Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ГОЛУБ

Елена Викторовна

Оценка  отдаленных  цитогенетических эффектов  у  лиц,  подвергшихся  острому или  пролонгированному  облучению

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Обнинск - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный консультант:  доктор биологических наук, профессор

  Севанькаев Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

  Воробцова Ирина Евгеньевна

доктор биологических наук

Суринов Борис Павлович

доктор биологических наук

Осипов Андреян Николаевич

Ведущая организация - Федеральное Государственное бюджетное учреждение                                 Российский научный центр рентгенорадиологии                                         Минздравсоцразвития России

  Защита состоится 24 января 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 в ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития России по адресу (249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, д. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития России.

  Автореферат разослан л_________________2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Использование источников ионизирующего излучения в производственных и военных целях не исключает вероятность аварийных ситуаций, в которых человек может подвергаться острому или пролонгированному облучению. По степени негативного влияния радиации на здоровье человека особое значение имеют отдаленные эффекты. К ним относятся хромосомные и генные мутации, которые играют ключевую роль в развитии ряда соматических заболеваний и канцерогенеза. Оценить повреждения генома после воздействия различных мутагенов, в том числе радиационной природы, и установить взаимосвязь структурных нарушений ДНК с состоянием здоровья пострадавших лиц в отдаленный пострадиационный период позволяет уникальная способность лимфоцитов периферической крови человека длительное время сохранять приобретенные изменения. Причем наблюдаемый широкий спектр и частота аберраций хромосом, превышающие спонтанный уровень в отдаленные сроки после облучения, могут свидетельствовать о повреждении лимфопоэтической ткани у пострадавшего контингента, либо о радиационно-индуцированной нестабильности генома. Так, наличие в спектре нестабильных аберраций дицентриков и центрических колец без сопутствующих парных фрагментов является показателем радиационных повреждений в стволовых клетках. По мнению ряда исследователей, повышенный уровень ацентрических фрагментов и аберраций хроматидного типа в лимфоцитах периферической крови пострадавших лиц в отдаленный пострадиационный период может быть результатом не только химического или вирусного, но и радиационного мутагенеза. Появление подобных нарушений de novo в поколениях выживших клеток свидетельствует о сохраняющейся длительное время активности мутационных процессов в клетках и тканях, подвергшихся радиационному воздействию. Особого внимания заслуживает также повышенный уровень стабильных аберраций, которые являются потенциальным источником малигнизации клеток. Эти структурные перестройки хромосом могут привести к образованию клоновых аберраций, способствующих развитию онкологических заболеваний.

Таким образом, индивидуальные цитогенетические показатели, полученные в результате длительного пострадиационного наблюдения лиц, пострадавших при различных радиационных ситуациях, могут служить объективным основанием для углубленного медицинского наблюдения с целью прогноза и оценки риска возникновения отдаленной постлучевой патологии.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы было изучение отдаленных цитогенетических эффектов при пролонгированном низко-дозовом облучении когорты ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и острого неконтролируемого облучения в высоких дозах лиц, пострадавших в различных аварийных ситуациях.

Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

  1. Исследовать зависимость частоты нестабильных и стабильных аберраций хромосом в когорте ликвидаторов (1010 чел) последствий аварии на ЧАЭС, подвергшихся пролонгированному облучению, от величины поглощенной дозы в разные годы работы в зоне аварии (1986 - 1989 гг.);
  2. Изучить динамику нестабильных и стабильных аберраций хромосом в данной когорте ликвидаторов в течение первых 6 лет наблюдения после облучения;
  3. Исследовать частоту и динамику различных типов нестабильных аберраций хромосом в отдаленный пострадиационный период (10 - 52 лет) в зависимости от степени тяжести острой лучевой болезни (ОЛБ) у лиц (48 чел), подвергшихся острому облучению в высоких дозах (1,1 - 9,8 Гр):
    • иквидаторы последствий аварии на ЧАЭС (10 чел);
    • военнослужащие на атомных подводных лодках (22 чел);
    • пострадавшие на военных полигонах при испытании ядерного оружия (5 чел);
    • пострадавшие от промышленных источников излучений (11 чел).
  4. Исследовать частоту и динамику стабильных аберраций (аномальных моноцентриков и транслокаций) в зависимости от степени тяжести ОЛБ в отдаленный пострадиационный период.

Положения, выносимые на защиту:

1. В обследованной когорте ликвидаторов аварии на ЧАЭС, подвергшихся пролонгированному облучению в средних дозах от 1,0 до 25,3 сГр, средняя частота хромосомных аберраций достоверно превышает контрольный уровень через 1 - 6 лет после облучения и зависит от величины поглощенной дозы. У ликвидаторов 1986 г. работы, для которых поглощенная доза составляла в среднем 25,3 сГр, уровень нестабильных аберраций достоверно превышает цитогенетические показатели, наблюдаемые у ликвидаторов последующих лет работы (1987, 1988, 1989 гг.), подвергшихся облучению в средних дозах 9,7; 4,8; 1,0 сГр, соответственно.

2. В группах лиц, подвергшихся неконтролируемому острому облучению в дозах от 1,1 до 9,8 Гр в различных аварийных ситуациях, приведшему к развитию ОЛБ IЦIV степени тяжести, выявлены общие закономерности изменения цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови в отдаленный пострадиационный период (10 - 52 лет):

  • средняя частота нестабильных аберраций хромосомного типа постепенно снижается за период наблюдения у большинства обследованных лиц с различной степенью тяжести ОЛБ, при этом оставаясь выше контрольного уровня в указанный период времени. Частота аберраций хроматидного типа имеет разнонаправленный характер: снижается у одних лиц и, наоборот, повышается у других, независимо от степени тяжести радиационного поражения;
  • частота стабильных аберраций хромосом (аномальных моноцентриков и транслокаций) превышает как контрольный уровень, так и частоту нестабильных аберраций практически у всех обследованных лиц с ОЛБ IЦIV степени, и коррелирует со степенью тяжести острого радиационного поражения. При этом частота аномальных моноцентриков имеет тенденцию к повышению со временем после облучения, в то время как частота транслокаций, определяемых FISH-методом, варьирует в пределах ошибки на повышенном уровне, проявляя тенденцию к снижению при высокой степени тяжести ОЛБ III-IV мтепени.

3. До 80% маркеров радиационного воздействия (дицентрики и центрические кольца), выявленных в отдаленный пострадиационный период, сопровождаются сопутствующими парными фрагментами, что свидетельствует о появлении лимфоцитов с этими аберрациями не из стволовых клеток (в этом случае дицентрики и центрические кольца наблюдаются без фрагментов), а, вероятно с субпопуляцией долгоживущих лимфоцитов в периферической крови.

Научная новизна. При сравнительном цитогенетическом обследовании представительной когорты ликвидаторов (1010 человек) в пострадиационный период (1 - 6 лет), подвергшихся пролонгированному низко-дозовому облучению при участии в восстановительных работах в 1986 - 1989 гг. после аварии на ЧАЭС, выявлено превышение контрольного уровня средне-групповой частоты аберраций хромосом, что свидетельствует о сохранении радиационно-индуцированных структурных мутаций в соматических клетках в отдаленный период после облучения и их зависимости от величины поглощенных доз, полученных в разные годы работы в зоне аварии.

Впервые изучены основные закономерности динамики частоты стабильных и нестабильных аберраций хромосом в отдаленные сроки (10 - 52 лет) после неконтролируемого острого облучения в высоких дозах (1,1 - 9,8 Гр), вызвавших ОЛБ различной степени тяжести. Выявлена повышенная частота нестабильных и стабильных аберраций хромосом. При этом маркеры радиационного воздействия (дицентрики и центрические кольца) в большинстве случаев сопровождались сопутствующими парными фрагментами, по-видимому, за счет субпопуляции долгоживущих лимфоцитов в периферической крови. Выявлена корреляция частоты стабильных аберраций (аномальные моноцентрики и транслокации) со степенью тяжести ОЛБ, что позволяет, в ряде случаев, ретроспективно оценить диапазон поглощенных доз с помощью биологической дозиметрии в отдаленные пострадиационные сроки. Обнаружено повышение уровня аномальных моноцентриков у лиц с высокой степенью ОЛБ со временем после облучения, что увеличивает вероятность образования клоновых аберраций, потенциально являющихся источником малигнизации клеток.

Практическая значимость результатов.

Полученные результаты расширяют представление о пострадиационном проявлении мутагенного эффекта радиации в соматических клетках человека, а также обосновывают необходимость систематического цитогенетического обследования лиц, подвергшихся облучению в высоких дозах, для выяснения закономерностей динамики частоты как стабильных, так и нестабильных аберраций в отдаленном пострадиационном периоде. Результаты исследования в целом имеют не только теоретическое, но и практическое значение для формирования групп риска развития отдаленной постлучевой патологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на практической конференции Ликвидация последствий загрязнения радионуклидами территории Калужской области в результате аварии на Чернобыльской АЭС, (Калуга, 1992); международном семинаре Проблемы смягчения последствий Чернобыльской катастрофы (Брянск, 1993); международном конгрессе Энергетика-3000 (Обнинск,1998); международном экологическом конгрессе Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности, (Санкт-Петербург, 2000); международной конференции Энергетика-3000 (Обнинск, 2000); научно-практической конференции Наследие Чернобыля (Калуга 2001); международной конференции Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций, (Москва, 2002); международной конференции Genetic Consequences of Emergency Radiation SituationsФ. - Russian Federation (Dubna, 2005); V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006); 2nd International Conference on Biodosimetry and 7th Internat.. Symposium on ESR Dosimetry and Applications, (USA, 2006); III международной конференции Радиоактивность и радиоактивные элементы в среде обитания человека (Томск, 2009); V съезде Радиобиологического общества Украины (Ужгород, 2009); VI съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010); научной конференции Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии (Санкт-Петербург, 2011).

Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального радиологического сектора ФГБУ МРНЦ РФ 01 июня 2011 г (протокол № 260).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 статья, из них 17 в российских и зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК, 4 статьи в отечественных сборниках, а также 16 тезисов докладов в материалах отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 193 страницах, включая 24 рисунка и 19 таблиц, и состоит из введения, восьми глав: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты цитогенетического обследования 5-и групп пострадавших, Обсуждение результатов, выводов и списка литературы, включающего 94 отечественных и 176 зарубежных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованные группы лиц. Материалом для исследования являлись лимфоциты периферической крови лиц, пострадавших в различных аварийных радиационных ситуациях:

  • когорта ликвидаторов (1010 человек), подвергшихся пролонгированному низко-дозовому облучению при работе в 30-километровой зоне ЧАЭС в 1986-1989 гг., обследование которых проводилось в отдаленные сроки после аварии (1 - 6 лет).
  • ица, подвергшиеся острому неконтролируемому облучению в высоких дозах (1,1 - 9,8 Гр), вызвавших у них развитие острой лучевой болезни различной степени тяжести. Эта группа объединяет 10 ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС; 22 военнослужащих атомных подводных лодок, 5 человек, пострадавшие при испытаниях ядерного оружия на полигонах Семипалатинска и Новой Земле; 11 человек, пострадавшие при работе с промышленными радиоактивными источниками. Обследование пострадавших проводилось в отдаленный пострадиационный период (10 - 52 лет)
  • в качестве контрольных групп было обследовано 99 человек среднего возраста 38,5 лет из Брянской области и 10 человек из числа ветеранов ВМФ среднего возраста 44,7 лет.

Методика культивирования лимфоцитов крови и приготовление препаратов хромосом.

Кровь отбирали из локтевой вены обследуемых лиц и помещали в пробирку с раствором гепарина (200 ЕД/мл крови). В стерильных условиях 0,8 мл крови переливали во флаконы Карреля с культуральной средой следующего состава: 6,16 мл среды МЕМ; 1,6 мл инактивированной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл антибиотика; 0,15 мл фитогемагглютинина. Инкубация клеток проводилась в термостате при 37оС в течение 48 ч. Для блокирования митозов на стадии метафазы за 2 ч до окончания инкубации во флаконы добавляли демеколцин 0,2 мкг/мл среды. По окончании инкубации культуру клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли, добавляли гипотонический раствор (0,75 М KCl) и выдерживали на водяной бане при 37оС (10-12 мин). По окончании гипотонизации вновь центирфугировали, с последующим удалением надосадочной жидкости. Фиксацию клеток проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Смену фиксатора проводили трижды. Препараты готовили непосредственно после окончания фиксации. Для анализа по стандартному методу препараты гидролизовали в 5N-ном р-ре HCl (10 мин) и окрашивали по методу Гимза.

Для выявления стабильных аберраций хромосом по методу FISH использовались два набора зондов в соответствии с прилагаемым протоколом: прямомеченные зонды на хромосомы 2, 4 и 12, составляющие 19% генома и непрямомеченные на хромосомы 2, 3 и 8, составляющие 14,9% генома. При работе с непрямомеченными зондами использовалась смесь биотинилированных (через PCR) ДНК зондов. Предварительно слайды обрабатывали РНКазой (100 мкг/мл в 2хSSC) в течение 1 ч при 370С. Денатурация слайдов и зондов проводилась раздельно, согласно методическим рекомендациям фирмы. Денатурацию ДНК на слайде проводили при 800С (4 мин) в растворе: 70% деионизированного формамида, 2хSSC и 10 мМ фосфатного буфера (рН=7,0). Далее проводилась отмывка в серии спиртов: 70%, 80%, 100%. Денатурацию хромосомных ДНК зондов проводили при 700С (5 мин) в гибридизационном буфере, затем помещали в ледяную воду (5 мин) и в водяную баню при 370С (45 мин). Слайд со смесью ДНК зондов под покровным стеклом помещали для гибридизации в термостат (37оС) на ночь. Далее отмывали в 50% формамиде, затем в 0,1хSSC и в 0,05% Tween 20. Для выявления зондов проводили иммунохимическое окрашивание с помощью FITS-Avidin D и Anti-Avidin D и наносили PI.

Для прямомеченных зондов перед гибридизацией проводили аналогичную предварительную обработку слайдов согласно рекомендациям фирмы. Денатурация осуществлялась в автоматической камере Hybrite при 74оС в течение 4 мин. Гибридизация  проходила  при  37оС  в термостате в течение 18 ч. После серии отмывок на второй день наносили DAPI.

Анализ нестабильных и стабильных аберраций хромосом.

Анализ нестабильных аберраций хромосом проводили на световом микроскопе под иммерсией 90х10. На каждую точку анализировали от 250 до 1000 метафаз. Анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования. Из нестабильных аберраций хромосомного типа - ацентрические фрагменты (парные и точковые), центрические кольца и дицентрики с сопутствующими парными фрагментами. Из аберраций хроматидного типа учитывали ацентрические фрагменты (одиночные и парные) и обменные аберрации (в целом). Стандартный метод метафазного анализа позволяет регистрировать и определенную часть стабильных аберраций - аномальные моноцентрики, являющиеся в подавляющем большинстве случаев реципрокными транслокациями.

Стабильные аберрации, окрашенные по методу FISH - транслокации (полные и неполные), инверсии и инсерции -  анализировали на флуоресцентном микроскопе фирмы Zeiss с дуальным фильтром, специфичным для FITC и PI, а также DAPI. На каждую точку анализировали от 234 до 3542 метафаз на каждого обследуемого. При регистрации аберраций хромосом использовалась классификационная система PAINT (Protocol of Aberration Identification and Nomenclature Terminology). Общая частота транслокаций для всего генома определялась по специальной формуле (Lucas et al., 1992), которая предполагает равновероятное участие хромосом в обменных перестройках в соответствии с количеством содержащейся в них ДНК:

Fg - частота транслокаций на весь геном;

Fp - частота обнаруженных транслокаций в части генома;

fp - фракция генома, включенная в анализ.

Статистическая обработка результатов выполнена стандартными методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ  И  ОБСУЖДЕНИЕ

1. Результаты цитогенетического наблюдения ликвидаторов, подвергшихся пролонгированному низко-дозовому облучению

1.1. Характеристика группы ликвидаторов

Однократное цитогенетическое обследование ликвидаторов, участвовавших в спасательно-восстановительных работах в 1986-1988 гг., проведено с 1990 по 1992 гг. после аварии на Чернобыльской АЭС. На момент проведения восстановительных работ возраст большинства обследованных лиц (в среднем 82,8%) составлял 19 - 40 лет. Ликвидаторы подвергались пролонгированному или фракционированному низко-дозовому радиационному воздействию, в основном, γ-β излучения. Из когорты лиц, представленных в данном исследовании, только 645 человек (64%) имели официально зарегистрированную поглощенную дозу облучения, которая составляла в среднем по группе 25,3; 9,7; 4,8 и 1,0 сГр в 1986, 1987, 1988 и 1989 гг. работы в 30-км зоне, соответственно. При этом у лиц с известной и неизвестной дозовой нагрузкой в группах ликвидаторов 1986 и 1988 гг. не отмечалось статистически значимого различия по всем цитогенетическим показателям, за исключением ликвидаторов 1987 г. работы, что позволило объединить данные частоты аберраций с целью объективности статистики.

1.2. Влияние радиационного фона в зоне аварии в 1986 г. на частоту аберраций хромосом

Проведен сравнительный анализ цитогенетических показателей 2-х подгрупп ликвидаторов, работавших в первой (конец апреля - август) и второй (сентябрь - декабрь) половине 1986 г. Данные, полученные через 4 - 6 лет после окончания работ показали, что средняя частота маркеров радиационного воздействия (дицентрики и центрические кольца) в обеих подгруппах была одинаковой - 0,21/100 клеток. Не наблюдалось достоверных различий и по частоте ацентрических фрагментов (0,53 и 0,55/100 клеток) Незначительно различалась частота аберраций хроматидного типа, составляя 1,01 и 0,80/100 клеток у ликвидаторов 1-ой и 2-ой половины 1986 г., соответственно. Отсутствие достоверного различия в частоте нестабильных аберраций, вероятно, объясняется тем, что дозы радиационного воздействия, полученные ликвидаторами в первые месяцы после аварии, определялись с высокой степенью погрешности, которая составляла в зависимости от использованного метода от 50 до 500% [Иванов, 1999].

1.3. Частота нестабильных аберраций хромосом у ликвидаторов разных лет работы в зоне аварии

С учетом изменяющейся радиационной обстановки в зоне лотчуждения в последующие годы после аварии проведен сравнительный анализ частоты нестабильных аберраций хромосом у ликвидаторов разных лет участия в спасательно-восстановительных работах. Практически во всех тестируемых группах ликвидаторов наблюдался достоверно (р<0,05) повышенный уровень аберраций хромосомного и хроматидного типа по сравнению с контролем. Наиболее высокая частота хромосомных аберраций наблюдалась у ликвидаторов 1986 г. Средне-групповая частота дицентриков и центрических

колец (таблица 1) снижалась у ликвидаторов каждого последующего года работы (1987-1989 гг.) после аварии - на 35%, 23% и 62%, соответственно.

Таблица 1. Средне-групповая частота нестабильных аберраций хромосом у                        ликвидаторов 1986-1989 гг. через 1 - 6 лет после аварии

Год участия

Число обследо-ванных лиц

Всего клеток

Частота аберраций хромосом на 100 клеток ± m

ацентрич. фрагмент.

дицентрики+центрические кольца

всего хромосомн. аберраций

всего хроматидных аберраций

1986

694

124848

0,54±0,02

0,26±0,01

0,68±0,02

0,87±0,03

1987

206

37110

0,35±0,03*

0,17±0,02*

0,52±0,04*

0,79±0,05

1988

93

16844

0,54±0,06

0,20±0,03*

0,71±0,07

0,99±0,08

1989

16

3003

0,33±0,1*

0,10±0,06*

0,43±0,1*

1,1±0,2*

контроль

99

36992

0,22±0,02

0,06±0,01

0,29±0,03

0,36±0,03

* - достоверное (р<0,05) отличие от цитогенетических показателей ликвидаторов 1986 г. участия в работах

В данной работе отмечалась повышенная средне-групповая частота ацентрических фрагментов и аберраций хроматидного типа (в контроле 0,22 и 0,36/100 клеток, соответственно) за весь период обследования, что может свидетельствовать, как и в других исследованиях, о снижении активности систем репарации в лимфоцитах периферической крови облученного организма (Сл озина и соавт., 2002; Norp pa et al., 2006; Wa nhua et al., 2002).

1.4. Зависимость частоты аберраций хромосом от пострадиационного периода

       Пострадиационный интервал времени начала обследования составил 4-6 лет для ликвидаторов 1986 г. въезда в зону аварии, 3-5 лет для ликвидаторов 1987 г. и 2-3 года - для ликвидаторов 1988 г. работы. Цитогенетическое обследование ликвидаторов 1986 и 1987 гг. на протяжении 3-х последовательных лет (1990-1992 гг.) свидетельствовало о снижении уровня лимфоцитов с нестабильными аберрациями в среднем на 25-30% в каждый из последующих лет наблюдения (таблица 2).

Таблица 2. Зависимость частоты аберраций хромосом (на 100 клеток± m) в                        лимфоцитах крови ликвидаторов от пострадиационного интервала                времени.

Год въезда

Год взятия образца крови

Число

обсле-дован-ных лиц

Всего клеток

Частота нестабиль-ных клеток

Частота хромосомных аберраций на 100 кл

Частота хроматидн.

аберраций

ацентрич.

фрагменты

дицентрик+

центрич кольца

1986

1990

48

6454

1,04±0,1

0,81±0,11

0,26±0,1

1,64±0,2

1991

495

92337

0,8±0,03

0,56±0,02″

0,22±0,02

0,86±0,03″

1992

151

26057

0,55±0,05

0,4±0,04″

0,15±0,02″

0,62±0,05″

1987

1990

21

2600

0,88±0,2

0,73±0,2

0,17±0,1

1,54±0,2

1991

143

26821

0,59±0,05

0,35±0,04

0,18±0,03

0,83±0,1″

1992

46

8008

0,41±0,07

0,26±0,06″

0,11±0,04

0,46±0,08″

1988

1990

16

2500

0,80±0,18

0,68±0,16

0,12±0,07

1,24±0,22

1991

74

13926

0,77±0,1

0,53±0,1

0,21±0,04

0,95±0,08

контр.

99

36992

0,22±0,02

0,06±0,01

0,36±0,03

″ - достоверное отличие от первичного взятия образцов крови в пределах одного года въезда в зону лотчуждения

Статистический анализ данных, полученных через одинаковый промежуток времени после облучения для ликвидаторов разных лет работы выявил зависимость частоты цитогенетических показателей от величины поглощенной дозы. Так, через 4 г. после работы в 30-км зоне частота лимфоцитов с нестабильными аберрациями составляла 1,04 и 0,59/100 клеток у ликвидаторов 1986 и 1987 гг., соответственно. Через 5 лет после аварии частота этих лимфоцитов также наблюдалась в 2 раза выше у ликвидаторов 1986 г. по сравнению с ликвидаторами 1987 г.  работы, составляя 0,8 и 0,41/100 клеток, соответственно.

Во всех обследованных группах отмечалось снижение частоты нестабильных аберраций хромосом с увеличением интервала времени после облучения. У ликвидаторов 1986 г. работы средняя частота маркеров радиационного воздействия (дицентрики и центрические кольца) снизилась на 42%, частота ацентрических фрагментов - на 51%, а частота хроматидных аберраций - на 62% за пострадиационный период наблюдения (4 - 6 лет).

У ликвидаторов 1987 г. работы частота дицентриков и центрических колец снизилась на 35%, частота ацентрических фрагментов - на 54%, частота аберраций хроматидного типа - на 70% за период наблюдения от 3 до 5 лет после облучения.

иквидаторы 1988 г. работы обследовались дважды - в 1990 и 1991 гг. Достоверного различия по частоте всех типов аберраций хромосом в эти пострадиационные сроки не обнаружено, что может быть вызвано малочисленностью группы ликвидаторов, обследованной в 1990 г.

Средне-групповая частота стабильных аберраций хромосом (аномальные моноцентрики) достоверно (р<0,05) превышала контрольный показатель (0,01/100 клеток), составляя 0,05 - 0,06/100 клеток и практически не зависела от пострадиационного периода наблюдения во всех обследованных группах ликвидаторов (1986 - 1988 гг.). Повышенный уровень стабильных аберраций в лимфоцитах крови ликвидаторов отмечался также в отдаленные сроки после облучения авторами (Za ire et al., 1996; Pilins kaya et al., 1996; Sal omaa et al., 1997). К моменту взятия образцов крови для цитогенетического анализа (через 1 - 6 лет после облучения) из периферического русла элиминировала большая часть лимфоцитов, содержащих одновременно нестабильные и стабильные аберрации. Поэтому выявленные аберрации нестабильного и стабильного типа могут быть не только радиационно-индуцированными, но и наблюдаться в лимфоцитах, поступающих из стволовых клеток. Это подтверждает наличие незначительной части дицентриков и колец без сопутствующих парных фрагментов (~ 11%), которые потерялись в процессе многократного деления предшественников лимфоцитов.

Повышенная частота аберраций хромосом, особенно стабильного типа, в течение длительного пострадиационного периода может свидетельствовать о различных функциональных сдвигах в соматических клетках, что определяет снижение качества жизни и повышает риск развития соматических заболеваний, а также злокачественного перерождения клеток (Красавин и др., 2004; Воробцова и др., 2006; Неронова и др., 2008).

2. Результаты цитогенетического наблюдения лиц, пострадавших при внештатном остром облучении в высоких дозах

2.1. Характеристика обследованных групп

Первую группу Л составили ликвидаторы (10 человек) последствий аварии на ЧАЭС, среднего возраста 35 - 58 лет на момент первого взятия образца крови. Цитогенетическое обследование проводилось периодически на протяжении от 10 до 25 лет после острого, относительно равномерного γ-, γ-β-облучения. При этом не исключается вероятность и внутреннего облучения от инкорпорированных радионуклидов (239-240Pu, 241Am), а также ингаляции радиоактивных изотопов йода в первые дни после аварии, зарегистрированных в 30-км зоне ЧАЭС (Пит кевич, 1995). В связи с отсутствием дозиметрических данных у обследованных лиц, доза облучения определялась у них по гематологическому тесту (числу нейтрофилов) и цитогенетическому (частоте дицентриков в лимфоцитах крови), наблюдаемым в ранний период после радиационного воздействия, частота которых, как известно, зависит от дозы острого облучения [Sev ankaev, 2005]. По этим двум тестам дозы общего облучения для ликвидаторов были относительно близкими. У 3-х человек оценка дозы облучения была проведена дополнительно в пострадиационный период по спектроскопии эмали зубов (ЭПР). По ранним клиническим проявлениям для каждого из обследованных ликвидаторов была определена степень тяжести острой лучевой болезни (1 человек с ОЛБ-I, 5 - с ОЛБ-II, 3 - с ОЛБ-III и 1 - с  ОЛБ-IV степени).

Вторую группу В представляют военнослужащие (22 человека) атомных подводных лодок (АПЛ), пострадавшие в результате радиационных аварий, произошедших на АПЛ в море (1961, 1968 и 1979 гг.) и у берега во время проведения ремонтных работ (1985 г.). Каждая авария имела особенности развития, обуславливающие и разную радиационную обстановку на аварийных объектах: аварии 1961, 1968 и 1979 гг. происходили в замкнутом пространстве отсеков лодки, а следовательно, характеризовались повышенным общим радиационным фоном γ - β, - - n-излучения, осложненным повышенной температурой и влажностью, что еще более усиливало радиационное поражение. Для одного подводника, пострадавшего в другой аварии в 1961 г., условия радиационной обстановки неизвестны. По условиям формирования радиационной обстановки на объекте и вокруг него авария 1985 г. была сходна с аварией на Чернобыльской АЭС. В обоих случаях контингент подвергался воздействию преимущественно смешанного поля --излучения.

Оценка дозы облучения подводников была определена у всех лиц по физическим параметрам, у некоторых по гематологическому и цитогенетическому тестам в остром периоде и по ЭПР эмали зуба в отдаленные сроки после облучения. Также практически у всех лиц определена доза облучения по частоте транслокаций в отдаленные пострадиационные сроки. В целом отмечались значительные различия в оценке поглощенной дозы этими методами. По ранним клиническим проявлениям для каждого из обследованных лиц установлена степень тяжести радиационного поражения (3 человека с лучевой реакцией, 15 - с ОЛБ-I, 3 - с ОЛБ-II и 1 - с ОЛБ-III степени). Цитогенетическое обследование проводилось для большинства лиц данной группы однократно через 16, 22, 33 и 40 лет после облучения. Только для одного подводника выполнено многократное наблюдение в отдаленные сроки после облучения (40 - 51 лет). Возраст подводников на момент взятия образцов крови составлял от 37 до 74 лет.

Третью группу П представляют пострадавшие при испытании ядерного оружия на военных полигонах Новая Земля и Семипалатинск (5 человек). Все пострадавшие подверглись острому, относительно равномерному γ-β-облучению. Дозы облучения, также оцененные в острый период по частоте дицентриков и нейтрофилам, были относительно близкими. У 2-х человек оценка дозы облучения была проведена дополнительно в пострадиационный период по спектроскопии эмали зубов (ЭПР). По ранним клиническим проявлениям для каждого из обследованных лиц была определена степень тяжести острой лучевой болезни (4 человека с ОЛБ-I и 1 - с ОЛБ-II степени). Цитогенетическое наблюдение осуществлялось на протяжении периода от 27 до 44 лет после облучения. Возраст обследованных лиц на момент первого взятия образцов крови составлял 55-68 лет.

Четвертую группу И представляют пострадавшие при остром внештатном γ-, β-γ- или γ--облучении (для 2-х человек характер облучения неизвестен) от промышленных радиоактивных источников (11 человек). Поглощенные дозы были определены для некоторых лиц по частоте дицентриков и нейтрофилам. По ранним клиническим проявлениям для каждого из обследованных лиц была определена степень тяжести острой лучевой болезни (5 человек c ОЛБ-I, 3 - с ОЛБ-II и 3 - с ОЛБ-III степени). Цитогенетическое обследование начато в различные интервалы времени после облучения. В относительно поздний пострадиационный период (1 - 3 лет) наблюдались 2 человека. Для остальных 9 пострадавших обследование начато через 18 - 43 г.  после облучения. Возраст обследованных лиц на момент взятия образца крови составлял 23 - 67 лет.

Контролем для групп Л, П и И служили цитогенетические показатели, полученные у 99 человек в возрасте 20-65 лет из Почепского района Брянской области. Для группы В контролем был уровень хромосомных аберраций, изученный в группе ветеранов ВМФ (10 человек) в возрасте от 56 до 72 лет на момент обследования, прослуживших 5Ц7 лет на АПЛ аналогичных проектов, но не подвергавшихся аварийному облучению.

2.2 Нестабильные аберрации хромосом

Изменение общей частоты нестабильных аберраций хромосом у всех неоднократно обследованных лиц носило волнообразный характер. При этом в каждый год наблюдения, за исключением отдельных случаев, эти цитогенетические показатели превышали контрольный уровень (0,29/100 клеток, у подводников - 0,52/100 клеток) и не зависели от степени тяжести ОЛБ.

Среди аберраций нестабильного типа наибольший интерес представляют маркеры радиационного воздействия - дицентрики и центрические кольца, частота которых также имела несистемный характер при неоднократном наблюдении и превышала контрольный уровень (0,06/100 клеток, у подводников -  0,04/100 клеток) в большинстве случаев обследования во всех представленных группах.

В группе Л на протяжении всего периода исследования (от 10 до 25 лет после облучения) средняя частота этих аберраций варьировала в диапазоне от 0 до 1,2/100 клеток у лиц с низкой степенью тяжести ОЛБ-I; от 0 до 6,0/100 клеток при более высокой степени тяжести ОЛБ-II; от 0,2 до 2,8/100 клеток при высокой степени тяжести ОЛБ-III и от 0,6 до 5,1/100 клеток при ОЛБ-IV степени. Причем среди лиц с одинаковой степенью тяжести ОЛБ-II степени у одного ликвидатора отмечались более высокие показатели частоты дицентриков и колец, что может быть отражением индивидуальной повышенной степени протекания мутационного процесса в лимфоцитах периферической крови и не противоречит мнению авторов (George et al., 2005). Не исключается также и внутреннее облучение от инкорпорированных долгоживущих радионуклидов (Vokurkova et al., 2006). У другого ликвидатора, наоборот, наблюдалась более низкая частота дицентриков и центрических колец. Вероятно, в данном случае большее значение имеет не столько индивидуальная радиочувствительность, сколько характер облучения. По данным авторов (Sevankaev et al., 2005) этот ликвидатор подвергался пролонгированному облучению, при котором возможна частичная репарация структурных повреждений хромосом. К тому же оценка дозы облучения по биологическим тестам - гематологический (по нейтрофилам) и цитогенетический (по частоте дицентриков) в острый период после облучения, для этого ликвидатора составила 1,4 и 1,6 Гр, соответственно, что также соответствует легкой степени тяжести ОЛБ.

У подводников (группа В) при всех сроках пострадиационного наблюдения (16 - 51 лет) частота дицентриков и колец наблюдалась на более низком уровне: у лиц с диагнозом ЛР - от 0,1 до 0,4/100 клеток; от 0,2 до 1,0/100 клеток при низкой степени тяжести ОЛБ-I; от 0,1 до 1,4/100 клеток при ОЛБ-II и от 0,4 до 0,5/100 клеток при высокой степени тяжести ОЛБ-III степени. В обследованной группе лиц не выявлено зависимости частоты дицентриков и центрических колец от сроков пострадиационного наблюдения (рис. 1). При этом необходимо отметить, что практически для всех подводников проводилось однократное обследование, в то время как такие же низкие показатели частоты этих аберраций периодически отмечались и у ликвидаторов. С другой стороны, для большинства лиц группы В был поставлен диагноз ОЛБ легкой степени тяжести, который скорее свидетельствовал об общей реакции организма на весь комплекс факторов сочетанного облучения, воздействовавший на подводников в период аварии (Сидоров, 2004).

Рис. 1. Индивидуальная частота дицентриков у лиц, пострадавших при радиационных авариях на АПЛ, в зависимости от времени после облучения.

У пострадавших двух других групп - П и И также наблюдался более низкий уровень вариабельности частоты дицентриков и центрических колец по сравнению с группой Л. У лиц группы П, обследованных в период от 31 Цдо 52 лет после облучения, при низкой степени тяжести ОЛБ-I степени частота этих маркерных аберраций колебалась в диапазоне от 0 до 1,6/100 клеток, при более высокой степени тяжести ОЛБ-II степени - от 0,3 до 1,0/100 клеток. У пострадавших группы И, обследованных в отдаленные сроки после различных радиационных инцидентов (18 до 51 лет), при низкой степени тяжести ОЛБ-I частота дицентриков и центрических колец варьировала в диапазоне от 0 до 1,0/100 клеток; при более высокой ОЛБ-II - от 0 до 1,8/100 клеток и от 0,4 до 1,2/100 клеток при ОЛБ-III степени. Сравнительно низкая частота  дицентриков и колец, по отношению к ликвидаторам, вероятно, объясняется более отдаленными сроками пострадиационного наблюдения пострадавших из групп В, П, И.

В целом, полученные результаты свидетельствовали об отсутствии зависимости частоты дицентриков и колец от степени тяжести радиационного поражения у всех обследованных лиц в отдаленный пострадиационный период.

Повышенная, по сравнению с контрольным уровнем, частота дицентриков и центрических колец за период пострадиационного наблюдения может быть результатом выхода аберраций из поврежденных гемопоэтических стволовых клеток - предшественников лимфоцитов и свидетельствует о дефекте восстановления нарушений кроветворного стволового пула (Crompton et al., 1998; Пилинская и др., 2001). Причем эти дицентрики и кольца наблюдаются без сопутствующих парных фрагментов, которые теряются в процессе цикла клеточных делений при выходе в циркулирующую кровь, вследствие образования мостов в анафазе при расхождении к разным полюсам веретена центромерных участков дицентрических хромосом. В данном исследовании частота таких дицентриков и центрических колец составляла от 8% до 25% от общего числа этих аберраций. Большая часть дицентриков и центрических колец, выявленных в лимфоцитах периферической крови обследованных лиц, сопровождались, как правило, сопутствующими парными фрагментами. Эти маркеры радиационного воздействия, вероятно, могли находиться в субпопуляции долгоживущих лимфоцитов. Нельзя исключать и формирование их de novo в результате радиационно-индуцированной нестабильности генома, молекулярными проявлениями которой, по мнению авторов (Mazurik et al, 2006), являются изменения окислительно-восстановительного гомеостаза, структуры ДНК и ее репарации в отдаленные сроки после острого облучения в высоких дозах.

Неоднократное наблюдение многих пострадавших из представленных групп свидетельствовало о постепенном снижении частоты дицентриков и центрических колец в исследованные сроки после облучения. У лиц с различной степенью тяжести ОЛБ уровень этих аберраций либо сближался, что отмечалось также в работах (Ram alho et al., 1995; Нугис и др., 2006), либо частота дицентриков и колец варьировала в среднем на одном повышенном уровне за весь период исследования (рис. 2, 3).

Рис. 2. Динамика частоты дицентриков и центрических колец у ликвидаторов с         ОЛБ I-IV степени тяжести в отдаленный пострадиационный период (10         - 24 лет).

Рис. 3. Динамика частоты дицентриков и центрических колец в отдаленный пострадиационный период у лиц, подвергшихся внештатному облучению от промышленных источников излучений

У всех пострадавших лиц анализировали также частоту ацентрических фрагментов и аберраций хроматидного типа, которая изменялась волнообразно при неоднократном наблюдении и превышала контрольный уровень (0,22; у подводников - 0,47 и 0,36; у подводников - 0,99 на 100 клеток, соответственно) в большинстве случаев. При этом независимо от степени тяжести ОЛБ и сроков пострадиационного обследования, у одних лиц отмечалась тенденция к снижению частоты ацентрических фрагментов и хроматидных аберраций, у других, наоборот, тенденция к повышению частоты этих аберраций. По-видимому, это объясняется, прежде всего, дополнительным воздействием каких-либо мутагенных факторов нерадиационной природы - курение, перенесенные инфекционные заболевания и их лечение химиопрепаратами и др. (Пилинская и др., 1992; Слозина и др., 2002; Мазник и др., 2004; Нугис и др., 2006). Можно также предположить снижение активности систем репарации в клетках и развитие радиационно-индуцированной нестабильности генома у облученных лиц (Surr alles et al., 1998).

2.3. Стабильные аберрации хромосом

2.3.1. Частота аномальных моноцентриков

При стандартной окраске хромосом, практически у всех обследованных лиц, в спектре аберраций хромосомного типа наблюдалось некоторое число стабильных аберраций хромосом - аномальных моноцентриков, которые являются преимущественно симметричными транслокациями. Выявляемость аномальных моноцентриков при окраске хромосом лимфоцитов крови по Гимза составляет до 50% (Ohtaki et al., 1982). Частота этих аберраций в группах Л, П, И сравнивалась с контрольным уровнем (0,01/100 клеток, полученным при анализе 30 тыс. метафаз клинически здоровых лиц (Севанькаев, 1974) и превышала его более чем в 20 раз. В группе В только у 9 однократно обследованных подводников частота этих аберраций наблюдалась выше собственного контрольного показателя (0,14/100 клеток).

У лиц группы Л частота аномальных моноцентриков колебалась в диапазоне 0,2 - 1,6/100 клеток при низкой степени тяжести ОЛБ-I, при более высокой степени тяжести ОЛБ-II - от 0,4 до 5,8/100 клеток. Еще более широкий диапазон вариабельности частоты этих аберраций отмечался у лиц с высокой степенью тяжести -  от 0,2 до 14,0/100 клеток при ОЛБ-III и от 3,2 до 20,7/100 клеток при ОЛБ-IV степени. Следует заметить, что у ликвидатора с ОЛБ-II степени, имевшего относительно низкую частоту дицентриков и колец, частота аномальных моноцентриков также наблюдалась на более низком уровне по сравнению с другими ликвидаторами аналогичной степени тяжести радиационного поражения.

Практически одинаковые условия облучения лиц группы В и относительная стабильность частоты аномальных моноцентриков со временем позволили оценить уровень этих аберраций в целом при всех сроках пострадиационного наблюдения подводников (16, 22, 33 и 40 лет). Полученные результаты свидетельствовали, что при однократном цитогенетическом обследовании лиц с диагнозом ЛР и ОЛБ-I степени индивидуальная частота аномальных моноцентриков колебалась от 0,1 до 0,3/100 клеток  и от 0,1 до 0,7/100 клеток, соответственно. У лиц с более высокой степенью тяжести ОЛБ-II степени частота этих аберраций наблюдалась в диапазоне от 0,5 до 0,9/100 клеток, а у лиц с высокой степенью тяжести ОЛБ-III степени  составляла 3,7 - 3,8/100 клеток. У неоднократно обследованного подводника с ОЛБ-II степени частота аномальных моноцентриков варьировала в диапазоне 1,0 - 6,3/100 клеток, что соответствовало этим цитогенетическим показателям у пострадавших с аналогичной степенью тяжести в группе Л.

В группе П у лиц с ОЛБ-I степени  частота аномальных моноцентриков колебалась в диапазоне от 0,6 до 1,2/100 клеток. Более высокий уровень вариабельности частоты этих аберраций отмечался у пострадавшего с ОЛБ-II степени - от 2,0 до 7,0/100 клеток Эти показатели вполне соответствовали частоте аномальных моноцентриков, наблюдаемых у ликвидаторов и неоднократно обследованного подводника с аналогичной степенью тяжести радиационного поражения.

У лиц с низкой степенью тяжести ОЛБ-I степени  из группы И частота аномальных моноцентриков варьировала практически в таком же диапазоне - от 0,4 до 1,4/100 клеток, как и у пострадавших с аналогичной степенью тяжести радиационного поражения из представленных выше групп. При более высокой степени тяжести ОЛБ-II степени частота аномальных моноцентриков отмечалась в диапазоне от 0 до 2,6 на 100 клеток.  У лиц с ОЛБ-III степени отмечались еще более высокие показатели частоты этих аберраций, которая варьировала в диапазоне от 0,4 до 6,2 на 100 клеток.

Полученные в целом результаты свидетельствовали о корреляции уровня вариабельности частоты аномальных моноцентриков со степенью тяжести радиационного поражения обследованных лиц.

При неоднократном обследовании пострадавших из всех представленных групп отмечалась либо тенденция к повышению частоты аномальных моноцентриков со временем после облучения, либо частота этих аберраций варьировала в среднем на одном уровне на протяжении пострадиационного периода наблюдения (рис. 4, 5).

Рис. 4. Динамика частоты аномальных моноцентриков у ликвидаторов с ОЛБ I-         IV степени в отдаленный пострадиационный период (10 - 24 лет).

Рис. 5. Динамика частоты аномальных моноцентриков в отдаленный период после облучения у лиц, подвергшихся внештатному облучению от промышленных источников излучений.

Повышение уровня аномальных моноцентриков может быть результатом образования клоновых перестроек хромосом, что подтверждается данными авторов (Kreja et al., 1999), наблюдавших клоновые хромосомы в колониях гемопоэтических стволовых клеток через 25 лет после радиационного инцидента. В нашем исследовании через 21Ц24 г после острого облучения у 5-и ликвидаторов с высокой степенью тяжести ОЛБ наблюдалась перестройка хромосомы 22 (del 22q), характерная для хронического миелолейкоза. Частота клеток с этой хромосомой составляла от 0,1% до 19,5% у лиц с ОЛБ II - IV степени. У одного из ликвидаторов с ОЛБ-III степени 1,1% лимфоцитов периферической крови имели клоновую транслокацию t (9; 22). Делетированная хромосома 22 (Филадельфийская хромосома) была отмечена у ликвидаторов и другими авторами (Salassidis et al., 1995; Zitzelsberger et al., 1998; Jonson et al., 1999) в отдаленные сроки после аварии на ЧАЭС. Выявить какие-либо другие клоновые перестройки при окраске хромосом по методу Гимза не представлялось возможным. При цитогенетическом наблюдении в такой отдаленный пострадиационный период, как представленное исследование, определенную роль в повышении частоты стабильных аберраций имеет и возраст обследованных лиц. Как известно, функциональные возможности клеток (репарация, поддержание стабильности генома и др.) снижаются с увеличением возраста, поэтому спонтанно возникающие перестройки клонового происхождения наблюдали как с увеличением возраста человека (Lucas et al., 1999), так и в процессе старения необлученных животных (Spruill et al., 2000).

2.3.2. Частота транслокаций

Для анализа частоты стабильных аберраций, выявляемых FISH-методом (транслокаций), в качестве контрольного уровня использовали данные литературы обследования населения (20 - 80 лет), согласно которым частота этих аберраций варьировала от 0,2 до 1,5/100 клеток/геном, что в среднем составило 0,85/100 клеток/геном (Edwards et al., 2005). В контрольной группе подводников частота транслокаций составляла 0,9/100 клеток/геном. Полученные данные частоты транслокаций в лимфоцитах крови пострадавших в группах Л, П и И свидетельствовали о превышении контрольного уровня этих аберраций у всех обследованных лиц более, чем в 4 раза в отдаленные пострадиационные сроки. В группе В частота транслокаций достоверно (р<0,05) превышала контрольный показатель только у 12 человек (из 22 обследованных). При сравнительном анализе частоты стабильных аберраций, выявленных стандартным методом (аномальные моноцентрики) и FISH-методом (транслокации) наблюдалось превышение общей частоты транслокаций от 1,3 до 100 раз частоты аномальных моноцентриков в зависимости от степени тяжести ОЛБ.

Для всех обследованных лиц наблюдалась общая закономерность, проявляющаяся в корреляции частоты транслокаций со степенью тяжести ОЛБ, что отмечалось в разные отдаленные сроки после острого облучения и другими авторами (Мазурик и др., 2006; Salassidis et al., 1994; George et al., 2005). В группе Л при низкой степени тяжести ОЛБ-I степени  частота транслокаций варьировала от 8,1 до 9,4/100 клеток/геном. Среди пострадавших с более высокой степенью тяжести ОЛБ-II степени  частота этих аберраций колебалась в диапазоне 8,3 - 39,4/100 клеток/геном. Причем, вновь у одного из них частота этих аберраций превышала средне-групповой показатель, что, по-видимому, является проявлением индивидуальной радиочувствительности и не противоречит мнению авторов (Bauchinger et al., 1989; Natarajan et al., 1998; Tucker et al., 2005).У другого, наоборот, более низкий уровень транслокаций, как и рассмотренных выше дицентриков и аномальных моноцентриков вероятно, является результатом пролонгированного облучения. Еще более высокий уровень вариабельности частоты транслокаций отмечался у лиц с ОЛБ-III степени - от 18,7 до 61,7/100 клеток/геном. Самые высокие показатели наблюдались при ОЛБ-IV степени - 91,4 и 114,9/100 клеток/геном.

В группе В у лиц, обследованных в основном однократно, общая частота транслокаций отмечалась на более низком уровне по сравнению с группой Л, но при этом сохранялась корреляция с тяжестью радиационного поражения. Полученные результаты по всем срокам пострадиационного обследования (16 - 51 лет) показали, что наиболее низкая частота этих аберраций наблюдалась у пострадавших с диагнозом ЛР - от 0,2 до 1,3/100 клеток/геном. У лиц с легкой степенью тяжести ОЛБ-I частота транслокаций отмечалась в диапазоне 0,8 - 4,9/100 клеток/геном. На более высоком уровне колебалась частота транслокаций при ОЛБ-II степени - от 5,3 до 8,1/100 клеток/геном. При высокой степени тяжести ОЛБ-III степени общая частота транслокаций составляла 16,0/100 клеток/геном. У неоднократно обследованного подводника с ОЛБ-II степени  частота транслокаций варьировала в диапазоне от 18,8 до 24,5/100 клеток/геном, что вполне соответствовало показателям частоты этих аберраций у ликвидаторов с аналогичной степенью тяжести радиационного поражения.

Частота транслокаций, наблюдаемая в лимфоцитах крови пострадавших группы П, в отдаленный пострадиационный период (30 - 44 лет) в целом также соответствовала уровню этих аберраций, выявленных у ликвидаторов с аналогичной степенью тяжести ОЛБ. При низкой степени тяжести ОЛБ-I общая частота транслокаций отмечалась в диапазоне от 3,6 до 9,3/100 клеток/геном. Более высокая частота транслокаций наблюдалась при ОЛБ-II степени - 31,3/100 клеток/геном.

В группе И частота транслокаций колебалась в диапазоне от 1,1 до 7,4/100 клеток/геном у лиц с ОЛБ-I степени, что в целом соответствовало диапазону вариабельности этих аберраций у пострадавших с аналогичной степенью тяжести радиационного поражения в представленных выше группах. При этом у лиц с более высокой степенью тяжести ОЛБ II - III степени частота транслокаций различалась незначительно и варьировала в диапазоне от 15,6 до 27,6/100 клеток/геном.

Исследование динамики частоты транслокаций при неоднократном наблюдении некоторых лиц показало, что при относительно низкой степени тяжести радиационного поражения частота этих аберраций варьировала в среднем на одном повышенном уровне на протяжении всего периода наблюдения, в то время как при высокой степени тяжести ОЛБ отмечалась тенденция к снижению частоты транслокаций (рис. 6, 7). Считается, что по

Рис. 6. Динамика общей частоты транслокаций у ликвидаторов, обследованных в отдаленный период (10 - 22 лет) после острого облучения в высоких дозах

Рис. 7. Динамика общей частоты транслокаций у лиц с ОЛБ-III степени через 21 - 36 лет после внештатного облучения промышленными источниками ионизирующих излучений.

прошествии длительного времени после облучения в процессе гемопоэза из стволовых делящихся клеток в периферическую кровь выходят лимфоциты, содержащие не только дицентрики, но и транслокации. При остром облучении в дозах, превышающих 1 Гр, велика вероятность образования этих 2-х типов аберраций одновременно в одной клетке (Gardner et al., 2002). Поэтому одним из механизмов снижения частоты транслокаций является отбор против клеток, содержащих одновременно стабильные и нестабильные аберрации (дицентрики и центрические кольца), а также другие сложные меж-и внутрихромосомные обмены, что вероятно имелось и в нашем исследовании. Как известно, менее устойчивыми являются и неполные транслокации, возможно из-за потери генетического материала в результате элиминации фрагментов (Litt lefield et al., 2000; Pres sl et al., 2000).

В лимфоцитах периферической крови всех лиц, обследованных FISH-методом, учитывались и такие стабильные аберрации, как инверсии и инсерции, вклад которых в целом составлял незначительную часть в общем числе стабильных аберраций. Однако следует заметить, что у лиц группы Л отмечалась определенная корреляция частоты инверсий и инсерций со степенью тяжести радиационного поражения. В группах В и П, которые представлены в основном пострадавшими с ОЛБ-I степени, частота этих аберраций отмечалась в единичных случаях. У лиц группы И инверсии и/или инсерции обнаружены практически в каждый год наблюдения при степени тяжести ОЛБ-II и ОЛБ-III.

Таким образом, полученные в целом результаты настоящего исследования выявили повышенный уровень частоты нестабильных и стабильных аберраций хромосом в отдаленный пострадиационный период в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся острому неконтролируемому облучению в высоких дозах. Эти данные свидетельствуют о необходимости и важности систематического пострадиационного наблюдения лиц, пострадавших в аналогичных радиационных инцидентах. Определяющей целью такого обследования является количественная оценка протекания мутационных процессов в соматических клетках человека в отдаленный пострадиационный период в зависимости от дозы (степени тяжести ОЛБ) и времени после облучения, прогноза и оценки риска возникновения отдаленной постлучевой патологии.

В  Ы  В  О  Д  Ы

  1. При цитогенетическом обследовании когорты ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 1 - 6 лет после участия в спасательно-восстановительных работах в 30-км зоне аварии в лимфоцитах периферической крови выявлено статистически значимое превышение контрольного уровня средне-групповой частоты нестабильных хромосомных аберраций, включая маркерные аберрации (дицентрики и центрические кольца) радиационного воздействия. При этом частота стабильных аберраций - аномальных моноцентриков, определяемых стандартным методом без кариотипирования, также статистически значимо превышала контрольный уровень. В целом, это свидетельствует о сохранении радиационно-индуцированных структурных мутаций в соматических клетках человека на протяжении первых 6 лет после облучения.
  2. В данной когорте ликвидаторов установлена положительная корреляция между наблюдаемой частотой нестабильных аберраций и величиной поглощенной дозы: уровень цитогенетических нарушений был достоверно выше у ликвидаторов, работавших в 1986 г. по сравнению с работавшими в 1987 - 1988 гг.; средние поглощенные дозы составляли 170, 130 и 30 мЗв, соответственно (данные Национального радиационно-эпидемиологического регистра). При этом средняя частота стабильных аберраций (аномальные моноцентрики) достоверно не различалась у ликвидаторов разных лет работы в зоне аварии.
  3. Установлена зависимость средне-групповой частоты нестабильных аберраций в когорте ликвидаторов от длительности пострадиационного периода (1 - 6 лет): частота нестабильных аберраций снижалась в среднем на 30 - 40% в каждый последующий год наблюдения ликвидаторов 1986 - 1987 гг. работы.
  4. Впервые в отдаленный пострадиационный период (10 - 52 лет) выявлены общие закономерности изменения частоты разных типов (нестабильные и стабильные) структурных нарушений хромосом в лимфоцитах периферической крови для лиц, подвергшихся острому облучению в высоких дозах (1,1 - 9,8 Гр) в различных неконтролируемых радиационных инцидентах.
  5. Обнаружен достоверно повышенный уровень как нестабильных, в том числе дицентриков и центрических колец, так и стабильных (аномальных моноцентриков и транслокаций) аберраций хромосом в отдаленный пострадиационный период в группах лиц, подвергшихся острому неконтролируемому облучению в высоких дозах (1,1 - 9,8 Гр), вызвавших у пострадавших ОЛБ различной степени тяжести.
  6. Обнаружена тенденция к постепенному снижению частоты нестабильных аберраций, включая дицентрики и центрические кольца, со временем после облучения у лиц с различной степенью тяжести ОЛБ. Для стабильных аберраций, выявляемых стандартным методом (аномальные моноцентрики), напротив, характерна тенденция к определенному росту во времени, что не исключает возможности образования клоновых аберраций. Частота стабильных аберраций, определяемых FISH-методом (транслокации), варьировала на достоверно повышенном уровне, проявляя тенденцию к снижению при наиболее высокой степени тяжести ОЛБ.
  7. Установлено, что в отдаленные сроки после облучения у лиц с различной степенью тяжести ОЛБ маркеры радиационного воздействия (дицентрики и центрические кольца), в среднем 20% от общего числа этих аберраций, не сопровождаются сопутствующими парными фрагментами, которые потерялись в процессе многократного деления предшественников лимфоцитов, поступающих в периферическую кровь из стволовых клеток. Большая часть дицентриков и центрических колец (до 80%) сопровождаются сопутствующими парными фрагментами, что позволяет предположить нахождение этих аберраций в субпопуляции долгоживущих лимфоцитов в периферической крови.
  8. Выявлена корреляция частоты стабильных аберраций (аномальные моноцентрики и транслокации) со степенью тяжести ОЛБ у лиц, подвергшихся неконтролируемому острому облучению, что позволяет оценивать диапазон поглощенных доз в отдаленный пострадиационный период цитогенетическими методами биодозиметрии.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Севанькаев А.В., Жлоба А.А., Потетня О.И., В.В., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Анкина М.А., Голуб Е.В., Михайлова Г.Ф., Поздышкина О.В., Епифанова Н.В., Дьяченко Г.А. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях Калужской области // Бюллетень Национального радиационно-эпидемиололгического регистра Радиация и риск. - 1994. - Вып.4. - С.121Ц124.
  2. Севанькаев А.В., Жлоба А.А., Потетня О.И., Н.В.Моисеенко В.В., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Анкина М.А., Голуб Е.В., Михайлова Г.Ф., Поздышкина О.В., Епифанова Н.В., Дьяченко Г.Л. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях Калужской области // В сб.: Медицинские аспекты влияния малых доз радиации на организм детей, подростков и беременных. - Обнинск, Москва, 1994. - Вып.2. - С.54Ц59.
  3. Севанькаев А.В., Анкина М.А., Голуб Е.В., Жлоба А.А., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Михайлова Г.Ф., Моисеенко В.В., Поздышкина О.В., Потетня О.И., Пятенко В.С. Результаты цитогенетического обследования жителей населенных пунктов, прилегающих к Семипалатинскому испытательному ядерному полигону // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35. - № 5. - С.596-607.
  4. Севанькаев А.В., Потетня О.И., Жлоба А.А., Моисеенко В.В., Потетня В.И., Анкина М.А., Голуб Е.В., Епифанова Н.В., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Михайлова Г.Ф., Поздышкина О.В., Пятенко В.С. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Калужской области // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35. - № 5. - С.581Ц588.
  5. Севанькаев А.В., Жлоба А.А., Потетня О.И., Анкина М.А., Голуб Е.В., Епифанова Н.В., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Михайлова Г.Ф., Н.В.Моисеенко В.В., Поздышкина О.В., Пятенко В.С. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Брянской области // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35. - № 5. - С.607Ц611.
  6. Sevankaev A.V., Khvostunov I.K., Mikhailova G.F. Golub E.V., Potetnya O.I., Shepel N.N., Nugis V.Yu., Nadejina N.M. Novel data set for retrospective biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after high accidental overexposure // Applied Radiation and Isotopes. - 2000. - V.52 - №5. - P.1149-1152.
  7. Севанькаев А.В., Потетня О.И., Михайлова Г.Ф., Хвостунов И.К., Пятенко В.С., Поздышкина О.В., Голуб Е.В., Шкаврова Т.Г. Частота цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови у жителей Орловской области, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях после Чернобыльской аварии // Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра Радиация и риск. - Обнинск-Москва. - Спец. Выпуск. - 2003. - С.87Ц95.
  8. Севанькаев А.В., Голуб Е.В., Хвостунов И.К., Потетня О.И., Шкаврова Т.Г., Скворцов В.Г., Иванников А.И., Тикунов Д.Д., Сидоров О.С., Амиев Г.Н., Емельяненко В.М., Возен Ф., Дюран В., Рой Л. Ретроспективная оценка доз в отдаленный пострадиационный период разными биологическими методами // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2004. - Т.44. - №6. - С.637Ц652.
  9. Севанькаев А.В., Шкаврова Т.Г., Потетня О.И., Михайлова Г.Ф., Цепенко В.В., Голуб Е.В., Хвостунов И.К., Саенко А.С., Гастева Г.Н., Нугис В.Ю., Молоканов А.А. Сравнительное исследование структурных и генных соматических мутаций у работников ядерно-химических предприятий. 1. Исследование нестабильных и стабильных хромосомных аберраций // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2005. - Т.45. - № 2. - C.149Ц161.
  10. SevanТkaev A.V., Lloyd, D.C., Edwards, A.A., Khvostunov, I.K., Mikhailova G.F., Golub E.V., Shepel, N.N., Nadejina, N.M., Galstian, I.A., Nugis, V.Yu., Barrios, L., Caballin, M.R. Barquinero, J.F. A cytogenetic follow-up of some highly irradiated victims of the Chernobyl accident // Radiation Protection Dosimetry. - 2005. - № 113. - P.152Ц161.
  11. Севанькаев А.В., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К., Голуб Е.В., Пятенко В.С., Поздышкина О.В., Шепель Н.Н., Матвеенко Е.Г., Боровикова М.П., Омарасхабов Н.О. Результаты динамического цитогенетического наблюдения за детьми и подростками, проживающими на радоактивно-загрязненных территориях после Чернобыльской аварии // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2005. - Т.45. - № 1. - C.5Ц15.
  12. Севанькаев А.В., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепаенко В.В., Голуб Е.В., Поздышкина О.В., Пятенко В.С., Матвеенко Е.Г., Боровикова М.П., Омарасхабов Н.О. Изучение спонтанной частоты оберраций хромосом у детей и подростков, проживающих на не загрязненных радионуклидами территориях Калужской области // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук., Калуга. - 2005. - Вып.8. - С.283-286.
  13. Sevankaev A.V., Khvostunov I.K., Lloyd D.C., Voisen Ph., Golub E.V., Nadejina N.M., Nugis V.Yu., Sidorov O.S., Skvortsov V.G. The analysis of suitability of FISH chromosome painting and ESR-spectroscopy of tooth enamel assays for retrospective dose reconstruction // J. Radiation Research. 2006. Vol. 47. Suppl. P. 75-80.
  14. Севанькаев А.В., Замулаева И.А., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К., Голуб Е.В., Пятенко В.С., Поздышкина О.В., Верещагина С.Г., Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Саенко А.С., Паршин В.С. Сравнительный анализ генных и структурных мутаций у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области после аварии на ЧАЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2006. - Т.46. - № 3. - C.316Ц322.
  15. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф., Ушенкова Л.Н., Надежина Н.М., Раева Н.Ф., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К., Михайлова Г.Ф., Голуб Е.В., Ллойд Д. Сопоставление результатов молекулярно-биохимического и цитогенетического изучения клеток крови пациентов в отдаленном периоде после острой лучевой болезни // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2006. - Т.46. - № 6. - C.393Ц409.
  16. SevanТkaev, A.V., Mikhailova G.F., Potetnya O.I., Tzepenko V.V., Mikhailova G.F., Potetnya O.I., Tsepenko V.V., Khvostunov, I.K., Golub E.V. Pyatenko V.S., Pozdyshkina O.V., Shepel N.N., Matveenko E.G., Borovikova M.P., Omarashabov N.O. The results of dynamic cytogenetic study of children and teenagers living on the radiatiion-contaminated territories after Chernobyl accident // In У20 years after the Chernobyl accident. Past, present and futureФChapter3, ed. Elena B.Burlakova, Valeria I.Naidich, Nova Science Publishers, Inc., New-York. - 2006. - P.23Ц38.
  17. Севанькаев А.В., Хвостунов И.К., Михайлова Г.Ф., Голуб Е.В., Цепенко В.В., Омарасхабов Н.О. Комплексный факторный анализ результатов медицинских осмотров и цитогенетических обследований населения, подвергающегося хроническому воздействию малых доз радиации в загрязненных районах Калужской области после аварии на ЧАЭС // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук., Калуга. - 2007. - Вып.11.  - С.361-376.
  18. Nugis V., Sevankaev A., Khvostunov I., Dudochkina N., Golub E., Nadejina N., Galstyan I. The continuous observation by chromosome aberration elimination at irradiated persons // Radioprotection. - 2008. - Vol.43. - № 5. - P.45-46.
  19. Голуб Е.В. Оценка отдаленных цитогенетических эффектов у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2009. - Т.49. - № 5. - С.563Ц567.
  20. Нугис В.Ю., Севанькаев А.В., Хвостунов И.К., Голуб Е.В. Надежина Н.М., Галстян И.А., Дудочкина Н.Е., Козлова М.Г. Результаты 25-летнего цитогенетического обследования лиц, подвергшихся облучению в различных дозах при аварии на Чернобыльской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т.51. - № 1. С.81-90.
  21. Nugis V., Sevankaev A., Khvostunov I., Golub E., Nadejina N.M., Galstyan I.A., Dudochkina N.E., Kozlova M.G. The results of 25 years of cytogenetic investigation of survivors who were exposed to different doses of irradiation during the Chernobyl accident // Biophysics. - 2011. - Vol.56. - № 3. - P.537-545.
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии