Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
Научный Центр Психического Здоровья Российская Академия медицинских наук
На правах рукописи
БОКША ИРИНА СЕРГЕЕВНА
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА ПРИ ШИЗОФРЕНИИ.
03.00.04 Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2008
Работа выполнена в Научном центре психического здоровья РАМН Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Бурбаева Г.Ш.
Официальные оппоненты:
Академик РАМН, д.м.н., профессор Чехонин В.П.
Доктор биологических наук, профессор Сяткин С.П.
Доктор биологических наук, профессор Болдырев А.А.
Ведущая организация - Институт биохимической физики РАН
Защита состоится 19 сентября 2008 г. на заседании Диссертационного Совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу:
117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.Автореферат разослан Е. ЕЕЕЕЕЕ2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.203.Доктор биологических наук, профессор Лукашева Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ В последние годы существенно расширились представления о роли различных нейрохимических систем (дофаминергической, серотонинергической, ГАМКергической и других) и соответствующих нейромедиаторов в деятельности нервной системы. Особенно важным для понимания функционирования мозга в норме и патологии является факт их взаимодействия на рецепторном уровне [Shutoh et al., 2000, Svensson, 2000]. Это делает необходимым не только уточнение, но и, возможно, пересмотр существующих гипотез патогенеза эндогенных психозов, в частности, шизофрении, большинство из которых основаны на относительной дискретности нейрохимических систем.
В свете сказанного особое внимание привлекает к себе глутаматергическая система мозга. Глутамат (Глу) - это основной возбуждающий нейромедиатор в центральной нервной системе. Глутаматергическая система включает в себя рецепторы (ионотропные и метаботропные) и переносчики Глу. Особенность передачи сигнала в синапсе при посредстве Глу состоит в том, что кроме нейронов в процессе непосредственно участвуют глиальные клетки: поскольку для прекращения возбуждающего действия Глу необходима его эвакуация из синаптической щели, Глу переносится в астроциты, где нейтрализуется, превращаясь в глутамин (цикл Глу/глутамин работает значительно интенсивнее лобратного захвата нейромедиатора нейронными переносчиками Глу).
Такой факт, как образование многими монаминергическими нейронами (дофаминовыми, серотониновыми, норадреналиновыми, холинергическими) глутаматергических синапсов и высвобождение ими Глу в качестве второго нейромедиатора [Trudeau, 2004, Gras et al., 2002, Allen et al., 2006], принципиально изменил постулаты, господствовавшие еще в конце прошлого века. Некоторые исследователи рассматривают глутаматергическую систему как своего рода регулятор (или модулятор) активности других нейромедиаторных систем [Zarate, 2003, Tamminga, 2006], но этот аспект еще не нашел достаточного отражения в литературе.
Возникновение глутаматергической (глутаматной) гипотезы патогенеза шизофрении можно отнести к 1980 г., когда J. Kim и соавт. обнаружили пониженные концентрации Глу в спинномозговой жидкости больных шизофренией. Некоторое время гипотеза оставалась без должного внимания, вероятно, из-за ограниченных знаний о глутаматной системе мозга человека и главенствующих представлений о том, что нарушение ее функции приводит к развитию Глу-индуцированной нейротоксичности, вызывающей нейродегенеративные изменения либо глубокие нару шения развития и функционирования нервной системы, каких не наблюдается при шизофрении. Следующие 20 лет происходило постепенное накопление фундаментальных знаний и клинических наблюдений, способствующих формированию глутаматергической гипотезы патогенеза шизофрении.
Сформировавшаяся на рубеже веков гипотеза предполагала снижение активности Глу-зависимого проведения нервных импульсов в мозге больных из-за недостаточной активности (ингибирования) Глу- рецепторов NMDA типа. Первоначально гипотеза основывалась на общих представлениях о дисфункции этих рецепторов и психотомиметических свойствах их антагонистов, а затем были получены и нейрохимические, а также фармакологические доказательства ее правомерности [HerescoLevy & Javitt 1998, Krystal et al., 1999]. Появились и предположения о том, что модулирование активности глутаматергической системы (в частности, регуляция функции рецепторов Глу) может быть перспективным подходом к лечению шизофрении [Carlsson, 2000, Goff et al., 1999, 2001], хотя на практике использовалось мало препаратов, действие которых направлено на глутаматергическую систему [Anand et al., 2000, Patil et al., 2007].
Ситуация, сложившаяся в области развития глутаматергической гипотезы шизофрении связана с тем, что проведение глутаматного нейромедиаторного сигнала зависит не только от количества и активности компонентов глутаматергической системы - рецепторов и переносчиков Глу, - но и от интенсивности метаболизма Глу. Публикуется все больше данных генетических, протеомных и биохимических исследований о том, что патологический процесс при шизофрении затрагивает ферменты важнейших путей метаболизма Глу - Глу/глутаминового, -глутамильного (глутатионового), N-ацетиласпартил-глутаматного (NAAG) циклов и глутаматдекарбоксилазу, декарбоксилирующую Глу с образованием -аминомасляной кислоты [Gluck et al., 2002, Beasley et al., 2006, Tosic et al., 2006].
Тем не менее, полученная информация о ферментах метаболизма Глу в мозге человека еще недостаточна, и в этом отношении представляют интерес прежде всего ключевые ферменты метаболизма Глу - глутаминсинтетаза (ГС) и глутаматдегидрогеназа (ГДГ).
Катализируемый ГС синтез глутамина из Глу глиальными клетками в мозге - важная реакция Глу/глутаминового цикла, впервые описанного Berl и Clark в 1969г.
На рубеже веков были получены прямые доказательства существования этого цикла методом ядерного магнитного резонанса in vivo. ГС играет важную роль в азотном метаболизме практически у всех живых организмов. Этот мультимерный фермент, регуляция активности которого подчинена сложному механизму, практически не изученному у млекопитающих, катализирует реакцию превращения Глу и аммония в глутамин за счет энергии гидролиза АТФ. Поскольку в мозге млекопитающих ГС играет важную роль в регуляции пула нейромедиатора-Глу и защите нейронов от повышенных концентраций Глу, в прекращении передачи нейромедиаторного сигнала Глу, ассимиляции и обезвреживании аммония, очевидна важность изучения молекулярной структуры ГС, а также факторов, влияющих на ее активность. Изучение структуры ГС актуально не только для понимания механизма ее функционирования, но и для разработок способов определения ее количества. ГС всех живых организмов имеют гомоолигомерную структуру с различной степенью олигомеризации (октамеры, додекамеры), но о ГС млекопитающих вообще и о ГС мозга человека в частности в этом аспекте информации было сравнительно мало, а вопрос о четвертичной структуре ГС мозга человека оставался открытым.
Другой ключевой фермент метаболизма Глу - ГДГ. Это один из многофункциональных ферментов, связывающих азотный и углеродный метаболизм: ГДГ катализирует обратимое окислительное дезаминирование L-Глу с образованием кетоглутаровой кислоты (-КГ), используя в качестве коферментов НАД/НАДФ. В мозге млекопитающих открыты различные изоформы ГДГ, которые адресуются в разные клеточные структуры, различаются силой ассоциации с мембранами и функциями, однако, способов очистки ГДГ мозга человека ранее опубликовано не было.
Хотя благодаря молекулярно-биологическим иследованиям в геноме человека обнаружены гомологичные последовательности, которые могут кодировать разные изоформы ГДГ, лишь немногие работы посвящены белковым продуктам этих генов [Shashidharan et al., 1997, Plaitakis et al., 2000, 2003]. Эти авторы выдвинули гипотезу о том, что одна изоформа ГДГ играет роль в базовом метаболизме, а вторая - специфическая для нервной ткани - задействована в поддержании пула нейромедиаторного Глу.
Если локализация ГС в глиальных элементах в ткани мозга здоровых лиц не вызывала сомнений (ГС обнаружена в астроцитах и олигодендроцитах), то данные о ГДГ в этом отношении противоречивы: есть сведения о том, что ГДГ - преимущественно глиальный фермент, хотя были получены также данные о локализации ГДГ не только в глии, но и в нейронах.
Что касается нейрональных ферментов - активируемой фосфатом глутаминазы, локализованной в нейронах и участвующей в синтезе нейромедиаторного Глу, а также глутаматдекарбоксилазы - из литературы известны работы, в которых обнаружено изменение интенсивности экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, при шизофрении [McCullumsmith et al. 2002, Bruneau et al., 2005], однако, информация о ГС и ГДГ в мозге человека очень скудна, структура и биохимические свойства этих ферментов не исследованы, а при патологии нервной системы об этих ферментах сведений еще меньше. В известных из литературы отдельных ранних работах, посвященных ГС и ГДГ, внимание уделялось окислительной инактивации ГС и количественным изменениям ГС и ГДГ при нейродегенеративных процессах. Изменение количества этих ферментов в ткани мозга, их повреждение или изменение распределения оценивалось по ферментативной активности, а также иммунохимическими методами с использованием в качестве зондов антител, полученных к антигенам из мозга млекопитающих (ввиду отсутствия препаративных способов выделения ферментов из мозга человека) [Plaitakis et al., 1984, Hussain et al., 1989, Le Prince et al., 1995].
В связи со сказанным выше, актуальной является разработка способов выделения нативных ферментов ГС и ГДГ из ткани мозга человека и изучение их свойств.
Недавно в литературе появились работы, посвященные изучению отдельных ферментов метаболизма Глу в мозге при шизофрении. Результаты свидетельствуют об измении количества отдельных ферментов метаболизма Глу [Tsai, 2005, Beasley et al., 2006], oднако эти исследования пока разрознены, и данные требуют подтверждения. Поскольку существуют теснейшие нейронально-глиальные метаболические связи, в том числе и через метаболизм Глу, необходимы комплексные исследования метаболизирующих Глу ферментов и глиальных белков. Развитие новых технологий, особенно количественных методов анализа белков/ферментов, позволяет реализовать такие комплексные системные нейрохимические исследования.
Известно, что патологический процесс при шизофрении затрагивает многие структуры мозга, при этом нарушение функций префронтальной коры (ПФК, поле 10 по Бродману) рассматривается как центральное событие в клинической манифестации и патогенезе заболевания. Помимо ПФК затрагиваются и лимбическая кора, базальные ганглии (хвостатое ядро), мозжечок [Manoach et al., 2000, Bottmer et al., 2005, Daskalakis et al., 2005]. Поэтому при проведении комплексных исследований мозга при шизофрении важно обследовать параллельно несколько структур, что пока редко встречается в нейрохимических работах, известных из литературы.
Нейрохимические исследования аутопсийного мозга помогают понять патогенез шизофрении. Но важно было бы также найти в периферической крови биохимические изменения, сопряженные с клиническими симптомами шизофрении. Это помогло бы правильному выбору и прогнозу эффективности антипсихотической терапии. В этом случае особое внимание обращают на себя тромбоциты крови, которые являются, по данным ряда авторов [Bosetti et al., 2002, Брусов и др. 2005], биохимической моделью, отражающей происходящие в нервной ткани процессы. В тромбо цитах найден ряд компонентов глутаматной системы - рецепторы и переносчики Глу (Глу-зависимые ионные каналы), зарегистрирована также глутаминазная ферментативная активность. Более того, в тромбоцитах больных шизофренией обнаружены ланомалии работы глутаматергической системы - сверхчувствительность глутаматных рецепторов к Глу [Berk et al., 1999, 2000]. Представляется важным найти в тромбоцитах периферической крови и другие ферменты глутаматного обмена и оценить их в качестве периферических маркеров состояния метаболизма Глу с целью поиска и выделения таких подгрупп больных шизофренией, для которых лечение препаратами, воздействующими на глутаматергическую систему, окажется наиболее эффективным.
Таким образом, дальнейшее исследование функции глутаматергической системы мозга и особенно метаболизма Глу и его изменений при психической патологии, в частности при шизофрении, является одним из важных направлений биологической психиатрии, которое может способствовать как выяснению механизма развития шизофрении, так и разработке путей ее лечения.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью настоящей работы являлась характеристика ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге и периферической крови человека в норме и при шизофрении на основе решения соответствующих методических вопросов по препаративному выделению ферментов, изучению их структуры, биохимических свойств и количественной оценки.
ЗАДАЧИ работы включали:
1) разработку препаративных способов выделения и очистки ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС и ГДГ - из аутопсийного мозга психически здоровых лиц;
2) изучение биохимических свойств и структуры этих ферментов;
3) разработку способов количественной оценки ГС и ГДГ в экстрактах мозга;
4) проведение сравнительных количественных исследований концентраций изучаемых ферментов в различных структурах мозга здоровых людей и больных шизофренией;
5) обнаружение ферментов метаболизма Глу (ГС и ГДГ) в элементах периферической крови человека и разработку способов их количественной оценки;
6) установление связи количества ГС и ГДГ в крови с выраженностью психопатологических проявлений шизофрении с использованием влияния антипсихотических средств.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые выделены в электрофоретически гомогенном виде и охарактеризованы ключевые ферменты метаболизма Глу - ГС и три изоформы ГДГ мозга человека; определена первичная структура ГС мозга человека и охарактеризована её четвертичная структура; впервые обнаружен и изучен белок (фермент), по свойствам подобный ГС мозга человека - ГСПБ.
Впервые в тромбоцитах человека иммунохимическим методом обнаружены ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и ГДГ и определена L-глутамин : гидроксиламин трансферазная ферментативная активность, за которую отвечает ГСПБ. Разработаны и представлены соответствующие методы определения перечисленных показателей.
Получены новые экспериментальные данные о корреляциях, связывающих друг с другом концентрации ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге психически здоровых лиц (предполагается, что это может отражать взаимосвязи экспрессии соответствующих генов, или их согласованную регуляцию). Установлены различия в корреляциях между концентрациями ключевых глиальных ферментов метаболизма Глу и ряда белков глии у психически здоровых лиц и больных шизофренией, указывающие на рассогласованность синтеза ферментов метаболизма Глу и глиальных белков при шизофрении.
Обнаруженные корреляции количества метаболизирующего Глу тромбоцитарного фермента - ГСПБ - с выраженностью клинической патологии при шизофрении, а также с длительностью лечения до достижения положительного эффекта терапии могут служить предиктором ее эффективности в целом.
Впервые установлено изменение количества ГСПБ и ГДГ в тромбоцитах больных хронической шизофренией в процессе антипсихотического лечения, что позволяет предполагать участие глутаматергической системы не только в патогенезе заболевания, но и в реализации терапевтического эффекта.
Показана перспективность системного (метаболомного) подхода к изучению биохимических процессов в мозге лиц, не страдающих психической патологией, и больных шизофренией для выявления особенностей метаболизма Глу при шизофрении.
Проведенное исследование позволило расширить и дополнить новыми сведениями об участии ферментов метаболизма Глу в патогенезе шизофрении современную глутаматергическую гипотезу шизофрении.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Открытие нескольких изоформ ГДГ, описание нового белка ГСПБ и свойств высокоочищенных ГДГ и ГС мозга человека и изучение структуры ГС расширяет представление о метаболизме Глу в мозге человека.
Соответствующие методы, разработанные в настоящем иследовании, могут быть использованы в повседневной работе других научных и практических учреждений.
Данные о том, что количества ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС, ГСПБ и ГДГ - изменяются в различных областях мозга при шизофрении, а изменения взаимосвязаны, расширяют и дополняют глутаматергическую гипотезу патогенеза этого заболевания. Эти данные наряду с обнаружением связи между количественными изменениями ферментов метаболизма Глу и других глиальных белков подтверждают наличие аномалий в метаболических циклах с участием Глу между нейронами и глией в мозге больных шизофренией.
Данные об изменениях метаболизма Глу при шизофрении открывают новые перспективы в выработке подходов к лечению этого заболевания, в том числе поиск модуляторов активности ферментов метаболизма Глу и в дальнейшем, возможно, регуляторов экспрессии генов, кодирующих эти ферменты.
Подтверждено, что биохимические изменения (количества ферментов метаболизма Глу) в крови до некоторой степени отражают нейрохимические процессы в мозге при шизофрении.
Обнаружен один из возможных биохимических предикторов эффективности фармакологического воздействия на психопатологическую симптоматику шизофрении - это количество ГСПБ, определенное в тромбоцитах крови, взятой до начала лечения: чем оно больше, тем быстрее достигается положительный эффект терапевтического вмешательства.
Предполагается, что изучение метаболизма Глу окажется продуктивным в дальнейшем изучении не только шизофрении, но и других расстройств (аутизма, сенильной деменции, болезни Альцгеймера, эпилепсии и т.д.), в патогенезе которых, по современным представлениям, важная роль отводится глутаматной системе.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Разработанные способы выделения и очистки до электрофоретически гомогенного состояния ферментов метаболизма Глу - ГС, ГСПБ и ГДГ из ткани мозга человека позволяют получить эти ферменты в олигомерной форме, с высокой удельной активностью в количествах, достаточных для изучения их структуры и свойств. В мозге человека ГДГ представлена тремя изоформами, а ГСПБ может выполнять функции ГС.
2. Разработанные иммунохимические способы оценки относительных количеств ГС, ГСПБ и изоферментов ГДГ в экстрактах ткани мозга человека позволяют проводить сравнительные исследования образцов, полученных от психически здоровых лиц и больных психическими заболеваниями. Сравнительные исследования количества ГС, ГСПБ и трех изоформ ГДГ в образцах из коллекции структур мозга контрольной группы и группы больных шизофренией показали существование достоверных различий между группами обследованных в каждой из изученных структур мозга (префронтальная кора, хвостатое ядро, мозжечок).
3. В мозге здоровых людей определяются положительные коррелятивные связи между количеством ферментов метаболизма Глу, а также уровнями креатинфосфокиназы ВВ (КФК ВВ), глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и основного миелинового белка (ОМБ). Коррелятивные связи при шизофрении отличаются от таковых у здоровых (большинство связей, установленных у здоровых людей, отсутствуют при шизофрении). Кластер-анализ позволяет сделать вывод, что психически здоровые и больные шизофренией представляют собой разные типы метаболизма Глу: у больных повышена концентрация изученных ферментов метаболизма Глу.
4. Обнаруженные в тромбоцитах периферической крови ферменты метаболизма Глу (ГСПБ и изоформы ГДГ I и II) проявляют ферментативную активность и поддаются количественной оценке с помощью специфических поликлональных антител, полученных к высокоочищенным ферментам мозга человека. Количество ГСПБ и в мозге, и в тромбоцитах при шизофрении достоверно выше, чем у здоровых лиц того же возраста и пола. Количество ГСПБ в тромбоцитах больных шизофренией до лечения коррелирует с длительностью антипсихотического лечения до достижения положительного эффекта (чем оно выше, тем меньше длительность лечения). Достоверно изменяющееся в ходе лечения количество ГСПБ и ГДГ подтверждает влияние атипсихотического лечения на метаболизм Глу.
АПРОБАЦИЯ, ВНЕДРЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИ Основные результаты исследований доложены на российских и международных совещаниях, симпозиумах, конференциях: 1996 - 8-й Междунар. Конгр. Чешского и Словацкого Нейрохимического Общества, Мартин, Словакия; 1998 - Междунар. Конференция Структура, стабильность и фолдинг белков. Фундаментальные и медицинские аспекты. Москва, Россия;
1999 - Конференция Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга. Москва, Россия; 2000 - Зимнее рабочее совещание по шизофрении. Давос, Швейцария;
2000 - XIII съезд психиатров России. Москва, Россия; 2001 - 7-й Всемирный Конгр. по Биол. психиатрии. Берлин, Германия; 2002 - XXIII Конгр. Междунар. Коллегии по Нейропсихофармакологии. Монреаль, Канада; 2002 - Конгр. по Биол. Психиатрии "Биология психозов", Копенгаген, Дания; 2002 - V-й Европейский Симпозиум по функции глиальных клеток в здоровом мозге и при патологии. Италия, Рим; 2002 - Конференция по Проблемам медицинской энзимологии. Москва, Россия; 2003 - Рабочее совещание НАТО по научным исследованиям Креатинкиназа и энергетический метаболизм мозга: функционирование и роль при патологии. Тбилиси, Грузия; 2006 - Научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 25-летию ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, Психическое здоровье населения Сибири и Дальнего Востока. Томск, Россия; 2006 ЦПродвинутый Курс Wellcome Trust по молекулярной неврологии и невропатологии. Хинкстон, Великобритания; 2006 - Междунар. Конференция по психическим расстройствам. Стамбул, Турция; 2006 - Конгресс по Социальной психиатрии. Москва, Россия;
2007 - Конгресс Балканской Федерации Клинических Лабораторий. Анталия, Турция; 2007 - 39-ая Ежегодная Генеральная Ассамблея Европейского Сообщества исследования мозга и поведения.
Триест, Италия; 2007 - 2-й Конгресс Всемирной Федерации Общества Биологической Психиатрии. Сантьяго, Чили; 2007 - Конференция по Биологической психиатрии памяти М.Е. Вартаняна.
Москва, Россия, 2007 - Конференция Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии. Москва, Россия.
Диссертация выполнена в соответствии с планами научных исследований НЦПЗ РАМН и апробирована на межлабораторной научной концеренции НЦПЗ РАМН.
Результаты диссертационной работы применяются в научной работе лаборатории нейрохимии НЦПЗ РАМН. Различные аспекты диссертационной работы являлись основанием для планирования новых тем, продолжающих данное научное направление.
По теме диссертационной работы опубликовано 28 научных статей (из них 10 - в отечественных журналах из перечня, рекомендуемого ВАК, 11 - в рецензируемых зарубежных изданиях) и 20 тезисов в сборниках трудов конференций и симпозиумов.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 177 страницах, иллюстрирована 26 рисунками, содержит таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и заключения, выводов, списка цитированной литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинико-анатомический и клинический материал. Исследования проведены на образцах мозга - префронтальная кора, хвостатое ядро и мозжечок - от 22 лиц контрольной группы и больных шизофренией. В контрольную группу вошли образцы мозга от лиц, не страдавших психическими или неврологическими заболеваниями. Этот аутопсийный материал был получен из патолого-анатомической лаборатории Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Аутопсийную ткань мозга в случаях шизофрении получали из московских городских психиатрических больниц. Диагностика шизофрении осуществлялась клиницистами соответствующих психиатрических учреждений по DSM-IV-TR и МКБ-10. Образцы структур ткани мозга во всех случаях брались из левого полушария, обрабатывались (в основном - не позднее 6 ч с момента смерти) при 4C, замораживались в жидком азоте и хранились при Ц80C до исследования.
Также исследованы тромбоциты из образцов крови 33 психически здоровых лиц и 40 больных шизофренией из отделения психофармакологии НЦПЗ РАМН (руководитель - д.м.н.
М.А.Морозова) - во всех случаях это были больные параноидной шизофренией с приступообразным течением (без остаточной симптоматики между приступами). По DSM-IV-TR они были отнесены к рубрике 295.30, а по МКБ-10 к параноидной шизофрении с эпизодическим ремитирующим течением - рубрика F20.03. Лечение больных оланзапином состояло из нескольких фаз - начального, wash-out периода (9 дней), в течение которого проводился скрининг больных и подготовка к исследованию. Следующий затем основной курс лечения состоял из интенсивной фазы (первые недель) и поддерживающей фазы (последующие 20 недель). Средняя доза оланзапина составляла 12,7 3,6 мг/день, начальная доза - 5 мг/день, затем - 20 мг/день в ходе интенсивной и 10 мг/день в ходе поддерживающей фаз лечения.
Методы лабораторных исследований.
Выделение, очистка и характеристика ферментов. Экстракция белков из ткани мозга проводилась следующими способами. Цитоплазматические легко растворимые белки экстраги ровали рН-нейтральным буфером низкой ионной силы с восстановителем (2-меркаптоэтанолом) - такая экстракция предотвращала инактивацию изучаемых ферментов. Ассоциированные с мембранами белки экстрагировали с добавлением Тритона Х-100 и NaCl (при выделении ассоциированной с мембранами изоформы ГДГ). Лизаты получали, когда требовалась наиболее полная экстракция всех исследуемых белков. В этом случае гомогенизацию ткани проводили на кипящей водяной бане с додецилсульфатом натрия (ДС-Na) - с целью дальнейшего электрофореза и иммуноблоттинга экстрактов.
Экстракция белков из тромбоцитов проводилась путем гомогенизации с ДС-Na.
При выделении, очистке белков и характеристике очищенных препаратов применялись методы: препаративного ультрацентрифугирования, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления (ионообменной, гель-фильтрации, сорбционной, гидрофобной, аффинной); ультрафильтрации; спектрофотометрического определения ферментативной активности, электрофореза в полиакриламидном геле, а также двумерного электрофореза (изоэлектрофокусирование в первом направлении, электрофорез с ДС-Na - во втором). При тестировании антител применялся твердофазный ИФА; при определении относительных количеств исследуемых белков - ферментсопряженный вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала (ECL) и компьютерным анализом изображения, с применением моноклональных (коммерческих) и поликлональных (полученных путем иммунизации животных) антител.
Поликлональные антитела к ГС мозга млекопитающих были любезно предоставлены д-ром М.Тарди (Париж, Франция), поликлональные антитела к различным белкам семейства CRMP, клеточные линии- сверхпродуценты CRMP и лимфоциты человека с повышенной экспрессией CRMP были исследованы в совместной работе с проф. М.-Ф.Белан и д-ром М.Турэ (INSERM, Лион, Франция); в этих совместных исследованиях применялся метод фермент-сопряженного вестерниммуноблоттинга с флуоресцентным усилением сигнала и компьютерным анализом изображения.
При изучении структуры очищенных белков в совместных исследованиях с д-ром Г.Дж.Шёнфельдом (научный отдел фирмы Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария) применялись методы: аналитического ультрацентрифугирования, квазиупругого светорассеяния, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), определения первичной структуры белка пептидным картированием - частичным гидролизом трипсином и времяпролетной масс-спектрометрией с лазерной десорбцией с матрицы и ионизацией (MALDI-TOF) пептидов либо их прямым секвенированием на секвенаторе после разделения ВЭЖХ.
Статистический анализ данных производился с помощью программы Statistica 6.0 (непараметрический модуль - U-тест Манна-Уитни, корреляции по Спирмену, парный тест Вилкоксона, Крускал-Уоллиса ANOVA, уровень значимости - Р<0,05). При множественных сравнениях проводилась корректировка Бонферрони (ужесточение критерия значимости, т.е. 0,05 делили на n - число определяемых параметров, и различия/корреляции считали достоверными при р<0,05/n). Прогностическое значение полученных данных оценивали с помощью Умодели выживанияУ - регрессионный анализ). Кластерный анализ проводили посредством программы Clust, разработанной в НЦПЗ РАМН [Судаков, Мясоедов, 2005].
РЕЗУЛЬТАТЫ ГС мозга человека Разработанный оригинальный способ выделения и очистки ГС мозга человека основан главным образом на колоночной хроматографии низкого давления. Схема очистки включает дифференциальное ультрацентрифугирование, дробное осаждение сульфатом аммония, последовательные колоночные: анионо- и катионообменную хроматографию (на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах или сефацелях), гельфильтрацию (на поперечно сшитой сефарозе 6В), аффинную хроматографию (на аминогексил-сефарозе). Очищенный фермент концентровали ультрафильтрацией или осаждением сульфатом аммония.
Благодаря разработанному способу очистки [Бокша и др. 1995, Boksha et al.
2000] из ткани мозга лиц без психических отклонений была выделена и очищена ГС в препаративных количествах, что позволило провести исследование первичной и четвертичной структуры фермента [Бокша и др. 2002].
Характеристика субъединиц ГС методом электрофореза в ПААГ. При одномерном электрофорезе ГС, выделенная из мозга человека, мигрировала в градиентном (4 - 20%) ПААГ с ДС-Na как белковая зона с молекулярной массой ~ 44 кДа (рис. 1), что близко к расчетной молекулярной массе мономера ГС печени человека (42,1 кДа, база данных Swiss Prot, P15104).
Очищенную ГС характеризовали также методом двумерного электрофореза. В нашей работе ГС выделяли как из замороженной, так и из незамороженной ткани мозга человека (в последнем случае ГС была выделена из цитоплазматической фракции ткани мозга). Для сравнения свойств субъединиц ГС, выделенных в обоих случаях, проводили двумерный электрофорез в ПААГ обоих образцов в одинаковых условиях (рис. 2). Образцы очищенной ГС мозга при двумерном электрофорезе в обоих случаях разделились на несколько белковых зон, все они локализовались в интервале изоэлектрических точек от 6,7 до 6,4 и имели молекулярные массы ~ кДа, при этом распределение белковых зон по плотностям у ГС из незамороженной и замороженной ткани оказалось различным.
Итак, у обоих препаратов ГС наблюдается микрогетерогенность. Этот феномен отмечали и другие исследователи [Tumani et al. 1995]. Различные интенсивности белковых зон на двумерных гелях, возможно, отражают различные соотношения субъединиц ГС, одни из которых принадлежат цитозольной ГС, а другие - компартментализованной ГС, высвободившейся в результате замораживания-оттаивания.
Разные субъединицы ГС могут представлять различные продукты индивидуальных генов, т.к. в геноме человека идентифицировано несколько ГС-подобных последовательностей [Wang et al. 1996]. Изоферменты ГС могут возникать и в результате посттрансляционной модификации, которая, вероятно, происходит в разной степени в цитозоле и в клеточных компартментах (процесс замораживания, безусловно, влияет на высвобождение ГС из субклеточных органелл). Микрогетерогенность может быть обусловлена и окислением метиониновых остатков полипептида [Berlett et al. 1998].
Определение первичной структуры (аминокислотной последовательности) ГС человека ранее не проводилось, хотя была известна аминокислотная последовательность ГС печени человека, выведенная из нуклеотидной последовательности гена [Gibbs et al. 1987, Christa et al. 1994].
Предпринятые в настоящей работе неоднократные попытки прямого секвенирования N-конца полипептида ГС мозга человека с помощью аминокислотного секвенатора не дали результата. Было сделано предположение, что у полипептида ГС N-конец блокирован [Бокша и др. 2002, Burbaeva et al. 1998]. Вероятно, N-конец заблокирован как у компартментализованной, так и у цитозольной форм ГС мозга человека, подобно тому, как это было обнаружено у предшественника митохондриальной ГС печени других позвоночных [Laud & Campbell 1994].
Гидролиз ГС мозга человека трипсином в геле с последующим разделением пептидов ВЭЖХ и определение прямым секвенированием на аминокислотном секвенаторе аминокислотных последовательностей трех внутренних пептидов (общей длиной 20 аминокислот) [Burbaeva et al. 1998] дали полное совпадение с последовательностью ГС печени человека из базы данных SwissProt.
Дальнейшая расшифровка первичной структуры ГС мозга человека проводилась посредством масс-спектрометрии пептидов, полученных в результате внутреннего гидролиза трипсином полипептида ГС. После электрофореза с ДС-Na в ПААГ препарата ГС (рис. 1) полосу ГС вырезали, расщепляли трипсином, анализировали MALDI TOF масс-спектрометрией и сравнивали с известными пептидными последовательностями по базе данных SwissProt.
Рисунок 1. Картина электрофореза в ПААГ с ДС-Na ГС мозга человека (правая дорожка). ГС (показана стрелкой, ~кДа) анализировалась триптическим гидролизом и масс-спектрометрией. Левая дорожка - белки-стандарты, слева от геля - их молекулярные массы в кДа.
Шесть пептидных масс точно соответствовали массам пептидов, получающихся при гидролизе трипсином белка-продукта гена ГС печени человека (Swiss Prot, P15104).
Рисунок 2. Изображения гелей, окрашенных кумасси R-250, после двумерного электрофореза в ПААГ ГС, очищенной из незамороженной (а) и замороженной (б) тканей мозга.
Справа - молекулярные массы, под каждой панелью - шкала изоэлек трических точек (ИЭТ).
В целом идентифицированные пептиды ГС составляют ~ 24% последовательности гипотетического продукта трансляции кДНК ГС человека [Бокша и др. 2002].
Четвертичная структура ГС мозга человека.
Гель-фильтрация и светорассеяние. При изучении четвертичной структуры очищенной ГС мозга человека в совместных исследованиях с научным отделом фирмы Hoffmann-La Roche (Базель, Швейцария) применялось несколько методов, поскольку структура олигомера ГС была неизвестна. В ходе гель-фильтрации на сефарозе CL 6В или Superdex 200 (ВЭЖХ) ГС элюировалась как олигомер с кажущейся молекулярной массой ~ 290 кДа. Однако этот способ не дает точных результатов для белков с неглобулярной формой молекул, также вносят свой вклад неспецифические взаимодействия с гелевым носителем [Schonfeld & Behlke 1998]. В связи с этим был применен альтернативный подход к исследованию белковых молекул - метод квазиупругого рассеяния света (исследования проводятся в растворе, и влияния носителя исключаются). Наблюдаемая при анализе этим методом монодисперсность образца ГС указывала на узкое распределение молекул по размерам [Бокша и др.2002], а в соответствии с полученным коэффициентом диффузии расчетная молекулярная масса ГС составила ~ 270 кДа, если предположить, что молекула имеет глобулярную форму [Schonfeld et al. 1998]. Эта масса хорошо соответствует результатам, полученным при гель-фильтрации, но поскольку форма молекул ГС человека была неизвестна, невозможно сказать, насколько верна оценка массы молекулы ГС обоими этими методами.
Аналитическое ультрацентрифугирование. Аналитическое центрифугирование, в отличие от двух предыдущих способов, дает возможность точно определить молекулярные массы растворенных белков с неизвестной формой молекул [Schoеnfeld et al. 1998]. В опытах по седиментационному равновесию с ГС профили радиального распределения, полученные через 40 ч после начала эксперимента, хорошо соответствовали однокомпонентной октамерной модели. Качество соответствия всех образцов немного возрастало, если вводили многокомпонентную модель (т.е. кроме октамеров в модель вводили тетрамеры, 16-меры - димеры октамеров - и олигомеры высшего порядка), а алгоритм подгонки всегда указывал на присутствие минимум 80% молекул в виде октамеров при концентрации белка 0,4 мг/мл (10 мкМ в расчете на субъединицу белка). Добавление 0,2 - 1,0 мМ Mn2+ или 5 - 20 мМ Mg2+, варьирование pH (7,8 и 7,1) или состава буфера не оказывало заметного влияния на результат. Средняя молекулярная масса ГС составила 351 кДа, что близко к теоретической массе октамера ГС (336,5 кДа). Модель октамера хорошо подтверждается величиной и правильностью распределения остаточных членов. В другом эксперименте по равновесному центрифугированию изучалась ГС при различных концентрациях белка: 0,4 и 0,04 мг/мл. Средние молекулярные массы, рассчитанные по приближенным кривым шести различных профилей при различных концентрациях, для однокомпонентной модели составили 339 13 и 2 11 кДа для 0,4 и 0,04 мг/мл соответственно, что указывает на слабую равновесную диссоциацию.
Итак, впервые была исследована первичная и четвертичная структура ГС, выделенной из мозга человека. Аминокислотная последовательность ГС мозга человека гомологична ГС печени человека (минимум 24% их последовательностей идентичны), а октамерная четвертичная структура совпадает с симметрией укладки, известной у ГС мозга млекопитающих.
Белок, подобный глутаминсинтетазе (ГСПБ) В ходе фракционирования белков, экстрагированных из замороженной ткани мозга человека с целью очистки ГС (которую отслеживали по ферментативной активности - L-глутамин : NH2OH трансферазной реакции) было обнаружено, что на последней стадии очистки (хроматография на аминогексил-сефарозе) с колонки элюируются две фракции, в одной из которых содержится описанная выше ГС, а в другой - фермент, обладающий высокой удельной трансферазной активностью.
Этот фермент был назван белком, подобным ГС (ГСПБ). ГС и ГСПБ прочно связываются с аминогексил-сефарозой в условиях низкой ионной силы буфера [Boksha et al. 2000], но их элюция происходит при различной ионной силе элюирующего буфера (около 0,3 М и 0,5 М NaCl соответственно).
Рисунок 3. Электрофореграмма очищенных препаратов ГС и ГСПБ.
1 - белковые стандарты молекулярных масс; 2 - ГС; 3 - ГСПБ.
Белки разделяли электрофорезом с ДСNa в 10%-ном ПААГ и окрашивали Кумасси R-250.
Поскольку выделенный препарат ГСПБ казался гомогенным при одномерном ЭФ с ДС-Na (рис. 3, дорожка 3), была идентифицирована мажорная белковая зона в препарате ГСПБ методом ее вырезания, триптического гидролиза и MALDI-TOF масс спектрометрии пептидов (совместные исследования с фирмой Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария). Эксперименты показали, что мажорная белковая зона в препарате ГСПБ содержит в качестве основного компонента CRMP2 - белок из се мейства гомологов дигидропиримидиназы, участвующий в стимулируемом коллапсином каскаде остановки аксонального роста в процессе развития нервной ткани.
При одномерном ЭФ в ПААГ субъединицы CRMP2 маскируют ГСПБ (повидимому, вследствие близких значений молекулярных масс) при кажущейся гомогенности препарата [Boksha & Schnfeld 2002]. Однако, дополнительные опыты по иммунохимическому окрашиванию белков, разделенных ЭФ в ПААГ, методом вестерн-иммуноблоттинга антителами, специфичными к CRMP2 (любезно предоставленными для совместных исследований д-ром М.Турэ, INSERM, Лион, Франция), явно указали на различия в молекулярных массах субъединиц белков CRMP и ГСПБ. Очевидно, ГСПБ и белки семейства CRMP выделяются совместно при использовании схем фракционирования, разработанных для очистки ГС/ГСПБ. Учитывая склонность CRMP к образованию функциональных комплексов в процессе развития нервной ткани, можно предположить, что совыделение ГСПБ и CRMP обусловлено формированием комплекса между ними. Дальнейшие совместные исследования показали, что CRMP2 не обладает трансферазной ферментативной активностью. Это подтверждает тот факт, что ГСПБ и CRMP - разные белки, а ГСПБ - ранее не описанный фермент, способный катализировать трансферазную реакцию с L-Глн.
Ферментативная активность ГС и ГСПБ. Ферментативная активность ГС мозга обычно измеряется посредством упомянутой выше трансферазной (AДФ + LГлн + NH2OH в присутствии Mn2+), а не синтетазной (ATФ + L-Глу + NH2OH в присутствии Mg2+) реакции по двум причинам: высокие активности АТФаз, присутствующих в экстрактах ткани мозга, быстро расщепляют АТФ, используемый в качестве субстрата в синтетазной реакции [Dennis et al. 1980], кроме того, измеряемая синтетазная активность ингибируется продуктом реакции АДФ [Yamamoto et al.
1987], так что в экстрактах мозга измеряется лишь кажущийся, сильно заниженный уровень ферментативной синтетазной активности.
Очищенный ГСПБ эффективно катализирует трансферазную реакцию, однако, удельная активность его в синтетазной реакции по меньшей мере на 2 порядка ниже, чем у очищенной ГС [Boksha et al. 2000]. Кинетический анализ ферментных препаратов ГС и ГСПБ показал линейное накопление во времени продукта, т.е. глутамилгидроксамовой кислоты, в течение первых 30 мин. инкубации после запуска трансферазной реакции, а углы наклона зависели от концентраций ферментов (ГС или ГСПБ) в условиях, описанных в публикации [Boksha et al. 2000].
Из результатов следует практически важный вывод: измеряемая в рутинных анализах трансферазная активность в экстрактах мозга человека является суммарной активностью, в которую вносят вклад минимум два фермента (ГС и ГСПБ). Это обстоятельство важно учитывать в сравнительных (например, прикладных, медицинских) исследованиях ферментативной активности ГС.
Отметим также, что ингибитор метионинсульфоксимин (MSOX), считающийся специфическим ингибитором ГС, способен подавлять не только ее ферментативную активность, но и активность ГСПБ, выполняющего in vivo еще не известную функцию в метаболизме Глу/глутамина [Boksha et al. 2000]. Из этого следует, что в основе нейротоксических эффектов, наблюдаемых при действии MSOX in vivo, может лежать не только повышение концентрации Глу из-за ингибирования ГС, но и нарушение пути, в котором задействован ГСПБ.
Оценка относительного количества ГС и ГСПБ иммунохимическим методом.
Поскольку данные показывают, что оба фермента - ГС и ГСПБ - вносят вклад в ферментативную трансферазную активность белковых экстрактов ткани мозга, можно предположить, что оценку количества каждого из ферментов адекватно было бы проводить посредством определения парциального вклада иммунореактивных ГС и ГСПБ с помощью иммунохимического метода. В связи с этим был разработан иммунохимический способ обнаружения ГС и ГСПБ и их количественного определения в образцах мозга.
В результате иммунизации кроликов очищенными белками ГС и ГСПБ было получено несколько кроличьих сывороток. Все сыворотки кроликов, иммунизированных ГСПБ по различным схемам иммунизации, характеризовались высокими титрами в твердофазном ИФА, однако, они окрашивали несколько белковых зон при иммуноблоттинге легко растворимых цитоплазматических белков мозга человека (данные не представлены) и не могли быть использованы в количественном анализе ГСПБ ни ИФА, ни иммуноблоттингом.
Также было проведено тестирование различных моно- и поликлональных антител к ГС разных видов млекопитающих на предмет пригодности анализа ГС и ГСПБ в образцах мозга человека. Интересно, что все антитела, полученные к ГС овцы, быка, либо человека (в настоящей работе), реагировали в твердофазном ИФА с ГС и ГСПБ, при этом титры всех антител, тестированных в ИФА, приблизительно вдвое выше к ГС, чем к ГСПБ. Однако, моноклональные антитела, полученные к ГС мозга овцы (фирмы Biogenesis, Великобритания), узнавали только ГС в иммуноблоттинге (рис. 4). Поликлональные антитела, полученные к ГС мозга человека, узнавали ГС и ГСПБ при ECL-вестерн-иммуноблоттинге экстрактов мозга человека.
Картина окрашивания ГС и ГСПБ в экстракте легко растворимых белков ткани мозга человека зависела от разведения сыворотки (антител): окрашенные зоны, соответствующие обоим белкам, получались при разведении антител 1:12000 (данные не показаны на рисунке), а при дальнейшем разведении антител (1:15000) окрашивалась одиночная зона белка, соответствующая ГСПБ (рис. 4).
Рисунок 4. Окраска ГС и ГСПБ в экстрактах легко растворимых белков из замороженной ткани мозга человека методом ECL-иммуноблоттинга. Шкала молекулярных масс приведена слева. Экстракты ткани мозга человека (10 мкг на 1 дорожку) подвергали разделению ЭФ в 10% ПААГ с ДС-Na с последующим ECL-иммуноблоттингом. 1 - окраска моноклональными антителами к ГС (Biogenesis, Великобритания), 1:80000, 2 - окраска поликлональными антителами, 1:15000.
Таким образом, ГС и ГСПБ обладают не только общей ферментативной активностью (способностью катализировать трансферазную реакцию), но и дают сильную перекрестную реакцию в твердофазном ИФА. Однако, использование антител, реагирующих с ГС и ГСПБ, и ECL-иммуноблоттинга (но не твердофазного ИФА) в качестве метода исследования дает возможность оценить относительное количество иммунореактивных ГС и ГСПБ, присутствующих в одном образце (в экстракте мозга), благодаря различным молекулярным массам субъединиц ГС и ГСПБ (разделенных ЭФ в ПААГ с ДС-Na) [Boksha et al. 2000].
Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) мозга человека Обнаружение, выделение и исследование изоформ ГДГ мозга человека. При разработке способа выделения и очистки ГДГ белки экстрагировали из ткани мозга лиц без психических отклонений. Экстракцию проводили буфером с добавлением детергента (1% Тритона Х-100) и 0,5 М NaCl. Экстракт хроматографировали на колонке с фенил-сефарозой 4В. При элюции с колонки линейно повышающимся градиентом концентрации (090%) этиленгликоля были получены три белковые фрак ции, проявляющие активность ГДГ (рис. 5). Наблюдаемая картина позволила предположить существование нескольких изоформ ГДГ, различающихся гидрофобностью.
Для разделения с последующим выделением и очисткой индивидуальных изоформ ГДГ разработаны способы, основанные на дифференциальном центрифугировании, фракционировании сульфатом аммония, колоночной гидрофобной (на фенил-сефарозе 4В), ионообменной - (на сефарозе Q и ДЭАЭ-сефацеле), сорбционной (на оксиапатите) и аффинной (на ГТФ-агарозе) хроматографии. При этом для получения двух легко растворимых изоформ ГДГ исходным материалом служит экстракт ткани, полученный с буфером низкой ионной силы без детергентов, а для получения ассоциированной с мембранами изоформы - буфером повышенной ионной силы (0,5 М NaCl) с добавлением детергента (1% Тритона Х-100). Разделение легко растворимых и ассоциированной с мембраной изоформ ГДГ в основном достигается на этапе экстракции из ткани. Разделение двух легко растворимых ГДГ обеспечивается на этапе сорбционной хроматографии.
Итак, в результате многостадийных процедур фракционирования удалось получить высокоочищенные препараты трех изоформ ГДГ - двух легко растворимых (ГДГ I и II) и одной ассоциированной с мембранами (ГДГ III) (рис. 6, рис. 7) и охарактеризовать их свойства. Показано, что измеряемая в белковых экстрактах мозга ферментативная активность ГДГ складывается из активностей различных изоформ (присутствующих одновременно в соизмеримых количествах), хотя биохимические свойства (кинетические константы взаимодействия с субстратами, термоустойчивость, гидрофобность) выделенных и очищенных изоферментов ГДГ различны. Подход к решению проблемы анализа ферментов, представленных в мозге несколькими изоформами, упоминался выше - это разработка иммунохимического способа количественного обнаружения. Были получены специфические поликлональные антитела, окрашивающие при иммуноблоттинге две легко растворимые ГДГ I и II, а также поликлональные антитела, окрашивающие ассоциированную с мембранами изоформу ГДГ III [Burbaeva et al. 2002, Воробьева 2003]. Эти иммунологические зонды позволили провести сравнительную оценку количества изоферментов ГДГ в экстрактах различных образцов мозга человека [Burbaeva et al., 2002, 2003].
A 2 8 2. Э Г 1. 50 % 40 % 90 % 6 0 % 0. 0% 0 2 0 4 0 6 0 8 0 100 12 0 1фр а к ц и и Рисунок 5. Профиль элюции белков мозга человека, экстрагированных 1% тритоном + 0,5М NaCl, при хроматографии на колонке с фенил-сефарозой 4В. Черными символами обозначен профиль поглощения А280, белыми - профиль активности ГДГ, ЭГ - этиленгликоль (прямая - градиент концентрации ЭГ в элюирующем буфере).
Рисунок 6. Электрофореграмма изоформ ГДГ I и II (смесь) и ГДГ III (электрофорез в 10% ДС-Na-ПААГ). 1 - белковые маркеры и значения их молекулярных масс, кДа, 2 - смесь ГДГ I и ГДГ II, молекулярная масса субъединиц - и 56 кДа, 3 - ГДГ III, молекулярная масса субъединиц кДа.
Рисунок 7. Электрофореграмма ГДГ I и ГДГ II (электрофорез в 10% ПААГ с ДС-Na).
Cлева - смесь ГДГ I и ГДГ II, молекулярная масса субъединиц: 58 и 56 кДа, средняя дорожка - очищенная ГДГ I, молекулярная масса субъединиц 58 кДа, правая дорожка - очищенная ГДГ II, молекулярная масса субъединиц 56 кДа.
активность ГДГ, усл. ед Приведенные данные о существовании нескольких изоформ ГДГ мозга человека могут служить объяснением расхождений во мнениях, встречающихся в литературе относительно клеточной локализации ГДГ в ЦНС (преимущественно глиальной или глиально-нейрональной) [Aree et al. 1990; Subbalakshmi & Murthy 1985, Aoki et al. 1987; Kaneko et al. 1987; Rothe et al. 1990, Schmitt & Kugler 1999]. Изоформы ГДГ могут представлять продукты разных генов, но могут и транслироваться с различных мРНК ГДГ, образованных путем альтернативного сплайсинга, или образовываться в результате посттрансляционных модификаций. Показана множественность генов (и наличие псевдогенов) ГДГ в геноме человека, по меньшей мере три гена функциональны [Anagnou et al. 1993, Deloukas et al. 1993, Tzimagiorgis et al.
1993, Michaelidis et al. 1993, Mavrothalassitis et al. 1988; Shashidharan et al. 1994].
Итак, разработанные иммунохимические способы оценки относительных количеств изоформ ГДГ позволяют провести сравнительные исследования уровней этих изоформ в контрольных образцах мозга и при патологии (образцы мозга от больных хронической шизофренией).
ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА В МОЗГЕ В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ Основная методология, применяемая на этом этапе исследований - сравнение относительного количества ферментов метаболизма глутамата в экстрактах аутопсийных образцов мозга контрольной группы и больных шизофренией.
Экстракты белков ткани мозга готовили двумя различными способами - с использованием буфера низкой ионной силы без детергентов (лцитоплазматические легко растворимые белки) и с добавлением детергента (ДС-Na) при нагревании (ллизаты). В первом случае исследования проведены на образцах префронтальной коры (ПФК), причем параллельно оценивались лобщие, или суммарные ферментативные активности всех изоформ и сравнивалось относительное количество каждого изофермента иммунохимическим способом. Во втором случае исследования проведены на образцах трех структур мозга (ПФК, хвостатого ядра и мозжечка), причем сравнивалось относительное количество каждого изофермента иммунохимическим способом (ферментативные активности не определялись, т.к. ферменты инактивировались). Этим способом более полно извлекаются исследуемые белки, но подвижность изоформ ГДГ I и II при электрофорезе с ДС-Na такова, что они плохо разрешаются на электрофореграммах, поэтому их оценивали вместе (ГДГ I+II).
ГС, ГСПБ и ГДГ в цитоплазматической фракции ПФК контрольной группы и больных шизофренией.
Сравнительное исследование относительных количеств ГС, ГСПБ и изоформ ГДГ у лиц контрольной группы и больных шизофренией проведено иммунохимическим методом ECL-вестерн-иммуноблоттинга с параллельной оценкой ферментативной активности ГДГ и трансферазной активности [Boksha et al. 2000; Терешкина и др.
2000; Burbaeva et al. 2002]. Наблюдалось достоверное (P<0,01) повышение ферментативной активности ГДГ и количества всех трех ее изоферментов, а также разнонаправленные изменения количества ГС и ГСПБ (т.е. увеличение ГСПБ и снижение ГС) в группе больных шизофренией по сравнению с контрольной [Терешкина и др.
2000, Burbaeva et al. 2003].
ГС, ГСПБ, ГДГ и глиальные белки в трех структурах мозга контрольной группы и больных шизофренией Следующим этапом работы было комплексное сравнительное исследование относительного количества ГС, ГСПБ и трех изоферментов ГДГ, а также трех глиальных белков - центрального фермента энергетического метаболизма - креатинфосфокиназы ВВ (КФК ВВ), глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и основного миелинового белка (ОМБ) в группе контроля и у больных шизофренией.
Сравнительные исследования групп (контрольной и больных шизофренией) проведены на фракции белков, полученных экстракцией буфером с ДС-Na (ллизаты) [Бурбаева и др.2007, Burbaeva et al. 2007]. Это исследование было проведено на более многочисленных обследуемых группах, чем в предыдущем случае, (22 случая контроля и 23 - больных шизофренией) одновременно на трех структурах мозга: к ПФК были добавлены хвостатое ядро (ХЯ) и мозжечок.
Хотя обследуемые группы (больные и контроль) не различались достоверно по возрасту и времени с момента смерти до момента взятия материала (постмортальному интервалу - ПМИ), было неизвестно, влияют ли эти параметры на количества исследуемых белков. Поэтому был проведен поиск корреляционных связей между количествами белков с возрастом представителей каждой группы и ПМИ.
Количество ГФКБ в мозжечке достоверно коррелировало с возрастом пациентов в обеих группах (больных и контрольной) (R=0,66, p=0,0007 и R=0,64, p=0,002).
В контрольной группе количество ГФКБ отрицательно коррелировало с ПМИ в ПФК (R= - 0,71, p=0,0002). На биохимические параметры в группе больных шизофренией ПМИ не оказывал влияния.
Было проведено сравнение относительного количества всех перечисленных белков (ГС, ГСПБ, ГДГ I, II и III, КФК ВВ, ГФКБ и ОМБ) в трех указанных структурах мозга у лиц контрольной группы. Применялся статистический метод ANOVA Крускал-Уоллиса, а различия считали достоверными при P<0,007, т.е. после введения поправки Бонферрони. Количество ГС, КФК ВВ и ОМБ оказалось достоверно различным в ПФК, ХЯ и мозжечке (количество остальных белков в этих структурах достоверно не различалось). Наиболее сильное различие между медианами значений, определенных в трех структурах, наблюдалось для ГС: минимальное количество ГС было обнаружено в мозжечке, за ним следовали ХЯ и ПФК (Р=0,0003). Наименьшее количество КФК BB было также обнаружено в мозжечке, за ним следовали ПФК и ХЯ (Р=0,0001). Сходным образом, наименьшее количество ОМБ было обнаружено в мозжечке, за ним следовали ПФК и ХЯ (Р=0,002).
В группе больных шизофренией количество ГС и ГДГ III оказалось различным в проанализированных структурах мозга. Так, низшие уровни ГС были обнаружены в мозжечке и ХЯ, высший - в ПФК (Р=0,0001). Низший уровень ГДГ III опять найден в мозжечке, он достоверно отличался от ПФК и ХЯ (Р=0,003). Количество остальных белков в трех структурах мозга достоверно не различалось.
Затем было проведено сравнение между группой контроля и группой больных шизофренией количества тех же белков в тех же трех структурах мозга.
Достоверные различия (повышение в группе больных по сравнению с контролем, Р<0,007 с учетом корректировки Бонферрони) обнаружены в случае ГС в ПФК (различие медиан в 2,25 раза); в ХЯ достоверно различались количества ГДГ I+II (двукратно), а в мозжечке ГС, ГСПБ (двукратно) и ГДГ I+II (в 1,6 раз).
Интересно, что в работе с цитоплазматической фракцией ПФК мы наблюдали достоверно сниженный уровень ГС при шизофрении по сравнению с контролем, тогда как в экстрактах ПФК с детергентом количество ГС оказалось достоверно по вышенным. Эти результаты указывают на возможность перехода ГС из цитоплазматической в мембранную фракцию при шизофрении.
Отметим, что при шизофрении картина изменений количества метаболизирующих Глу ферментов различна в разных структурах мозга. Действительно, как в норме, так и при патологии регуляция экспрессии генов (например, гена ГС) зависит от области мозга [Khelli et al. 1990].
Хотя в каждой из обследованных областей мозга образцы от больных достоверно отличались от контроля по меньшей мере по одному из определяемых параметров, зона перекрытия, или смешения значений для больных и контроля составила существенную долю для любого из параметров. Рассмотрим, например, количество ГДГ I+II, ГС и ГСПБ, измеренное в образцах мозжечка обеих групп. На диаграмме (рис. 8) различными символами показано количество этих белков (в отн.
ед. [Бурбаева и др.2007, Burbaeva et al. 2007]) для каждого объекта. Символы распределены в парные колонки: красные для каждой пары символов - больные шизофренией, серым отмечены представители контрольной группы, а горизонтальные линии соответствуют медианам по группам. При сравнении групп больные шизофренией с контрольной с помощью непараметрического теста Манна-Уитни для всех трех белков были получены достоверные различия между группами (ГДГI+II - p=0,002; ГС - р=0,0005; ГСПБ - р=0,0001).
Из данных диаграммы (рис. 8) видно, что в случае ГС и ГСПБ даже при почти двукратном различии медиан группы сильно смешаны между собой: зона перекрытия настолько велика, что лишь 2 контрольных объекта и 7 больных выходят за ее пределы в случае ГС (6 и 9 объектов, соответственно, в случае ГСПБ, т.е. по этому параметру получается лучшее разделение групп).
Как видно, в образцах от двух исследуемых групп наблюдаются количественные различия по ряду параметров, но в случае любого отдельно взятого параметра наблюдается значительное смешение групп. В связи с этим у нас возникло предположение о продуктивности комплексного подхода в анализе биохимических данных.
9810978766554432312ГДГI+II ГС ГСПБ КФК ВВ ГФКБ ОМБ 1Рисунок 8. Относительные количества ГДГI+II, ГС и ГСПБ в мозжечке больных шизофренией (красные символы) и контрольной группы (серые символы).
Обозначения: ГДГ I+II - кружочки, ГС - ромбики, ГСПБ - треугольнички.
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД В ИССЛЕДОВАНИИ БЕЛКОВ МОЗГА Изложенные цели и задачи были ориентированы на выдвигаемую нами гипотезу о том, что уровни метаболизирующих глутамат ферментов и ключевых глиальных белков в различных областях мозга здоровых людей регулируются совместно и взаимосвязаны. Проверке этой гипотезы посвящен следующий экспериментальный раздел.
Вначале был проведен поиск коррелятивных связей между количествами ферментов и глиальных белков в трех разных структурах мозга у лиц контрольной груп Отн.Ед.
Rel. U.
пы. Структуры рассматривали попарно: ПФК/ХЯ, ХЯ/мозжечок и ПФК/мозжечок).
Коррелятивные связи считали достоверными при Р<0,007 (с поправкой для множественных сравнений). В ряде случаев наблюдалась взаимозависимая регуляция количества отдельно взятого белка в разных структурах мозга. Так, уровни ГСПБ достоверно связаны между собой в ПФК и ХЯ (коэффициент корреляции R=0,58). Для каждого из белков - ГСПБ и ГФКБ - наблюдались достоверные корреляции их количества в ХЯ и мозжечке (R=0,57 и R=0,70, соответственно).
В группе больных шизофренией связи, характерные для группы контроля, отсутствовали. Исчезновение коррелятивных связей, типичных для контрольного мозга, свидетельствует о том, что при шизофрении нарушаются регуляторные механизмы, поддерживающие в норме гомеостаз нейромедиаторных систем и глиальных клеток. В то же время, в группе больных, в отличие от контроля, появились новые коррелятивные связи: количество ГС оказалось связанным в ПФК и ХЯ (R=0,54), а ГДГ I+II - в ПФК и мозжечке (R=0,55). Возможно, появление новых связей служит свидетельством включения компенсаторных механизмов в мозге при шизофрении.
СВЯЗИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ ФЕРМЕНТОВ И ДРУГИХ БЕЛКОВ В ТРЕХ СТРУКТУРАХ МОЗГА В КАЖДОЙ ОБСЛЕДУЕМОЙ ГРУППЕ (КОНТРОЛЬ, ШИЗОФРЕНИЯ) Анализ корреляционной матрицы позволил обнаружить достоверные связи (непараметрический анализ - коэффициенты Спирмена с поправкой Бонферрони) между количествами анализируемых ферментов/белков (ГС, ГСПБ, ГДГ I, II и III, КФК ВВ, ГФКБ и ОМБ) в пределах каждой из структур мозга в контрольной группе.
Картина обнаруженных коррелятивных связей схематично изображена на рис. 9.
Аналогично обнаружены достоверные связи в группе больных шизофренией.
Картина коррелятивных связей схематично изображена на рис. 10.
Общая картина коррелятивных связей, очевидно, изменена в группе больных шизофренией по сравнению с контрольной группой.
Рисунок 9. Картина коррелятивных связей между относительными количествами ферментов метаболизма глутамата (ГС, ГСПБ, ГДГ) и других глиальных белков (КФК ВВ, ОМБ, ГФКБ) в трех структурах мозга лиц контрольной группы. Красным показаны связи в префронтальной коре, зеленым - в хвостатом ядре, черным - в мозжечке. Первое число - R, коэффициент корреляции Спирмена, второе - Р.
Жирными линиями на Рис. 9-выделены связи, достоверные после корректировки Бонферрони.
Рисунок 10. Картина корреляционных связей между относительными количествами ферментов метаболизма глутамата (ГС, ГСПБ, ГДГ) и других глиальных белков (КФК ВВ, ОМБ, ГФКБ) в трех структурах мозга больных шизофренией. Красным показаны связи в префронтальной коре, зеленым - в хвостатом ядре, черным - в мозжечке. Стрелками указаны достоверные изменения при шизофрении по сравнению с контролем.
Наблюдения позволили выдвинуть гипотезу о системных нейрохимических изменениях в мозге при шизофрении [Boksha et al., 2006, Boksha, 2007, Бурбаева с соавт. 2007, Burvaeva et al., 2007].
КЛАСТЕРНЫЙ АНАЛИЗ НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ ДАННЫХ Применяя в качестве основной методологии сравнение относительных количеств ферментов метаболизма глутамата и глиальных белков в экстрактах аутопсийных образцов мозга контрольной группы и больных шизофренией, мы обрабатывали нейрохимические данные с помощью статистических методов непараметрического анализа (пользуясь программой Statistica, версия 6.0). С помощью такого подхода была получена информация о достоверных различиях между группами (больных хронической шизофренией по сравнению с контролем) по некоторым отдельным параметрам. Однако, классические методы непараметрического анализа не позволяют составить полной картины, в которую вносили бы вклад все измеряемые параметры.
Таким требованиям (одновременного учета многочисленных разнородных параметров) удовлетворяет кластерный анализ, который представляется адекватным информативным способом описания и обработки информации, полученной нейрохимическими методами.
Действительно, кластерный анализ (с помощью программы Clust - см. методы) 25 параметров-признаков (количества пяти ферментов - ГС, ГСПБ, ГДГ I+II, ГДГ III, КФК ВВ и двух глиальных белков - ГФКБ и ОМБ, определенных в ПФК, ХЯ и мозжечке, а также таких признаков, как возраст, пол, ПМИ и диагноз - отсутствие/наличие шизофрении) на выборке из 44 объектов (лица контрольной группы и больные шизофренией) позволил отделить случаи психически здоровых от больных шизофренией с высокой степенью достоверности (средняя ошибка смешения < 20%, P 0,00004). Таким образом, группы психически здоровые и больные шизофренией объективно составляют различные метаболические типы [Бурбаева и др., 2008]: больные характеризуются повышенными количествами ключевых ферментов метаболизма Глу.
ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОМПОНЕНТОВ ГЛУТАМАТНОЙ СИСТЕМЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Далее описаны экспериментальные подходы к моделированию на тромбоцитах (элементах периферической крови) биохимических закономерностей, установ ленных в ЦНС, и поиск корреляционных связей между количеством ферментов метаболизма Глу в тромбоцитах и тяжестью психической патологии при шизофрении.
ОБНАРУЖЕНИЕ ГСПБ И ИЗОФЕРМЕНТОВ ГДГ В ТРОМБОЦИТАХ ЛИЦ КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ В экстрактах тромбоцитов человека количества иммунореактивной ГС и ассоциированной с мембраной изоформы ГДГ III оказались ниже порога обнаружения методом ECL-иммуноблоттинга с использованием моноклональных (Biogenesis) либо поликлональных [Boksha et al. 2000, Burbaeva et al. 2003] антител соответственно.
Однако, в тромбоцитах человека нам удалось обнаружить ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и два легко растворимых изофермента ГДГ I и ГДГ II [Boksha 2006, Бурбаева и др. 2003, Burbaeva et al. 2006]. Эти ферменты обнаруживаются по специфической активности и иммунореактивности (возможно их количественное обнаружение антителами, полученными к мозговым изоформам этих ферментов) (рис. 11).
Значит, наряду с ранее обнаруженной глутаминазой [Gluck et al 2000], тромбоциты человека содержат ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и две изоформы ГДГ.
Рисунок 11. Картина окрашивания экстрактов тромбоцитов, полученных экстракцией с ДС-Na, в ECL-вестерн-иммуноблоттинге с антителами к ГСПБ (слева) и ГДГ I, II (справа). Числа справа и слева - молекулярные массы субъединиц, посереГСПБ ГДГI,II дине - положения белковых стандартов молекулярных масс.
ГСПБ и ГДГ I+II были обнаружены в количествах, поддающихся сравнительному анализу, у всех обследованных лиц без психической патологии (33 человека, составившие контрольную группу). Относительное количество иммунореактивных белков (ГСПБ, ГДГI+II) в каждом контрольном случае оценивались с использованием калибровочной кривой, построенной с использованием внутреннего стандарта.
ТРОМБОЦИТАРНЫЕ ГСПБ И ГДГ В КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ И У БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ (ДО И В ХОДЕ АНТИПСИХОТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ).
ГСПБ и ГДГI+II были обнаружены в достаточных для сравнительного анализа количествах также и у всех 40 обследованных больных шизофренией. Относительные количества иммунореактивных ГСПБ и ГДГ I+II у каждого больного оценивались и выражались в тех же единицах, что у лиц контрольной группы.
В наших исследованиях проверялась гипотеза о том, что (1) уровень ферментов, метаболизирующих Глу, может быть изменен в тромбоцитах больных шизофренией по сравнению с контролем, и что (2) на этот уровень может влиять лечение атипичным нейролептиком - оланзапином, который, как известно, может модулировать концентрацию Глу в мозге и плазме крови [Goff et al., 2002].
Группы (контроль и больные) были уравнены по возрасту (18 - 63 года) и соотношению представителей обоих полов. Количество ГСПБ и ГДГ I+II измеряли в контрольной группе однократно, а у больных - до и после линтенсивной и поддерживающей фаз лечения.
Хотя количество ГДГI+II в двух группах достоверно не различалось, количество ГСПБ в тромбоцитах больных до начала антипсихотического лечения оказалось достоверно больше, чем в контрольной группе, р<0,01. Отметим, что это согласуется с данными о повышенном уровне ГСПБ в мозге больных шизофренией и может свидетельствовать о системной регуляции экспрессии гена, кодирующего этот фермент.
В контрольной группе наблюдалась корреляционная связь между уровнями ГСПБ и ГДГ (корреляция по Спирмену R = 0,414; Р = 0,02).
В группе больных связь между уровнями ГСПБ и ГДГ была обнаружена до начала антипсихотического лечения (корреляция по Спирмену R= 0,616; Р = 0,00002). Корреляций между количествами исследуемых ферментов и полом или возрастом ни в группе контроля, ни в группе больных не обнаружено (p>0,1).
Вариабельность количества ГСПБ и ГДГ, измеренного до лечения, оказалась высокой, поэтому была выделена подгруппа больных, обладающих изначально уровнем ГСПБ выше медианы по всей группе (т.е. половина всех больных). В этой подгруппе было обнаружено, что уровни ГСПБ достоверно изменяются как после интенсивной, так и после поддерживающей фазы лечения (Р= 0,007 и 0,004, соответственно, метод парных сравнений Вилкоксона). В этой подгруппе в целом общее снижение ГСПБ оказалось достоверным и по критерию Манна-Уитни (P=0,009 и 0,003, соответственно), но после поддерживающей фазы лечения все еще отличалось от контроля (P = 0,0001, U-тест Манна-Уитни). Количество ГДГ в этой подгруппе достоверно изменилось в результате лечения (P = 0,002 и 0,025 после острой и поддерживающей фаз соответственно, метод парных сравнений Вилкоксона), и было неотличимым от контрольной группы (U-тест Манна-Уитни,
0,1).Таким образом, количество ГСПБ и ГДГ достоверно изменяется в ходе лечения больных шизофренией оланзапином, что подтверждает влияние этого атипичного нейролептика на метаболизм Глу и согласуется с известным фактом модуляции оланзапином уровня Глу в мозге и плазме крови больных шизофренией [Goff et al.
2002]. Отмечено также уменьшение разброса уровней ГСПБ и ГДГ (в результате лечения в группе больных уровни ГСПБ не нормализуются, но выравниваются).
В ходе клинического обследования состояние больных оценивалось врачами не только традиционным клинико-психопатологическим методом, но и с помощью психометрической шкалы выраженности позитивных и негативных синдромов шизофрении (PANSS), которая позволяет количественно оценить тяжесть психической патологии и наличие или отсутствие эффекта лечения.
В связи с этим с разрешения врачей клинического отделения НЦПЗ РАМН (руководитель - д.м.н. М.А.Морозова) мы использовали соответствующие количественные показатели для установления клинико-биохимических корреляций. Основные данные суммарной оценки по PANSS в обследованной нами группе больных были следующими: до лечения - 76,5 (54-127) баллов, в фазе интенсивного лечения - 51 (50-102) балл и в фазе поддерживающего лечения - 49 (30-93) баллов.
Клиническая реакция на лечение оланзапином была определена a priori как снижение суммарной оценки по PANSS на 20% и более от начального уровня (до лечения). Эта клиническая реакция была использована в качестве критерия, по которому разделялись больные с выраженным эффектом терапии (лреспондеры) и с отсутствием такового (лнонреспондеры). Проведен анализ т. наз. кривой выживаемости с применением корреляционного регрессионного анализа данных [Реброва, 2002] (Survival Analysis, регрессионная модель программы Statistica 6.0).
Анализ кривой выживаемости в регрессионной модели для всей группы больных позволил определить регрессионный параметр (): для ГСПБ в ходе поддерживающей фазы он составил =Ц 0,00276 (значение t = -2,453, константа с = 2,854, получилось значимое значение критерия хи квадрат = 4,795, p = 0,0285).
Параметр регрессии бета отрицателен, значит, количество ГСПБ и время перехода пациентов в категорию респондер связаны обратной корреляцией, т.е. чем больше количество ГСПБ в тромбоцитах до лечения пациента, тем меньшее время необходимо для перехода этого больного в категорию респондер. Число недель от начала лечения до этого момента связано с количеством ГСПБ, измеренным до начала лечения, следующей зависимостью:
S=exp(2.854-0.00276ХГСПБ), где S - число недель от начала лечения, ГСПБ - количество ГСПБ, измеренное до начала лечения.
ВЫВОДЫ 1) На основании проведенных фундаментальных исследований установлены единство и сопряженность нейрохимических процессов в глутаматергической системе, протекающих на уровне мозга и периферической крови человека - как в норме, так и при развитии психической патологии.
2) Впервые определена аминокислотная последовательность ГС мозга человека, составляющая 24% длины гипотетического продукта трансляции кДНК ГС человека и идентичная имеющейся в базе данных Swiss Prot последовательности ГС печени человека (P15104). Установлено, что по четвертичной структуре ГС мозга человека является гомооктамером.
3) Установлено, что ГДГ мозга человека представлена тремя изоформами (легко растворимые ГДГ I, ГДГ II и ассоциированная с мембранами ГДГ III), которые выделены в электрофоретически гомогенном виде и охарактеризованы биохимически.
4) В ткани мозга человека обнаружен и биохимически охарактеризован ГСПБ, обладающий in vitro трансферазной ферментативной активностью ГС и дающий перекрестную иммунологическую реакцию с антителами, специфичными к ГС мозга животных и человека.
5) Сравнительные исследования экстрактов трех структур аутопсийного мозга - префронтальной коры, хвостатого ядра и мозжечка - выявили различия между этими структурами в количестве ГС и ГДГ Ш: у психически здоровых различается только количество ГС (минимальное - в мозжечке, максимальное - в префронтальной коре), а у больных шизофренией - ГС и ГДГШ (в мозжечке количество этих ферментов меньше, чем в двух других структурах).
Установлены положительные корреляционные связи как между концентрациями отдельных ферментов метаболизма глутамата, так и этих ферментов с уровнями глиальных белков: КФК ВВ, ГФКБ. Эти корреляционные связи характерны для каждой структуры мозга, при этом общая картина связей различается у здоровых и больных шизофренией.
Типы метаболизма глутамата различаются у психически здоровых людей и больных шизофренией: в мозге больных достоверно повышено количество ГС, ГСПБ и ГДГ по сравнению со здоровыми.
6) Методами определения ферментативной активности и ECL-иммуноблоттингом в тромбоцитах крови выявляются ГСПБ и изоформы ГДГ I и II. ECLиммуноблоттинг позволяет определить относительные количества ГСПБ и изоферментов ГДГ в тромбоцитах крови. У больных шизофренией количество ГСПБ в тромбоцитах выше, чем у здоровых.
7) Изменения количества ГСПБ и ГДГ при шизофрении по сравнению с контролем обнаруживаются в мозге и элементах периферической крови, что позволяет говорить о нарушениях метаболизма глутамата при шизофрении в организме в целом, т.е. как на гуморальном, так и на мозговом уровнях.
8) Количество ГСПБ и ГДГ достоверно изменяется в ходе антипсихотического лечения, что свидетельствует о влиянии такой терапии на метаболизм глутамата.
Изучение влияния атипичного нейролептика оланзапина позволяет предположить, что его эффект связан с действием на глутаматную систему (помимо известного действия на другие нейромедиаторные системы).
9) Результаты работы подтверждают правомочность существования глутаматной гипотезы патогенеза шизофрении, которая может быть представлена следующим образом: в патогенезе шизофрении играют роль не только рецепторы и переносчики глутамата, но также ферменты обмена глутамата. При этом особенности метаболизма глутамата при шизофрении состоят в изменениях количества ключевых метаболических ферментов в мозге и крови больных по сравнению с психически здоровыми лицами, а также в изменениях корреляционных связей между концентрациями этих ферментов в мозге больных по сравнению с психически здоровыми.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Бокша И.С., Данилов В.С., Лебедева Н.В. Биосенсор для экспресс-анализа ионов аммония. // Биологические науки (МГУ).- 1992.- №5.-С. 71-2. Бокша И.С., Данилов В.С. Ферментативный способ определения ионов аммония в растворе.
Авт. Свидет-во:1752766 бюлл. No:9229, 05.11.193. Бокша И.С. Глутаминсинтетаза мозга человека. // Нейрохимия (Москва). Ц1995.-Т.12, №2.С.62-63.
4. Бокша И.С., Бурбаева Г.Ш., Терешкина Е.Б. Очистка и некоторые свойства глутаминсинтетазы мозга человека. // Биохимия. Ц1995.-Т.60,№10.-С. 1299-1303.
5. Tereshkina E.B., Boksha I.S., Burbaeva G.Sh. Metal ion actions on the activity of human brain glutamine synthetase. 8-th International Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Soc., Martin, Slovakia (Proceedings) 1996.-P.34.
6. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Burbaeva G.Sh. Partial primary structure of human brain glutamine synthetase. //J. Neurochemistry.-1998.-V. 71S1.-P. S84A.
7. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K. Biochemical approaches to the brain glutamate metabolism study in schizophrenia. // Schizophrenia Res..-1999.-V.36, N1-3.-P. 70.
8. Бокша И.С., Терешкина Е.Б., Турищева М.С., Савушкина О.К., Воробьева Е.А., Бурбаева Г.Ш.
Гетерогенность глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы мозга человека. Тезисы докладов конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга". Ц1999.-М.- С.16.
9. Boksha I. S., Tereshkina E. B., Burbaeva G. Sh. Glutamine synthetase and glutamine synthetase-like protein from human brain: Purification and comparative characterization. //J. Neurochemistry.-2000.V.75.-P. 2574-2582.
10. Терешкина Е.Б., Бокша И.С., Савушкина О.К., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза и белок, подобный глутаминсинтетазе, во фронтальной коре больных шизофренией. //Ж. Невропатол. и психиатрии им. C.C. Корсакова. - 2000.-№.7.-С. 51-53.
11. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Burbaeva G.Sh. Alterations of glutamine synthetase levels in schizophrenic posterior cingulate cortex. //Schizophrenia Res.-2000.- V.41.N1.- P. 256.
12. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Savushkina O.K., Tereshkina E.B. Increase of glutamate dehydrogenase level in frontal and cingulate cortex in schizophrenia. // Schizophrenia Res. - 2000.- V.41,N1.-P. 255.
13. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С., Савушкина О.К., Терешкина Е.Б., Воробьева Е.А. Нарушение метаболизма глутамата в мозге при психической патологии (болезни Альцгеймера и шизофрении). //Вестник РАМН.- 2001.-т.7.-С. 34-37.
14. Burbaeva G. Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Vorobyeva E.B., Morozova M.A., Jarkova N.B., Turishcheva M.S., Savushkina O.K. Glutamate dehydrogenase immunoreactivity in platelets in schizophrenia. // World J. Biol. Psychiatry. Ц2001.- V.3S1.-P. 32.
15. Бокша И.С., Шёнфельд Г.-И., Ланген Х., Мюллер Ф., Терешкина Е.Б., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза мозга человека: октамерная структура и гомология с глутаминсинтетазой печени человека. //Биохимия.- 2002.-т. 67.-С.1012-1020.
16. Boksha I.S., Burbaeva G.Sh., Savushkina O.K. Comparative studies of brain creatine kinase levels in various brain cortex areas in schizophrenia by ECL-immunoblotting with the use of monoclonal antibody. Boksha I.S., Savushkina O.K., Burbaeva G.Sh.. NATO Advanced Research Workshop Creatine Kinase and Brain Energy Metabolism: Function and Disease 2003 Tbilisi, Georgia, June 14-18, 20( 17. Burbaeva G. Sh., Turishcheva M.S., Vorobyeva E.B., Savushkina O.K., Tereshkina E.B., Boksha I.S. Diversity of glutamate dehydrogenase in human brain. // Prog. Neuropsyhopharmacol. Biol. Psychiatry. Ц2002.-V.26,N3.-P. 427-435.
18. Boksha I. S., Schnfeld H.-J. Human brain glutamine synthetase-like protein is homologous to collapsin response mediator protein-2. In: The Internat. J. Neuropsychopharmacology.-2002.-V.5, S.1, S191, Abstracts from the XXIII CINP Congress, Montral, Canada, 23-27 June, 2002.
19. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K. Vorobyeva E.A., Prokhorova T.A. Glial glutamate metabolizing enzymes in frontal cortex of patients with schizophrenia. V-th European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease. //Glia.- 2002. V.S.1.P.S80.
20. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С., Терешкина Е.Б., Воробьева Е.А, Савушкина О.К. Метаболизирующие глутамат ферменты в мозге и тромбоцитах больных шизофренией.
//Сибирский Вестник Психиатрии и наркологии.-2003.-т.1,№27.-С.36-39.
21. Burbaeva G. Sh., Savushkina O.K., Boksha I.S. Comparative study of creatine kinase BB decrease in brain of patients with AlzheimerТs disease and schizophrenia. // NATO Science Series, IOS Press, Netherlands.- 2003.-V. 342.-P. 125-132.
22. Burbaeva G. Sh., Savushkina O.K., Boksha I.S. Creatine kinase BB in brain in schizophrenia.
//World J. Biol. Psychiat. Ц2003.-V.4.-P. 177-183.
23. Burbaeva, G. Sh., Boksha, I.S., Turishcheva, M. S., Vorobyeva, E.A., Savushkina, O. K., TereshTereshkina, E. B. Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in prefrontal cortex of patients with schizophrenia. //Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry.-2003.- V.27.-P. 675-680.
24. Burbaeva G. Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Vorobyeva E.A., Prokhorova T.A. Glial glutamate metabolizing enzymes in cingulate cortex in schizophrenia. // Glia. Ц2003.-V.S2.-P. 65.
25. Бокша И.С. Взаимосвязь нейронов и глиальных клеток через метаболизм глутамата в мозге здоровых людей и больных психическими заболеваниями.//Биохимия.Ц2004.- т. 69,№7.-С.869886.
26. Burbaeva G.Sh.; Boksha I.S.; Tereshkina E.B.; Savushkina O.K.; Starodubtseva L.I.; Turishcheva M.S. Glutamate metabolizing enzymes in prefrontal cortex of AlzheimerТs disease patients. //Nerochem.
Res. Ц2005.- V.30, N11.-P.1443-1451.
27. Burbaeva G.Sh.; Boksha I.S.; Morozova M.A., Starodubtseva L.I., Tereshkina E.B. Platelet GSLP as a predictor of olanzapine efficacy in schizophrenia. //World J. Biol. Psychiat.-2005.-V.6(S1).P.249228. Бокша И.С. Биохимические аномалии при аутизме. //Аутизм и нарушения развития. Ц2005.- Т.72, №2.-С.1-24.
29. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Савушкина О.К., Стародубцева Л.И., Терешкина Е.Б., Турищева М.С., Брусов О.С., Каледа В.Г., Цуцульковская М.Я., Морозова М.А. Компоненты глутаматной системы в крови больных шизофренией: прогностическая ценность и корреляция с клиническими параметрами. // II Национальный конгресс по социальной психиатрии Социальные преобразования и психическое здоровье Труды. Ц2006.- С.170.
30. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Терешкина Е.Б., Савушкина О.К., Турищева М.С., Стародубцева Л.И., Брусов О.С., Морозова М.А.. Мониторинг ферментов метаболизма глутамата в тромбоцитах больных шизофренией в ходе лечения оланзапином. Научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 25-летию ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН Психическое здоровье населения Сибири и Дальнего Востока Труды. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. Ц2006.-Т.41.- С.57-58.
31. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Turishcheva M.S., Starodubtseva L.I., Brusov O.S., Morozova M.A. Effect of olanzapine treatment on platelet glutamine synthetase-like protein and glutamate dehydrogenase immunoreactivity in schizophrenia. //World J. Biol.
Psychiat. Ц2006.-V.7,N2.-P.75-81.
32. Boksha I.S. Glutamine synthetase-like protein in brain and blood of patients with schizophrenia.
Wellcome Trust Advanced course in Molecular Neurology and Neuropathology, UK, Proceedings.
2006.- Р.18.
33. Boksha I.S., Burbaeva G.Sh., Savushkina O.K., Starodubtseva L.I., Tereshkina E.B., Turishcheva M.S. Glutamate Metabolism in Schizophrenia: Systemic Approach. //Abstracts of International Conference on Mood Disorders, Istanbul, Turkey.- 2006.- P. 90.
34. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Стародубцева Л.И., Савушкина О.К., Терешкина Е.Б., Турищева М.С., Прохорова Т.А., Воробьева Е.А., Морозова М.А. Нарушение метаболизма глутамата при шизофрении, наблюдаемое в мозге и тромбоцитах периферической крови. // Вестник РАМН. - 2007.-Т. 3.-С. 19-24.
35. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Воробьева Е.А., Морозова М.А., Прохорова Т.А., Савушкина О.К., Стародубцева Л.И., Терешкина Е.Б., Турищева М.С. Системные биохимические нарушения при шизофрении: метаболизм глутамата. // Психиатрия. Ц2007.-Т. 4, №28.- С.72-78.
36. Boksha I.S., Burbaeva G.Sh., Tereshkina E.B. Systemic biochemical alterations in brain in schizophrenia. 39th Annual General Meeting of the European Brain and Behaviour Society. 2007. Trieste, Italy. 37. Burbaeva G.S.; Boksha I.S.; Tereshkina E.B.; Savushkina O.K.; Starodubtseva L.I.; Turishcheva M.S., Mukaetova-Ladinska E.B. Systemic neurochemical alterations in schizophrenic brain: glutamate metabolism in focus. // Neurochemical Res. Ц2007.- V.32, N9.-P. 1434-1444.
38. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Судаков С.А., Мясоедов С.Н., Савушкина О.К., Терешкина Е.Б., Стародубцева Л.И., Турищева М.С., Воробьева Е.А. Использование кластерного анализа омплексной нейрохимической оценки глиальных метаболических ферментов и мажорных белков в мозге психически здоровых лиц и больных хронической шизофренией. // Ж. Неврол. психиатрии им. C.C. Корсакова [2008 №2].
39. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Савушкина О.К., Терешкина Е.Б., Стародубцева Л.И., Турищева М.С., Воробьева Е.А. Ферменты метаболизма глутамата в тромбоцитах больных шизофренией.
Конференция Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии. Труды. 2007. С.
319-320.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ MALDI TOF-МС - Времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией с матрицы и ионизацией MSOX - метионинсульфоксимин NAAG - N-ацетиласпартилглутамат NMDA - N-метил-D-аспартат PANSS - positive and negative syndrome scale -КГ - -кетоглутаровая кислота ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГАМК - -аминомасляная кислота ГДГ - глутаматдегидрогеназа Глу - глутаминовая кислота ГС - глутаминсинтетаза ГСПБ - белок, подобный глутаминсинтетазе ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок ДС-Na - додецилсульфат натрия ИЭТ - изоэлектрическая точка ИФА - иммуноферментный анализ КФК ВВ - мозговая изоформа креатинкиназы ОМБ - основной миелиновый белок ПААГ - полиакриламидный гель ПМИ - постмортальный интервал ПФК - префронтальная кора ХЯ - хвостатое ядро ЦНС - центральная нервная система ЭФ - электрофорез Features of glutamate metabolism in schizophrenia The fundamental research has enabled to reveal unity and coupling between neurochemical processes at the levels of human brain (HB) and peripheral blood in norma and mental pathology. Enzymes involved in HB glutamate (Glu) metabolism, such as glutamine synthetase (GS) and Glu dehydrogenase (GDH) have been studied. Partial (~1/4) amino acid sequence of HB GS proved to be identical to that of human liver GS; quaternary structure of HB GS is octameric. Three isoenzymes of HB GDH (readily soluble GDH I, II, and membrane-associated GDH III) are purified to apparent homogeneity on 1-D electrophoresis and characterized. GS-like protein (GSLP) is revealed in HB tissue, purified and characterized. Like GS, GSLP possesses in vitro specific enzymatic activity and crossreactivity with antibodies to animal- and HB GS. Comparative immunochemical study of extracts from postmortem HB prefrontal cortex (PFC), caudate nucleus (CN), and cerebellum (CER) has revealed differences between these structures in GS and GDH III amounts:
only GS is different in mentally healthy controls (with minimum in CER, and maximum in PFC), and both - GS and GDH III - in schizophrenia (SCH) patients (minimum in CER).
Amounts of Glu metabolizing enzymes are linked together with positive correlative links, as well as the levels of these enzymes are linked with amounts of glial proteins, such as creatine phosphokinase and glial fibrillary acidic protein (GFAP). These correlative links are typical for each brain structure, whereas general pattern of links in controls differs from that in SCH. Concerted regulation of GSLP level is found in PFC and CN, and both, GSLP and GFAP levels, are subjected to concerted regulation in CN and CER in controls, but not in SCH patients. Healthy controls differ from SCH patients in types of brain Glu metabolism: total amounts of GS, GSLP, and GDH are elevated in the patients. GSLP and GDH I and II are detected in platelets by enzymatic activity and ECL-immunoblotting, which enables to compare relative amounts of platelet GSLP and GDH: GSLP amount in SCH is higher than in control. Changes in GSLP and GDH levels in SCH compared with controls are found in HB and peripheral blood thus enabling to judge of Glu metabolism impairment in whole organism in SCH, both at humoral and brain levels. Changes in GSLP and GDH amounts found in the corse of antipsychotic treatment suggest the influence of such therapy on Glu metabolism; the effect of olanzapine is likely associated with its influence on Glu system in addition to its known effects on other neurotransmitter systems. The results of the study confirm validity of glutamate hypothesis of SCH pathogenesis, which can be presented as follows: enzymes of Glu metabolism play an important role comparable with that of Glu receptors and transporters in SCH pathogenesis, wherein the features of Glu metabolism in SCH comprise the elevation in amounts of key enzymes in HB and blood of patients with SCH compared with controls.