Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КУЗНЕЦОВА Екатерина Михайловна
ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Саратов - 2011
Работа выполнена в ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна
Официальные оппоненты:
Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова Минсельхоза Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Матора Лариса Юрьевна доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, заместитель директора по научной работе
Ведущая организация:
ФКУЗ Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Защита состоится л 21 марта 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб (410005, г. Саратов, Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб Роспотребнадзора.
Автореферат разослан л 8 февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А. А.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории Российской Федерации и соседних стран [Trnvik A. et al., 2004; Топорков В.П. и др., 2007, Мещерякова И. С. и др., 2007; Безсмертный В.Е. и др., 2008; Wang Y. et al., 2011]. Возбудитель туляремии - Francisella tularensis включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001; Gallagher-Smith M. et al., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не изучены [Havlasova J.
et al., 2002; Sjstedt A., 2003; Eyles J.E., 2007; Oyston P.C.F., 2008; Santic M., 2010; Broms J.
E. et al., 2011].
абораторная диагностика туляремии основывается на иммунологических (сероаллергологическая диагностика) и бактериологических методах, в настоящее время дополнена молекулярно-генетическими методами [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoеsser W. D. et al., 2005; Осина Н. А. и др., 2007; Романова Л. В., 2008; Johansson A.
et al., 2010; Ветчинин С. С. и др., 2011; Larson M. F. et al., 2011].
У возбудителя туляремии липополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как основа для создания профилактических и диагностических препаратов [Хлебников В.С. и др., 1992, 1993; Аронова Н. В., Павлович Н. В., 2000; Ellis J. et al., 2002; Conlan J.W., 2004; Oyston P.C.F., 2008, Beasley A.S.
et al., 2011, Zarella T.M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплексных антигенов F. tularensis [Trnvik A., Berglund L., 2003; Splettstoеsser W. D. et al., 2005;
Pierson T. et al., 2011]. Получаемые по классическому методу А. Boivin (1933) липополисахаридо-белковые комплексы (ЛПБК) возбудителя туляремии содержат до 10 % белка и характеризуются высокой серологической активностью [Родионова И.В., Шипицина Г.К., 1967]. В зависимости от способа получения ЛПБК имеют различный состав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. tularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультразвуком с последующим ультрацентрифугированием, с содержанием 12-22 % белка (25 белковых фракций) и 40 % липидов [Хлебников В.С. и др., 1991]. При обработке ВМ растворами детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников В.С. и др., 1992, Кулевацкий Д.П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодоминантные белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С.Ф. и др., 1992; Кулевацкий Д.П., 1994] и белок-шаперон 63 кДа (GroEL) [Коровина О.В., 1993]. Комплекс ЛПС-17кДа белок рассматривается в качестве прототипа химической туляремийной вакцины [Khlebnikov V.S. et al., 1996], также как и один из препаратов ЛПБК ВМ F. tularensis - С-комплекс [Жемчугов В.Е., 2004; патенты РФ 2147234, 2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплекса туляремийного микроба в условиях масштабированного культивирования штамма-продуцента F. tularensis 15 НИИЭГ был разработан метод его изоэлектрической преципитации [Шепелв И.А., 2005]. С использованием этого подхода нами был получен препарат ЛПБК туляремийного микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компонента (более 60 %) и высокой протективной активностью при экспериментальной туляремии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протективный антигенный комплекс - ПАК [Кузнецова Е.М. и др., 2011].
Несмотря на достигнутые успехи в исследовании антигенных комплексов ВМ F. tularensis важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологически активной форме. Изучение особенностей состава и свойств комплексных антигенов туляремийного микроба разных подвидов позволит провести их детальную характеристику.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Получить диагностически значимые антигенные комплексы F. tularensis и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагностические препараты.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Оптимизировать способы получения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба.
2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляремийного микроба разных подвидов.
3. Получить высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки к протективному антигенному комплексу туляремийного микроба и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагностикумы для детекции возбудителя туляремии.
4. Разработать на основе антигенных комплексов туляремийного микроба экспериментальные препараты для детекции специфических антител.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Оптимизированы способы получения биомассы F. tularensis для последующего выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки № 2010131275 на изобретение Способ получения биомассы туляремийного микроба (приоритет от 26.07.10 г). Для получения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба были усовершенствованы способы их выделения и количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилированный белковый комплекс туляремийного микроба, обладающий выраженной иммуногенностью и высокой специфичностью, хроматографически гомогенный, с молекулярной массой (571) кДа, состоящий из двух белковых субъединиц (и 14-17 кДа). Выделен протективный антигенный комплекс, установлен его компонентный состав: субъединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 1417 кДа - липопротеидную. С помощью протеомного анализа в составе протективного антигенного комплекса впервые показано наличие следующих идентифицированных белков:
белков-шаперонов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KatG, AcpP), белков ВМ (OmpH, FTL_0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протективный антигенный комплекс является видоспецифичным антигеном, регистрируется у F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности штамма, формы ЛПС бактериальной клетки и наличия капсулы.
Впервые на основе сравнительного анализа структуры и свойств препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japonica, subsp. nearctica, subsp. mediаasiatica, установлено, что все препараты обладают иммуногенностью, сходны по химическому составу и содержат иммунохимически активные субъединицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммунохимической активностью, увеличением содержания углеводной части на (703) %, наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в области 57-85 кДа.
Сконструированы экспериментальные антительные и антигенные туляремийные диагностикумы. Использование ПАК и гликозилированного белкового комплекса в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге, ИФА и ДИА позволяет определять туляремийные антитела в крови вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных. Чувствительность экспериментальных антительных диагностикумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиагностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104-105 м.к./мл. Сконструированный иммуносуспензионный диагностикум в реакции латекс агглютинации (РЛА) позволяет выявлять содержащие капсулу (Cap+) и бескапсульные (Cap-) штаммы F. tularensis в отличии от коммерческого диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), выявляющего только Cap+-штаммы.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа и Получение гликозилированного белкового комплекса внешних мембран клеток туляремийного микроба, одобренные Ученым советом РосНИПЧИ Микроб (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.
В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб депонирован бескапсульный штамм F. tularensis holarctica КМ 9, производный вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ, который может быть использован при создании диагностических туляремийных тест-систем для детекции Cap- штаммов.
Выделенные препараты ПАК разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ Микроб. Научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба, полученные в результате работы, включены в теоретический материал при чтении лекций цикла Микробиология и лабораторная диагностика туляремии на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности бактериология в институте Микроб.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Оптимизированный метод выделения комплексных антигенов туляремийного микроба, основанный на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза с последующей хроматографической очисткой, позволяет получать иммунохимически активные препараты.
2. Протективный антигенный комплекс является общим антигеном для туляремийного микроба основных подвидов (subsp. holarctica, nearctica, mediаasiatica), обладает сходной структурой и свойствами.
3. Особенности биохимического и иммунохимического строения протективного антигенного комплекса из F. tularensis subsp. novicida обусловливают снижение его иммуногенности по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.
4. Экспериментальные антительные препараты на основе гипериммунных поликлональных кроличьих сывороток к протективному антигенному комплексу туляремийного микроба позволяют выявлять в различных вариантах иммуноанализа клетки F. tularensis разных подвидов в минимальном количестве 104-105 м.к./мл, а также антиген в минимальной концентрации (0,50,1) нг/мл.
5. Экспериментальные иммунодиагностические препараты на основе антигенных комплексов позволяют выявлять специфические противотуляремийные антитела у лабораторных животных (вакцинированных, инфицированных и переболевших) и в гипериммунных сыворотках.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях, Волгоград, 2005, на Российской научно-практической конференции Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины, Санкт-Петербург, 2006, на VII Межгосударственной научнопрактической конференции Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита Группы восьми и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ, п. Оболенск, 2006, на IХ Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007, на научно-практической конференции Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России, Ставрополь, 2007, на IX Межгосударственной научно-практической конференции Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ, Волгоград, 2008, на научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора Биологическая безопасность в современном мире, п. Оболенск, 2009, на Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения, Нижний Новгород, 2009, на X Межгосударственной научно-практической конференции Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ, Ставрополь, 2010, на научнопрактической конференции молодых ученых Роспотребнадзора Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения, Н. Новгород, 2011, на III научнопрактической школе-конференции молодых ученых и специалистов научноисследовательских учреждений Роспотребнадзора, п. Оболенск, 2011, на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ Микроб, Саратов, 2005-2011 гг.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них статей в изданиях, рекомендованных ПеречнемЕ ВАК России.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объем диссертации 150 страниц. Список литературы содержит 321 источник, из них 177 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 18 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Работа выполнена с использованием 65 штаммов F. tularensis разных подвидов и биоваров (holarctica: eryR, eryS, japonica; nearctica, mediаasiatica, novicida), а также 30 гетерологичных микроорганизмов. Все штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб. Культивирование туляремийного микроба проводили при 37 оС на плотных и жидких питательных средах FT, T и LB. Анализ коэффициентов сходства фенограмм штаммов F. tularensis рассчитывали по формуле Дисе [Звягинцева И. С. и др., 1999].
Для получения препаратов ПАК разных подвидов использовали методику, разработанную ранее для выделения антигенного комплекса из вакцинного штамма [Шепелв И.А., 2005] в нашей модификации.
Концентрацию белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот определяли общепринятыми методами [Спирин А.С., 1958; Amenta J., 1964; Сборник инструкций по методам контроляЕ, 1983; Скоупс Р., 1985]. Электрофорез в полиамилакридном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по U. Laemmli [1970] в 4 % концентрирующем и 10-12,5 % разделяющих гелях. Для детекции белков использовали окрашивание Кумасси яркосиним R-250, для ЛПС-содержащих компонентов - азотнокислым серебром. Иммуноблоттинг проводили по методу H. Towbin [1979].
Протеомный анализ ПАК был проведен в ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва) по договору о научно-исследовательском сотрудничестве. Белки идентифицировали с помощью программы Mascot в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, 2010 г.). Надежно идентифицированными (p< 0,05) считались белки с критерием достоверности score > 74.
Для получения сывороток к антигенным комплексам туляремийного микроба использовали взрослых (2 кг) кроликов породы Шиншилла. Иммуноглобулиновые фракции (Ig ПАК) выделяли по L. Rane, L. Newhauser [1954]. Для постановки метода флуоресцирующих антител (МФА) использовали препарат Ig ПАК и его F(ab,)2-фрагменты, меченные флуоресцеинизотиоцианатом по методу J. Marshall et al. [1958]. Иммунопероксидазный конъюгат получали методом перйодатного окисления [Фримель Г., 1987]. Для прямого ДИА использовали антитела, конъюгированные с коллоидными металлами (серебром - проведено в РосНИПЧИ Микроб Н.А. Шараповой, золотом - в ИБФРМ РАН д.б.н. Л.А.
Дыкманом).
Для очистки препаратов антигенов и иммуноглобулинов, разделения их компонентов применяли колоночную хроматографию с использованием различных носителей на хроматографе низкого давления Biologic LP фирмы Bio-RAD (США). В работе использовали РНГА с иммуноглобулиновым и антигенным диагностикумами (л48 ЦНИИ МО РФ г. Киров, СтавНИПЧИ г. Ставрополь), ИФА и ДИА с экспериментальными препаратами и коммерческими тест-системами (СтавНИПЧИ).
Для изучения иммуногенности полученных препаратов использовали беспородных белых мышей (191 г) и морских свинок (25020 г). Среднюю заражающую дозу (LD50) вирулентных штаммов F. tularensis и среднюю иммунизирующую дозу (ED50) антигенных препаратов рассчитывали по методу Кербера. Работу с животными проводили по стандартным методикам [МУ 3.3.1.2161-07].
При обработке полученных результатов применяли общепринятые статистические методы, вычисляя среднеарифметические величины, степень достоверности различий по t-критерию Стьюдента, исходя из уровня значимости (Р) 0,05 (95 %) [Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962; Рокицкий П.Ф., 1973].
Результаты исследований и их обсуждение Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и характеристика их компонентного состава. Протективный антигенный комплекс туляремийного микроба, полученный из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (ПАК-15), представляет собой антиген сложной химической природы, в состав которого входят белки, липиды и углеводы в соотношении 3:1:1. Данный препарат характеризуется высокой иммунохимической активностью. Особенности этого комплексного антигена по сравнению с другими ЛПБК представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Сравнительная характеристика препаратов ЛПБК и ПАК F. tularensis 15.
Препарат Способ получения М. масса, Белок, ED501, ИФА2, кДа % мкг мкг/м л ЛПБК ВМ ультрацентрифугирование уль[Хлебников В.С. и др., тразвукового дезинтеграта бакте- Ч 12-22 720 1991] риальных клеток ЛПС-17 кДа белок обработка ВМ детергентами, [Кулевацкий Д.П., ультрацентрифугирование, 15-35 50 25 0,1994] колоночная гель-фильтрация дифференциальное центрифугиС-комплекс рование ультразвукового дезин[Патент РФ 2221591; 2000 15-26 261 теграта бактериальных клеток, Жемчугов В.Е., 2005] ультрафильтрация высаливание и изоэлектрическая ПАК-15 преципитация из водораствори- 28010 60-65 2,4 0,00мого пула ВМ 1 - ED50 препаратов при однократной подкожной иммунизации белых мышей с последующим заражением F. tularensis 503 в дозе 80-100 м.к.; 2 - ИФА со специфическими антителами.
Была проведена работа по определению состава белковых субъединиц ПАК-15 и их идентификации. С помощью SDS-PAGE был установлен белковый спектр данного антигена, представленный субъединицами с молекулярными массами от 10 до 85 кДа, мажорные из которых 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14 кДа были иммунохимически активны. Протеомным анализом в составе ПАК были идентифицированы 9 биологически активных молекул, специфических для F. tularensis (рисунок 1). Высокую иммунобиологическую активность ПАК, возможно, обусловливает присутствие в его составе стрессовых белков-шаперонов (GroES и GroEL), регуляторных белков (EF-Tu и RplL), бактериальных ферментов (GAPDH, KatG, AcpP) и белков ВМ (OmpH, FTL_0617).
А Б А - SDS-PAGЕ: 1 - белковый профиль, 2 - иммуноблоттинг с Ig ПАК, М - маркеры молекулярной массы.
Б - Двумерный PAG-электрофорез и идентифицированные белки.
Рисунок 1 - Определение субъединичного состава и идентификация белковых компонентов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба.
Учитывая сложную химическую природу протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, а также его высокую иммунохимическую активность, проводили работу по определению его активных компонентов. Было установлено, что ПАК-15 термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне рН от 1,0 до 13,0, обратимо преципитирует при 50-55 % насыщении сульфатом аммония. Химическим гидролизом растворами детергентов была определена белковая природа его основных субъединиц с молекулярными массами от 20 до 58 кДа. Наибольшей устойчивостью к действию детергентов обладали субъединицы с молекулярной массой 81-85 и 14-17 кДа. Максимальной иммунохимической активностью (титр в ДИА 1/102400) по сравнению с контрольным ПАК (1/51200) обладал модифицированный саркозилом препарат - ПАК-Д, который может использоваться как сенситин в ИФА и ДИА при определении специфических антител. Фенольная экстракция позволила разделить препарат ПАК-15 на две фракции: фенольную, на 70 % состоящую из углеводных и липидных компонентов, и водную, содержащую в своем составе мажорные белки ПАК-15 (78-80 % белка). Фенольная фракция обладала меньшей активностью (титр в ДИА 1/3200), чем водная (титр 1/25600). Присутствие в обеих фракциях двух иммунореактивных компонентов с молекулярными массами в диапазоне 14-17 кДа свидетельствовало о липопротеидной природе этих субъединиц, что согласуется с данными литературы [Sjstedt A. et al., 1991].
Установлена высокая чувствительность ПАК к действию пепсина, вызывающего его полный гидролиз, и протеиназы К, приводящей к гидролизу только белковой части и позволяющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для S-формы грамотрицательных бактерий. Иммунохимическая активность данного препарата по отношению к контролю была значительно ниже (титр в ДИА 1/800, по сравнению с контрольным 1/51200), что указывает на зависимость серологической активности компонентов ПАК от содержания в них белка.
Разработанный нами метод ферментативного гидролиза ПАК-15 проназой Е позволил получить комплексный антиген углевод-белковой природы (гликозилированный белковый комплекс). Препарат является хроматографически гомогеным, его молекулярная масса около (571) кДа, и содержит в своем составе, по данным SDS-PAGE, мембранные белки 41-и 14-17 кДа (рисунок 2) и О-полисахаридный компонент. Соотношение белков и углеводов - 2:1.
А Б А - белковый профиль (1), иммуноблоттинг с Ig ПАК (2), иммуноблоттинг с МкАт к ЛПС F. tularensis 15 НИИЭГ (3), М - маркеры молекулярной массы.
Б - гель-хроматография на Sephacryl S-300: по оси абсцисс - время элюции, мин; по оси ординат - оптическая плотность элюента при 280 нм (A.u.) Рисунок 2 - Результаты SDS-PAGE, иммуноблоттинга и гель-хроматографии гликозилированного белкового комплекса туляремийного микроба.
В экспериментах на лабораторных животных было установлено, что препарат гликозилированного белкового комплекса нетоксичен, безвреден, обладает высокой иммуногенной активностью. После однократной подкожной иммунизации белых мышей (дозой мкг) и морских свинок (дозой 1 мг) антительный ответ регистрировался на 7-е и 22-е сутки соответственно. Реакция лейкоцитолиза была резко положительная у мышей к 7-м суткам (33 %), у морских свинок - к 28-м суткам (35 %). В лостром опыте при заражении биомоделей вирулентным штаммом F. tularensis subsp. holarctica 503/840 (в дозе для белых мышей 100 LD50, для морских свинок - 1000 LD50) было установлено достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных углевод-белковым комплексом животных по сравнению с контрольной группой (Р0,05), ED50 для белых мышей составила (2,50,3) мкг, для морских свинок (20010) мкг.
Учитывая поверхностное расположение ПАК, был проведен эксперимент по определению участия данного антигена в формировании капсулоподобного вещества F. tularensis.
Нами с помощью обработки клеток акридиновым оранжевым [Sandstrm G. et al., 1988] из культуры F. tularensis 15 НИИЭГ были получены Сap- штамм F. tularensis КМ 9 (депонирован в ГКПБ Микроб) и субкультура в R-форме, которые взаимодействовали с Ig ПАК в ИФА, ДИА в концентрации 106 м.к./мл и иммуноблоттинге. При анализе состава ПАК из клеток бескапсульных штаммов F. tularensis LVS Сap- и КМ 9 было установлено, что по основным физико-химическим и иммунохимическим свойствам они сходны с аналогичными препаратами, выделенными из штаммов F. tularensis с Сap+ фенотипом. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что присутствие ПАК на поверхности клетки не зависит от формы ЛПС, и в его состав не входят антигенные компоненты капсулоподобного вещества туляремийного микроба.
Основываясь на полученных данных о составе и свойствах протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, была проведена работа по оптимизации условий культивирования штамма-продуцента и схемы выделения ПАК. Введение дробной подкормки (глюкозы совместно с витаминами группы В) при выращивании на жидкой питательной среде увеличивало выход ПАК. Учитывая литературные данные, что в условиях повышенной температуры увеличивается экспрессия белков-шаперонов F. tularensis [Роо манова Л.В, 2008; Savitt A.G. et al., 2009], было проведено культивирование при 42 С и 52 оС (тепловой шок). В результате не получили ожидаемого увеличения выхода ПАК или его компонентов, что может свидетельствовать о стабильности этого антигена. Применение комплексного подхода, основанного на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза ПАК с последующей хроматографической очисткой, позволило получить иммунохимически активные антигены - ПАК-Д и гликозилированный белковый комплекс (рисунок 3). С целью повышения технологичности выделения ПАК была уменьшена кратность циклов гидродинамической обработки клеток до двух, а фракционирование сульфатом аммония с последующим осаждением в изоточке позволило более эффективно освобождаться от балластных веществ.
Осадок Гидродинамический Биомасса стресс 25 мин микробных F. tularensis клеток Центрифугирование 20000 об/мин., 20 мин.
Культуральная Метод Супернатант жидкость изоэлектрической преципитации Фракционирование сульфатом диализ (рН 4,3) аммония до 50-55 % насыщения Ферментативный Гликозилированный ПАК гидролиз проназой Е белковый комплекс Обработка 2 % саркозилом NL30 ПАК-Д Рисунок 3 - Схема получения диагностически значимых антигенных комплексов туляремийного микроба.
Сравнительный анализ препаратов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, полученных из штаммов-продуцентов разных подвидов.
Для оценки возможности получения ПАК из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийного микроба был проведен электрофоретический анализ суммарных клеточных белков 65 штаммов F. tularensis. Коэффициент сходства суммарных клеточных белков F. tularensis внутри подвида в среднем составлял 99 %, между подвидами - 95 %, что соответствует литературным данным [Sjstedt A. B., 2003; Svensson K. et al., 2005]. Иммуноблоттингом доказано наличие белковых фракций протективного антигенного комплекса туляремийного микроба в составе всех исследуемых штаммов.
По оптимизированной методике, представленной на рисунке 3, нами были получены препараты ПАК из следующих штаммов-продуцентов: F. tularensis subsp. holarctica eryR 503/840 (ПАК-503), holarctica eryS В-300 (ПАК-В 300), holarctica japonica Miura (ПАК-Miura), nearctica В399 A`Сole (ПАК-A`Сole), mediаasiatica А 179 (ПАК-А 179), mediаasiatica А-61 (117) КМ 4 (ПАК-А 61), novicida Utah 112 (ПАК-Utah 112). Все штаммы по проведенным биохимическим тестам внутривидового типирования соответствовали своему подвиду. В результате сравнительного анализа физико-химических, антигенных и биохимических свойств было установлено, что все протективные антигенные комплексы, кроме ПАК-Utah 112, сходны по составу с препаратом ПАК-15 и содержат в среднем (61,82,7) % белков, (15,11,6) % углеводов, (23,62,3) % липидов. Иммунохимическая активность ПАК F. tularensis основных подвидов и биоваров в ИФА составила около (0,50,1) нг/мл. Препарат из подвида novicida отличался большим содержанием углеводной части до (26,51,2) % и снижением белковой до (45,54,1) %, его иммунохимическая активность была в 4 раза ниже.
Электрофоретический белковый профиль ПАК из клеток вирулентных штаммов (503, В 300, Miura, A`Cole, А 179, А 61) не отличался от препарата, полученного из клеток вакцинного штамма. Было установлено наличие во всех полученных препаратах ПАК компонентов липополисахаридной природы, которые представлены липидом А с коровым олигосахаридом и боковыми цепями. Показано, что иммунохимическая активность этих комплексных антигенов связана с их белковой частью, в составе которой были определены иммунодоминантные полипептиды, характерные для всех исследованных препаратов и аналогичные ПАК-15 (рисунок 4).
А Б А - белковый профиль; Б - иммуноблоттинг с Ig ПАК препаратов: 1 - ПАК-15; 2 - ПАК-В 300; 3 - ПАК-503; 4 - ПАК-Мiura; 5 - ПАК- А 179; 6 - ПАК-A`Cole; 7 - ПАК-Utah 112. М - маркеры молекулярной массы.
Рисунок 4 - SDS-PAG электрофорез и иммуноблоттинг препаратов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба разных подвидов.
Препараты ПАК-15, ПАК-503, ПАК-В 300, ПАК-А 179, ПАК-А 61 и ПАК-A`Сole, по данным гель-хроматографии на Sephacryl S-300, были хроматографически гомогенными, представлены одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль ПАК-Utah 112 имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа, состав которых отличался: в первом были белки с молекулярной массой более 43 кДа, а во втором - менее 23 кДа. Установлено, что ПАК-Utah 112 взаимодействовал со специфическими антителами, но не был иммунохимически идентичен препаратам ПАК других подвидов. Электрофоретический профиль препарата ПАК-Utah 112 также отличался наличием дополнительных белков с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в диапазоне от 50 до 90 кДа (рисунок 4).
Поскольку важным условием при использовании антигенов для получения специфических сывороток является их высокая иммунологическая эффективность и отсутствие токсичности для животных-продуцентов, была проведена работа по оценке иммунобиологических свойств полученных препаратов. Было показано, что все препараты ПАК, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, обладают выраженной антигенной активностью. Их однократное введение биомоделям (мыши, морские свинки, кролики) вызывало формирование выраженного антительного ответа, независимо от способа иммунизации. Все препараты ПАК были нетоксичны для лабораторных животных, не оказывали выраженного повреждающего действия на спленоциты и тимоциты белых мышей. Положительная реакция лейкоцитолиза у белых мышей на 14-21 сутки после введения препаратов ПАК подтверждала их высокую иммуногенность. Максимальной иммуномодулирующей активностью обладал препарат, полученный из вакцинного штамма. В частности, при однократной подкожной иммунизации белых мышей препаратом ПАК-15 в дозе 10 мкг отмечено формирование антительного ответа в ранние сроки (на 3-7 сутки). При иммунизации морских свинок (доза 100 мкг) антительный ответ также регистрировался в ранние сроки, стабилизировался на высоком уровне к 42-м суткам (титр в ИФА 1/640-1/960) и сохранялся до 4,5 месяцев.
Показано, что все препараты ПАК защищают белых мышей от гибели при экспериментальной туляремии, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов (заражающая доза 100 LD50), а также большими дозами (107 м.к.) вакцинного штамма. Во всех случаях отмечено достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных ПАК животных по сравнению с контрольными группами (Р0,05). Было установлено, что препарат ПАК-15 обладал максимальной протективной активностью при заражении штаммами голарктического подвида (ED50 = 3,(2,411,3) мкг для F. tularensis 503/840 и ED50 = 1,4 (0,62,9) мкг для F. tularensis НИИЭГ). При заражении F. tularensis subsp. nearctica В399 AТCole максимальная протективная активность отмечена у препарата ПАК-А 179 (ED50 = 16,21 (9,225,1) мкг). Минимальной протективной активностью по отношению к F. tularensis subsp. holarctica 503/8обладал препарат ПАК-Utah 112 (ED50 = 155,9 (66,7469,4) мкг). Это может быть связано с особенностями его строения, в частности с большим содержанием углеводного компонента и с отсутствием ряда иммунореактивных белков.
Разработка экспериментальных иммунодиагностических препаратов для детекции возбудителя туляремии и специфических антител. Для получения гипериммунных туляремийных поликлональных сывороток были разработаны две схемы иммунизации кроликов. Был получен ряд сывороток к каждому препарату ПАК основных подвидов (ПАК-15, ПАК-503, ПАК-A`Cole). Показано, что все сыворотки этого ряда иммунохимически идентичны и выявляют иммунодоминантные субъединицы всех препаратов, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, что наряду с данными сходства строения и свойств свидетельствует о видовой специфичности протективного антигенного комплекса.
Установлено, что применение на первых этапах иммунизации кроликов комплекса воднофенольных экстрактов штаммов F. tularensis различной подвидовой принадлежности (subsp.
mediаasiatica A-61 (117) КМ 4, subsp. nearctica В399 A`Cole, subsp. holarctica 503/840 и НИИЭГ) с последующим внутривенным введением препарата ПАК-15 позволило увеличить специфичность сывороток, которые использовались в нашей дальнейшей работе.
На следующем этапе был проведен анализ чувствительности и специфичности полученных иммунных сывороток в сравнении с коммерческой туляремийной сывороткой - КТС (сыворотка диагностическая туляремийная агглютинирующая, Иркутский НИПЧИ). При этом в ДИА чувствительность КТС при разведении 1/100 для штаммов F. tularensis составляла 107 м.к./мл, тогда как экспериментальные сыворотки при тех же разведениях выявляли возбудителя в концентрации 106 м.к./мл. Специфичность последних составила 100 % при концентрации гетерологичных штаммов 108 м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Escherichia coli и Salmonella paratyphi в концентрации 107 м.к./мл. Для повышения специфичности экспериментальных сывороток была проведена сорбция перекрестнореагирующих антител с применением в качестве адсорбентов микробных клеток чумного и псевдотуберкулезного микробов. Из цельной гипериммунной сыворотки были получены Ig ПАК, которые использовали при конструировании экспериментальных антительных препаратов для детекции возбудителя.
Чувствительность экспериментальной иммуноферментной тест-системы (ИФА, ДИА) анализировали на расширенной панели штаммов F. tularensis разных подвидов (50 штаммов). В среднем этот показатель составил в ИФА (3,20,3)105 м.к./мл, в ДИА - (6,50,4)105 м.к./мл (таблица 2). Специфичность экспериментальных антительных препаратов была проверена на панели из 30 гетерологичных штаммов и составила 100 % при концентрации 108 м.к./мл и 84 % при концентрации 109 м.к./мл.
При определении влияния способа инактивации бактериальных клеток на чувствительность экспериментальных ИФА и ДИА было установлено, что экспериментальные тестсистемы в 100 раз чувствительнее при обработке культур F. tularensis фенолом без нагревания, чем формалином с прогреванием. Пороговый уровень чувствительности экспериментальной иммуноферментной тест-системы в модельных опытах: пробы почвы, речной воды, суспензии паренхиматозных органов и сыворотки белых мышей, искусственно контаминированные различными концентрациями вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, составил 2105 м.к./мл. При апробации разработанной экспериментальной тест-системы для выявления возбудителя туляремии в смешанных культурах использовали взвесь клеток F. tularensis 15 НИИЭГ с Y. pestis EV, Y. pseudotuberculosis I серовара, Y. enterocolitica 121 и Brucella abortus 19BA. В этом случае чувствительность составила 6105 м.к./мл при 100 % специфичности для гетерологичных штаммов в концентрации 108 м.к./мл.
Таблица 2 - Чувствительность (м.к./мл) экспериментальных антительных препаратов.
Подвидовая Количество штаммов в %, выявляемых в принадлежность ИФА ДИА штаммов 1106 5105 1105 5104 1106 5105 1105 51F. tularensis holarctica eryR 100 100 35 12 100 41 18 holarctica eryS 100 100 25 13 100 63 25 holarctica japonica 100 100 0 0 100 100 33 nearctica 100 100 67 0 100 33 11 mediаasiatica 100 100 45 0 100 55 9 novicida 100 0 0 0 100 0 0 Экспериментальный латексный диагностикум на основе Ig ПАК выявлял Сap+ и Сap- штаммы F. tularensis в РСА на стекле и РЛА микрометодом. Чувствительность РЛА для Сap+ штаммов составила 5106 м.к./мл, для Сap- - 107 м.к./мл, тогда как коммерческий диагностикум для РНГА не выявлял Сap- штаммы F. tularensis в концентрации 109 м.к./мл.
На основе Ig ПАК и его F(abТ)2-фрагментов получены экспериментальные конъюгаты: иммунопероксидазные и с коллоидными металлами, позволившие повысить чувствительность ИФА и ДИА для клеток F. tularensis до 104 м.к./мл и упростить методику постановки анализа, используя прямой вариант. Эти экспериментальные препараты отличались низкой стабильностью (менее 3 месяцев) и нуждаются в дальнейшем усовершенствовании. Также были получены экспериментальные ФИТЦ-конъюгаты Ig ПАК и F(abТ)2фрагментов. При постановке МФА с использованием экспериментальных препаратов было отмечено специфическое свечение возбудителя в мазках-отпечатках органов, зараженных вирулентными штаммами F. tularensis разных подвидов белых мышей на 3 креста так же, как при использовании коммерческого диагностикума (ИДТЛ, производство НИИЭМ им.
Н.Ф. Гамалеи). При бактериологическом анализе отпечатков этих органов в 100 % проб был отмечен рост туляремийного микроба, а при их бактериоскопии (окраска мазков-отпечатков по Романовскому-Гимзе) возбудитель обнаруживали только в некоторых пробах, что согласуется с данными литературы [Олсуфьев Н.Г., 1975].
Были проведены лабораторные испытания сконструированных антительных иммунодиагностикумов (ИФА и ДИА) для обнаружения возбудителя туляремии у экспериментально зараженных лабораторных животных и в природном материале. Исследование суспензии паранхематозных органов от 21 белой мыши, инфицированной F. tularensis 503/840 и B3A`Cole в дозе 100 LD50, и 20 мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 104 м.к., показало, что возбудитель туляремии выявлялся с помощью ИФА в 34 пробах (83 %), ДИА - в 29 пробах (71 %), тогда как бактериологическим методом - только в пробах (36,6 %). В период от 1 до 8 суток после заражения была отмечена 100 % корреляция между результатами бактериологического анализа и экспериментальным ИФА и ДИА.
При сравнении полученных результатов с использованием коммерческой диагностической тест-системы для выявления возбудителя туляремии в ИФА (ИФА-Тул-СтавНИПЧИ) было показано, что возбудитель обнаруживался только в 22 пробах из 41 (54 %). В ранние сроки (до 8 сут.) корреляция полученных с помощью ИФА-Тул-СтавНИПЧИ результатов с данными бактериологического анализа и экспериментальными антительными препаратами составила 95 %.
Поскольку Саратовская область относится к энзоотичным по туляремии территориям [Федорова З. П., 1995; Матросов А. Н. и др., 2007], представляло интерес использовать разработанные экспериментальные иммунодиагностические препараты для анализа природного материала. При эпизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова на обнаружение антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоновых животных данного региона. Положительные результаты получены в ИФА и ДИА в 17 и случаях, соответственно (таблица 3). Было отмечено, что положительные пробы зарегистрированы в трех из 15 исследованных природных эпитопах.
Таблица 3 - Результаты обнаружения антигенов туляремийного микроба в суспензии печени и селезенки в различных объектах эпизоотологического обследования.
Коли- Количество положительных проб Вид исследуемого чество ИФА-Тулматериала ИФА ДИА проб СтавНИПЧИ Рыжая полевка 51 10 9 Обыкновенная полевка 3 2 2 Желтогорлая мышь 18 5 4 Лесная мышь 22 0 0 Домовая мышь 1 0 0 Обыкновенная бурозубка 7 0 0 Малая бурозубка 1 0 0 Большая синица 3 0 0 Сконструированные антигенные препараты для ИФА на основе ПАК выявляли специфические антитела как в гипериммунных туляремийных сыворотках (в титрах 1/512001/204800), так и у зараженных, иммунизированных и вакцинированных лабораторных животных (в титрах 1/800- 1/3200). Использование гликозилированного белкового комплекса в качестве сенситина в ИФА также давало возможность выявления туляремийных антител (у лабораторных животных в титре 1/100-1/400, в сыворотках - 1/3200). Специфичность экспериментальных антигенных диагностикумов в обоих случаях составила 100 % в отношении нормальных сывороток и коммерческих гетерологичных антительных препаратов. Показана возможность использования ПАК-15 в иммуноблоттинге для регистрации туляремийной инфекции у лабораторных животных. Идентификацию проводили по антигенам с молекулярной массой около 43 и 17 кДа. Этим методом в течение 2-х месяцев регистрировали туляремийные антитела у белых мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 104 м.к. Применение препаратов антигенных комплексов в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге может быть использовано как подтверждающий тест при постановке ИФА и ДИА.
Полученные данные представляют научный и практический интерес, поскольку впервые было показано, что протективный антигенный комплекс является общим антигеном для туляремийного микроба, независимо от подвида возбудителя. Были получены препараты ПАК из штаммов F. tularensis subsp. holarctica, nearctica, mediаasiatica и novicida, проведен сравнительный анализ их структуры, антигенных, биохимических и иммунологических свойств. Разработанные способы получения и выявления антигенных комплексов туляремийного микроба и специфических антител могут служить основой для создания новых средств диагностики туляремии.
ВЫВОДЫ 1. С помощью оптимизированного метода выделения комплексных антигенов туляремийного микроба, основанного на способах химического и ферментативного гидролиза с последующей колоночной хроматографией, были получены иммунохимически активные препараты: протективный антигенный комплекс и гликозилированный белковый комплекс.
2. Выявлена высокая иммунохимическая активность и антигенная идентичность препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из клеток штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japonica, subsp. nearctica и subsp.
mediаasiatica. Протективный антигенный комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы липополисахарида и наличия капсулы.
3. Выявлены особенности протективного антигенного комплекса F. tularensis subsp.
novicida, состоящие в преобладании углеводного и липидного компонентов над белковым и отсутствии иммунодоминантных полипептидов с молекулярной массой в диапазоне от до 90 кДа, которые приводят к снижению его иммуногенности.
4. Разработанная схема гипериммунизации кроликов-продуцентов с последовательным использованием в качестве иммуногена смеси водно-фенольных экстрактов клеток F. tularensis subsp. holarctica, nearctica, mediaаsiatica и протективного антигенного комплекса, позволяет получать активные туляремийные сыворотки с минимальным уровнем содержания гетерологичных антител. Сконструированные на основе полученных поликлональных антител экспериментальные иммунодиагностикумы (иммуноферментные, иммуносуспензионные, иммунофлуоресцентные) выявляют возбудитель туляремии в концентрациях, соответствующих чувствительности методов.
5. Лабораторные испытания экспериментальных антительных препаратов для детекции F. tularensis в ИФА и ДИА на чистых и смешанных культурах, в искусственно контаминированных пробах биологического материала и внешней среды показали их высокую специфичность и чувствительность. При исследовании органов инфицированных лабораторных животных была отмечена 100 % корреляция результатов экспериментального ИФА с данными бактериологического анализа в ранние сроки после заражения. Эффективность применения экспериментальных иммуноферментных тест-систем подтверждена исследованиями полевого материала, собранного при эпизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова.
6. Применение антигенных комплексов туляремийного микроба в качестве сенситинов в ИФА и ДИА и маркерных антигенов в иммуноблоттинге позволяет определять специфические антитела в гипериммунных туляремийных сыворотках и при изучении динамики образования антител у иммунизированных, вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Волох О.А., Шепелв И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Ермин С.А., Дятлов И.А.
Разработка иммуноферментного анализа на основе С-комплекса туляремийного микроба // Санит. охрана террит. государств участников СНГ: пробл. биол. безоп. и противодействия биотерроризму в совр. условиях: Матер. VI Межгосуд. науч.-практ. конф. - Волгоград, 2005. - С. 217-219.
2. Волох О.А., Ермин С.А., Шепелв И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Авдеева Н.Г., Дятлов И.А. Разработка комплексного профилактического препарата против чумы и туляремии // Инф. болезни: пробл. здравоохр. и военной медицины: Матер. Рос. науч.практ. конф. - СПб, 2006. - С. 70.
3. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А. Использование препарата С-комплекса Francisella tularensis для определения противотуляремийных антител // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и санит.
охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. - п.
Оболенск, 2006. - С. 254-255.
4. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Дятлов И.А. Использование С-комплекса туляремийного микроба для создания диагностических тест-систем // Биотехнология. - 2007. - №2. - С. 72-77 (из перечня ВАК).
5. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Авдеева Н.Г. Использование антител к С-комплексу Francisella tularensis для выявления возбудителя туляремии // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - С. 91.
6. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А., Кузнецов О.С., Алшина Ю.А., Ермин С.А. Изучение ответных реакций макроорганизма на введение С-комплекса туляремийного микроба // Совр. аспекты эпид. надзора за особо опасными инф. заболеваниями на Юге России: Матер. науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 152-154.
7. Волох О.А., Шепелв И.А., Фирстова В.В., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Авдеева Н.Г., Самохвалова Ю.И., Ермин С.А., Дятлов И.А. Оценка иммунобиологической активности препаратов С-комплекса возбудителя туляремии как перспективного компонента химических вакцин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2007. - № 3. - С. 16-21 (из перечня ВАК).
8. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Уткин Д.В., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Волох О.А.
Оценка чувствительности и специфичности антительных препаратов к С-комплексу туляремийного микроба // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. - Волгоград, 2008. - С. 143-144.
9. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Разработка препарата для иммунодиагностики возбудителя туляремии // Биол. безоп. в совр. мире: Матер. науч.практ. конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. учрежд. Роспотребнадзора. - п.
Оболенск, 2009. - С. 129-131.
10. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А. Актуальные вопросы дифференциации подвидов Francisella tularensis // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения:
Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - Н. Новгород, 2009. - С. 143-146.
11. Волох О.А., Кузнецова Е.М., Ермин С.А., Гусева Н.П., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Перспективы создания химической туляремийной вакцины // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - Н. Новгород, 2009. - С. 329-331.
12. Кузнецова Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А. Структурно-функциональная характеристика основных антигенов Francisella tularensis // Проблемы особо опасных инфекций - 2009. - Вып. 2 (100). - С. 44-49 (из перечня ВАК).
13. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Терехова И.В., Сырова Н.А., Шепелв И.А. Получение и характеристика модифицированного С-комплекса туляремийного микроба // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ:
Мат. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С.
198-199.
14. Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох О.А., Никифоров А.К. Апоптоз и пролиферативная активность иммунокомпетентных клеток биомоделей при иммунизации С-комплексом туляремийного микроба различных подвидов // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ:
Мат. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С.
269-270.
15. Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох О.А., Никифоров А.К. ДНК-цитометрия иммунокомпетентных клеток биомоделей в условиях иммунизации препаратами С-комплекса туляремийного микроба различных подвидов // Проблемы особо опасных инфекций - 2011. - Вып. 1 (107). - С. 74-76 (из перечня ВАК).
16. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Гликозилированный белковый комплекс Francisella tularensis // Инновационные технологии в противоэпид. защите населения: Мат. науч.-практ. конф. молодых ученых Роспотребнадзора. - Н. Новгород, 2011. - С. 93-95.
17. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К. Иммунобиологические свойства антигенных комплексов туляремийного микроба // Проблемы особо опасных инфекций - 2011. - Вып. 3 (109). - С. 46 - 49 (из перечня ВАК).
18. Шепелв И.А., Волох О.А., Самохвалова Ю.И., Кузнецова Е.М., Еремин С.А. Использование феномена QS в технологии культивирования штаммов-продуцентов протективных антигенов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности:
Мат. III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора. - п. Оболенск, 2011. - С. 301-304.