Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет На правах рукописи
Грачева Юлия Александровна
НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ПРООКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ТОКСИЧНЫХ ОЛОВООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ЛОВУШЕК
02.00.08 - химия элементоорганических соединений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре органической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант: Милаева Елена Рудольфовна, доктор химических наук, профессор Брегадзе Владимирович Иосифович,
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор (Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН, зав. лабораторией) Шеховцова Татьяна Николаевна, доктор химических наук, профессор (кафедра аналитической химии Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, зав. лабораторией)
Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений (ФГУП ГНИИХТЭОС)
Защита диссертации состоится 24 октября 2012 г. в 1200 на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.69 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Химический факультет, ауд.
446.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан л24 сентября 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук, профессор Т.В. Магдесиева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучение механизма токсичности оловоорганических соединений RnSnX4-n представляет значительный интерес как с точки зрения снижения их токсического действия на организм в результате антропогенного воздействия, так и с целью поиска лекарственных препаратов цитотоксического действия. Данные соединения могут взаимодействовать с компонентами клеточных мембран, приводя к деструкции липидного бислоя, ускорять процессы ионного обмена через клеточные мембраны, ингибировать процессы окислительного фосфорилирования. Молекулярный механизм биологической активности RnSnX4-n, как правило, объясняют их способностью связываться с цистеиновыми и гистидиновыми аминокислотными остатками белков. Однако данные соединения участвуют также в биологических окислительных процессах. До настоящего времени недостаточно внимания уделялось роли органических групп, связанных с атомом металла в оловоорганических соединениях, в механизме токсичности. В металлоорганической химии хорошо известны процессы, приводящие к разрыву связи металл-углерод, одним из которых является гомолитический разрыв связи Sn-C, приводящий к образованию активных свободных органических радикалов. Эти активные частицы могут являться инициаторами цепных радикальных процессов, в том числе и пероксидного окисления липидов.
Промотирование данного важного физиологического процесса приводит к апоптозу или некрозу клетки и является причиной многих патологий. Поэтому необходимо исследовать как процесс образования связи SnЦбиосубстрат, так и процесс генерирования органических радикалов RХ, и найти новые методы детоксификации.
Цель работы заключается в изучении in vitro влияния оловоорганических соединений общей формулы RnSnX4-n и их комплексов с O,N,S-лигандами на биохимически значимые процессы: пероксидное окисление липидов с использованием ненасыщенных жирных кислот, биомембран, органов и тканей, функционирование ферментов антиоксидантной защитной системы, а также in vivo влияния на организм лабораторных животных.
В задачи работы входило: 1) комплексное сравнительное исследование активности оловоорганических соединений RnSnX4-n, различающихся числом и природой органических групп R, а также их комплексов с фосфохолином и тиоамидными лигандами, как моделей связывания олова с биосубстратами, в указанных выше процессах; 2) установление основных факторов, определяющих характер влияния природы органических радикалов RХ, образующихся при гомолитическом разрыве связи Sn-С; 3) разработка способов снижения токсичного эффекта оловоорганических соединений в присутствии ингибиторов радикальных процессов полифункционального действия; 4) поиск противораковых агентов.
Научная новизна. Установлено, что одной из причин прооксидантной активности соединений RnSnX4-n является вовлечение данных соединений в радикальный процесс, приводящий к разрыву связей SnЦC и образованию активных органических радикалов RХ, которые служат инициаторами цепного радикального процесса. Природа образующихся радикалов также оказывает влияние на прооксидантную активность оловоорганических соединений.
Доказано, что комплексы оловоорганических соединений с фосфохолином и тиоамидными лигандами ведут себя как прооксиданты, и эффект их промотирующего действия в пероксидном окислении ненасыщенных жирных кислот сравним с эффектом действия соответствующих оловоорганических соединений RnSnX4-n или превышает его.
В работе предложен подход к снижению прооксидантного действия RnSnX4-n с использованием полифункциональных органических соединений, содержащих как антиоксидантные группы, так и фрагменты, способные координировать металл (хелаторы).
Для таких соединений принято условное название лантиокислительные ловушки.
Показано, что защитное действие in vivo свободного основания мезо-тетракис(3,5-дитрет-бутил-4-гидроксифенил)порфирина и фосфонатов с фенольными группами, обусловлено особенностью их химического строения - наличия в молекулах 2,6-ди-третбутилфенольных фрагментов, выполняющих антиоксидантную функцию, а также свободного основания порфирина и остатков фосфоновой кислоты как хелаторов.
Установлено, что оловоорганические комплексы с тиоамидными лигандами проявляют высокую антипролиферативную активность против раковых клеток лейкосаркомы у крыс, при этом наблюдается корреляция с данными об их высокой прооксидантной активности, а также ингибирующей активности фермента липоксигеназа.
Практическая ценность. В работе предложен новый подход, заключающийся в использовании в качестве ингибиторов радикальных процессов, индуцированных RnSnX4-n, полифункциональных органических соединений, в состав молекул которых входят как хелатирующие так и антиоксидантные фрагменты (порфирины и фосфонаты, содержащие 2,6-ди-трет-бутилфенол). На основании полученных результатов, предложены способы снижения уровня пероксидного окисления липидов печени Asipensier guldenstadti Brandt добавлением (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты (Патент РФ RU № 2405032 C1 от 27.11.2010, Патент РФ RU № 2457240 от 27.07.2012.) На основании данных о противоопухолевой активности комплексы оловоорганических соединений с гетероциклическими лигандами можно рассматривать в качестве перспективных фармакологических препаратов цитостатического действия.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на XIX и XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Россия, Волгоград, 2011, Казань, 2003), XХV, XXIV, ХХIII Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Россия, Суздаль, 2011, Россия, Санкт-Петербург, 2009, Украина, Одесса, 2007), 10th European Biological Inorganic Chemistry Conference (Греция, Салоники, 2010), IVth International Symposium on Bioorganometallic Chemistry (США, 2008), International Conference nd on Organometallic and Coordination Chemistry (Нижний Новгород, 2008), 2 European Conference on Chemistry for Life Sciences (Польша, Вроцлав, 2007), 13th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (Австрия, Вена, 2007), Vth Conference УClusters2006Ф (Россия, Астрахань, 2006), International Conference УHalchem-IIIФ (Греция, Иоаннина, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей, 10 тезисов докладов, получено 2 патента.
Объем и структура диссертации. Материал диссертационной работы изложен на 1страницах, включает 13 таблиц, 38 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы из 234 наименований.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 08-03-00282-а, 09-03-00090-а, 10-0301137-a, 11-03-12088-офи м, 11-03-00402-а).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы посвящен анализу известных данных о токсичности оловоорганических соединений, немногочисленных способах их детоксификации, а также поиску перспективных фармакологических препаратов на основе оловоорганических соединений.
2. Обсуждение результатов В работе изучено in vitro влияние различных оловоорганических соединений общей формулы RnSnX4-n и их комплексов с модельными биосубстратами на важные физиологические процессы: пероксидное окисление липидов с использованием ненасыщенных жирных кислот (Z-9-октадеценовая кислота), биомембран, органов и тканей, функционирование ферментов антиоксидантной защитной системы (супероксиддисмутаза и каталаза), а также изучено in vivo влияние оловоорганических соединений на организм.
Предложены новые способы снижения токсичного действия оловоорганических соединений в присутствии ингибиторов радикальных процессов полифункционального действия.
Обнаружено цитотоксическое действие комплексов оловоорганических соединений с гетероциклическими лигандами.
2.1. Влияние оловоорганических соединений и их комплексов на пероксидное окисление ZЦ9Цоктадеценовой кислоты как структурного фрагмента липидов Оловоорганические соединения RnSnX4-n В настоящей работе проведено комплексное исследование активности ряда оловоорганических соединений общей формулы RnSnX4-n, различающихся числом и n природой органической группы R (n = 1 -3; R = Me, Et, Bu, Ph), в процессе пероксидного окисления Z-9-октадеценовой (олеиновой) кислоты как модельного субстрата LH.
Кинетические исследования пероксидного окисления олеиновой кислоты кислородом проводили при 25, 37, 65, 90С в присутствии RnSnX4-n по накоплению соответствующих гидропероксидов LOOH в течение 5 ч методом иодометрического титрования.
В интервале температур от 25 до 90С концентрация LOOH возрастает в присутствии всех оловоорганических соединений по сравнению с экспериментом без добавок. На рис. представлены кинетические кривые накопления LOOH в присутствии MenSnX4-n (n = 1 -3) при 37С. Активность метильных производных олова увеличивается с увеличением числа CH3 групп в их молекулах. Кинетические параметры окисления олеиновой кислоты в присутствии RnSnX4-n представлены в табл. 1. Кинетические кривые накопления гидропероксидов LOOH хорошо описываются экспоненциальными функциями, а их логарифмические анаморфозы (lnC/Co) имеют линейный характер, что соответствует реакции псевдопервого порядка.
LOOH, мM Рис. 1. Кинетические кривые накопления гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в присутствии MenSnCl4-n: ( 1) олеиновая кислота без добавок; (2) MeSnCl3, ( 3) Me2SnCl2, 20 (4) Me3SnCl (37С, концентрация добавок 1Х10-3 мольХл-1, барботирование воздуха).
0 5000 10000 15000 200 с Для всех соединений наблюдается соотношение ki/ko >1 и qi >1 во всем интервале температур (25-90С), что позволяет сделать вывод о том, что скорость образования LOOH больше скорости их разложения в этих же условиях (табл. 1). Величины ki/ko и qi достигают максимальных значений при температуре 37С и уменьшаются с ростом температуры, что свидетельствует о промотирующей активности соединений олова в распаде образующихся гидропероксидов. Полученные результаты позволяют предположить, что причиной промотирующей активности RnSnX4-n является вовлечение данных соединений в радикальный процесс. Известно, что реакция SH2 бимолекулярного гомолитического замещения у атома Sn протекает с большой легкостью. В связи с этим ускорение процесса окисления олеиновой кислоты может быть объяснено взаимодействием образующихся пероксильных радикалов LOOХ с оловоорганическими соединениями, что приводит к разрыву связей SnЦC и образованию активных органических радикалов RХ.
LOOХ + RnSnX4-n Rn-1SnX4-n(OOL) + RХ (1) Реакция замещения приводит к увеличению концентрации активных радикалов RХ, которые являются инициаторами цепного радикального процесса окисления LH. Число органических групп R в молекуле оловоорганического соединения влияет на активность соединения: с увеличением n активность возрастает (рис. 1).
Таблица 1. Значения кинетических параметров ki/ko и qi для процесса накопления гидропероксидов олеиновой кислоты (LOOH) в присутствии оловоорганических соединений при различных температурах 25C 37C 65C Соединения ki/ko qi ki/ko qi ki/ko qi Без добавок 1 1 1 1 1 MeSnCl3 1,6 1,13 1,59 1,55 1,01 1,Me2SnCl2 1,70 1,24 1,88 1,74 1,03 1,Me3SnCl 2,38 2,21 2,17 2,97 1,11 1,EtSnCl3 1,72 1,14 1,50 1,4 1,14 1,Et2SnCl2 1,92 1,38 1,88 2,51 1,13 1,Et3SnCl 3,82 1,95 2,02 2,68 1,15 1,n Bu2SnCl2 1,74 1,4 1,46 1,33 1,14 1,n Bu3SnCl 1,81 1,5 1,58 1,42 1,17 1,PhSnCl3 1,65 1,36 1,52 1,69 1,09 1,Ph2SnCl2 1,68 1,46 1,87 1,92 1,12 1,Ph3SnCl3 2,05 1,67 1,93 2,64 1,18 1,ko - константа скорости реакции псевдопервого порядка накопления гидропероксидов без добавок;
ki - в присутствии оловоорганических соединений;
Аi = (Ci-Co)/Co; Ci - концентрация гидропероксидов через 5ч после начала окисления;
Сo - начальная концентрация гидропероксидов в опытах с добавками оловоорганических соединений;
Аo - начальная величина для опытов без добавок; qi = Ai/Ao Так, например, относительная конечная концентрация LOOH при 37С для Me3SnCl в 1,3 раза выше по сравнению с Me2SnCl2 и в 1,9 раза выше по сравнению с MeSnCl3. Такая закономерность прослеживается для всех оловоорганических соединений (Табл.1).
Промотирующее действие RnSnX4-n в процессе окисления LH зависит от температуры.
Наибольший эффект можно наблюдать при добавке Me3SnCl при 25 и 37С. При повышении температуры до 65С значения ki/ko для всех систем лежит в пределах 11,2. Полученные результаты хорошо коррелируют с кинетическими данными: с увеличением температуры значения Ai и qi также максимальны при 25 и 37С. Уменьшение значений ki/ko при увеличении температуры можно объяснить разложением LOOH в реакциях RnSnX4-n с гидропероксидами при высоких температурах:
LOOH + RnSnX4-n RnSnX3-n(OOL) + HX (2) Скорость образования гидропероксидов и скорость их разложения при 65С имеют близкие значения. Начальные участки кинетических кривых близки линейным зависимостям (рис. 2), что соответствует сопоставимости значений констант скоростей реакций RnSnX4-n как с LOOХ, так и с LOOH.
Таким образом, все исследованные оловоорганические соединения промотируют пероксидное окисление олеиновой кислоты. Общий эффект влияния органических соединений Sn на процесс окисления олеиновой кислоты, как структурного фрагмента липидов, зависит от температуры процесса и проявляется в накоплении или расходовании начальных продуктов - гидропероксидов. Такой эффект может быть одной из составляющих общего механизма токсичности оловоорганических соединений.
12LOOH, мМ 10Рис. 2. Кинетические кривые накопления гидропероксидов 8олеиновой кислоты LOOH в присутствии добавок: (1) 6олеиновая кислота без добавок, (2) Me2SnCl2, ( 3) Et2SnCl2, 4(65С, концентрация добавок 110-3 мольл-1, барботирование 2воздуха).
0 2000 4000 6000 80 с Комплексы оловоорганических соединений с фосфохолином Одним из маршрутов в механизме токсичности соединений RnSnX4-n является возможность их взаимодействия с донорными группами в биологически значимых молекулах. В клеточных мембранах оловоорганические соединения могут взаимодействовать c фосфатными фрагментами биомолекул, образуя комплексы с координационными связями Sn-O при сохранении связей SnЦC. В этом случае атом Sn блокирован дополнительным лигандным окружением, а реакционноспособным участком молекулы комплекса является связь Sn-C, способная к O гомолитическому разрыву.
Me Me + O P O N В связи с этим в данной части работы нами Me OH исследовано влияние на пероксидное окисление PChol олеиновой кислоты комплексов оловоорганических соединений с фосфохолином* (PChol) - короткоцепочечным аналогом фосфолипида [HOP(O)(O-)OCH2CH2CH2N+(Me)3], входящим в группу лицетинов. Для комплексов оловоорганических соединений с фосфохолином MeSnCl3PChol (1), Me2SnCl2PChol (2), (Me3SnCl)2PChol (3), PhSnCl3PChol (4), Ph2SnCl2PChol (5), ( Ph3SnCl)2PChol (6) при температуре, близкой к физиологической (37С), наблюдается ускорение накопления гидропероксидов по сравнению с опытом без добавок (табл. 2, рис. 3).
*Комплексы были синтезированы к.х.н. Е.В. Григорьевым и предоставлены для дальнейших исследований При этой температуре комплексы 1-6 ведут себя как прооксиданты, и эффект их промотирующего действия сравним с эффектом действия соответствующих оловоорганических соединений RnSnX4-n или превышает его (табл. 1,2). Кинетические кривые накопления LOOH при 37С в присутствии комплексов хорошо описываются экспоненциальными функциями, а их логарифмические анаморфозы представляют собой линейные зависимости с коэффициентами корреляции 0,93-0,98.
В табл. 2 представлены константы скорости ki и относительные величины ki/k0, рассчитанные для реакции псевдопервого порядка. Ускорение процесса наблюдается в присутствии всех исследуемых комплексов, причем величина их промотирующего эффекта возрастает c увеличением числа органических групп R в молекуле.
Наибольший эффект ускорения окисления LH наблюдается в присутствии комплексов R3SnCl2PChol, наименьший - RSnCl3PChol (R = Me, Ph).
При более высокой температуре (65С) кинетические кривые приобретают Sобразный характер (рис. 4). Это свидетельствует о том, что скорость распада LOOH в присутствии комплексов Sn через определенный промежуток времени становится равной скорости их образования. Кинетические кривые S-образного характера при 65С с хорошей степенью точности описываются полиномами третьего порядка. Для количественного анализа использованы начальные участки этих зависимостей, соответствующие протеканию реакции окисления в течение ~ 3 ч, которые также описываются функциями eat. Полученные данные показывают, что в начальный момент времени все комплексы ведут себя как прооксиданты, и эффект их действия сопоставим с эффектом соответствующих оловоорганических соединений.
1LOOH, LOOH, 8мM мМ 6420 20 5000 10000 15000 2000 5000 10000 15000 200 с с Рис. 3. Кинетические кривые накопления Рис. 4. Кинетические кривые накопления гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в присутствии добавок: (1) без добавок, (2) присутствии добавок: (1) без добавок, (2) MeSnCl3PChol, ( 3) Me2SnCl2PChol, ( 4) PhSnCl3PChol, (3) Ph2SnCl2PChol, ( 4) (Me3SnCl)2PChol (37С, концентрация добавок (Ph3SnCl)2PChol, (65С, концентрация добавок 110-3 мольл-1, барботирование воздуха). 110-3 мольл-1, барботирование воздуха).
Таким образом, полученные результаты подтверждают предположение о том, что связывание оловоорганических соединений в комплексы с моделями фосфолипидов не предотвращает их промотирующего действия в процессе пероксидного окисления ненасыщенных жирных кислот. Ответственными за механизм этого действия могут являться образующиеся при разрыве связи C-Sn свободные органические радикалы.
Таблица 2. Кинетические параметры окисления олеиновой кислоты в присутствии комплексов оловоорганических соединений с фосфохолином RnSnCl4-nPChol при 37 и 65С 37C 65С 0B№ 1BДобавки ki/k0 qi ki/k0 qi Без добавок 1 1 1 1 2,11 (1,59)* 2,06 (1,55) 1,41 (1,01) 1,23 (1,22) MeSnCl 3PChol 2 2,15 (1,88) 2,64 (1,74) 1,51 (1,03) 1,31 (1,25) Me2SnCl2PChol 3 2,14 (2,17) 2,61 (2,9) 1,63 (1,11) 1,39 (1,27) (Me3SnCl)2PChol 4 2,12 (1,52) 2,09 (1,69) 1,44 (1,09) 1,24 (1,29) PhSnCl3PChol 5 2,25 (1,87) 2,33 (1,92) 1,59 (1,12) 1,22 (1,37) Ph2SnCl2PChol 6 2,31 (1,93) 2,45 (2,64) 1,85 (1,18) 1,49 (1,56) (Ph3SnCl)2PChol *в скобках приведены значения ki/k0 и qi для соответствующих оловоорганических соединений Комплексы оловоорганических соединений с гетероциклическими лигандами Одним из установленных механизмов биохимической активности оловоорганических соединений является взаимодействие Sn c атомом S цистеина или метионина в белках, что приводит к нарушению нативной структуры белка. Однако при этом связи Sn-C сохраняются. Исследование процесса пероксидного окисления олеиновой кислоты проводили для комплексов оловоорганических соединений 7-14 с гетероциклическими лигандами L1ЦL2 (L1 = 2-меркаптопиримидин, L2 = 5-хлор-2-меркаптобензотиазол).* R R N N N N Sn R Sn N N N S S SH N S R R LR = Ph (10) R = Me (7), nBu (8), Ph (9) Cl Cl Cl S R R N N N SH Sn R Sn S S S S N Cl S S R R LR = Me (11), nBu (12), Ph (13) R = Ph (14) По данным РСА структуры соединений (рис. 5) представляют собой искаженный октаэдр (11-13) и тригональную бипирамиду (10, 14).
*Комплексы были синтезированы M.N. Xanthopoulou, S.K. Hadjikakou (Университет Иоаннины, Греция) и переданы для дальнейших исследований Обнаружены два изомера с различными расстояниями Sn-N для всех комплексов.
Результаты ИК и КР спектроскопии подтверждают цис-N2,, цис-S2 -координацию вокруг иона Sn4+ в случае комплексов 12, 13. Данные РСА и спектральные исследования комплексов олова свидетельствуют о том, что в молекулах этих соединений связи Sn-C пространственно доступны для атаки реагентами, в том числе, и радикалами LOO.
Рис. 5. Молекулярные структуры соединений 12, 14.
Исследовано влияние оловоорганических комплексов 7-9 и 11-13 на накопление гидропероксидов олеиновой кислоты при 37 и 65С. Показано, что действие всех соединений проявляется в увеличении содержания LOOH в начальный период времени. Представленные результаты демонстрируют влияние природы органической группы на активность соответствующих комплексов R2SnL22 (рис. 6,7).
1 2контроль LOOH, 6 1мM 1111110 5000 10000 15000 20000 с.
Рис. 6. Кинетические кривые накопления Рис. 7. Относительное содержание гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в гидропероксидов олеиновой кислотыLOOH присутствии добавок при 37С: (1) олеиновая (% относительно контроля) без добавок и в n кислота без добавок, (2) Me2SnL22, (3) Bu2SnL22, присутствии комплексов: 11 - Me2SnL22, 12 - n (4) Ph2SnL22 (концентрация добавок 110-3мольл-1). Bu2SnL22, 13 - Ph2SnL22, при 37С через 5 ч.
Связывание оловоорганических фрагментов с атомами S в лиганде моделирует взаимодействие с SH-группами белков. Однако промотирующая активность комплексов, содержащих -связь Sn-C, обусловливает возможность их взаимодействия с реакционноспособными пероксильными радикалами LOO. Период полураспада образующихся радикалов R может оказывать влияние на степень промотирования, т.е. чем LOOH (% от контроля) n стабильнее образующиеся С-центрированные радикалы (Me < Bu < Ph), тем более эффективными промоторами окисления оказываются соответствующие комплексы. Такой эффект наблюдается в случае комплексов оловоорганических соединений с 5-хлоро-2меркаптобензотиазолом 11-14, для которых производные, содержащие фрагмент - Ph2Sn оказались более активными, чем соответствующие метильные производные. Для доказательства образования радикалов в процессе гомолитического распада Ph3SnCl, Me2SnCl2 и их комплексов Ph3SnL2 и Me2SnL22 мы изучили спектры ЭПР продуктов облучения (рис. 8). Полученные данные показывают, что во всех случаях генерируются радикальные частицы с близкими значениями g-факторов сигналов в спектрах ЭПР.
Рис. 8. Спектры ЭПР растворов Me2SnCl2 (а), Ph3SnCl (б), L2 (в), и их комплексов Me2SnL22 (г) и Ph3SnL2 (д) в бензоле после облучения УФ. Облучение проводили ртуть-ксеноновой лампой в жидком азоте при 77 K, спектры регистрировали через 20 с после облучения.
Таким образом, включение оловоорганического фрагмента в комплекс с аналогом биосубстратов за счет образования связей Sn-N, Sn-S не устраняет инициирующей активности комплексов олова, а данные соединения, как и в случае комплексов с фосфохолином, являются прооксидантами пероксидного окисления олеиновой кислоты.
2.2. Применение лантиокислительных ловушек для снижения прооксидантного действия оловоорганических соединений Проявление оловоорганическими соединениями RnSnX4-n и их комплексами с O, N, S - донорными лигандами прооксидантной активности за счет вовлечения в радикальные реакции и генерирования активных радикалов R предполагает использование ингибиторов радикальных процессов для снижения прооксидантного эффекта RnSnX4-n. В качестве таких ингибиторов могут выступать 2,6Цдиалкилфенолы - биомиметики природного антиоксиданта - -токоферола. С другой стороны для снижения токсичного действия металла применяют хелаторы. В работе предложен подход, заключающийся в использовании полифункциональных органических соединений, в состав молекул которых входят как хелатирующие фрагменты (лиганды - Lig), так и антиоксидантные группы ингибитора 2,6 - ди-трет-бутилфенола (InH). Для таких соединений в работе использовано условное название лантиокислительные ловушки (схема 1).
Схема RnSnX4-n окислительная деструкция, сопровождающаяся гомолитическим разры вом cвязи Sn-C ингибитор(InH) хелатор (Lig).
t RH R Bu "Sn" Lig("Sn") -In Lig HO t Bu антиокислительны е ловушки В работе изучено пероксидное окисление олеиновой кислоты LH в присутствии оловоорганических соединений RnSnCl4-n и ингибитора радикальных цепных реакций - 2,6ди-трет-бутилфенола. Кривые накопления гидропероксидов LOOH на примере этильных производных олова в присутствии ингибитора представлены на рис. 9. Скорость накопления LOOH существенно снижается при сравнении с процессом без добавок. Таким образом, присутствие 2,6-ди-трет-бутилфенола существенно снижает прооксидантный эффект действия оловоорганических соединений. Снижение величины ki [ki10-4 = ( 1,39 0, 16) (1,84 0,09)] в присутствии 2,6-ди-трет-бутилфенола и RnSnCl4-n (R = Et, nBu) по сравнению со значением для самого фенола (ki10-4 = 1,73 0, 15) можно, по-видимому, объяснить возможностью регенерации антиоксиданта за счет восстановления 2,6-ди-третбутилфеноксильного радикала. В этом случае образующиеся активные радикальные интермедиаты CH3CH2 и CH3CH2CH2CH2 могут служить донорами атома H для феноксильного радикала, образуя соответствующие алкены CH2=CH, CH3CH2CH=CH2. В результате, возрастает суммарный ингибирующий эффект 2,6-ди-трет-бутилфенола.
10LOOH, Рис. 9. Кинетические кривые накопления мM 8гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в 6присутствии добавок EtnSnCl4-n и 2,6-ди-трет4бутилфенола: (1) без добавок, (2) Et3SnCl, (3) Et2SnCl2, (4) EtSnCl3 (65С, концентрация добавок 110-3 мольл2, соотношение добавок 1:1).
0 5000 10000 15000 200с Пероксидное окисление Z-9-октадеценовой кислоты в присутствии свободного основания мезоЦтетра(3,5Цди-трет-бутил-4Цгидроксифенил)порфирина и оловоорганических соединений В работе изучена активность свободного основания порфирина с антиоксидантными 2,6Цди-трет-бутфенольными фрагментами 15 в модельной реакции пероксидного окисления Z-9-октадеценовой кислоты. Для сравнения рассмотрено также свободное основание мезотетрафенилпорфирина 16 с фенильными заместителями, обладающее хелатирующей активностью, но не содержащее OH But But антиоксидантных групп. Активность порфиринов 15 и 16 в пероксидном But But N N N N H H окислении олеиновой кислоты представлена HO OH H H N N N N But But на рис. 10. Добавка порфирина 15 с 2,6-дитрет-бутилфенольными заместителями But But OH критически снижает уровень накопления 15 гидропероксидов в сравнении с олеиновой кислотой без добавок на 96% (с 642 до 26 мМ).
Соединение 16 с фенильными группами не оказывает существенного влияния на уровень накопления гидропероксидов, отношение ki/ko близко к 1. Cравнение действия порфирина и 2,6-ди-трет-бутилфенола в соотношении 1:1 и 1:4 показало, что активность порфирина как ингибитора сопоставима с действием четырех эквивалентов 2,6-ди-трет-бутилфенола.
Таким образом, соединение 15 является эффективным ингибитором процесса пероксидного окисления, его антиоксидантный эффект определяется наличием четырех фенольных групп.
Присутствие эквимолярной смеси диалкильных соединений олова и порфирина 15 в олеиновой кислоте приводит к значительному снижению накопления гидропероксидов (рис.
11). Общее содержание LOOH через 4 ч более чем в 10 раз ниже, чем в эксперименте без добавок и составляет 7,6 и 8,4 % от контроля для Me2SnCl2 и Et2SnCl2 соответственно.
Данные на рисунке 12 иллюстрируют активность фенольного порфирина 15, как антиоксиданта, способного также активно предотвращать прооксидантное действие SnCl2 и выступать одновременно как в роли ловушки для металла, так и ингибитора промотируемых им радикальных процессов окисления.
10LOOH, 20LOOH, мM мМ 81661248240 4000 8000 12000 16000 2000 4000 8000 12000 160 c с Рис. 10. Кинетические кривые накопления Рис. 11. Кинетические кривые накопления гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH в присутствии добавок: (1) без добавок, (2) 16, (3) присутствии смеси 15 и R2SnCl2: (1) без добавок, 2,6-ди-трет-бутилфенол, (4) 15 (65С, (2) Me2SnCl2, (3 ) Et2SnCl2 (65С, концентрация концентрация добавок 110-3моль л-1). добавок 110-3 мольл-1, соотношение добавок 1:1).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что фенолсодержащий порфирин проявляет антиоксидантную активность в модельной реакции окисления олеиновой кислоты, препятствуя накоплению гидропероксидов благодаря наличию 2,6-ди-третбутилфенольного фрагмента, как основному реакционному центру при взаимодействии с пероксидными радикалами. С другой стороны, можно предположить, что фенолсодержащий порфирин способен связывать ионы металлов за счет участия порфиринового кольца.
Экпериментальные данные показывают, что в процессе пероксидного окисления олеиновой кислоты фенолсодержащий порфирин 15 действует как высокоэффективный ингибитор, снижая накопление LOOH на 92 % через 3 ч окисления по сравнению с экспериментом без добавок. Добавка эквимолярного количества фенолсодержащего порфирина в реакционную смесь, содержащую SnCl2, эффективно подавляет образование гидропероксидов и снижает скорость их накопления по сравнению с действием неорганической соли до ~50 % через 3 ч окисления, выступая в качестве хелатирующего агента (ловушки) для ионов олова.
1LOOH, 140 мМ 1Рис. 12. Накопление гидропероксидов олеиновой 1кислоты LOOH в присутствии добавок: (1) без добавок, (2) SnCl2, ( 3) - 15, ( 4) SnCl2 и 15 (65С, 3 ч, концентрация добавок 110-3мольл-1, соотношение добавок 1:1).
1 2 3 Спектральными методами (электронная спектроскопия поглощения, ЭПР) показано, что в присутствии агентов радикальной природы, к которым относятся, в частности, реакционноспособные пероксидные радикалы LOOХ, происходит отрыв атомов водорода от фенольных групп порфирина 15, образуется относительно стабильный бирадикал, который превращается в производное порфодиметендихинометида (схема 2, рис. 13), дальнейшее окисление которого приводит к образованию конечного продукта - мезо-тетракис(3,5-дитрет-бутил-4-хинометид)порфириногена. Стадии окисления обратимы и производные порфодиметендихинометида и порфириногена могут быть легко восстановлены до исходного порфирина. Таким образом, действие соединения 15 может не зависеть от присутствия R2SnCl2 в реакционной смеси. Однако значения ki/ko для смеси соединения 15 и R2SnX2 составляют 0,3 (R = Me) и 0,15 (R = Et), и эти значения в обоих случаях ниже, чем для чистой олеиновой кислоты с соединением 15, для которой ki/ko составляет 0,69. Этот факт подтверждает, что именно процесс внедрения атома олова в порфириновое кольцо является результатом окислительного деалкилирования R2SnX2.
Схема.
O O OH But But But But But But NH N. NH N NH N -2H R' R' R' R' R' R'.
+2H HN N N HN N HN But But But But But But.
O O OH But R' = OH Рис. 13. Изменение спектра поглощения порфирина 15, But соответствующее окислению фенольных групп до производного дихинопорфодиметена в олеиновой кислоте (О2, 65С).
Таким образом, фенолсодержащий порфирин 15 может не только предотвращать окислительную деструкцию органических субстратов, но его можно рассматривать и как ловушку ионов металлов в связи с выраженной способностью к образованию комплексов с металлами за счет наличия N - координирующих центров.
Пероксидное окисление Z-9-октадеценовой кислоты в присутствии 2,6Цди-третбутилфенолов, содержащих фосфонатные группы Для ряда фосфорзамещенных производных 2,6Цди-трет-бутилфенола, содержащих одну, две или три фосфонатные группы (соединения 17-20), исследованы антиоксидантные свойства. Для сравнения использовали известные антиоксиданты 2,6Цди-трет-бутил-4OH метилфенол (ионол) и 2,6ЦдиOH OH t t t t t t Bu Bu Bu Bu Bu Bu трет-бутилфенол. Также для сравнительного анализа было O O O _ выбрано производное анизола R'O R'O OR' RO H P H P P диэтиловый эфир (4R'O P O OR' R'O O P P O R'O OR' метоксифенил)метилендифосфоно R'O OR' R'O OR' R = H, R' = H (17) вая кислота, не содержащее R' = H (19) R' = Et (20) R = SiMe3, R' = Et (18) фенольного фрагмента.
При окислении олеиновой кислоты при 37, 50, 65С обнаружено, что соединения 17-обладают выраженной ингибирующей активностью в процессе образования первичных продуктов окисления - гидропероксидов LOOH. Антиоксидантный эффект этих соединений выше, чем у стандартного антиоксиданта ионола (30%) (рис. 14), с повышением температуры наблюдается возрастание антиоксидантной активности соединений. Наибольший эффект ингибирования достигается в случае соединений 17 (58%), 18 (48%), 20 (69%) при 37C.
Изучен также процесс накопления конечных продуктов окисления олеиновой кислоты карбонильной природы с использованием тиобарбитуровой кислоты (ТБК-зависимые продукты). Соединения 17-20 также проявляют значительный антиоксидантный эффект, однако наибольшей активностью обладают соединения 18 и 20 (75 и 51% соответственно).
Сравнивая антиоксидантную активность и устойчивость феноксильных радикалов, образующихся при окислении соединений 17-20, можно видеть, что не наблюдается прямой корреляции между устойчивостью феноксильных радикалов и антиоксидантной активностью.
1 % от контроля Рис. 14. Антиоксидантная активность фенолов 1720 в процессе накопления гидропероксидов олеиновой кислоты LOOH при 37C, (концентрация добавок 110-3мольл-1) 17 18 19 20 ионол Так, устойчивость феноксильных радикалов по данным метода ЭПР* возрастает в следующем ряду: 17<19<18<20. Антиоксидантная активность соединений меняется следующим образом: 17<201819. Из литературных данных известно, что такого рода зависимость можно объяснить возможным образованием хиноидной структуры (Схема 3, табл. 3). В этом случае малоактивный радикал ингибитора, участвующий в обрыве цепей реакции окисления субстрата, может образовываться как с участием гидроксильной группы фенольного фрагмента, так и при отрыве бензильного атома водорода. Обратимость процесса окисления в целом приводит к усилению ингибирующей активности данных соединений. Для соединения 20 возникновение подобной хиноидной структуры невозможно, и антиоксидантный эффект его действия ниже, но сравним с активностью ионола.
Таблица 3. Константы СТВ и величины g-факторов радикалов, полученных при окислении соединений 18- Радикал a, мТл g - фактор а(2Н)=0.17 2.00Схема 3 18 But But а(Р)=3.а(1Н)= 1.-2H HO CHR1R2 O CR1Rа(2Н)=0.16 2.0019 +2H а(1Н)=0.But а(1Р1)=2.But а(1Р2) =2.а(2Н)=0.18 2.0020 а(1Р1)= 3.а(2Р2)= 0.*Спектры ЭПР были сняты в.н.с., к.х.н. В.Ю. Тюриным Таким образом, фосфорзамещенные производные 2,6Цди-трет-бутилфенола 17-20, обладают выраженной ингибирующей активностью как в процессе образования первичных продуктов радикальных реакций окисления - гидропероксидов, так и конечных - карбонильных соединений.
In vitro пероксидное окисление липидов гомогенатов печени лабораторных животных Для оценки влияния наиболее активных антиоксидантов - свободного основания тетра(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)порфирина 15 и (3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты 19 на пероксидное окисление липидов в биологических объектах в настоящей работе проведены in vitro исследования на примере гомогенатов печени лабораторных крыс линии Wistar и рыб (Acipenser guldenstadti Brand)*.
Для сравнительного анализа использованы также тетрафенилпорфирин 16 и диэтиловый эфир (4-метоксифенил)метилендифосфоновой кислоты 21, не содержащие фенольных групп.
Эффективность действия 19 и 21 оценивали по величине эффективности антиоксидантного действия (Е), которая рассчитывалась по формуле:
Е = ((Со - С1)/Со)100% где, C0 и С1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени в контрольном эксперименте и с добавкой соединений соответственно. В случае положительного значения Е тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие, при отрицательном значении - прооксидантное действие.
Эффективность действия соединений 19 и 21 существенно изменяется в ходе длительно протекающего процесса пероксидного окисления липидов в гомогенате печени и зависит от природы заместителя в пара-положении фенола (рис. 15). На начальном этапе (3 ч) наибольший эффект проявляет соединение 19, а также 2,6-ди-трет-бутилфенол, однако затем эффективность антиоксидантного действия 2,6-ди-трет-бутилфенола снижается.
Через 24 ч после начала эксперимента и далее максимальное действие оказывают фенолы и 21, для которых величина Е несколько возрастает по мере протекания процесса.
12,6-ди-третЕ (%) бутилфенол Рис. 15. Эффективность (Е) соединений 19, 21 и 2,6-ди-трет-бутилфенола в пероксидном окислении липидов 21 гомогенатов печени Acipenser guldenstadti Brandt в течение 3, 24, 48 и 72 ч (концентрация добавок 110-3 мольл-1).
ионол 3ч 24ч 48ч 72ч *Образцы печени лабораторных крыс линии Wistar предоставлены биологическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова; эксперименты с гомогенатами печени рыб (Acipenser guldenstadti Brandt) выполнены совместно с к.х.н. Н.А. Антоновой (Астраханский государственный технический университет).
Для моделирования поведения соединений 19, 21 в условиях длительного окислительного процесса, промотированного Me2SnCl2, накопление ТБК-зависимых продуктов изучено в период времени от 1 до 48 ч (рис. 16).
Полученные результаты показывают, что соединения проявляют антиоксидантное действие на всех этапах процесса, причем в отличие от контроля эффект снижения уровня окисления наблюдается уже на ранних этапах, несколько возрастая с увеличением длительности периода окисления.
Рис. 16. Эффективность (Е) соединений и 21 в присутствии Me2SnCl2 в пероксидном окислении липидов печени Acipenser guldenstadti Brandt (концентрация добавок 110-3мольл-1, соотношение добавок 1:1) Таким образом, показана выраженная эффективность действия 2,6-ди-третбутилфенолов с фосфонатными группами. Активность данных соединений может определяться не только наличием фенольной группы, но и присутствием хелатирующих фосфонатных фрагментов в их молекулах.
На рис. 17 представлена антиоксидантная активность порфирина 15, выполняющего одновременно роль антиоксиданта и ловушки металла в период выдерживания гомогената в инкубационной среде от 50% (1 ч) до 66% (48 ч). Эти данные свидетельствуют также о достаточной стабильности порфирина и о его пролонгированном действии. Добавление в n инкубационную среду эквимолярных количеств Bu2SnCl2 и порфирина 15 приводит к снижению выраженного прооксидантного действия оловоорганического соединения в среднем на 22%.
Е ( %) Рис. 17. Эффективность (Е) соединения 15 при длительном окислении липидов гомогенатов печени 40 Acipenser guldenstadti Brandt, (концентрация добавок 110-3мольл-1).
1ч 3ч 24ч 48ч In vivo активность свободного основания тетра(3,5Цди-трет-бутил-4гидроксифенил)порфирина в снижении токсичного действия хлорида триметилолова Защита клеток от активных метаболитов кислорода в норме осуществляется действием ряда антиоксидантных ферментов, в том числе и мембрано-ассоциированных.
Первую линию защиты от свободных радикалов выполняют ферменты супероксиддисмутаза и каталаза. В случае, если система защиты не справляется, это приводит к патологиям и некрозу клетки. Защитное действие фенолсодержащего порфирина 15 in vivo изучено на примере антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) для лабораторных крыс линии Wistar, которым перорально вводили хлорид триметилолова*. Изучено также общее содержание SH-групп, маркеров действия Me3SnCl на белки и глутатион органов крыс.
Полученные, результаты свидетельствуют о том, что при действии хлорида триметилолова СОД в печени и почках ингибируется практически полностью, 92% и 93% соответственно. Такая же доза порфирина практически не оказывает влияния на активность фермента. У животных, получавших добавки Me3SnCl и порфирина 15 в равных количествах, степень ингибирования фермента значительно меньше (рис. 18).
Аналогичная картина наблюдается и для каталазы (рис. 19), этот фермент также ингибируется при действии хлорида триметилолова, что свидетельствует об интенсивно протекающих параллельных процессах: включение оловоорганического соединения в метаболизм печени и почек, и выведение метаболитов. Через 24 ч в присутствии Me3SnCl наблюдается подавление активности каталазы и СОД, что, по-видимому, связано с нарушением нативной структуры белка и изменением активного и/или аллостерического центров ферментов.
Изучено также содержание свободных SH-групп, маркеров защитного действия порфирина по отношению к токсическому действию триметилоловохлорида in vivo (рис.20).
Представленные результаты, свидетельствуют о том, что при действии Me3SnCl наблюдается критическое снижение содержания SH-групп белков в печени и почках.
Рис. 18. Относительная активность СОД в Рис. 19. Относительная активность каталазы в печени лабораторных крыс, через 24 ч печени лабораторных крыс через 24 ч после после перорального введения животным 5 перорального введения животным 5 мгХкг-1 Me3SnCl, мгХкг-1 Me3SnCl, порфирина 15 и их смеси в порфирина 15 и их смеси в соотношении 1:1.
соотношении 1:1.
*In vivo исследования проведены совместно с к.м.н. М.А. Додоховой (РГМУ).
Введение порфирина 15 обуславливает существенный защитный эффект при определении суммарного содержания тиольных групп. Наблюдается уменьшение содержания SH-групп при действии Me3SnCl и порфирина через 24 ч на 36 и 54 % в печени и почках соответственно.
Рис. 20. Относительное содержание SH-групп в печени лабораторных крыс через 24 ч после перорального введения животным 5 мгХкг-Me3SnCl, соединения 15 и их смеси в соотношении 1:1.
Следовательно, порфирин 15 снижает токсичное действие соединения олова на ферменты антиоксидантной защиты. Такой эффект объясняется особенностью химического строения порфирина, имеющего в своем составе 2,6-ди-трет-бутилфенольные фрагменты, выполняющие роль антиоксиданта, и свободное основание порфирина как хелатора.
Оловоорганические соединения являются не только эффективными прооксидантами, но и ингибиторами ферментов антиоксидантной защиты, что влияет на функцииональнометаболическое состояние организма и приводит к снижению компенсаторных возможностей организма в целом. Способность фенолсодержащего порфирина коррегировать внутриклеточные антиоксидантные процессы в печени и почках, может свидетельствовать о его цитопротекторном действии.
2.3. Цитотоксическая активность комплексов оловоорганических соединений с гетероциклическими лигандами Способность оловоорганических соединений накапливаться в клетке, а также их высокая токсичность позволяет рассматривать эти соединения в качестве перспективных фармакологических препаратов специфичного действия, в том числе, цитостатиков.
С целью установления возможного механизма действия мы изучили влияние комплексов оловоорганических соединений 7-14, 22, 23* с гетероциклическими лигандами L1, L2, L3, L4 на активность O SH Lлипоксигеназы, ключевого фермента, Ph N N ответственного за окисление Ph Sn X S S арахидоновой кислоты до лейкотриенов, Ph LSH X = O (22), S (23) активных участников процессов развития N опухолей.
*Комплексы синтезированы M.N. Xanthopoulou, S.K. Hadjikakou (Университет Иоаннины, Греция) и предоставлены для дальнейших исследований Влияние комплексов 7-14, 22, 23 на окисление линолевой кислоты ферментом липоксигеназа было изучено в интервале концентраций от 5 до 75 М. Полученные результаты сопоставлены с активностью известного препарата - цисплатина. В присутствии всех комплексов наблюдается снижение ферментативной активности липоксигеназы по сравнению с цисплатином, который не проявляет столь значительного действия.
Полученные результаты подтверждаются значениями IC50, которые составляют 14, и 10 М для наиболее активных соединений 11, 12 и 13 соответственно (рис. 21).
Дифенильное производное Sn 13 является наиболее эффективным ингибитором, значение IC50 составляет 10 М.
1цисплатин Рис. 21. Концентрационная зависимость активности фермента липоксигеназы при окислении линолевой кислоты в присутствии комплексов 11-13 и цисплатина.
0 10 20 30 40 50 С, М Очевидно, что ингибирующая активность комплексов зависит как от числа, так и от природы заместителей, связанных с атомом олова.
Для определения типа ингибирования фермента был использован метод стационарной кинетики при различных концентрациях субстрата (0,01 - 0,1 мМ) в присутствии и в отсутствие комплексов (концентрация добавки 15 М). Экспериментальные данные были обработаны графическим методом в координатах Лайнуивера - Берка. Показано, что для изученных соединений характерен смешанный механизм ингибирования фермента.
Для изучения взаимодействия комплексов 7-14, 22, 23 с белком был осуществлен компьютерный докинг, который подтвердил предположение о смешанном механизме ингибирования фермента, по которому могут образоваться как комплексы связывания ингибитора (I) с ферментом (E) - EI, так и комплекс фермент-субстрат-ингибитор - ESI (рис.
22).
Все исследованные соединения 7-14, 22, 23 значительно ингибируют ферментативное окисление линолевой кислоты с участием липоксигеназы, однако соединение демонстрирует значительно более низкую ингибирующую активность, что связано, повидимому, с малыми значениями энергии связи образующихся комплексов ESI и EI.
Активность (%) Рис. 22. Сайты связывания комплексов 7 и 10 с липоксигеназой Для соединений 7-14, 22, 23 были проведены тесты на противораковую активность при различных концентрациях по отношению к клеткам лейкосаркомы мезенхимы лабораторных крыс линии Wistar, при этом осуществляли контроль раковых клеток в течение 24 ч после инкубирования исследованными соединениями. Данные по антипролиферативной активности комплексов по отношению к раковым клеткам саркомы представлены на рис. в сравнении с цисплатином.
1цисплатин Рис. 23. Концентрационная зависимость выживших раковых клеток (%) лейкосаркомы крыс в присутствии комплексов 11-13 и цисплатина.
0 2 4 6 8 С, M Показано, что все оловоорганические комплексы проявляют высокую антипролиферативную активность против раковых клеток лейкосаркомы у крыс, характер действия комплексов согласуются с данными о высокой ингибирующей активности по отношению к ферменту липоксигеназе. Значения IC50 для представленных комплексов лежат в области наномолярных концентраций. Комплекс дифенилолова 13 демонстрирует высокую антипролиферативную активность и проявляет наиболее высокую ингибирующую активность по отношению к липоксигеназе (IC50 = 10 M).
Установлено, что комплексы 11-13 ингибируют фермент липоксигеназу в соответствии с такой же закономерностью, что и промотируют неферментативное пероксидное окисление олеиновой кислоты (рис. 7, 21). Проведенные исследования подтверждают корреляцию между антипролиферативной и ингибирующей активностями оловоорганических комплексов с тиоамидами, которая определяется не только геометрическими особенностями или числом и природой арильных и алкильных заместителей при атоме Sn, но в значительной степени - природой органического гетероциклического лиганда.
вы живаемость клеток, % Выводы 1. Показано, что оловоорганические соединения RnSnX4-n проявляют свойства прооксидантов в процессе пероксидного окисления Z-9-октадеценовой (олеиновой) кислоты LH как структурного фрагмента липидов. Причиной промотирующей активности является вовлечение данных соединений в цепной радикальный процесс, характеризующийся взаимодействием пероксильных радикалов LOOХ с оловоорганическими соединениями, что приводит к разрыву связей SnЦC и образованию инициаторов радикального процесса - активных алкильных радикалов RХ.
2. Установлено, что связывание оловоорганических соединений в комплексы с фосфохолином как модели фосфолипидов, не предотвращает их прооксидантного действия.
Эффект данного промотирующего действия сравним с действием соответствующих оловоорганических соединений RnSnX4-n или превышает его.
3. Показано, что образование оловоорганических комплексов с гетероциклическими лигандами за счет образования связей Sn-N, Sn-S не устраняет инициирующей активности комплексов олова, и данные соединения, как и в случае комплексов с фосфохолином, являются прооксидантами пероксидного окисления олеиновой кислоты.
4. В работе предложен новый подход, заключающийся в использовании полифункциональных органических соединений (лантиокислительных ловушек), в состав молекул которых входят хелатирующие фрагменты и антиоксидантные группы ингибитора 2,6-ди-трет-бутилфенола для существенного снижения прооксидантного эффекта оловоорганических соединений.
5. Показано, что свободное основание мезо-тетракис(3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)порфирин обладает высокой антиоксидантной активностью в модельных системах, а также при действии на различные биологические объекты in vitro (крысы, рыбы) и существенно снижает токсичное действие хлорида триметиолова на ферменты антиоксидантной защиты каталазу и супероксиддисмутазу в печени и почках крыс in vivo.
6. Показана выраженная эффективность защитного действия 2,6-ди-третбутилфенолов с фосфонатными группами в присутствии оловоорганических соединений на биологических объектах in vitro (крысы, рыбы).
7. Обнаружена противоопухолевая активность комплексов оловоорганических соединений с гетероциклическими лигандами. Показано, что все оловоорганические комплексы проявляют высокую антипролиферативную активность против раковых клеток лейкосаркомы крыс, характер действия комплексов согласуется с данными о высокой ингибирующей активности по отношению к ферменту липоксигеназе и активности процесса пероксидного окисления олеиновой кислоты.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. M.N. Xanthopoulou, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis, E.R. Milaeva, Yu.A. Gracheva, V.Yu. Tyurin, N. Kourkoumelis, K.C. Christoforidis, A.K. Metsios, S. Karkabounas, K.
Charalabopoulos. Biological studies of new organotin(IV) complexes of thioamide ligands // Eur. J.
Med. Chem., 2008, Vol. 43, P. 327-335.
2. Н.А. Антонова, М.Н. Коляда, В.П. Осипова, Ю.Т. Пименов, Н.Т. Берберова, В.Ю.
Тюрин, Ю.А. Грачева, Е.Р. Милаева. Исследования антиоксидантных свойств фосфорилзамещенных фенолов // Докл. АН, 2008, Т. 419, №3, С. 342-344.
3. М.Н. Ксантопуло, С.К. Хаджикако, Н. Хаджилиадис, Н. Куркумелис, Е.Р. Милаева, Ю.А. Грачева, В.Ю. Тюрин, Л. Вергинадис, С. Каркабунас, М. Барил, И.С. Батлер. Изучение биологической активности комплексов оловоорганических соединений с 2- меркаптопиримидином // Изв. Акад. Наук. Сер. Хим. 2007. № 4, С. 751-757.
4. В.Ю. Тюрин, Ю.А. Грачева, Е.Р. Милаева, А.А. Прищенко, М.В. Ливанцов, О.П.
Новикова, Л.И. Ливанцова, А.В. Маряшкин, М.П. Бубнов, К.А. Кожанов, В.К. Черкасов.
Фосфорсодержащие производные 2,6-ди(трет-бутил)фенола: антиоксидантная активность и свойства соответствующих феноксильных радикалов // Изв. Акад. Наук Сер. Хим, 2007, №4, С. 744-750.
5. E.R. Milaeva, V.Yu. Tyurin, D.B. Shpakovsky, O.A. Gerasimova, Zhang Jinwei, Yu.A.
Gracheva. Organotins-promoted pe roxidation o f uns aturated f atty a cids: a ne w a ntioxidative scavenger for promoters // Heteroatom Chem., 2006, Vol. 17, P. 475-480.
6. E.R. Milaeva, V.Yu. Tyurin, Yu.A. Gracheva, M.A. Dodochova, L.M. Pustovalova, V.N.
Chernyshev. Protective effect of meso-tetrakis-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)porphyrin on the in vivo impact o f tr imethyltin c hloride o n th e antioxidative d efense s ystem // B ioinorg. C hem.
Appl., 2006, P. 1-5.
7. E.R. Milaeva, D. Shpakovsky, Yu. A. Gracheva,. O.A. Gerasimova,. V.Yu. Tyurin, V. S.
Petrosyan. Influence o f m etalloporphyrins o n ol eic a cid pe roxidation / / J. Porphyrins Phthalocyanines, 2004, Vol. 8, P.701-706.
8. В.С. Петросян, Ю.А. Грачева, Е.В. Григорьев, Е.Р. Милаева, Л. Пеллерито. Влияние оловоорганических соединений и их комплексов с фосфохолином на процесс перекисного окисления структурных фрагментов липидов // Ж. Орг. Хим., 2003, Т. 39, Вып.3, С. 384-387.
9. V.S. Petrosyan, E.R. Milaeva, Yu.A. Gracheva, E.V. Grigoriev, V.Yu. Tyurin, Yu.T.
Pimenov, N.T. Berberova. The promoting effect of organotin compounds upon peroxidation of oleic acid // Appl. Organomet. Chem., 2002, Vol. 16, P. 655-659.
10. Ю.А. Грачева, В.Ю. Тюрин, Е.Р. Милаева, Н.Т. Берберова, Ю.Т. Пименов, В.С.
Петросян. Перекисное окисление олеиновой кислоты в присутствии оловоорганических соединений // Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины. Сб. научных трудов. Издательский центр УАкадемияФ, Тюмень, 2002, C.89-91.
11. Н.Т. Берберова, В.П. Осипова, М.Н. Коляда, Н.А. Антонова, С.И. Филимонова, Ю.А. Грачева, А.А. Прищенко, М.В. Ливанцов, Л.И. Ливанцова, О.П. Новикова, Е.Р.
Милаева, Н.С. Зефиров. Способ снижения уровня пероксидного окисления липидов печени добавлением (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты. Патент РФ RU № 2405032 C1 от 27.11.2010.
12. Н.Т. Берберова, И.М. Чернушкина, В.П. Осипова, М.Н. Коляда, Ю.Т. Пименов, Ю.А. Грачева, А.А. Прищенко, М.В. Ливанцов, О.П. Новикова, Л.И. Ливанцова, Е.Р.
Милаева, Н.С. Зефиров. Способ стабилизации липидов рыбных кормов. Патент РФ RU № 2457240 от 27.07.2012.
13. Ю.А. Грачева, М.А. Додохова, Е.Р. Милаева. Изучение in vivo активности порфирина с 2,6-ди-трет-бутилфенольными группами в снижении токсического действии хлорида триметилолова // Тезисы XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 2011, Волгоград 25-30 сентября, Т. 1, С. 495.
14. Ю.А. Грачева, Е.Р. Милаева Новый подход к снижению прооксидантной активности токсичных оловоорганических соединений с использованием лантиокислительных ловушек // Тезисы XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии, 2011, Суздаль 6-11 июня, С. 430.
15. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, S.I. Filimonova, Y.A. Gracheva, E.F. Shevtsova, S.O.
Bachurin, N.S. Zefirov. Novel metal based antioxidants as protectors against the oxidative stress // 10 European Biological Inorganic Chemistry Conference, 22-26 June, 2010, Thessaloniki, Greece, SL07.
16. E.R. Milaeva, V.Yu. Tyurin, Yu.A. Gracheva, D.B. Shpakovsky. Radical mechanism of organometallics toxicity. A novel approach to the detoxification. // IV International Symposium on Bioorganometallic Chemistry, Missoula, USA, 2008, 6-10 July, OP. 8.
17. Yu. Gracheva, V. Tyurin, V. Osipova, Yu. Piminov, E. Milaeva, E. Shevtsova. A novel antioxidant - 2,6-di-tert-butylphenol w ith phos phonate groups // International C onference o n Organometallic and Coordination Chemistry, 2008, N. Novgorod, September 2-8, P. 36.
18. В.Ю. Тюрин, Ю.А. Грачева, Яохуань У, Е.Р. Милаева, М.П. Бубнов, К.А. Кожанов, В.К. Черкасов, Е.Ф. Шевцова. Фосфорсодержащие 2,6Цди-трет-бутилфенолы как антиоксиданты и хелатирующие агенты // XXIII Международная Чугаевская конференция по координационной химии, 4-7 сентября 2007 г., Одесса. С. 373.
19. Ю.А. Грачева, В.Ю. Тюрин, Е.Р. Милаева, С.К. Хадьякакоу, Н. Хаджилиадис.
Биологическая активность комплексов оловоорганических соединений с 2меркаптопиримидином. XXIII Международная Чугаевская конференция по координационной химии, 4-7 сентября 2007 г., Одесса. С. 372.
20. V.Yu. Tyurin, Yu.A. Gracheva, A.A. Prishchenko, M.P. Bubnov, K.A. Kozhanov, V.K.
Cherkasov, Yauhuan Wu, E.R. Milaeva. Phosphoryl s ubstituted 2,6Цdi-tert-butylphenols:
nd antioxidative a ctivity a nd pr operties of t he c orresponding phe noxyl r adicals / / 2 European Conference on Chemistry for Life Sciences. September 4-8, 2007 Wroclav, Poland. P. 200.
21. Yu.A. G racheva, M.N. X anthopoulou, S.N. H adjikakou, N. K ourkoumelis, I.
Verginadis, S. K arkabounas, V.Yu. T yurin, E.R. M ilaeva., N. H adjiliadis. B iological a ctivity o f organotin(IV) complexes with 2-mercaptopyrimidine // 13th International Conference on Biological Inorganic Chemistry. July 15-20, 2007, Vienna, Austria, P. 122. Yu.A. Gracheva, V.Yu. Tyurin, Jingwei Zhang, A.A. Prishchenko, M.V. Livantsov, O.P.
Novikova, L.I. Livantsova, E.R. M ilaeva. P hosphoryl s ubstituted phe nols a s a ntioxidative th scavengers f or or ganotins i n uns aturated a cids peroxidation / / V Conference У C lasters-2006Ф, Russia, Astrakhan, September 4-8, 2006, P. 114-115.