изолятов HCV может быть использовано для совершенствования региональной диагностики гепатита С.
Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.
Положения, выносимые на защиту:
1. Внутривенное употребление наркотиков является основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С (OR=27.3) и смешанной инфекцией HCV и HBV (OR=10.0) на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. Вторым по значимости фактором риска являются инвазивные медицинские процедуры, наибольшую опасность из которых представляет переливание крови (OR=3.8Ц11.3). Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV является статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах (OR=1.66-2.88).
2. При наличии клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры необходимо проведение ПЦР-анализа для выявления геномов наиболее распространенных вирусных гепатитов. Такой подход позволяет дополнительно диагностировать 32.7% случаев острого гепатита и 78.9% случаев хронического гепатита в группах безмаркерных пациентов.
3. С увеличением возраста респондентов, инфицированных HCV, растет доля генотипа 1 и снижается доля генотипа 3. Этот сдвиг обусловлен миграцией генотипа 3 HCV из районов производства наркотиков. Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет.
4. Генотипирование изолятов HCV (n=818) по двум противоположным районам генома 5Т-UTR и NS5В выявило четыре рекомбинантных изолята с генотипами 2k/1b (2) и 2a-2c/1b (2), что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома - 5Т-UTR.
5. Через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В в группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (<10МЕ\л), положительный индекс HBsAg стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев, что достоверно выше (p < 0.05), чем в группе с протективным уровнем анти-HBs IgG (48.1%). Это свидетельствует о важности оценки клеточной составляющей иммунитета при разработке стратегии вакцинации и ревакцинации.
6. Полноразмерное пептидное сканирование антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 выявило существенные различия, характерные для сибирских изолятов 1b, 2a/2c и 3a генотипов HCV. Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. Этот факт необходимо учитывать при разработке вакцин против гепатита С.
7. Иммуногенные свойства рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV существенно зависят от эукариотической системы экспрессии, в которой эти белки продуцируются. Рекомбинантные белки, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины, обладают большей иммуноадекватностью природным белкам, чем гликопротеины, полученные в системе экспрессии вируса Синдбис.
8. Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам в позициях а.о. 264-318 рекомбинантного белка Е1 и a.о. 496-515 рекомбинантного белка Е2 HCV, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов вакцин против гепатита С.
Апробация результатов диссертации и публикации. Работа представлялась в докладах и постерах на 8 международных и 9 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: на IV конференции по вирусным гепатитам В, С и Д (Москва, 2001); 2-й научной конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера (Новосибирск, 2002); XIIth International Congress of Virology (Paris, France, 2002); V Российской научно-практической конференции Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики (Москва, 2003); 6-м ежегодном съезде Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ой Конференции по Современной ситуации в области хронических вирусных гепатитов (Лион, Франция, 2003); Международном междисциплинарном конгрессе Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека (Судак, Крым, Украина, 2004); Международной конференции Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний (Сосновка, Новосибирская обл., 2004); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных болезней (Москва, 2004); на 1-й Международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2004); на Российской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний (Сосновка, Новосибирская обл., 2005); на Всероссийской конференции Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, 2005); III Российской научной конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера (Новосибирск, 2006); Международной научно-практической конференции Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков (Алматы, Казахстан, 2006); Международной научно-практической конференции Молекулярная диагностика инфекционных болезней (Минск, Белоруссия, 2007); Всероссийской научной конференции Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний (Санкт-Петербург, 2008); XIV International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008); 16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Nice, France, 2009); American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) annual meeting (Boston, USA, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 45 работ, включая 26 тезисов в сборниках конференций и 19 статей, из которых 15 опубликованы в журналах списка, рекомендованного ВАК, 2 статьи опубликованы в международных журналах Antiviral Therapy и Journal of Medical Virology.
Работа выполнена в 1998-2010 гг. в ФГУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора в рамках научных тем организации, по гранту Американского Фонда Гражданских Исследований и Развития (CRDF) №RB0-893 Совместный эпидемиологический проект по изучению вирусного гепатита С, по грантам Международного научно-технического центра (МНТЦ) № 1637p Изучение частоты встречаемости, распределения генотипов и молекулярной вариабельности изолятов вируса гепатита С в сибирских регионах России и № 3255р Исследование иммунологических и структурных свойств рекомбинантных белков Е1 и Е2 ВГС экспрессированных в клетках млекопитающих.
Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, под ее руководством и в соавторстве с к.х.н. Г.Ф. Сиволобовой (раздел 3.1-3.2 и 5.2), к.б.н. А.А. Гражданцевой (раздел 3.1-3.2; 4.2 и 5.3-5.4), к.б.н. А.В. Качко (раздел 3.3.4; 3.5.3; 5.5), к.ф.-м.н. А.Н. Шваловым (раздел 3.5 и 5.1), Т.А. Лупан (раздел 5.2.1), к.б.н. А.В. Шустовым (раздел 3.3.2), к.м.н. И.В. Плясуновой (раздел 3.3.2-3.3.3), к.б.н. Р.Б. Баяндиным (раздел 3.3.1), Е.В. Чуб (раздел 3.3.2), А.В. Ивановой (раздел 5.2.2), к.б.н. В.А. Терновым (раздел 3.2.5), А.Е. Нестеровым (раздел 4.3-4.4), к.б.н. О.В. Носаревой (раздел 4.3-4.4), Л.А. Акинфеевой (раздел 3.2). Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.
Автор искренне признателен врачам, оказавшим помощь в выполнении данной работы: к.м.н. В.М. Гранитову, Н.Г. Клиновенко, к.м.н. О.И. Матрос, к.м.н. И.А. Хорошиловой (г. Барнаул); Л.И. Губановой, А.П. Четверикову, Ю.А. Данилову, В.В. Леоненко (г. Иркутск); В.Г. Орловскому, М.В. Алешиной, В.И. Кузубову, Л.И. Локтевой, Р.П. Алейникову (р.п. Кольцово); Е.Г. Сахаровой, Н.Я. Черноусовой, И.В. Красильниковой, Д.И. Козлову, Т.Г. Бурмистровой, Т.Г. Томиленко, Я.С. Ульяновой, Е.А. Фихман, О.В. Мельниковой, Т.А. Масленниковой, А.Г. Лебедеву (г. Новосибирск).
За сотрудничество в работе автор признателен и благодарен своим американским коллегам Dr. Stephen M. Feinstone (зав. лабораторией вирусов гепатитов, FDA, USA) и Dr. Marian E. Major (ведущий специалист лаборатории вирусов гепатитов, FDA, USA).
Автор искренне благодарит своих консультантов д.б.н., профессора, члена-корреспондента РАН С.В. Нетесова и д.б.н., профессора В.Б. Локтева за научное руководство и помощь в организации работ, представленных в диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 347 страницах, включая 43 рисунка, 31 таблицу, 449 библиографических ссылок. Нумерация рисунков и таблиц приводится отдельно для каждой главы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов в сибирских регионах России
1.1. Организация молекулярно-эпидемиологических исследований в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае
Эпидемиологическая часть работы выполнена по схеме УпоперечногоФ (cross-sectional) исследования, от обследуемых лиц получали не только образец сыворотки крови, но также собирали эпиданамнез. Для этого, каждому участнику предлагали ответить на вопросы заранее разработанной анкеты в условиях индивидуального анонимного интервью.
Было использовано три варианта анкет, набор вопросов в которых варьировал для разных групп участников и разрабатывался с учетом международного опыта по проведению аналогичных исследований. Все работы были одобрены Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ Вектор. Интервьюирование и взятие крови осуществляли только после подписания респондентом Информированного согласия.
Одноразовые вакуумные системы забора крови Вакутайнер были впервые нами использованы для проведения крупномасштабного эпидемиологического исследования на территории Сибири. Мы использовали вакутайнеры с гелевой пробкой, которая формирует разделительный барьер между сывороткой и клетками крови во время центрифугирования. Этот барьер обеспечивал качество образцов сывороток при хранении и транспортировке из больниц в лабораторию ФГУН ГНЦ ВБ Вектор для проведения последующих анализов.
В целом нами было проведено два крупных молекулярно-эпидемиологических исследования, в результате которых были созданы три электронные базы данных. Каждая база данных включает более 400 полей, по которым в дальнейшем проводили статистическую обработку. Каждое поле представляет вопрос Анкеты, пункт Истории болезни, результат ИФА отдельно по всем тестированным маркерам вирусных гепатитов, ПЦР анализа или генотип вирусного изолята.
Первая электронная база данных (база данных №1 далее) содержит информацию о 2000 участниках исследования, представляющих четыре группы населения Новосибирской области:
1) пациенты Муниципального городского наркологического диспансера г. Новосибирска (МГНД), которые являются группой риска в отношении парентеральных вирусных гепатитов вследствие социального поведения и повышенных гемоконтактов;
2) пациенты Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (цСПИД), р.п. Кольцово, эта группа была использована для оценки частоты встречаемости гепатитов В и С среди стационарных пациентов инфекционных больниц широкого профиля;
3) посетители поликлиники Новосибирской районной больницы №1 (НРБ-1), р.п. Кольцово использовались как группа сравнения в связи с тем, что такая выборка представляет общую популяцию лучше, чем доноры крови, поскольку большая часть последних уже прошла предварительный отбор по наличию HBsAg и антител к HCV;
4) медицинские работники МГНД, НРБ-1, цСПИД, больницы скорой медицинской помощи №2 (БСМП-2) г. Новосибирска, эта группа также является группой риска в отношении парентеральных вирусных гепатитов вследствие своей профессиональной активности.
Исследование проводили в 2001-2002 гг. При формировании всех четырех групп не делали никакого отбора по возрасту, полу или диагнозу, а включали в обследование всех лиц, подписавших Информированное согласие, до достижения объёма выборки n=500.
Вторая электронная база данных (база данных №2 далее) была окончательно сформирована в 2004 году. Она включает информацию о 3441-м пациенте инфекционных больниц 3-х сибирских регионов России - Новосибирской обл. (n=1509), Иркутской обл. (n=888) и Алтайского края (n=1044). В обследовании участвовали пациенты, поступившие в больницы в период с 1 сентября 2001 по 31 декабря 2002 года с симптомами острого гепатита и не имеющие в анамнезе указаний на перенесенные гепатиты.
Третья электронная база данных (база данных №3 далее) была существенно меньше двух предыдущих и содержала информацию о 164-х пациентах Государственной областной клинической больницы г. Новосибирска (ГОКБ) с диагнозом хронический гепатит. Она была выполнена в рамках второго молекулярно-эпидемиологического исследования вместе с анализом острых гепатитов и полностью сформирована в 2004 году.
Общий объем выборки, доступной для эпидемиологического анализа на электронном носителе, составляет 5605 жителей сибирских регионов России. Все базы данных выполнены в рекомендованном ВОЗ международном формате EpiInfo [ на английском языке.
1.2. Общая характеристика обследованной выборки на основе всех баз данных
Рис. 1.1. Поло-возрастная структура обследованной выборки.
Обследованная нами популяция жителей Сибири содержит примерно равное количество мужчин (n=2860) и женщин (n=2745), и это соотношение соблюдается для всех регионов (Рис. 1.1). Более 50% участников исследования входят в возрастную группу до 35 лет. Эта группа представляет наибольший интерес с точки зрения оценки инфекции парентеральными вирусными гепатитами, поскольку обладает высокой репродуктивной и социальной активностью и особенно ценна с точки зрения прогнозирования здоровья регионов.
Наше исследование с исчерпывающей ясностью показывает, что внутривенное употребление наркотиков являлось основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С и смешанной инфекцией HCV и HBV на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. (Табл. 1.1). Среди потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) процент инфицированности HCV и микста HCV+HBV составляет 83% и 28.9% соответственно, в то время как во всей остальной популяции - 15.2% и 3.9%. Риск инфицирования HCV и микстом HCV+HBV у ПИН в 27.3 и 10 раз выше, чем у лиц, не употребляющих наркотики. Статистически достоверным фактором риска для ПИН также является инфекция HBV (OR=1.74).
Таблица 1.1.
Риск инфицирования гепатитами В и С среди потребителей инъекционных наркотиков.
Фактор риска | N1 | %(+)2 | OR3 | N | %(+) | OR | N | %(+) | OR |
Гепатит C (анти-HCV IgG) | Микст В+С (анти-HCV IgG + HBsAg) | Гепатит В (HBsAg) | |||||||
Всего | 5605 | 25.5 | 5605 | 7.6 | 5605 | 28.5 | |||
Внутривенное употребление наркотиков | |||||||||
Да | 835 | 83.0 | 27.30 | 835 | 28.9 | 10.0 | 835 | 38.7 | 1.74 |
Нет | 4737 | 15.2 | 0.037 | 4737 | 3.9 | 0.10 | 4737 | 26.6 | 0.58 |
1 Общее число обследованных респондентов по 3-м базам.
2 Процент проб, позитивных в ИФА на HBsAg и/или анти-HCV IgG.
3 Отношение шансов (OR). Количественные значения OR рассчитаны на 5% уровне значимости.
Рис. 1.2. Процент употребления различных наркотических препаратов.
Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет, и доля мужчин существенно выше, чем женщин. Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет так называемая ханка (80.57%) (Рис. 1.2), которая представляет собой кустарно приготовленный грубый экстракт опия-сырца. Вторым по значимости является героин (45.85%). Из интраназальных наркотиков респондентами были указаны крэк (20.74%) (курение) и, в существенно меньшей степени, кокаин (1.75%) (вдыхание). Амфетамины и метадон имеют незначительное распространение, 1.31% и 0.87% соответственно.
1.3. Встречаемость серологических маркеров гепатитов В и С в различных группах населения регионов Сибири
Исследование серологических маркёров инфекции HBV и HCV выполнено с использованием коммерческих тест-систем, активно используемых в сибирских регионах для диагностирования данных инфекций: ЗАО Вектор-Бест (г. Новосибирск) и НПО Диагностические системы (г. Нижний Новгород). В некоторых спорных случаях для диагностики дополнительно использовали наборы фирмы MONOLISA (Франция) и Ortho Clinical Diagnostics (США). В случае гепатита С анализировали IgG к белкам core, NS3, NS4 и NS5; в случае гепатита В - HBsAg, HBeAg, анти -HBc IgM и IgG, анти-HBе IgG, анти-HBs IgG; в случае гепатита А - общие анти-HAV IgM и IgG и в случае гепатита Е - общие анти-HEV IgM и IgG.
Для повышения достоверности результатов ИФА нами использовались как скрининговые, так и подтверждающие тест-системы в случае определения HBsAg и анти-HCV IgG.
Частота встречаемости серологических маркёров HCV и HBV в группе посетителей поликлиники оказалась достаточно велика: анти-HCV IgG -5.6%; HBsAg - 3.6%, анти-HBc IgG - 24.0%, что свидетельствует о неблагополучной ситуации по гепатитам В и С в р.п. Кольцово и отражает рост заболеваемости этими инфекциями в период 2001-2002 гг. в России в целом [ЗНиСО, №1, 2003].
У обследованного медицинского персонала больниц Новосибирской области HBsAg встречался с частотой 5.4%, а средняя частота выявления анти-HCV IgG составила 5.2% (Табл. 1.2), 27% медработников были вакцинированы против HBV.
Таблица 1.2.
Встречаемость серологических маркеров HBV, HCV и количество вакцинированных против HBV в группе медицинские работники.
Маркер вирусов гепатита | БСМП-2 (n=218) n (%) | НРБ-1 (n=145) n (%) | МГНД (n=93) n (%) | цСПИД (n=44) n (%) | Всего (n=500) n (%) |
HBsAg | 10 (4.6) | 7 (4.8) | 2 (2.2) | 8 (18.2) | 27 (5.4) |
анти-HBc IgG | 48 (22.0) | 33 (22.8) | 22 (23.7) | 9 (20.5) | 112 (22.4) |
анти-HBs IgG | 66 (30.3) | 62 (42.8) | 23 (24.7) | 11 (25.0) | 162 (32.4) |
Вакцинированы против HВV | 49 (22.4) | 65 (44.8) | 12 (12.9) | 9 (20.5) | 135 (27) |
анти-НCV IgG | 16 (7.4) | 6 (4.1) | 0 | 4 (9.5) | 26 (5.2) |
Среди медработников-женщин HBsAg выявлен, в основном, у медсестер и сотрудников диагностических лабораторий. Среди медработников-мужчин HBsAg был найден у хирургов, анестезиологов, медбратьев. Самая высокая частота встречаемости анти-HCV IgG (7.3%) выявлена нами у персонала больницы скорой помощи (БСМП-2), что связано со спецификой работы таких медучреждений: оказание экстренной помощи, работа в экстремальных ситуациях или в ночное время.
Из числа обследованных пациентов цСПИД 35.8% оказались позитивными в ИФА на анти-HCV IgG. Частота встречаемости HBsAg составила 35.0%, анти-HBc IgM и/или IgG выявлялись с частотой 50.7%, а анти-HBs IgM и/или IgG обнаружены у 20.8% пациентов.
Среди образцов крови, полученных от пациентов МГНД, анти-HCV IgG были найдены в 48.0% образцов. Частота выявления HBsAg среди всех пациентов МГНД составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов (244/500), а анти-HBs IgM и/или IgG обнаружены в 32.6% случаев.
Рис. 1.3. Этиология острых вирусных гепатитов в сибирских регионах.
Доля вирусных гепатитов А, В, С и Е в структуре заболеваемости острыми гепатитами в сибирских регионах России составляет 85.4% (Рис. 1.3), при этом наибольший вклад вносят HAV (40.7%) и HBV (37.8%).
Высока частота встречаемости смешанных инфекций (16.6% в суммарной популяции), среди которых 48.8% составляет микст-инфекция HBV+HCV. В последнем случае среди больных преобладали лица моложе 30 лет и употребляющие наркотики внутривенно. В Иркутске процент инфицирования ПИН вирусом гепатита С был наиболее высок (45%). Это коррелирует с вспышкой ВИЧ инфекции среди ПИН г. Иркутска в этот же период, когда в город была завезена большая партия инфицированного героина. Препараты наркотиков на наличие HCV специально не проверялись, однако общий путь передачи этих вирусов определяет высокую вероятность ко-инфекции при инъекционных процедурах.
Случаи гепатита Е среди пациентов с острым гепатитом в Сибири достаточно редки. Нами было выявлено только 3 случая HEV инфекции в Новосибирске, 2 из которых подтверждены ПЦР-анализом.
Рис. 1.4. Структура острых вирусных гепатитов в разных возрастных группах. На оси ординат указан объем выборки (n), на оси абсцисс - возрастные группы.
Отрицательны в ИФА на маркеры гепатитов А-Е оказались 14.6% больных (выявлены болезни желчевыводящих путей, ОРЗ и др.), 30% из них были выписаны с формулировкой гепатит невыясненной этиологии. Анализ показал, что доля пациентов данной группы растет с увеличением возраста. Так, среди пациентов моложе 25 лет только 8.8% больных с признаками острого гепатита не имели серологических маркеров А-Е гепатитов. В возрастной группе старше 60 лет доля таких гепатитов составляет 51.4% (Рис. 1.4). ПЦР анализ данных образцов выявил наличие геномов вирусов гепатитов А, В или С в 32.7% случаев.
В группе больных хроническим гепатитом хотя бы один из маркеров гепатита В имели 25.6% респондентов, маркеры гепатита С - 69.5%, смешанная инфекция гепатитов В и С регистрировалась в 6.7% случаев и у 11.6% пациентов не было найдено серологических маркёров ни HCV, ни HBV инфекций. Проведение ПЦР для этой группы лиц позволило определить этиологию гепатита в 78.9% случаев. Эти данные подтверждают важность проведения ПЦР для диагностики острого и хронического гепатита в случае наличия клинических симптомов и отсутствия серологических маркеров известных вирусов гепатитов.
1.4. Генотипическое разнообразие сибирских изолятов HBV, HCV и HGV
Молекулярно-биологическая часть работы предусматривала проведение ПЦР-амплификации фрагментов областей preS2-S (303 п.о.) для выявления ДНК HBV; 5Т-UTR (260 п.о.) и NS5B (360 п.о.) - для выявления РНК HCV; NS5B (402 п.о.) для детекции генома HGV и определение их первичных структур посредством прямого секвенирования амплификатов. Секвенированные последовательности депонированы в электронную базу GenBank. Генотипирование образцов выполнено с помощью филогенетического анализа полученных нами данных секвенирования и последовательностей гомологичных районов прототипных изолятов соответствующих вирусов из международных баз данных.
Для оценки генотипического разнообразия изолятов HBV на территории сибирских регионов России нами были использованы 246 секвенированных фрагментов вирусной ДНК. Результаты филогенетического анализа (Рис. 1.5) показали, что последовательности полученных нами изолятов относятся к трем генотипам: 4 последовательности относятся к генотипу А (1.6%), 2 последовательности к генотипу С (0.8%), 240 последовательностей к генотипу D (97.6%).
Рис. 1.5. Филогенетическое дерево, построенное с помощью программы Mega v.2.1 методом UPGMA на основе нуклеотидных последовательностей preS2/S области генома HBV (303 п.о.). Изоляты, полученные нами, помечены шифром Nov и Bar. Цифры в скобках указывает количество идентичных последовательностей. Прототипные последовательности из GenBank приведены с добавлением заглавной латинской буквы, обозначающей генотип, а также указанием страны происхождения. Большие латинские буквы в узлах дерева показывают принадлежность последовательностей к соответствующему генотипу. Внизу приведен масштаб шкалы генетических расстояний.
Изучение распределения генотипов HBV не выявило никаких особенностей среди различных социальных, экономических, половых, возрастных групп, а также групп лиц, склонных к рискованному поведению и людей, вынужденных часто обращаться за медицинской помощью. Это обусловлено высокой долей генотипа D во всех выше перечисленных группах.
Рис. 1.6. Филогенетические деревья нуклеотидных последовательностей фрагментов генома рекомбинантных изолятов генотипа 2k/1b (KNG318 и KNG327) и прототипных изолятов, построенные с помощью программы Mega v.2.1 методом Neighbor-Joining. Справа указаны районы генома HCV и в скобках размеры амплифицированных фрагментов.
Изучение генотипического разнообразия изолятов HCV (n=818) в Иркутской, Новосибирской областях и Алтайском крае среди всех обследованных групп показало, что преобладающим является субтип 1b (54.6%), следующий по частоте встречаемости - субтип 3a (36.9%), c меньшими частотами встречаются изоляты генотипа 2 (2a, 2c, 2k, 2a/2c). Выделено четыре межтиповых рекомбинантных изолята HCV: два рекомбинантных изолята 2k/1b (Рис. 1.6) и два рекомбинантных изолята 2a-2c/1b, что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома - 5Т-UTR.
Распределение генотипов в сибирских регионах России является средним между европейской популяцией [Шахгильдян, 2003], Средней Азией [Khan et al., 2008; Kurbanov et al., 2003] и Северным Китаем [Zhang et al., 1995].
Рис. 1.7. Доля (%) изолятов HCV генотипов 1, 2 и 3 в возрастных группах с 5-ти летними интервалами.
Генотипическое разнообразие изолятов HCV оказалось неодинаковым в разных возрастных группах. С увеличением возраста респондентов происходит постепенное снижение доли генотипа 3 (с 40% в группе 18-25 лет до 5% среди лиц старше 50 лет), увеличение доли генотипа 1 (с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет) и сохранение доли генотипа 2 на примерно одном уровне 6-13% во всех возрастных группах (Рис. 1.7). Такой сдвиг генетической вариабельности HCV обусловлен основным фактором риска инфицирования - внутривенным употреблением наркотиков.
Повышенная частота генотипа 3 среди ПИН отмечена во многих исследованиях, выполненных в различных, удалённых друг от друга, странах: в Германии, Бельгии, Франции [Esteban et al., 2008], в Узбекистане [Kurbanov et al., 2008], в Австралии [Freeman et al., 2000], в Таиланде [Hansurabhanon et al., 2002], в Иране [Hajia et al., 2010]. Данная связь описана и для Европейской России [Бобкова и др., 2002]. Эпидемиологическая интерпретация наших результатов и указанных выше работ других авторов позволяет предполагать возможность контаминирования препаратов наркотиков вирусом гепатита С ещё в местах их производства. Согласно отчёту Агентства ООН по борьбе с распространением наркотиков (UNDCP) основным источником опиатов в мире в 2001-2002 гг являлся Афганистан (доля в мировом производстве героина - 76%) (UNDCP annual report, 2003). До настоящего времени не было опубликовано работ по определению генотипического разнообразия изолятов HCV в Афганистане, но такие исследования были выполнены для стран-соседей по южноазиатскому региону и выявили доминирование генотипа 3 [Amarapurkar et al., 2001; Hajia et al., 2010; Shah et al., 1997].
Встречаемость РНК HGV оценивали в группе пациентов МГНД (n=500), поскольку в этой группе процент инфицирования HCV наиболее высок, а из данных литературы известно о большой вероятности ко-инфекции HGV и HCV [Chu et al., 2001; Хлопова и др., 1999]. Частота встречаемости РНК HGV среди всех пациентов МГНД составила 33.6%. Среди 240 образцов сывороток, положительных на серологические маркёры HCV, РНК HCV найдена в 195 (81.3%) пробах, а РНК HGV обнаружена в 103-х образцах (42.9%, OR = 2.26).
Были протестированы также 260 проб, отрицательных на серологические маркеры к HCV, среди них РНК HGV была обнаружена в 65 образцах (25%), из которых 2 образца были положительны на маркеры гепатита В.
Секвенирование ПЦР-фрагментов генома 78 изолятов HGV и последующий филогенетичсекий анализ показал, что большинство из них относится ко 2 генотипу, который преимущественно циркулирует в Европе (Рис. 1.8). Найдена только одна сыворотка 4 генотипа, который распространен в Южной Азии и Австралии.
Рис. 1.8. Филогенетическое дерево, построенное с помощью программы Mega v.4 методом UPGMA на основе нуклеотидных последовательностей NS5B области генома HGV (402 п.о.). Изоляты, полученные нами, отмечены шифром KGB или RIG с соответствующим номером. Для прототипных последовательностей указаны уникальные шифры базы данных GenBank. Внизу приведен масштаб шкалы генетических расстояний.
1.5. Анализ факторов риска парентеральных вирусных гепатитов В, С и G
Фактор риска - некое условие, формирующее высокие показатели заболеваемости в определённом коллективе на заданной территории. Факторы риска включают в себя риск становления (формирования) эпидемического варианта возбудителя, риск распространения эпидемического варианта возбудителя, риск заражения, риск заболевания [Беляков и др., 1989]. Фактор риска - особенность организма или внешнее воздействие, приводящие к увеличению риска возникновения заболевания или иному неблагоприятному исходу [Флетчер и др., 1998].
На основе вышеуказанных определений, которыми мы руководствовались в своей работе, к факторам риска инфекции парентеральных вирусных гепатитов относятся как процедуры непосредственного контактного воздействия на организм человека, так и особенности образа жизни участников исследования.
Величину фактора риска выражали отношением шансов инфицирования и не инфицирования для каждого тестируемого фактора (OR). Значения OR больше единицы свидетельствуют о том, что данный фактор является фактором риска, значения OR меньше единицы - фактором защиты. Ниже рассмотрены факторы риска, уровень достоверности которых превышает 95%.
1.5.1. Факторы риска инфицирования HBV
Расчет факторов риска проводили на основе выявления статистических связей между ответами на вопросы соответствующих каждой базе данных анкет и результатами ИФА в отношении двух серологических маркеров: HBsAg (скрининговый и подтверждающий тест) и/или анти-HBc IgG. Эти серологические маркеры наиболее полно охватывают все группы инфицированных HBV: острую и хроническую инфекцию, а также реконвалесцентов и лиц, перенесших инфекцию HBV в бессимптомной форме (только анти-HBc IgG).
Наиболее значимые факторы риска инфицирования гепатитом В представлены в Табл. 1.3. Как следует из данной таблицы риск одновременного инфицирования HBV и HCV существенно превосходит риск HBV моноинфекции во всех обследованных группах жителей Сибири. Следующим по значимости фактором риска является употребление наркотических препаратов.
Нозокомиальные факторы явились значимыми для инфекции HBV в 2001-2002 гг во всех исследованных группах и регионах. В частности, наличие в анамнезе общей анестезии (операций) кроме медработников явилось также фактором риска в группе посетителей поликлиники НРБ-1 (OR=1.6), а переливание крови - в группе пациентов Центра СПИД (OR=3.0). Посещение хирурга достоверно коррелировало с инфекцией HВV в группе пациентов МГНД (OR=1.75).
Таблица 1.3.
Наиболее значимые факторы риска инфицирования HВV
Фактор риска | Отношение шансов - OR | |||||||
База данных №1 | База данных №2 (n=3441) | |||||||
Мед. персонал n=500 | Поликли ника n=500 | цСПИД n=500 | МГНД n=500 | Новоси бирск n=1509 | Барнаул n=1044 | Иркутск n=888 | Все n=3441 | |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Микст инфекция с гепатитом С | ||||||||
Да | 14.523 | 22.718 | 53.423 | 52.763 | 4.6227 | 6.5538 | ||
Нет | 0.0689 | 0.044 | 0.019 | 0.019 | 0.216 | 0.152 | ||
Инъекционное употребление наркотических средств | ||||||||
Да | 2.701 | 10.959 | 29.27 | 2.21 | 1.7397 | 2.1635 | 2.15 | |
Нет | 0.370 | 0.091 | 0.034 | 0.45 | 0.5748 | 0.462 | 0.47 | |
Количество половых партнеров | ||||||||
3 | 2.474 | 2.4048 | 1.89 | 1.981 | 1.90 | |||
<3 | 0.404 | 0.416 | 0.53 | 0.505 | 0.53 | |||
Половые контакты с партнерами с гепатитом в анамнезе | ||||||||
Да | 2.160 | 2.031 | 2.4379 | 2.051 | ||||
Нет | 0.4629 | 0.492 | 0.4102 | 0.488 | ||||
Наличие ЗППП в анамнезе | ||||||||
Да | 1.68 | 2.6546 | 2.1510 | 1.90 | ||||
Нет | 0.60 | 0.377 | 0.465 | 0.53 | ||||
Переливание крови | ||||||||
Да | 1.812 | 3.049 | ||||||
Нет | 0.552 | 0.328 | ||||||
Хирургические вмешательства | ||||||||
Да | 1.712 | 1.661 | 1.757 | 1.614 | 1.305 | |||
Нет | 0.584 | 0.602 | 0.569 | 0.6198 | 0.766 | |||
Образование | ||||||||
Нет | 1.5116 | 1.62 | 1.262 | |||||
Наличие Работы | ||||||||
Да | 0.611 | 0.769 | 0.686 | |||||
Нет | 2.793 | 2.3225 | 7.0497 | 1.30 | 1.458 | |||
Употребление крепких напитков | ||||||||
Да | 0.636 | 0.080 | 1.635 | 1.380 | 1.445 | |||
Нет | 1.572 | 12.46 | 0.612 | 0.725 | 0.692 | |||
Содержание под стражей в течение 6 мес. до заболевания | ||||||||
Да | 2.045 | 3.326 | ||||||
Нет | 0.489 | 0.301 | ||||||
Наличие татуировок | ||||||||
Да | 2.0916 | 1.564 | ||||||
Нет | 0.478 | 0.639 | ||||||
Посещение маникюрного кабинета | ||||||||
Да | 1.527 | 2.096 | 1.654 | |||||
Нет | 0.655 | 0.477 | 0.605 | |||||
Бытовые контакты (общие щетки, бритвы и пр.) | ||||||||
Да | 1.293 | 1.693 | 1.639 | |||||
Нет | 0.774 | 0.591 | 0.610 | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Вакцинация | ||||||||
Да | 0.474 | 0.480 | ||||||
Нет | 2.11 | 2.083 | ||||||
Среди социальных факторов риска инфекции гепатита В наиболее высоким является статус безработного (OR=2.3-7.0), что достоверно связано с отсутствием образования (OR=1.5 и 1.6 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно), ранним началом (до 17-ти лет) употребления крепких напитков (OR=1.7 и 3.36 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно) и тюремным заключением (OR=2.0 и 3.32 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно).
Набор факторов риска в отношении гепатита В отличался в разных сибирских регионах. Так лечение в больнице в последние 6 месяцев до заболевания, наличие в анамнезе эндоскопии или зондирования оказались факторами риска гепатита В в Алтайском крае (OR=1.6 и 1.3), а наличие татуировок - в Иркутской области (OR=2.09). Иглоукалывание оказалось значимым фактором риска гепатита В в общей выборке по трем сибирским регионам (OR=1.7). Использование общих с другими людьми предметов гигиены и посещение маникюрного кабинета в последние 6 мес. до заболевания являлись факторами риска инфицирования HBV в Новосибирске и Иркутске (OR 1.3:1.5 и 1.5:2.0 соответственно). Статус безработного повышал риск инфицирования HBV в Барнауле (OR=1.3) и Иркутске (OR=1.458).
Попытка проанализировать факторы риска HBV инфекции по базе данных №3 (хронические гепатиты, 164 респондента) имела успех только в отношении одного фактора - наличие язвенной болезни достоверно коррелировало с сероконверсией по маркерам HBV (OR=4.3).
1.5.2. Факторы риска инфицирования HСV
Для оценки статуса по HCV инфекции были выбраны два теста - подтверждающий ИФА и/или ПЦР на наличие РНК HCV. Позитивный ответ на наличие антител хотя бы к одному из белков Core или NS в подтверждающем ИФА является точным и универсальным маркером гепатита С. В связи с высокой иммуногенностью HCV антитела к Core и/или NS белкам появляются очень рано в процессе инфекции, сохраняются пожизненно у хронических больных и являются маркером паст-инфекции [Pavio et al., 2003]. Маркер РНК HCV обеспечил включение в анализируемую выборку серонегативных образцов. Таким образом использование данных двух маркеров позволило нам достаточно полно проанализировать случаи инфекции вирусом гепатита С, начиная с реконвалесцентов и бессимптомных носителей и кончая хронической и острой манифестной инфекцией.
Как следует из Табл. 1.4 основным фактором риска инфекции HCV является внутривенное употребление наркотиков, причем OR в этом случае в десятки и сотни раз превышает аналогичные показатели для других факторов риска. Основным источником заражения в группах ПИН во всех регионах является совместное использование контейнеров, игл или шприцев при употреблении наркотиков. В связи с такими высокими значениями OR среди респондентов-ПИН для анализа менее значимых по инфекции HCV факторов риска было целесообразно исключить данную категорию участников из тестируемых выборок. Такой подход позволил нивелировать искажение оценки статистически значимых факторов риска вследствие неравномерного попадания ПИН в те или иные тестируемые выборки (факторы).
Переливание крови являлось вторым по значимости фактором риска HCV среди разных групп населения Новосибирской области в 2001-2002 гг. (OR=3.8 - 11.3).
Таблица 1.4.
Наиболее значимые факторы риска инфицирования HCV
Фактор риска | Отношение шансов - OR | |||||||
База данных №1 (n=2000) | База данных №2 (n=3441) | |||||||
Мед. персонал | Поликли ника | цСПИД | МГНД | Новоси бирск | Барнаул | Иркутск | Все | |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Всего | n=500 | n=500 | n=500 | n=500 | n=1509 | n=1044 | n=888 | n=3441 |
Внутривенное употребление наркотических средств | ||||||||
Да | 47.5 | 31.7 | 175.3 | 16.68 | 12.02 | 23.50 | 15.36 | |
Нет | 0.021 | 0.032 | 0.006 | 0.06 | 0.083 | 0.043 | 0.07 | |
Совместное использование контейнеров, игл или шприцев | ||||||||
Да | 4.13 | 12.5 | 2.80 | 2.44 | 2.35 | |||
Нет | 0.242 | 0.080 | 0.36 | 0.41 | 0.43 | |||
Без ПИН | n=498 | n=493 | n=315 | n=255 | n=1300 | n=895 | n=810 | n=3005 |
Переливание крови | ||||||||
Да | 10.44 | 3.831 | 11.364 | |||||
Нет | 0.096 | 0.261 | 0.088 | |||||
Хирургические вмешательства | ||||||||
Да | 1.70 | 1.31 | ||||||
Нет | 0.59 | 0.76 | ||||||
Эндоскопия или зондирование в анамнезе | ||||||||
Да | 1.41 | |||||||
Нет | 0.71 | |||||||
Инъекционные медицинские процедуры (>10) в течение 6 мес. до заболевания | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Да | 2.17 | |||||||
Нет | 0.46 | |||||||
Количество половых партнеров | ||||||||
3 | 2.88 | 1.68 | 1.95 | |||||
<3 | 0.35 | 0.6 | 0.51 | |||||
Половые контакты с партнерами с гепатитом в анамнезе | ||||||||
Не знаю | 2.25 | 1.66 | 2.05 | 1.68 | ||||
Нет | 0.54 | 0.47 | 0.65 | |||||
Употребление крепких напитков | ||||||||
Да | 3.175 | 1.72 | 1.32 | |||||
Нет | 0.315 | 0.58 | 0.76 | |||||
Употребление пива более 900г в неделю | ||||||||
Да | 1.98 | 1.69 | 1.67 | 1.68 | ||||
Нет | 0.51 | 0.59 | 0.60 | 0.59 | ||||
Наличие татуировок | ||||||||
Да | 3.67 | 2.94 | 2.16 | |||||
Нет | 0.27 | 0.34 | 0.46 | |||||
Содержание под стражей в течение 6 мес. до заболевания | ||||||||
Да | 4.17 | 7.86 | 3.25 | |||||
Нет | 0.24 | 0.127 | 0.31 | |||||
Половой путь передачи HCV оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Особое значение при этом имеет количество половых партнеров больше или равно 3 в последние 6 месяцев до заболевания (OR=1.68-2.88) и половой контакт с партнерами, которые перенесли гепатит 6 и менее месяцев назад (OR=1.66-2.25). Количество половых партнеров меньше 3-х обеспечивало достоверную защиту от HCV инфекции.
Наличие хирургических операций являлось фактором риска в Иркутской области (OR=1.7), а большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализации увеличивало риск инфекции HCV в 2.5 раза в объединенной выборке. Из других медицинских процедур эндоскопия или зондирование проявились как фактор риска в объединенной выборке (OR=1.4).
Высоким фактором риска в отношении HCV инфекции оказалось пребывание в тюрьме или камере предварительного заключения в Новосибирской и Иркутской областях (OR=4.17 и 7.86). Эти данные коррелируют с наличием татуировок у респондентов в этих же регионах (OR=3.67 в Новосибирске и OR=2.94 в Иркутске).
Употребление алкоголя, особенно пива больше 900г в неделю, достоверно коррелировало с высоким статусом по HCV инфекции во всех сибирских регионах (OR=1.67-1.98).
Анализ факторов риска в базе данных №3 также показал, что внутривенное употребление наркотических препаратов является основной причиной хронической HCV инфекции в Новосибирской области (OR=6.98). В этой группе среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно, 94.7% имели маркёры HCV. Среди пациентов ГОКБ, никогда не употреблявших наркотики, риск инфицирования HCV был достоверно выше у тех лиц, которые указывали о заболеваемости острым гепатитом кого-нибудь из членов семьи (OR=5.74).
1.5.3. Факторы риска инфицирования HGV
Наибольшие шансы инфицирования HGV имели пациенты с гепатитом С (OR=2.26) и употребляющие наркотики внутривенно (OR=2.15). Выявлено, что употребление героина (OR=1.4) является менее опасным фактором, чем употребление ханки (OR=2.4). Фактором риска было также наличие большого количества (более 7) половых партнёров в течении жизни (OR=1.5) и статус безработного (OR=2.0).
В то же время не было показано статистически значимой зависимости между наличием гемотрансфузий в анамнезе, их количеством и временем их выполнения (до 1994 года и после) и инфицированием вирусом гепатита G.
***
Наличие и, главное, широкое использование вакцины против гепатита В в настоящее время является огромным успехом мирового здравоохранения. Число хронически инфицированных HBV людей в мире оценивается в 350 миллионов человек, и все они являются возможным источником заражения для остальной популяции, при этом вирус гепатита В в 100 раз более контагиозен, чем ВИЧ. Наше исследование также показало, что самым значимым фактором защиты против HBV инфекции является вакцинация (OR=0.48). Следующий раздел диссертации посвящен более подробному анализу факторов иммунной защиты в отдаленные сроки после вакцинации такой группы риска как сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ Вектор, которые вели активную работу с материалом, инфицированным HBV.
2. Исследование напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В
Для определения состояния поствакцинального иммунитета мы учитывали уровень анти-HBs IgG и индекс специфической стимуляции лимфоцитов методом ELISPOT. Концентрацию анти-HBs IgG определяли с помощью тест-системы ВектоHBsAg-антитела (ЗАО Вектор-Бест, г. Новосибирск). ELISPOT-анализ проводили с использованием набора INF-γ BDЩ ELISPOT Set (BD Biosciences, США). В качестве клеток-эффекторов использовали лимфоциты периферической крови, в качестве специфического антигена - природный HBsAg (Внутрилабораторный контроль HBsAg ЗАО Вектор-Бест, г. Новосибирск), в качестве неспецифического митогена - фитогемоагглютинин (ФГА, Sigma, США). Регистрацию и обработку результатов реакции ELISPOT проводили на AxioCam, Stemi 2000C с помощью программы AxioVision Rel. 4.5 Carl Zeiss (Германия). Определяли отношение спотов (ИФН--продуцирующих клеток) в экспериментальной (стимулированной специфическим антигеном) лунке к количеству спотов в контрольной (не стимулированной) лунке. Кратность превышения была обозначена как индекс специфической стимуляции лимфоцитов. Ответ считали положительным, если наблюдался ответ на митоген (контроль системы), индекс специфической стимуляции был больше 2, и регистрировалось более чем 20 спот-формирующих единиц на 106 лимфоцитов.
Результаты, полученные при анализе образцов крови вакцинированных сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ Вектор, получивших в 2002 году полный курс вакцины Engerix, приведены в Табл. 2.1. Как видно из данной таблицы, 22.4% вакцинированных имеют антитела к HBcAg, что свидетельствует об инфекции вирусом гепатита В. Существовали ли эти антитела до вакцинации или были индуцированы после, сказать не представляется возможным, так как обследование на маркеры HBV до вакцинации не проводилось. Если предположить, что инфицирование произошло до вакцинации, то при наличии достаточного уровня анти-HBs IgG (>10 МЕ/л) и отсутствии HBsAg, 22.4% данной выборки могли бы не подвергаться вакцинации как имеющие естественный иммунитет вследствие бессимптомной инфекции HBV (в Анкете эти сотрудники указали, что ранее вирусным гепатитом не болели). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения обследования на наличие маркеров HBV инфекции перед вакцинацией.
В группе вакцинированных, не содержащих анти-HBc IgG (45 человек, Табл.2.1), протективный уровень антител к HBsAg (>10МЕ/л) был выявлен у 27 человек, т.е. эффективность иммунизации вакциной Engerix в данной группе через 5 лет составила 60.0%, при этом только 16 человек из 27 имели уровень анти-HBs IgG >100 МЕ/л.
Таблица 2.1.
Выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета у сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ Вектор через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix в 2002 г.
Наличие анти-HBc IgG (+/-) | n | Доля вакцинированных лиц с разным уровнем анти-HBs IgG | Доля вакцинированных лиц, имеющих положительный индекс стимуляции, n (%) | |
Конц. анти- HBsAg | n (%) | |||
+ | 13 | >10МЕ\л | 10 (77.0%) | 6 (60.0%) |
<10МЕ\л | 3 (23.0%) | 3 (100%) | ||
_ | 45 | >10МЕ\л из них >100МЕ\л | 27 (60.0%) 16 (35.6%) | 13 (48.1%) 7 (43.8%) |
<10МЕ\л | 18 (40.0%) | 13 (72.2%) | ||
При анализе индекса специфической стимуляции лимфоцитов в этой группе было установлено, что только у 13 человек (48.1%) (Рис. 2.1, сектор Б) из 27 вакцинированных (Рис. 2.1, сектор Б и Г), имеющих протективный уровень анти-HBs IgG (>10 МЕ/л), присутствует клеточная составляющая иммунитета (индекс стимуляции 2 и более). В группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (Рис. 2.1, сектор А и В), положительный индекс стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев (Рис. 2.1, сектор А), что достоверно выше (p < 0.05), чем в группе с протективным уровнем антител к HBsAg (Рис. 2.1, сектор Б). Это согласуется с данными о том, что иммунологическая память формируется независимо от уровня антител, так как обусловлена в основном Т-клеточным звеном иммунитета [Селиашвили и др., 2006; Banatvala et al., 2000].
Доля лиц с положительным индексом стимуляции лимфоцитов растет по мере снижения уровня анти-HBs IgG. Так в группе с уровнем антител более 100 МЕ/л положительный индекс стимуляции лимфоцитов имеют меньше половины вакцинированных, 7 человек из 16 (43.8%), а в группе с уровнем антител 10-100 МЕ/л - больше половины вакцинированных, 6 человек из 11 (54.5%). Возможным объяснением полученных данных является сбалансированность иммунного ответа на уровне индивидуального организма: в случае доминирования цитокинсекреторной активности Т-хелперов 1-го типа происходит снижение активности Т-хелперов 2-го типа, которые регулируют стимуляцию гуморального иммунитета [Bertoletti et al., 1997].
Рис. 2.1. Соотношение показателей клеточного (индекс специфической стимуляции лимфоцитов) и гуморального (уровень анти-HBs IgG) иммунного ответа в группе вакцинированных. Сектор А: анти-HBs IgG < 10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов 2; сектор Б: анти-HBs IgG >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов 2; сектор В: анти-HBs IgG <10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов 2; сектор Г: анти-HBs IgG >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов 2.
Таким образом, оказалось, что через 5 лет из группы вакцинированных, не имеющих анти-HBc IgG, 27 человек (60.0%) имеют протективный уровень антител к HBsAg, 26 человек (58.0%) имеют положительный индекс стимуляции лимфоцитов (2 и более), и оба положительных ответа имеют 13 человек (28.8%). В целом из 45-ти вакцинированных 5 лет назад 40 человек имеют хотя бы один положительный показатель протективности, что составляет 89.0% и существенно превышает уровень оценки, сделанный только на основе количества анти-HBs IgG (60.0%).
В группе вакцинированных с анти-HBc IgG (Табл. 2.1) выявлена тенденция к увеличению количества образцов с протективным уровнем антител к HBsAg (77.0%), что может быть обусловлено аддитивным эффектом вакцинации и перенесенной инфекции. У трех человек, имеющих анти-HBc IgG, антитела к HBsAg оказались ниже протективного уровня - эти лица требуют усиленного наблюдения с целью исключения развития хронического гепатита В. Увеличение частоты выявления положительного индекса стимуляции лимфоцитов в этой группе (6 человек из 10 и 3 человека из 3-х) оказалось недостоверно на уровне значимости p < 0.05.
2.1. Оценка необходимости ревакцинации при различном соотношении показателей иммунного ответа
Результаты исследования напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В показали, что кроме общепринятого критерия оценки эффективности вакцинации против гепатита В - уровень анти-HBs IgG, при решении вопроса о ревакцинации необходимо учитывать и Т-клеточную составляющую иммунитета - определение HBsAg-стимулированной продукции ИФН- лимфоцитами методом ELISPOT. Совокупность этих данных позволит более адекватно оценить эффективность вакцинации и принять решение о ревакцинации. Из представленных данных следует, что положительный индекс специфической стимуляции лимфоцитов встречается чаще при низком уровне антител, что позволяет определить состояние иммунитета у вакцинированных со слабым гуморальным ответом и в отдаленный период, когда содержание анти-HBs IgG становится ниже 10 МЕ/л.
Анализ полученных нами данных и данных литературы позволил сформулировать следующий алгоритм вакцинации и ревакцинации против гепатита В:
1. Проведение перед вакцинацией обследования на наличие маркеров гепатита В (HBsAg, анти-HBc IgG, анти-HBs IgG) .
2. Проведение обследования после полного курса вакцинации против гепатита В с целью определения ее эффективности:
- при уровне анти-HBs IgG ниже 10 МЕ/л провести оценку клеточного иммунитета (ELISPOT), при индексе стимуляции <2 рекомендовать проведение дополнительной вакцинации;
- при уровне анти-HBs IgG >10 МЕ/л - рекомендовать скрининг уровня анти-HBs IgG через 5 лет и при снижении данного показателя ниже протективного (10 МЕ/л) определять состояние клеточного иммунитета c целью оценки необходимости ревакцинации.
***
Одним из предикторов успеха при создании вакцины против гепатита В явилось наличие высокоиммуногенной консервативной детерминанты ла в поверхностном белке вируса - HBsAg. Выявлению и конструированию таких детерминант в поверхностных гликопротеинах Е1 и Е2 вируса гепатита С посвящена следующая часть работы.
3. Изучение антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 HCV
3.1. Пептидное сканирование антигенных детерминант нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV
В работе использовали коллекцию из 45 сывороток крови хронически инфицированных HCV пациентов ГУЗ Государственный Новосибирский Областной Клинический Диагностический Центр, г. Новосибирск. В коллекцию входили образцы, содержащие HCV трех генотипов - 1b, 2a/2c и 3a, которые наиболее широко распространены на территории России и, в частности, в г. Новосибирске. Каждая генотипическая группа сывороток включала 15 образцов.
Cканирование антигенно-значимых детерминант поверхностных белков HCV проводили методом ИФА с использованием набора синтетических пептидов, перекрывающих полную последовательность гетеродимера Е1Е2 (192-809 а.о.) (PepScan анализ). Набор состоит из 76 пептидов, рассчитанных на основе структуры штамма H77 HCV, генотип 1а и синтезированных в фирме Mimotopes (Австралия). Пептиды имеют длину 20 а.о. с перекрыванием в 12 а.о., благодаря чему при сканировании каждая последовательность представлена 2-3 раза.
Для увеличения репрезентативности антигенных профилей и нивелирования колебаний неспецифических фоновых значений оптической плотности (ОП) индивидуальных сывороток нами была проведена теоретическая оценка антигенной активности каждой аминокислоты тестируемых Е1 и Е2 белков HCV (ОПак) с учетом количества пептидов, в которых она участвует в PepScan анализе, и среднего значения ОП для каждого пептида внутри группы сывороток одного генотипа. Такой подход позволил также преодолеть ступенчатый характер пептидного анализа (в нашем случае размер ступени составляет 8 а.о.) и картировать антигенные детерминанты в соответствии с позициями определенных аминокислот на полипротеине Е1Е2 HCV. Суммированные по разным генотипам HCV результаты расчета представлены на Рис. 3.1.
Как следует из Рис. 3.1 общие высокоиммуногенные эпитопы выявлены в следующих позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440, 680-690 (Е2 белок). В позициях 340-350, 490-500 и 560-580 а.о. также регистрируются общие, но существенно слабее реагирующие эпитопы. Широкое варьирование границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости белков Е1 и Е2, однако способность антител, индуцированных разными генотипами HCV, реагировать с одинаковыми пептидами свидетельствует также и о возможности создания на основе этих пептидов универсальных иммуногенных конструкций для разработки вакцин против HCV.
Рис. 3.1. Антигенные профили поверхностных белков HCV трех разных генотипов, построенные на основе расчета активности отдельных аминокислот Е1Е2 полипротеина HCV в пептидном анализе. Вдоль оси абсцисс указаны позиции а.о. в полипротеине Е1Е2, вдоль оси ординат указаны рассчитанные для каждой аминокислоты значения ОПак. Генотипы HCV указаны в рамках в правом верхнем углу рисунка, ВГС отр. обозначает значения ОП негативных на присутствие маркеров HCV сывороток человека (n=6, отрицательный контроль), среднее на нижнем рисунке обозначает среднее значение ОП для всех генотипов HCV. Все расчеты проводили в среде программного обеспечения LabView.
Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях а.о. 280-290, 410-430 и 520-540 (Рис. 3.1). Так, в частности, в районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена ранее не описанная в литературе антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с субтипа сибирских изолятов HCV.
Выявленные нами межгенотиповые различия антигенного профиля поверхностных белков HCV свидетельствуют о необходимости генотипирования изолятов при изучении свойств поверхностных белков Е1 и Е2 и некорректности в ряде случаев распространения данных, полученных для отдельного генотипа, на вирус гепатита С в целом (как следует из Рис. 3.1, среднее).
3.2. Получение и анализ рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV
Рис. 3.2. Схематическое изображение мембран-связанных поверхностных белков HCV и структура конструкта, использованного в нашей работе.
A - процессинг структурных белков HCV от N до C конца: Сore, E1, E2 и P7; стрелками указаны сайты разрезания пептидазами клетки. Цветные боксы - полноразмерные белки Е1 и Е2 с указанием краевых позиций а.о. в полипротеине HCV; полые боксы - необходимые для их функциональной активности фрагменты Сore (для E1) и E1 (для E2) [Bian et al., 2009].
В - структура встраиваемого фрагмента генома HCV.
Белки Е1 и Е2 являются поверхностными гликопротеинами HCV и относятся к трансмембранным белкам I типа с высокогликозилированным N-терминальным эктодоменом (5 сайтов гликозилирования для Е1 и 11 - для Е2) и С-терминальным гидрофобным якорем. Процессинг Е1 и Е2 белков и формирование нековалентного гетеродимера происходит на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Рис. 3.2А).
Трансмембранные домены гликопротеинов Е1 и Е2 HCV играют определяющую роль в формировании и субклеточной локализации Е1Е2 гетеродимера, который является функционально активной формой поверхностных белков HCV и обеспечивает проникновение вируса в клетку [Lavie et al., 2007]. Несмотря на то, что в последние годы была разработана система культивирования HCV с использованием выделенного в Японии JFH-1 клона, способного размножаться в клетках гепатомы человека Huh7.5 [Kato et al., 2006], выделение и изучение свойств поверхностных белков HCV в этой системе проводить затруднительно вследствие низкого уровня репродукции вируса. Лучшими кандидатами для экспрессии генов поверхностных белков HCV являются вирусные векторы, поскольку гликозилирование белков и образование Е1Е2 комплексов в этом случае происходит наиболее близким к природному образом.
Для продукции препаративных количеств Е1 и Е2 белков нами были использованы два вируса: Синдбис вирус (альфавирус с РНК геномом позитивной полярности) и вирус осповакцины (ортопоксвирус с ДНК геномом). Эти два вируса совершенно различны по скорости репликации, внутриклеточной локализации и механизмам синтеза и процессинга белков, что позволяет выбрать наиболее адекватную природной систему экспрессии. В обоих случаях проводили ко-экспрессию генов белков Е1 и Е2 HCV с целью обеспечения возможности образования Е1Е2 гетеродимера. При конструировании в расчет было принято также то, что для правильного процессинга Е1 белка необходим С-концевой фрагмент Core, а для процессинга Е2 белка - примыкающий к нему С-концевой фрагмент Е1 (Рис. 3.2А) [Bian et al., 2009; Dubuisson et al., 2003]. Таким образом встраиваемая конструкция состояла из фрагмента гена Core, кодирующего 21 а.о. С-концевой части этого белка, полноразмерной копии гена белка Е1 (192Ц383 а.о. по последовательности полипротеина штамма Н77, генотип 1а) и усеченного с С конца гена белка Е2 (384Ц715 а.о.), у которого был удален гидрофобный трансмембранный домен и введены шесть остатков гистидина (E1E2T-HIS) (Рис. 3.2В).
Рекомбинантный вирус осповакцины со встройкой Е1Е2 фрагмента генома HCV в структурную часть гена тимидинкиназы (rVV-E1E2) был получен нами из американской лаборатории вирусных гепатитов (CBER, FDA).
Для конструирования рекомбинантного вируса Синдбис была использована двух-плазмидная система: плазмида SinRepЕ1Е2Т-His, несущая гены всех неструктурных белков вируса Синдбис со встройкой последовательности Е1Е2T-HIS и вспомогательная плазмида DH-BB helper, несущая встройку генов структурных белков вируса Синдбис [Bredenbeek et al., 1993]. Синтез функционально активных РНК, представляющих фрагменты генома вируса Синдбис (структурная и неструктурная часть) осуществляли in vitro с помощью SP6 РНК полимеразы, под контролем промотора которой клонированы гены вируса Синдбис в плазмидных ДНК. Рекомбинантный вирус Синдбис (rSin-E1E2) получали совместной электропорацией клеток препаратами РНК SinRepЕ1Е2Т-His и DH-BB helper. Образующиеся вирионы содержат рекомбинантную субгеномную РНК вируса Синдбис SinRepЕ1Е2Т-His и не способны формировать полноценное потомство вследствие отсутствия генов структурных белков. Такой подход обеспечивает безопасность работы с системой экспрессии вируса Синдбис поскольку в нативном состоянии данный вирус патогенен для человека. Однократная абортивная инфекция клеток BHK-F вирусом rSin-E1E2 способна эффективно направлять экспрессию генов рекомбинантных белков HCV, встроенных в субгеномную РНК вируса Синдбис.
Продукцию рекомбинантных белков осуществляли в клетках почки китайского хомячка BHK-F вследствие инфекции их рекомбинантными вирусами осповакцины или Синдбис. Не смотря на высокую репродуктивную способность rVV-E1E2 и rSin-E1E2, уровень продукции Е1 и Е2 белков оказался невысок и составлял приблизительно 1.25 х10-12 г/клетка в случае осповакцины и 2.1 х10-12 г/клетка в случае Синдбис вируса, что не превышает 1% от общего белка клетки. В связи с этим нами был разработан многостадийный метод выделения комплекса Е1Е2 гликопротеинов HCV.
Мы использовали ранее описанный принцип очистки высоко гликозилированных белков [Maertens et al., 2006] и особенность Е1 и Е2 белков HCV, связанную с наличием преимущественно маннозных остатков в их гликозидных цепочках [Flint et al., 2000]. Такой тип модификации позволяет использовать на первом этапе очистки Е1 и Е2 белков HCV иммобилизованный на агарозе GNA-лектин, обладающий высокой аффинностью к маннозным сахарам. HisЦtag технологию использовали на втором этапе очистки Е1Е2 гетеродимера. Все фракции, выделенные на хроматографе, анализировали в Western blot на присутствие белков Е1 и Е2 HCV с использованием моноклональных антител анти-E1 (МКА Е1 A4) и анти-E2 (МКА Е2 A11) [Dowd et al., 2009] (любезно предоставлены Dr. Marian Major, США).
Анализ очищенных препаратов белков, экспрессированных в системе вируса осповакцины (VV-E1E2) представлен на Рис. 3.3, а в системе вируса Синдбис (SIN-E1E2) - на Рис. 3.4.
Рис. 3.3. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса осповакцины. Слева - маркер молекулярных весов (BioRad, Kaleidoscope Prestained Standards, Cat 161-0324). А - связывание с МКА E1 A4; В - связывание с МКА Е2 A11; С - 10% SDS-ПААГ, окраска по Laemmly. 1 и 2 - два препарата очищенных белков VV-Е1Е2: 1 - нанесен1 г; 2 - нанесено 0.2 г белков.
Рис. 3.4. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса Синдбис. Слева - маркер молекулярных весов. А - связывание с МКА E1 A4; В - связывание с МКА Е2 A11; С - 10% SDS-ПААГ, окраска по Laemmly. 1 - очищенный препарат белков VV-E1E2 (положительный контроль); 2 и 3 - два препарата очищенных белков SIN-Е1Е2.
Как следует из Рис. 3.3 и 3.4, при анализе белков в SDS-ПААГ видимая полоса формируется только белком Е2, однако Western blot анализ выявляет и присутствие белка Е1 (Рис. 3.3А и 3.4А), который выделяется в составе нековалентного комплекса с Е2. Во всех препаратах белков в иммуноблоте с МКА А4 Е1 регистрируется также полипротеин Е1Е2 с Мв около 100 кДа. Таким образом полученные нами очищенные препараты Е1Е2 белков представлены белком Е2, нерасщепленным полипротеином Е1Е2 и гетеродимером Е1Е2, что наиболее ценно с точки зрения природного фолдинга этих белков и последующего изучения их иммуногенных и протективных свойств.
При сравнении Рис. 3.3 и 3.4 хорошо видны различия в уровне гликозилирования белков в двух системах экспрессии. В препаратах белков VV-E1E2 наблюдаются отдельные четкие полосы, соответствующие полностью гликозилированным формам белков E1 (35 кДа), E2 (72 кДа) и комплексу E1E2 (Рис. 3.3). Белки, экспрессированные в системе вируса Синдбис, не полностью гликозилированы, что выражается в наличии серии полос в иммуноблоте (Рис. 3.4). Это особенно наглядно выявляется в случае белка E1, где можно наблюдать до четырех полос, соответствующих 4-м сайтам гликозилирования данного белка [Dubuisson et al., 2003].
Оценку иммуноадекватности выделенных нами рекомбинантных белков нативным аналогам проводили в ИФА и Western blot анализе с использованием фрагмента коллекции HCV-позитивных сывороток человека, описанных в разделе 3.1: по 13 образцов 1b и 2a/2c генотипов и 11 образцов 3a генотипа HCV. Все тестированные сыворотки распознавались как позитивные в ИФА с использованием в качестве антигена VV-E1E2. Белки SIN-E1E2 распознают все сыворотки только в случае генотипа 3a HCV и не распознают 5 сывороток в группе с генотипом 2a/2c и 3 сыворотки в группе с генотипом 1b.
Таким образом, по результатам ИФА рекомбинантные белки, экспрессированные в системе вируса осповакцины, являются более компетентными для иммуноанализа (100% узнавания), чем белки из системы Синдбис вируса (78% узнавания). Еще в большей степени различия между рекомбинантными белками проявились в Western blot анализе, в котором система экспрессии вируса Синдбис обеспечивала только 46% узнавания HCV-позитивных сывороток против 100% в системе вируса осповакцины.
3.3. Вируснейтрализующая активность иммуногенных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2
Для оценки иммуногенных и протективных свойств рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV проводили иммунизацию мышей линии BALB/c очищенными препаратами белков. Позитивные сыворотки объединяли в пулы (VV-AB и SIN-AB, соответственно) и анализировали в PepScan анализе с набором пептидов, описанным в разделе 3.1 (Рис. 3.5). Главный линейный эпитоп, узнаваемый обоими пулами сывороток, был локализован в позиции а.о. 632-667 (Рис. 3.5A) с сравнимым титром антител (~106) (Рис. 3.5Б). Сыворотки SIN-AB узнавали только 3 основных линейных эпитопа (а.о. 496-515, 512-547 и 632-667), в то время как 10 больших линейных детерминант узнавалось VV-AB пулом сывороток в полноразмерной последовательности Е1Е2 полипротеина.
Рис. 3.5. ИФА иммунных сывороток крови мышей с набором синтетических пептидов, перекрывающих последовательность полипротеина Е1Е2 HCV (PepScan).А - результаты PepScan анализа сывороток мышей в разведении 1:300; В - титры антител для каждого эпитопа в обеих сыворотках, полученные методом предельных 4-х кратных разведений в диапазоне от 1:200 до 1:3276800 (Рис. 5-13 B) в PepScan анализе.
Вируснейтрализующую активность сывороток (Рис.3.6) оценивали с использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 с генотипом 2а, способного к многопассажной репликации в клетках Huh-7.5 [Lindenbach et al., 2005]. Для оценки перекрестной межгенотиповой вируснейтрализующей активности использовали химерные вирусы с поверхностными белками генотипов 1a (химера 1а/2а) и 1b (химера 1b/2a). Работа проводилась в американской лаборатории вирусных гепатитов (FDA, USA) в рамках проекта Международного научно-технического центра № 3255-п, руководителем которого являлась автор представленной диссертации.
Рис. 3.6. Нейтрализация 1а/2а и 1b/2а химерных вирусов и 2а J6/JFH1 клона иммунными сыворотками мышей VV-AB и Sin-AB. NMS - нормальная мышиная сыворотка. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в единицах лингибирующая доза 50 (ID50). ID50 рассчитывали как максимальное разведение, способное нейтрализовать 50% вируса [Zhang et al., 2007]. Расчет средних значений и стандартного отклонения проводили с использованием пакета программ Origin для уровня значимости Р < 0.05.
Из Рис. 3.6 следует, что пул сывороток VV-AB обладает существенно большей нейтрализующей и перекрестной активностью, чем SIN-AB. Самые существенные различия между сыворотками были выявлены в случае генотипа 2а HCV (J6/JFH1), в котором ID50 титр для VV-AB составил 295.7 в сравнении 109.3 для SIN-AB, т.е. больше в 2.7 раза. Средний ID50 титр для нормальной мышиной сыворотки (NMS) в этих же экспериментах составил 21.47.
Для картирования вируснейтрализующих детерминант рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV нами было проведено блокирование иммунных мышиных сывороток пептидами, соответствующими четырем наиболее иммуногенным эпитопам белков VV-E1E2 и SIN-E1E2: а.о. 264-318; 496-515; 512-547 и 632-667 (Рис. 3.7). На первом этапе тест вирусной нейтрализации проводили с химерой 1a/2a HCV, последовательность Е1 и Е2 белков которой гомологична рассчитанным и синтезированным пептидам.
Как следует из Рис. 3.7A и B наибольший вклад в нейтрализацию вируса вносят пептиды, соответствующие районам а.о. 264-318 и 496-515. Эти районы представляют новые ранее не описанные вируснейтрализующие эпитопы белков Е1 и Е2 HCV. Суммарное блокирование сывороток двумя пептидами, соответствующими данным эпитопам (Рис. 3.7С), приводило к практически полной отмене нейтрализующей активности SIN-AB и редукции ID50 титра до уровня неспецифической нейтрализации нормальной мышиной сывороткой и контрольным пептидом Flu. В случае VV-AB эффект был выражен в меньшей степени, что свидетельствует о наличии других вируснейтрализующих детерминант в Е1Е2 рекомбинантных белках, синтезированных в системе вируса осповакцины. Из проведенного анализа также следует, что наибольший иммунный ответ как в случае VV-E1E2, так и в SIN-E1E2 формируется к не нейтрализующим эпитопам, локализованным в районах a.о. 512-547 и a.о. 624-667.
Рис. 3.7. Снижение титра ID50 иммунных сывороток мышей после блокирования специфическими пептидами. Блокирование антител к специфическому пептиду осуществляли как описано в работе [Major et al., 1999], используя 1-5г небиотинилированных пептидов в 100мкл сыворотки. Оценку блокирования осуществляли с использованием соответствующего биотинилированного пептида в ИФА. В качестве негативного контроля использовали пептид Flu (Mimotopes, Австралия) в той же концентрации как HCV-специфичные пептиды.
Анализ перекрестной межгенотиповой активности вируснейтрализующих эпитопов проводили с использованием VV-AB сыворотки и трех вариантов HCV - 2а (J6/JFH1 клон), химеры 1а/2а и 1b/2а. Кроме выявленных нами двух новых вируснейтрализующих эпитопов в позициях а.о. 264-318, а.о. 496-515 и не нейтрализующего доминантного эпитопа в позиции а.о. 624-667 нами были проанализированы три другие, ранее описанные в литературе, иммунодоминантные эпитопы, выявленные в VV-E1E2 белках (Рис. 3.8).
Рис. 3.8. Анализ перекрестной активности эпитоп-специфичных антител в сыворотке VV-АB для 1а, 1b и 2а генотипов HCV. Активность рассчитывали как % снижения титра ID50 до и после блокирования специфическими пептидами.
Как следует из Рис. 3.8 блокирование антител к пептиду а.о. 624-667 оказывало слабый эффект на нейтрализацию всех трех тестированных вирусов, что соответствует данным, представленным на Рис. 3.7. Блокирование антител к выявленному нами новому эпитопу а.о. 264-318 вызывало ~20% - ную редукцию ID50 титра для 1a и 1b HCV, но не влияло на нейтрализацию 2a вируса, что свидетельствует о неконсервативности этого района в случае 2а генотипа. Блокирование антител к хорошо изученным районам белка Е2 в позициях а.о. 390-410 (HVR1) и 448-483 существенно редуцировало нейтрализацию 1a вируса, но не влияло на нейтрализацию 1b или 2a вирусов, что очевидно является следствием высокой вариабельности этих районов. Напротив, район а.о. 412-419 (EPI) является высоко консервативным между генотипами [Zhang et al., 2007], и блокирование антител к этому району приводило к снижению нейтрализации вируса на 50% для всех тестированных генотипов 1a, 1b и 2a. Блокирование антител к эпитопу в позиции а.о. 496-515 также существенно снижало нейтрализацию всех трех вирусов на 30-50%. Этот район консервативен между тремя исследуемыми генотипами и представляет новый универсальный вируснейтрализующий эпитоп.
ВЫВОДЫ
- Впервые на территории Сибири проведено крупномасштабное (n=5605) молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов B, C и G, по результатам которого созданы три электронные базы данных в международном формате EpiInfo.
- С использованием этих баз данных проведен анализ частоты встречаемости, генотипического разнообразия и факторов риска парентеральных вирусных гепатитов B, C и G среди представителей разных групп населения Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края в период 2001- 2003 гг.
- Частоты выявления иммунологических маркеров HBV инфекции: среди пациентов поликлиники (n=500) положительными на HBsAg оказались 3.6% пациентов, анти-HBc IgG выявлены у 24.0%; в общей группе медработников (n=500) HBsAg встречался с частотой 5.4%, анти-HBc IgG обнаружены у 22.4% респондентов; частота выявления HBsAg среди всех пациентов МГНД (n=500) составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов; в группе больных острыми гепатитами Новосибирской (n=1509), Иркутской областей (n=888) и Алтайского края (n=1044) HBsAg встречался с частотой 48.8, 20.6 и 36.5% соответственно; в группе больных хроническим гепатитом (n=164) только 25.6% имели серологические маркеры HBV инфекции.
- Частоты выявления иммунологических маркеров HCV инфекции: 48.0% - среди пациентов Муниципального наркологического диспансера, 5.6% - среди посетителей поликлиники и 5.2% - у медицинских работников больниц Новосибирской обл. В группе больных острыми гепатитами Иркутской, Новосибирской областей и Алтайского края анти-HCV имели 17.2, 21.0 и 35.1% соответственно. В группе больных хроническим гепатитом - 69.5%.
- Отрицательными в ИФА на маркеры гепатитов оказались 14.6% больных острым гепатитом и 11.6% больных хроническим гепатитом. Доля таких пациентов растет с увеличением возраста и составляет 8.8% среди лиц моложе 25 лет и 51.4% в возрастной группе старше 60 лет. ПЦР анализ позволил определить этиологию гепатита в 32.7% и 78.9% случаев в группах с острым и хроническим гепатитом соответственно.
- На территории сибирских регионов преобладает генотип D HBV, доля которого в обследованных популяциях составила 97.6% (генотип А - 1.6% и генотип С - 0.8%).
- Генотипическое разнообразие изолятов HCV (n=818), циркулирующих в Сибири, ограничено четырьмя субтипами: 1b, 2a, 2c, 3a, среди которых превалируют субтипы 1b (54.6%) и 3а (36.9%), субтипы 2а и 2с встречаются с частотой 7.9%. Выявлено четыре рекомбинантных изолята генотипов 2k/1b (2) и 2a-2c/1b (2). Генотипическое разнообразие HCV не одинаково в разных возрастных группах. С ростом среднего возраста респондентов происходит снижение доли генотипа 3 с 40% в группе 18-25 лет до 5% среди лиц старше 50 лет и увеличение доли генотипа 1 с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет.
- Частота встречаемости РНК HGV среди пациентов МГНД (n=500) составила 33.6%. Частота ко-инфекции с HCV составляла 42.9%, (ОR=2.26). Все генотипированные изоляты HGV (n=78) относятся ко 2 генотипу, найден только один изолят 4 генотипа.
- Общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и С+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков (OR=1.74-175.3). Основной путь заражения - использование общих шприцев и игл (OR=2.26). Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет ханка (80.57%), вторым по значимости является героин (45.85%). Употребление героина (OR=1,4) является менее опасным фактором, чем употребление ханки (OR=2.4).
- Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Факторами риска являлись: количество половых партнеров больше или равно 3 в последние 6 месяцев до заболевания (OR=1.68-2.88), половые контакты с ПИН и партнерами с гепатитом в анамнезе (OR=1.66-2.25).
- Инвазивные медицинские процедуры также являлись факторами риска заражения гепатитами В и С в 2001-2002 гг: переливание крови (OR=2.45-11.3), эндоскопия и зондирование (OR=1.3-1.6). Хирургические операции и большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализациях достоверно увеличивали риск гепатита С (OR=1.31 и 2.5), но не являлись факторами риска в отношении гепатита В.
- Низкий социально-экономический статус был ассоциирован с повышенным риском инфицирования HBV, HCV и HGV, но набор факторов варьировал для разных гепатитов. Гепатиты В и G - статус безработного (OR=4.46 и 2.0); гепатиты В и С - пребывание в тюрьме (OR=2.5 и 3.25), наличие татуировок (OR=1.5 и 2.16), употребление крепких напитков (OR=1.4 и 1.32). Гепатит В - посещение маникюрного кабинета (OR=1.65) и бытовые контакты (OR=1.63).
- Вакцинация против HBV инфекции является достоверно значимым фактором защиты (OR=0.47) в группе медработников, где выборка вакцинированных на момент нашего исследования была наиболее высока (n=135).
- Оценка состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В показала, что протективный уровень анти-HBs IgG (>10МЕ/л) через 5 лет после полного курса вакцинации имеют только 60% вакцинированных, при этом 48.1% из них обладают и клеточным иммунитетом (индекс HBsAg-стимуляции лимфоцитов более 2-х). В группе вакцинированных с отсутствием протективного уровня антител число лиц с клеточным иммунитетом достоверно выше и составляет 72.2%.
- Пептидное сканирование Е1 и Е2 белков сибирских изолятов HCV генотипов 1b, 2а/2с и 3а (n=45) выявило консервативные высокоиммуногенные эпитопы в позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440, 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия были зарегистрированы в позициях а.о. 280-290 (Е1), 410-430 и 520-540 (Е2).
- Проведен сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV, полученных в клетках млекопитающих с помощью двух вирусных систем экспрессии - вирусы Синдбис и осповакцины.
Показано, что:
- иммунохимические свойства Е1 и Е2 HCV белков из системы вируса осповакцины в большей степени соответствуют природным аналогам, чем белки вируса Синдбис - связывание с HCV-позитивными сыворотками человека в ИФА и иммуноблот анализе составляло (100 и 78)% и (100 и 46)%, соответственно;
- белки, экспрессированные вирусом осповакцины, обладали большей иммуногенностью для мышей и большим разнообразием антигенного профиля (10 детерминант) по сравнению с белками вируса Синдбис (3 детерминанты);
- мажорные иммуногенные эпитопы рекомбинантных белков индуцировали антитела, не обладающие нейтрализующими свойствами.
- Выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1) и 496-515 (Е2), первый из которых оказался генотип-специфическим, а второй обладал перекрестной активностью. Пептиды, соответствующие данным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах
- Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Shustov A.V., Gavrilova I.V., Nesterov A.E., Streltsova M.A., Paltsev A.I., Loktev A.V., Maksyutov A.Z., West E., Netesov S.V. and Ryder R.W. The prevalence and risk factors of hepatitis C virus and hepatitis B virus infections among health care workers in Novosibirsk region hospitals. // Antiviral Therapy. - 2000. - Vol. 5 (Suppl. 1). - P.31-32.
- Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Стрельцова М.А., Пальцев А.И., Локтев А.В., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., West T.E., Нетесов С.В., Ryder R.W., Онищенко Г.Г. Частота встречаемости маркеров гепатита C и факторы риска у персонала больниц Новосибирской области. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 2. - С.26-32.
- Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Нетесов С.В. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирской области. // Инфекционные болезни. - 2004.- №3. - С.39-44.
- Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Zelicoff A.P., Нетесов С.В. Частоты встречаемости маркёров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди некоторых групп населения Новосибирской области. // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2004. - №5. - С.20-25.
- Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов С.В. Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Инфекционные болезни. - 2005. - Т. 3. - №1. - С.26-31.
- Качко А.В., Ершов А.Е., Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Букин В.Н., Комиссарова М.А., Нетесов С.В. Частота встречаемости РНК HGV/GBV-C и факторов риска у пациентов наркологического диспансера Новосибирска. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2005. - № 2. - С.25-30.
- Shustov A.V., Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazhdantseva A.A., Gavrilova I.V., Akinfeeva L.A., Rakova I.G., Aleshina M.V., Bukin V.N., Orlovsky V.G., Bespalov V.S., Robertson B.H., Netesov S.V. Molecular epidemiology of the hepatitis C virus in Western Siberia. // J. Med. Virol. - 2005. - Vol. 77(3). - P.382-389.
- Мануйлов В.А., Нетесова И.Г., Осипова Л.П., Шустов А.В., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Генетическая вариабельность изолятов вируса гепатита В у населения Шурышкарского района Ямало-Ненецкого Автономного Округа. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - №4. - С.30-34.
- Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алёшина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П., Нетесов С.В. Факторы риска заражения больных гепатитом С в инфекционных больницах Новосибирска. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №6. - C.28-33.
- Матрос О.И., Гранитов В.М., Кочнева Г.В., Шустов А.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Чуб Е.В., Нетесов С.В.. Особенности вирусных гепатитов в Алтайском крае в первые годы XXI века: клиника и эпидемиология. // Российские медицинские вести. - 2005. - №3. - С.57-60.
- Терновой В.А., Чаусов Е.В., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Изучение генетического разнообразия вируса гепатита А в Западной Сибири. // Вопросы вирусологии. - 2006. - № 51(1). - С.23-27.
- Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Святченко В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Киселев Н.Н., Сахарова Е.Г., Нетесов С.В. Выявление вируса гепатита Е при остром гепатите в Сибири. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 3. - С.36-40.
- Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Локтев В.Б., Гранитов В.М., Нетесов С.В. Частота обнаружения маркеров, генотипы вируса и факторы риска гепатита В у пациентов инфекционного отделения городской больницы Барнаула. // Инфекционные болезни. - 2007. - Т.5. - №1. - С.5Ц10.
- Гаврилова И.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Баяндин Р.Б., Нетесов С.В. Распространенность, генотипическое разнообразие и факторы риска гепатита C среди больных с хроническими вирусными гепатитами в Новосибирской области. // Инфекционные болезни. - 2007. - Т.5. - № 3. - С.9Ц15.
- Чуб Е.В., Кочнева Г.В., Гранитов В.М., Нетесов С.В. Рекомбинанты вируса гепатита С типа 2k/1b у населения Алтайского края. // Инфекционные болезни. - 2007. -Т.5. - №4. - С.5-11.
- Гражданцева А.А., Носарева О.В., Нестеров А.Е., Сиволобова Г.Ф., Локтева Л.И., Aлейников Р.П., Кузубов В.И., Кочнева Г.В. Изучение показателей иммунитета при вакцинации против гепатита В. // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2008. - №5. - C.40-46.
- Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Лупан Т.А., Разумов И.А., Швалов А.Н., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Выделение и иммунохимическая характеризация поверхностных гликопротеинов Е1 и Е2 вируса гепатита С, экспрессированных в клетках млекопитающих. Достижения современной биотехнологии. // Сборник научных трудов ФГУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора под ред. д.м.н., проф. Дроздова И.Г. - 2008. - Новосибирск. - С.250-259.
- Кочнева Г.В., Чуб Е.В., Гранитов В.М., Матрос О.И., Клиновенко Н.Г., Хорошилова И.А., Нетесов С.В. Обнаружение природных рекомбинантных вариантов вируса гепатита С в Алтайском крае и Новосибирской области. // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Юбилейный сборник научных работ, посвященный 50-летию кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет. - 2009. - Барнаул. - С.147-153.
- Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Major M., Чуб Е.В., Швалов А.Н., Юдин П.В., Нетесов С.В., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Полноразмерный пептидный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита C. // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12. - № 1-2. - С.115-124.
Тезисы или статьи в сборниках конференций
- Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Пальцев А.И., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., Райдер Р.У. Факторы риска и генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С у персонала больниц Новосибирской области // IV Конф. по вирусным гепатитам В, С и Д. - Москва. - 2001. - C. 15.
- Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Aкинфеева Л.A., Ryder R.W. Влияние характеристик серологической тест-системы на результат эпидемиологического исследования // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 62.
- Шустов А.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Кочнева Г.В., Гаврилова И.В., Баяндин Р.Б., Акинфеева Л.А., Зеликов А. Распространенность и факторы риска заболевания вирусными гепатитами В и С среди медицинских работников больниц Новосибирской области // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 63.
- Shustov A.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Kochneva G.V., Gavrilova I.V., Bayandin R.B., Akinfeeva L.A., Zelicoff A., Netesov S.V. The Prevalence and Risk Factors of HCV and HBV Infections Among Health Care Workers in Novosibirsk Region Hospitals // XIIth International Congress of Virology. Abstracts. - 2002. - P. 343.
- Нетесов С.В., Шустов А.В., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Маркович Н.А., Гранитов В.М., Губанова Л.И., Сахарова Е.Г. Вирусные гепатиты в Западной Сибири за сорок лет в сравнении с данными по России и другим странам // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. - Москва. - 2003. - С. 206-207.
- Шустов А.В., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Фаворов М.О., Робертсон Б. Дж., Нетесов С.В. Генотипы вирусов А, В и С, циркулирующих среди населения Западной Сибири // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. - Москва. - 2003. - С. 352-353.
- Shustov A.V., Gavrilova I.V., Ternovoi V.A., Rudzevich T.N., Chub E.V., Bayandin R.B., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Sivolobova G.F., Favorov M.O. and Netesov S.V. Genotypes of hepatitis A, B, and C viruses circulating in the population of Western Siberia // 6-ой ежегодный съезд Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ая Конференция по Современной ситуации в области Хронических Вирусных Гепатитов. - Лион (Франция). - 2003.
- Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алешина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П. Частота встречаемости маркеров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска // Материалы международного междисциплинарного конгресса Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека. ЦСудак (Украина). - 2004. - С. 87Ц88.
- Чаусов Е.В., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // Материалы международного междисциплинарного конгресса Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека. ЦСудак (Украина). - 2004. - С. 154 - 155.
- Шустов А.В., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Ракова И.Г., Алешина М.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Сахарова Е.Г., Гранитов В.М., Губанова Л.И. Предварительные итоги сторожевого надзора за острыми вирусными гепатитами в трех городах Западной Сибири: Новосибирске, Барнауле и Иркутске // Материалы международной конференции Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний. - Сосновка, Новосибирская обл. - 2004. - Новосибирск: ЦЭРИС, 2004. - С. 301 - 302.
- О.И.Матрос, Г.В.Кочнева, Е.В.Чуб, Г.Ф.Сиволобова, А.А.Гражданцева, А.В.Шустов, В.М.Гранитов, С.В.Нетесов. Генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С в Алтайском крае // Сборник трудов 5-ой всероссийской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва. - 2004. - Т. 1. - С. 254-256.
- Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Нетесов С.В. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В среди некоторых групп населения Новосибирска // Тезисы 1-й Международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность. - Москва. - 2004. - С. 21-22.
- Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Выявление случаев гепатита Е в западной Сибири // Материалы Российской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний. - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 78.
- Чуб Е.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Генотипы изолятов вируса гепатита С у больных острыми гепатитами в г. Барнауле Алтайского края и выявление ВГС-рекомбинантов // Материалы Российской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний. - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 80.
- Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Плясунов И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. Молекулярное разнообразие геномов вирусов гепатитов А, В, С, Е и его диагностическое, клиническое и эпидемиологическое значение // Материалы Всероссийской конференции Фундаментальные науки - медицине. - Новосибирск. - 2005. - С. 62.
- Баяндин Р.Б., Шустов А.А., Ершов А.Е., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С.. Гранитов В.М.. Нетесов С.В. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Тезисы III Российской научной конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. - Новосибирск. - 2006. - С. 37.
- Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Плясунова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М.. Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов С.В. Этиология гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Тезисы III Российской научной конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. - Новосибирск. - 2006. - С. 44.
- Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Материалы Международной научно-практической конференции Молекулярная диагностика инфекционных болезней. - Минск. - 2007. - С. 82-83.
- Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Выявление случаев гепатита Е в Западной Сибири // Материалы международной научно-практической конференции Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков. - Алматы (Казахстан). - 2006. - С. 223-224.
- Чуб Е.В., Kurbanov F., Mizokami M., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Обнаружение рекомбинантных вариантов вируса гепатита C в Сибири и разработка ПЦР-системы для их идентификации // Материалы Международной научно-практической конференции Молекулярная диагностика инфекционных болезней. - Минск. - 2007. - С.83-84.
- Кочнева Г.В., Баяндин Р.Б., Мануйлов В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Молекулярно-генетическое разнообразие изолятов вируса гепатита в и факторы риска передачи вирусного гепатита В в регионах Азиатской части России // Материалы Всероссийской научной конференции Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний. - Санкт-Петербург. - 2008. - С. 435.
- Chub E., Kochneva G., Manuilov V., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Kurbanov F., Tanaka Y., Mizokami M., Netesov S. Hepatitis C virus recombinants type 2k/1b were found in Siberia, Russia // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 284.
- Bayandin R., Kochneva G., Netesov S. Isolates genotypic variability and risk factors of HBV infection among different groups of Novosibirsk and Barnaul population // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 278.
- Plyasunova I., Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Bayandin R., Netesov S. The prevalence, distribution of genotypes and risk factors of Hepatitis C virus in patiens with chronic Hepatitis in Novosibirsk region // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 280.
- Kachko A., Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Lupan T., Wells F., Merchlinsky M., Ivanova A., Shvalov A., Loktev V., Netesov S., Major M. Mammalian expression systems used to produce recombinant HCV envelope glycoproteins influence the immunogenicity and antibody profile induced // 16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses. - Nice (France). - 2009. ЦP. 121.
- Kachko A., Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Lupan T., Zubkova I., Wells F., Merchlinsky V., Williams O., Ivanova A., Shvalov A., Loktev V., Netesov S. and Major M. New neutralizing antibody epitopes in hepatitis C virus envelope glycoproteins are revealed by dissecting peptide recognition profiles // American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) annual meeting. - Boston (USA), - 2010.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии