Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

РОМАНОВ Дмитрий Викторович

ОСОБЕННОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ПРОТЕИН-КОДИРУЮЩИХ ГЕНОВ

У ALLIUM CEPA L. И  ALLIUM FISTULOSUM L.

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хрусталева Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

Поляков Владимир Юрьевич доктор биологических наук, профессор, МГУ имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.аБелозерского, отдел электронной микроскопии, заведующий отделом

Кан Людмила Юрьевна кандидат сельскохозяйственных наук, ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, лаборатория генетики и цитологии, заведующая лабораторией

а

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

Защита состоится л28 ноября 2012 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, тел./факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им.аН.И.аЖелезнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан л26 октября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета  Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность  темы. Лук репчатый (Allium cepa L.) является второй самой важной овощной культурой, уступая лишь томату (FAO, 2010). Лук входит  в ежедневное меню питания человека. В нашей стране его выращивают на 12% площадей открытого грунта, занятых под всеми овощными культурами (Кокорева, Титова, 2007). Химический состав луковиц и зеленых листьев включает в себя множество полезных веществ. Обилие витаминов и их удачная комбинация  в луке способствуют профилактике многих заболеваний. Исследования последних лет показали, что содержащиеся в луке сульфорганические соединения обладают выраженным противораковым  эффектом и снижают агрегацию тромбоцитов, т.е. предупреждают образование тромбов (Imai et al., 2002; Голубев и др., 2003).

На сегодня в мире в селекции лука репчатого существует большая проблема обедненного генофонда этой культуры, как результат более 5000-летнего периода целенаправленной селекции и утери при этом ряда ценных признаков. В современной селекции лука репчатого близкородственный вид лук-батун (Allium fistulosum L.) является уникальным источником многих ценных признаков (высокое содержание сухого вещества, холодостойкость, устойчивость к ржавчине, шейковой гнили, луковой мухе, корневой гнили), которые могли бы быть использованы для создания новых сортов лука репчатого.

Необычайно огромный геном лука (1С = 16а415 млн. п.н.) является главной причиной, по которой задерживается создание генетических ресурсов для этого экономически и филогенетически важного растения. Геном лука в 103 раза больше генома арабидопсиса, в 34 и  6 раз больше генома риса и кукурузы, соответственно (King et al., 1998).

Исследования  последних лет по организации и эволюции генома растений  с крупным геномом показали, что плотность генов увеличивается по направлению к дистальному концу хромосомы и коррелирует с чаcтотой рекомбинаций (Akunov et al., 2003; Khrustaleva et al., 2005). В связи с этим возникает вопрос  об организации генов у таких видов, как  A. cepa  и A. fistulosum, которые диаметрально отличаются  по распределению частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы (Albini et al., 1988). У A. cepa точки рекомбинации локализованы в дистальном и интерстициальном регионах, a у A. fistulosum - вблизи центромерного района.

Недавно было установлено, что положение гена на хромосоме играет важную роль  в изменении признаков и эволюции  организмов (Rockman et al., 2010). Возможность увидеть ген/гены на физической хромосоме и сравнительный анализ положения гена на хромосоме у разных видов, объединенных в определенную таксономическую группу, значительно обогатят наши знания в области функциональной и сравнительной геномики и эволюции видов. 

Учитывая масштабы выращивания лука, его ценность как продукта питания и как сырья для фармацевтической индустрии, являются актуальными расширенные исследования  по изучению его генома, клонированию, секвенированию и физическому картированию генов.

Цели и задачи работы. Цель работы - изучить особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у A. cepa  и A. fistulosum.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

  1. Провести биоинформатический анализ ДНК сиквенсов лука, размещённых в международном банке данных  (NCBI) и нуклеотидных последовательностей  EST клонов лука в двух имеющихся у нас EST библиотеках;
  2. Провести клонирование 700 EST клонов в E. coli, выделение плазмидной ДНК и приготовление меченных ДНК проб для гибридизации in situ;
  3. Усовершенствовать метод приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом A. cepa  и A. fistulosum для молекулярно-цитогенетических исследований;
  4. Провести Tyramide-FISH локализацию 631 EST клона на хромосомах  A. cepa  и A. fistulosum и сделать сравнительный анализ локализации генов на хромосомах этих двух близкородственных видов;
  5. Провести картирование индивидуальных EST  клонов на хромосомах A. cepa  с помощью Tyramide-FISH;
  6. Подобрать праймеры на известные нуклеотидные последовательности генов аллиназы, фактора элонгации 1B-  и -комплекса зарождающегося полипептида. Получить ПЦР-продукты с подобранными праймерами и геномной ДНК A. cepa  и A. fistulosum;
  7. Провести клонирование и секвенирование экзон-интронных фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1B-  и -комплекса зарождающегося полипептида;
  8. Провести Tyramide-FISH-картирование экзон-интронных последовательностей фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1B-  и -комплекса зарождающегося полипептида;
  9. Провести интегрирование сконструированных физических карт и ранее полученных генетических карт A. cepa.

Научная новизна. Впервые проведены широкомасштабные исследования по хромосомной организации протеин-кодирующих генов на луковых: проведен  сравнительный  анализ распределения 631 EST клона на физических хромосомах  у A. cepa  и A. fistulosum.  Впервые физически картирован ген (EST клон API66), кодирующий транспортазу сахарозы  A. cepa и  установлено положение генов семейства транспортаз сахарозы на физических хромосомах A. cepa. Впервые с помощью Tyramide-FISH физически картированы на хромосомах  A. cepa ген аллиназы (экзон-интронный фрагмент) и ген (EST клон API20), кодирующий светопоглощающий белок 3. Впервые клонированы, секвенированы и физически картированы на хромосомах A. cepa  и A. fistulosum экзон-интронные фрагменты генов фактора элонгации 1B-  и -комплекса зарождающегося полипептида. Впервые проведено интегрирование созданных ранее генетических карт A. cepa и физических карт, полученных нами с помощью молекулярно-цитогенетического картирования генов на хромосомах A. cepa,  что позволило  установить положение маркеров относительно теломеры и центромеры на физической хромосоме и определить физическое расстояние между ними.

Практическая значимость. Физическое картирование генов позволяет определить точное местонахождение конкретного гена на хромосоме, связать физическую и генетическую карты, что дает возможность  определить  распределение частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы и тем самым установить  положение гена относительно частоты рекомбинации.

Результаты работы могут быть использованы в селекции лука. Полученные знания о физическом положении генов на хромосомах позволяют прогнозировать возможности их переноса от одного генотипа к другому, определять размеры селекционной популяции, время и экономические затраты на получение нужных форм.

Полученные интегрированные карты  могут быть использованы при секвенировании генома лука. Наличие интегрированных карт намного облегчает процесс секвенирования, что было наглядно показано при секвенировании генома человека (Yu et al., 2001), риса (Chen et al., 2002) и томата (Szinay et al., 2008).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XI молодежной научной конференции, секция Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 2011), XII Международной научно-практической конференции Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности (Санкт-Петербург, 2011), II Международной школе-конференции молодых учёных Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях (Москва, 2011), 35-й Международной конференции студентов сельскохозяйственной и ветеринарной медицины (Сербия, Нови-Сад, 2011), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011), 6-ом Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), Международной конференции: Молекулярное картирование и селекция с помощью маркеров (Вена, Австрия, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков, 5 таблиц, 1 приложение. Диссертация состоит из разделов Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследований и их обсуждение, Выводы, Заключение, Список литературы, Список иллюстративного материала и Приложения. Список литературы включает 162 источника, из них 146 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: лук репчатый A. сера сорт Халцедон и лук-батун A. fistulosum сорт Русский зимний. Семена данных растений были произведены агрофирмой Гавриш.

Выделение ДНК. Выделение ДНК из проростков проводили CTAB-методом согласно Rogers & Bendich (1988) с некоторыми модификациями.

Клонирование кДНК. EST-клоны, используемые в данной работе, были получены из двух кДНК-библиотек. Первая была синтезирована из неизвестных тканей и клонирована в pUC-13 векторе в Native Plants, Inc. (NPI), Salt Lake City, Utah (обозначаются префиксом API). Вторая кДНК-библиотека была синтезирована из тканей луковицы A. cepa и клонирована в векторе pPCR-ScriptTM Amp SK(+) в Plant Research International, Wageningen, The Netherlands (обозначаются префиксом PRI).

Трансформацию клеток E. coli проводили векторами pUC-13 и pPCR-ScriptTM Amp SK(+), несущими вставки кДНК, на электропораторе MicroPulser. Отбор колоний, несущих вектор со вставкой кДНК, проводили на селективной питательной среде с добавлением ампициллина и X-Gal.

Дизайн праймеров. Для подбора праймеров использовалась программа Primer3. Праймеры All1.8(L), All1.8(R) подбирались на нуклеотидную последовательность L48614.1 (ген аллиназы A. сера) (GenBank).

Праймеры API15_1(L), API15_1(R), API15_2(L), API15_3(R) подбирали на нуклеотидную последовательность BE205550.1 (кДНК клон API15 с гомологией к фактору элонгации 1B-) (GenBank).

Праймеры API59_1(L), API59_1(R), API59_2(L), API59_2(R) подбирали на нуклеотидную последовательность BE205590.1 (кДНК клон API59 с гомологией к -комплексу зарождающегося полипептида) (GenBank).

Клонирование ПЦР-продуктов. Клонирование полученных ПЦР-продуктов было проведено с помощью коммерческого набора  pGEMо-T Easy Vector System (Promega, USA) согласно прилагаемому протоколу. Трансформацию клеток E. coli  проводили вектором pGEMо-T Easy с различными вставками  ПЦР продуктов на электропораторе MicroPulser. Отбор колоний, несущих вектор со вставкой кДНК, проводили на селективной питательной среде с добавлением ампициллина и X-Gal.

Приготовление препаратов митотических хромосом. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом A. cepa и A. fistulosum проводилось согласно Pijnacker et al. (1984) и Бочков и др. (1989) с некоторыми модификациями, а именно, использование гидроксимочевины для синхронизации клеточного цикла, использование в качестве цитостатика закиси азота под давлением 10 атмосфер, применение низких температур для улучшения ферментной мацерации тканей и разброса хромосом на цитологических препаратах.

Приготовление ДНК-пробы. Выделение плазмидной ДНК проводилось  с использованием коммерческого набора реактивов The GeneJETЩ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, USA), согласно прилагаемому протоколу.

Мечение плазмидной ДНК проводилось методом Nick-трансляции с использованием DIG-Nick Translation Mix (Roche, Germany) согласно прилагаемой инструкции.

Флуоресцентная in situ гибридизация (Tyramide-FISH). Предгибридизационную обработку слайдов и гибридизацию проводили по Kuipers et al. (1997) с некоторыми модификациями. Tyramide-FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) процедура была проведена согласно Khrustaleva & Kik (2001) с некоторыми модификациями.

Микроскопия и анализ изображения.  Препараты хромосом были просмотрены  с помощью микроскопа Zeiss AxioImager M1, снабженного фильтрами для детекции FITC и DAPI, ультрафиолетовой лампой HBO мощностью 100 Вт., а также  соединенной с компьютером цифровой камеры AxioCam. Морфометрия и кариотипирование метафазных пластинок были проведены с помощью программ AxioVision v.4.6, Isis v.5.ru и MicroMeasure v.6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ ДНК сиквенсов луков, размещённых в международном банке данных  (NCBI). BLASTX анализ библиотек EST клонов, полученных из луковичной ткани A. cepa

Проведенный нами анализ базы данных  на сервере NCBI показал, что накоплено всего лишь около 54000 различных последовательностей ДНК для A. cepa, включая 20180 EST. Геном A. fistulosum представлен в NCBI ещё меньшим числом - 728 последовательностей (данные на 22.10.2012).

Проведенный BLASTX анализ  показал, что транслируемые аминокислотные последовательности с некоторых EST клонов гомологичны к белкам, принадлежащим следующим семействам: рибосомальных белков, пероксидаз, белков ионных каналов, трансфераз и киназ (рисунок 1).  Так как в клетке практически всегда присутствует очень большое количество рибосом, то не удивительно, что значительную часть среди EST, составляют EST, аминокислотная последовательность которых имеет гомологию к рибосомальным белкам. Если рассматривать функции найденных белков, то следует отметить, что большая часть белков относится к белкам общего метаболизма клетки.

Рисунок 1. Процентное соотношение белков, соответствующих EST клонам в имеющейся библиотеке

Используя программу CENSOR (Jurka et al., 2005), было проверено 43 EST клона, случайно отобранных из всех имеющихся EST клонов. Оказалось, что из 43 анализируемых сиквенсов 9 (21%) имели внутри своей последовательности фрагменты ДНК (50-60 п.н.) гомологичные (на 70-80%) к каким-либо повторам, известным как у растений, так и у животных (таблица 1).

Таблица 1. Результаты поиска гомологии сиквенсов EST к сиквенсам повторяющихся элементов

EST клон

Тип повтора

Организм с гомологичным повтором

ALED9

Gypsy-подобные элементы

Oryza sativa

ALRD7

LTR Ретротранспозон

Schmidtea mediterranea

ALVC7

Ретровирус-подобный повтор класса 1

Monodelphis domestica

ALVE3

Gypsy повтор

Zea mays

ALWA7

Ретровирус-подобный повтор класса 1

Monodelphis domestica

ALWE7

HERV19 Ретровирус-подобный повтор класса 1

Homo sapiens

ALXG5

Повтор из семейства Polinton ДНК транспозонов

Strongy locentrotus

ALBD10

Non-LTR Ретротранспозон

Crithidia fasciculata

Таким образом, проведенный на первом этапе работы биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей EST клонов в двух имеющихся у нас библиотеках  позволил найти в базах данных аминокислотные последовательности белков, гомологичные последовательностям, транслируемым in silico с сиквенсов EST клонов. Так же была получена информация о наличии в ряде EST клонов последовательностей ДНК с частичной гомологией к повторам, которая позволила исключить эти клоны из исследований и  избежать сложностей с их картированием in situ.

2.  Сравнительный анализ Tyramide-FISH локализации 631 EST клона на хромосомах  A. cepa  и A. fistulosum 

Была проведена in situ гибридизация 631 EST клона с ДНК метафазных хромосом A. cepa и A. fistulosum (рисунок 2).  EST-библиотеки были разделены на 26 гибридизационных смесей, в каждой по 11-25 случайных EST-клонов. Был проведен анализ распределения сайтов гибридизации  на хромосомах  этих двух близкородственных видов  (таблица 2). У A. cepa большая часть сайтов гибридизации ESTs  была выявлена в дистальных и интерстициальных регионах. У A. fistulosum большая часть сайтов гибридизации ESTs  была выявлена в проксимальных и интерстициальных регионах.

 

Рисунок 2. Tyramide-FISH-картирование 11 EST-клонов из кДНК-библиотеки лука репчатого на хромосомах A. cepa (а) и A. fistulosum (б)

Таблица 2. Обобщенные данные  Tyramide-FISH картирования 631 EST клона: количество и распределение сайтов гибридизации EST вдоль физических хромосом  A. cepa и A. fistulosum

Регион хромосомы

Проксимальный

Интерстициальный

Дистальный

Всего

A. cepa

121*

201

286

608

19.9%**

33.1%

47.0%

100%

A. fistulosum

261

241

119

621

42.0%

38.8%

19.2%

100%

*количество сайтов гибридизации, **% от общего числа выявленных сайтов гибридизации

Ранее проведенный английскими исследователями анализ распределения событий кроссинговера показал, что  92,6 % хиазм у A. fistulosum расположены в проксимальных регионах, и,  наоборот, у A. cepa  97,9% хиазм расположены в дистальных и интерстициальных регионах (Albini & Jones, 1988). Таким образом, предположение, что виды с проксимальным положением рекомбинаций могут иметь противоположный градиент распределения генов вдоль хромосомы (Akhunov et al., 2003), подтверждается результатами нашей работы.

Полученные данные физического картирования генов показывают, что хромосомная организация луковых отличается от хромосомной организации других однодольных с крупным геномом. Однако, на основе числа проанализированных EST клонов мы можем сделать выводы только об организации небольшой части экспрессирующихся генов. Кроме того, выявляемые нами флуоресцирующие сигналы могут исходить не только из мест локализации экспрессирующихся генов, но и быть результатом гибридизации  ДНК  пробы с  последовательностями с высокой гомологией, например, псевдогенами или другими молчащими копиями экспрессирующихся генов. Было показано, что  высоко экспрессирующиеся гены, могут иметь несколько псевдогенов до 5% от общего числа  EST-соответствующих генов (Harrison et al., 2001).

3. Картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах  A. cepa 

3.1. Картирование EST  клона с гомологией к транспортазе сахарозы

Сахароза - основной углевод, транспортируемый по флоэме большинства растений, включая луковые (Hayashi et al., 1990). Количество сахара в листьях луковых колеблется от 1,3 до 5,1 %, а в луковицах Ч от 4,5 до 21,4 % (Казакова, 1970). Транспортазы сахарозы  важны как для поступления сахарозы во флоэму из питающих тканей, так и для подачи сахарозы в нуждающиеся клетки.

В результате  Tyramide-FISH  анализа митотических метафазных хромосом A. cepa  было выявлено 25 сайтов гибридизации EST-клона API66, несущего вставку гена транспортазы сахарозы (рисунок 3). Сигналы встречались на всех хромосомах.

Рисунок 3. Tyramide-FISH c EST-клоном API66 с гомологией к транспортазе сахарозы на хромосомах A. cepa (а); Идиограмма кариотипа A. cepa с положениями сигналов гибридизации EST-клона API66 (б)

Ген транспортазы сахарозы принадлежит к большому суперсемейству генов у растений с высокой гомологией ДНК внутри подсемейств и между отдельными подсемействами (Shiratake, 2007). Этим объясняются полученные множественные сайты гибридизации in situ в наших экспериментах с учетом параметров  жесткости гибридизации и отмывки (80%). Подобная организация генов, кодирующих  транспортазу сахарозы, показана на арабидопсисе, где установлено 24 локуса генов этого семейства на всех хромосомах, и на рисе, у которого найдено 20 локусов на всех хромосомах (NCBI, 2012).

3.2 Физическое картирование EST с гомологией к светопоглощающему белку 3

В анализируемой EST-библиотеке только один клон API20 был генетически картирован ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 1 (Martin et al., 2005). В результате Tyramide-FISH  анализа митотических метафазных хромосом A. cepa  был выявлен также один сайт гибридизации EST клона API20, гомологичного светопоглощающему белку 3. Эти данные согласуются с данными генетической карты Martin et al. (2005). Результаты интегрирования физической и генетической карт представлены на рисунке 4.

 

Рисунок 4. Tyramide-FISH c EST-клоном API20 с гомологией к светопоглощающему белку 3 на хромосомах A. cepa (а); Интегрирование  положения  маркера API20-E5-4.3/3.0 на генетической  карте (Martin et al., 2005) (б) и  положения соответствующего ему EST клона API20 на хромосоме 1 (в)

4. Картирование экзон-интронных последовательностей генов Ц продуктов ПЦР с геномной ДНК

Нами был применен новый подход в создании меченной ДНК пробы для гибридизации in situ, который заключается в использовании существующей базы данных (GenBank NCBI) для дизайна праймеров с целью получения фрагментов ДНК, включающих не только экзоны, как в EST, но и интроны. Этот подход позволил на порядок увеличить специфичность гибридизации, благодаря присутствию в пробе более вариабельной последовательности интронов. Одновременно  возросла чувствительность метода за счет увеличения размеров ДНК-мишени.

4.1 Клонирование фрагмента гена аллиназы и его физическое картирование

Фрагмент гена аллиназы был получен с помощью ПЦР, в которой  использовали геномную ДНК A. cepa и  праймеры All1.8 (рисунок 5) на  экзон-интронную  последовательность гена аллиназы (номер в GenBank L48614.1).

  1092 п.н.

Рисунок 5. Схематическое изображение фрагмента гена аллиназы, ограниченного праймерами All1.8

Был получен ПЦР продукт размером приблизительно 1100 п.н.  Длина ПЦР продукта совпадала с теоретически ожидаемым размером (рисунок 5).

Для определения нуклеотидной последовательности амплифицированного ПЦР продукта было проведено клонирование в плазмидном  векторе pGEM-T с последующим отбором клонов и их секвенированием. Нуклеотидные последовательности были проанализированы, используя программу BLASTN, с помощью которой был проведен  поиск в базе данных GenBank (NCBI). В результате была установлена идентичность полученной нами нуклеотидной последовательности (размером 1092 п.н.) к  нуклеотидной последовательности фрагмента гена аллиназы A. cepa.

Анализ положения сигналов, исходящих от сайтов гибридизации фрагмента гена аллиназы, показал наличие сигнала на хромосоме 4 в дистальном регионе длинного плеча в положении 74,4% 1 (рисунок 6). На менее конденсированных хромосомах было выявлено два сайта гибридизации пробы, что  может указывать на наличие двух локусов гена аллиназы.

Наши данные согласуются с работами по генетическому картированию данного гена, где также было показано наличие двух копий, относящихся к одной группе сцепления на хромосоме 4 (Martin et al., 2005). Результаты интегрирования физической и генетической карт представлены на рисунке 6.

Рисунок 6. Tyramide-FISH c фрагментом гена аллиназы на хромосомах A. cepa (а); интегрирование  положения  маркеров Alliinase-E5-3.5 и  Alliinase-B1-14.5/13.0 на генетической  карте (Martin et al., 2005) (б) и  положения соответствующего им гена аллиназы  на хромосоме 4 (в)

Нами было рассчитано соотношение числа пар нуклеотидов к частоте рекомбинации в данном регионе, которое составило 1,76 Мb/сМ. Согласно данным Khrustaleva et al. (2005), полученным  при интегрировании физической и генетической карт, этот показатель в регионах с высокой частотой рекомбинации для Allium составляет 1,4 Mb/cM,  а  в регионах с низкой частотой рекомбинации - 74,3 Mb/cM. Таким образом, согласно приведённым расчётам, ген аллиназы расположен в  регионе с  высокой частотой рекомбинации.

4.2. Клонирование фрагментов генов фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида  и их физическое картирование

Хромосома 5 является объектом пристального внимания селекционеров лука, так как в ней находятся QTL, контролирующие  содержание сухого вещества, устойчивость к абиотическим факторам, лежкость  луковиц и другие ценные гены (McCallum et al., 2007; Masamura et al., 2012). В анализируемой EST-библиотеке два  клона API15-E1-3.0 и API59-H3-15.0/9.5 были картированы ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 5 (Martin et al., 2005). BLASTX анализ показал, что EST клон API15 имеет гомологию к гену фактора элонгации 1B- и EST клон API59 имеет гомологию к гену -комплекса зарождающегося полипептида. Последовательности этих EST клонов были использованы для подбора праймеров с целью получения экзон-интронных фрагментов этих генов.

После проведения ПЦР с праймерами, подобранными на EST клон API15, и геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum, были получены ПЦР продукты размером 2100 п.н. и 1800 п.н., а после проведения ПЦР с праймерами, подобранными на EST клон API59, и геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum, были получены ПЦР продукты одинакового размера 1000 п.н..

ПЦР продукты были клонированы в плазмидный pGEM-T вектор, с последующим отбором клонов и их секвенированием. Полученные сиквенсы были проанализированы, используя программу BLASTN. В результате была выявлена высокая степень гомологии полученных нами сиквенсов к  сиквенсам соответствующих EST клонов, после чего было проведено их выравнивание с помощью программы GeneDoc (рисунок 7).

       

Рисунок 7. Результаты выравнивания фрагментов генов фактора элонгации 1B- A. cepa и A. fistulosum с EST клоном API15 (а) и фрагментов генов -комплекса зарождающегося полипептида A. cepa и A. fistulosum с EST клоном API59 (б).Черным цветом показаны участки генов, гомологичные EST клонам (экзоны), серым - негомологичные EST клонам (интроны)

       В результате выравнивания было выяснено, что фрагменты генов фактора элонгации 1B- A. cepa и A. fistulosum содержат минимум три экзона и два интрона (в секвенированных участках), причем экзоны, как наиболее консервативные элементы генов, содержат только 8 нуклеотидных замен, а интроны - 8 делеций, общей протяженностью 34 нуклеотида, и 76 замен. Фрагменты генов -комплекса зарождающегося полипептида A. cepa и A. fistulosum содержат три экзона и два интрона; экзоны содержат в себе 19 однонуклеотидных замен, а интроны - 4 делеции, общей протяженностью 9 нуклеотидов, и 30 замен (рисунок 7).

       Кроме того, BLASTN-анализ фрагментов генов фактора элонгации 1B- A. cepa и A. fistulosum выявил высокую степень гомологии к  EST API92, а BLASTN-анализ фрагментов генов -комплекса зарождающегося полипептида A. cepa и A. fistulosum выявил высокую степень гомологии к  EST API23. Выравнивание EST API15 и EST API92 (оба имеют гомологию к гену фактора элонгации 1B-) показало 99% соответствия. Выравнивание EST API59 и EST API23 (оба имеют гомологию к гену -комплекса зарождающегося полипептида) показало 99% соответствия. Клоны API92-E1-11.0/12.0 и API23-H3-12.0/6.5 были картированы ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 5 (Martin et al., 2005). Таким образом, мы имеем дело с двумя копиями гена фактора элонгации 1B- и двумя копиями гена -комплекса зарождающегося полипептида, EST клоны которых находятся в одной группе сцепления, соответствующей хромосоме 5.

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена фактора элонгации 1B- у A. cepa показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 22,24% 2,83 и  в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 54,45% 3,21 (рисунок 8).

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена -комплекса зарождающегося полипептида у A. cepa показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 30,95% 3,72 и  в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 53,51% 2,57 (рисунок 8).

Рисунок 8 Tyramide-FISH c фрагментом гена фактора элонгации 1B- на хромосомах A. cepa (а) и c фрагментом гена -комплекса зарождающегося полипептида на хромосомах A. cepa (б); положение генов фактора элонгации 1B- (в) и -комплекса зарождающегося полипептида (г) на хромосоме 5

Наши данные согласуются с работами по генетическому картированию данных генов, где так же было показано наличие двух копий гена фактора элонгации 1B- и  двух копий гена -комплекса зарождающегося полипептида, относящихся к одной группе сцепления на хромосоме 5 (Martin et al., 2005). В результате интегрирования физической и генетической карт было установлено, что проксимальные локусы генов -комплекса зарождающегося полипептида и фактора элонгации 1B- расположены в регионах с  относительно низкой частотой рекомбинации (21,83 Мb/сМ), а более дистальные локусы этих генов расположены в регионе с высокой частотой рекомбинации (0,3 Мb/сМ) (рисунок 9).

         

Рисунок 9. Интегрирование  положения  маркеров API15-E1-3.0 и API92-E1-11.0/12.0 и маркеров API59-H3-15.0/9.5 и API23-H3-12.0/6.5 на генетической  карте (Martin et al., 2005) (а) и  положения соответствующих им генов фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида на физической хромосоме 5 A. cepa (схема) (б)

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена фактора элонгации 1B- у A. fistulosum показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 33,31% 2,44 (рисунок 10).

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена -комплекса зарождающегося полипептида у A. fistulosum показал наличие сигналов на хромосоме 5 в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 40,07% 3,49 (рисунок 10).

Рисунок 10. Tyramide-FISH c фрагментом гена фактора элонгации 1B- на хромосомах A. fistulosum (а) и c фрагментом гена -комплекса зарождающегося полипептида на хромосомах A. fistulosum (б); положение сигналов гибридизации фрагмента гена фактора элонгации 1B- (в) и фрагмента гена -комплекса зарождающегося полипептида (г) на хромосоме 5

Итак, Tyramide-FISH выявил по две копии генов фактора элонгации 1B- и -комплекса зарождающегося полипептида у A. cepa и по одной копии этих генов у A. fistulosum. Результаты физического картирования генов совпадают с результатами ранее проведенных исследований King et al. (1998) по созданию генетической карты морфологических признаков и Kuhl et al. (2004) по генетическому картированию EST клонов, в которых было показано, что для A. cepa характерен высокий уровень дупликации генов.

ВЫВОДЫ

  1. Показано, что с помощью чувствительного метода Tyramide-FISH можно визуализировать на высоко компактизированной растительной хромосоме короткие последовательности генов (1-3,5 тыс. п.н.), что позволяет создавать молекулярно-цитогенетические маркеры для определения индивидуальных хромосом и интегрирования генетических и физических карт.
  2. Предложен новый подход к созданию ДНК проб для in situ картирования генов, основанный на клонировании экзонных-интронных фрагментов генов, что позволяет увеличить  чувствительность метода и специфичность  картирования.
  3. Успешная Tyramide-FISH визуализация генов на хромосомах A.cepa и A.fistulosum луков  позволила сконструировать физические карты хромосом, провести  их интегрирование с генетическими  картами и  установить  положение гена относительно частоты рекомбинации.
  4. Установлена корреляция плотности генов с частотой рекомбинации: Tyramide-FISH 631  EST клона на хромосомах двух видов луков  с диаметрально противоположным распределением частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы выявила 80,1% сайтов гибридизации на хромосомах A. cepa в дистальном и интерстициальном регионах,  у A. fistulosum 80,8% EST клонов были локализованы в проксимальном и интерстициальном регионах.
  5. BLASTX анализ картируемых in situ библиотек EST клонов, полученных из луковичной ткани A. cepa, выявил следующий состав экспрессирующихся генов в одной отдельно взятой ткани: гены рибосомальных белков - 14%; другие гены домашнего хозяйства - 26% (пероксидазы - 9%, белки ионных каналов - 5%, киназы - 5%, трансферазы - 7%); видоспецифичные гены - аллиназы (2,4%) и другие низко- и однокопийные гены (57,6%).
  6. Скрининг EST клонов с помощью программы CENSOR показал наличие повторов в экзонных областях некоторых генов, что позволило исключить эти гены из Tyramide-FISH  экспериментов, так как наличие повторов маскирует сигнал, исходящий от генов.
  7. Установлено, что EST клоны, принадлежащие к большим семействам сходных генов (> 80% гомологии), не могут быть использованы как  ориентиры для интегрирования физических и генетических карт. Картирование EST клона API66 с гомологией к гену, кодирующему транспортазу сахарозы, выявило 25 сайтов гибридизации, распределенных  по всем хромосомам A. cepa.
  8. EST клон API20 с гомологией к гену, кодирующему светопоглощающий белок 3, был картирован в проксимальной части длинного плеча (22,99% 2,69 от центромеры относительно длины плеча) хромосомы 1 A. cepa. Проведено интегрирование положения гена на физической и генетической карте.
  9. Клонирован и секвенирован экзон-интронный 1092 п.н. фрагмент гена аллиназы A. cepa.  С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в дистальной части длинного плеча (74,4% 1) хромосомы 4 A. cepa. Установлено наличие двух сайтов гибридизации гена в данном регионе на менее конденсированных хромосомах. Установлено, что ген аллиназы расположен в  регионе с  высокой частотой рекомбинации: соотношение числа пар нуклеотидов к частоте рекомбинации в данном регионе  1,76 Мb/сМ.
  10. Клонирован и секвенирован экзон-интронный фрагмент гена фактора элонгации 1B-  размером 2100 п.н. у A. cepa  и 1800 п.н. у A. fistulosum. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 A. cepa  (22,24% 2,83 и 54,45% 3,21) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 A. fistulosum (33,31% 2,44).
  11. Клонирован и секвенирован 1000 п.н экзон-интронный фрагмент гена -комплекса зарождающегося полипептида, одинакового размера  у A. cepa и A. fistulosum. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 A. cepa (30,95% 3,72 и 53,51% 2,57) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 A. fistulosum (40,07% 3,49).
  12. Интегрирование физической и генетической карт хромосомы 5 показало,  что проксимальные локусы генов -комплекса зарождающегося полипептида и фактора элонгации 1B- расположены в регионах с  относительно низкой частотой рекомбинации (21,83 Мb/сМ), а более дистальные локусы этих генов расположены в регионе с высокой частотой рекомбинации (0,3 Мb/сМ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования по клонированию, секвенированию, физическому картированию протеин-кодирующих генов на хромосомах A. cepa и A. fistulosum  и интегрированию сконструированных нами физических карт с имеющимися генетическими картами позволяют нам сделать заключение о том, что у однодольных с крупным геномом плотность генов на хромосоме коррелирует с частотой рекомбинаций, что согласуется с данными полученными на других однодольных, таких как пшеница, ячмень и кукуруза.  Плотность генов и частота рекомбинаций у этих зерновых культур  наиболее высокая в дистальных регионах хромосом.  Однако, известно, что у A. fistulosum  градиент частоты рекомбинаций вдоль хромосомы диаметрально противоположен градиенту у большинства существующих видов растений, в т.ч. у A. cepa и зерновых. A. fistulosum в этом отношении является одним из редких видов, у которых события кроссинговера чаще всего происходят в проксимальном регионе хромосом.  Благодаря возможности визуализировать гены на хромосоме с помощью Tyramide-FISH, было доказано, что  плотность генов у A. fistulosum  высокая в проксимальном регионе и очень низкая в дистальном регионе хромосом.  Обнаружены различия в распределении плотности генов вдоль физической хромосомы у A. fistulosum и других однодольных (A. cepa, зерновые).

Сравнительный анализ картирования индивидуальных генов на хромосомах A. cepa  и A. fistulosum показал наличие дупликации генов у A. cepa. Для A. cepa характерен высокий уровень дупликации генов, в этом видится одна из причин укрупнения генома в ходе длительной, более 5000 лет, селекции этого вида. Близкородственный дикорастущий вид A. fistulosum имеет на 27%  меньше размер генома и меньший уровень дупликации генов.

Конструирование физических карт  с помощью прямого Tyramide-FISH картирования генов/маркеров на хромосоме  и их интегрирование с генетическими картами позволяет оценить  положение интересующего гена относительно частоты рекомбинации, что является важным критерием в практической селекции для прогнозирования переноса гена и определения размеров популяции. Гены, находящиеся в регионе с высокой частотой рекомбинации, проще перенести от одного растения к другому, и для этого нужен меньший размер популяции, чем для переноса генов из регионов с низкой частотой рекомбинации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

  1. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих аллиназу и слезоточения фактор синтетазу // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, Москва, 2011. - С. 40-41.
  2. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Особенности хромосомной организации генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы у луковых // Сборник статей участников Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева, Москва, 2012. - Т. 1. - С. 79-81.
  3. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. Клонирование, секвенирование и физическое картирование генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы у луковых // Сборник статей XII международной научно-практической конференции Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности, Санкт-Петербург, 2011. - Т. 1. - С. 237-238.
  4. Романов Д.В., Хрусталева Л.И. Tyramide-FISH c EST-клоном, кодирующим транспортазу сахарозы, на хромосомах Allium cepa // Сборник статей XII международной научно-практической конференции Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности, Санкт-Петербург, 2011. - Т. 2. - С. 288-291.
  5. Киров И.В., Романов Д.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих аллиназу и синтазу фактора слезотечения // Известия ТСХА, выпуск 3, 2011. - С. 58-65.
  6. Киров И.В., Романов Д.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. Физическое картирование генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы на хромосомах Allium cepa L. с помощью tyr-FISH // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, Москва, 2011. - С. 23.
  7. Kirov I., Romanov D. Physical mapping of the onion genes using
    Tyramide-FISH (Физическое картирование генов лука с использованием Tyramide-FISH) // Proceeding of the 35th conference of agricultural
    students and veterinary medicine with international participation, Serbia, 2011. - Р. 225-230.
  8. Киров И.В., Романов Д.В. Tyramide-FISH - ценный инструмент для
    сравнительной геномики растений // Сборник статей 2-й Международной школы-конференции молодых учёных Генетика и селекция растений,
    основанная на современных генетических знаниях и технологиях,  Цифровичок, Москва-Звенигород, 5-10 декабря 2011. - С. 48.
  9. Khrustaleva L., Kirov I., Romanov D., Fesenko I. Single-gene detection using ultra-sensitive Tyramide-FISH for assembling physical and recombination maps in the onion (Allium cepa) (Детектирование однокопийных генов с помощью ультрачувствительной Tyramide-FISH для совмещения физической и рекомбинационной карт лука Allium cepa) // International conference: Molecular mapping and marker assisted selection, Vienna, Austria, February 8-11  2012. - P. 19.
  10. Khrustaleva L., Romanov D., Budylin M., Kirov I., Fesenko I., Kiseleva A. Chromosomal Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Allium (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) // Материалы 6-го Международного симпозиума по съедобным Alliaceae, Фукуока, Япония, 21-24 мая 2012. - P. 34.

БЛАГОДАРНОСТИ

       Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю - доктору биологических наук, профессору Хрусталевой Людмиле Ивановне за всестороннюю поддержку и бесценную помощь при выполнении научной работы.

  Автор благодарит профессора Mike Havey, университет Висконсин, США и доктора Arnaud Bovy, университет Вагенинген и научный центр, Нидерланды за предоставленную плазмидную ДНК EST библиотек.

       Автор выражает свою благодарность всем сотрудникам Центра молекулярной биотехнологии за помощь на всех этапах подготовки и проведения научной работы.

       Отдельную благодарность автор выражает к.б.н. Дивашуку Михаилу Георгиевичу и к.б.н. Фесенко Игорю Александровичу за помощь в проведении секвенирования.

       Искреннюю и сердечную благодарность автор выражает своей семье, в первую очередь Романову Виктору Степановичу и Романовой Ирине Сергеевне за понимание и неоценимую поддержку.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии