Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

на правах рукописи

Игнатьева Анна Викторовна

ОСОБЕННОСТИ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА, РАСПОЗНАВАЕМЫЕ АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ СОВРЕМЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА А ПОДТИПОВ Н5 И Н1

03.02.02 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития Российской Федерации

Научный руководитель:         Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Каверин Николай Вениаминович

Официальные оппоненты:                

Заведующая лабораторией молекулярной биологии вирусов гриппа ФГБУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН, д.б.н., Гамбарян Александра Сергеевна

Заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России, д.б.н., профессор, Народицкий Борис Савельевич

Ведущее Учреждение:

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится л__________________2012 г в ____ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.131.01. при ФГБУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в ФГБУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автореферат диссертации разослан л_____ __________________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук       Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из наиболее распространенных вирусов, патогенных для человека и животных, является вирус гриппа А. Он способен вызывать эпидемии и пандемии, сопровождающиеся высокой смертностью. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, имеет широкий круг хозяев. Вирус гриппа А быстро эволюционирует. Наиболее вариабельны поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), определяющие иммунный ответ. HA является мишенью для вируснейтрализующих антител, которые играют главную роль в защите от инфекции.

В настоящее время известны 16 антигенных подтипов HA (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А.

В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, HA которых относятся к двум подтипам: Н1 и Н3. Другие подтипы HA (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не представлены в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а иммунитетом против вируса подтипа Н2 обладают лица старше 44 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Вирус гриппа А, резко отличающийся по антигенной специфичности от вирусов, циркулирующих в человеческой популяции, может рассматриваться как потенциальный источник гена гемагглютинина вирусов будущих пандемий.

В 1918 году появился вирус гриппа А подтипа Н1N1, вызвавший опустошительную пандемию, получившую название лиспанки и унесший не менее 40 миллионов жизней. Вирус гриппа подтипа Н1N1 циркулировал до 1957 года и сменился вирусом Н2N2. С 1957г. по 1968г. циркулировал вирус Н2N2, после 1968 г. - Н3N2. В 1977 году снова стал циркулировать вирус гриппа А Н1N1, но на этот раз вирус Н3N2 не исчез, и эти вирусы циркулировали вместе, поочередно преобладая при сезонных эпидемиях и постепенно дрейфуя.

В начале апреля 2009 года поступило сообщение о вспышке гриппа в Мексике, которая была вызвана новым вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, генетический состав которого ранее не регистрировали среди вирусов гриппа свиней и людей. Уже 11 июня в связи с устойчивой передачей вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о 6-ой, самой высокой, фазе пандемии. Пандемический вирус гриппа A(H1N1)pdm09 появился на фоне сезонной активности эпидемических штаммов и вытеснил их из циркуляции, став доминирующим.

Пандемический вирус возник в результате скрещивания двух вирусов гриппа свиней, классического североамериканского и европейского [Garten et al., 2009]. Новый вирус резко отличается по антигенным свойствам от циркулировавшего в предшествующие годы вируса гриппа А подтипа H1.

Из вирусов гриппа птиц особый интерес представляет вирус подтипа Н5. В 1997 году в Гонконге были отмечены заболевания человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа А птиц подтипа Н5N1. С 2004 года в Китае, Камбодже, Вьетнаме, Индонезии, Турции, Египте, Нигерии, Пакистане и других странах зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные данным вирусом. К настоящему времени суммарное количество подтвержденных случаев заболевания людей вирусом гриппа Н5N1 насчитывает 602 человека, из которых 355 погибло. С 2005 года эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом Н5N1 отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. Достоверные случаи передачи вируса от человека к человеку пока не описаны. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов гриппа А подтипа Н5 и активной циркуляцией их в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. Поэтому детальное исследование антигенных свойств НА подтипа Н5 и, в частности, изучение распределения участков, реагирующих с нейтрализующими антителами, является важной задачей.

После публикации трехмерной структуры НА подтипа Н5 по данным рентгеноструктурного анализа было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5 [Kaverin et al., 2002]. В 2007 году было проведено антигенное картирование трехмерной структуры молекулы НА высоко патогенного штамма вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) [Kaverin et al., 2007]. Данные об особенностях антигенной структуры НА того варианта вируса H5N1, который вызвал вспышки в Европе и Африке (цинхайского варианта), в научной литературе отсутствовали.

Исследование антигенных эпитопов, распознаваемых нейтрализующими антителами, весьма актуально в связи с продолжающейся эволюцией вирусов гриппа А подтипа H5N1, появлением новых антигенных вариантов, и с возможностью в будущем антигенного дрейфа в случае заноса вируса гриппа А подтипа Н5 в человеческую популяцию с последующей постоянной циркуляцией в ней. Изучение антигенных свойств пандемического вируса 2009 года подтипа Н1N1 имеет не меньшую значимость, так как при циркуляции вирус претерпевает дрейф, который надо учитывать при вакцинопрофилактике.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выявить особенности антигенной структуры НА вируса гриппа А, распознаваемые антителами против современных вариантов вирусов подтипов Н5 и Н1, а также исследовать влияние мутаций, обеспечивающих резистентность к нейтрализующему действию антител, на взаимодействие НА с аналогами клеточных рецепторов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить эскейп-мутанты, резистентные к моноклональным антителам против современных вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н1, и определить их антигенную специфичность в перекрестных реакциях с моноклональными антителами;
2. Провести секвенирование генов НА всех полученных эскейп-мутантов с целью выявления аминокислотных замен в молекуле НА, определяющих их резистентность к моноклональным антителам;
3. Определить локализацию аминокислотных замен, обеспечивающих резистентность к моноклональным антителам, в трехмерной структуре молекулы НА подтипов Н5 и Н1.
4. Провести исследование влияния антигенно значимых аминокислотных замен эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1 на сродство к сиалосодержащим синтетическим аналогам природных рецепторов.

Научная новизна и практическое значение работы

В работе представлены результаты антигенного картирования молекулы НА вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1, которые отражают ранее не выявленные аспекты антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5, а также характеризуют специфичность моноклональных антител, полученных к современным вариантам вирусов гриппа подтипов Н1 и Н5.

Антигенное картирование посредством селекции и характеристики эскейп-мутантов с использованием моноклональных антител против распространенного в странах Африки и Европы цинхайского варианта высокопатогенного вируса подтипа Н5N1 до настоящего времени не было проведено. Данная работа расширяет представление об особенностях антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5 и об участках молекулы НА, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции. Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА, распознаваемых моноклональными антителами против вируса гриппа А подтипа H5N1 цинхайской группы.

В данной работе также проведено антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, штамм A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Были выявлены пять аминокислотных позиций в НА, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами против пандемического вируса гриппа 2009 года подтипа Н1N1, причем некоторые из них вызывали снижение сродства к сиалосодержащим аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф пандемического вируса гриппа H1N1.

Работа имеет преимущественно теоретический характер, но полученные данные в будущем должны будут приниматься во внимание при решении практических проблем. В связи с продолжающейся эволюцией высокопатогенных вирусов гриппа А подтипа H5N1 и их выраженной патогенностью для человека, новые данные по картированию молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5, а также сведения об участках НА, реагирующих с моноклональными антителами против наиболее распространенного цинхайского варианта вируса H5N1, будут важны для оценки характера эволюции высокопатогенного вируса гриппа H5N1. Данные об антигенных эпитопах НА вируса гриппа A(H1N1)pdm09 важны для оценки потенциала антигенного дрейфа в ходе будущей циркуляции новых вариантов вируса гриппа А подтипа H1N1.

В ходе выполнения работы был впервые получен высокопродуктивный реассортантный штамм, содержащий гены НА и NA отечественного штамма пандемического вируса гриппа 2009 года. Штамм может найти применение для производства инактивированных и субъединичных вакцин (решение о выдаче патента от 03.05.2012, заявка на патент №2011129286/10 от 14.07.2011, Каверин Н.В., Руднева И.А., Тимофеева Т.А., Шилов А.А., Игнатьева А.В. Реассортант ReM8 - вакцинный штамм вируса гриппа А подтипа H1N1).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антигенное картирование молекулы НА вируса гриппа А подтипа Н5 посредством селекции эскейп-мутантов с помощью антител против высокопатогенного вируса гриппа H5N1, выделенного на территории России, позволяет уточнить и дополнить картину антигенной структуры НА подтипа Н5, а также выявляет область в молекуле НА, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа H5N1 цинхайского варианта, распространившемуся в странах Европы и Африки.
2. Вируснейтрализующие моноклональные антитела к НА вируса А/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) распознают не выявленную ранее область в НА, которая определяет вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.
3. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях НА подтипа Н5, подобных антигенному дрейфу, что указывает на роль выявленных антигенно значимых аминокислотных позиций при эволюции вируса.
4. Впервые проведенное антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать 5 аминокислотных позиций, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами в НА вируса A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Полученные данные указывают на преимущественную роль ограниченного участка молекулы НА вируса гриппа 2009 года в пределах антигенных сайтов Sa и Sb в индукции вирус-нейтрализующих антител.
5. Определение сродства НА эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов H5N1 и H1N1 к сиалосодержащим синтетическим аналогам клеточных рецепторов выявило влияние аминокислотных замен в области НА, прилегающей к рецептор-связывающему карману.
6. Для НА подтипа Н1 выявлена корреляция изменений степени сродства к сиало-олигосахаридам с изменениями электростатического заряда при аминокислотных заменах, влияющих на взаимодействие НА с нейтрализующими антителами.
7. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов подтипа Н1 с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции молодых ученых, Берлин, Германия, 2010 г, 30-й Ежегодной конференции Американского Общества Вирусологов, Миннеаполис, Миннесота, США, 2010 г.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России 24 мая 2012 года.

Публикации

       По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 2 - в материалах международного конгресса и конференции.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 166 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, пяти разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация содержит 9 схем, 19 таблиц, 6 рисунков и 1 приложение. Список использованной литературы содержит 246 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Вирусы

Вариант вируса А/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), адаптированный к мышам (сокращенно A/Mlrd/PA-MA), был получен ранее в лаборатории субвирусных структур [Smirnov et al., 2000] ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Вирус А/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) близок по антигенной специфичности к вирусу А/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), но в отличие от него полностью авирулентен для птиц. Использованы также вирусы A/Ruddy Turnstone/244/91 (H5N2) (сокращенно A/RT/244/91), A/Duck/Primorie/2633/01 (H5N3) и рекомбинантный вирус A/VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1), содержащий гены HA и NA вирулентного вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) и остальные 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (предоставлен доктором Р. Донисом, CDC, Атланта, США). Ген НА этого вируса модифицирован сайт-специфическим мутагенезом путем удаления полиосновного участка в области сайта нарезания, после чего вирус перестал быть вирулентным для кур и хорьков, что позволяет его использовать для работы в обычных условиях.

Для получения высокопродуктивного штамма-реассортанта, содержащего гены НА и NA пандемического вируса 2009 года, были использованы штамм A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl, изолированный ранее в ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, и высокопродуктивный реассортант X-31 (H3N2), содержащий 6 генов внутренних и неструктурных белков вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариант Mount Sinai.

Вирусы A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl и X-31 (H3N2), были получены из Государственной коллекции штаммов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. В работе были также использованы вирусы: A/WSN/33 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариант Mount Sinai, A/FM/1/47 (H1N1), A/USSR/90/77 (H1N1), X-53A (H1N1) (реассортант вируса А/New Jersey/11/76 и A/Puerto Rico/8/34, имеющий гены HA и NA вируса А/New Jersey/11/76), A/Swine/Wisconsin/1/67 (H1N1), A/Turkey/Kansas/4880/80 (H1N1), A/Brisbane/59/07 (H1N1), полученные из Государственной коллекции штаммов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России.

Вирус накапливали в 10-дневных куриных эмбрионах. Зараженные куриные эмбрионы инкубировали в течение 48 часов при 37С, после чего охлаждали в течение ночи при 4С и собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость.

Антитела

Для получения эскейп-мутантов были использованы моноклональные антитела (МКАТ) 3G9, 6F3, 4F11, 5F12, 6E2 и 5G9 против НА вируса гриппа А/Duck/Novosibirsk/56/05 (Н5N1), выделенного в Новосибирской области в 2005 г, и МКАТ против НА вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl 1Е7, 3D9, 5F7, 6A3, 3A3, 10G2, любезно предоставленные проф. А.А Кущ (лаборатория клеточной инженерии, ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России).

Использовали также МКАТ: ср46, ср55, ср58, ср79 против НА вируса A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2); 176/26, 364/1, 777/1 против НА вируса A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2); VN02, VN08, VN09, VN010, VN013, VN015, VN016 против НА вируса A/VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1). МКАТ были любезно предоставлены доктором Р.Г. Вебстером (Детская клиника Сент-Джуд, Мемфис, США) в виде асцитной жидкости мышей.

Для селекции реассортантов подтипа Н1N1 использовали поликлональную сыворотку морской свинки против вируса X-31 (H3N2).

Селекция эскейп-мутантов

Получение эскейп-мутантов вируса гриппа А проводили по методике Webster, Laver [Webster et al., 1980] с некоторыми модификациями. Аллантоисную жидкость, разведенную до концентрации инфекционного вируса 2107 ЭИД50/мл, смешивали с МКАТ и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Смесью заражали 10-ти дневные куриные эмбрионы, с последующей инкубацией при 37С в течении 48 часов. Отбирали варианты, устойчивые к данному МКАТ и проводили 5-6-ти кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений с целью получения однородной вирусной популяции.

Очистка и концентрация вирусов

Вируссодержащую аллантоисную жидкость после осветления центрифугированием на малой скорости (3000 об/мин, 15мин, 4 оС) наслаивали на 4 мл 20% сахарозы в буферном растворе (0,15 М NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,2) и осаждали центрифугированием в роторе SW-27 при 22000 об/мин в течение 90 мин при 4оС. Вирус ресуспендировали в гомогенизаторе Даунса в том же буферном растворе в 1/64 исходного объема, снова осветляли центрифугированием на малой скорости (3500 об/мин, 8 мин, 4 оС). Очищенный и сконцентрированный вирус титровали в РГА и хранили при -80оС.

Определение рецептор-связывающей активности очищенного вируса гриппа А

Рецептор-связывающая активность очищенного вируса гриппа А была определена методом ингибирования РГА с помощью сиало-олигосахаридов (1000-2000 кDa). Метод основан на ингибировании гемагглютинации за счет связывания гемагглютинина вируса с сиало-олигосахаридом [Matrosovich et all, 1990].

Для определения рецептор-связывающей активности вируса гриппа А были использованы следующие сиало-олигосахариды, предоставленные Л. В. Мочаловой (НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, Россия), синтезированные в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, зав. лаб., Бовин Н.В:

Neu5Ac2-3Gal1-4Glc-PAA                        (3ТSL),

Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc-PAA                        (3ТSLN),

Neu5Ac2-3Gal1-3GlcNAc-PAA                        (SiaLec),

Neu5Ac2-3Gal1-3(Fuc1-4)GlcNAЦPAA                (SiaLea),

Neu5Ac2-3Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc -PAA        (SiaLex),

Neu5Ac2-3Gal1-4(6-O-su)GlcNAc-PAА                (6-su-3ТSLN),

Neu5Ac2-6Gal1-4Glc-PAA                        (6ТSL),

Neu5Ac2-6Gal1-4GlcNAc-PAA                        (6ТSLN),

Neu5Ac2-6Gal1-4(6-O-su)GlcNAc-PAA                (6-su-6ТSLN),

где Neu5Ac - N-5-ацетилнейраминовая кислота, Gal - галактоза, GlcNAc - N-ацетилглюкозамин, Fuc - L- фукоза, PAA - полиакриламидный носитель. Сиалогликокнъюгаты SiaLex  и SiaLea имеют фукозный заместитель в третьем звене и отличаются друг от друга типом связи между галактозой и последующим звеном (1-3) или (1-4). Олигосахаридная группировка присоединена к полиакриламидному полимеру.

В 96-луночных планшетах к последовательным двукратным разведениям сиало-олигосахаридов добавляли равные объемы аллантоисного вируса, разведенного до 4-6 ГАЕ в буферном растворе (0,15 М NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,2) с добавлением 4мкМ ингибитора NA (2,3-дидегидро-2,4-дидезокси-4-амино-N-ацетил-D-нейраминовая кислота, Sigma, США) и инкубировали в течении 30 мин при 4С, после чего добавляли такой же объем 0,5% суспензии куриных эритроцитов и инкубировали 40-50 мин при 4С. Реакцию оценивали по последнему разведению сиалогликоконъюгата, тормозящему агглютинацию эритроцитов, и сродство вируса к сиало-олигосахаридам выражали в мкМ сиаловой кислоты в этом разведении.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА)

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили в модификации Philpott  et al. [1989] c некоторыми изменениями. В 96 луночный планшет сорбировали по 100 ГАЕ очищенного вируса при 4 оС в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7.4 (NaCl 0,18 M, KCl 0,003 M, Na2HPO4 0,01 M, KH2PO4 0,015 M) в течение 18 часов. Планшеты 3 раза отмывали ФСБ с 0,05% Tвин-20, вносили БСА в концентрации 2,0% и инкубировали в течение 1 ч при 37 оС для блокировки свободных участков поверхности лунок. Затем вносили смесь МКАТ в ФСБ с 1% БСА, инкубировали 2 ч при 37оС, промывали 3 раза ФСБ с 0,05% Tвин-20 и инкубировали 1 час при 37оС с антимышиным козьим иммуноглобулином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Sigma Chemical Co, США) в рабочем разведении 1:2000 (ФСБ, 1% БСА). Для проявления реакции лунки промывали 4 раза ФСБ с 0,05% Tвин-20 и вносили по 100 мкл индикаторной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) (МДЛ, Россия). Реакцию останавливали 2М Н2SO4 и определяли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Процент связывания МКАТ с вирусами рассчитывали по формуле A=100(Bxv/Bpv)/(Bxw/Bpw), где A - процент связывания  по отношению к вирусу дикого типа (100%), Bxv  - связывание МКАТ с эскейп-мутантом, Bpv - связывание смеси МАКТ  с эскейп-мутантом,  Bxw - связывание МКАТ с вирусом дикого типа и Bpw - связывание смеси МКАТ с вирусом дикого типа.

Автоматическое секвенирование

Секвенирование было проведено д.б.н. А.А. Шиловым на базе лаборатории молекулярной генетики (зав. лаб. Прилипов Алексей Геннадьевич) ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Вирусная РНК была выделена из аллантоисной жидкости с помощью специального набора RNeasy minikit (QIAGEN). С полученными образцами была проведена ПЦР с обратной транскрипцией со специфическими праймерами к сегменту гена гемагглютинина. Образцы для секвенирования содержали 0,01-0,03 мкг ПЦР-продукта и 3,2 пкмоль специфического праймера. Каждый ПЦР-фрагмент прочитывался с помощью прямого (fovard) и обратного праймеров (revers), использовавшихся для ПЦР. Секвенирование осуществляли с использованием автоматического секвенатора DNA ABI Prism 3130 (Applied Boisystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) и BigDye Terminator v3.1 kit.

Статистическая обработка результатов экспериментов

Статистическая обработка проводилась с использованием среднего квадратического отклонения и коэффициента Стьюдента.

Построение трехмерной модели НА

Построение трехмерной модели гемагглютинина проводилось с помощью программы PyMol 0.99с и данных о трехмерной структуре НА подтипа Н5 из Protein Data Bank (pdb файл 1JSM) и структуре НА подтипа Н1 (pdb файл 3LZG, 3UBN).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. окализация и структура антигенных эпитопов, распознаваемых МКАТ к НА вируса гриппа подтипа Н5N1

Для выявления антигенных эпитопов, распознаваемых МКАТ к A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), необходимо было провести селекцию мутантов, устойчивых к нейтрализующему действию того или другого МКАТ, охарактеризовать их в перекрестных реакциях с МКАТ и секвенировать мутантные гены НА. Но, прежде всего, необходимо было выбрать вирус, подходящий для получения набора эскейп-мутантов. Таким вирусом мог бы быть вирус A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), к которому были получены МКАТ, или какой-либо другой вирус подтипа Н5, реагирующий с данной панелью МКАТ. Использование вируса A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) в качестве вируса дикого типа для получения эскейп-мутантов было затруднено высокой патогенностью этого вируса, допускавшей работу только в специально оборудованных помещениях. Однако, это не было главным мотивом при выборе дикого типа. Важнее было получить возможность адекватного сопоставления данных картирования, полученных в ходе настоящей работы, с полученными ранее результатами определения локализации антигенных эпитопов в НА подтипа Н5 [Kaverin et al., 2002]. В работах, выполненных ранее в лаборатории физиологии вирусов, было проведено антигенное картирование молекулы НА адаптированного к мышам варианта вируса А/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) (штамм A/Mlrd/PA-MA) [Kaverin et al., 2002] и НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) [Kaverin et al., 2007]. Данные РТГА разных вирусов подтипа Н5 с МКАТ к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) показали, что вирус A/Mlrd/PA-MA реагирует со всей панелью МКАТ и может быть использован в качестве вируса дикого типа для селекции эскейп-мутантов.

1.1. Селекция эскейп-мутантов и их антигенная характеристика в перекрестной РТГА с МКАТ

Для получения эскейп-мутантов, резистентных в отношении МКАТ к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) был использован в качестве вируса дикого типа штамм A/Mlrd/PA-MA (H5N2). С помощью МКАТ 6F3, 4F11, 5F12, 6E2, 5G9 были селекционированы четырнадцать мутантов. Каждым из МКАТ 6F3, 4F11, 5F12, 6E2 было отобрано по два мутанта, и по три мутанта были селекционированы МКАТ 5G9 и 3G9. Полученные эскейп-мутанты были обозначены по тем МКАТ, которые были использованы для их селекции. Результаты перекрестной РТГА продемонстрировали особенности специфичности МКАТ, полученных к вирусу А/Duck/Novosibirsk/56/05 (табл. 1). Мутанты m4F11(1) и m4F11(4), отобранные с помощью МКАТ 4F11, были резистентны только к этому МКАТ.

Полученные данные позволили предполагать, что антигенные эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F12, 6E2 и МКАТ 6F3, 5G9, 3G9 частично перекрываются, причем МКАТ 5G9 и 3G9 распознают весьма обширный эпитоп.

Таблица 1. Перекрестная РТГА селекционированных эскейп-мутантов подтипа Н5 с МКАТ к A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1).

Вирусы	МКАТ
	3G9	6F3	4F11	5F12	6E2	5G9
A/Mlrd/PA-MA	1600	6400	51200	6400	6400	12800
m3G9(1)	<200	3200	102400	400	400	200
m3G9(2)	<200	<200	102400	<200	<200	200
m3G9(3)	<200	6400	25600	400	400	400
m6F3(11)	200	<200	102400	3200	3200	800
m6F3(15)	<200	<200	102400	400	400	400
m4F11(1)	6400	6400	<200	1600	1600	12800
m4F11(4)	3200	3200	<200	3200	6400	12800
m5F12(5)	200	3200	102400	<200	<200	<200
m5F12(7)	200	3200	102400	<200	400	<200
m6E2(9)	<200	3200	102400	<200	<200	<200
m6E2(10)	<200	3200	102400	400	400	<200
m5G9(1)	<200	<200	102400	<200	<200	<200
m5G9(4)	<200	400	102400	<200	<200	<200
m5G9(5)	<200	<200	102400	<200	<200	<200

1.2. Секвенирование НА селекционированных эскейп-мутантов

Для выявления аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с МКАТ к вирусу А/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) и характеристики полученных эскейп-мутантов, было проведено секвенирование генов HA исходного вируса A/Mlrd/PA-MA (H5N2) и эскейп-мутантов. Секвенирование показало, что полученные эскейп-мутанты несут одну, две или три аминокислотные замены в составе субъединицы HA1, причем у некоторых мутантов присутствуют и замены в субъединице HA2 (табл. 2).

Аминокислотные замены у мутантов, резистентных к МКАТ 4F11, были расположены в позициях 145 и 143, то есть в области, соответствующей сайту А молекулы НА подтипа Н3. Мутации у эскейп-мутантов, устойчивых к МКАТ 6F3, 5F12, 6E2, 5G9, 3G9, сгруппированы в районе, соответствующем сайту В молекулы НА подтипа Н3.

Два эскейп-мутанта, отобранные с помощью МКАТ 6F3, различались по аминокислотным заменам. Мутант m6F3(11) имеет одну замену S128P, а мутант m6F3(15) имеет три замены, две из которых S128P, P185S соответствуют сайту В подтипа Н3, а третья - K222N, расположена вблизи сайта D подтипа Н3.

С помощью МКАТ 5F12 были отобраны два эскейп-мутанта, из которых m5F12(5) имеет замену I124L в субъединице НА1 и замену R76G в субъединице НА2, а m5F12(7) имеет замены R166G и M230T в субъединице НА1, из которых антигенную значимость, вероятнее всего, имеет замена R166G, так как относится к антигенному сайту В подтипа Н3. Данные перекрестной РТГА выявили различия между мутантами m5F12(5) и m5F12(7) (табл. 1). Поскольку эти МКАТ распознают разные эпитопы в сайте В, можно полагать, что антигенные различия между мутантами обусловлены разной локализацией аминокислотных замен в НА1.

С помощью МКАТ 3G9 были селекционированы три эскейп-мутанта, два из которых m3G9(1) и m3G9(3), имеют аминокислотную замену в позиции 166, а у эскейп-мутанта m3G9(2) были выявлены замены в НА1 субъединице Q122K и в НА2 субъединице L124F. Разная локализация аминокислотных замен в НА1 у этих мутантов позволяет объяснить антигенные различия между ними в перекрестной РТГА (табл. 1).

Проведенное секвенирование показало, что эпитопы, распознаваемые моноклональными антителами 3G9, 5F12, 6E2 и 5G9, частично перекрываются. Аминокислотные замены в НА2 у мутантов m3G9(2), m4F11(1), m5F12(5) и m5G9(4) не оказывали влияния на взаимодействие мутантов с МКАТ в РТГА (табл. 1).

Таблица 2. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов вируса A/Mlrd/PA-MA (H5N2).

МКАТ к A/Duck/Novosibirsk/ 56/05 (H5N1)	Эскейп-мутанты	Замены в НА (нумерация Н3)	Замены в НА (нумерация Н5)
3G9	m3G9(1)	R166W	R162W
	m3G9(2)	Q122K, L124F(HA2)	Q115K, L124F(HA2)
	m3G9(3)	R166K	R162K
6F3	m6F3(11)	S128P	S123P
	m6F3(15)	S128P, P185S, K222N	S123P, P181S, K218N
4F11	m4F11(1)	G143D, A198T(HA2)	G139D, A198T(HA2)
	m4F11(4)	S145P	S141P
5F12	m5F12(5)	I124L, R76G(НА2)	I117L, R76G(НА2)
	m5F12(7)	R166G, M230T	R162G, M226T
6E2	m6E2(9)	K120I	K113I
	m6E2(10)	S126F	S121F
5G9	m5G9(1)	S125(a)I	S120I
	m5G9(4)	S126Y, T156A(HA2)	S121Y, T156A(HA2)
	m5G9(5)	P125S	P118S

3. Картирование антигенных сайтов в трехмерной структуре НА подтипа Н5

Аминокислотные замены всех полученных эскейп-мутантов были нанесены на трехмерную структуру гемагглютинина подтипа Н5 [Ha et al., 2001] (рис. 1). Мутации, придающие вирусу резистентность к МКАТ 4F11, расположены в латеральной, выдающейся над поверхностью молекулы петле большой субъединицы НА1, сформированной аминокислотными остатками 140-145, что соответствует антигенному сайту А у подтипа Н3. Мутации остальных эскейп-мутантов, отобранных с помощью МКАТ 3G9, 6F3, 5F12, 6E2, 5G9, сгруппированы в разных областях полипептидной цепи (позиции 120, 122, 124-128, 166, 185), которые, однако, в трехмерной структуре НА сближены (рис. 1). Эти замены образуют достаточно протяженную область в сайте, аналогичном сайту В в молекуле НА подтипа Н3.

У мутантов, селекционированных МКАТ 6F3, аминокислотные замены в позициях 128 и 185 расположены в сайте В, а позиция 222 находится на краю рецептор-связывающего кармане вблизи сайта D. Аминокислотный остаток в позиции 185 лишь в малой степени экспонирован на поверхности молекулы и поэтому его взаимодействовие с МКАТ маловероятно.

На рис.1 желтым цветом показаны замены, полученные ранее с помощью панели МКАТ против A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2), A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) [Kaverin et al., 2002]. На трехмерной структуре видно, что новые замены в сайте, аналогичном сайту В, расположены в другой области этого сайта.

Таким образом, аминокислотные позиции, распознаваемые МКАТ к НА штамма цинхайской ветви подтипа H5N1, локализованы преимущественно в участках молекулы НА, входящих в антигенные сайты, аналогичные сайтам А и В подтипа Н3 или примыкающих к ним. Однако выявленные нами антигенно значимые аминокислотные позиции в НА отличаются от выявленных ранее и существенно расширяют данные об антигенных эпитопах в молекуле НА подтипа Н5.

Рис. 1. Антигенные сайты гемагглютинина подтипа Н5 по суммарным данным об аминокислотных заменах в НА (вид с вершины глобулы).

Обозначения:

Синим цветом обозначены позиции замен, выявленных у эскейп-мутантов в данной работе. Розовым цветом обозначена позиция замены, совпадающая с ранее выявленной. Желтым цветом обозначены позиции замен, выявленных ранее. Цифрами обозначены позиции аминокислотных замен в нумерации Н3.

2. Антигенное картирование молекулы НА пандемического вируса (H1N1) 2009 года

2.1. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов

Для селекции эскейп-мутантов в качестве вируса дикого типа был выбран реассортант ReM8, содержащий гены НА и NA вируса A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl и обладающий большей урожайностью, чем вирус A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Для получения реассортантов была использована методика Шульмана и Палези, с некоторыми модификациями [Rudneva et al., 1993].

С помощью МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl были получены 18 мутантов вируса ReM8. По пять эскейп-мутантов были селекционированы с помощью МКАТ 3D9 и 10G2, и по два мутанта с МКАТ 1E7, 3A3, 6A3, 5F7 (табл. 4). Все эскейп-мутанты были протестированы в перекрестной РТГА (табл. 4) с панелью моноклональных антител, полученной против A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl.

По данным перекрестной РТГА моноклональные антитела можно разделить на две группы по распознаваемым ими эпитопам: К первой группе принадлежат МКАТ 1Е7, 3D9, 6A3, 3A3, 5F7, а ко второй - МКАТ 10G2. Эскейп-мутанты, селекционированные МКАТ 10G2, в перекрестной РТГА не реагируют только с тем МКАТ, с помощью которого были получены Эскейп-мутанты, отобранные МКАТ 1Е7, 3D9 и 3А3, не реагировали с этими МКАТ, а также с МКАТ 6А3, тогда как мутанты, отобранные МКАТ 5F7 и 6А3 резистентны как к МКАТ 5F7 и 6А3, так и к МКАТ 1Е7 и 3D9. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 1E7, 3D9, 3A3, 6A3 и 5F7, либо полностью, либо частично, перекрываются.

Таблица 4. РТГА эскейп-мутантов первого поколения с МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl.

Вирусы	МКАТ к A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl
	1E7	3D9	5F7	6A3	3A3	10G2
RеM8	102400	102400	51200	102400	102400	51200
m1E7(3)	<200	<200	25600	<200	<200	12800
m1E7(4)	<200	<200	51200	<200	<200	51200
m3D9(9)	200	<200	51200	<200	<200	51200
m3D9(1)	200	<200	102400	<200	<200	51200
m3D9(4)	200	<200	102400	<200	<200	25600
m3D9(5)	200	<200	51200	<200	<200	25600
m3D9(12)	<200	<200	12800	<200	<200	12800
m3A3(3)	400	400	51200	400	400	25600
m3A3(5)	200	400	102400	200	200	51200
m5F7(10)	3200	400	400	400	25600	25600
m5F7(11)	3200	400	400	400	25600	12800
m6A3(1)	3200	1600	400	400	51200	25600
m6A3(5)	3200	1600	800	400	51200	25600
m10G2(2)	25600	12800	12800	12800	25600	<200
m10G2(4)	51200	25600	25600	12800	51200	<200
m10G2(6)	25600	12800	25600	51200	25600	<200
m10G2(7)	51200	12800	25600	51200	25600	<200
m10G2(12)	409600	102400	51200	204800	102400	<200

2.2. Секвенирование НА эскейп-мутантов первого поколения

Для выявления аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с МКАТ к A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl и характеристики полученных эскейп-мутантов, было проведено секвенирование генов HA исходного вируса ReM8 и селекционированных эскейп-мутантов. Секвенирование показало, что полученные эскейп-мутанты несут одну, две или три аминокислотные замены в составе субъединицы HA1.

Для антигенной структуры НА подтипа Н1 традиционно принята иная номенклатура антигенных сайтов, чем у подтипа Н3. Антигенные сайты Sa и Sb в НА подипа Н1 [Caton et al., 1980] соответствуют разным участкам сайта В подтипа Н3.

Аминокислотные замены в позициях 156, 158, 159 у мутантов (табл. 6), резистентных к МКАТ 5F7, 6A3, 3A3, 1E7, 3D9, относятся к антигенному сайту Sa подтипа Н1, который соответствует части антигенного сайта В подтипа Н3. Причем МКАТ 1E7, 6A3, 3D9 распознают в РТГА позиции 156, 158, 159 (табл. 4), тогда как МКАТ 3A3 распознает позиции 156, 159, и только одну аминокислотную позицию 158 распознает МКАТ 5F7. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F7, 6A3, 1E7, 3D9, имеют разную степень протяженности и частично перекрываются, что подтверждает данные перекрестной РТГА.

Эскейп-мутант m3D9(12) имеет две аминокислотные замены, одна из которых K163N относится к антигенному сайту Sa в молекуле НА подтипа Н1, а другая - Q192L относится к антигенному сайту Sb подтипа Н1. Аминокислотная замена лизина на аспарагин в позиции 163 дает появление потенциального сайта гликозилирования. По данным РТГА невозможно точно определить какая из этих замен влияет на антигенность, а также утверждать, что МКАТ 3D9 перекрывает два антигенных сайта, как это было описано ранее для подтипа Н5 [Кaverin et al. 2007].

Под действием МКАТ 10G2, было отобрано пять одиночных эскейп-мутантов, три из которых имели одиночную замену в позиции 190, относящуюся к антигенному сайту Sb в молекуле НА подтипа Н1. Мутант m10G2(7) помимо той же замены D190N имел дополнительную замену S210N, а мутант m10G2(12) имел другую замену в позиции 190, D190E, а также дополнительные замены G228E и K285M (табл. 6). Позиции 210, 228 и 285 находятся вне антигенных сайтов молекулы НА подтипа Н1, и как показывают данные перекрестной РТГА, не влияют на антигенность (табл. 4).

3. Селекция, антигенная характеристика и секвенирование эскейп-мутантов второго поколениия

Для расширения данных об антигенных эпитопах и аминокислотных заменах в молекуле НА подтипа Н1, вовлеченных во взаимодействие с нейтрализующими МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl, пять мутантов первого поколения, m3D9(9), m5F7(10), m3A3(3), m6A3(5) и m10G2(12), были использованы для селекции 11 эскейп-мутантов второго поколения.

Секвенирование генов НА мутантов второго поколения выявило новые аминокислотные замены в молекуле НА. Селекционированные с помощью МКАТ 5F7 эскейп-мутанты второго m3A3(3)-5F7(28) и m3D9(9)-5F7(17) имели новые аминокислотные замены в позиции 129 (N129S и N129D соответственно). Таким образом, МКАТ 5F7 способно отбирать эскейп-мутанты с заменами не только в позиции 158, но и в позиции 129. Позиция 129 относится к сайту Sa в молекуле НА подтипа Н1.

Мутанты первого и второго поколения были охарактеризованы в перекрестной ТФИФА со всей панелью МКАТ. В целом результаты перекрестной РТГА и ТФИФА совпадают. Лишь некоторые эскейп-мутанты, не реагируя в РТГА, сохраняли способность связывать МКАТ. Данные РТГА, ТФИФА и секвенирования позволяют выявить аминокислотные остатки, распознаваемые каждым МКАТ. МКАТ 1E7, 6A3, 3D9 распознают в РТГА позиции 156, 158, 159, а также 163 или 192 (табл. 5), тогда как МКАТ 3A3 распознает позиции 156, 159, 163 или 192, и МКАТ 5F7 - только позиции 158 и 129. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F7, 6A3, 1E7, 3D9, разной степени протяженности и частично перекрываются.

Таблица 5. Аминокислотные позиции, распознаваемые МКАТ к A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl.

МКАТ	Аминокислотные позиции
3D9	156 158 159 (163 или 192)
5F7	129 158
6A3	156 158 159 (163 или 192)
3A3	156 159 (163 или 192)
1E7	156 158 159 (163 или 192)
10G2	190

Позиции аминокислотных замен, селекционируемых определенным МКАТ обозначены полужирным курсивом. В скобках обозначены позиции, для выбора между которыми в отношении их антигенной значимости нет достаточных данных.

4. окализация аминокислотных позиций, распознаваемых МКАТ к вирусу A(H1N1)pdm09, в трехмерной структуре НА

Аминокислотные замены всех полученных эскейп-мутантов были нанесены на трехмерную структуру гемагглютинина подтипа Н1N1, сделанную по данным рентгеноструктурного анализа вируса А/California/04/09 Н1N1 (pdb файл - 3lzg) [Xu et al., 2010] (рис. 2).

Аминокислотные замены у мутантов, резистентных к МКАТ 5F7, 6A3, 3A3, 1E7, расположены в верхушке глобулы субъединицы НА1 и относятся к антигенному сайту Sa подтипа Н1, что соответствует антигенному сайту В подтипа Н3. У мутантов, резистентных к МКАТ 3D9, аминокислотные замены расположены в позициях 156, 163, что относится к антигенному сайту Sa подтипа Н1, и в позиции 192, которая расположена в антигеном сайте Sb подтипа Н1. Не исключено, что МКАТ 3D9 способно перекрывать два антигенных сайта. Стоит также отметить появление в позиции 163 потенциального сайта гликозилирования, который может экранировать антигенные детерминанты.

МКАТ 10G2 селекционирует эскейп-мутанты с аминокислотными заменами в позиции 190, которая расположена в -спиральном участке верхушки глобулы молекулы НА и соответствует антигенному сайту Sb подтипа Н1. У мутантов m10G2(7) и m10G2(12) помимо замены в позиции 190 присутствуют и дополнительные замены в позициях 210, 228, 285, которые находятся вне антигенных сайтов и не влияют антигенность. Позиции 190, 192 и 228 находятся непосредственно на краю рецептор-связывающего кармана, что может влиять на рецепторную специфичность эскейп-мутантов по отношению к вирусу дикого типа. Таким образом, выявленные аминокислотные замены в молекуле НА подтипа Н1 сформированы выступающими аминокислотными остатками на вершине глобулы НА в области, соответствующей сайту В подтипа Н3, и могут прямо распознаваться иммунной системой.

Рис. 2. Антигенные сайты гемагглютинина подтипа Н1 по данным анализа эскейп-мутантов вируса A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl.

Примечание. Цветом обозначены антигенные сайты подтипа Н1. Аминокислотные позиции обозначены в нумерации Н3. Аминокислотная позиции 210 не показана на рисунке, так как не видна при данной проекции молекулы Н1.

Таблица 6. Аминокислотные замены в НА у эскейп-мутантов, селекционированных МКАТ против вируса A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl.

МКАТ	Эскейп-мутанты	Аминокислотные замены в нумерации Н3	Аминокислотные замены в нумерации Н1
3D9	m3D9(1), m3D9(4), m3D9(5), m3D9(9), m3D9(12)	K156E K163N; Q192L	K153E K160N; Q189L
5F7	m5F7(10), m5F7(11)	G158E	G155E
6A3	m6A3(1), m6A3(5)	G158E	G155E
3A3	m3A3(3), m3A3(5)	N159D	N156D
1E7	m1E7(3), m1E7(4)	N159D	N156D
10G2	m10G2(2), m10G2(4), m10G2(6) m10G2(7) m10G2(12)	D190N D190N; S210N D190Е; G228E; K285M	D187N D187N; S207N D187Е; G225E; K283M
3D9, 5F7	m3D9(9)-5F7(14) m3D9(9)-5F7(17)	K156E; G158E K156E; N129D	K153E; G155E K153E; N125D
5F7, 3A3	m5F7(10)-3A3(1), m5F7-3A3(4)	G158E; N159D	G155E; N156D
5F7, 10G2	m5F7(10)-10G2	G158E; D190N	G155E; D187N
3A3, 5F7	m3A3(3)-5F7(28) m3A3(3)-5F7(29)	N159D; N129S N159D; G158E	N156D; N125S N156D; G155E
3A3, 10G2	m3A3(3)-10G2	N159D; D190N	N156D; D187N
6A3, 10G2	m6A3(3)-10G2(3), m6A3(3)-10G2(4)	G158E; D190E	G155E; D187E
10G2, 6A3	m10G2(12)-6A3(10)	N159D; D190E; G228E; K285M	N156D; D187E; G225E; K283M

3. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов вирусов гриппа А подтипов Н1 и Н5 с сиало-олигосахаридами

У полученных эскейп-мутантов подтипов Н1 и Н5 были выявлены замены, расположенные в рецептор-связывающем кармане в позициях 185 и 222 (у Н5), 190, 192, 228 (у Н1), которые могут приводить к изменению рецепторной специфичности. Поэтому было уместным исследовать взаимодействие эскейп-мутантов с различными сиалосодержащими аналогами клеточных рецепторов.

3.1. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа Н5

В таблице 7 приведены данные ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами с вирусом дикого типа A/Mlrd/PA-MA (H5N2) и эскейп-мутантами, где представлены цифры, которые соответствуют последнему разведению сиало-олигосахарида, тормозящему агглютинацию эритроцитов. Сродство вируса к сиало-олигосахаридам выражали в мкМ сиаловой кислоты (чем больше цифра, тем слабее связывание). Вирус дикого типа A/Mlrd/PA-MA (H5N2) показал приблизительно одинаково хорошее сродство к 3ТSL, 3ТSLN, 6-su-3ТSLN, SiaLec, и фактическое отсутствие взаимодействия с фукозилированными сиало-олигосахаридами SiaLex  и SiaLea (табл. 7).

У эскейп-мутанта m6F3(15) с заменами S128P, P185S, K222N наблюдалось изменение рецепторной специфичности, а именно увеличение сродства с SiaLex  и SiaLea, почти отсутствующего у вируса дикого типа. Так как мутант m6F3(11) с заменой S128P не взаимодействовал с SiaLex  и SiaLea, а позиция 185 не находится на поверхности молекулы НА, то скорее всего за данное изменение рецепторной специфичности у мутанта m6F3(15) ответственна замена K222N, которая находится на краю рецептор-связывающего кармана и меняет электростатический заряд. Остальные аминокислотные замены, влияющие на взаимодействие с МКАТ, не оказывали у эскейп-мутантов вируса подтипа Н5 выраженного влияния на сродство к сиаловым рецепторам.

Таблица 7. Рецептор-связывающая активность вируса дикого типа и его эскейп-мутантов подтипа Н5 с сиало-олигосахаридами.

Вирусы	Замены в НА (нумерация H3)	Сиало-олигосахариды, мкМ сиаловой к-ты
		3ТSL	3ТSLN	6-su-3ТSLN	Sialex	SiaLea	Sialec
A/Mlrd/PA-MA	-	0,063	0,031	0,031	4	4	0,031
m3G9(1)	R166W	0,063	0,125	0,125	4	4	0,063
m3G9(2)	Q122K l124F(HA2)	0,031	0,031	0,031	4	4	0,031
m3G9(3)	R166K	0,031	0,031	0,031	4	>4	0,063
m6F3(11)	S128P	0,031	0,063	0,031	4	4	0,031
m6F3(15)	S128P P185S K222N	0,063	0,125	0,063	0,063	0,125	0,063
m4F11(1)	G143D A198T(HA2)	0,125	0,063	0,063	4	>4	0,125
m4F11(4)	S145P	0,063	0,031	0,031	4	>4	0,063
m5F12(5)	I124L R76G(НА2)	0,063	0,063	0,031	4	>4	0,063
m5F12(7)	R166G M230T	0,031	0,031	0,031	4	4	0,031
m6E2(9)	K120I	0,063	0,031	0,063	4	4	0,063
m6E2(10)	S126F	0,063	0,031	0,031	4	>4	0,063
m5G9(1)	S125(a)I	0,063	0,031	0,063	1	4	0,031
m5G9(4)	S126Y T156A(HA2)	0,125	0,031	0,063	1	4	0,063
m5G9(5)	P125S	0,125	0,063	0,063	1	>4	0,063

3.2. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа Н1

Для определения рецепторной специфичности с синтезированными высокомолекулярными сиало-олигосахаридами (1000-2000кDa) были выбраны 6 эскейп-мутантов первого поколения и 8 эскейп-мутантов второго поколения с разными аминокислотными заменами в молекуле НА. В таблице 8 приведены данные ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами с вирусом дикого типа ReM8 и эскейп-мутантами. Реакция ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами выявила, что вирус дикого типа ReM8 обладает сродством к фукозилированным -(2,3)- SiaLex и SiaLea и к -(2,6)- 6-su-6ТSLN сиалозидам, причем наиболее выражено сродство к SiaLea. У эскейп-мутантов первого и второго поколения с заменой K156E наблюдается снижение сродства к SiaLex и SiaLea, что коррелирует с появлением отрицательно заряженного аминокислотного остатка 156E. Еще более существенно снижается сродство к SiaLex и SiaLea у мутантов m10G2(12), m10G2(12)-6A3(10), что также коррелирует с появлением отрицательного заряда в позициях 190Е, 228Е и 159D.

Замены G158E и N159D у мутантов m5F7(10) и m3A3(3) расположены в трехмерной структуре НА вне рецептор-связывающего кармана, но появление отрицательного заряда в позициях 158 и 159 у мутантов вызывало уменьшение взаимодействия с SiaLex , SiaLea и резко ослабляло связывание с 6-su-6ТSLN.

У мутанта m10G2(6) с заменой D190N отмечается увеличение сродства к 3ТSL, 6-su-3ТSLN и небольшое улучшение связывания с SiaLex, SiaLea и 6-su-6ТSLN по сравнению с диким типом. Появление у мутантов второго поколения m3A3(3)-10G2 и m5F7(10)-10G2 замены D190N восстанавливает сродство к 6-su-6ТSLN, в то время как мутанты первого поколения m3A3(3) и m5F7(10) не связываются с данным сиало-олигосахаридом. Так как позиция 190 находится в -спиральном участке на краю рецептор-связывающего кармана, то аминокислотные замены, приводящие к уменьшению отрицательного заряда 190N, оказывают сильное влияние на связывание с сульфатированным 6Т-сиалиллактозамином.

Таким образом, снижение электростатического заряда в результате аминокислотных замен у эскейп-мутантов вируса H1N1, в отличие от вируса H5N1, ослабляло сродство к аналогам клеточных рецепторов.

4. Поиск аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов, среди циркулирующих изолятов Н5N1 и Н1N1

Для того чтобы узнать насколько вовлечены полученные при селекции эскейп-мутантов замены в НА1 в антигенный дрейф вирусов гриппа А был осуществлен скриниг аминокислотных последовательностей НА в Генбанке для штаммов, выделенных в разные годы.

1. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н1, среди изолятов пандемического вируса подтипа Н1N1

С помощью данных Генбанка было просмотрено 9019 аминокислотных последовательностей НА штаммов вирусов гриппа А подтипа Н1N1, выделенных с 2009 по 2011 год (табл. 9). Только 163 штамма содержали те же аминокислотные замены, что были обнаружены у эскейп-мутантов, селекционированных МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. Наиболее часто встречалась аминокислотная замена N129D, особенно в 2010-2011 годах, тогда как остальные замены быстро исчезли при циркуляции вирусов Н1N1.

Таблица 8. Рецептор-связывающая активность вируса дикого типа подтипа Н1 и его эскейп-мутантов с сиало-олигосахаридами.

Вирусы	Замены в НА (нумерация H3)	Сиало-олигосахариды, мкМ сиаловой к-ты
		3ТSL	3ТSLN	6-su-3ТSLN	Sialex	SiaLea	Sialec	6ТSL	6ТSLN	6-su-6ТSLN
ReM8	-	4	4	2	0,25	0,063	2	>4	>4	0,25
m3D9(9)	K156E	4	4	4	0,5	0,5	4	>4	>4	>4
m3D9(12)	K163N Q192L	4	4	4	0,5	0,125	4	>4	>4	4
m5F7(10)	G158E	4	>4	4	0,5	0,25	>4	>4	>4	>4
m3A3(3)	N159D	4	4	4	0,5	0,125	2	>4	>4	>4
m10G2(6)	D190N	0,5	4	0,5	0,125	0,031	1	4	>4	0,063
m10G2(12)	D190E G228E K285M	4	4	4	2	1	4	>4	>4	0,125
m3D9(9)-5F7(14)	K156E G158E	>4	>4	>4	1	0,5	4	>4	>4	>4
m3D9(9)-5F7(17)	K156E N129D	4	>4	>4	1	0,5	4	>4	>4	>4
m5F7(10)-10G2	G158E D190N	2	>4	4	0,25	0,125	>4	>4	>4	0,125
m3A3(3)-5F7(28)	N159D N129S	4	4	4	0,5	0,25	4	>4	>4	>4
m3A3(3)-5F7(29)	N159D G158E	4	4	4	0,5	0,5	4	>4	>4	>4
m3A3(3)-10G2	N159D D190N	2	>4	2	0,25	0,125	4	>4	>4	0,125
m6A3(5)-10G2(3)	G158E D190E	4	4	1	0,063	0,063	2	>4	>4	1
m10G2(12)-6A3(10)	N159D D190E G228E K285M	4	4	2	2	1	4	>4	>4	>4

Таблица 9. Аминокислотные замены в НА у штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, выделенных в 2009-2011гг., идентичные тем, которые были обнаружены у эскейп-мутантов.

Аминокислотные замены	Год
	2009	2010	2011
N129D	6	78	30
N129S	1	0	4
K156E	11	3	1
G158E	15	1	1
N159D	3	1	3
D190N	5	0	0

2. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н5 среди изолятов подтипа Н5N1, выделенных от птиц

У вируса гриппа А птиц подтипа Н5, в отличие от большинства вирусов гриппа птиц, отмечалось подобие антигенного дрейфа, что связывают с вакцинацией кур, проводившейся в некоторых странах Азии и Африки [Abdel-Moneim et al., 2011]. Поэтому представляет интерес наличие мутаций, обеспечивающих устойчивость к нейтрализующим антителам, у изолятов H5N1. C помощью данных Генбанка было просмотрено 3585 аминокислотных последовательностей НА штаммов вирусов гриппа А птиц подтипа Н5N1, выделенных с 2003 по 2011 год (табл. 10).

Стоит отметить, что наиболее часто встречались замены по четырем аминокислотным позициям 128, 145, 166 и 185, в гораздо меньшем количестве встречались замены в позициях 122, 125, 126. Возможно, это обусловлено как преимущественной ролью антител, распознающих эти четыре позиции (128, 145, 166 и 185), в резистентности вакцинированных птиц к вирусу, так и негативным влиянием других замен на жизнеспособность вируса.

В работе были охарактеризованы антигенные участки гемагглютинина двух разных подтипов вируса гриппа А птиц Н5N1 и человека Н1N1. Полученные данные по характеристике эпитопов вируса гриппа птиц Н5N1 позволяют уточнить и дополнить картину антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5, а также выявляют в молекуле гемагглютинина вируса H5N1 цинхайской ветви ту область, которая ответственна за индукцию вируснейтрализующих антител, и указывают на существенные изменения иммунодоминантной области гемагглютинина, распознаваемой антителами, в ходе эволюции вирусов подтипа Н5 при циркуляции в природе. Антигенное картирование гемагглютинина пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать аминокислотные позиции, распознаваемые вируснейтрализующими моноклональными антителами против штамма A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl, причем 4 аминокислотные замены вызывали снижение сродства к аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в гемагглютинине подтипа Н1 природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Выводы

1. Впервые охарактеризованы антигенные эпитопы молекулы гемагглютинина вируса гриппа А, распознаваемые моноклональными антителами против высокопатогенного вируса подтипа H5N1, выделенного на территории России. Полученные результаты позволяют уточнить и дополнить картину антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5, а также выявляют область в молекуле гемагглютинина, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа H5N1 цинхайского варианта, распространившемуся в странах Европы и Африки.
2. Аминокислотные замены в гемагглютинине эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях гемагглютинина у природных изолятов вирусов гриппа подтипа Н5N1.
3. Селекция и характеристика 27 эскейп-мутантов позволила идентифицировать 5 аминокислотных позиций в гемагглютинине штамма A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl (129, 156, 158, 159, 190), распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными  антителами против пандемического вируса A(H1N1)pdm09.
4. Выявлено влияние антигенно значимых аминокислотных замен на сродство гемагглютинина эскейп-мутантов к сиалосодержащим аналогам клеточных рецепторов.
5. Для гемагглютинина подтипа Н1 выявлена корреляция изменений степени сродства к сиалогликополимерам с изменениями электростатического заряда в области гемагглютинина, прилегающей к рецептор-связывающему карману. Аминокислотные замены в позициях 156, 158 и 159 у эскейп-мутантов вируса A(H1N1)pdm09, идентифицированные как ответственные за резистентность к моноклональным антителам, вызывали снижение сродства к аналогам клеточных рецепторов.
6. Аминокислотные замены, обнаруженные у эскейп-мутантов, встречаются среди штаммов вирусов гриппа А(Н1N1)pdm09, выделенных с 2009 по 2011 год, крайне редко и не удерживаются в циркуляции, за исключением замены в позиции 129. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в гемагглютинине природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Rudneva I.A., Kushch A.A., Masalova O.V., Timofeeva T.A., Klimova R.R., Shilov A.A., Ignatieva A.V., Krylov P.S., Kaverin N.V. Antigenic epitopes in the hemagglutinin of Qinghai-type influenza H5N1 virus.// Viral Immunology. - 2010. - V. 23. - №2. - P. 181 -187.
2. Игнатьева А.В., Руднева И.А., Тимофеева Т.А., Шилов А.А., Забережный А.Д., Алипер Т. И., Каверин Н.В., Львов Д.К. Высокопродуктивный вирус-реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу пандемического вируса гриппа А/Moscow/01/2009 (H1N1).// Вопросы вирусологии. - 2010. - Т. 56. - №4. - С. 9-14.
3. Timofeeva T.A., Ignatieva A.V., Rudneva I.A., Shilov A.A., Kaverin N.V. Yields of virus reassortants containing the HA gene of pandemic influenza 2009 virus.// Acta Virologica. - 2012. - V. 56. - №2. - P. 149-151.
4. Rudneva I, Ignatieva A, Timofeeva T, Shilov A, Kushch A, Masalova O, Klimova R, Bovin N, Mochalova L, Kaverin N. Escape mutants of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus: Variations in antigenic specificity and receptor affinity of the hemagglutinin.// Virus Research. - 2012. - V. 166. - P. 61-67.
5. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Ignatieva A.V., Kushch A.A., Masalova O.V., Klimova R.R. Escape mutants of influenza A (H1N1) virus of the 2009 pandemic: variations in the antigenic specificity and receptor affinity of the hemagglutinin.// American Society for Virology, 30th Annual Meeting, Minneapolis, Minnesota. - 16-20 July 2011. - W3-5.
6. Ignatieva A.V. Reassortment procedure by crossing different Influenza A viruses.// Free University of Berlin. Young scientist workshop "Methods to study influenza virus". - 20-23 September 2011. - P. 21-22.

Благодарности.

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, профессору, академику РАМН, заведующему лабораторией физиологии вирусов Каверину Николаю Вениаминовичу за предоставление возможности проводить данные исследования, определение целей, всестороннюю помощь и внимание к проводимой работе. Искренне благодарю ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Рудневу Ирину Александровну за всестороннюю поддержку, понимание и терпение, всемерную помощь и непосредственное участие в работе. Благодарю ведущего научного сотрудника Шилова Александра Александровича и заведующего лабораторией молекулярной генетики Прилипова Алексея Геннадьевича за помощь в проведении секвенирования. Благодарю старшего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Тимофееву Татьяну Анатольевну, ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Варич Наталью Львовну и остальных сотрудников лаборатории физиологии вирусов за помощь и поддержку в ходе проведения научной работы. Благодарю заведуюшую лабораторией клеточной инженерии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития Кущ Аллу Александровну за предоставление моноклональных антител для выполнения работы. Выражаю глубокую признательность за консультации и помощь в освоении методик определения сродства гемагглютинина вируса гриппа А к сиалосодержащим рецепторным аналогам, а также предоставление реактивов, ведущего научного сотрудника НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, Мочаловой Ларисе Витальевне, заведующему лабораторией углеводов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, доктору химических наук Бовину Николаю Владимировичу, а также заведующей лабораторией поисковых исследований НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов Гамбарян Александре Сергеевне.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии