Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное  

На правах рукописи

ОПАТИН СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ

ЭПИЗООТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА НЕКРОБАКТЕРИОЗА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология;

  16.00.04 Ц  ветеринарная фармакология с токсикологией        

Автореферат

на соискание ученой степени

доктора ветеринарных  наук

Новосибирск  - 2006

Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

  Самоловов Андрей Артемьевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор, 

  Ноздрин Григорий Антонович,

  доктор ветеринарных наук, профессор,

  Гуславский Иван Игнатьевич,

  доктор ветеринарных наук, профессор,

  Бажин Михаил Аристоклевич

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального

  образования УРоссийский университет

  дружбы народовФ  (РУДН)

Защита состоится У___Ф ________ 2007 г. в ____ ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, СО РАСХН, ИЭВСиДВ

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Автореферат разослан  У____Ф  _________ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета  С.И. Логинов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Некробактериоз имел широкое распространение в 70-80-е годы прошлого века во всех республиках бывшего Советского Союза. С середины 90-х годов, с распадом СССР и образованием на его основе независимых суверенных государств, по данным официальной государственной ветеринарной отчетности, во многих областях Российской Федерации наметилась тенденция к снижению числа неблагополучных по некробактериозу пунктов  и заболевших животных. Практически не поступает биоматериала для диагностики болезни в ветеринарные лаборатории. Однако результаты  эпизоотологических исследований  указывают на значительное распространение болезни на территории Сибирского региона, Республики Татарстан, Европейской части страны, и в независимых сопредельных государствах (А.А. Самоловов, 1993; Д.А. Хузин, Г.Х Камалов, 1995; В.В. Максимович, Э.И. Веремей, 1999; Х.Н. Макаев и др., 2000; В.Н. Кисленко с соавт., 2001; В.А. Молоканов, В.М. Щеглов, М.Т. Байкенов, 2001; В.И. Тетеричев и др., 2001; Т.Е. Какоулин, Л.Н. Головкова, 2002).

Так, по данным О.И. Соломаха, Л.В. Кириллова (2001), в Российской Федерации ежегодно болеют некробактериозом около 7% крупного и 16% - мелкого рогатого скота. По распространенности болезнь занимает третье место после лейкоза и туберкулеза. А. Сидорчук, А. Воронец (2001) указывают, что за последние 20-25 лет заболеваемость крупного рогатого скота некробактериозом вышла в структуре инфекционной патологии на одно из первых мест.

Болезнь наносит неблагополучным хозяйствам большой экономический ущерб. По сообщениям Ю.Д. Караваева с соавт. (2003), в процессе переболевания коровы теряли 30-40% массы тела и до одной тонны молока. В оленеводстве из заболевших за год 50-70 тыс. животных  30-35% погибали.

Основным способом лабораторной диагностики некробактериоза крупного и мелкого рогатого скота является бактериологическое исследование: микроскопия мазка, посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных. Эти методы диагностики направлены в основном на выделение F. necrophorum без учета его вирулентности. Традиционно по этому признаку у микроба различали три основных (А, В и С) и один промежуточный биотип (АВ). (A.L. Hodgson et al., 1993, L.A. Nicholson et al, 1994, D.L. Emery, 1985, T. Shinjo, K. Hiraiwa, S. Miazato, 1990)

При некробактериозе, особенно его кожной форме, наряду с основным возбудителем в больших количествах присутствует сопутствующая микрофлора: стафилококки, стрептококки, микрококки, кишечная палочка и другие микроорганизмы, препятствующие получению чистой культуры и своевременной и правильной постановке диагноза. В целом на постановку диагноза затрачивается 8-10 суток, а в случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой это время увеличивается на 6-10 дней.

В настоящее время наиболее чувствительными и специфичными признаны способы диагностики инфекционных болезней, основанные на выявлении генома возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции.

В России с начала 90-х годов многочисленными группами авторов начались усиленные исследования по изысканию биологических препаратов, в частности вакцин разного типа, для профилактики некробактериоза животных. По данным А. Сидорчук, А. Воронец (2001), применение вакцин нековак и нековак-стимул в течение одного-двух лет способствует резкому снижению количества больных животных в неблагополучном стаде (с 30-50% до 1-5%), а в ряде случаев дает возможность добиться полной ликвидации заболевания. Как указывают авторы, в целях  повышения эффективности вакцинации необходимо сочетать применение препарата с другими ветеринарно-санитарными мероприятиями.

По сообщению О.И. Соломаха, Л.В. Кириллова (2001), среди животных, привитых инактивированной формолвакциной, заболело 0,3% особей, при заболеваемости до вакцинации и в контроле от 15% до 30%.

Ю.Д. Караваев с соавт., (2004) на основании своих исследований показали, что инактивированная эмульсин-вакцина предохраняет от заболевания около 98% привитых животных и обладает терапевтическим эффектом. Наилучший эффект отмечался в тех хозяйствах, где было сбалансированное кормление, вовремя проводилась обрезка копытцев у животных.

За последние 10-15 лет для лечения больных некробактериозом животных было предложено и апробировано значительное количество неспецифических лечебных средств местного и общего действия. Препараты общего действия (левотетрасульфин, некрофар и др.) обладают раздражающим действием на организм животных и содержат в своем составе большое количества антибиотиков, что исключает возможность использования молочной и мясной продукции в пищу в течение 7-10 дней после их применения. После длительного их использования возможно привыкание возбудителя некробактериоза к антибиотикам. Большинство лечебных препаратов, применяемых местно при некробактериозе, обладают или антимикробным, или только дегидратирующим действием. Поэтому разработка эффективных комплексных препаратов и поиск оптимальных схем лечения крупного рогатого скота при указанной болезни имеют большое значение для сохранения поголовья.

Таким образом, очевидна необходимость совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота на основе различных средств и методов диагностики, специфической и неспецифической профилактики и терапии.

Цель исследований Ц  усовершенствовать систему  контроля  эпизоотического процесса  некробактериоза крупного рогатого скота, в том числе на основе новых препаратов для лечения больных животных, и обосновать ее эффективность в практических условиях.

Задачи исследований:

1. Обосновать необходимость совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза в связи с многообразием  форм его проявления.

2. Усовершенствовать  методы диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных.

3. Определить роль специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.

4. Обосновать неспецифические  методы  оздоровления в неблагополучных по некробактериозу хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией.

5. Разработать и испытать препараты для лечения больных некробактериозом животных.

Научная новизна работы.  Некробактериоз животных следует рассматривать не как местное поражение тканей дистальных отделов конечностей, а как системное заболевание, ведущими силами, влияющими на инфекционный и эпизоотический процессы, выступают условия кормления и содержания. Исходя из этого положения, обоснованы разработанные лечебные и профилактические мероприятия.

Установлено, что больные некробактериозом животные имеют пониженную естественную резистентность организма, особенно по лизоцимной и бактерицидной активностям,  по сравнению со здоровыми,  как при стойловом, так и пастбищном содержании.

Разработан и практически обоснован новый метод  отбора биоматериала из пораженной конечности для лабораторной диагностики некробактериоза, повышающий  ее эффективность на 33,3%.

Впервые показано, что диагностическое исследование биологических образцов из пораженных конечностей на некробактериоз бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией имеет тождественное значение, и ПЦР с гнездовыми праймерами для выявления F. necrophorum subsp. necrophorum  может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.

Биологическими исследованиями обосновано определение  штамма Fusobacterium necrophorum ИВ B-845.

Разработаны  методики приготовления антигена из штамма Fusobacterium necrophorum ИВ B-845 и постановки реакции агглютинации для выявления титра антител.

Разработана и апробирована вакцина ГОА ИЭВСиДВ, не уступающая по эффективности другим известным вакцинам. Установлено, что у иммунизированных животных  заболеваемость некробактериозом была достоверно ниже по сравнению с невакцинированными. Показано, что применение  только одного метода вакцинации для профилактики и ликвидации некробактериоза животных в неблагополучном хозяйстве  не обеспечивает полную защиту животных от данной болезни. Коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса после применения вакцин составил от 41,1 до 59,78 %. 

Теоретически и практически обосновано, что  меры борьбы с некробактериозом крупного рогатого скота должны базироваться на комплексном проведении организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и лечебно-профилактических мероприятий, воздействующих на все звенья эпизоотического процесса - восприимчивое животное, возбудителя инфекции и факторы передачи.

Разработан и предложен для ветеринарной практики комплексный, безвредный лечебный препарат для местного применения Ц некрогель (патент РФ № 2204997, 2003 г.), обладающий антимикробным действием в отношении микроорганизмов, участвующих в инфекционном гнойно-некротическом процессе при некробактериозе животных.

Разработаны и испытаны два инъекционных препарата тетрацин, некросептин и препарат для местного применения Ц фузоцид.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований вносят существенный теоретический и практический вклад в совершенствование системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза и будут полезными в учебном процессе ВУЗов и при дальнейшем изучении проблемы некробактериоза. Результаты исследований по разработке мер борьбы и профилактики некробактериоза животных вошли в УПравила по профилактике и ликвидации некробактериоза животныхФ, N ВП 13.4.1313-00 от 11.07. 2000 г., утвержденные Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода России.

Предложены  для  лечебных целей  препараты местного и системного действия.

Разработанные методические рекомендации по изготовлению антигена Fusobacterium necrophorum и постановке реакции агглютинации для определения титров агглютининов при иммунизации могут использоваться  работниками научно-исследовательских учреждений при проведении дальнейших исследований по проблеме некробактериоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГНУ ИЭВСиДВ (1990Ц2006 гг.) научно-практической Российско-Монгольской конференции по проблемам развития АПК Монголии (Новосибирск, 1998), Международной научно-практической  конференции "Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве", посвящ. 100-летию со дня рожд. Х.С. Горегляда и  М.К. Юсковца (Минск,1998), VI научно-практической конференции УРазвитие агропромышленного комплекса в зонах рискованного земледелияФ (Новокузнецк, 1999), Международной научно-практической конференции УПроблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в ХХI векеФ (Новосибирск,1999), Научно-практической конференции УВнедрение ресурсосберегающих технологий в сельскохозяйственном производствеФ (Новокузнецк, 2000),  Международной научно-практической конференции УПроблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и МонголииФ (Новосибирск, 2000), Международной научно-практической конференции УПроблемы ветеринарной науки и практики в современных условияхФ, посвященной 10-летию независимости Республики Казахстан (Алматы, 2001), Научно-практической конференции УБолезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологий и меры борьбы с нимиФ (Иркутск, 2001), 5-й международной научно-практической конференции  УНаучное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана (Абакан,  2002), VII международной научно-производственной конференции УПроблемы с/х производства на современном этапе и пути их решенияФ  (Белгород, 2003), Международной научно-практической конференции УАктуальные проблемы болезней животных  в современных условияхФ (Душанбе, 2003),  Международной научной конференции УСовременные проблемы эпизоотологииФ (Новосибирск, 2004),  Сибирской международной  научно-практической конференции УАктуальные вопросы ветеринарной медициныФ  (Новосибирск,  2004), Сибирском Международном ветеринарном конгрессе УАктуальные вопросы ветеринарной медициныФ  (Новосибирск,  2005), Международном съезде терапевтов, диагностов УАктуальные проблемы патологии животныхФ (Барнаул, 2005), Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летнему Юбилею  Каз НИВИ УСовременное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики, посвященной 100-летию институтаФ (Алматы, 2005).

Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (2006).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 48 научных  работ, в том числе 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ (УВетеринарияФ,  УАграрная наукаФ,  УДостижения науки и техники АПКФ,  УМолочное и мясное скотоводствоФ,  УСибирский вестник сельскохозяйственной наукиФ). 

Объем и структура диссертации.  Диссертация изложена на 325 страницах, содержит 52 таблицы, 6 рисунков, и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и практические предложения, список использованной литературы, приложения. Список использованной литературы включает 658 источников, в том числе 180 зарубежных авторов.

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований  нашли  отражение в УПравилах по профилактике и ликвидации некробактериоза животныхФ, N ВП 13.4.1313-00 от 11.07. 2000 г., утвержденных Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода России.

На основании результатов исследований подготовлена нормативно-техническая документация на препарат некрогель, прошедшая экспертизу  в ФГУ УВГНКИФ  для утверждения в Россельхознадзоре Федеральной службы по ветеринарному  и фитосанитарному надзору МСХ РФ.

По результатам исследований разработаны две научно-методические рекомендации, которые рассмотрены  подсекцией  УИнфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока отделения ветеринарной медицины РАСХН протокол  №4  от 04.05.05 г. и № 6 от 23.09.05 г. и рекомендованы для использования в оленеводческих хозяйствах и в научных исследованиях. 

Депонирован штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845 в Научно-исследовательском институте  Коллекции  культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии УВектор (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование необходимости совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.

2. Данные по  усовершенствованному методу диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных.

3. Результаты исследований по изучению роли специфической профилактики  в системе контроля  эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого.

4.  Данные  по оздоровлению неблагополучных по некробактериозу хозяйств с разной эпизоотической ситуацией неспецифическими  методами.

5. Результаты разработки и испытания препаратов для лечения больных некробактериозом животных.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность доктору ветеринарных наук, профессору, заведующему лабораторией некробактериоза животных А.А. Самоловову - за консультационную помощь; доктору ветеринарных наук, профессору С.К. Димову и доктору ветеринарных наук А.А. Колосову за методическую помощь; доктору ветеринарных наук, профессору А.Г. Хлыстунову, кандидату ветеринарных наук, научному сотруднику лаборатории некробактериоза животных Т.М.аМагеровой,  кандидату ветеринарных наук, заведующему лабораторией генной инженерии В.И. Семенихину, доктору ветеринарных наук, директору ГНУ НИИСХ КС  К.А. Лайшеву, ветеринарному врачу Управления ветеринарии Таймырского АО С.Г.аСамойлову  -  за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методы исследований и объем работы. Работа выполнена в 1991-2006 гг. в лаборатории некробактериоза животных ГНУ  ИЭВСиДВ,  животноводческих хозяйствах региона Сибири в соответствии с планами научно-исследовательских работ.

Диагноз на некробактериоз животных устанавливали согласно УМетодическим указаниям по лабораторной диагностики некробактериозаФ, (1987). Эпизоотологическое обследование хозяйств Новосибирской, Томской областей и Алтайского края  проводили по методическим рекомендациям УМетоды эпизоотологических исследованийФ  С.И. Джупины и А.А. Колосова, (1991) с определением условий содержания и кормления.

Оценку питательности рационов кормления животных осуществляли по обменной энергии и питательным различным веществам согласно УНормам и рационам кормления сельскохозяйственных животныхФ,  А.П. Калашников с соавт., (1985), УПрактикуму по кормлению сельскохозяйственных животныхФ, Е.А. Петухова с соавт., (1990).

Для диагностики некробактериоза  биоматериал (пораженная фаланга)  брали от животных в хозяйствах с выраженными  клиническим признаками, абсцессы печени отбирали при убое животных на Новосибирском мясокомбинате. Диагностика некробактериоза включала микроскопию мазков из патологического материала, посевы на питательные среды и заражение лабораторных животных.  В качестве питательных сред использовали среду Китта-Тароцци, аминокровин-сывороточный бульон, мясопептонный бульон.

Параллельную пробу материала передавали в лабораторию генной инженерии для исследования методом ДНК- технологии. По окончании исследований проводили сравнение полученных результатов бактериологической диагностики с методом ПЦР.

Изучение влияния нормализации обмена веществ и улучшение санитарных условий содержания на заболеваемость животных некробактериозом выполняли в научно-производственных опытах. В хозяйствах с высокой заболеваемостью был осуществлен ряд организационно-хозяйственных мер для улучшения условий содержания, а именно реконструкция длины стойл, применение подстилки, моцион,  изменение рациона кормления, в который были включены больше грубых кормов, и  витаминно-минеральные подкормки (премиксы).

Учет и анализ биохимических показателей сывороток крови животных проводили  по данным  экспертиз ветеринарных лабораторий Новосибирской области и Алтайского края.

Для определения показателей естественной резистентности организма животных  пробы крови (сыворотки) отбирали в хозяйствах, благополучных и неблагополучных по некробактериозу животных. В каждом хозяйстве по принципу аналогов сформировали контрольные и опытные группы по 6 голов в каждой. В контрольной группе находились клинически здоровые животные, в опытной Ц больные некробактериозом. Перед взятием крови учитывали общую заболеваемость коров некробактериозом по стаду.

Естественную резистентность организма крупного рогатого скота оценивали по  фагоцитарной активности (ФА), лизоцимной активности (ЛА),  бактерицидной активности (БА) согласно методическим рекомендациям УОценка естественной резистентности крупного рогатого скота и овецФ (П.Н. Смирнов с соавт., 1989).

Морфологические,  протеолитические биохимические, патогенные и гемагглютинирующие свойства  культур F. necrophorum изучали согласно методикам Т.С. Костенко, Е.И. Скаршевской, С.С. Гительсона (УПрактикум по ветеринарной микробиологииФ, 1989), работе В.А. Гришанина, В.Д. Бадикова (УКультивирование микроорганизмов в лабораторных условияхФ, 1999).

Опытную экспериментальную инактивированную гидроокисьалюминиевую  вакцину (ГОА ИЭВСиДВ) конструировали из штамма  Fusobacterium necrophorum ИВ В-845.

Крупный рогатый скот иммунизировали в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией по некробактериозу крупного рогатого скота.  По принципу аналогов формировали опытные и контрольные группы животных.  Экспериментальную гидроокисьалюминиевую  вакцину  вводили подкожно в дозе 3 мл, двукратно с интервалом 3 недели,  с ревакцинацией через 5 месяцев. Вакцины нековак и инактивированную эмульгированную  (ВИЭВ) применяли согласно наставлениям по их применению. Коров контрольной группы не вакцинировали.

Перед началом опыта, а затем каждый месяц от 6Ц10 модельных животных опытных и контрольной групп исследовали сыворотки крови на наличие антител в реакции агглютинации (РА).

Профилактическую эффективность  вакцин  определяли ежемесячно по титру антител сыворотки крови, определяемых в реакции агглютинации (РА), а также по заболеваемости животных в опытных и контрольных группах.

Неспецифические мероприятия при оздоровлении от некробактериоза животных проводили  в неблагополучных хозяйствах по результатам эпизоотологического обследования, руководствуясь положениями общей эпизоотологии (А.А. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин и др. УЭпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животныхФ, 1984).

В лаборатории института составляли прописи и изготавливали препараты. Апробацию препаратов для  лечения некробактериозных поражений конечностей крупного рогатого скота проводили в хозяйствах, неблагополучных по данной болезни. В составе препаратов не были включены лекарственные вещества, негативно влияющие на организм животных и качество животноводческой продукции. 

ечение крупного рогатого скота с инфицированными ранами дистальных отделов конечностей осуществляли следующим образом. Первоначально выполняли туалет раны с удалением гноя и свободнолежащих нежизнеспособных тканей с применением  0,25%-го раствора перманганата калия. По возможности иссекали все некротизированные ткани, вскрывали ниши карманы.  Далее орошали раневую поверхность 3%-ным раствором перекиси водорода, обсушивали ватно-марлевым тампоном. Наносили испытуемые препараты и накладывали марлевую повязку с интервалом 2Ц3 дня. Лечебный эффект действия препаратов сравнивали с контрольной группой животных, раны которых обрабатывали общепринятыми средствами.

Антимикробную активность разрабатываемых лечебных средств определяли методом серийных разведений препарата в питательной среде по методу Е.П. Сиволодского (1999)  УМетоды определения чувствительности, устойчивости и толерантности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратамФ. В качестве тест-микробов использовали референтные штаммы и полевые изоляты, выделенные от больных некробактериозом животных. Антибактериальную активность препаратов выражали в минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в мкг/мл.

Изучение токсичности мази  некрогель выполняли согласно УМетодическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводствеФ (Л.П. Маланин, А.П. Морозов, А.С. Селиванова, 1988). Расчет LD50  осуществляли при помощи статистического метода Г.Н. Першина (УЭлементы количественной оценки фармакологического эффектаФ М.Л. Беленький, 1963). Испытание на стерильность некрогеля определяли методом мембранной фильтрации (УГосударственная фармакопея СССРФ, XI издание, 1989).

Для постановки клинических экспериментов опытные и контрольные группы животных формировали по принципу аналогов. В контрольных группах животных лечили традиционными лекарственными средствами в соответствии с действующими наставлениями.

Производственное испытание разрабатываемых  препаратов проводили в неблагополучных хозяйствах Новосибирской области, Алтайского края,  в Республиках Татарстан и Хакасия, в Таймырском автономном округе. Животных в опытных группах лечили испытуемыми лечебными средствами согласно разработанных нами наставлений по их применению, контрольных - традиционными препаратами (присыпка Плахотина, Островского,  мазь Вишневского, левотетрасульфин). В течение 30 дней с начала лечения учитывали количество выздоровевших животных и сроки их выздоровления. Лечебную эффективность препаратов  оценивали по количеству выздоровевших животных и продолжительности их лечения.

Экономическую эффективность  комплексной системы мероприятий по оздоровлению от некробактериоза животных и применения препарата некрогель в неблагополучных хозяйствах определяли по УМетодике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятийФ, утвержденной начальником Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России 21 февраля 1997 г.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики (М.Г. Таршис, В.М. Константинов, 1975, Г.Ф. Лакин, 1980, А.А. Самоловов, 1990). Степень достоверности полученных показателей определяли путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.

Для испытания вакцин было использовано 4240 голов крупного рогатого скота. Неспецифические мероприятия по оздоровлению от некробактериоза применяли на поголовье 9520 животных.

Препараты для лечения испытаны на  17350 головах  крупного рогатого скота, 421 северном олене.

При проведении работы использовано около 560 белых нелинейных мышей с массой тела 18-20 г, 25 кроликов с массой тела 2,0-2,5 кг, 15 морских свинок с массой тела 400-500 г, 16 белых нелинейных  крыс с массой тела  150-200 г.

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Обоснование необходимости совершенствования системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота в связи с многообразием форм его проявления

Некробактериоз сельскохозяйственных животных в большинстве случаев научными работниками и практическими ветеринарными специалистами  ассоциируется с гнойно-некротическими поражениями в области дистального отдела конечностей. Однако с интенсификацией животноводства, связанной с концентрацией животных, введением силосно-концентратного типа кормления и  высокой механизацией производственных процессов, стали регистрировать поражения некробактериозной этиологии и других органов. Так, в США у крупного рогатого  скота, убиваемого на мясо, в среднем  у 12-32%  животных регистрируют абсцессы печени  (D.R. Brink et al., 1990), при этом в отдельных группах они могут варьировать от 1 до 95% (T.G. Nagaraja, M. M.  Chengappa, 1998). 

Принимая во внимание, что возбудитель некробактериоза является постоянным обитателем  рубца жвачных, S. Narayanan et al. в 1997 г. подтвердили генетическую однотипность изолятов Fusobacterium necrophorum, выделенных из абсцессов печени и пораженного эпителия рубца, а T.G. Nagaraja et al. (1999) доказал, что снижение концентрации Fusobacterium necrophorum в содержимом рубца способствует уменьшению инцидентности абсцессов в печени.

Этому также способствует увеличение доли грубых кормов в рационе (R.A. Zinn, A. Plascencia, 1996), о чем, на основании своих исследований, убедительно показали  T.G. Nagaraja, M.M  Chengappa (1998), заключив, что наибольшая инцидентность абсцессов печени регистрируется в откормочных хозяйствах с преобладанием высококонцентратного типа кормления.

Наши исследования также показали, что в животноводческих хозяйствах Сибири достаточно широко распространена патология печени в виде абсцессов. Так, по данным  ветеринарно-санитарной экспертизы животных, убиваемых на Новосибирском мясокомбинате, абсцессы печени установлены в 25,4% хозяйств, поставлявших скот, с инцидентностью от 2,1 до 35,2% животных, достигая в отдельных случаях 40-80%.

Таким образом, в настоящее время считается, что основными факторами, способствующими возникновению абсцессов печени, являются всевозможные нарушения кормления животных, в том числе несбалансированность рационов по количеству и типу кормов. Объясняется это тем, что стенка рубца, подверженная высокой кислотности из-за несбалансированного кормления и действия инородных предметов, становится восприимчивой  к вторжению и колонизации возбудителя, который, обладая адгезивными свойствами по отношению к эпителию рубца, через кровь попадает в печень.

По нашим многолетним наблюдениям, в  Сибири у крупного рогатого скота в основном поражается кожа конечностей в области мякишей, межкопытцевого свода и венчика. В то же время зарубежные исследователи из США, Великобритании, Италии поражения мягких тканей дистального отдела конечностей подразделяют на четыре формы клинического проявления  (D.G. Baggot, 1978, R.W. Blowey, 1994,  S.L. Berry, 1997,  С. Bergsten, 1999).

Тем не менее, мы наблюдали несколько форм клинического проявления некробактериоза. Некоторые из них ранее не отмечены (поражения сосков вымени, фрагментов кожи в области рудиментарных копытцев).

В ЗАО УАвангардФ Усть-Таркского района Новосибирской области инфекционным заболеванием было поражено 350 дойных коров, или 70% стада. Болезнь протекала в летний период (июль - август). В этот период часто шли дожди.

Клинические признаки болезни Ц поражение кожи в области рудиментарных копытцев задних конечностей. Пораженные участки  имели форму полосок размером 2,5Ц3,0×1,0Ц2,0 см. В начальной стадии развития заболевания отмечали отечность, гиперемию кожи, болезненность при пальпации, хромоту, повышение местной температуры. Во второй стадии заболевания образовывалась рана в виде язвы. Поверхность раны покрыта фибринозно-гнойным экссудатом, на ней были участки некроза. Раневая поверхность была сухой; корочки фибринозного экссудата отторгались на 3Ц4-й  день, образуя язву.

Одним из основных факторов, способствующих появлению некробактериоза,  являлась сырость на пастбище и в загонах. Заболеваемость коров некробактериозом прекратилась в конце августа, когда установилась сухая погода.

Второй случай некрабактериоза отмечен в пастбищный период в ЗАО УЦелинныйФ  Коченевского района Новосибирской области.  Заболеванию был подвержен молодняк в возрасте 12 мес.: 60% телочек из 450 голов и 50% бычков из 320 голов. У животных поражались участки кожи над венчиком задних конечностей. Клинические признаки заболевания: хромота, образование воспалительного отека, что сопровождалось припуханием кожи и повышением местной температуры. Затем  развивался абсцесс, с последующим  образованием язвы; от раны исходил запах сероводорода. Появление болезни было связано с травмированием стеблями сухой травы кожи конечностей в результате засушливого жаркого лета. 

Третий случай клинического проявления некробактериоза связан с поражением кожи сосков вымени.  Эта форма некробактериоза была отмечена у высокоудойных коров в одном из хозяйств Новосибирской области. При осмотре кожи сосков обнаруживались гнойно-некротические язвы. Бактериологическим исследованием выделили чистую культуру, патогенную для белых мышей. Поражения кожи сосков вымени были вызваны травмированием ее резиной стаканов доильных аппаратов в процессе доения.

Поражение мышечной ткани тазовых конечностей при некробактериозе  наблюдали в нескольких хозяйствах  Сибири (Новосибирская и Томская области, Красноярский край). В этих хозяйствах некробактериозом заболевали высокопродуктивные коровы и первотелки. Коровы не хромали; дистальный отдел конечностей не поражался. При убое животных отмечали гнойно-некротические поражения мышц тазового пояса, бедренной кости и эпифизарной части костного мозга. Мышечная ткань была вишневого цвета, дряблой консистенции, от нее исходил неприятный запах. Костная ткань эпифиза на разрезе  наполнена кровью, костный мозг  серо-коричневого цвета, мягкой консистенции.

Согласно данным других исследований,  с интенсификацией  откорма крупного рогатого скота участились случаи появления гнойного воспаления тканей хвоста, вызванные возбудителем некробактериоза F. necrophorum. Они связывают это с односторонним кормлением бычков и неудовлетворительными условиями содержания (Л.А. Сергеева и П.Н. Баканов, 1982; А.А. Самоловов, 1989; P. Klucznick, 1976; W.Goldhorn, 1984).

Имеются сообщения об этиологической роли F. necrophorum  в воспалении половых органов (I.M. Sheldon et al., 2004;  E. J. Williams et al., 2005) и вымени животных  (T. Shinjo, 1983). Эндометриты встречаются у 20Ц40% коров после отела. По данным зарубежных исследователей,  этиология послеродовых болезней у коров может быть связана со следующими возбудителями: Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Bacteroides melaninogenicus. Синергизм между Arcanobacterium pyogenes и Fusobacterium necrophorum усиливает их вирулентность, в результате чего  эндометрит у коров протекает очень тяжело. Fusobacterium necrophorum продуцирует лейкотоксин, который способствует распространению Arcanobacterium pyogenes в ткани органов животных. В то же время, Arcanobacterium pyogenes вырабатывает фактор роста для Fusobacterium necrophorum (R.A. Laven, A.R. Peters, 1996; G.S. Lewis, 1997;  E. Malinowski, 2004).

М.Н. Коннов, В.Г. Гумеров, В.Г. Гафаров и др., (2003), М.Н. Коннов (2004)  в результате вирусологических и бактериологических исследований доказали, что этиологическими агентами, вызывающими инфекционный баланопостит откормочных бычков, являются герпесвирус типа 1 и бактерии Fusobacterium necrophorum. Впервые установлено, что баланопостит у откормочных бычков протекает, в основном, в виде смешанной инфекции.

В КП УБеклемишевскоеФ Читинской области поражение бычков некробактериозом в форме баланопостита составляло до 35% (А.А. Ежинов, Б.Н. Бубеев, А.В. Волченко, 2002;  Б.Н.  Бубеев, 2004).

При лабораторном исследовании проб секретов из сосков вымени коров в летний период содержания в 35% случаев выделяли  Corynebacterium pyogenes, Peptococcus indolicus Ц  31%  и  Fusobacterium necrophorum Ц 22%  (J.M. Van Den Bogaard, M.J. HazenU Vecht, 1987).

Некробактериозные поражения хвоста были отмечены у бычков на откорме в одном из хозяйств Новосибирской области. Заболевали бычки, находившиеся на втором периоде откорма. Болезнью было охвачено 23,5% животных.

Следовательно, некробактериоз животных следует рассматривать не как местное поражение тканей дистального отдела конечностей, а как системное заболевание, которому свойственен эпизоотический процесс. Ведущими же факторами, влияющими на степень его проявления,  выступают условия кормления и содержания. Исходя из этих положений, необходимо совершенствовать диагностические, лечебные и профилактические мероприятия. 

2.2.2 Совершенствование методов диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных 

2.2.2.1 Усовершенствование метода отбора биоматериала из пораженной конечности для лабораторного исследования

По данным экспертиз районных и областных ветеринарных лабораторий  в большинстве случаев диагноз на некробактериоз не подтверждается. Одной из причин таких заключений лабораторий мы связываем с трудоемкостью взятия для бактериологического исследования некротизированных тканей из  пораженного пальца внутри роговой капсулы. Второй причиной, на наш взгляд, является то, что некротизированные участки тканей для исследования отбираются с поверхности пораженного органа. На поверхности пораженных тканей органа присутствует, как известно, большое количество аэробных микроорганизмов. А возбудитель некробактериоза относится к анаэробным микроорганизмам и в пораженном органе находится глубоко, на границе здоровой и некротизированной тканей.

Для исследования в лабораторию направляют обычно пораженную фалангу по путовый сустав. Взятие из глубины пораженной фаланги некротизированных фрагментов тканей  скальпелем, ножницами, пинцетом или ложкой Фолькмана, как правило, всегда очень затруднительно.

Мы предлагаем пораженную фалангу механически расчленить  на несколько фрагментов (3-4), в зависимости от степени поражения. Затем в боксе из пораженных участков фаланги ложкой Фолькмана, скальпелем, ножницами или пинцетом, предварительно обработанных 70% спиртом или подвергнутых фломбированию над пламенем горелки,  отбирают пробы некротизированных тканей для исследований. Дальнейшее бактериологическое исследование проводят согласно УМетодическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериозаФ (1987).

При исследовании 15 пораженных конечностей диагноз на некробактериоз подтвердился при усовершенствованной методике отбора биологического материала для лабораторного исследования в 93,3 % случаев, а при обычной методе в 60%.

Таким образом, новый метод  отбора биоматериала из пораженной конечности способствовал увеличению эффективности диагностики некробактериоза на 33,3% и может быть рекомендован для ветеринарных диагностических лабораторий.

2.2.2.2 Сравнительная эффективность индикации  Fusobacterium necrophorum бактериологическим методом и с помощью гнездовой ПЦР

Исследования по разработке гнездовой ПЦР для диагностики некробактериоза проводили совместно с лабораторией генной инженерии (заведующий  В.И. Семенихин). Нами проводилась индикация возбудителя некробактериоза и сопутствующей микрофлоры, накопление бактериальной массы,  и взятие биологических образцов.

Первоначально проверена специфичность разрабатываемой диагностичеснкой тест-системы. Положительные анализы продуктов ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК патогенного возбудителя F.necrophorum subsp. necrophorum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий: стафилонкокков, стрептококков, кишечной палочки, протея, микоплазмы.

Затем провели тестирование возбудителя некробактериоза в пробах, полученных  от коров из разных хозяйств Кемеровской, Новосибирской областей и Алтайского края. Пробы были взяты от животных по клиническим показаниям.

Во всех случаях бактериологическое  исследование  биоматериала из пораженных конечностей  (фаланга, костный мозг фаланги, кровь фаланги)  при положительной биопробе  на белых мышах совпадало с положительным результатом ПЦР, преимущественно с внутренним праймером (табл.1).

При исследовании абсцессов печени совпадение бактериологического исследования и ПЦР составило 50%.

Таблица 1 Ц Результаты  сравнительных исследований биологических
образцов на некробактериоз

№ проб	Исследуемый материал	Бактериологическое исследование		ПЦР с праймерами
		питательные среды и биопроба	получена чистая культура	наружные	внутренние
1	Фаланга 1	+	+	-	+
2	Фаланга 2	+	-	-	+
3	Фаланга 3	+	-	-	+
4	Фаланга 4	+	+	-	+
5	Фаланга 5	+	+	-	+
6	Фаланга 6	+	-	-	+
7	Фаланга 7	+	-	-	+
8	Фаланга 8	+	-	-	+
9	Фаланга 9	+	+	-	+
10	Фаланга 10	+	+	-	+
11	Костный мозг фаланги	+	+	+	+
12	Кровь фаланги	+	-	-	+
13	Абсцесс печени 1	+	-	-	-
14	Абсцесс печени 2	+	-	-	-
15	Абсцесс печени 3	+	+	-	-
16	Абсцесс печени 4	+	-	-	+
17	Абсцесс печени 5	+	-	-	+
18	Абсцесс печени 6	+	+	-	+
19	Абсцесс мышц	+	-	-	+
20	Биоматериал от мыши	+	-	+	+
21	Некротич. очаг от мыши	+	-	-	+
22	F. necroph. из коллекции	+	+	-	+
23	F. necrophorum лиофилизиров. 1	+	н/и	-	+
24	F. necrophorum лиофилизиров. 2	+	н/и	-	+
25	F. necrophorum.	+	+	-	+

Примечание:  У + Ф  положительный результат,

У- Ф  отрицательный результат

Разработанная  диагностическая тест-система полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами обладает строгой специфичностью и  позволяет  выявлять в биологических образцах  патогенный биотип АВ F. necrophorum subsp. necrophorum.

Диагностическое исследование биологических образцов из пораженных конечностей на некробактериоз бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией тождественно.

ПЦР с гнездовыми праймерами для выявления        F. necrophorum subsp. necrophorum  может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.

2.2.3 Определение роли специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.

2.2.3.1  Регламент получения антигена Fusobacterium necrophorum и
постановка реакции агглютинации

В настоящее время нет единого антигена для обнаружения антител против возбудителя некробактериоза F. necrophorum. Каждый исследователь готовит собственный антиген (АГ) для РА на основе полученных  изолятов. В доступной отечественной литературе мы не встретили работ, сообщающих  о методике  изготовления антигена F. necrophorum для РА, утвержденной директивными органами РФ. Ранее в своих исследованиях  РА использовали ученые ВИЭВ (Я.Р. Коваленко, 1948, А.Р. Мусаев, 1993), НИИСХ Крайнего Севера (О.И. Соломаха, 1973).

Исходя из имеющихся сведений,  мы поставили перед собой задачу разработать регламент приготовления АГ F. necrophorum и методику постановки  РА.

2.2.3.1.1  Выбор культуры (изолята) в качестве антигена

Для исследования взяли 10 культур F. necrophorum, выделенных от больных некробактериозом животных  с разной клинической формой.

Все культуры F. necrophorum хорошо росли на среде Китта-Тароцци или аминокровин-сывороточном бульоне (АКСБ) при температуре 37С. Десять исследуемых  культур  выделяли газы сероводород и  индол, не расщепляли углеводы.

Культура F. necrophorum УИВФ вызывала агглютинацию взвеси эритроцитов 5%-ой концентрации в разведении 1:32. Культура УТФ  агглютинировала 5%-ую  взвесь эритроцитов до разведения 1:16, культуры УОр1Ф, УBn2Ф, УЭФ, УВФ  только до  разведения  1:4. Слабой агглютинирующей способностью обладали культуры УНФ,  УОр2Ф -  до разведения  1:2. 

Вирулентные свойства культур F. necrophorum изучали на белых мышах. По данным таблицы 2 можно отметить, что наиболее патогенным для мышей оказалась  культура  УИВФ F. necrophorum. На месте инъекции культуры  УИВФ F. necrophorum у всех мышей образовался некроз тканей.  Она вызвала гибель всех мышей через 5-7 дней.

Культура  F. necrophorum УТФ,  вызвала образование некроза на месте инъекции  у всех животных в опытной группе. Гибель мышей составила 66,7 % через 7-8 дней в группе.

Таблица 2 - Результаты изучения патогенности культур
F. necrophorum на мышах

Название  культур F. necrophorum	Количество мышей	Время образования некроза (сутки)	Количество павших, гол./%	Время наступления летального исхода (сутки)
УBn2	3	6	1/33,3	7
УНФ	3	6	0/0	-
УИВФ	3	5	3/100	5-7
УОр1Ф	3	8	0/0	-
УОр2Ф	3	9	0/0	-
УТФ	3	7	2/66,7	7-8
УОФ	3	7	1/33,3	8
УЭФ	3	7	1/33,3	7
УАлтФ	3	8	1/33,3	7
УВФ	3	7	1/33,3	7
Контроль	3	-	-	-

Культуры УBn2Ф,  УОФ, УЭФ, УАлтФ,  УВФ также вызвали некроз тканей у всех мышей. Гибель животных составила 33,33% в каждой группе. Культуры  УНФ, УОр1Ф, УОр2Ф вызвали некроз тканей на месте инъекции бактериальной взвеси,  но все мыши оказались живыми.

В контрольной группе животных  на месте инъекции физиологического раствора воспаления не обнаружено, все мыши остались живыми.

Таким образом, по данным реакции гемагглютинации и изучения вирулентных свойств культур F. necrophorum наиболее патогенной для мышей оказалась культура УИВФ.  Культура F. necrophorum УИВФ выделена из пораженной конечности коровы.  Летальная доза (LD50) Fusobacterium necrophorum УИВФ для мышей составила 9,77 млн. микробных клеток (9,77 107м.к.).  На основании проведенных исследований для приготовления антигена отобрана культура Fusobacterium necrophorum УИВФ, которая принята на депонирование Научно-исследовательским институтом  Коллекции  культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии УВекторФ. 

Принятая культура Fusobacterium necrophorum УИВФ в НИИ ККМ получила регистрационный номер: B-845 (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.), и определяется нами как штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845.

Методика приготовления антигена и постановки реакции агглютинации выглядит в следующем виде.

2.2.3.1.2  Методика приготовления антигена F. necrophorum и техника
постановки РА

Культуру выращивали двое суток на среде Китта-Тароцци, затем  для получения большого количества бактериальной массы Fusobacterium necrophorum ее пересевали на  специальную среду аминокровин-сывороточный бульон (АКСБ). Бактериальные клетки освобождали от среды путем центрифугирования  при 3000 об/мин в течение 20 мин, промывали  физиологическим  раствором. Для предотвращения самоагглютинации АГ осадок клеток  Fusobacterium necrophorum ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,6  до концентрации  10 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту. Исследуемые пробы сыворотки крови животных также разводили в фосфатном буфере.

Антиген инактивировали 0,4%-ым раствором формалина. Стерильность антигена определяли путем посева на среды Китта-Тароцци, МПА, МПБ.

Основные этапы постановки реакции агглютинации следующие: 1. Готовили основное разведение каждой испытуемой сыворотки крови; 2. Готовили рабочие разведения каждой пробы сыворотки; 3. На следующем этапе работы во все пробирки с разведенными сыворотками  вносили  антиген. Для контроля антигена с целью исключения самоагглютинации в 1 мл фосфатного буфера добавляли 0,1 мл антигена.  Штатив с пробирками  помещали в термостат при температуре 37С на 15-18 часов, а затем выдерживали при комнатной температуре 2-3 часа, после чего учитывали реакцию агглютинации визуально и оценивали ее в крестах.

Показатели  агглютинации в пробирках на четыре, три или два креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три или четыре креста, считали ее титром.

2.2.3.2  Изготовление и апробация вакцины ГОА ИЭВСиДВ

2.2.3.2.1  Определение иммунизирующей дозы вакцины.

На основании лабораторных исследований нами разработан регламент  изготовления вакцины на основе штамма Fusobacterium necrophorum ИВ B-845, стимулятора резистентности и адъюванта гидроокиси алюминия. Для определения иммунизирующей дозы вакцины сформировали семь групп животных: шесть опытных и одна  контрольная, в каждой группе было по 4 коровы. Коровам опытных групп № 1, 3, 5 вакцину вводили однократно, а № 2, 4, 6  дважды с интервалом три недели. Доза вакцины для животных групп № 1 и 2 - 1 мл, № 2 и 4 -  3 мл, № 5 и 6 - 5 мл. Животные 7-ой группы (контроль) не были вакцинированы. Титры антител в пробах сыворотки крови животных  определяли при помощи разработанной нами реакции агглютинации (табл. 3).

Таким  образом, на основании результатов этих исследований в качестве иммунизирующей взята доза вакцины 3 мл, как более экономичная и достаточно иммуногенная.

Таблица 3 Ц Титры антител сыворотки крови коров, иммунизированных  разными дозами вакцины

Группа, кратность введения	Доза вак-цины	Титры антител  (lg)
		перед опытом	через 14 дней	через 1,5 мес.	через 3 мес.	через 5мес.	через 6 мес.
I/1	1 мл	2,30,05	2,450,04	2,50,05	2,50,05	2,30,03	2,30,04
II/2	1 мл	2,30,06	2,50,07	3,00,03*	2,60,08**	2,450,05	2,30,02
III/1	3 мл	2,30,04	3,00,05*	3,00,04*	2,80,04*	2,50,07	2,30,02
IV/2	3 мл	2,30,04	3,00,05*	4,20,03*	3,50,04*	3,00,05*	2,40,06
V/1	5 мл	2,40,07	3,00,06*	3,00,05*	2,90,07*	2,50,04	2,30,08
VI/2	5 мл	2,20,04	3,10,04*	4,30,05*	3,60,04*	3,00,06*	2,40,09
VII (Контроль)		2,30,04	2,30,07	2,20,05	2,30,06	2,20,08	2,30,04

Примечание: достоверный уровень значимости  по отношению к контролю

и перед опытом *-  Р<0,01, -  ** Р<0,05

2.2.3.2.2  Испытание вакцины в неблагополучных по
некробактериозу хозяйствах

Испытание профилактической эффективности вакцины ГОА ИЭВСиДВ провели в трех неблагополучные хозяйства Новосибирской области: хозяйство №1, хозяйство №2 и хозяйство №3 (табл. 4). Данные хозяйства неблагополучны по некробактериозу от 6 до 10 лет.

По данным таблицы 4, в исследуемых хозяйствах среднегодовой удой на 1 фуражную корову  колебался от 2750 кг до 6000 - 7500 кг. В структуре рациона удельный вес сена составлял от 7,5  до 17,9%, сочных кормов (силос +сенаж)  - от 37,3 до 83,3%, концентратов  - от 6,7 от 17,9%,  дробины - от 0 до 37,3%.

Таблица  4 - Зоотехнические и эпизоотические показатели в неблагополучных  по некробактериозу хозяйствах и результаты применения вакцины ГОА ИЭВСиДВ

№ п/п	Показатель	Хозяйство №1	Хозяйство №2	Хозяйство №3
1	Поголовье коров, гол.	560	750	200
2	Удой на 1 фуражную корову, кг	6000 -7500	2750	2800
3	Структура рациона кормления живот- ных до проведения мероприятий, %
	- сено	7,5	17,9	10,0
	- силос +сенаж	37,3	71,4	83,3
	- концентраты	17,9	10,7	6,7
	- дробина	37,3	0	0
4	Тип кормления	К**	П***	П***
5	Дефицит компонентов рациона к  норме, %:
	- вит. Д,	62,86	69,0	73,4
	-  каротин,	7,66	Норма	Норма
	- сахар,	59,89	64,0	67,47
	- сырая клетчатка,	Норма	17,5	Норма
	- фосфор,	14,25	36,2	47,62
	- кальций,	6,2	23,0	9
	- сера,	9,0	22,27	28,64
	- йод,	69,24	65,0	67,35
	- кобальт,	15,3	40,68	57,63
	- цинк,	31,98	38,46	47,7
	- медь,	Норма	Норма	30,9
6	Сахаропротеиновое отношение	0,31	0,28	0,31
7	Абсцессы печени, %	6,52	-	-
8	Биохимические показатели сыворотки крови коров:
	- щелочной резерв, (норма 46-66 Об% СО2)	36,71,7	45,81,24	32,41,2
	- кальций общий, (норма 2,5-3,13 ммоль/л)	2,390,04	2,460,03	2,20,04
	- фосфор неорганический, (норма 1,45-1,94 ммоль/л)	1,60,04	1,490,05	1,30,05
	- каротин, (норма 0,4-2,8 мг%)	0,130,02	0,160,01	0,340,03
	- общий белок, (норма 72-86 г/л)	87,01,5	75,01,2	73,41,8
9	Заболеваемость по хозяйству, %	8- 10	16-17	8-11
10	Количество  животных  (опыт/контроль)	100/100	160/120	60/60
11	Среднемесячная заболеваемость (M±m),  опыт/контроль, (%)	3,7±0,9  * 9,2±0,74	8,47±0,47 * 14,32±0,9	4,43±1,2 *  8,6±0,67
12	Продолжительность опыта, мес.	10	12	6
13	КСИ****, %	59,78	41,1	48,49

Примечание: * Ц  достоверный уровень значимости по отношению к контролю,  Р<0,01, К** -  концентратный, П*** - полуконцентратный, КСИ**** - коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса

Тип кормления коров в хозяйстве №1 -  концентратный (концентрированные корма составляли 45,4% от питательности рациона кормления), в двух остальных полуконцентратный (25,3 - 28,10%). Во всех хозяйствах анализ питательности рационов кормления по отношению к норме выявил дефицит витамина Д, сахара, фосфора, кальция, серы, йода, кобальта, цинка,  в хозяйстве №1 - каротина, в хозяйстве №2 - сырой клетчатки, в хозяйстве №3 - меди. Ниже нормы было сахаропротеиновое отношение, от 0,28 до 0,31. 

В хозяйстве №1 среди крупного рогатого скота, поставляемого на убой на ОАО УНовосибирский мясоконсервный комбинатФ, при послеубойной  экспертизе внутренних органов выявлены  поражения печени в виде абсцессов (6,52%), вызванные Fusobacterium necrophorum. Некробактериозом болели преимущественно коровы и нетели после отела.

По результатам биохимического исследования сыворотки крови коров во всех хозяйствах  установлены ниже нормы показатели  щелочного резерва, каротина, кальция общего, в хозяйстве №3 - фосфора неорганического, а в хозяйстве №1 было выше нормы содержание общего белка.

Заболеваемость коров кожной формой  некробактериоз колебалась от  8 до 17%.

В хозяйствах №2 и  №3 при клиническом исследовании животных обнаружено провисание путового и венечного суставов, рассасывание хвостовых позвонков. В помещениях для животных высокая влажность.

В данных хозяйствах  иммунизировали коров вакциной ГОА ИЭВСиДВ в  период стойлового содержания. В течение опыта среднемесячная заболеваемость коров в вакцинированных группах животных была достоверно ниже (Р<0,01) по сравнению с контрольными. Коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса  (КСИ) составил: в хозяйстве №1 - 59,78%, в хозяйстве №2 Ц 41,1%, в хозяйстве №3 - 48,49%.

2.2.3.3 Сочетанное  применение вакцинации и неспецифических
мероприятий при оздоровлении от некробактериоза

Опыты по сочетанному  применению  неспецифических мероприятий и вакцинации при оздоровлении от некробактериоза крупного рогатого скота провели в хозяйстве №4 Тюменской, хозяйстве №5 Новосибирской,  в хозяйстве №6 Томской области и хозяйстве №7  Алтайского края (табл.  5).

По данным таблицы 5, в исследуемых хозяйствах среднегодовой удой на 1 фуражную корову  колебался от 3600 кг до 4700 кг. В структуре рациона удельный вес сена составлял от 0  до 11,45%, сочных кормов (силос +сенаж) - от 68,73 до 83,3%, концентратов - от 8,2 до 19,82%.

Тип кормления коров в хозяйствах №4, №6, -  концентратный (концентрированные корма составляли 42,70-46,72% от питательности рациона кормления), а в хозяйствах №5, №7 полуконцентратный (26,80-37,91%). Во всех хозяйствах анализ питательности рационов кормления по отношению к норме выявил дефицит витамина Д, сахара, фосфора,  йода, а также в хозяйствах №4-6 - серы,  №5-7 - кобальта и цинка, №6  - сырой клетчатки, кальция, марганца и меди. Ниже нормы было сахаропротеиновое отношение, от 0,34 до 0,50. 

В хозяйстве №4 среди крупного рогатого скота, при послеубойной  экспертизе выявлены  поражения мышечной ткани тазовых конечностей, вызванные Fusobacterium necrophorum. По результатам биохимического исследования сыворотки крови коров в  хозяйствах № 4, №5, №6, №7  установлены ниже нормы показатели кальция общего, фосфора неорганического в хозяйствах №5, №6, №7 - щелочного резерва, каротина,  в хозяйстве №4  -  общего белка.

Таблица 5 - Зоотехнические и эпизоотические показатели в хозяйствах и результаты  оздоровления от некробактериоза при сочетании вакцинации с неспецифическими методами

№ п/п	Показатель	Хозяйство №4	Хозяйство №5	Хозяйство №6	Хозяй- ство №7
1	Поголовье коров, гол.	600	1200	570	1700
2	Удой на 1 фуражную корову, кг	4250	4000	4700	3600
3	Структура рациона кормления живот- ных до проведения мероприятий, %:
	- сено	11,45	9,9	0	7,9
	- силос +сенаж	68,73	81,9	83,3	76,8
	- концентраты	19,82	8,2	16,7	15,3
4	Тип кормления	К*	П**	К*	П**
5	Дефицит компонентов рациона к  норме, %:
	- вит. Д,	40,54	62,1	80	60,8
	- сахар,	7,37	52,0	59,7	42,4
	- сырая клетчатка,	Норма	Норма	14	Норма
	- фосфор,	17	30,44	27,2	5,7
	- кальций,	Норма	Норма	14,2	Норма
	- сера,	19	5,54	11	Норма
	- йод,	56,6	62,5	72,2	64,1
	- кобальт,	Норма	37,4	25	6,5
	- цинк,	Норма	35,27	43,4	23,3
	- марганец,	Норма	Норма	12,46	Норма
	- медь,	Норма	Норма	8	Норма
6	Сахаропротеиновое отношение	0,50	0,43	0,34	0,41
7	Поражение мышечной ткани тазов. кон.	-	-	+	-
8	Биохимические показатели сыворотки крови коров: - щелочной резерв
	(норма 46-66 Об% СО2)	47,20,99	38,50,05	32,60,08	40,10,06
	-кальций общий, (норма 2,5-3,13 ммоль/л)	2,10,06	2,10,05	1,90,04	2,340,07
	- фосфор неорганический, (норма 1,45-1,94 ммоль/л)	1,00,07	1,30,04	1,10,05	1,160,04
	- каротин, (норма 0,4-2,8 мг%)	0,500,046	0,210,02	0,270,03	0,320,03
	- общий белок, (норма 72-86 г/л)	71,00,8	72,80,6	84,31,5	81,81,3
9	Вакцина	ГОА ИЭВСиДВ	ГОА ИЭВСиДВ	ГОА фор-молвакц.	ВИЭВ
10	Заболеваемость животных до проведения мероприятий - коровы/молодняк, %	50/10	14/0	30/15	21,4/0
11	Заболеваемость животных после проведения мероприятий коровы/молодняк, %	8/4	0/0	9/3	3,5/0
12	Продолжительность наблюдения, лет	1	7	1,5	4
13	КСИ***, % (коровы/молодняк)	84/60	100	70/80	83,65

Примечание: К* -  концентратный, П** - полуконцентратный, КСИ*** - коэффициент

снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса

В хозяйстве №4  при клиническом исследовании  животных отмечали признаки остеодистрофии: расслабление связочного аппарата суставов пальца, рассасывание хвостовых позвонков как результат нарушения обменных процессов на почве несбалансированного кормления. В помещениях для животных высокая влажность.

Заболеваемость коров кожной формой  некробактериоз колебалась от  14 до 50%. В хозяйствах №4 и №6 также кожной формой некробактериоза болел и молодняк, заболеваемость составляла от 10 до 15% .

В хозяйстве №4 все поголовье животных (600 коров) в октябре было привито противонекробактериозной ГОА ИЭВСиДВ вакциной. В октябре (перед вакцинацией), ноябре,  декабре 1994 г. и в апреле 1995 г  проведено определение титра антител, который  составил соответственно  lg 2,4±0,07; lg 4,0±0,08, (Р<0,01), lg 3,2±0,05, (Р<0,01),  и lg 2,5±0,09.

Проведенный биохимический анализ сыворотки крови в октябре, декабре и апреле показал улучшение их показателей. Если в октябре такие показатели обмена веществ  как содержание кальция, фосфора и белка были ниже нормативных показателей, то к  декабрю произошло их достоверное повышение (Р <0,05-0,01).

В результате проведенных ветеринарно-санитарных и специфических мероприятий в хозяйстве заболеваемость коров снизилась с 50 до 8%, молодняка - с 10 до 4%, КСИ составил соответственно 84 и 60 %.

В хозяйстве №5 в начале стойлового содержания и в конце февраля (ревакцинация) ежегодно (2000-2005 гг.) всех коров и нетелей  двукратно прививали  опытной гидроокисьалюминиевой вакциной.

абораторные исследования сыворотки крови животных показали, что содержание в ней каротина, кальция, фосфора, белка, щелочного резерва находится в пределах физиологической нормы: каротина - 0,50,0262 мг%, кальция общего - 2,50,0162 ммоль/л, фосфора неорганического - 1,5740,036 ммоль/л, общего белка -  86,50,93 г/л, щелочной резерв  - 53,760,00 об%/СО2.

Внедрение комплексной системы мероприятий  способствовало  оздоровлению хозяйства №5 от некробактериоза крупного рогатого скота, КСИ составил 100%, а экономическая эффективность из расчета на 1 рубль затрат составила 4,63 руб.

В хозяйстве № 6 все поголовье животных, начиная с 4-х месячного возраста, иммунизировали инактивированной гидроокисьалюминиевой (ГОА) формолвакциной против некробактериоза животных согласно наставлению по ее применению.

В результате проведенных ветеринарно-санитарных и специфических мероприятий удалось снизить заболеваемость коров с 30 до 9,0%, молодняка - с 15 до 3%, КСИ составил соответственно 70 и 80 %. Поражения мышечной ткани тазовых конечностей больше не зафиксировано.

В хозяйстве № 7 все поголовье коров ежегодно, начиная с 2002 года, иммунизировали инактивированной эмульгированной вакциной против некробактериоза животных (ВИЭВ) согласно наставлению по применению.

В результате проведения системы мероприятий по оздоровлению и профилактике  некробактериоза с марта 2002  по  май 2006 гг. заболеваемость коров некробактериозом уменьшилась с 21,4 до 3,5%, КСИ составил 83,65 %.

2.2.3.4 Одномоментное испытание разных разрабатываемых
противонекробактериозных вакцин в однотипных условиях

В 90-е годы в России разработкой вакцин против некробактериоза занимались несколько научных коллективов: ГНУ ИЭВСиДВ -  гидроокисьалюминиевая вакцина; МВА и  ВГНКИ - нековак  и нековак-ститул вакцины;  ВИЭВ - эмульгированная инактивированная вакцина. Нами проведено одновременное испытание этих вакцин в неблагополучном  хозяйстве №8 Новосибирской области на одной и той же ферме, при одинаковых условиях кормления, ухода и  содержания животных (табл. 6).

По данным таблицы 6, в хозяйстве содержали 1109 коров. Среднегодовой удой на 1 фуражную корову составлял 3500 л.  Некробактериозом в основном болели животные после отела, с ярко выраженными клиническими признаками. Заболеваемость животных некробактериозом на протяжении предыдущих 5 лет ежегодно составляла 11-24%.  Кроме гнойно-некротического поражения дистального отдела конечностей у животных отмечали признаки остеодистрофии: расслабление связочного аппарата суставов пальца,  рассасывание хвостовых позвонков. У 1,81%  животных при убое на мясокомбинате обнаружены абсцессы печени, вызванные Fusobacterium necrophorum. Животных содержат в типовых коровниках, в стойловый период на  привязи, моциона в зимний период практически нет, весной и осенью - на необорудованных выгульных дворах в течение двух  часов (с 16 до 18 час). В помещениях высокая влажность. Подстилка из соломы,  навозоудаление скребковыми транспортерами. В структуре рациона удельный вес сена составлял 11,9 %, силоса - 59,5 %,  концентратов - 11,9%, соломы - 16,7%. Тип кормления коров Ц полуконцентратный  (концентрированные корма составляли 29,7% от питательности рациона кормления). На 1 кормовую единицу приходилось 85,1 г переваримого протеина, сахара - 23,91 г, жира Ц36,49 г, кальция - 5,87 г, фосфора - 2,76 г, магния - 2,36 г, серы - 1,80 г.

Анализ питательности рациона кормления животных по отношению к норме выявил дефицит витамина Д, сахара, фосфора,  йода,  кобальта и цинка.  Сахаропротеиновое отношение ниже нормы (0,28). 

абораторные исследования сыворотки крови показали содержание ниже нормы кальция  2,30,051 ммоль/л, фосфора неорганического 1,32 0,09 ммоль/л и щелочного резерва  36,20,62 Об% СО2,. В данном хозяйстве,  неспецифические меры профилактики, намеченные нами, руководством хозяйства не были проведены.

Все вакцины применяли согласно  наставлениям по их применению. Среднемесячная заболеваемость животных в опытных группах была достоверно ниже  по сравнению с контрольными (Р<0,01).

Коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса при применении вакцин соответственно составил: ГОА ИЭВСиДВ Ц 50,71 %, нековак - 46,1%, инактивированной эмульгированной (ВИЭВ) Ц 41,2%.

Таким образом, вакцинация против некробактериоза животных несколько снижает заболеваемость, поэтому для полной ликвидации инфекции в неблагополучных хозяйствах иммунизацию  необходимо сочетать с ветеринарно-санитарными мерами.

Таблица 6 Ц Зоотехнические и эпизоотические показатели в хозяйстве и
результаты одномоментного испытания разных разрабатываемых
противонекробактериозных вакцин

№ п/п	Показатель	Хозяйство № 8
1	Поголовье коров, гол.	1109
2	Удой на 1 фуражную корову, кг	3500
3	Структура рациона кормления животных до проведения мероприятий,  %:
	- сено	11,9
	- солома	16,7
	- силос	59,5
	- концентраты	11,9
4	Тип кормления	П**
5	Дефицит компонентов рациона к норме, %:
	- вит. Д,	71
	- сахар,	63,5
	- фосфор,	23,0
	- йод,	28,4
	- кобальт,	6,9
	- цинк,	9,4
6	Сахаропротеиновое отношение	0,28
7	Абсцессы печени, %	1,81
8	Биохимические показатели сыворотки крови коров
	- каротин	0,507 0,04
	- щелочной резерв, (норма 46-66 Об% СО2)	36,2 0,62
	- кальций общий, (норма 2,5-3,13 ммоль/л)	2,30,051
	- фосфор неорганический, (норма 1,45-1,94 ммоль/л)	1,32 0,09
9	Заболеваемость животных по хозяйству,  %	24
10	Количество  животных опыт/контр.	50/50
11	- Среднемесячная заболеваемость (M±m), %:
	- вакцина ГОА ИЭВСиДВ	8,020,36*
	- вакцина Нековак	8,770,34*
	- вакцина ВИЭВ	9,570,43*
	- контроль	16,270,84
12	Продолжительность опыта, мес.	12
13	КСИ** *:
	- вакцина ГОА ИЭВСиДВ	50,71
	- вакцина Нековак	46,1
	- вакцина ВИЭВ	41,2

Примечание: * Ц  достоверный уровень значимости по отношению к контролю,  Р<0,01, П** -  полуконцентратный,  КСИ***- коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса

2.2.4  Оздоровление неблагополучных по некробактериозу хозяйств с разной эпизоотической ситуацией неспецифическими  методами

2.2.4.1  Естественная резистентность организма крупного рогатого скота - как условие эффективности неспецифических методов оздоровления

Исходя из имеющихся теоретических предпосылок о зависимости заболеваемости животных от состояния резистентности их организма, провели исследования в неблагополучных по некробактериозу хозяйствах в этом направлении. Установлено, что у больных животных  естественная резистентность организма была ниже по сравнению со здоровыми,  как при стойловом, так и пастбищном содержании. Эта разница особенно  заметна и имела достоверное значение (P<0,05) по лизоцимной и бактерицидной активностям. Если лизоцимная активность у больных животных в стойловый период была 8,611,19%, то во время летнего пастбищного содержания  она равнялась 16,931,56%. Увеличение ее на 8,32% при оценке методами математической статистики оказалось достоверным (Р<0,05). Более высокие значения лизоцимной активности установлено у здоровых животных в стойловый и пастбищный периоды. Так, в летнее время у больных животных лизоцимная активность была 16,931,56%, тогда как у здоровых коров в это же время она составляла 22,68±1,65%. Разность между этими показателями статистически достоверна (Р<0,05).

Фагоцитарная активность  больных  и здоровых животных  изменялась незначительно, как в стойловый, так и пастбищный периоды. Среднее ее значение колебалось от  68,11±1,24% до 70,91±1,19%.

Сравнительное изучение естественной резистентности организма крупного рогатого скота в хозяйствах в зависимости от их благополучия по некробактериозу также показало, что она была выше в пастбищный период, как в благополучном, так и неблагополучном хозяйствах. Увеличение зарегистрировано по состоянию бактерицидной и лизоцимной активностям, тогда как показатель фагоцитарной активности изменился незначительно.

Так, в пастбищный период БА у животных в неблагополучном хозяйстве составила 56,71±1,54%, а в благополучном Ц  66,24±1,47% (P<0,05). Лизоцимная активность в сыворотке крови коров резко увеличилась в пастбищный период в неблагополучном хозяйстве по отношению к животным, находившимся на стойловом содержании: показатели ее 20,34±1,19%  и  10,68±1,39% соответственно.

В одном из неблагополучных по некробактериозу хозяйств Новосибирской области на модельной группе коров изучали динамику показателей естественной резистентности организма с учетом ежемесячной заболеваемости животных в стаде  (рис.).

Анализ результатов исследований показал,  что уже с ноября началось снижение бактерицидной активности сыворотки крови. Такое явление продолжалось до апреля, после 2-месячного стабильного состояния, в мае она несколько повысилась, в июне, июле и августе отмечено относительно стабильное состояние, а в сентябре началось вновь ее понижение.  Разность  в показателях по снижению бактерицидной активности с ноября (62,60,98%) к апрелю (51,71,7%) оказалась статистически достоверной (Р<0,05). Показатели лизоцимной активности сыворотки крови в течение осенне-зимних месяцев, с ноября по февраль снижались медленно, а с марта по апрель кривая ее пошла резко вниз и составила 8,270,72%, Р<0,05, тогда как с мая началось ее стабильное увеличение, которое продолжалось до августа  15,90,84%. Разность между показателями ЛА в летние и зимние месяцы достоверна (Р<0,05-0,01).

Рисунок - Показатели естественной резистентности  и заболеваемость крупного рогатого скота некробактериозом в неблагополучном хозяйстве

Фагоцитарная активность крови с ноября по май колебалась незначительно (57-58%), после чего она стала возрастать до августа (62,00,4%), а затем начала снижаться. Увеличение фагоцитарной активности в летние месяцы по сравнению с уровнем зимних  достоверно (Р<0,05). При сопоставлении динамик показателей естественной резистентности и заболеваемости, животных некробактериозом можно заметить, что при снижении уровня резистентности происходит увеличение заболеваемости. Особенно это просматривается в отношении бактерицидной и лизоцимной активностей и меньшей степени в сравнении с фагоцитарной активностью. Так, в ноябре, заболеваемость животных была наименьшая (1,5%), а показатели естественной резистентности относительно высокими: БА Ц 62,60,98%, ЛА Ц 10,10,5%, ФА Ц 59,00,7%.  В апреле, когда показатели резистентности были низкими (БА 51,71,7%, ЛА 8,270,7%, ФА 57,00,9%) заболеваемость возросла в 3,67 раза и составила 5,5%.  С мая по август  показатели естественной резистентности  начали возрастать, а заболеваемость животных некробактериозом уменьшилась за этот промежуток времени  в 2,35 раза и составила 1,7%.

Таким образом, показатели естественной резистентности организма крупного рогатого скота, как бактерицидная, так и лизоцимная активности меняются в течение года. В меньшей степени изменяется фагоцитарная активность крови. Наиболее высокая она в летний период, во время пастбищного содержания, с постановкой на стойловое содержание начинается ее снижение. В хозяйствах, неблагополучных по некробактериозу, показатели резистентности ниже, чем в благополучных хозяйствах, и они ниже у больных животных по сравнению со здоровыми. Динамика показателей естественной резистентности и заболеваемости имеет противоположную направленность, т.е. со снижением  показателей естественной резистентности увеличивается заболеваемость и, наоборот, при повышении резистентности снижается заболеваемость, при коэффициенте корреляции: БА- r = -0,924,  ЛА-  r = -0,600, ФА-  r = -0,656.

2.2.4.2. Применение неспецифических мероприятий в неблагополучных хозяйствах

Опыты по применению  неспецифических мероприятий  при оздоровлении от некробактериоза крупного рогатого скота провели в хозяйстве №9, хозяйстве №10, хозяйстве №11,  хозяйстве №12 и хозяйстве №13  Новосибирской  области и Алтайского края (табл. 7).

По данным таблицы 7, в исследуемых хозяйствах среднегодовой удой на 1 фуражную корову  колебался от 3240 кг до 7700 кг. В структуре рациона удельный вес сена составлял от 6,3  до 14,9%, сочных кормов (силос +сенаж) - от 69,3 до 78,1%, концентратов  - от 10,5 до 24,40%.

Тип кормления коров в хозяйствах  №9, №11, №13 -  полуконцентратный (концентрированные корма составляли 26,30-33,75% от питательности рациона кормления), а в хозяйствах  №10, №12 - концентратный (40,00 - 52,85 %). Во всех хозяйствах анализ питательности рационов кормления по отношению к норме выявил дефицит витамина Д, сахара,  йода, цинка,  в хозяйствах №10-13 - фосфора и кобальта, в хозяйствах №10-12 - серы, в хозяйстве №10 -  сырой клетчатки, в хозяйстве №12 - каротина, кальция и меди. Ниже нормы было сахаропротеиновое отношение, от 0,34 до 0,48. 

В хозяйствах №10, №12, №13 у животных при убое на мясокомбинате обнаружены абсцессы печени от 2,05 до  7,8 %, вызванные Fusobacterium necrophorum.  Также в хозяйстве №12 среди первотелок и коров после второго отела были отмечены поражения кожи сосков вымени,  обусловленные Fusobacterium necrophorum.

В хозяйстве №11 при клиническом исследовании животных обнаружено провисание путового и венечного суставов, рассасывание хвостовых позвонков. Все эти факторы говорят о том, что у животных нарушен витаминно-минеральный обмен.  Это способствует понижению резистентности организма животных.

По результатам биохимического исследования сыворотки крови коров во всех хозяйствах (№ 9-№13)  установлены ниже нормы показатели щелочного резерва, кальция общего, фосфора неорганического, а в хозяйствах №9, №10, №11, №13 - также каротина.

В изучаемых хозяйствах (№9 - №13) заболеваемость коров кожной формой  некробактериоза колебалась от  8 до 19%. В хозяйствах №9 и №11 кожной формой некробактериоза болел  также молодняк, заболеваемость которого составляла от 8 до 15% .

В результате применения неспецифических мероприятий по ликвидации некробактериоза в хозяйстве №9  показатели сыворотки крови животных  по кальцию общему достигли  нормы в декабре 2002 г. - 2,500,08  ммоль/л, фосфора  и  щелочного резерва в феврале 2003 г., соответственно - 1,620,04 ммоль/л и 55,01,2 Об%/СО2, каротина в декабре 2003 г. - 0,410,03 мг%. За четырехлетний период оздоровления заболеваемость коров снизилась  с 15 до 0,2%,  молодняка с  8  до 2 %, КСИ составил соответственно 98,67 и 75 %.

Экономическая эффективность при проведении  оздоровительных мероприятий при некробактериозе крупного рогатого скота равнялась 8,8 руб., из расчета на 1 рубль затрат. В результате применения некрогеля и тетрацина для лечения некробактериоза крупного рогатого скота экономическая эффективность из расчета на 1 рубль затрат составила 3,58 руб. Лечебная эффективность некрогеля составила 86%, схемы: некрогель+ тетрацин  - 93%.

Таблица 7 - Зоотехнические и эпизоотические показатели  в хозяйствах и результаты оздоровления  от некробактериоза неспецифическими  методами

Показатель	Хозяйст-во №9	Хозяйст-во №10	Хозяйст- во №11	Хозяйст-во №12	Хозяйст- во №13
1. Поголовье  коров, гол.	754	1727	760	2369	1100
2. Удой на 1 фуражную корову, кг	4000	4350	3500	7700	3240
3. Структура рациона кормления животных до проведения мероприятий,  %
- сено	8,9	11,8	14,9	6,3	9,4
- силос +сенаж	77,8	71,0	74,6	69,3	78,1
- концентраты	13,3	17,2	10,5	24,4	12,5
4. Тип кормления	П**	К*	П**	К*	П**
5. Дефицит компонентов рациона к норме, %:
- вит. Д,	50,75	67,58	52,0	76,36	56,6
- каротин,	Норма	Норма	Норма	5,87	Норма
- сахар,	31,2	51	49,74	64,35	40,0
- сырая клетчатка,	Норма	9,1	Норма	Норма	Норма
- фосфор,	Норма	16,7	22,35	24,1	11,0
- кальций,	Норма	Норма	Норма	10,5	Норма
- сера,	Норма	9,0	8,5	11,17	Норма
- йод,	56,35	65,52	64,60	78,0	65,12
- кобальт,	Норма	14,3	27,7	24,76	14,3
- цинк,	8,74	30,47	29,5	46,14	25,25
- медь,	Норма	Норма	Норма	5,2	Норма
6. Сахаропротеиновое отношение	0,42	0,37	0,41	0,34	0,48
7. Абсцессы печени	-	2,3	-	7,8	2,05
8. Поражение кожи сосков вымени	-	-	-	+	-
9. Биохимические показатели сыворотки крови коров:
- щелочной резерв, (норма 46-66 Об% СО2)	44,01,2	38,03,3	41,4 2,1	23,20,63	32,2 0,8
- кальций общий, (норма 2,5-3,13 ммоль/л)	2,40,03	1,900,05	2,480,05	1,910,07	2,140,03
- фосфор неорганический, (норма 1,45-1,94 ммоль/л)	1,400,07	2,140,02	1,370,02	1,390,11	1,2 0,05
- каротин, (норма 0,4-2,8 мг%)	0,260,02	0,220,02	0,360,17	0,420,09	0,390,06
10. Заболеваемость животных до проведения мероприятий - коровы/молодняк, %	15/8	15/0	8/15	12/0	19/0
11. Заболеваемость животных после проведения мероприятий - коровы/молодняк,%	0,2/2	3/0	1,2/3,0	3/0	2,7/0
12. Продолжительность наблюдения, лет	4	8	2	4	2,9
13. КСИ***, % (коровы/молодняк)	98,7/75	80	85/80	75/0	85,79/0

Примечание:  К* -  концентратный, П**- полуконцентратный,

КСИ** *- коэффициент снижения интенсивности проявления эпизоотического процесса

В результате проведения оздоровительных мероприятий неспецифическими методами в хозяйстве №10  лабораторными исследованиями сыворотки крови  установлено нормализация обменных процессов в организме животных,  что видно по содержанию  кальция -  2,900,12 ммол/л, щелочному резерву - 48,00,67  об% СО2,  каротину - 0,530,042 мг%. Проведенные мероприятия способствовали снижению заболеваемости животных некробактериозом  с 15 до 3,0%, КСИ составил 80 %.  При проведении оздоровительных мероприятий при некробактериозе крупного рогатого скота экономическая эффективность из расчета на 1 рубль затрат равнялась 4,04 руб.

У животных хозяйства №11  биохимические показатели сыворотки крови:  кальций общий, щелочной резерв, фосфор неорганический пришли в норму в 2004 году и составили соответственно 2,51 0,04 ммоль/л, 52,44 1,5 об% СО2 и 1,57 0,06 ммоль/л. За двухлетний период оздоровления заболеваемость среди коров уменьшилась с 8 до 1,2%, среди молодняка - с 15  до 3%, КСИ составил соответственно 85 и 80%.

В результате применения неспецифических мероприятий по ликвидации некробактериоза  в хозяйстве №12  с  2001 года по март 2006 заболеваемость коров некробактериозом снизилась  с 12  до 3,0%,  при  КСИ - 75%.

В 2004-2006 гг. биохимические показатели сыворотки крови животных хозяйство №13 по каротину (0,78 0,02 - 0,94 0,44 мг%); кальцию (2,5 0,03 ммоль/л), фосфору  (1,7 0,09 ммоль/л) и  щелочному резерву  (48,5 0,6 Об% СО2) пришли к норме. В результате проведения системы мероприятий по оздоровлению и профилактике  некробактериоза с марта 2003 года по  апрель 2006 заболеваемость коров некробактериозом уменьшилась с 19  до 2,7%, КСИ достиг 85,79%.

 

2.2.5  Разработка и испытание препаратов для лечения больных некробактериозом животных

2.2.5.1  Новый лекарственный препарат некрогель местного действия

2.2.5.1.1 Состав препарата и доклинические исследования

На основании данных о том, что при гнойно-некротическом процессе в области дистальных отделов конечностей наряду с возбудителем некробактериоза присутствует  сопутствующая микрофлора и, учитывая ее биологические свойства, антибиотико - и лекарственную устойчивость, заключили, что препарат для местного применения при некробактериозе животных должен быть многокомпонентным и многофункциональным.

Исходя из этого положения, в состав препарата включили лекарственные вещества из групп антибиотиков, сульфаниламидов, местноанастезирующих, антисептических  средств и  формообразователей. Эта многокомпонентная смесь на водорастворимой основе, имеющая форму мази желто-коричневого цвета,  со специфическим запахом чеснока, названа некрогель.

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) некрогеля составила  в отношении штамма Fusobacterium  necrophorum  УИВФ - 1,0 мкг/мл,  изолята Fusobacterium  necrophorum  Ц 1,0 мкг/мл,  Escherichia coli (изолят) - 7,8 мкг/мл, Staphylococcus aureus (изолят) - 4,3 мкг/мл, Streptococcus (изолят) - 4,2 мкг/мл, Micrococcus (изолят) - 22,4 мкг/мл.

Приведенные данные свидетельствуют, что некрогель обладает высокой антимикробной активностью в отношении микроорганизмов, участвующих в гнойно-некротическом процессе при некробактериозе животных.

ечебная эффективность некрогеля в научном опыте. Для научного  опыта  по  принципу  аналогов  подобрали две группы по 9 животных:  опытная и контрольная. Лечение больных неробактериозом животных проводили следующим образом. Первоначально у подопытных животных осуществляли хирургическую  обработку раны. Затем в опытной  группе  рану  животных обрабатывали некрогелем,  а в контрольной мазью Конькова.  После  этого накладывали марлевую повязку,  смену ее проводили через 4 дня. Наблюдение за животными продолжали в течение 20 дней.

В обеих группах животные имели среднюю стадию некробактериозного поражения. За это время в опытной группе из 9  животных  выздоровело  9,  или 100%. Количество обработок составило  2,56±0,18, (Р<0,01),  продолжительность лечения - 9,7±0,5 дня, (Р<0,01). В контрольной группе из 9 животных выздоровело 7 или  77,78%.  Продолжительность лечения составила 14,4±0,7 дня, число обработок - 3,4±0,2.

У всех больных животных исследовали лизоцимную, бактерицидную и фагоцитарную активности до лечения и через 30 дней после выздоровления. Данные показатели у животных после выздоровления повысились соответственно на 2,85%,  0,92% и 4,15%  Однако  эта  разность  при  оценке методом математической статистики оказалась  недостоверной  (Р>0,05).  В  контрольной группе показатели  естественной резистентности остались на одном уровне.

2.2.5.1.2 Токсичность некрогеля для лабораторных животных

В экспериментах определили токсикологические параметры некрогеля для белых мышей при введении в желудок: максимально переносимая доза (МПД)  - 4000 мг/кг, LD100 Ц 10000 мг/кг; расчетная LD50 Ц 6600 мг/кг массы.

При изучении острой токсичности некрогеля на белых крысах за 10-дневный период наблюдений ни одна из подопытных и контрольных животных не пали, что указывает о безопасности этого препарата для белых крыс. Поэтому сочли не целесообразным проводить дальнейшие опыты по определению острой токсичности некрогеля  для данного вида животных, а также субхронической токсичности для лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Изучение местно-раздражающего действия некрогеля проводили на  кроликах и морских свинках. За животными наблюдали в течение 20 дней, определяя состояние кожи и измеряя толщину кожной складки. Ни в одном случае и ни у одного животного не отметили ее увеличения от исходного состояния. Не отмечали также гиперемии, отека  и болезненности при пальпации. Применение некрогеля в виде аппликации на кожу не оказывало какого-либо влияния на гематологические показатели крови  у кроликов.

2.2.5.1.3 Действие некрогеля на организм крупного рогатого скота

Исследования проведены на 5 коровах, у которых выстригали волосяной покров на участке средней трети шеи размером 2х3 см и измеряли толщину кожной складки. Затем на подготовленный участок кожи наносили некрогель в дозе 0,25-0,5 г дважды с интервалом 3 дня. Перед нанесением препарата, затем на 5-й и 10-й день брали пробы крови для гематологического исследования. Наблюдение за состоянием  кожи и измерение толщины кожной складки проводили через 2 часа в течение 12 часов, а затем один раз в сутки в течение всего периода наблюдения (20 суток). Ни у одной из коров ни после первого, ни  второго нанесения некрогеля на коже  не обнаружили никаких изменений и утолщения кожной складки.

Применение некрогеля в виде аппликации на кожу не оказывало какого-либо влияния на гематологические показатели крови  у коров.

Препарат стерилен, что подтверждено методом мембранной фильтрации.

Проведенные экспериментальные исследования на  морских свинках показали, что  мазь некрогель не обладает аллергизирующим действием.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать заключение, что в соответствии ГОСТ 12.1.00.7-76 УВредные вещества. Классификация и общие требования безопасностиФ некрогель относится к препаратам 4-го класса опасности Ц вещества малоопасные.

2.2.5.1.4 Определение лечебной эффективности некрогеля в
контролируемых производственных опытах

Проведенные доклинические исследования позволили перейти к испытанию препарата в контролируемых производственных опытах, результаты которых приведены табл. 8.

По данным таблицы 8, некрогель испытан в  8 неблагополучных по некробактериозу  хозяйствах на общем поголовье 1989 животных. Лечебная эффективность некрогеля колебалась от 78 до 92,86 % и в среднем по хозяйствам составила 85,671,89%, (Р<0,01).  В контроле при обработке 1037 больных животных общепринятыми препаратами (присыпка Плахотина, Островского, мазь Вишневсого) лечебная эффективность варьировала от 61,00 до 71,00% и в среднем  равнялась 64,761,32%.

Препарат некрогель мы впервые испытали при некробактериозе северных оленей.  Для производственного испытания некрогеля сформировали две группы оленей: опытная Ц 195 животных и контрольная Ц 136 голов. В опытной группе животных обрабатывали некрогелем, в контрольной -  мазью Вишневского.  В опытной группе из 195 оленей выздоровело 152 головы(78%), (Х2=8,6; Р<0,01), в контрольной группе из 136 оленей - 86 животных(63,2 %).

Таким образом, некрогель в производственных условиях при обработке больных животных оказался более эффективным  препаратом,  по сравнению с общепринятыми лечебными средствами. При использовании некрогеля для лечения некробактериоза крупного рогатого скота, экономическая эффективность из расчета на 1 рубль затрат составила 5,39 руб. В контрольной группе животных экономическая эффективность  на 1 рубль затрат была в 2,18 раза ниже и составила 2,47 руб.

Таблица 8 Ц Лечебная эффективность некрогеля при некробактериозе
животных в производственных условиях

Наименование хозяйства	Некрогель		Контроль
	обработано животных	выздоровление, %	препарат	обработано, гол	выздоровление, %
ОАО УПР БурлинскийФ Алтайский край	224	92,86	присыпка Плахотина	205	65,37
ОАО ПКЗ УНовый ПутьФ Алтайский край	288	91,0	Присыпка Островского	172	66,86
СХПК "Серп и Молот" Ресублика Татарстан	207	85,9
ФГУ ППКЗ "Чикский" Новосибирская область	507	80,0	Присыпка Островского	236	61,0
ЗАО им Кирова Новосибирская область	212	86,0	Присыпка Островского	54	64,8
СПК УШагаловскийФ Новосибирская область	106	89,62	Присыпка Островского	72	61,11
ЗАО УОвощеводФ, Томская область	250	82	Присыпка Островского	162	71
Таймырский АО, (олени)	195	78,0	Мазь Вишневского	136	63,2
Итого, 8	1989	85,67 1,89*		1037	64,76 1,32

Примечание:*Ц достоверный уровень значимости по отношению к контролю,  Р<0,01

2.2.5.1.5 Производственное испытание препарата некрогель в ряде регионов страны

  В течение 2002-2006 гг. препарат некрогель широко использовали в ряде регионов России, результаты которых отраженные в табл. 9.

Таблица 9 - Лечебная эффективность некрогеля при некробактериозе крупного рогатого скота в разных регионах страны

Наименование региона	Количество хозяйств	Получено препарата, кг	Обработа- но животных.	Выздорове- о, %
Новосибирская область	34	621	9936	88
Алтайский край	10	120	1920	90
Республика Татарстан	5	215	3440	86
Томская область	2	21	335	84
Республика Хакасия	2	15	242	87
Кемеровская область	3	14	221	85
Читинская область	2	10	160	87
Кировская область	1	8	128	84
Тюменская область	1	6	96	85
Красноярский край	3	6	112	85
Краснодарский край	1	5	80	88
Таймырский АО (олени)	1	5	195	87
Итого 12	65	1046	16865	86,330,53

По данным таблицы 9, мазь некрогель испытана в 65 неблагополучных хозяйствах на 16865 больных животных в 12 субъектах России. Лечебная эффективность мази колебалась от 84 до 90 % и в среднем составила 86,330,53%. Больше всего обработано больных животных в Новосибирской области, Республики Татарстан и Алтайском крае, соответственно 9936, 3440, 1920 голов.

Таким образом, на основании проведенный исследований можно сделать заключение, что  разработанный препарат некрогель (патент РФ № 2204997 от 27 мая 2003 г.) для лечения больных некробактериозом животных обладает достаточно высокой лечебной эффективностью, составляющей в научных опытах 100%, в производственных условиях - 78-95,3 %. 

2.2.5.2  Разработка препарата местного действия в форме присыпки

Составлено несколько прописей лечебного препарата в форме присыпки. В качестве наполнителя и адсорбента использовали бентонит, энтеросорбенты, тальк.

В состав прописей присыпок входили антисептические и противовоспалительные средства, отсутствовали антибиотики.

ечебная эффективность присыпок составила на основе бентонита - 100%, энтеросорбента  - 91,7%,  талька - 83,3%.

Присыпку на основе бентонита  мы назвали фузоцид. Препарат фузоцид испытали в 6 хозяйствах Новосибирской области, трех хозяйствах Алтайского края и одном хозяйстве Республики Хакасия на 380 больных некробактериозом животных без учета стадии болезни при лечебной эффективности 78,151,2%, (Р<0,01). В контрольной группе из 146 больных животных (присыпки Островского, Плахотина) выздоровело  65,341,1%.

Таким образом, при производственном испытании лечебная эффективность фузоцида составила 78,151,2% а общепринятых лечебных средств (присыпки Островского, Плахотина) была  достоверно ниже - 65,34 1,1%.

2.2.5.3. Испытание лечебных препаратов разных фирм-производителей

Мазь профезима серии 191294, предложенная НИКТИ БАВ НПО УВекторФ. Профезим - бактериальный препарат протосубтилин, полученный из Bac. subtilis,  иммобилизованный на аминоэтиленцеллюлозе, обладающий способностью быстро очищать гнойно-некротические раны за счет длительного гидролиза денатурированных белков.  Лечебная эффективность мази составила 65%.

Процеол Ц препарат НИКТИ БАВ НПО УВекторФ применили для группового лечения и профилактики некробактериоза крупного рогатого скота в ножных ваннах.  Лечебная эффективность в первоначальном контролируемом научном опыте равнялась  95,6%.  Дальнейшее испытание процеола на разных группах в разных хозяйствах при терапии гнойных ран показало низкую терапевтическую эффективность (60Ц70%). Данный препарат, как и профезим при лечении гнойных ран  необходимо применять с лечебными средствами, способствующими заживлению ран.

Новый антисептик Ц повиаргол изготовлен НИИКТИ БАВ НПО УВекторФ. Повиаргол - коллоидное серебро, стабилизированное синтетическим полимером. Лечебная эффективность в  научном опыте была лишь 33,3%. 

Учитывая полученный недостаточно высокий результат применения мази повиаргола, приготовили из порошкообразного повиаргола гель на водорастворимой основе с добавлением антибиотика тетрациклиновой группы и стабилизатора. Лечебная эффективность препарата составила 100%.

Однако, учитывая очень высокую цену при покупке повиаргола, мы вынуждены были отказаться от разработки препаратов на основе коллоидного серебра.

Оксигель-К Ц изготовитель ЗАО УФармтехнологияФ. Оксигель - К представляет вязкую опалесцирующую массу от желтого до зеленевато-желтого цвета. Лечебная эффективность оксигеля-К составила 100%, присыпки Островского - 85%. Препарат оксигель-К испытали в 3 хозяйствах Новосибирской области на 184 больных некробактериозом животных, из которых выздоровело 76,32,3%.

Данный препарат, также  как процеол и профезим при лечении гнойных ран  необходимо применять с лечебными средствами, способствующими заживлению ран.

2.2.5.4  Разработка и испытание инъекционных лечебных препаратов

Для лечения больных некробактериозом животных предложено большое количество разных препаратов, эффективность которых не во всех случаях высокая. Это связано, по-видимому, с тем, что многие исследователи не учитывали или не указывали в своих работах степень некробактериозного поражения, что, на наш взгляд, может существенно влиять на результаты лечения. Большинство инъекционных препаратов готовят на основе окситетрациклина гидрохлорида. Однако, по данным И.В. Петрухина (1989), окситетрациклин при внутримышечном введении сильно раздражает окружающие ткани на месте введения и вызывает жжение и боль, а также появление инфильтратов. Практикующие ветеринарные врачи хозяйств, также сообщали о раздражающем действии в месте введения инъекционных лечебных средств, и о снижении лечебного эффекта при длительном  их применении.

Учитывая вышеперечисленные недостатки лечебных препаратов,  нами на основе известных субстанций и использовании соответствующих растворителей, приготовили и испытали два препарата.

Некросептин Ц комплексный препарат, представляющий собой композит антибиотиков, пролангаторов и анальгезирующих веществ.

Испытание некросептина в зависимости от стадии болезни (начальная, средняя) провели в одном из неблагополучных хозяйств Новосибирской области.

Для эксперимента по принципу аналогов подобрали две  группы по 10 коров в каждой.  Первая группа Ц животные с начальной стадией некробактериоза, вторая Ц со средней. Животным 1-й группы некросептин вводили внутримышечно двукратно с интервалом 4 дня. Коровам 2-й группы одновременно с инъекцией некросептина в такой же дозе и по той же схеме проводили хирургическую  обработку раны. Пораженную область смазывали некрогелем и накладывали марлевую повязку. Смену повязок проводили двукратно через 3-4 дня. Наблюдение за животными продолжали в течение 1 месяца. За это время в группе 1 (начальная стадия некробактериоза) из 10 коров выздоровело 10 (100%). Продолжительность лечения составила 10 дней. В группе 2  (средняя стадия некробактериоза) из 10 коров выздоровело 9 (90,0%). Продолжительность лечения составила 16 дней.

Производственное испытание некросептина провели в трех неблагополучных хозяйствах на поголовье 317 животных. Лечебная эффективность препарата составила  84,70,56 %, (Р<0,01). В контрольной группе было 161 больных животных. Животных лечили инъекционным препаратом левотетрасульфин согласно наставлению. Эффективный лечебный результат достигнут 82,00,66%.

Однако, как некросептин, так и левотетрасульфин обладают раздражающим действием в месте введения больным животным.  Учитывая это, нами разработан новый инъекционный препарат Ц тетрацин, который не вызывает побочной реакции при введении больным животным.

Тетрацин Ц комплексный препарат, представляющий собой композит антибиотиков нового поколения, пролангаторов и анальгезирующих веществ.

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) тетрацина для Fusobacterium  necrophorum оставила 0,7-0,8 мкг/мл. 

Тетрацин испытали в  неблагополучном по некробактериозу хозяйстве. Для эксперимента по принципу аналогов подобрали две группы по 12 коров в каждой. Первая группа - животные с начальной стадией некробактериоза, вторая - со средней. Животным первой группы вводили только тетрацин 2-3 раза. Коровам 2-й группы одновременно с инъекцией тетрацина в такой же дозе и по той же схеме проводили хирургическую  обработку раны. Пораженную область смазывали некрогелем и накладывали марлевую повязку. Смену повязок проводили двукратно через 3-4 дня. Наблюдение за животными продолжали в течение 20 дней. За это время в группе 1 (начальная стадия некробактериоза) из 12 коров выздоровело 12 (100%). Продолжительность лечения равнялась 3-4 дням. В группе 2  (средняя стадия некробактериоза) из 12 коров выздоровело 11 (91,7%). Продолжительность лечения составила 8-10 дней.

Производственное испытание тетрацина без учета стадии некробактериоза проведено в 4 неблагополучннных хозяйствах на 394 больных животных, из которых выздоровело в среднем 92,70,46 %, (Р<0,01). В контрольной группе при обработке левотетрасульфином 162 животных лечебная эффективность составила 81,00,43 %.

Таким образом, один тетрацин или в комплексе с некрогелем  показал высокую лечебную эффективность в начальной и средней стадиях некробактериоза крупного рогатого скота. Продолжительность лечения  животных больных некробактериозом тетрацином в начальной стадии в 2,5 раза меньше, чем некросептином,  средней стадии в комплексе с некрогелем в 2 раза. При производственном испытании лечебная эффективность  тетрацина составила 92,70,46%, некросептина  - 84,70,56%, левотетрасульфина  - 81,00,43 - 82,00,66%. При внутримышечном введении животным  тетрацин не обладал раздражающим действием по сравнению с некросептином и левотетрасульфином.

Тетрацин мы впервые испытали  на больных некробактериозом северных оленях в  неблагополучном  хозяйстве Таймырского автономного округа. Для эксперимента по принципу аналогов подобрали две группы: опытная - 60 оленей, контрольная - 20 голов. Оленям опытной группы одновременно с инъекцией тетрацина проводили хирургическую  обработку раны с последующим смазыванием  пораженной области  некрогелем и накладыванием марлевой повязки. Животным контрольной группы внутримышечно вводили взвесь антибиотиков (окситетрациклина гидрохлорид) на 0,15%-ом растворе агар-агара. Пораженную область конечности обрабатывали мазью Вишневского. В опытной группе  из 60 оленей выздоровело 55 (91,6 %), (Х2=17,6; Р<0,01). В контрольной группе из 20 животных выздоровело 9 (45 %).

Таким образом, при производственном испытании на больных некробактериозом северных оленях  лечебная эффективность тетрацина совместно с некрогелем оказалась в два раза выше (91,%)  по сравнению с взвесью антибиотиков (окситетрациклина гидрохлорид) и на 0,15 % растворе агар-агара и мазью Вишневского.

3. ВЫВОДЫ

1. Некробактериоз крупного рогатого скота следует рассматривать как системное заболевание, проявляющееся  гнойно-некротическим воспалением преимущественно кожных покровов разных участков тела (дистальный отдел конечностей, вымя, хвост), слизистых оболочек (ротовая полость, половые органы), внутренних органов (печень, легкие, почки), при септическом процессе - мышечной ткани.  Вторичными движущими силами эпизоотического процесса  выступают преимущественно условия кормления и содержания животных.

2. Интенсивность проявления инфекционного и эпизоотического процессов в неблагополучных хозяйствах зависит от состояния естественной резистентности организма, обусловленной  питательной ценностью и структурой кормов, продуктивностью животных и условиями содержания. В  обследуемых хозяйствах до оздоровления в структуре рациона для коров удельный вес сена составлял  от 0 до 17,9 %,  сочных кормов - 37,3Ц 83,3%, концентратов - от 6,7 до 24,40%, дробины - 37,3%. В  хозяйствах при концентратном (40,00 - 52,85 %) типе кормления и продуктивности от 4250 кг до 7700 кг, заболеваемость  коров кожной формой некробактериоза  колебалась  от 8 до 50%, абсцессы печени - от 2,3 до 7,80%, отмечены единичные случаи поражения мышечной ткани и сосков вымени. В хозяйствах при полуконцентратном (25,3 Ц 37,91%) типе кормления коров и  удое на 1 фуражную корову от 2750 до 4000 кг, заболеваемость  коров кожной формой некробактериоза колебалась от 8  до 24%, абсцессы печени Ц от 1,81 до 2,05%. 

3. Показатели естественной резистентности  организма у больных животных ниже по сравнению со здоровыми,  как при стойловом, так и пастбищном содержании. Эта разница особенно  заметна и имеет достоверную разность (P<0,05) по лизоцимной и бактерицидной активностям. Так, лизоцимная активность у больных животных в стойловый период составляет 8,611,19%, во время летнего пастбищного содержания  она повышается до 16,931,56%. Динамика показателей естественной резистентности и заболеваемости имеют противоположный вектор, т.е. со снижением  показателей естественной резистентности увеличивается заболеваемость и, наоборот, при повышении резистентности снижается заболеваемость, при коэффициенте корреляции: БА-  r= -0,924,  ЛА-  r= -0,600, ФА-  r= -0,656.

4. В  неблагополучных по некробактериозу хозяйствах рационы кормления не сбалансированы по многим показателям: имеется дефицит  витамина Д - 40,54- 80%, йода  - 56,35-78,0%, сахара Ц  7,37-64,35%, кобальта Ц 6,5-37,4%, фосфора Ц  5,7-30,44%, цинка - 8,74-46,14%, серы - 5,54Ц19,0%, меди Ц 5,2-8%, кальция  Ц  10,5Ц14,2%, сырой клетчатки Ц 9,1Ц14,0%, каротина Ц 5,87%, марганца - 12,46%; нарушены обменные процессы организма животных с проявлением клинических признаков остеодистрофии: содержание каротина  в сыворотке крови Ц 0,210,02 - 0,390,06 мг%, кальция общего - 1,830,07-2,400,03 ммоль/л, фосфора неорганического - 1,000,07-1,400,07 ммоль/л,  щелочного резерва Ц 23,20,63-44,01,2 об%/СО2. Ветеринарно-санитарное состояние животноводческих помещений не соответствуют комфортным условиям  содержания.

5. Оздоровление животных от некробактериоза возможно только после стабилизации обменных процессов за счет нормированного сбалансированного кормления и условий содержания, контролируемых по основным биохимическим показателям  сыворотки крови. В оздоравливаемых хозяйствах они повысились до нормы. Заболеваемость коров снизилась с 8Ц19 до 0,2Ц3%, КСИ - 75Ц 98,7%,  молодняка с 8Ц15 до 2Ц3%, КСИ 75Ц80%.

6. Применение вакцин для профилактики и ликвидации некробактериоза животных способствует достоверному снижению заболеваемости крупного рогатого скота (P<0,01), КСИ составляет от 41,1 до 59,78 %.  Вакцинация животных  с одновременным  улучшением ветеринарно-санитарного состояния хозяйств способствует снижению заболеваемости: коров с 14Ц50% до 0Ц9%, КСИ  70Ц 100%; молодняка  - с 10Ц15% до 3Ц 4%, КСИЦ 60Ц 80%.

7. Разработаны и предложены для ветеринарной практики лечебные препараты:

Ц комплексный лечебный препарат для местного применения - некрогель, обладающий  высокой антимикробной активностью в отношении Fusobacterium necrophorum и сопутствующей микрофлоры. При производственном испытании на  поголовье 1989 животных лечебная эффективность составила 85,671,89%, (Р<0,01),  экономический эффект на 1 рубль затрат Ц  3,58Ц5,39 руб.;

Ц  препарат для местного применения в виде присыпки  Ц  фузоцид, показавший при производственном испытании на 380 больных некробактериозом крупном рогатом скоте без учета интенсивности инфекционного процесса Ц 78,151,2%, (Р<0,01);

Ц инъекционные препараты тетрацин  и некросептин для применения при осложненной стадии болезни. При производственном испытании на крупном рогатом скоте лечебная эффективность составила: тетрацина - 92,70,46%, (Р<0,01), некросептина - 84,70,56%, (Р<0,01), в контроле (левотетрасульфин) - 81,00,43%; на северных оленях совместное применение тетрацина с некрогелем  давало положительный результат в  91,7%, (Х2=17,6; Р<0,01), взвеси антибиотиков (окситетрациклина гидрохлорид) на 0,15 % растворе агар-агара с мазью Вишневского Ц 45,0%.

8. Усовершенствованный метод механического расчленения  биоматериала из пораженной конечности увеличивает эффективность диагностики некробактериоза на 33,3% и может быть рекомендован для ветеринарных диагностических лабораторий. Диагностическая тест-система полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами обладает строгой специфичностью и  позволяет выявлять в биологических образцах  патогенный биотип АВ F. necrophorum subsp. necrophorum и может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.

9. По морфологическим,  протеолитическим, биохимическим, патогенным и гемагглютинирующим свойствам  одна культура F. necrophorum из 10 изученных идентифицирована как  штамм (зарегистрированный при депонировании под номером B-845).

10. Внедрение оптимизированной системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота, основанной на организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и лечебно-профилактических мероприятиях, воздействующих на все звенья эпизоотического процесса - восприимчивое животное, возбудителя инфекции и факторы передачи возбудителя, способствует  оздоровлению хозяйств или стабилизации эпизоотического процесса на низком уровне.  Экономическая эффективность системы мероприятий из расчета на 1 рубль затрат составила от 4,63  до  8,8 руб.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований по некробактериозу животных использованы в следующих нормативных документах:

Ц УПравила по профилактике и ликвидации некробактериоза животныхФ, утвержденные 11.07. 2000 г., N ВП 13.4.1313-00 Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода России.

Ц Нормативно-техническая документация на лекарственное средство некрогель (Технические Условия  ТУ №933730-001-05095732-2005, Инструкция по применению, данные о производстве, методы контроля качества, результаты доклинического исследования, результаты фармакологических и токсикологических исследований, результаты ветеринарных исследований), утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №3 от 21.06.05.г.) и подсекцией УИнфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего ВостокаФ отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №5 от 21.06.05 г.).  Нормативно-техническая документация прошла экспертизу  в ФГУ УВГНКИФ  для утверждения в Россельхознадзор Федеральной службы по ветеринарному  и фитосанитарному надзору МСХ РФ.

Ц Разработаны методические рекомендации  УПриготовление антигена Fusobacterium necrophorum и постановка реакции агглютинации для определения титров агглютининов при иммунизации крупного рогатого скотаФ, утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №1 от 15.01.04.г.) и подсекцией УИнфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего ВостокаФ отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 15.01.04 г.).

Ц Методические рекомендации УМероприятия по профилактике и борьбе с некробактериозом северных оленей в Таймырском автономном округеФ, утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №4 от 23.09.05.г.) и подсекцией УИнфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего ВостокаФ отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №6 от 23.09.05 г.).

Ц Методические рекомендации УОценка эпизоотической ситуации по некробактериозу и прогноз заболеваемости крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствахФ, утвержденные  подсекцией УИнфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего ВостокаФ отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 04.05.05 г.).

Ц Разработаны и испытаны для лечения некробактериоза животных два инъекционных препарата тетрацин, некросептин и препарат для местного применения - фузоцид.

  - Депонирован штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845 в Научно-исследовательском институте  Коллекции  культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии УВектор (справка № 0100 от 18 сентября 2000 г.).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для публикации основных результатов диссертации

1. Причины возникновения и способы профилактики некробактериоза крупного рогатого скота / Соавт. А.А. Самоловов // Достижения науки и техники АПК. - 2003. -№а5. -С.21-23.

2.  Естественная резистентность организма крупного рогатого скота при некробактериозе в пастбищный и стойловый период содержания/ Соавт. А.А. Самоловов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2003. -№ 3. -С.76-78.

3. Транспозоны в передаче патогенных свойств Fusobacterium necrophorum subs. necrophorum/ Соавт.:  В.И. Семенихин, А.С. Донченко, В. Блинов и др.// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2003. -№ 4. -С.85-89.

4. Лечебная эффективность некрогеля в разных регионах России при некробактериозе крупного рогатого скота/ Соавт. А.А. Самоловов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - №3. - Новосибирск, 2004. -С.107-108.

5.  Распространение абсцессов печени у крупного рогатого скота в Новосибирской области и роль F. necrophorum  в их этиологии/ Соавт.: Т.М. Магерова, А.А.аСамоловов// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -Новосибирск, 2005. -№ 2. -С.15-19.

6.  Полиморфизм  ДНК изолятов возбудителя некробактериоза крупного рогатого скота/ Соавт.: В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Ю.А. Горбунов и др. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -Новосибирск, 2005. -№ 2. -С.99-102.

7. Профилактика некробактериоза крупного рогатого скота// Молочное и мясное скотоводство. - 2006. - №1. - С.33-35.

8.  Некрогель при некробактериозе животных/ Соавт. А.А. Самоловов// Ветеринария. -2006. - №1. - С.26-27.

9. Сравнительная индикация Fusobacterium necrophorum бактериологическим методом и с помощью гнездовой ПЦР/Соавт.: А.А. Самоловов, Ю.Д. Караваев, В.И. Семенихин и др.// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -Новосибирск, 2006. -№ 2. -С.92-96.

10. Профилактика некробактериоза крупного рогатого скота/Аграрная наука.-2006. - №2. - С.25-27.

11. Эффективность препаратов при некробактериозе животных// Молочное и мясное скотоводство. - 2006. - №4. - С.39-41.

Патенты

12. Пат. 2204997 Российская Федерация.  Некрогель -  препарат для лечения инфицированных ран в области копытец животных и способ его получения/ Соавт. А.А. Самоловов. - заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН; заявл.30.01.2001; опубл. 27.05.03; Бюл.  №15.

Статьи в научно-практических журналах и сборниках научных трудов

13. Состояние обмена веществ у здорового и больного некробактериозом крупного рогатого скота/Соавт.: А.А. Самоловов, Н.И. Фомина// Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1992. - С.114 - 119.

14. Лечебная эффективность оригинальных эмульсий при некробактериозе крупного рогатого скота// Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1992. - С.119-122.

15. Резистентность крупного рогатого скота при некробактериозе/ Соавт. А.А. Самоловов// Эпизоотология,  профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1993. -С.120 -124.

16. Fusobacterium necrophorum - как тест микроб при определении естественной резистентности организма животного//Диагностика инфекционных болезней животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1993. -С.98 Ц102.

17. Повиаргол в ветеринарии. Сообщение 1/ Соавт.:  А.А. Самоловов, А.М. Юдин// Серебро в медицине, биологии и технике. Выпуск №5: Институт клинической иммунологии СО РАМН. -  Новосибирск, 1996. - С.119-120.

18. Динамика показателей естественной резистентности организма крупного рогатого скота при некробактериозе/ Соавт. А.А. Самоловов// Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с  болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1997. -С.105 Ц108.

19. Конструирование и оценка вакцин для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота/ Соавт.: А.А. Самоловов, В.А. Цурбанов, А.В. Киселев// Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с  болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1997. -С.108 Ц114.

20. Лечение крупного рогатого скота при разных стадиях некробактериозного процесса// Соавт.: А.А. Самоловов, В.А. Цурбанов// Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с  болезнями животных: Сб. науч. тр./РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1997. - С.122 Ц124.

21. Испытание серебросодержащего препарата  при лечении некробактериозных поражений конечностей/ Соавт.: А.А. Самоловов, А.М.Юдин// Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб. науч. тр. /РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2000. -С.158-161.

22. Противоэпизоотическая оценка нековак-стимул вакцины при некробактериозе  крупного рогатого скота/ Соавт. А.А. Самоловов// Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб. науч. тр. /РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2000. - С.161-163.

23. Выделение хромосомной  ДНК Fusobacterium necrophorum/ В.И. Семенихин, А.А. Самоловов// Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб. науч. тр. /РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2000. - С.163 -167.

24. Некробактериоз крупного рогатого скота и пути решения проблемы/ Соавт. А.А. Самоловов// Аграрная Россия, 2001.-№ 3. - С.34-38.

25. Опыт применения комплексной системы мероприятий при некробактериозе животных в ЗАО Уим КироваФ/ Сборник трудов, посвященный 70-летию ДальЗНИВИ. - Благовещенск, 2005. -С.94-95.

26. Абсцессы и другие патологии печени, выявляемые при убое КРС/ Соавт.: Т.М. Магерова, А.А. Самоловов// Практик. № 7-8. -Санкт-Петербург, 2005. -С.17-19.

Материалы докладов международных и региональных научных и научно-практических конференций

27. Использование повиаргола для лечения некробактериоза крупного рогатого скота/ Соавт. А.Г. Хлыстунов// Материалы научно-практической Российско-Монгольской конференции по проблемам развития АПК Монголии. Ц Новосибирск, 1998. -С.83-84.

28. Испытание комплексной системы оздоровления ферм крупного рогатого скота  от некробактериоза на примере ГПКЗ "Чикский"/ Соавт.: А.А. Самоловов, В.А. Цурбанов//Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции,  посвящ. 100-летию со дня рожд. Х.С. Горегляда и  М.К. Юсковца  (г. Минск, 10-11 декабря, 1998 г.). -Минск,1998. -С.93.

29. Мазь профезима при некробактериозе крупного рогатого скота// Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции, посвящ. 100-летию со дня рожд. Х.С. Горегляда и  М.К. Юсковца  (г. Минск, 10-11 декабря, 1998 г.). -Минск, 1998. -С.180-181.

30. Процеол - препарат для неспецифической профилактики некробактериоза крупного рогатого скота/ Соавт.: Ю.С. Аликин, А.А. Самоловов// Развитие агропромышленного комплекса в зонах рискованного земледелия: Материалы VI научно-практической конференции. -Новокузнецк, 1999. -С.33-34.

31. Оксигель ЦК для лечения болезней пальцев животных/ Соавт.: В.С. Грозин, А.А. Самоловов//Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в ХХI веке: Тезисы докладов Международной научно-практической конференции (г. Новосибирск, 20-23 июля 1999 г.). - Новосибирск, 1999. - С.170-171.

32. Результаты испытания эффективности разных прописей присыпок при некробактериозе крупного рогатого скота/ Соавт. А.Г. Хлыстунов// Внедрение ресурсосберегающих технологий в сельскохозяйственном производстве: Материалы научно-практической конференции. -Новокузнецк, 2000. - С.69-70.

33. Испытание экспериментальной вакцины при некробактериозе крупного рогатого скота/ Соавт. А.Г. Хлыстунов // Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии: Материалы 3-й Международной научно-практической конференции. - Новосибирск, 2000. - С.181.

34. Некробактериоз крупного рогатого скота: причины и пути решения проблемы/ Соавт. А.А. Самоловов// Проблемы ветеринарной науки и практики в современных условиях: Материалы международной научно-практической конференции, посвящ. 10-летию независимости Республики Казахстан. - Алматы, 2001. - С.281-286.

35. Опыт применения инактивированной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота в ЗАО Уим КироваФ/ Соавт.: Т.М. Магерова, А.Г. Хлыстунов// Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологий и меры борьбы с ними: Материалы научно-практической конференции. (г. Иркутск, 6 Ц7 сентября 2001 г.). - Новосибирск, 2001.- С. 109- 110.

36. Лечебно-профилактические мероприятия при некробактериозе крупного рогатого скота// Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана: Материалы 5-й международной научно-практической конференции (г. Абакан, 10-12 июля, 2002 г.). Ц Новосибирск, 2002. - С.436-438.

37. Показатели естественной резистентности организма коров при некробактериозе// Проблемы с/х производства на современном этапе и пути их решения: Материалы VII международной научно-производственной конференции, часть 1, Белгородская ГСХА (г. Белгород, 25-28 марта 2003 г.). - Белгород, 2003. Ц С.160.

38. Результаты испытания разных видов вакцин при некробактериозе крупного рогатого скота/ Соавт. Т.М. Магерова// Актуальные проблемы болезней животных  в современных условиях: Материалы Международной научно-практической конференции. (г. Душанбе, 27-28 ноября 2003 г.). - Душанбе, 2003. - С 40-42.

39. Прогнозирование заболеваемости крупного рогатого скота некробактериозом и оценка факториальной нагрузки на основе программы NEUROPRO/ Соавт.: А.А. Самоловов, Т.М. Магерова// Современные проблемы эпизоотологии: Материалы Междунар. науч. конф. (Краснообск, 30 июня 2004 г.). - Новосибирск, 2004. -С.227-230.

40. Новые препараты и подходы при лечении больного некробактериозом крупного рогатого скота/ Соавт. А.А. Самоловов // Современные проблемы эпизоотологии: Материалы Междунар. науч. конф. (Краснообск, 30 июня 2004 г.). - Новосибирск, 2004. -С.140-142.

41. Частота патологий печени (абсцессы) у крупного рогатого скота и роль Fusobacterium necrophorum в их этиологии/ Соавт.: Т.М. Магерова, А.А. Самоловов, В.М. Фомин// Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сибирской международной  научно-практической конференции (Новосибирск, 12-13 февраля 2004 года). -Новосибирск, 2004. -С. 67-68.

42. Роль иммунизации в комплексной системе мероприятий при некробактериозе крупного рогатого скота/ Соавт. Т.М. Магерова// Современные проблемы эпизоотологии: Материалы Междунар. науч. конф. (Краснообск, 30 июня 2004 г.). -Новосибирск, 2004. -С.313-319.

43. Этиология и инцидентность  абсцессов печени у крупного рогатого скота, убиваемого на мясокомбинатах/Соавт.: Т.М. Магерова, А.А. Самоловов//Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. междунар. ветеринар. конгресса /Новосиб. гос. агроунивер. (Новосибирск, 3-4 марта 2005 г). - Новосибирск, 2005. -С.197.

44. Применение комплексной системы мероприятий при некробактериозе животных в ОАО УБурлинскийФ и ее экономическая эффективность/ Соавт. А.А. Самоловов// Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. междунар. ветеринар. конгресса /Новосиб. гос. агроунивер. (Новосибирск, 3-4 марта 2005 г). - Новосибирск, 2005. -С.141-142.

45. Культурально-морфологические свойства Fusobacterium necrophorum штамма УИВФ, используемого для изготовления антигена при реакции агглютинации// Актуальные проблемы патологии животных: Материалы Международного съезда терапевтов, диагностов. - Барнаул, 2005. - С. 102-104.

46. Комплексная противоэпизоотическая оценка вакцин в системе противонекробактериозных мероприятий// Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики, посвященной 100-летию института: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летнему Юбилею  Каз НИВИ (15-16 сентября, 2005 г.). - Алматы, 2005. - Т.1. - С.191-194.

47. Способ оценки  эпизоотической ситуации по некробактериозу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах/ Соавт.: А.А. Самоловов, Т.М. Магерова // Сб. науч. тр., посвящ.70-летию ДальЗНИВИ. -Благовещенск, 2005. - С.91-94.

48. Эффективность комплексных антибактериальных средств при некробактериозе северных оленей/ Соавт.: К.А. Лайшев, С.Г. Самойлов, А.А. Самоловов//Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Материалы международной конференции. Ц М., 2006. Ц С.255-257.        

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное