Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
БЛИЗНЕЦОВА ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА
Оксидативный стресс и система оксида азота при
постнатальной адаптации и развитии заболеваний у сельскохозяйственных животных
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Воронеж - 2010
Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН.
Научный консультант: | доктор биологических наук, профессор Рецкий Михаил Исаакович |
Официальные оппоненты: | доктор биологических наук, профессор Артюхов Валерий Григорьевич |
доктор биологических наук, профессор Пашков Александр Николаевич | |
доктор биологических наук, профессор Шапошников Андрей Александрович | |
Ведущая организация: | ФГОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия им. И.И. Иванова |
Защита состоится л15 октября 2010 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.02 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б).
Автореферат разослан л__ __________ 2010 г.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор вет. наук, профессор А.Г. Нежданов
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Процессы свободнорадикального окисления (СРО), лежащие в основе метаболизма всех клеток и определяющие адаптивную состоятельность организма к действию повреждающих факторов, являются не только необходимым звеном жизнедеятельности клетки, но и выступают как универсальное неспецифическое звено в развитии многих патологических состояний (Владимиров Ю.А., 1987; Зенков Н.К., 2001).
Исследование состояния и механизмов нарушения регуляции кислородзависимых процессов позволяет выявить общие закономерности и уточнить патогенез различных заболеваний. Решение этих вопросов тесно связано с фундаментальными общебиологическими проблемами, такими как образование свободнорадикальных форм кислорода и азота, пероксидной модификацией липидов и белков, функционированием биомембран, компартментализацией биохимических реакций и может быть весьма полезным для выяснения сложных многоуровневых взаимоотношений различных метаболических звеньев при развитии патологических состояний.
Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют считать, что, как в реакциях окислительного стресса, так и в механизмах антиоксидантной защиты принимает участие оксид азота (Klebanoff S.J., 1992; Маеда Х., Акаике Т., 1998; Dobashi K. et al., 1997; Ulker S. еt al., 2003). Физиологический эффект взаимодействия АФК и NO• остается предметом активных дебатов. В ряде работ in vitro продемонстрировано, что NO• может фактически замедлять пероксидное окисление липидов, действуя как скавенджер кислородных радикалов (Laskin J.D. et al., 2001; Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002). Этот своеобразный Уантиоксидантный" эффект NO• позволил некоторым исследователям предположить, что взаимодействие между супероксиданионом и NO• может быть биологически важным путем детоксикации потенциально опасных активных форм кислорода (Huie R.E., Padmaja S., 1993; Зенков Н.К. с соавт., 2000, 2001; Murphy M.P., 2009). В тоже время есть и противоположные данные, свидетельствующие о том, что оксид азота способен усиливать негативные эффекты супероксидного радикала и других активных форм кислорода, которые играют важную роль в патогенезе заболеваний животных (Epe B. et al., 1996; Greenacre S.A., Ischiropoulos H., 2001).
В последнее время появился ряд работ, в которых приводятся отдельные результаты изучения взаимосвязи состояния процессов пероксидного окисления липидов, антиоксидантной системы и интенсивности образования в организме оксида азота при патологиях различной этиологии (Laskin J.D. et al., 2001; Murphy M.P., 1999; Lee K.J. et al., 2004; Реутов В.П. с соавт., 2007). Однако полученные данные зачастую носят противоречивый характер, и у авторов нет единого мнения о роли и взаимосвязи антиоксидантного статуса, как совокупности про- и антиоксидантных процессов и системы оксида азота.
Помимо этого процессы свободнорадикального окисления и система оксида азота являются универсальными факторами регуляции стрессорных и адаптивных ответов организма (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1995). В настоящее время выдвинута гипотеза о том, что NO• участвует в регуляции стресс-реакции, ограничивая ее чрезмерную активацию, и ее повреждающие эффекты, как на центральном, так и на периферическом уровне (Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., 2000). Эта гипотеза предполагает наличие наряду с известными стресс-лимитирующими системами (ГАМК-ергической, пептидергической, антиоксидантной и др.) и NO - ергической стресс-лимитирующей системы (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998). Один из защитных эффектов NO• при стрессе связан с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов и экспрессию кодирующих их генов (Dobashi K. et al., 1997; Ulker S. et al., 2003).
Поэтому изучение окислительного и нитрозативного напряжения, а также локальных антиоксидантной и NO-ергической стресс-лимитирующих систем в норме, в процессе онтогенеза, при стрессе, адаптации и развитии патологических состояний является весьма актуальным и перспективным. Учитывая большую функциональную нагрузку данных метаболических систем, можно предполагать, что регуляция межклеточных и системных взаимодействий, связанных с изменением продукции NO• и изменениями антиоксидантного статуса организма, окажется весьма эффективным способом предупреждения и лечения многих заболеваний.
Таким образом, всё выше изложенное подтверждает актуальность изучения роли и взаимодействия окислительного и нитрозативного напряжения в адаптивных ответах организма и при развитии различных патологических состояний.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение роли системы оксида азота и её взаимосвязи с антиоксидантным статусом организма в возрастном аспекте и при развитии различных патологических состояний у разных видов сельскохозяйственных животных.
В соответствии с указанной целью на разрешение поставлены следующие задачи.
1. Изучить видовые и возрастные особенности функционирования антиоксидантной и NO•- L-аргинин систем.
2. Определить роль оксидативного стресса и системы оксида азота в постнатальной адаптации животных.
3. Выявить роль оксида азота в формировании колострального иммунитета у новорожденных животных.
4. Изучить динамику свободнорадикального окисления и состояние ситемы NO•- L-аргинин при различных патологиях сельскохозяйственных животных.
5. Выявить характер влияния модуляции продукции оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO• и S-нитрозотиолов.
Научная новизна. Впервые изучены видовые и возрастные особенности состояния системы оксида азота, охарактеризована ее роль в формировании колострального иммунитета у новорожденных животных. Впервые комплексно изучены интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и белков, состояние ферментативного звена антиоксидантной системы и образование оксида азота при развитии патологий различной этиологии. Определено влияние индукции синтеза оксида азота L-аргинином и ингибирования образования NO• на динамику образования супероксиданиона в митохондриальной и микросомальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) клеток печени, интенсивность пероксидного окисления липидов в крови и окислительной модификации плазменных белков как в норме, так и при иммобилизационном стрессе, токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме, а также характер реакции антиоксидантной системы в норме и при патологии.
Впервые комплексно изучено применение животным в преддверии стрессовых ситуациях различной этиологии и отличающихся по патогенетическим механизмам развития соединения ФБ-26, обладающего свойствами антиоксиданта и донора оксида азота. Новизна проведенных исследований подтверждена 4 патентами РФ.
Практическая значимость. Изучение характера течения процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, функционирования антиоксидантной системы и системы оксида азота позволяют углубить и систематизировать современные представления о значении нитрозотивного и оксидативного стресса в развитии патологий разного генеза. Результаты исследования особенностей этих процессов в условиях модуляции образования оксида азота в организме, как в норме, так и патологии позволят предложить новые подходы в разработке способов и методов прогнозирования исхода, профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственных животных разной этиологии.
На основании проведенных исследований разработаны и утверждены на федеральном уровне: Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных (Воронеж, 2005); Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению субклеточной генерации супероксиданиона в тканях (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят (Воронеж, 2008); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гепатопатий у крупного рогатого скота (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гестоза у молочных коров и свиноматок (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета у новорожденных животных (Воронеж, 2009).
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международных научно-практических конференциях Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2002); Свободные радикалы, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека (Смоленск, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных (Воронеж, 2005); Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2006); Ι съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Воронеж, 2007); Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области (Курск, 2008); Трансферт инновационных технологий в животноводстве (Орел, 2008); Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2008); ΙΙ съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009).
Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 57 печатных работах, в том числе в 26 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 8 методических рекомендациях, 1 методическом пособии и 4 патентах.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Видовые и возрастные особенности функционирования антиоксидантной и NO•- L-аргинин систем.
2. Роль оксидативного стресса и системы оксида азота в постнатальной адаптации животных.
3. Характер свободнорадикального окисления и состояние ситемы NO•- L-аргинин при различных патологиях сельскохозяйственных животных.
4. Влияние модуляции продукции оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO• и S-нитрозотиолов.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 285 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения и список литературы. Диссертационная работа проиллюстрирована 49 таблицами и 41 рисунками. Список литературы включает 449 источников, в том числе 298 иностранных авторов.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в 2005-2010 г.г. в отделе патобиохимии и патофизиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданиям 04.01.01 УИзучить на молекулярно-биохимическом, структурно-функциональном, системно-физиологи-ческом и экологическом уровнях и определить причины и механизмы перехода организма из нормального состояния в патологическое и на этой основе разработать средства, методы и технологии защиты здоровья и продуктивности животныхФ (№ гос. регистрации 01.200.117018) и 08.04.01 Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.001.2).
В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники и аспиранты ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии А.Г. Нежданов, С.М. Сулейманов, А.И. Золотарев, Ю.Н. Масьянов, В.И. Шушлебин, Т.Г. Ермолова, Н.Н. Каверин, С.С. Артемьева, Н.В. Пасько, А.Е. Черницкий, Д.Б. Чусов и другие, а так же сотрудник института геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского В.А.Сафонов, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.
В проведении экспериментальных и научно-производственных работ использовали: самцов белых беспородных крыс с массой тела 200,025,0 г (n=274); откормочных быков (n=18), коров (n=209) и телят красно-пестрой и симментальской породы (n=250); ягнят (n=25), поросят (n=30) и кровь новорожденных детей (n=14). Подробнее схемы проведения опытов и дозировки используемых веществ представлены в соответствующих разделах диссертации.
Токсическое повреждение печени у крыс вызывали путем двукратного внутрибрюшинного введения, один раз в сутки тетрахлорметана (CCl4) в виде 40% раствора в оливковом масле в дозе 0,2 мл/100 г массы тела. Исследования проводили через сутки после второго введения CCl4. О степени повреждения печеночной паренхимы судили по изменению активности в сыворотке крови маркерных ферментов: аланинаминотрансферазы (ААт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт).
Эмоционально-болевой стресс моделировали путём иммобилизации крыс на спине с жесткой фиксацией конечностей в течение 18 часов. В качестве контроля использовали животных, не подвергавшихся иммобилизации, но лишенных воды и пищи в течение 18 часов.
До экстремального воздействия и после иммобилизации животных взвешивали. Затем с соблюдением существующих норм отделяли и взвешивали надпочечники, тимус, селезенку, вычисляли относительную массу органов (мг/100 г массы тела животного). Для оценки стрессогенного ульцерогенеза желудок промывали, просматривали и подсчитывали в нём количество язв, измеряли их длину.
Нанесение ожоговой травмы у крыс осуществляли под хлороформным ингаляционным наркозом. Два дозированных симметричных ожога IIIA степени площадью по 300 мм2 наносили на обе стороны предварительно выбритой заднебоковой части тела с помощью специального приспособления при t =100С в течении 10 секунд. Общая площадь ожогов при этом составляла около 5% поверхности тела.
Кровь для проведения биохимических исследований у всех лабораторных животных получали под наркозом из сердца. В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА-Na2 . Для получения гомогената печени ткань гомогенизировали в 0,05 М трис-буфере рН 7,4 в соотношении вес/объем 1:5.
При модуляции продукции оксида азота в качестве эндогенного индуктора синтеза использовали L-аргинин (L-Arg), который вводили животным в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно. Блокаторы синтеза NO• аминогуанидин (AG) и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) вводили животным в одинаковой дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Животным контрольных групп вводили либо дистиллированную воду, либо 0,9% раствор хлорида натрия. Более подробные схемы применения модуляторов продукции NO•, представлены в соответствующих разделах.
При изучении влияния соединения ФБ-26 - нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина - на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота, раствор исследуемого соединения вводили внутрибрюшинно в дозах 20 и 100 мг/кг массы тела при иммобилизационном стрессе и в дозе 100 мг/кг массы тела при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме.
Содержание в сыворотке крови глюкозы, холестерина, креатинина, мочевины, кальция, неорганического фосфора, активность γ-глутамилтранс-феразы (γ-ГТ), аспартат- (АсАТ) и аланинтрансферазы (ААТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе Hitachi-902 (Япония). В ряде опытов активность γ-ГТ, ААТ и АсАТ, содержание β-липопротеидов, показатель сулемовой пробы, общие липиды определяли с помощью наборов фирм Vital Diagnostic (Россия), Lachema (Чехия) и KONE (Финляндия), щелочной резерв в об.% СО2 - диффузным методом (Кондрахин И.П. с соавт., 2004).
Содержание общих иммуноглобулинов определяли по величине светорассеивания после преципитации сульфатом цинка (Костына М.А., 1997), а IgG - методом простой радиальной иммунодиффузии в геле по G. Mancini (1965).
Содержание лигандных форм (Hb, HbO2, MetHb) в растворе гемоглобина определяли при 500, 569 и 577 нм, используя для расчета эмпирическую систему уравнений, предложенную Zwart A. с соавторами (Zwart A. et. al., 1981).
Содержание белка (г/л) определяли биуретовым методом (Досон Р., 1991); активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) (мкМ НАДФ/минг Hb) по убыли НАДФН (Асатиани В.С., 1965).
Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, состояния системы антиоксидантной защиты и функционирования системы L-аргинин-NO в крови и сыворотке (плазме) крови животных определяли: содержание диеновых конъюгатов (ДК) (D232 /мг липидов) и кетодиенов (КД) (D278 /мг липидов) (Бузлама В.С. с соавт., 1997); содержание малонового диальдегида (МДА) (мкМ/л) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); содержание оснований Шиффа (ОШ) (отн. ед./мл сыв.) (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973); степень окислительной модификации белков (нМ/мг белка) (Reznick A.Z., 1994; Дубинина Е.Е., 1995); содержание молекул средней массы (ед.опт.пл.) (Гребнева О.Л. с соавт., 2006); потенциальную преимущественную генерацию супероксиданиона (нМоль О2 • /г×сек) (Близнецова Г.Н. с соавт., 2004); содержание НЭЖК (мкМ/л) (Прохоров М.Ю. с соавт., 1977); сорбционную способность эритроцитов (%) (Тогайбаев А.А. с соавт., 1988); содержание восстановленного глутатиона (мМ/л) (Sedlak J., Lindsay R.H., 1968); активность каталазы (мкМ Н2О2/л×мин) (Королюк М.А., 1988); активность глутатионпероксидазы (мМ восстановленного глутатиона/л×мин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность глутатионредуктазы (мкМ окисленного глутатиона /лмин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность супероксиддисмутазы (СОД) (усл.ед./мг Hb) (Сирота т.в., 1999); сумму стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) (Близнецова Г.Н. с соавт, 2002); содержание S-нитрозотиолов (нМ/л) (Kubes P. et al., 1999; Moore K.P. et al., 2002).
Каждую пробу исследовали в 3-х аналитических повторностях. Обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине. Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента. Статистически достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Видовые и возрастные особенности функционирования NO•- L-аргинин стресс-лимитирующей системы
Установлено, что для телят в первые часы жизни характерен очень высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (рис. 1А). Через сутки после рождения уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOх) снижается на 33,4%, а через 2-3 дня их концентрация уменьшается более чем в 2 раза по сравнению с содержанием их в сыворотке крови через 30-60 минут после рождения (до получения первой порции молозива). Начиная с 10-суточного возраста, суммарная концентрация NOх продолжает снижаться и к месячному возрасту достигает величин, близких к уровню NOх у взрослых животных, составляющему у коров в зависимости от срока до или после отела от 40 до 150 мкМ/л.
Для поросят сразу после рождения (до приёма молозива) также характерен высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота, отражающий степень его образования в организме новорожденного (рис. 1Б). На 2-е сутки после рождения содержание в плазме крови NOх уменьшается более чем в 3 раза, а в 3-дневном возрасте концентрация NOх практически снижается до уровня, зафиксированного в возрасте 2-3 недель.
Уровень стабильных метаболитов оксида азота у ягнят до первой выпойки молозива так же превышал таковой у взрослых животных более чем в 10 раз (рис. 1В). Далее интенсивность образование оксида азота статистически достоверно снижалась за 1 сутки на 37,9%, в течение вторых суток - на 32,5%, и третьих - на 54,4%. Как видно из представленных данных динамика изменения изучаемого показателя у ягнят в целом была идентична таковой у других видов животных, с той лишь разницей, что содержание оксида азота в крови ягнят менялось более резко и достигало уже к 15-м суткам жизни значений, характерных для взрослых овцематок, составляющих 19-25 мкМ/л.
Рис. 1. Содержание стабильных метаболитов оксида азота
в плазме крови: А-телят, Б-поросят, В-ягнят, Г-детей (мкМ/л)
При определении суммы стабильных метаболитов в плазме пуповинной крови у новорожденных детей (n=14) установлено, что её величина колеблется в пределах от 25,6 до 45,0 мкМ/л и составляет в среднем 34,3±8,52 мкМ/л (рис. 1Г). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий между показателями, определенными у детей на 1, 5 и 30 сутки жизни.
Таким образом, установлено, что для новороженных телят, поросят и ягнят в первые сутки жизни характерно высокое содержание стабильных метаболитов оксида азота (NO2+NO3), которое существенно снижается к месячному возрасту.
3.2. Система оксида азота в период ранней постнатальной адаптации
телят
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенное поступление больших количеств нитратов и нитритов телятам с молозивом и молоком коров может быть исключено, поскольку у коров их содержание изменялось в пределах 37,8Ц145,0 мкМ/л в зависимости от периода исследования.
Высокая концентрация NOх в сыворотке крови телят не является следствием недостаточной элиминации нитратов и нитритов из плазмы у новорожденных, чем у животных более старшего возраста, так как с возрастом снижается не только уровень стабильных метаболитов оксида азота в крови, но и выделение их с мочой (рис. 2).
Можно было бы объяснить установленный феномен тем, что высокая концентрация NOх у новорожденных телят, по сравнению с животными более старшего возраста, является следствием поступления в организм высоких концентраций оксида азота вместе с вдыхаемым воздухом, но при этом, как известно, значительно возрастает содержание метгемоглобина в крови (Salguero K.L., Cummings J.J., 2002). Исследования содержания в крови различных лигандных форм гемоглобина показало, что уровень метгемоглобина в крови у телят сразу после рождения составляет 1,5% от общей концентрации гемоглобина и снижается к месячному возрасту до 0,9 %.
| Рис.2. Сравнительная возрастная динамика содержания стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче телят |
Другим потенциальным источником NO• в сыворотке крови телят могут выступать S-нитрозотиолы. В связи с вышеизложенным представляло интерес изучить динамику их содержания в крови подопытных животных в течение первого месяца жизни.
Как показали проведенные исследования через 0,5-1 час после рождения для телят характерно довольно низкое содержание S-нитрозотиолов в сыворотке крови, но спустя 24 часа после рождения происходит резкое возрастание (в 4,2 раза) их уровня, по сравнению с уровнем сразу после рождения (табл. 1).
Таблица 1
Содержание S-нитрозотиолов в сыворотке крови клинически здоровых телят
Возраст телят | RSNO, нМ/л |
До выпойки молозива | 509±20,6* |
1 сутки | 2122±214,3* |
2 суток | 2108±154,2* |
3 суток | 2670±98,6* |
10-15 суток | 3046±284,4 |
25-30 суток | 3397±56,3 |
Примечание: * -P<0,05-0,001 по сравнению с уровнем у телят в возрасте 25-30 суток
К 10-суточному возрасту концентрация S-нитрозотиолов еще более увеличивается, а к месячному - достигает величин, близких к уровню у взрослых животных, составляющего у коров около 3500 - 4000 нМ/л.
Следует отметить различия в динамике содержания метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов. Если содержание NO• в первые часы жизни характеризуется очень высоким уровнем, то концентрация S-нитрозотиолов в данный период жизни достаточно низкая. В течение первого месяца жизни уменьшение концентрации NOх происходит на фоне роста уровня в сыворотке крови S-нитрозотиолов. При этом установлено наличие отрицательной корреляции между содержанием NOх и S-нитрозотиолов в сыворотке крови телят (r = - 0,918, P<0,001).
Вероятнее всего образование столь высоких количеств оксида азота происходит у телят еще в период внутриутробного развития. Это подтверждается и тем, что при исследовании содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота в амниотической жидкости их матерей установлен весьма высокий уровень NOх, существенно превышающий уровень в плазме крови у коров в период родов (табл. 2).
Таблица 2
Содержание стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови и амниотической жидкости коров в период родов
Объект исследования | NOx, мкМ/л | RSNO, нМ/л |
Плазма крови | 108,619,44 | 3965±161,6 |
Амниотическая жидкость | 653,3144,31* | 550±104,3* |
Примечание:* - Р ≤0,05 по сравнению с показателями в плазме крови
Учитывая полученные экспериментальные данные, можно утверждать, что высокая концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO2 + NO3) в плазме крови новорожденных телят, формируется за счет интенсивного эндогенного образования NO• еще во внутриутробный период, которое заметно уменьшается с возрастом.
3.3. Интенсивность процессов свободнорадикального окисления и
система антиоксидантной защиты в период ранней постнатальной
адаптации телят
Анализ содержания продуктов ПОЛ в крови телят свидетельствует об активации свободнорадикальных реакций в первые трое суток после рождения и наличие у новорожденных явления оксидативного стресса (табл. 3).
Таблица 3
Концентрация продуктов ПОЛ в крови у телят разного возраста
Показатели | Возраст животных, сутки | |||
1 | 3 | 10 | 30 | |
ДК, D232/мг липидов | 0,224±0,008* | 0,2170,011* | 0,175±0,006 | 0,157±0,010 |
КД, D278/мг липидов | 0,063±0,003* | 0,0720,004* | 0,045±0,003 | 0,036±0,001 |
МДА, мкМ/л | 2,35±0,140* | 2,170,125* | 1,10±0,065* | 0,90±0,052 |
ОШ, отн. ед./мл сыв. | 0,15±0,011* | 0,210,009* | 0,30±0,047* | 0,17±0,036 |
Примечание:* - Р ≤0,05 по сравнению с показателями у животных в возрасте 30 суток
К 10-суточному возрасту содержание конъюгированных диенов (ДК), которое отражает наличие гидроперекисей липидов в крови телят, снижалось на 21,9%. Более существенные изменения были отмечены для более УпозднихФ продуктов ПОЛ - кетодиенов (КД) и МДА, концентрация которых уменьшалась в данном возрасте на 28,6% и 53,3% соответственно. Наиболее низкий уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ был отмечен у телят в месячном возрасте.
Несколько иная возрастная динамика отмечена для интенсивности образования оснований Шиффа (ОШ), являющихся конечными продуктами пероксидации липидов. К третьим суткам жизни их концентрация увеличивалась на 40%, а уже к 10-суточному возрасту повышалась в 2 раза. По-видимому, это является следствием активно протекающих процессов СРО у телят в первые сутки после рождения, что закономерно отражалось в увеличении концентрации ОШ к концу первой декады постнатального развития.
Высокий уровень пероксидации липидов в первые сутки жизни, вероятнее всего, обусловлен изменением кислородного режима новорожденного и перестройкой его метаболизма в связи с переходом в новую среду обитания и легочное дыхание.
Развитие оксидативного стресса у животных в первые дни жизни отражалось на структурно-функциональном состоянии и устойчивости к повреждению эритроцитарных мембран. Так, сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) у новорожденных телят до первой выпойки молозива и в конце первых суток жизни свидетельствовал о более высокой проницаемости их клеточных мембран по сравнению с взрослыми животными (рис. 3).
Рис.3. Изменение ССЭ у клинически |
Изучение степени окислительной модификации белковых молекул показало, что сразу (через 0,5-1 час) после рождения телят уровень карбонильных групп в белках в 1,7 раза превышает таковой, зарегистрированный для взрослых животных, составляющий от 1,20 до 1,30 нМ/мг белка. Через 24 часа после рождения уровень окислительной модификации снижается на 23,7%, а к концу первого месяца жизни приближается к показателям, характерным для взрослых животных.
Полученные результаты позволяют полагать, что сразу после рождения окислительной модификации в первую очередь подвергаются белки, а затем и липиды. Этот факт мы считаем весьма важным в связи с тем, что наиболее интенсивное всасывание колостральных иммуноглобулинов происходит именно в первые 24-48 часов жизни, в последующем скорость их пассивного транспорта резко снижается (Гончарук В.А., 1998; Weaver D.M. et al., 2000).
Существенные возрастные изменения происходят и в ферментативном звене системы АОЗ крови телят. В связи с тем, что антиоксиданты преимущественно работают в комплексе (Журавлев А.И., 1989) и действуют на разных этапах восстановления кислорода, особого внимания заслуживают синхронные изменения активности ключевых антиоксидантных ферментов, в частности СОД и каталазы.
Установлено, что наиболее высокую активность данные ферменты проявляют сразу после рождения животных, что полностью согласуется с данными о значительном повышении интенсивности пероксидного окисления липидов и белков в первые сутки жизни телят (рис. 4). При этом до выпойки молозива активность СОД составляла 214,7%, в первые сутки - 203,3%, а каталазы - 167,7% и 144,4%, соответственно, по отношению к уровню данных показателей у животных месячного возраста.
Рис. 4. Возрастная динамика активности супероксиддисмутазы и каталазы в крови телят (в % к уровню у 30-дневных животных) |
Повышение активности антиоксидантных ферментов в период постнатальной адаптации животных, обусловлено, прежде всего, резко возрастающей обеспеченностью организма новорожденных атмосферным кислородом. При этом закономерно повышение в крови содержания супероксиданиона, который выступает по отношению к СОД в качестве индуцирующего и активирующего фактора (Fridovich I., 1989).
Таким образом, переход от антенатального к постнатальному периоду сопровождается явлениями окислительного стресса, которые выражаются в смещении оксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону интенсификации свободнорадикального окисления липидов и белков, причем, в первую очередь окислительной модификации подвергаются белки.
3.4. Роль оксида азота в формировании колострального иммунитета
у новорожденных телят
Формирование иммунитета у новорожденных телят происходит за счет пассивного переноса иммуноглобулинов (ИГ) с молозивом или молоком через стенку кишечника. Причем адекватность иммунитета достигается только в том случае, если иммуноглобулины попадают в кровь в неизменном виде в течение первых часов жизни.
| Рис. 5. Возрастная динамика содержания IgG и общего белка в сыворотке крови телят |
Наиболее интенсивно колостральные ИГ у новорожденных телят всасываются в течение первых 3-х суток после рождения (рис. 5).
Проведенное исследование взаимосвязи содержания стабильных метаболитов оксида азота через 0,5-1,0 час после рождения (до выпойки молозива) и иммуноглобулинов в сыворотке крови через сутки после рождения у телят показало наличие высокой степени положительной корреляции исследуемых показателей, с коэффициентом r =+0,864, P<0,001.
| Рис. 6. Возрастная динамика стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) у здоровых и заболевших телят |
Ретроспективный анализ зависимости между интенсивностью всасывания колостральных иммуноглобулинов и дальнейшей заболеваемостью новорожденных телят колибактериозом, показал, что животные с содержанием иммуноглобулинов менее 8 г/л, как правило, в течение первых 10 дней жизни заболевали энтеритной формой колибактериоза. Эти же телята имели и низкий уровень суммы стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови, но не в течение всего периода наблюдения, а только в первые дни жизни (рис. 6).
Сразу после рождения у оставшихся здоровыми телят уровень стабильных метаболитов оксида азота на 18,3% превышал их содержание у заболевших животных, в конце первых суток жизни эта разница составила 18,8%. К третьим суткам жизни содержание стабильных метаболитов оксида азота у оставшихся здоровыми животных на 27,1 % превышало показатели у заболевших телят.
На 10 сутки у здоровых телят содержание в сыворотке крови NOх продолжало снижаться, а у больных животных его уровень возрастал, что связано с развитием инфекционного заболевания, при котором продукция оксида увеличивается за счет активации макрофагальной NO-синтазы.
3.5. Тест для оценки пассивного переноса колостральных
иммуноглобулинов у новорожденных телят
Поскольку γ-глутамилтрансфераза относиться макромолекулярным белкам, которые секретируются альвеолоцитами молочной железы (Lombardi P. et al., 2001; Maden M. et al., 2003) и содержится в большом количестве в молозиве и только в незначительном - в сыворотке у новорожденных и имеет молекулярную массу близкую к таковой IgG (молекулярная масса IgG составляет ≈ 140 кД, а γ-глутамилтрансферазы ≈ 90 кД) пассивный перенос этого ферментного белка в кишечнике новорожденного может быть косвенным показателем и переноса IgG из молозива.
Установлено, что если до выпойки молозива активность γ-глутамил-трансферазы в сыворотке крови новорожденных телят была минимальной, то в суточном возрасте (после 4-ой выпойки молозива) она в значительной степени возрастает и превышает исходную более, чем в 10 раз, а далее постепенно снижается (табл. 4).
Таблица 4
Возрастная динамика активности γ-глутамилтрансферазы и содержания иммуноглобулинов у телят
Показатели | Возраст | |||||
До 1-й выпойки молозива | 1 сутки | 2 суток | 3 суток | 15 суток | 1 месяц | |
IgG, г/л | 0,80,15* | 10,4±2,47 | 16,3±2,26* | 15,8±2,45* | 7,20±0,96 | 9,54±1,06 |
γ-ГТ, мккат/л | 0,700,22 | 7,20,80* | 2,10,29* | 1,40,20* | 0,60,11 | 0,60,09 |
Примечание: *-P<0,05-0,001 по сравнению с показателями в месячном возрасте
При этом у телят в суточном возрасте коэффициент корреляции между уровнем IgG и активностью γ-ГТ составляет +0,86 (P<0,001), через 2-е суток - +0,82 (P<0,01) и 3-е суток - +0,75 (P<0,02).
Таким образом, наряду с определением уровня общих иммуноглобулинов преципитацией сульфатом цинка и общего белка в сыворотке крови достаточно информативным тестом для оценки интенсивности всасывания колостральных иммуноглобулинов можно считать определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови у новорожденных телят в 1-2 сутки после рождения. При этом активность γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови новорожденных телят в этом возрасте менее 3 мккат/л свидетельствует о недостаточности колострального иммунитета и риске развития неонатальных болезней инфекционной этиологии.
3.6. Свободнорадикальное окисление и состояние системы оксида азота при заболеваниях у сельскохозяйственных животных
3.6.1. Роль дисбаланса активных форм кислорода и азота в
возникновении и течении бронхолегочной патологии у телят
Установлено, что развитие бронхолегочной патологии вызывало существенное повышение содержания первичных и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ в крови телят (табл. 5).
Таблица 5
Интенсивность процессов ПОЛ при бронхопневмонии у телят
Показатели ПОЛ | Группы животных | ||
1 | 2 | 3 | |
Здоровые | Субклинический трахеобронхит | Бронхопневмония | |
ДК, D232/мг липидов | 0,139 0,008 | 0,207 0,015* | 0,238 0,029* |
КД, D278/мг липидов | 0,044 0,006 | 0,054 0,009* | 0,068 0,013* |
МДА, мкМ/л | 0,88 0,071 | 1,18 0,09* | 1,94 0,110* |
ОШ, отн. ед./мл сыв. | 0,19 0,025 | 0,24 0,031* | 0,33 0,041* |
Примечание:* - P<0,05 по сравнению с показателями у здоровых животных
При этом выявлены отличия в интенсивности накопления в крови первичных продуктов ПОЛ и продуктов более глубокой пероксидации у животных 2-ой (субклинический трахеобронхит) и 3-ей (бронхопневмония) групп.
Так, уровень ДК у телят, больных бронхопневмонией, выше на 71,2 %, кетодиенов - на 54,5 %, а более поздних продуктов ПОЛ: малонового диальдегида и оснований Шиффа в 2,2 и 1,7 раза соответственно по сравнению со здоровыми животными.
Содержание конъюгированных диенов и кетодиенов у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, статистически достоверно возрастало в 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению со здоровыми животными, но было ниже на 13% и 20,6 %, чем у телят с клиническими признаками заболевания. Такая же тенденция сохранялась для более поздних продуктов пероксидного окисления липидов - малонового диальдегида и оснований Шиффа.
У больных животных была значительно снижена мощность ферментативного звена системы АОЗ (табл. 6).
Таблица 6
Некоторые показатели системы антиоксидантной защиты в норме и
при бронхолегочной патологии у телят
Показатели ПОЛ | Группы животных | ||
1 | 2 | 3 | |
Здоровые | Субклинический трахеобронхит | Бронхо-пневмония | |
СОД, усл.ед. | 0,78 0,142 | 1,29 0,027* | 1,01 0,015* |
Каталаза, мкМH2O2/(л×мин) | 31,5 1,69 | 39,7 1,19* | 34,8 1,59* |
ГПО, мМ G-SH/(л×мин) | 14,73 1,782 | 16,36 1,133* | 16,75 0,21* |
ГР, мкМ GH /(л×мин) | 323,6±15,4 | 347,1 12,67* | 399,8 5,65* |
Примечание:* - P<0,05 по сравнению с показателями у здоровых животных
Активность СОД у телят с субклиническим трахеобронхитом составляла 165,4%, с бронхопневмонией - 129,5% от таковой у здоровых животных. Активность каталазы так же возрастала. Наибольшее значение данного показателя было характерно для животных 2-ой группы, для телят 3-ей группы он был несколько ниже. Для ферментов глутатионового звена АОЗ была выявлена иная закономерность - активность глутатионпероксидазы у животных с бронхолегочной патологией возрастала, но незначительно. При этом статистически достоверных различий между изучаемым показателем у животных 2 и 3-ей группы зафиксировано не было. Самые высокие показатели активности глутатионредуктазы были характерны для телят, больных бронхопневмонией - на 23,6 % выше, чем у здоровых телят, и на 15,2 %, чем при субклиническом трахеобронхите.
Состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят с субклиническим трахеобронхитом является метаболически более предпочтительным, поскольку сохраняется эффективный контроль со стороны АОС. При бронхопневмонии происходит повышение концентрации вторичных продуктов ПОЛ при практически неизменной активности основных биоантиоксидантов, по сравнению с телятами больными субклиническим трахеобронхитом, что косвенно может указывать на повышенное образование активных форм кислорода, а следовательно и более глубокие деструктивные изменениям пораженных тканей.
Установлено так же, что уровень стабильных метаболитов оксида азота у животных с симптомокомплексом трахеобронхита составляет 152,2 % от такового у здоровых телят (рис. 7).
Повышение содержания NOx в крови у телят может быть обусловлено либо активацией индуцибельной формы NO-синтазы под влиянием цитокинов, а также эндотоксинов и липополисахаридов (Tavaf-Motamen H. at al., 1998), либо за счет конститутивной формы этого изофермента.
Закономерно было бы ожидать высоких концентрационных показателей для NOх при бронхопневмонии, учитывая глубокое поражение дыхательной системы, сопровождающееся воспалительным синдромом при данной патологии.
| Рис. 7. Содержание стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в сыворотке крови у телят (в % к показателям здоровых животных) |
Однако проведенные нами исследования показали, что содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови телят, больных бронхопневмонией, было лишь на 60,9% выше, чем у здоровых животных.
В целом, можно отметить, что в независимости от тяжести поражения дыхательной системы, происходит активация продукции NO•. При этом, происходит истощение основного пула депо оксида азота - S-нитрозотиолов.
Учитывая современные литературные данные, позволяющие рассматривать NO• в качестве медиатора, способствующего расширению бронхов и одновременно препятствующего их констрикции (Лев Н.С., 2000), поддержание гомеостаза системы L-аргинин - NO при бронхолегочной патологии является важной защитно-приспосо-бительной функцией организма при развитии патологии респираторной системы. Нарушение же адекватного функционирования систем антиоксидантной защиты и L-аргинин - NO• является одним из существенных компонентов патогенеза бронхолегочной патологии у телят, и влечет за собой интенсификацию процессов пероксидного окисления липидов и избыточное накопление в организме его токсических продуктов.
3.6.2. Система оксида азота и оксидантно-антиоксидантный статус при гепатопатиях у сельскохозяйственных животных
Установлено, что жировая дистрофия печени у откормочных бычков сопровождается существенным (в 2-2,5 раза) повышением активностей ААт и АсАт в сыворотке крови, что свидетельствовало о наличии выраженного цитолитического синдрома. Существенное повреждение печеночной паренхимы установлено и при гистологическом исследовании. При этом в печени происходит уменьшение на 60,6% активности ГПО и на 34,6% - витамина Е, увеличение на 62,6% активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и концентрации МДА на 76,6% (табл. 7).
Таблица 7
Показатели антиоксидантного статуса в крови и печени бычков
при жировой дистрофии печени
Показатели | Здоровые | Жировая дистрофия | |
Кровь | МДА, нМ/мл | 0,890,15 | 1,890,19* |
Витамин Е, мкг/л | 12,61,58 | 9,40,88* | |
ГПО, мкМ G-SH/минг Hb | 180,318,76 | 171,920,37 | |
Г6ФДГ, мкМ НАДФ/минг Hb | 8,10,84 | 8,40,78 | |
Печень | МДА, нМ/г | 14,51,12 | 25,61,89* |
Витамин Е, мкг/г | 20,82,66 | 13,61,89* | |
ГПО, мкМ G-SH/минг белка | 22,62,21 | 13,71,35* | |
Г6ФДГ, мкМ НАДФ/минг белка | 2,40,22 | 3,90,41* | |
Примечание: * - P<0,05 к показателям у здоровых животных
С другой стороны, при жировой дистрофии печени в крови животных имелись лишь незначительные изменения активности ГПО и Г6ФДГ, но при этом у больных животных был в 2,1 раза выше уровень МДА и на 25,4 % снижено содержание витамина Е. Выявленные изменения в уровне МДА как в печени, так и в крови свидетельствуют об интенсификации процессов пероксидного окисления липидов и развитии в организме животных окислительного напряжения.
Изменения в ферментативном звене системы антиоксидантной защиты в печени в ответ на развитие жировой дистрофии являются свидетельством адаптивного повышения функциональной активности антиоксидантной системы в ответ на развитие окислительного стресса. Значительное уменьшение активности ГПО в печени при данной патологии может быть связано либо с увеличением уровня свободных радикалов в клетках печени, которые угнетают активность фермента, окисляя тиоловые группы или аминокислоты, входящие в структуру белка, либо может свидетельствовать о недостаточном синтезе этого фермента.
С другой стороны, отсутствие значительных изменений в активности ГПО и Г6ФДГ в крови при жировой дистрофии указывает на то, что в эритроцитах у крупного рогатого скота при данной патологии отсутствуют признаки окислительного напряжения.
Кроме того, роль активных форм кислорода в патогенезе жировой дистрофии может заключаться в снижении уровня эндогенных антиоксидантов в организме, о чем и свидетельствует более низкий уровень витамина Е в сыворотке крови больных животных. Истощение механизмов антиоксидантной защиты может ослаблять клеточные функции и делать гепатоциты более чувствительными к повреждающим эффектам эндогенных и экзогенных перекисей.
При патологии печени происходит более чем 3-кратное повышение содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO2+NO3) в плазме крови (рис. 8).
Рис. 8. Содержание суммы стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови при жировой дистрофии печени |
Увеличение образования оксида азота, вероятнее всего, происходит не столько за счет генерализованного повышения активности конститутивных изоформ NO-синтаз, сколько за счет активации индуцибельной NO-синтазы и экспрессии m-РНК данной изоформы de novo, стимулируемой цитокинами, концентрация которых в очаге воспаления резко возрастет.
Повышение содержания S-нитрозотиолов в плазме крови животных с жировой дистрофией печени отражает процессы депонирования избыточного количества NO•. Наличие пула нитрозотиолов наиболее эффективно позволяет участвовать системе оксида азота в процессах репарации, делает возможным локальное расширение сосудов и капилляров в очаге воспаления, тем самым снижает вероятность попадания токсичных продуктов некроза в соседние участки и клетки.
Таким образом, при жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота происходит усиление процессов пероксидного окисления липидов и снижение уровня эндогенных антиоксидантов в организме, а определение активности ГПО и Г6ФДГ в печени может быть использовано для диагностики жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота.
Активация синтеза NO• при патологии печени, видимо, обеспечивает быстрое выведение токсинов и поступление биологического материала для репаративных процессов, а также более точную направленность адаптивных перестроек метаболизма.
3.6.3. Антиоксидантный статус и система оксида азота при послеродовом эндометрите коров
Исследования проведены на 2-х группах коров, которые на основании акушерских исследований ретроспективно были разделены на клинически здоровых (n=22) и коров, в последующем заболевших эндометритом (n=13).
Установлено, что в период глубокой стельности у оставшихся здоровыми коров происходит интенсификация процессов СРО, о чем свидетельствует повышение содержание в крови МДА (табл. 8).
Выявленное изменение указывает на максимальное напряжение метаболических процессов, протекающих в организме беременных коров, а также может свидетельствовать об усилении стрессового состояния животных.
У животных с послеродовым эндометритом в предродовой период содержание МДА было выше на 17%, чем у коров, оставшихся в последствии здоровыми. Более высокая концентрация МДА в крови у животных с послеродовым эндометритом, превышающая данный показатель в 1,5 раза по сравнению со здоровыми животными, по-видимому, обусловлена резким увеличением макрофагальной продукции АФК, происходящим при развитии воспалительного процесса.
Таблица 8
Некоторые показатели системы ПОЛ-АОЗ у коров в норме
и при послеродовом эндометрите
| Показатели системы ПОЛ-АОЗ | Группы животных | |||
Оставшиеся здоровыми | Заболевшие эндометритом | |||
Глубокая стельность | Две недели после родов | Глубокая стельность | Две недели после родов | |
1 | 2 | 3 | 4 | |
МДА, (мкМ/л) | 1,820,055 | 1,150,187* | 2,130,074♦ | 1,720,060 |
Каталаза, (мМ Н2О2/л×мин) | 38,70,92 | 29,72,05* | 30,31,39 ♦ | 38,10,69 |
ГПО, (мМ G-SН/л×мин) | 12,60,92 | 9,70,16* | 9,50,62 ♦ | 16,50,66 |
ГР, (мкМ G-SS-G/л×мин) | 360,19,32 | 304,710,34* | 307,58,19 ♦ | 337,19,99 |
СОД, (усл.ед./мг Hb) | 1,180,052 | 0,910,040* | 1,000,032 ♦ | 1,070,052 |
Примечание: * - P1Ц2 < 0,05; ♦ - P1Ц3 < 0,05; - Р3-4 < 0,05, - Р2-4 < 0,05-0,00
Накопление промежуточного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в период глубокой стельности у животных без послеродовых осложнений не связано с недостаточностью функционирования ферментативного звена антиоксидантной системы. В предродовой период у животных, оставшихся здоровыми, активность ферментов, обеспечивающих элиминацию активных форм кислорода - СОД и каталазы - повышалась в 1,3 раза, по сравнению с данными показателями через две недели после родов. Активность ГПО и ГР в предродовой период возрастала примерно в одинаковой степени (в 1,3 и 1,2 раза), что свидетельствовало о сбалансированном функционировании глутатионового звена системы АОЗ и адекватном восполнении общего пула восстановленного глутатиона.
У животных с послеродовой патологией матки в предродовой период изменения в системе антиоксидантной защиты организма были менее сбалансированы. Так, активность каталазы была ниже на 21,7%, а СОД - на 15,3%, ГПО - на 24,6%, а ГР - на 14,6% по сравнению с данными показателями у животных без патологии матки.
Таким образом, в предродовой период у коров, у которых впоследствии развивался эндометрит, была снижена мощность антиокислительной системы. Это говорит о том, что уже на этапе беременности создаются благоприятные условия для развития заболеваний, как вследствие стрессового характера самого родового акта, так и ввиду определенной недостаточности антиоксидантной системы.
Для выяснения роли оксида азота в патогенезе послеродового эндометрита проведено изучение содержаний его стабильных метаболитов, а также уровня S-нитрозотиолов (RSNO), выступающих в качестве соединений, способных потенцировать его биологические эффекты.
Установлено, что у здоровых животных перед отелом уровень стабильных метаболитов оксида азота возрастает почти в 3,3 раза (табл. 9).
Таблица 9
Содержание NOx и S-нитрозотиолов в сыворотке крови коров в норме
и при послеродовом эндометрите
| Показатели системы оксида азота | Группы животных | |||
Оставшиеся здоровыми | Заболевшие эндометритом | |||
Глубокая стельность | Две недели после родов | Глубокая стельность | Две недели после родов | |
1 | 2 | 3 | 4 | |
NOx, мкМ/л | 158,24,37 | 47,80,291* | 123,65,15 ♦ | 138,77,14 |
RSNO, Моль/мл | 254455,3 | 3046139,2* | 2490172,4 | 270942,5 |
Примечание: * - P1Ц2 < 0,005; ♦ - P1Ц3 < 0,05; - Р3-4 < 0,05, - Р2-4 < 0,05
Такое значительное увеличение продукции NO• с одной стороны, необходимо для расслабления цервикального канала, с другой - обусловлено развитием физиологического стресса у коров перед родами.
У коров с послеродовым эндометритом в период стельности в 250-260 дней уровень оксида азота был ниже на 21,9%. При этом содержание S-нит-розотиолов статистически достоверно не отличалось от уровня, характерного для животных без акушерской патологии. Возможно, что достижение определенной концентрации оксида азота имеет физиологический смысл для нормального течения родового акта, сократительной функции матки и отделения последа, что и снижает вероятность развития эндометрита.
Резкое возрастание продукции NO• выявлено при развитии послеродового эндометрита, в этиологии которого существенная роль принадлежит микробному фактору. В этом случае повышение уровня стабильных метаболитов оксида азота уже после отела в 2,9 раза, по сравнению с его уровнем у животных без патологии, возможно, является следствием его генерации в иммунокомпетентных клетках - макрофагах и нейтрофилах.
Таким образом, проведенные исследования позволяют считать, что состояние антиоксидантного статуса и системы оксида азота играют существенную роль, как в регуляции функционирования репродуктивной системы, так и в патогенезе послеродового эндометрита.
3.6.4. Интенсивность пероксидного окисления, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при субинволюции матки
Исследования проведены на 2-х группах коров, которые на основании акушерско-гинекологических исследований ретроспективно были разделены на клинически здоровых (n=39) и коров, с нарушением сократительной функции матки после отела (n=26).
Установлено, что до родов у оставшихся в последствии здоровыми и коров с послеродовой субинволюцией матки был сходный уровень содержания стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови.
В период клинического проявления острой субинволюции матки интенсивность продукции оксида азота возрастала. Уровень NOх в крови коров с острой субинволюцией матки на следующий день после родов превышал таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов на 48,4%, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза (рис. 9).
Рис. 9. Содержание стабильных метаболитов оксида азота (NOх ) в сыворотке крови у здоровых коров и коров с острой субинволюцией матки, мкМ/л |
Высокая интенсивность генерации оксида азота в организме больных животных, по-види-мому, обусловлена развитием воспалительного процесса в этот момент, сопровождающегося активацией свободнорадикаль-ного окисления, внутриклеточной кальциевой перегрузкой, что в свою очередь активирует NO-синтазы, отвечающие за синтез NO•.
Изменения в динамике содержания S-нитрозотиолов были аналогичны в предродовой период, а после отела носили противоположный характер. Вероятно, более низкая концентрации RSNO после отела у животных с нарушением сократительной функции матки связана с нарушением механизмов регуляции системы оксида азота. Данные нарушения и проявление избыточного релаксирующего действия самого оксида азота на миометрий, могут являться одной из причин сбоя физиологического течения инволюционных процессов в матке.
Несколько иная динамика была выявлена при изучении процессов свободнорадикального окисления липидов и функционального состояния антиоксидантной системы. Если в предродовой период статистически достоверных различий между показателями интенсивности системы оксида азота у оставшихся здоровыми и заболевших животных не было выявлено, то для коров с субинволюцей матки за 10-14 дней до отела была характерна пониженная мощность глутатионового звена АОС (табл. 10).
Об этом свидетельствует более низкий уровень в крови у заболевших после отела коров глутатионредуктазы (на 38,2%) - фермента, поддерживающего общий пул восстановленного глутатиона в организме. Помимо этого, у заболевших коров в крови снижена активность ГПО на 39,8а%, что в целом свидетельствует о более низком уровне функционального состояния ферментативного звена антиоксидантной системы у коров, предрасположенных к субинволюции матки.
Таблица 10
Активность ферментов глутатионового звена системы антиоксидантной защиты в крови у здоровых и заболевших коров
Группа животных | За 10-14 дней до отела | Через 1-2 суток после отела |
Глутатионпероксидаза, мМ восстановленного глутатиона/лмин | ||
Здоровые | 21,2±2,34 | 29,3±2,32 |
Заболевшие | 14,1±2,17* | 18,1±2,18* |
Глутатионредуктаза, мкМ окисленного глутатиона/лмин | ||
Здоровые | 256,4±18,6 | 200,4±21,6 |
Заболевшие | 158,0±15,9* | 120,6±17,8* |
Примечание: * - P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными
Следствием сниженного функционального состояния глутатионового звена антиоксидантной системы, контролирующей интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления, является и более высокое содержание в крови у заболевших коров первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов (табл. 11).
Таблица 11
Содержание продуктов ПОЛ в крови у здоровых и заболевших коров
в разные периоды до и после отела
Группа животных | Периоды исследования | |
За 10-14 дней до отела | Через 1-2 суток после отела | |
Конъюгированные диены | ||
Здоровые | 0,124±0,016 | 0,144±0,025 |
Заболевшие | 0,156±0,034 | 0,266±0,035* |
Малоновый диальдегид | ||
Здоровые | 0,56±0,051 | 0,98±0,055 |
Заболевшие | 0,88±0,064* | 2,29±0,109* |
Основания Шиффа | ||
Здоровые | 0,16±0,012 | 0,27±0,029 |
Заболевшие | 0,24±0,019* | 0,79±0,062* |
Примечание: *- P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными
За 10-14 дней до отела у коров, которые после родов имели нарушение инволюционных процессов, содержание малонового диальдегида было выше на 57,1%, чем у оставшихся впоследствии здоровыми животных
На второй день после родов у коров без субинволюции матки содержание в крови конъюгированных диенов превышает дородовый уровень на 16,1%, малонового диальдегида - на 75,0%. У заболевших после родов коров, уровень конъюгированных диенов возрастал на 70,5а%, а малонового диальдегида - в 2,3 раза.
Таким образом, проведенный сравнительный анализ состояния систем АОЗ и процесса ПОЛ у коров с нормальным и патологическим течением послеродового периода свидетельствует о том, что у животных, у которых в дальнейшем развилась субинволюция матки, уже за 10-14 дней до отела отмечается тенденция к снижению потенциала ферментативного звена системы АОЗ и более интенсивному течению процессов пероксидации липидов. Это не позволяет адекватно контролировать и удерживать в физиологических пределах нарастающий при стрессе уровень активных форм кислорода, сдерживать чрезмерную активацию процессов ПОЛ, что приводит к неблагоприятным метаболическим изменениям.
3.6.5. Антиоксидантный статус и система оксида азота у коров
с дисфункцией яичников
Установлено, что у коров с дисфункцией яичников происходит интенсификация процессов СРО, о чем свидетельствует повышение содержания в крови МДА на 44,0% по сравнению со здоровыми циклирующими животными (табл. 12).
Таблица 12
Показатели системы ПОЛ-АОЗ у коров в норме и при дисфункции яичников
Показатели системы ПОЛ-АОЗ | Группы животных | |
Контроль | Бесплодные, дисфункция яичников | |
МДА, (мкМ/л) | 1,000,277 | 1,440,058* |
Каталаза, (мМ Н2О2/л×мин) | 25,91,80 | 32,20,84* |
ГПО, (мМ G-SН/л×мин) | 9,40,32 | 12,00,64* |
ГР, (мкМ G-SS-G/л×мин) | 293,112,6 | 324,18,24* |
СОД, (усл.ед./мг Hb) | 0,720,035 | 0,950,051* |
Примечание: * - P < 0,05 по сравнению со здоровыми животными
Учитывая то, что пероксидное окисление липидов играет важную роль в липидном обмене организма, можно предположить, что значительное возрастание скорости течения СРО при бесплодии, может являться одной из причин угнетения синтеза стероидных гормонов, а, следовательно, нарушения стероидогенеза (Зенков Н.К. с соавт., 2001), характерного для данной патологии.
Высокое содержание МДА - промежуточного продукта ПОЛ - у бесплодных животных не связано с функциональной недостаточностью ферментативного звена антиоксидантной системы, о чем свидетельствует более высокий функциональный потенциал антиоксидантной системы у коров с дисфункцией яичников. Так, у них, по сравнению со здоровыми циклирующими животными, активность каталазы была выше на 24,3%, СОД - на 31,9%, ГПО - на 27,7%, ГР - на 10,6%.
Однако надо отметить наличие определенного дисбаланса в работе глутатионового звена системы АОЗ, поскольку, при повышении активности ГПО на 27,7%, активность ГР возрастала всего на 10,6%, а следовательно пул восстановленного глутатиона истощался.
У коров с дисфункцией яичников наблюдалось снижение суммарной концентрации NO2+NO3 в сыворотке крови на 61,1% и содержания S-нитрозотиолов на 29,8% по сравнению с контрольными животными (рис. 10).
| Рис. 10. Содержание NOx и S-нитрозотиолов в сыворотке крови коров в норме и при дисфункции яичников |
Дать однозначную оценку физиологическому эффекту снижения продукции оксида азота при дисфункции яичников у коров сложно. Однако, исходя из имеющихся данных о том, что оксид азота способен замедлять процесс старения яйцеклеток (Goud P.T. et al., 2008), можно предположить, что снижение уровня генерации оксида азота у бесплодных животных влечет за собой нарушение процесса ово- и фолликулогенеза и дисфункцию гонад. Кроме того, установлена взаимосвязь образования в организме NO• с уровнем эстрогенов (Moreno A.S., Franci C.R., 2004) и прогестерона (Coughlan T. et al., 2005).
Таким образом, развитие ряда заболеваний сельскохозяйственных животных, таких как бронхопневмония, жировая дистрофия печени и патологии репродуктивной системы сопровождается изменением в интенсивности образования оксида азота. В этой связи можно полагать, что модулирующее воздействие на систему генерации оксида азота позволит направленно влиять на функциональное состояние организма и может послужить основой для разработки нового класса лекарственных препаратов.
3.7. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность свободнорадикального окисления, состояние АОС и систему оксида азота в норме и при экспериментальных патологических состояниях
В опытах на самцах белых беспородных крыс по влиянию модуляции продукции оксида азота на состояние оксидантно-антиоксидантного равновесия и системы оксида азота в качестве блокаторов синтеза NO• применяли аминогуанидин (AG) - селективный ингибитор индуцибельной формы NO-синтазы и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) - неселективный ингибитор NO-синтаз (Гильяно Н.Я. с соавт., 2007). В качестве индуктора синтеза NO• использовали L-аргинин (L-Arg), являющегося естественным эндогенным источником образования оксида азота в организме (Wink D.A., Mitchell J.B., 1998) и соединение ФБ-26, являющееся одновременно и антиоксидантом, и донором оксида азота (Мищенко Д.В. с соавт, 2003).
3.7.1. Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота
у здоровых животных
Установлено, что введение животным L-аргинина в дозе 400 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток приводит к увеличению суммарного содержания в плазме крови нитрата и нитрита на 43,5%, а применение ингибиторов NO-синтазы - к снижению более чем в 2 раза суммы NOх в крови у животных (табл. 13).
Таблица 13
Содержание суммы стабильных метаболитов оксида азота и нитрозотиолов в плазме крыс в условиях модуляции продукции оксида азота
Группа животных | NOx мкМ/л | RSNO, нМоль/л |
1. Контроль | 14,7±0,60 | 1436±60,5 |
2. L-аргинин | 21,1±0,87* | 2183±47,1* |
3. L-NAME | 7,0±0,18* | 1340±33,3 |
4. Аминогуанидин | 6,7±0,47* | 1165±45,6 |
Примечание: *Ц P1-2,3,4 <0,05-0,001 - P2-3,4 <0,05-0,001
В то же время введение животным L-NAME и AG - ингибиторов NO-синтаз в дозе 50 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток не вызвало существенного изменения в содержании S-нитрозотиолов по сравнению с животными контрольной группы. Это, возможно, связано с тем, что в плазме крови существует некий базовый уровень S-нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, и который даже в условиях ингибирования его продукции используется незначительно.
Генерация супероксиданиона в разных компартментах клетки при введении L-аргинина статистически не отличалась от интенсивности его образования у контрольных животных. В тоже время, применение блокаторов синтеза NO• приводило к увеличению как спонтанной, так и стимулированной продукции супероксиданиона (табл. 14).
Таблица 14
Спонтанная, НАДН- и НАДФН-стимулированная продукция супероксид-анионрадикала в гомогенате печени крыс
| Группа животных | Продукция O2•, нмоль/г×сек | ||
Спонтанная | Стимулированная | ||
НАДН | НАДФН | ||
1. Контроль | 0,51 ± 0,013 | 6,49 ± 0,082 | 7,18 ± 0,098 |
2. L-аргинин | 0,42 ± 0,020 | 6,53 ± 0,100 | 7,27 ± 0,175 |
3. L-NAME | 0,76 ± 0,056* | 9,07 ± 0,300* | 12,67 ± 0,340* |
4. Аминогуанидин | 0,61 ± 0,045* | 8,02 ± 0,521* | 12,09 ± 0,284* |
Примечание: *Ц P1-2,3,4 <0,05; - P2-3,4 <0,05
Введение здоровым животным L-аргинина, аминогуанидина и L-NAME не влияло на интенсивность процессов пероксидации липидов и окислительной модификации белков, так как статистически достоверных изменений в содержании диеновых конъюгатов, кетодиенов, малонового альдегида и карбонильных групп в белках не было установлено.
Полученные данные подтверждают концепцию о циклических превращениях для NO• в организме млекопитающих (Реутов В.П. с соавт., 1998), благодаря чему обеспечивается не только его эффективная наработка, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества (ионы NO2 и NO3), чем и может быть объяснено отсутствие биологического ответа при применении, как активаторов, так и ингибиторов NO-синтаз.
Введение животным эндогенного предшественника оксида азота L-аргинина повышало на 13,6 % активность СОД и на 22,1% - каталазы.
Активация синтеза оксида азота L-аргинином у здоровых животных повлияла на активность и ферментов глутатионового звена АОЗ. Так, активность глутатионпероксидазы статистически достоверно возрастала на 16,7%, а активность глутатионредуктазы - на 14,1 %. Применение же блокаторов синтеза оксида азота здоровым крысам не вызывало статистически достоверных изменений в активности ферментов АОЗ.
Таким образом, стимуляция продукции NO•, с одной стороны не оказывает влияние на интенсивность процессов СРО, а с другой способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты. Механизм повышения активности ферментов АОЗ, может быть связан с влиянием NO• на экспрессию генов, кодирующих данные ферменты (Dobashi K. et al., 1997; White A.C. et al., 1995).
3.7.2. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность
пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при эмоционально-болевом стрессе
Исследование проведено на 4-х группах животных. Первая группа - интактные животные (n=8). Крысам 2-ой группы (n=10) вводили внутрибрюшинно 1 мл дистиллированной воды. Животным третьей группы (n=10) - внутрибрюшинно вводили однократно водный раствор L-аргинин в дозе 200 мг/кг, для которого в этой дозе установлено выраженное антистрессорное действие (Gupta V. et al., 2005). Крысам 4-ой (n=10) группы - однократно внутрибрюшинно раствор аминогуанидина в дозе 50 мг/кг. Через 6 часов животных 2, 3 и 4 группы иммобилизировали в течение 12 часов в положении на спине с фиксацией конечностей.
На основании проведенных исследований установлено, что введение L-аргинина и блокатора NO-синтаз - аминогуанидина при 12-ти часовой иммобилизации по-разному влияет на выраженность и проявление стресс-реакции.
Введение животным L-аргинина достаточно эффективно препятствует снижению массы тела крыс при эмоционально-болевом стрессе, уменьшает в 1,48 раза гипертрофию надпочечников, в 1,89 раза и 1,4 раза инволюцию селезёнки и тимуса, соответственно.
Иммобилизация крыс на фоне ингибирования NO-синтаз аминогуанидином приводит к усугублению проявлений триады Селье в стадии напряжения стресс-реакции: более выраженная гипертрофия надпочечников и инволюция органов тимико-лимфатической системы по сравнению, как с контрольными, так и с животными, которым вводили L-аргинин.
Применение L-аргинина перед стресс-воздействием способствует снижению интенсивности образования супероксиданиона в печени крыс: спонтанная продукция уменьшалась на 49,6%, НАДН-стимулированная - на 35,7%, НАДФН-стимулированная - на 17,4%, по сравнению с животными, которых иммобилизировали без применения каких-либо веществ. И, наоборот, ингибирование продукции NO• аминогуанидином вызывало существенное повышение как спонтанной, так и стимулированной продукции O2•.
предварительное введение животным блокатора и донора оксида азота по-разному сказалось на характере изменений процессов пероксидного окисления биологических субстратов и ответной реакции антиоксидантной системы на стресс-воздействие. Так, введение L-аргинина вызывало статистически достоверное снижение на 20,4% содержания в крови МДА и на 45,1% окислительной модификации белков плазмы крови, по сравнению с аналогичными показателями у животных, подвергнутых иммобилизации без применения модуляторов. Блокада синтеза оксида азота, напротив, приводила к некоторому усилению свободнорадикального окисления липидов и белков при стрессе.
При изучении состояния некоторых показателей ферментативного звена АОС при развитии эмоционально-болевого стресса на фоне модуляции продукции оксида азота, установлено, что предварительное введение животным L-аргинина приводит к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты. Активность СОД возрастала на 23,4%, активность каталазы - на 28,3%, активность ферментов глутатионового звена: ГР и ГПО - на 27,3% и 36,2%, соответственно, по сравнению с данными показателями у иммобилизированных животных (табл. 15).
Таблица 15
Состояние ферментативного звена антиоксидантной системы при ЭБС при модуляции синтеза оксида азота
Группа животных | СОД | Каталаза | ГПО | ГР |
1. Интактные | 1,28±0,044 | 35,3±0,84 | 36,7±1,27 | 159,5±3,19 |
2. Иммобилизация | 1,75±0,018* | 42,7±1,95* | 47,8±1,93* | 181,9±4,83* |
3. Иммобилизация | 2,16±0,045* | 54,8±1,13* | 65,1±2,40* | 231,5±4,61* |
4. Иммобилизация | 1,94±0,067* | 44,1±1,31* | 49,3±2,57* | 176,5±5,56* |
Примечание: *Ц P1Ц2,3,4 < 0,05; - P2-3,4 <0,05; - P 3Ц4 <0,05
Применение же блокатора NO-синтаз аминогуанидина не оказывало существенного влияния на характер изменений в ферментативном звене антиоксидантной системы при стрессе по сравнению с животными контрольной (иммобилизация) группы.
Таким образом, стимуляция образования оксида азота в организме животных повышает их устойчивость к действию стресс-факторов и установленные эффекты NO• могут лежать в основе ограничения свободнорадикального окисления и активации адаптационных перестроек метаболизма при развитии стрессового состояния.
3.7.3. Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при токсическом повреждении печени
Исследование проведено на 5 группах животных. Первая группа - контрольные животные (n=10). У крыс 2-й группы (n=10) вызывали токсическое повреждение печени тетрахлорметаном (CCl4). Крысам 3-ей группы (n=15) в течение 6 дней внутрибрюшинно вводили водный раствор L-аргинин в дозе 400 мг/кг. Животным 4-ой (n=15) и 5-ой (n=15) групп вводили метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) и аминогуанидин в одинаковой дозе 50 мг/кг. У крыс 3, 4 и 5 групп на фоне введения L-аргинина, L-NAME и AG на 5 и 6 дни вызывали токсическое повреждение печени введением CCl4. Исследования проводили через сутки после второго введения тетрахлорметана.
Установлено, что токсическое поражение печени тетрахлорметаном на фоне введения L-аргинина сопровождалось увеличением продукции NO• в 5,2 раза, по сравнению с животными контрольной группы, и в 3,8 раза по сравнению с животными, получавшими только L-аргинин. Применение блокаторов NO-синтаз - L-NAME и AG - приводило к снижению образования NO• на 13,2% и 20,0% (P<0,05), соответственно, по сравнению с группой животных с CCl4-интоксикацией.
Поддержание концентрации оксида азота на определенном уровне при токсическом повреждении печени, видимо, играет роль в ограничении чрезмерной активации процесса свободнорадикального окисления и его повреждающих эффектов, так как применение индуктора синтеза NO• L-аргинина, снижало, а введение блокаторов NO-синтаз (AG и L-NAME) усугубляло проявление цитолитического синдрома в условиях CCl4-интоксикации. Об этом свидетельствовало снижение активности в сыворотке крови ААТ на 23% (P<0,05) при стимуляции продукции NO• при токсическом повреждении печени по сравнению с данным показателем у крыс, которым вводили только CCl4.
Установлено, что токсическое повреждение печени при введении L-аргинина сопровождается снижением интенсивности образования супероксиданиона в печени крыс: спонтанная продукция уменьшалась на 22,2%, НАДН-стимулированная - на 20,5%, НАДФН-стимулированная - на 21%, по сравнению с животными, которым вводили только ССl4. Вполне вероятно, что гепатопротекторный эффект применения L-аргинина, описанный выше, связан именно со снижением продукции супероксиданионрадикала.
Ингибирование продукции NO• при токсическом повреждении печени вызывало повышение как спонтанной, так и стимулированной продукции O2•, что привело к более ярко выраженному цитолизу клеток печени.
Интенсификация наработки NO• понижала степень окислительной модификации белков на 21,6% (рис. 11) и содержание МДА на 16,9%. Наиболее ярко выраженный прооксидантный эффект имело введение аминогуанидина.
Рис. 11. Влияние модуляции продукции NO• на содержание карбонильных групп в плазме крови животных с токсическим повреждением печени |
Применение L-аргинина не только ограничивает активацию свободнорадикального окисления биологических субстратов при токсическом повреждении печени, но и сохраняет эффективный контроль этого процесса со стороны антиоксидантной системы в отношении локализации более глубоких стадий окисления.
Предварительное введение животным L-аргинина вызывало увеличение активностей ферментов антиоксидантной защиты: активность СОД возрастала на 20,3%, активность каталазы - на 33,1%, активность ферментов глутатионового звена: ГР и ГПО - на 33% и 34%, соответственно, по сравнению с группой животных с ССl4-интоксикацией.
Применение же L-NAME и аминогуанидина не оказывало существенного влияния на состояние ферментативного звена антиоксидантной системы при токсическом повреждении печени, по сравнению с животными, которым вводили только тетрахлорметан.
Таким образом, стимулирование продукции NO• (введение L-аргинина) повышает резистентность клеток печеночной паренхимы к повреждающему действию тетрахлорметана. Подобный цитопротекторный эффект связан, вероятно, с тем, что NO• способен инактивировать супероксиданион - один из наиболее важных агентов свободнорадикального окисления, который вызывает дезинтеграцию биомембран (Осипов А.Н. с соавт., 1990).
3.7.4. Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при ожоге
Исследования влияние модуляторов синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при ожоге проведены на 4-х группах крыс по 10 животных в каждой. Первая группа - интактные животные. Животным второй группы перед нанесением ожоговой травмы ежедневно в течение 6 дней один раз в день внутрибрюшинно вводили 1 мл дистиллированной воды, крысам 3-ей группы - L-аргинин в дозе 400 мг/кг, 4-ой - аминогуанидин в дозе 50 мг/кг массы тела. Исследования проводили на 3-и сутки после нанесения ожога.
Крысам 2, 3 и 4 групп наносили два дозированных симметричных ожога площадью по 300 мм2
Введение животным перед нанесением ожоговой травмы L-аргинина и аминогуанидина по-разному сказалось на характере изменений скорости пероксидного окисления липидов и ответной реакции антиоксидантной системы на ожоговую травму.
Если у крыс контрольной группы содержание диеновых конъюгатов на 3-и сутки после нанесения ожоговой травмы было увеличено на 68,4%, то у крыс, которым перед нанесением ожога в течение 6 дней внутрибрюшинно вводили L-аргинин в дозе 400 мг/кг, уровень конъюгированных диенов в крови возрастал всего на 17,1%.
Введение животным перед нанесением ожоговой травмы аминогуанидина в некоторой степени даже способствовало интенсификации накопления в крови вторичных продуктов ПОЛ. Так, у крыс контрольной группы концентрация МДА в крови на 3-и сутки после нанесения ожога была выше, чем у интактных животных на 95,6 % , а у крыс, которым вводили AG - на 128,1 % и выше, чем у контрольных крыс, на 16,7% (P<0,05).
| Рис. 12. Влияние аргинина и аминогуанидина на соотношение МДА/ДК в крови у крыс при ожоге |
Соотношение МДА/ДК дает возможность судить о направленности интенсивности процессов свободнорадикального окисления и характеризовать функциональное состояние антиоксидантной системы.
Из данных представленных на рисунке 12 видно, что если введение аминогуанидина существенно не отражается на общей направленности процессов ПОЛ при ожоге, то применение L-аргинина не только ограничивает его активацию, но и сохраняет эффективный контроль этого процесса со стороны антиоксидантной системы, в отношении локализации более глубоких стадий окисления.
| Рис. 13. Изменение содержания NOx в плазме крови и НАДФН-стимулированной генерации О2• в печени крыс при ожоге (в % к контролю) |
Существует прямая зависимость между изменением концентрации в плазме крови суммы NOх и НАДФН-стимулированной продукцией супероксиданиона в печени крыс при ожоговой травме (рис. 13). Коэффициент корреляции между уровнем NOх и НАДФН-стимулированной генерацией О2• составляет +0,96 (P<0,001), а между уровнем NOх и НАДН-стимулированной генерацией О2• - всего +0,27 (P>0,05).
Оценивая скорость заживления ожоговой раны на фоне модуляции оксида азота (рис. 14), можно констатировать следующее: нанесение ожога III A
| Рис. 14. Влияние L-аргинина и аминогуанидина на изменение площади раневой поверхности при заживлении ожоговой раны (в % к площади сразу после нанесения ожога) |
степени при стимуляции продукции NO• L-аргинином примерно на неделю ускоряет, а на фоне ингибирования продукции NO• аминогуанидином - на неделю замедляет восстановление кожного покрова после ожога и заживление ожоговой раны. Эти различия начинают проявляться уже на 3-и сутки постожогового периода, но наиболее заметны они становятся в период с 7 по 14 сутки.
Таким образом, изменения в процессах пероксидного окисления липидов, состоянии антиоксидан-тной системы, суммарном содержании нитратов и нитритов (NOх) у крыс при ожоговой травме, вызываемые использованием модуляторов продукции NO•, обуславливают различную скорость заживления ожоговой раны.
3.7.5. Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота при эмоционально-болевом стрессе
Установлено, что применение ФБ-26 в дозах 20 и 100 мг/кг предупреждает снижение массы тела крыс при иммобилизационном стрессе. Введение ФБ-26 в этих дозах препятствует развитию стрессорной гипертрофии надпочечников - достоверно предотвращает снижение их массы в 1,2 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с группой животных подвергнутых иммобилизации. Имеется также дозозависимое предупреждение язвообразования на слизистой желудка. Так, среди животных, получавших ФБ-26 дозе 20 мг/кг, поражения обнаружены у 50% крыс, в дозе 100 мг/кг - у 30%. Всё это свидетельствует о том, что соединение ФБ-26 обладает выраженной стресс-протекторной активностью, наиболее выраженной при введении его в дозе 100 мг/кг.
Применение ФБ-26 в указанных дозах крысам за 6 часов до иммобилизации в значительной мере предотвращает стрессовую активацию процессов ПОЛ, снижая степень избыточного накопления продуктов липопероксидации в организме. Уровень МДА в крови крыс, которым вводили ФБ-26 в дозе 20 мг/кг, был ниже на 17,2%, по сравнению с животными группы отрицательного контроля. Применение этого соединения в дозе 100 мг/кг стабилизировало интенсивность пероксидного окисления липидов на уровне, характерном для интактных животных (табл. 16).
Реакция со стороны глутатионового звена системы АОЗ на острое стресс-воздействие у крыс, получавших ФБ-26, принципиально схожа с реакцией этого звена системы АОЗ у животных 2-ой группы (иммобилизация). Однако степень выраженности этих изменений несколько меньше. Наблюдается даже некоторое понижение активности ГПО и ГР по сравнению с показателями, характерными для животных второй группы. Так, активность глутатионпероксидазы в группе с применением препарата в дозе 100 мг/кг снижается на 14,1%, а глутатионредуктазы - на 21,3%.
Таблица 16
Влияние ФБ-26 на систему ПОЛ-АОЗ в крови крыс при иммобилизации
МДА, мкМ/л | Каталаза, мМ Н2О2 /л×мин | СОД, ед.акт./мг Hb | ГПО, мМ восст. глут./л×мин | ГР, мкМ окисл. глут./л×мин |
1 группа (контроль) | ||||
1,650,16 | 38,42,34 | 0,760,034 | 40,63,55 | 219,21,51 |
2 группа (иммобилизация) | ||||
2,380,27* | 46,72,45* | 1,510,167* | 46,13,17* | 254,14,38* |
3 группа (иммобилизация + ФБ-26, 20 мг/кг) | ||||
1,970,24* | 46,64,14* | 1,470,145* | 43,62,56 | 229,73,78 |
4 группа (иммобилизация + ФБ-26, 100 мг/кг) | ||||
1,600,17 | 40,33,35 | 1,060,081* | 39,62,04* | 200,13,62* |
Примечание: *Ц P1Ц2,3,4 < 0,05; - P2-3,4,<0,05; - P 3Ц4 <0,05
Введение ФБ-26 в дозе 20 мг/кг не вызывало статистически достоверных изменений показателей, характеризующих активности СОД и каталазы. Повышение дозы ФБ-26 до 100 мг/кг приводило к снижению активности данных энзимов на 29,8 и 13,7%, соответственно, по сравнению с показателями у животных 2-ой группы
Можно было бы отнести установленные изменения к негативным, однако исследования, проведенные по изучению интенсивности образования супероксиданиона в печени подопытных животных, показали, что применение ФБ-26 в дозе 20 мг/кг ограничивало спонтанную продукцию супероксиданиона на 52,6%, а НАДН- и НАДФН-зависимую - на 64,6% и 62,5%, соответственно. Увеличение дозы ФБ-26 усилило его эффективность. Спонтанная продукция О2• снижалась до 18,6%, а НАДФН-стимулированная до 19,6% от показателей, характеризующих данные процессы у иммобилизированных животных, которым вводили только физраствор. Это является доказательством достаточно выраженных антирадикальных свойств ФБ-26.
Установлено также, что профилактическое применение ФБ-26 до иммобилизации активирует систему оксида азота (табл. 17).
Таблица 17
Влияние ФБ-26 на состояние NO-ергической стресс-лимитирующей системы у крыс при эмоционально-болевом стрессе
Группы животных | NOx, мкМ/л | RSNO, нМ/л |
1. Интактные | 44,63,73 | 1572,058,04 |
2. Контроль (иммобилизация) | 93,58,37* | 2240,073,8* |
3. Иммобилизация + 20 мг/кг ФБ-26 | 160,25,45* | 2312,568,8* |
4. Иммобилизация + 100 мг/кг ФБ-26 | 186,66,86* | 2450,0125,8* |
Примечание: *Ц P1Ц2,3,4 < 0,05; - P2-3,4,<0,05
Установлено, что в дозах 20 мг/кг и 100 мг/кг применение ФБ-26 статистически достоверно повышает содержание стабильных метаболитов оксида азота в 1,7 и 2 раза, соответственно, по сравнению с их концентрацией в плазме крови животных 2-ой группы. При этом достоверных различий в содержании S-нитрозотиолов у крыс 2-ой, 3-ей и 4-ой групп не установлено, что с одной стороны свидетельствует о повышении концентрации NO• за счет нитратной группировки изучаемого соединения, с другой - о сохранении пула нитрозотиолов, способных потенцировать эффекты оксида азота.
Таким образом, с учетом основных критериев оценки острой стресс-реакции (изменение общей массы тела, массы надпочечников, тимуса и селезенки, интенсивность язвообразования), установлено, что соединение ФБ-26 обладает выраженными стресс-протективными, антирадикальными и антиоксидантными свойствами. Его применение препятствует избыточной активации ПОЛ в ответ на стресс-воздействие, снижает негативные изменения в ферментативном звене антиоксидантной системы организма и активирует NO-ергическую стресс-лимитирующую систему оксида азота.
3.7.6. Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный
статус и систему оксида азота при токсическом повреждении печени
тетрахлорметаном
Установлено, что применение ФБ-26 оказывает достаточно выраженное гепатопротекторное действие, о чем свидетельствует снижение активности маркерных ферментов цитолиза клеток печени - аспартат- (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (ААТ) в сыворотке крови. Наиболее эффективным было профилактическое применение ФБ-26 за 12 часов до первой инъекции тетрахлорметана, которое снижало активность ААТ и АсАТ в 2,2 и 2,1 раза, соответственно, по сравнению с их активностью у животных с токсическим гепатитом, вызванным введением гепатотоксина. У животных, которым соединение вводили за 1 час до второй инъекции тетрахлорметана, динамика активности маркерных ферментов цитолиза была аналогичной, но менее выраженной.
Применение ФБ-26 (3-я и 4-я группы) при токсическом гепатите снижало образование супероксиданиона в печени (табл. 18).
Максимальное снижение интенсивности образования супероксид-аниона было характерно для животных 4-ой группы: спонтанная генерация О2• уменьшалась на 27,7%, НАДН-стимулированная - на 37,1%, НАДФН-стимулированная - на 18,7%, по сравнению с животными, которым вводили только тетрахлорметан.
Ограничивающее влияние ФБ-26, оказываемое на интенсивность образования активных форм кислорода, по всей вероятности, и обусловило его корригирующее действие на интенсивность накопления в крови начальных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что для ограничения процессов ПОЛ при токсическом повреждении печени более предпочтительно применение ФБ-26 за 1 час до повторной инъекции гепатотоксина (4-я группа), снижавшее уровень диеновых конъюгатов на 33,6%, кетодиенов - на 36,0% и малонового диальдегида на 37,2%, по сравнению с показателями у животных с CCl4-интоксикацией.
Таблица 18
Влияние применения ФБ-26 на продукцию О2• в печени крыс
при токсическом повреждении печени
Группы животных | Продукция O2•, нмоль/г×сек | ||
Спонтанная | Стимулированная | ||
НАДН | НАДФН | ||
1. Интактные | 0,50±0,021 | 6,5±0,08 | 7,9±0,06 |
Токсическое повреждение печени | |||
2. Контроль | 0,83±0,024* | 15,1±0,51* | 22,5±0,10* |
3. 100 мг/кг ФБ-26 за 12 часов | 0,67±0,040* | 10,8±0,28* | 17,1±0,41* |
4. 100 мг/кг ФБ-26 за 1 час | 0,60±0,032* | 9,5±0,52* | 18,3±0,72* |
Примечание: *ЦP1Ц2,3,4 < 0,05; - P2-3,4 <0,05
Изучение состояния ферментативного звена АОС показало, что независимо от схемы введения ФБ-26, его применение повышало активность каталазы на 13,5-17,9%, и СОД - на 15,2-19,7 и практически не влияло на состояние глутатионового звена АОС в крови животных с токсическим повреждением печени. Следовательно, это соединение не только ограничивает пероксидацию липидов при токсическом повреждении печени, но и способствует сохранению эффективного контроля этих процессов со стороны антиоксидантной системы, предотвращая протекание более глубоких стадий свободнорадикального окисления.
введение тетрахлорметана вызывало значительное увеличение продукции NO•, о чем свидетельствовало более чем 3-кратное повышение содержания суммы NO2+NO3 в плазме крови. Использование ФБ-26 при токсическом повреждении печени стимулировало дальнейшее накопление NO• в биофазе.
Рис. 15. Cодержание NO2+NO3 и RSNO в плазме крови крыс при повреждении печени CCl4 (в % к отрицательному контролю) |
Так, концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота возрастала в плазме крови животных 3-ей группы на 47,3%, 4-ой группы - на 68,8% (рис. 15). Максимальный уровень S-нитрозо-тиолов был зафиксирован у животных, получавших соединение за 12 часов до инъекции токсина, - их концентрация составила 3940 нМ/мл, хотя статистически достоверных различий между данными показателями, характеризующими накопление RSNO для животных 2-ой и 3-ей группы, отмечено не было.
Таким образом, проведенные исследования показали наличие гепатопротекторных свойств у ФБ-26. Механизм коррекции цитолитического синдрома при токсическом повреждении печени, по-видимому, обусловлен рядом факторов: во-первых, применение ФБ-26 достаточно эффективно снижает субклеточную продукцию супероксидного радикала, а во-вторых - стимулирует повышение концентрации NO•, вовлеченного в ограничение повреждающих эффектов, как на центральном, так и на периферическом уровне.
3.7.7. Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота при ожоговой травме
Применение ФБ-26 способствовало снижению интенсивности свободнорадикального окисления липидов у животных при ожоговой травме. Наиболее значительные изменения установлены в содержании в крови диеновых конъюгатов и кетодиенов, концентрации которых составили 58,8% и 53,4%, соответственно, от таковых у животных группы отрицательного контроля. При этом концентрация более позднего продукта пероксидации - МДА была ниже на 34,2 %.
| Рис. 16. Влияние ФБ-26 на ферментативное звено АОС при ожоге (в % к уровню у интактных животных) |
Ограничивающее действие ФБ-26 на образование первичных и вторичных продуктов ПОЛ сказалось и на степени индукции активности антиоксидантных ферментов в крови крыс при ожоге.
Применение ФБ-26 нормализовало состояние ферментативного звена антиоксидантной системы в крови животных с ожоговой травмой (рис. 16). Так, активность СОД была ниже в 1,6 раза, каталазы и глутатионпероксидазы - на 26,4% и 39,3%, соответственно. Активность глутатионредуктазы статистически не отличалась от таковой у интактных животных.
Введение животным до нанесения ожога ФБ-26 практически предотвращает спонтанное усиление генерации О2• и его продукцию в ЭТЦ митохондрий. Причем надо отметить отсутствие статистически достоверных различий между показателями спонтанной продукции О2• в печени крыс, не подвергавшихся никаким воздействиям, и животных, которым при ожоговой травме применяли изучаемое соединение.
Указанные различия в характере спонтанного образования О2• при ожоге вполне согласуются с приведенными выше данными об изменениях в интенсивности накопления продуктов ПОЛ в крови животных и активности антиоксидантных ферментов при нанесении ожоговой травмы на фоне применения ФБ-26.
Соединение ФБ-26 способствовало увеличению содержания стабильных метаболитов оксида азота на 33%, а нитрозотиолов - на 26%, по сравнению с показателями, характерными для животных с ожоговой раной и не подвергавшихся какой-либо обработке (рис. 17).
|
Важно отметить тот факт, что повышение содержания NOх на фоне использования ФБ-26 не сопровождалось истощением пула нитрозотиолов, а, следовательно, сохраняется динамическое равновесие S-нитрозотиолов и NO•, что имеет большое значение для реализации физиологических функций последнего (Stamler J.S. et al., 1992).
Изменения в интенсивности процессов ПОЛ, суммарном содержании NOх и состоянии антиоксидантной системы у крыс при ожоговой травме, нанесенной при введении изучаемого соединения, обусловили и различную скорость заживления ожоговой раны у подопытных животных.
Интенсивность репаративных процессов у крыс, которым применяли ФБ-26, была значительно выше. Так, на 3-и сутки площадь раневой поверхности у этих животных составила 79,1%, тогда как у крыс группы отрицательного контроля 93,6%. Если в целом оценить эффективность использования данного соединения, можно констатировать тот факт, что его применение сокращает заживление раны на 5-7 суток.
Оценивая эффективность соединения ФБ-26 для поддержания про- и антиоксидантного равновесия в условиях ожоговой травмы, следует отметить, что его применение до нанесения ожога способствовало снижению интенсивности ПОЛ и сохранению эффективного контроля ферментативного звена АОЗ над течением окисления по свободнорадикальному типу.
1. Процессы свободнорадикального окисления липидов и белков, функциональное состояние системы антиоксидантной защиты и системы оксида азота имеют важное значение в осуществлении защитно-приспособительных реакций организма животных в период постнатальной адаптации, при действии стресс-факторов различной природы, развитии патологических состояний различной этиологии.
2. Для новорожденных телят, поросят и ягнят в первые дни жизни характерно высокое содержание в плазме крови стабильных метаболитов оксида азота (NO2+NO3) превышающее уровень у взрослых особей соответственно в 13,9, 14,4 и 12,9 раза.
Высокая концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота в моче и концентрация метгемоглобина в крови у новорожденных телят в первые сутки жизни в пределах физиологической нормы, высокое содержание NOx в амниотической жидкости у коров являются доказательством его интенсивного эндогенного образования еще во внутриутробный период развития.
3. Ранний постнатальный период развития клинически здоровых телят сопровождается явлениями окислительного стресса, которые выражаются в смещении оксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону интенсификации свободнорадикального окисления липидов и белков, причем, в первую очередь окислительной модификации подвергаются белки.
Наибольшая степень окислительной модификации белков сыворотки крови установлена сразу (через 0,5-1 час) после рождения и превышает в 1,7 раза уровень у взрослых животных и составляет от 1,20 до 1,30 нмоль карбонильных групп/мг белка. При этом содержание МДА достигает своего максимума 2,35±0,140 мкМ/л только к концу первых суток жизни.
4. У новорожденных телят с более выраженными явлениями оксидативного стресса затруднен пассивный перенос в кишечнике колостральных иммуноглобулинов, а всосавшиеся иммуноглобулины подвергаются окислительной модификации, что нарушает их функцию в обеспечении противоинфекционной защиты.
5. Интенсивность всасывания колостральных иммуноглобулинов зависит от баланса в системе оксид азота - S-нитрозотиолы (RSNO). Существует высокая степень корреляции (r = + 0,864, P < 0,001) между суммарным содержанием стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке через 0,5-1,0 час после рождения (до выпойки молозива) и общих иммуноглобулинов в сыворотке крови у телят через сутки после рождения.
6. Развитие респираторной патологии у телят сопровождается интенсификацией свободнорадикального окисления липидов. Чем глубже поражение дыхательной системы, тем выше скорость СРО: при трахеобронхите содержания МДА в крови повышается на 34%, а бронхопневмонии - в 2,1 раза.
Состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят с субклиническим трахеобронхитом является метаболически более предпочтительным, поскольку сохраняется эффективный контроль со стороны АОС: активность СОД и каталазы у телят с субклиническим трахеобронхитом была выше на 27,7% и 14,1%, соответственно, от таковой у животных, больных бронхопневмонией. Снижение содержания S-нитрозотиолов в сыворотке крови при субклиническом трахеобронхите происходит в 1,8 раза, при бронхопневмонии - 2,4 раза, что свидетельствует о нарушении адекватного функционирования системы оксида азота.
7. При жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота в тканях печени и крови животных происходит усиление процессов пероксидного окисления липидов и снижение уровня эндогенных антиоксидантов: в тканях печени содержание МДА возрастает на 76,6%, а в крови - в 2,7 раза, концентрация витамина Е уменьшается на 34,6% и 25,4%, соответственно. Патология печени вызывает более чем 3-кратное повышение содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO2+NO3) в плазме крови, что свидетельствует о значительном увеличении продукции NO•.
8. Функциональная недостаточность систем антиоксидантной защиты и генерации оксида азота у коров в конце стельности является предрасполагающим фактором развития послеродового эндометрита. Клиническое проявление острого послеродового эндометрита происходит на фоне повышенной интенсивности пероксидного окисления липидов, увеличения концентрации стабильных метаболитов оксида азота и несбалансированных изменений в системе антиоксидантной защиты. Повышение активности ГР на 10,6%, по сравнению с ростом активности ГПО в 1,7, свидетельствует о низком функциональном потенциале глутатионового звена системы АОЗ и о невозможности адекватного пополнения пула восстановленного глутатиона.
9. До отела интенсивность образования оксида азота и содержание S-нитрозотиолов у коров с субинволюцией матки существенно не отличается от таковой у животных с нормальным течением послеродового периода. Клиническое проявление субинволюции матки сопровождалось истощением пула оксида азота, о чем свидетельствует повышение интенсивности его образования примерно в 1,5 раза и снижение содержания S-нитрозотиолов. Данные нарушения и проявление избыточного релаксирующего действия самого оксида азота на миометрий являются одной из причин сбоя физиологического течения инволюционных процессов в матке.
10. У коров с послеродовой субинволюцией матки за 10-14 дней до отела происходит снижение функционального потенциала системы антиоксидантной защиты, которое выражается в снижении активности СОД на 22,2%, ГПО - на 39,8%, а ГР - на 38,2% по сравнению с животными, оставшимися здоровыми, что не позволяет поддерживать на относительно стабильном и контролируемом уровне стрессорную активацию процессов ПОЛ в раннем послеродовом периоде.
11. У коров с дисфункцией яичников снижена концентрация стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови на 61,1% и содержание S-нитрозотиолов - на 29,8% по сравнению со здоровыми животными. Более интенсивное течение процессов пероксидного окисления липидов у бесплодных животных не связано с недостаточностью ферментативного звена антиоксидантной системы, о чем свидетельствует высокий функциональный потенциал антиоксидантной системы у коров с дисфункцией яичников. У таких коров активность каталазы выше на 24,3%, СОД - на 31,9%, ГПО - на 27,7%, ГР - на 10,6%, по сравнению со здоровыми циклирующими животными.
12. Стимуляция продукции оксида азота, с одной стороны не оказывает влияние на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов, а с другой способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты. Введение животным ингибиторов NO-синтаз приводит к снижению продукции оксида азота более чем в 2 раза, но не вызывает существенных изменений в содержания S-нитрозотиолов в плазме крови по сравнению с интактными животными. Это позволяет считать, что существует определенный базовый уровень S-нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, который даже в условиях ингибирования его генерации используется в незначительной степени.
13. Активация синтеза оксида азота L-аргинином повышает устойчивость животных к действию стресс-факторов при иммобилизационном стрессе, токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме. Эффект применения L-аргинина в отношение проявления оксидативного стресса обусловлен снижением интенсивности процессов пероксидации липидов и белков вследствие уменьшения образования супероксиданиона в митохондриальной электронтранспорной цепи.
Ингибирование синтеза оксида азота, напротив, смещает прооксидантное-антиоксидантное равновесие в сторону интенсификации свободнорадикального окисления биологических субстратов, из чего следует, что состояние системы генерации оксида азота может являться одним из важных механизмов поддержания оптимального баланса между про- и антиоксидантными процессами.
14. Применение животным перед стрессовой ситуацией различной этиологии и с различными механизмами патогенеза соединения ФБ-26, обладающего свойствами антиоксиданта и донора оксида азота, приводит к такому изменению состояния NO-ергической и антиоксидантной стресс-лимитирующих систем и интенсивности течения процессов свободнорадикального окисления, которое обеспечивает более оптимальное протекание адаптационных перестроек метаболизма и репаративных процессов при осуществлении стресс-реакции и снижение её отрицательных последствий для организма животных.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для определения интенсивности образования оксида азота в организме животных использовать Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови (М.: РАСХН, 2007).
2. Для оценки интенсивности генерации супероксиданиона в тканях использовать Методические рекомендации определения субклеточной локализации генерации супероксиданиона в тканях (М.: РАСХН, 2007).
3. Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов и состояния системы антиоксидантной защиты с учётом индивидуальных, видовых, физиологических, возрастных особенностей, клинического состояния животных использовать Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (М.: РАСХН, 2007).
4. В качестве теста для оценки интенсивности всасывания колостральных иммуноглобулинов использовать определение активности γ-глутамил-трансферазы в сыворотке крови у новорожденных телят в 1-2 сутки после рождения. Активность γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови новорожденных телят менее 3 мккат/л свидетельствует о недостаточности колострального иммунитета и риске развития неонатальных болезней инфекционной этиологии.
5. В основу фармакологического изучения новых лекарственных веществ, повышающих резистентность и продуктивное здоровье животных, включить оценку их действия на антиоксидантную систему и систему оксида азота.
6. Научные результаты работы использовать в учебном процессе студентов по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных и при проведении научно-исследовательских работ аспирантами и научными работниками в НИУ и ВУЗах биологического и зооветеринарного профиля.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- *Рецкий М.И. Ермакова Н.В., Близнецова Г.Н. и др. Динамика стабильных метаболитов оксида азота у коров с субинволюцией матки // Ветеринарная патология. 2003. № 2. С.89-90.
- *Рецкий М.И., Шахов А.Г., Близнецова Г.Н. и др. Возрастная динамика образования оксида азота в организме крупного рогатого скота // Доклады РАСХН. 2004. №4. С. 58-60.
- *Близнецова Г.Н., Артемьева С.С. Оксид азота и нитрозотиолы при токсическом повреждении печени CCl4 в условиях модуляции синтеза NO // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. № 8(Т. 90). С. 3-4.
- *Близнецова Г.Н., Цебржинский О.И., Нацвина А.К., Рецкий М.И. Метод определения субклеточной генерации супероксиданиона у здоровых животных и при токсическом повреждении печени // Вестник ВГУ. Серия химия, биология. 2004. № 2. С. 108-111.
- Артемьева С.С. Оксид азота и его взаимосвязь с формированием колострального иммунитета у новорожденных поросят / С.С. Артемьева, Г.Н. Близнецова, А.М. Зайко и др. // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы Международной научно-практической конференции.- Воронеж: ВГУ, 2004. - с. 14-17.
- Близнецова Г.Н. Состояние антиоксидантной системы в условиях стимуляции L-аргинином продукции оксида азота при токсическом повреждении печени // Материалы международной научно-практической конференции Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Воронеж: ВГУ, 2004. с. 17-21.
- Рецкий М.И., Шахов А.Г., Артемьева С.С., Близнецова Г.Н. и др. Роль оксида азота в формировании колострального иммунитета у новорожденных телят // Материалы международной научно-практической конференции Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Воронеж: ВГУ, 2004. с. 134-139.
- Заливанский Э.Б., Рецкий М.И., Близнецова Г.Н. и др. Роль оксида азота в патогенезе гестоза // Материалы международной научно-практической конференции Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных. Воронеж: Европолиграфия, 2005. С.292-299.
- Рецкий М.И., В.И. Михалев, Близнецова Г.Н., Пасько Н.В. Роль оксида азота в патогенезе субинволюции матки у коров // Материалы международной научно-практической конференции Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных. Воронеж: Европолиграфия, 2005. С.382-385.
- Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных / А.Г. Шахов, Ю.Н. Масьянов, М.И. Рецкий, Ю.Н. Бригадиров, А.И. Ануфриев, М.В. Бирюков, С.И. Першина, А.М. Кардашов, М.Г. Петрова, Е.В. Батищева, В.И. Беляев, А.И. Золотарев, Г.Н. Близнецова и др. // Воронеж, 2005. 116 с.
- *Шахов А.Г., Рецкий М.И., Масьянов Ю.Н., Золотарёв А.И., Бригадиров Ю.Н., Близнецова Г.Н. и др. Повышение эффективности специфической профилактики факторных инфекций путём коррекции антиоксидантного и иммунного статуса коров и телят // Ветеринарная патология. 2005. №3 (14). С. 84-89.
- *Рецкий М.И., Артемьева С.С., Близнецова Г.Н. О взаимосвязи интенсивности образования оксида азота и S-нитрозотиолов в период ранней постнатальной адаптации телят // С.-х.биология. Сер. Биология животных. 2005. N 6. С. 31-34.
- *Рецкий М.И., Шахов А.Г., Масьянов Ю.Н., Чудненко О.В., Близнецова Г.Н. и др. Взаимосвязь некоторых показателей биохимического статуса с интенсивностью всасывания колостральных иммуноглобулинов у новорожденных телят//Доклады РАСХН. 2005. №5. С. 44-46.
- *Близнецова Г.Н., Артемьева С.С. Влияние L-аргинина и ингибиторов NO-синтазы на образование оксида азота и нитрозотиолов при токсическом повреждении печени // Биомедицинская химия. 2005. №6(Т. 51). С.656-661.
- Рецкий М.И., Мисайлов В.Д., Золотарев А.И., Г.Н. Близнецова и др. Роль метаболических нарушений в развитии послеродовой субинволюции матки у коров // Научные основы профилактики и лечения болезней животных: Сборник научных трудов ведущих ученых России, СНГ и др. стран. Уральское издательство, Екатеринбург, 2005. С.547-551.
- *Шахов А.Г., Рецкий М.И., Масьянов Ю.Н., Золотарев А.И, Бригадиров Ю.Н., Г.Н. Близнецова и др. Повышение эффективности специфической профилактики факторных инфекций путем коррекции антиоксидантного и иммунного статуса коров и телят // Ветеринарная патология. 2005. N 3. С. 84-89.
- Каверин Н.Н., Мещерякова М.Ю., Близнецова Г.Н. Большой практикум по физиологии человека и животных. Биохимические методы исследований // Пособие для вузов. Воронеж, 2006. 50 с
- Каверин Н.Н., Филатов Н.В., Близнецова Г.Н. Влияние селекора на параметры биохемилюминесценции плазмы крови телят // В кн. Селекор. Биологическое действие. М.: MAGERIC, 2006. С.141-147.
- Артемьева С.С., Близнецова Г.Н., Филатов Н.В. Влияние селекора на окислительную модификацию белков у новорожденных телят // Материалы 1-ой международной научно-практической конференции молодых ученых Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии. Воронеж, 2006. С.10-14.
- Близнецова Г.Н., Артемьева С.С. Субклеточная локализация генерации супероксиданиона в печени при стрессе // Материалы 1-ой международной научно-практической конференции молодых ученых Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии. Воронеж, 2006. С.20-24.
- Близнецова Г.Н., Артемьева С.С. Стабильные метаболиты оксида азота и S-нитрозотиолы в плазме крови животных при стрессе // Материалы 1-ой международной научно-практической конференции молодых ученых Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии. Воронеж, 2006. С.24-27.
- *Близнецова Г.Н., Рецкий М.И., Полякова-Семенова Н.Д. и др. Роль процессов свободнорадикального окисления в механизме гепатопротекторного действия масла из семян амаранта // Биомедицина. 2006. №2. С.105-112.
- *Шахов А.Г. Михалев В.И., Рецкий М.И., Мисайлов В.Д., Близнецова Г.Н. и др. Значение оксида азота и половых стероидов в развитии субинволюции матки коров // Доклады РАСХН. 2006. №6. С.49-51.
- Близнецова Г.Н., Артемьева С.С, Рецкий М.И. О механизме антистрессорной активности аргинина // Материалы 1-го съезда фармакологов России. Воронеж, 2007. С.119-125.
- Близнецова Г.Н., Пасько Н.В., Рецкий М.И. Роль оксида азота в регуляции сократительной активности миометрия в период беременности и родов // Материалы 1-го съезда фармакологов России. Воронеж, 2007.С.126-131.
- Близнецова Г.Н., Филатов Н.В., Артемьева С.С, Масьянов Ю.Н. Влияние селеданта на окислительную модификацию белков и формирование колострального иммунитета у новрожденных телят // Материалы 1-го съезда фармакологов России. Воронеж, 2007. С.131-136.
- *Рецкий М.И., Шахов А.Г., Филатов Н.В., Золотарёв А.И., Близнецова Г.Н. и др. Роль метаболического статуса в развитии омфалита у новорожденных телят // Доклады РАСХН. 2007. №4. С. 50-53.
- Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных / М.И. Рецкий, А.Г. Шахов, В.И. Шушлебин, А.М. Самотин, В.Д. Мисайлов, Г.Г. Чусова, А.И. Золотарев, Д.В. Дегтярев, Т.Г. Ермолова, О.В. Чудненко, Г.Н. Близнецова и др. // В кн. Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. Ч.III. Методы исследований по проблемам незаразной патологии у продуктивных животных. М.: РАСХН, 2007. С. 5-109.
- Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови / М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова // В кн. Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. Ч.III. Методы исследований по проблемам незаразной патологии у продуктивных животных. М.: РАСХН, 2007. С. 119-123.
- Методические рекомендации по определению субклеточной генерацией супероксиданиона в тканях / М.И. Рецкий, О.И. Цебржинский, Г.Н. Близнецова // В кн. Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. Ч.III. Методы исследований по проблемам незаразной патологии у продуктивных животных. М.: РАСХН, 2007. С. 119-123.
- Кочура М.Н., Близнецова Г.Н., Нежданов А.Г и др. Биохимическая и морфологическая характеристика крови коров при гестозе // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской обл. Курск, 2008. С.215-217.
- Нежданов А.Г., Рецкий М.И., Близнецова Г.Н. и др. Гормонально-метаболический гомеостаз и продуктивное здоровье высокопродуктивных молочных коров // Материалы международной конференции Трансферт инновационных технологий в животноводстве. Орел, 2008. С. 133-136.
- *Близнецова Г.Н., Ковалев А.А., Черницкий А.Е. и др. Система антиоксидантной защиты телят при бронхопневмонии // Вестник РАСХН. 2008. N 1. С. 76-78.
- *Близнецова Г.Н., Рецкий М.И., Нежданов А.Г. и др. Антиоксидантный статус и продукция оксида азота у коров при акушерско-гинекологической патологии // Доклады РАСХН. 2008. N 1. С. 53-55.
- *Близнецова Г.Н., Черницкий А.Е., Ковалев А.А. и др Биохимические параметры конденсата выдыхаемого воздуха телят // Ветеринария. 2008. N 3. С. 44-47.
- Близнецова Г.Н. Оксид азота при патологии печени у крупного рогатого скота // Материалы международной научно-практической конференции Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Воронеж, 2008. С. 44-46.
- *Титов В.Ю. Винникова Э.З., Фисинин В.И., Близнецова Г.Н. и др. Значение оксида азота и его метаболитов в развитии эмбрионов // Доклады РАСХН. 2008. №4. С.44-46.
- *Рецкий М.И., Чусов Д.Б., Ермолова Т.Г., Близнецова Г.Н. и др. Биохимические маркеры развития окислительного стресса у новорожденных телят // Ветеринария. 2008. N 8. С. 47-49.
- *Сафонов В.А., Близнецова Г.Н., Нежданов А.Г. и др. Влияние дефицита селена на состояние системы антиоксидантной защиты у коров в период стельности и при акушерской патологии // Доклады РАСХН. 2008. №6. С.50-51.
- *Рецкий М.И., Самотин А.М., Близнецова Г.Н. и др. Антиоксидантный статус при жировой дистрофии печени у бычков // С.-х. биология. Сер. Биология животных. 2008. N 4. С. 106-109.
- *Рецкий М.И., Шахов А.Г., Близнецова Г.Н. и др. Тест для оценки пассивного переноса колостральных иммуноглобулинов // Ветеринария. 2008. №6. С. 48-50.
- Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят / А.И. Золоторев, А.Г. Шахов, Ю.Н. Алехин, М.И. Рецкий, Н.В. Филатов, Г.Н. Близнецова, Т.Г. Ермолова // Воронеж, 2008. 25 с.
- *Рецкий М.И., Близнецова Г.Н., Шахов А.Г., Масьянов Ю.Н. Роль оксида азота в формировании колострального иммунитета у новорожденных поросят// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2009. №7. С. 126-130.
- *Шабунин С.В., Золотарев А.И., Близнецова Г.Н. и др. Динамика биохимических показателей крови у новорожденных телят в первую неделю жизни // Сельскохозяйственная биология. Серия биология животных. 2009. № 6. С. 94-98.
- *Близнецова Г.Н., Шабунин С.В., Косенко Ю.М., Г.А. Востроилова Интенсивность процессов свободнорадикального окисления при ожогах и лечении их препаратом цидисепт-гель // Ветеринария и кормление. 2009. №3. С. 22-23.
- *Близнецова Г.Н., Косенко Ю.М., Ермакова Т.И. Лечение эндометритов у коров путем применения суппозиториев с циминалем и липотоном // Ветеринария. 2009. № 7. С.8-10.
- Близнецова Г.Н. Влияние фармакологической модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы у животных // Материалы ΙΙ съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. Казань, 2009. С. 49-52.
- Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гепатопатий у крупного рогатого скота / Ю.Н. Алехин, С.В. Шабунин, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, И.Р. Сидельникова, Д.Б. Чусов // Воронеж, 2009. 86 с.
- Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гестоза у молочных коров и свиноматок / А.Г. Нежданов, С.В. Шабунин, М.И. Рецкий, А.И. Золотарев, Ю.Н. Масьянов, Л.Ю. Сашнина, Г.Н. Близнецова, Ю.Н. Алехин и др.// Воронеж, 2009. 30 с.
- Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета у новорожденных животных / А.Г. Шахов, С.В. Шабунин, В.Д. Мисайлов, В.Н. Коцарев, Ю.Н. Алехин, М.И. Рецкий, В.И. Михалев, Г.Н. Близнецова и др.// Воронеж, 2009. 42 с.
- *Рецкий М.И., Шабунин С.В., Близнецова Г.Н., Востроилова Г.А. Мобилизация свободнорадикальных процессов в нейтрофилах крови при разных формах бронхопневмонии у телят // Сельскохозяйственная биология. Серия биология животных. 2010. № 2. С.100-102.
- *Нежданов А.Г., Кочура М.Н., Мисайлов В.Д., Шахов А.Г., Рецкий М.И., Близнецова Г.Н. и др. К проблеме гестоза у молочных коров // Международный вестник ветеринарии. 2010. №1. С.12-17.
- Артемьева С.С., Близнецова Г.Н. Особенности продукции оксида азота у телят в период ранней постнатальной адаптации // Журнал теоретической и практической медицины. 2010. Т.8, №2. С. 162-165.
Патенты РФ:
54. Способ профилактики омфалита у новорожденных телят: пат. 2301060 РФ:МПК А61К 31/245, 31/7036, 39/08 /А.И. Золотарёв, А.Г. Шахов, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, Н.В. Филатов/ заявитель и патентообладатель ГНУ ВНИВИПФиТ.- 2006105366/13; заявл. 20.02.2006; опубл. 20.06.2007, Бюл. №17- 7 с.
55. Способ профилактики омфалофлебита у новорожденных телят: пат. 2320350 РФ:МПК А61К 33/00, 39/108 /А.И. Золотарёв, А.Г. Шахов, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, Л.Ю. Сашнина, Н.В. Филатов/ заявитель и патентообладатель ГНУ ВНИВИПФиТ.- 2006125257; заявл. 13.07.2006; опубл. 27.03.2008, Бюл. №9- 5 с.
56. Способ ранней диагностики трахеобронхита у новорожденных телят: пат. 2320254 РФ:МПК А61В 1/127, А 61D 99/00 /А.И. Золотарёв, А.Г. Шахов, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова/ заявитель и патентообладатель ГНУ ВНИВИПФиТ.- 2006142989; заявл. 04.12.2006; опубл. 27.03.08, Бюл. №9.- 5с.
57. Способ повышения колострального иммунитета у новорожденных телят с пониженной жизнеспособностью: пат. 2391816 РФ:МПК А01К 67/02, А61К 39/108 А61К 31/00 / М.И. Рецкий, А.Г. Шахов, А.И. Золотарёв, Т.Г. Ермолова, Г.Н. Близнецова и др./ заявитель и патентообладатель ГНУ ВНИВИПФиТ.- 2008152883; заявл. 30.12.2008; опубл. 20.06.10, Бюл. №17.- 7с.
*- издания из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии