НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ВИДОВ РОДА HYPERICUM L. 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Самара

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

На правах рукописи

Правдивцева Ольга Евгеньевна

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ

ВИДОВ РОДА HYPERICUM L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Самара - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89).

Научный консультант: - доктор фармацевтических наук, профессор

Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты: - доктор фармацевтических наук

профессор Киселева Татьяна Леонидовна

- доктор фармацевтических наук

профессор Бубенчикова Валентина Ивановна

- доктор химических наук

профессор Буланова Анджела Владимировна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится л 6 мая 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 443079, г. Самара, проспект. Карла Маркса, 165Б.

Факс: 8-(846)-333-29-76. E-mail: vakur@samaramail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан л__ ________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в медицинской практике наблюдается тенденция все более широкого применения фитопрепаратов для лечения и профилактики различных заболеваний. Это связано с тем обстоятельством, что лекарственные средства на растительной основе, как правило, сочетают в себе широту и мягкость терапевтического действия с отсутствием значительного числа побочных эффектов в случае рационального применения. Именно поэтому целесообразным является применение фитопрепаратов для лечения хронических заболеваний, в том числе патологий центральной нервной системы, главными причинами которых являются стресс, психоэмоциональное напряжение и экологическое неблагополучие окружающей среды. Перспективным источником растительных средств, на основе которого возможно получение отечественных эффективных антидепрессантных препаратов, являются виды рода Зверобой - Hypericum L.

В настоящее время в медицинской практике Российской Федерации применяется два вида рода Зверобой (Hypericum L.) - зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый (четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz., (синоним Hypericum quadrangulum L.) семейства Hypericaceae (Guttiferae). Так, трава обоих фармакопейных видов зверобоя в нашей стране служит для получения антимикробных, противовоспалительных, вяжущих и фотосенсибилизирующих средств, в то время как за рубежом на основе данного сырья производят эффективные антидепрессантные препараты, такие как Деприм, Негрустин и Гелариум Гиперикум, разрешенные к применению на территории РФ. Однако до сих пор нет единого мнения относительно характера нейротропного эффекта препаратов зверобоя: его трактуют седативным, антидепрессивным, а в некоторых случаях стимулирующим ЦНС. Противоречия касаются и химической природы биологически активных соединений (БАС) видов рода Hypericum L., обладающих нейротропным действием. Все это не способствует созданию на основе травы зверобоя импортозамещающих отечественных антидепрессантных лекарственных средств. Разработке отечественных антидепрессантных аналогов мешают и такие факторы, как недостаточная степень изученности химического состава видов рода Зверобой, отсутствие унифицированного подхода к анализу сырья и препаратов зверобоя (Самылина И.А., 1994). Кроме того, требуется оптимизация методик анализа как для сырья, так и препаратов, включая средство Зверобоя настойка. Это обстоятельство связано с тем, что в действующей нормативной документации (НД) допущены существенные неточности. Кроме того, в случае зверобоя травы для определения подлинности сырья не используются современные физико-химические методы анализа.

Исследования по этой проблеме представляются актуальными и важными также ввиду того, что трава зверобоя широко применяется как в нашей стране, так и за рубежом, однако до сих пор многие проблемы оставались нерешенными. Так, в нашей стране качество сырья и препарата Зверобоя настойка оценивается методом дифференциальной спектрофотометрии по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин. В то же время, в препаратах импортного производства методом прямой спектрофотометрии оценивается содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин. И тот, и другой подход к анализу имеет свои недостатки в силу того, что каждый из них в отдельности не позволяет в полной мере объективно охарактеризовать качество сырья и препаратов видов рода Зверобой.

Создание конкурентоспособных препаратов возможно лишь на основе глубокого изучения химической природы действующих веществ, а также использовании современных методов стандартизации сырья и препаратов (Куркин В.А., 2007). Выделение из сырья индивидуальных биологически активных веществ позволяет изучить их химическое строение, физико-химические свойства и фармакологические эффекты.

Кроме того, следует также отметить, что изучение морфолого-анатомических признаков фармакопейных и примесных видов рода Зверобой ранее в сравнительном аспекте не проводилось, тогда как современный уровень исследований предполагает использование в НД качественных цветных цифровых микрофотографий макро- и микроскопических признаков отдельных частей сырья, представляющего собой траву.

Таким образом, углубленное изучение химического состава, фармакологических свойств индивидуальных веществ и субстанций, в сочетании с проведением морфолого-анатомического анализа позволит научно обосновать подходы к созданию и стандартизации сырья и препаратов видов рода Зверобой.

Цель и задачи исследования. Экспериментально-теоретическое обоснование новых подходов к созданию и стандартизации лекарственных средств на основе видов рода Зверобой (Hypericum L.).

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Сравнительное исследование химического состава надземной части видов рода Зверобой.

2. Выделение из надземной части зверобоя продырявленного индивидуальных биологически активных соединений, установление структуры выделенных веществ и изучение их физико-химических и фармакологических свойств.

3. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование надземных частей видов рода Зверобой с использованием цифровой микроскопии.

4. Разработка и научное обоснование новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя травы, отвечающих параметрам валидации.

5. Разработка методик качественного анализа для сырья и препаратов зверобоя травы с использованием метода тонкослойной хроматографии в сочетании с качественными реакциями и УФ-спектроскопией.

6. Разработка методик количественного анализа для сырья и препаратов зверобоя травы с применением дифференциальной спектрофотометрии (в случае суммы флавоноидов), а также прямой спектрофотометрии (в случае антраценпроизводных).

7. Научное обоснование подходов к созданию новых антидепрессантных лекарственных препаратов на основе зверобоя травы.

8. Обоснование способов получения лекарственного препарата Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой.

9. Исследование показателей качества сырья и препаратов зверобоя.

10. Разработка проектов ФСП Зверобоя трава, Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой.

11. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике отечественных антидепрессантных препаратов на основе зверобоя травы.

Научная новизна. Исследования химического состава видов рода Hypericum L. позволило получить новые данные о содержании биологически активных соединений. Так, из надземной части зверобоя продырявленного выделено 9 индивидуальных соединений, относящихся к флавоноидам, флороглюцинам, фенилпропаноидам и стеринам. На основе изучения данных ЯМР-спектроскопии, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, тонкослойной хроматографии (ТСХ) установлено химическое строение выделенных веществ, среди которых вещества 3,811-бисапигенин, гиперфорин, -ситостерин и эргостерин выделены впервые в РФ, а 6,811-дикверцетин впервые описан для рода Hypericum L. и является новым природным соединением.

Сравнительное исследование видов рода Hypericum L. позволило выявить разнообразную природу биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение для целей стандартизации имеют флавоноиды (гиперозид, рутин и бисапигенин) и антраценпроизводные (гиперицин). Разработаны новые подходы к стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L., которые заключаются в сочетанном определении двух групп действующих веществ - суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.

Сравнительное анатомо-морфологическое исследование сырья видов рода Hypericum L. позволило выявить общие и отличительные признаки для фармакопейных и примесных видов, необходимых для объективной идентификации сырья. На основе цифровых микрофотографий показано, что основные диагностические признаки выявляются при рассмотрении листьев, цветков и чашелистиков сырья.

Обоснованы технологические подходы для создания препаратов Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой, которые позволили повысить выход целевых веществ, обладающих нейротропной активностью. В результате фармакологических исследований обнаружена выраженная антидепрессантная активность для новых препаратов Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой. Обоснована целесообразность применения в медицинской практике импортозамещающих препаратов видов рода Hypericum L. в качестве антидепрессантных средств.

Практическая значимость работы. Сравнительное исследование сырья видов рода Hypericum L. свидетельствует о различии в содержании биологически активных соединений фармакопейных и примесных видов сырья, что имеет существенное значение с точки зрения идентификации сырья и препаратов зверобоя. Разработаны унифицированные методики качественного (ТСХ в сочетании с качественными реакциями и УФ-спектроскопией) и количественного анализа (сочетанное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин и определение содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин) для зверобоя травы, зверобоя настойки, зверобоя экстракта жидкого и зверобоя экстракта сухого. Исследованы показатели качества сырья Зверобоя трава, Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой. Проведенные фармакологические исследования нейротропной активности позволили выявить наличие выраженной антидепрессантной активности для новых препаратов на основе видов рода Hypericum L. Обоснована ресурсосберегающая технология заготовки сырья высокого качества, что нашло свое отражение в рекомендациях по заготовке сырья. Разработаны проекты ФСП Зверобоя трава, Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой.

Получен патент РФ на изобретение № 2327481 Способ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью (2008 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 77 научных работах, в том числе 19 работ в журналах, реферируемых ВАК, 1 патенте РФ на изобретение и монографии Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных средств (2008 г.).

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на различных региональных, Всероссийских и Международных конференциях, в том числе на X, XI, XII, XIII, XIV, XV Всероссийском конгрессе Экология и здоровье человека (Самара, 2005; 2006; 2007; 2008; 2009; 2010), XIII, XIV, XV, XVI и XVII Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2006; 2007; 2008; 2009; 2010); Международном медицинском конгрессе (Ганновер, 2006), Международной конференции по полифенольным соединения (Канада, 2006), XII Съезде русского ботанического общества Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века (Петрозаводск, 2008), VII, VIII Международной конференции Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы (Минск, 2009; 2010), VII Международном конгрессе Традиционная медицина (Москва, 2009), Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2010) и др.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Росздрава по темам Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения (№ 01200900658) и Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов (№ 01200405620), а также соответствует тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам. Кроме того, работа выполнена при поддержке проекта 02.740.11.0650 ФЦП Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

Результаты химического изучения травы зверобоя продырявленного.
Результаты сравнительного морфолого-анатомического анализа сырья различных видов рода Hypericum L.
Новые подходы к стандартизации сырья и препаратов на основе зверобоя травы, которые заключаются в сочетанном определении суммы флавоноидов в пересчете на рутин и определении суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.
Способы получения новых лекарственных средств Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой.
Научное обоснование целесообразности применения разработанных препаратов в медицинской практике.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 90 рисунков. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 355 источников, из которых 50 зарубежных.

Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований растений рода Hypericum L., в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств и применению в медицине. Главы 2-7 являются экспериментальными, в них дана характеристика объектов и методов исследования, обсуждаются результаты изучения химического состава сырья видов рода Hypericum L., разработки новых подходов к стандартизации сырья и препаратов, изложены способы получения новых лекарственных препаратов, а также результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования сырья видов рода Hypericum L.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили высушенные на воздухе образцы сырья видов Hypericum L. Для сравнительного анализа использовались образцы надземных частей зверобоя продырявленного, заготовленные в 2000-2009 годах в течение вегетационного периода на территории различных регионов РФ. Для анализа содержания основных БАС сырья в зависимости от сроков вегетации и длины стебля, а также для установления оптимального режима сушки сырья были использованы образцы надземных частей зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), культивируемого на территории Ботанического сада Самарского государственного университета. В Ботаническом саду были также собраны образцы надземных частей зверобоя большого (Hypericum ascyron L.), зверобоя олимпийского (Hypericum olympicum L.) и зверобоя красивого (Hypericum androsaemum L.). Данное сырье было заготовлено от культивируемых видов. Образцы надземных частей зверобоя жестковолосистого (волосистого) (Hypericum hirsutum L.) и зверобоя изящного (Hypericum elegans Steph.) были собраны на территории Самарской области от дикорастущих растений. На территории Кировской области, Республики Марий Эл и Чувашской Республики были заготовлены образцы травы зверобоя пятнистого (четырехгранного) (Hypericum maculatum Crantz., (синонимы Hypericum quadrangulum L.). Кроме того, были использованы образцы сырья зверобоя продырявленного, культивируемые на территории специализированного хозяйства ЗАО Самаралектравы (Самарская область), а также промышленные образцы КФХ Кентавр (Самарская область), ООО Лекрасэт и Алтайфарм (Алтайский край), ОАО Красногорсклексредства (Московская область), ООО Народная медицина (Ленинградская область).

Объектами исследования были водно-спиртовые извлечения (настойки, жидкие экстракты), изготовленные в лабораторных условиях по различным технологическим схемам из травы зверобоя продырявленного. Образцы сухого экстракта зверобоя были получены на основе жидкого экстракта зверобоя продырявленного. Кроме того, были использованы образцы препарата Зверобоя настойка, выпущенные промышленным способом, а также образцы препаратов Негрустин, Деприм и Гелариум Гиперикум.

Для приготовления растворов стандартных веществ были использованы образцы ГСО рутина, гиперозида и кверцетина. В исследованиях использовали также образцы индивидуальных веществ, выделенных из травы зверобоя продырявленного.

Для исследования морфолого-анатомических признаков сырья готовили образцы надземной части различных видов рода Hypericum L. как по методике в соответствии с требованиями ГФ СССР XI издания, так и с использованием собственных разработок. Все микрофотографии сырья получены с помощью цифрового микроскопа Motic DM 111.

Для целей детального исследования химического состава надземной части зверобоя продырявленного и выделения биологически активных веществ в индивидуальном виде применен метод колоночной хроматографии в отношении ряда образцов травы зверобоя. Для этих целей извлечения из надземной части зверобоя продырявленного упаривали и наносили на силикагель L 40/100. Экстрактивные вещества хроматографировали используя качестве элюента хлороформ, спирто-хлороформные смеси в различных сочетаниях и спирт этиловый. Элюаты делили на фракции, примерно одинакового объема по 150-200 мл, затем упаривали под вакуумом. Индивидуальные вещества получали методом рехроматографии на колонках, где в качестве сорбента использовали полиамид Woelm и сефадекс LH-20, а также путем перекристаллизации. Выделенные вещества были исследованы и помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии и 13С-ЯМР-спектроскопии, УФ-спектроспопии, масс-спектрометрии, различных химических превращений, тонкослойной хроматографии (ТСХ) и других методов для установления их структуры.

Методом ТСХ проводили изучение образцов травы зверобоя и препаратов травы зверобоя, а также осуществлялся контроль чистоты выделенных веществ при использовании колоночной хроматографии. При этом были использованы пластинки Silufol UV 254, Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ и Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ. Для анализа были использованы следующие системы растворителей: хлороформ - этиловый спирт 2:1, 4:1, 6:1, 9:1, хлороформ - метиловый спирт - вода 26:14:3, а также система хлороформ - этиловый спирт - вода 26:16:3. Прежде чем поместить пластинку, камеру насыщали парами растворителей в течение 1 часа. Анализ проводили при комнатной температуре, фронт прохождения растворителя составлял около 9 см (Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ и Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ) или 13 см (лSilufol UV 254). Для анализа использовали растворы ГСО рутина, кверцетина и гиперозида, а также другие выделенные индивидуальные соединения в качестве веществ-свидетелей.

Спектрофотометрический метод использовали для количественной оценки содержания суммы антраценпроизводных, а также флавоноидов в траве зверобоя и образцах препаратов зверобоя. Для анализа флавоноидов был использованы методы дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин с использованием спиртового раствора алюминия хлорида. Метод прямой спектрофотометрии использован для анализа антраценпроизводных. В случае прямой спектрофотометрии раствором сравнения являлся 95 % этиловый спирт. Все исследования проводились на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Кроме того, метод УФ-спектроскопии использовался для идентификации веществ, выделенных из травы зверобоя методом колоночной хроматографии.

Образцы настоек были получены в соответствии с имеющимися требованиями в соотношении сырье:экстрагент 1:5. Были использованы два классических способа получения настоек: мацерация, перколяция и новый метод модифицированной мацерации. Препарат Зверобоя экстракт жидкий получали в лабораторных условиях различными технологическими методами: перколяцией и реперколяцией в соотношении сырье-экстрагент 1:1. Препарат Зверобоя экстракт сухой получали путем высушивания под вакуумом жидкого экстракта при температуре не выше 50 0С.

Для всех полученных препаратов, а также выделенных индивидуальных веществ проводили исследование биологической активности. Доклинические испытания нейротропной активности осуществляли на белых беспородных крысах обоего пола.

Антидепрессантную активность изучали в тесте открытое Отчаяние. Антидепрессивную активность препаратов оценивали по уменьшению времени (неподвижности), которая считается проявлением подавленности или лотчаяния. В качестве препарата сравнения был использован препарат Амитриптилин.

Анксиолитическое действие препаратов оценивали, используя тест Приподнятый крестообразный лабиринт. Данная методика основана на способности животных под действием препаратов преодолевать естественный страх перед падением с высоты и открытыми площадками. В качестве препарата сравнения был использован препарат Феназепам.

Результаты эксперимента приводятся в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки. Статистическую значимость различий параметров определяли с помощью критериев t Стьюдента (р < 0,05) и Statistica 6.0.

2. Исследование химического состава надземной части зверобоя продырявленного

Для исследования химического состава травы зверобоя продырявленного методом препаративной колоночной хроматографии было использовано извлечение, полученное с помощью 90% этилового спирта из сырья, заготовленного в Самарской области в 2006 и 2008 гг. Полученное извлечение упаривали под вакуумом и наносили на силикагель L 40/100. Таким образом, нами был получен ряд фракций (более 300), которые в дальнейшем использовали для выделения индивидуальных веществ. Индивидуальные вещества получали методом рехроматографии на колонках, где в качестве сорбента использовали полиамид Woelm и сефадекс LH-20. Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью метода ТСХ на пластинках Silufol UV 254, Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ и Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ в системах хлороформ-спирт (2:1), а также специально разработанной нами системе хлороформ-этанол-вода (26:16:3). Выделенные вещества были исследованы с помощью УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии, 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, различных химических превращений, ТСХ. Затем все описанные выше операции были повторены в отношении извлечения из травы зверобоя, полученного на основе 70% этилового спирта, а также сырья, заготовленного в 2007 г. В результате проведенного исследования были выделены следующие компоненты: 3,811-бисапигенин, кверцетин, 6,811-дикверцетин, гиперозид, рутин (флавоноиды), хлорогеновая кислота (фенилпропаноид) и гиперфорин (флороглюцин), а также -ситотерин и эргостерин (стерины). Физико-химические и спектральные характеристики выделенных веществ, в частности, бисапигенина, представлены на рис. 1 и в таблице 1.

Рисунок 1 - 1Н-ЯМР- спектр 3,811бисапигенина.

Таблица 1

Физико-химические константы соединений, выделенных из надземной части зверобоя продырявленного

№ п/п	Название, структура	Физико-химические константы
1.	3,811 - Бисапигенин	С30Н18О10 с т.пл. 233-2350С, М+ 302 (100 %), УФ-спектр: λmax 270, 330 нм. 1Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (, м.д.): 13,15 (с, 5-ОН), 12,99 (с, 511-ОН), 7,71 (д, 9 Гц, 2Н, Н-21,61), 7,51 (д, 9 Гц, 2Н, Н-2111,6111),), 6,90 (д, 9 Гц, 2Н, Н-31,51), 7,79 (д, 9 Гц, 2Н, Н-3111,5111), 6,61 (с, Н-311), 6,60 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,35 (д, 2,5 Гц, Н-6), 6,34 (с, Н-611).
2.	6,811 - Дикверцетин	С30Н18О14, УФ-спектр в этаноле: λmax 257, 268 пл, 374 нм. 1Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (, м.д.): 7,83 (д, 9 Гц, Н-21), 7,70 (дд, 2 и 9 Гц, Н-61), 7,53 (д, 9 Гц, Н-2111), 7,48 (дд, 2 и 9 Гц, Н-6111), 6,98 (д, 9 Гц, Н-51), 6,89 (д, 9 Гц, Н-5111), 6,53 (уш. с, Н-8), 6,27 (уш. с, Н-6).
3.	Кверцетин	С15Н10О7 с т.пл. 312-314 0С, М+ 302 (100 %), УФ-спектр в этаноле: λmax 257, 268 пл, 372 нм. 1Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (, м.д.): 12,20 (с, 5-ОН), 7,83 (д, 9 Гц, Н-2Т), 7,70 (дд, 2 и 9 Гц, Н-6Т), 6,99 (д, 9 Гц, Н-5Т), 6,53 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,26 (д, 2,5 Гц, Н-6).
4.	Гиперозид	С21Н20О12 с т.пл. 233-2350С (водный ацетон); УФ-спектр в этаноле: λmax 258, 266 пл, 362 нм. 1Н-ЯМР-спектр в смеси дейтероацетона и дейтероводы (, м.д.): 12,30 (с, 5-ОН), 7,92 (д, 2,5 Гц, Н-21), 7,55 (дд, 2,5 и 9 Гц, Н- 61), 6,88 (д, 9 Гц, Н-51), 6,45 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,20 (д, 7,5 Гц, Н-111 галактозы), 3,5-4,0 (м, 6Н галактозы).
5.	Рутин	С27Н30О16; т.пл. 192-194 0С (водный спирт) УФ-спектр: λmax 258, 266 пл, 362 нм. 1Н-ЯМР-спектр в смеси дейтероацетона и дейтероводы, 2:1 (, м.д.): 7,74 (д 9 Гц, Н-21), 7,68 (дд, 2,5 и 9 Гц, Н-61), 6,94 (д, 9 Гц, Н-51), 6,50 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,27 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,13 (д, 7 Гц, Н-111 глюкозы), 4,55 (д, 2 Гц, Н-1111 рамнозы), 3,70-3,25 (м, 6Н глюкозы + 4Н рамнозы), 1,08 (д, 6 Гц, 3Н, СН3 рамнозы).
6.	Хлорогеновая кислота	С16Н18О9. Т. пл. 203-205О (вода). УФ-спектр в спирте этиловом: 243, 300 пл, 330 нм. 1Н-ЯМР-спектр в ДМСО-d6 (100 МГц, м.д.): 7.45 (д, 16 Гц, Н-7), 7.06 (д, 2 Гц, Н-21), 7.01 (дд, 2 и 8 Гц, Н-61), 6.80 (д, 8 Гц, Н-51), 6.18 (д, 16 Гц, Н-8), 5.10 (дт, 5 и 9 Гц, Н-5), 4.00 (кв, 3 Гц, Н-3), 3.62 (дд, 3 и 9 Гц, Н-4).
7.	Гиперфорин	С35Н54О4; УФ-спектр в этаноле: λmax 275 нм. 1Н-ЯМР-спектр в дейтерохлороформе (, м.д.): 4,8-5,3 (м, 4Н, Н-15, Н-22, Н-27, Н-32), 4,2-4,3 (м, 2Н, Н-14), 3,20 (м, 1Н, Н-11), 1,8-2,5 (м, 10Н, Н-6, Н-7, 2Н-19, 2Н-21, 2Н-26, 2Н-31), 1,5-1,8 (м, 28Н, СН3-17, 18, 24, 25, 29, 30, 34, 35), 1,20 (с, 6Н, СН3-12, СН3-13), 1,00 (с, 3Н, СН3-20).
8.	-Ситостерин	С29Н50О.; т.пл. 132-133, 1Н-ЯМР-спектр 200 МГц в дейтерохлороформе (, м.д.): 5,32 (м, 1H, Н-6), 3,73 (м, 1H, Н-3), 0,8-2,2 (м, 47H, в том числе 6 СН3). Масс-спектр (70 eV, 200 оС, m/z, %): 414 (М+, 32), 255 (32), 231 (19), 213 (27), 145 (34), 135 (37), 119 (60), 105 (43), 97 (58), 71 (63), 69 (65), 43 (50).
9.	Эргостерин	С28Н44О, т.пл. 163-165 оС. УФ-спектр (EtOH, λmax): 271 нм. 1Н-ЯМР-спектр 200 МГц в дейтерохлороформе (, м.д.): 5,35 (м, 2H, Н-6, Н-7), 4,37 (д, 2Н, 7,7, Н-22, Н-23), (м, 1H, Н-3), 3,1-3,4 (м, 2Н, Н-9, Н-14), 0,65-2,4 (м, 47H, в том числе 6 СН3). Масс-спектр (70 eV, 200 оС, m/z, %): 396 (М+, 100), 255 (7), 213 (13), 147 (28), 80 (34), 57 (52), 43 (68).

Следует отметить, что 3,811-бисапигенин и гиперфорин впервые выделены из травы зверобоя продырявленного, произрастающего в РФ. Вещество 6,811-дикверцетин впервые описано для рода Hypericum L. и является новым природным соединением. Из надземной части Hypericum perforatum L. впервые выделены -ситостерин и эргостерин.

3. Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L.

3.1. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя

В настоящее время весьма актуальным является исследование вопросов стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L. Несмотря на то, что в нормативной документации на сырье (ГФ СССР XI издания (ст. 52) и препарат Зверобоя настойка (ФС 42-814-73 и ФС 42-1889-95) предусмотрены качественный и количественный анализ, и в том, и другом случае имеются существенные неточности, которые необходимо исправить. Прежде всего следует отметить, что в методике анализа сырья в качестве экстрагента используется 50% этиловый спирт, однако результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том (табл. 2), что оптимальным экстрагентом для травы зверобоя является 70% этиловый спирт, который, на наш взгляд, следует использовать для целей стандартизации. Это обстоятельство согласуется с данными научной литературы, в которых сообщается, что оптимальным экстрагентом для флавоноидов рутина и гиперозида, содержащихся в траве зверобоя, является этиловый спирт 70% концентрации. Для получения извлечения из травы зверобоя по методике, изложенной в ГФ СССР XI издания, следует провести три последовательные экстракции по 30 мин, объединяя полученные извлечения. Наши исследования не показали значительного увеличения содержания флавоноидов в получаемых извлечениях при увеличении количества экстракций до трех. Таким образом, изучение динамики извлечения суммы флавоноидов из травы зверобоя продырявленного свидетельствуют о том, что оптимальным подходом является однократная экстракция травы зверобоя в течение 90 мин на кипящей водяной бане, где в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт.

Таблица 2

Зависимость выхода флавоноидов травы зверобоя от концентрации экстрагента

№ п/п	Экстрагент	Время экстракции мин	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (%)
1.	40% этиловый спирт	90	5,90 0,09
2.	50% этиловый спирт	90	6,00 0,10
3.	70% этиловый спирт	90	6,45 0,10
4.	90% этиловый спирт	90	5,76 0,09

Методом качественного анализа в ГФ СССР XI выбрана пробирочная реакция с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида, позволяющая обнаружить лишь присутствие флавоноидов. Учитывая многообразие БАС зверобоя в качестве основного метода качественного анализа (рис. 2 и 3) нами предложено использовать метод ТСХ на пластинках Silufol UV 254, Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ или Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ. Результаты четко оцениваются при просматривании пластинки в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм, а также после проявления раствором диазотированной сульфаниловой кислоты или диазобензолсульфокислоты. Данный метод позволяет оценить не только содержание конкретных флавоноидов в траве зверобоя, но и наличие антраценпроизводных. При этом в качестве веществ-свидетелей предложено использовать растворы ГСО рутина и гиперозида - доминирующих флавоноидов травы зверобоя, которые четко обнаруживаются на ТСХ (рис. 2 и 3). Однако при этом на хроматограмме четко диагностируется и бисапигенин, а не кверцетин (содержащийся в небольших количествах), как сообщается в литературе. Таких результатов разделения веществ можно было добиться, используя систему растворителей хлороформ: этиловый спирт: вода в соотношении 26:16:3. На хроматограмме также четко фиксируется наличие антраценпроизводных в виде пятна красного цвета с Rf около 0,6 до высыхания хроматограммы и стального цвета после высыхания. Это пятно светится красным светом при просматривании хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм.

Кроме того, на наш взгляд, целесообразно использовать две химические реакции на группы веществ, характерные для зверобоя. Реакция на антраценпроизводные: наличие для извлечения из травы зверобоя характерной красной окраски (флуоресцирующей в УФ-свете при длине волны 366 нм), переходящей в зелено-желтый цвет после добавления раствора щелочи и восстановление первоначальной красной окраски после добавления раствора хлористоводородной кислоты. Показательна также реакция на конденсированные дубильные вещества, которая заключатся в прибавлении к извлечению нескольких капель раствора железоаммонийных квасцов или раствора хлорида окисного железа при котором наблюдается черно-зеленое окрашивание. Эффективным методом качественного анализа является УФ-спектроскопия извлечений из травы зверобоя (рис. 4 и 5). При этом характерными являются максимумы поглощения в области 270 и 350 нм (флавоноиды), а также при 591 нм (антраценпроизводные).

В фармакопейной статье на траву зверобоя определение суммы флавоноидов осуществляется с использованием дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 415 нм (в пересчете на рутин). Причем в тексте статьи допущен ряд неточностей, существенно искажающих суть методики. Так, приготовление исследуемого раствора (Б) делается следующим образом: в мерную колбу на 25 мл помещают 1 мл раствора хлорида алюминия и доводят 95% спиртом до метки. При этом раствор сравнения готовится следующим образом: в колбу на 25 мл помещают 1 мл извлечения из травы (раствора А), 1 каплю раствора уксусной кислоты и доводят до метки 95% спиртом. Совершенно очевидно, что для приготовления испытуемого раствора (Б) необходимо добавить 1 мл извлечения (раствора А).

Рисунок 2 - ТСХ извлечения из травы зверобоя продырявленного в системе растворителей: хлороформ-этиловый спирт-вода в соотношении 26:16:3

Рисунок 3 - ТСХ извлечения из травы зверобоя продырявленного в системе растворителей: этилацетат - муравьиная кислота - 2 н хлористоводородная кислота в соотношении 85:6:9

Обозначения:

1. Излечение из травы зверобоя продырявленного

2. Раствор ГСО рутина

3. Раствор ГСО гиперозида

4. Раствор ГСО кверцетина

5. Раствор РСО бисапигенина.

На наш взгляд, определение оптической плотности оптимально проводить при длине волны 412 нм, а не 415 нм, как указано в статье ГФ СССР XI издания. Это обусловлено тем, что максимум кривой поглощения раствора рутина в присутствии алюминия хлорида находится при длине волны 412 нм.

Рисунок 4 - УФ-спектр раствора извлечения травы зверобоя.

Рисунок 5 - УФ-спектры раствора извлечения травы зверобоя в присутствии раствора алюминия хлорида.

Обозначения:

1 - извлечение из травы зверобоя 1:2500 на 70% этиловом спирте

2 - извлечение из травы зверобоя 1:2500 на 70% этиловом спирте (+AlCl3).

Подбирая оптимальные условия для излечения антраценпроизводных из сырья, работу проводили аналогично анализу флавоноидов (табл. 3). Оптимальными условиями экстракции оказались те же параметры, что и для флавоноидов. Следовательно, возможно получение извлечения из сырья, часть которого используется для анализа флавоноидов, часть - для анализа антраценпроизводных. В своих исследованиях мы отталкивались от методики анализа, изложенной в НД на препарат Деприм, в которой используется определение суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин с использованием прямой спектрофотометрии при длине волны 590 нм. Однако, как показали проведенные нами исследования, максимум для суммы антраценпроизводных находится при длине волны 591 нм. В действующей методике анализа препарата Деприм используется ряд агрессивных реактивов, таких как метиловый спирт, что нежелательно с точки зрения безопасности. Кроме того, в методике предполагается использование дорогостоящих и редких реактивов, оснащения и аппаратов, не используемых широко в методиках фармацевтического анализа нашей страны. Предложенная нами методика анализа антраценпроизводных, где в качестве метода также используется прямая спектрофотометрия при длине волны 591 нм, выгодно отличается от существующей отсутствием токсичных реактивов, дорогостоящего оснащения и непродолжительным временем, необходимом для анализа.

Таблица 3

Зависимость выхода антраценпроизводных от параметров экстракции

№ п/п	Экстрагент	Соотношение сырье (г) Цлэкстрагент (мл)	Время экстракции мин	Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	40% этиловый спирт	1:50	90	0,59 0,02
2.	70% этиловый спирт	1:30	90	0,64 0,03
3.	70% этиловый спирт	1:50	90	0,72 0,03
4.	90% этиловый спирт	1:50	90	0,46 0.02
5.	95% этиловый спирт	1:50	90	0,33 0,01

На наш взгляд, такой же подход (сочетание определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин) целесообразно применять и для анализа препаратов зверобоя на основе травы зверобоя.

Качество препарата Зверобоя настойка регламентируется ФС 42-1889-95. В качестве метода качественного анализа для препарата выбран метод ТСХ-анализа, в котором используются растворы трех ГСО рутина, гиперозида и кверцетина. По нашему мнению, целесообразно использовать лишь растворы ГСО рутина и гиперозида. Это связано с тем, что кверцетин, хотя и содержится в траве зверобоя в небольшом количестве, в настойке, приготовленной на 40% этиловом спирте, этот флавоноид практически не обнаруживается. Кроме того, в данной статье в качестве системы растворителей используется система, состоящая из этилацетата, муравьиной кислоты и хлористоводородной кислоты в соотношении 85:6:9. На наш взгляд, оптимальной является система хлороформ - этиловый спирт - вода в соотношении 26:16:3. Данная система более проста в приготовлении и не содержит агрессивные реагенты. Следует также отметить, что в фармакопейной статье предлагается проявление пластинки осуществлять раствором алюминия хлорида, что позволяет обнаружить только флавоноиды. На наш взгляд, целесообразно использовать просмотр пластинок в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм, а также проявление раствором диазобензолсульфокислоты кислоты, которая проявляет большее количество фенольных соединений, присущих траве зверобоя. Как и в случае сырья зверобоя, в качестве основного метода качественного анализа для препарата Зверобоя настойка нами предложено использовать метод тонкослойной хроматографии наряду с пробирочными реакциями (на антраценпроизводные и дубильные вещества).

В методике количественного определения суммы флавоноидов в препарате Зверобоя настойка при измерении оптической плотности исследуемого раствора настойки (с добавлением алюминия хлорида) в качестве раствора сравнения используется раствор, состоящий из 1 мл исследуемого раствора (раствора А), 1 капли уксусной кислоты, доведенный спиртом до метки 25 мл, что вполне логично, однако в случае раствора ГСО рутина, оптическая плотность которого измеряется параллельно, предлагается использовать 95% этиловый спирт. Данный подход вряд ли можно считать корректным, ведь максимум кривой поглощения раствора рутина (без добавления алюминия хлорида) составляет 362 нм. На наш взгляд, раствор рутина (раствор Б) следует готовить по схеме, аналогичной испытуемому раствору настойки. В мерную колбу на 25 мл необходимо помещать 1 мл раствора А рутина, 1 мл раствора алюминия хлорида и доводить до метки 95% спиртом. В качестве раствора сравнения следует использовать раствор, состоящий из 1 мл исследуемого раствора А рутина, доведенный до метки 25 мл. При этом спектрофотометрию, как и в случае травы зверобоя, следует проводить при длине волны 412 нм (оптимальной для комплекса рутина с алюминием хлоридом). Нерациональным, на наш взгляд, остается и подход, предусматривающий при расчете содержания суммы флавоноидов в настойке использовать показатель плотности (). На наш взгляд, использование этого показателя нецелесообразно, так как неоправданно усложняет методику анализа.

Для анализа суммы антраценпроизводных препарата Зверобоя настойка также нами предложено использовать прямую спектрофотометрию при длине волны 591 нм, а не при 590 нм, как это предусмотрено в методиках анализа зарубежных препаратов.

3.2. Методики качественного анализа сырья Зверобоя трава

1. ТСХ-анализ. На линию старта пластинки УСилуфол УФ-254Ф, УСорбфил-ПТСХ-П-А-УФФ или УСорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФФ микропипеткой наносят 0,03 мл полученного извлечения из травы зверобоя (cм. раздел 3.3.), рядом наносят такие же объемы 0,1% раствор ГСО гиперозида и раствора ГСО рутина (раствор А - cм. раздел 3.3.).

Хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают не менее 1 ч смесью растворителей: хлороформ - этиловый спирт - вода (26:16:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 13 см (силуфол) или 8 см (сорбфил), пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм. Затем хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором диазобензолсульфокислоты. На хроматограмме извлечения обнаруживаются пятна доминирующих веществ травы зверобоя: рутина (Rf около 0,4), гиперозида (Rf около 0,5), гиперицина (Rf около 0,6) и бисапигенина (Rf около 0,8). При этом пятна, соответствующие рутину, гиперозиду и бисапигенину флуоресцируют фиолетовым светом в УФ-свете при длине волны 254 нм на уровне соответствующих стандартов и проявляются раствором диазобензолсульфокислоты в желто-коричневый цвет (рутин и гиперозид) и в коричнево-оранжевый цвет (бисапигенин); пятно, соответствующее гиперицину, проявляется в УФ-свете при длине волны 366 нм (розово-красная флуоресценция). Допускается наличие и других пятен.

Примечание: 1. Подготовка пластинок. Пластинки УСилуфол УФ 254Ф 15 х 15 см, Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФФ или УСорбфил ПТСХ-П-А-УФФ (ТУ 26-11-17-89) перед использованием активируют в сушильном шкафу при 100-105 ОС в течение 1 ч. Пятна исследуемых растворов наносят на линию старта, проведенную вдоль линий накатки.

2. Приготовление раствора гиперозида. 0,025 г гиперозида (ВФС 42-1088-81) помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 15-20 мл 70% спирта, растворяют на кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и доводят 70 % спиртом до метки. Срок годности 0,1% раствора ГСО гиперозида - 1 месяц.

3. Приготовление раствора ГСО рутина См. раздел 3.3.

4. Приготовление раствора диазобензолсульфокислоты. 0,01 г диазобензолсульфокислоты (ГФ X, стр. 876) растворяют в 10 мл 10 % раствора натрия карбоната. Раствор используют свежеприготовленным.

Целесообразным является проведение и других качественных реакций на сырье Зверобоя трава

Так, извлечение травы зверобоя (см. раздел 3.3.) имеет ярко-красный цвет и красную флуоресценцию в УФ-свете при длине волны 366 нм (антраценпроизводные). Для этого в пробирку помещают 1-2 мл извлечения и несколько капель раствора гидроксида натрия: наблюдается зелено-желтое окрашивание. Затем прибавляют несколько капель раствора хлористоводородной кислоты, при этом наблюдается восстановление первоначальной красной окраски раствора (антраценпроизводные).

С целью обнаружения дубильных веществ в пробирку помещают 1 мл извлечения и прибавляют несколько капель раствора железоаммонийных квасцов или хлорида окисного железа. Появляется черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества).

Кроме того, излечение из травы зверобоя имеет характерный УФ-спектр, обусловленный наличием бисапигенина (270 2 нм) и антраценпроизводных (591 2 нм), а также плечо при (362 2 нм), обусловленное флавоноидами, в частности, рутинном и гиперозидом (рис. 4).

3.3. Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера 1 мм. Около 1 г сырья (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до + 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу закрывают той же пробкой снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через рыхлый комочек ваты или бумажный фильтр (Красная полоса) и остужают в течение 30 мин (извлечение из травы). Испытуемый раствор для анализа флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл извлечения из травы помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор сравнения А).

Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина (ФС 42-2508-87) помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл, и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор Б рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D m0 50 50 1 100 100

X = ЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ

D0 m 1 50 25 (100-W)

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина;

m0 - масса ГСО рутина, в граммах;

m Цмасса сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве зверобоя, по нашим данным, варьирует в пределах 3,00-7,50%. Результаты статистической обработки свидетельствуют, что ошибка единичного определения составляет 1,49% (табл. 4). Опыты с добавками ГСО рутина свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки.

Следует отметить, что извлечение из травы зверобоя используется для целей качественного и количественного анализа. Для целей качественного анализа также используется раствор А рутина.

Таблица 4

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя

P (%)

T (P,t)

E, %

6,03

0,1400

0,0200

95 %

2,23

0,09

1,49 %

3.4. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье Зверобоя трава

5 мл полученного извлечения из травы (см. раздел 3.3.) помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл и доводят 95% этиловым спиртом до метки.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм. Раствором сравнения при этом является этиловый спирт. Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D 50 50 100

X = ЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ

718 m 5 (100-W)

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

718 - удельный показатель поглощения 1% раствора гиперицина;

m - масса сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин в траве зверобоя, по нашим данным, находится в пределах 0,10 - 0,92 %. Результаты статистической обработки свидетельствуют, что ошибка единичного определения составляет 4,11% (табл. 5).

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в зверобоя траве

P (%)

T (P,t)

E, %

0,73

0,0470

0,0022

95 %

2,23

0,03

4,11%

4. Обоснование ресурсосберегающих технологий производства сырья видов Hypericum L.

4.1. Исследование вопросов получения зверобоя травы

высокого качества

Как известно, для получения сырья высокого качества, прежде всего, необходима правильная заготовка лекарственного растения. В соответствии с инструкцией по заготовке, в сырье зверобоя допускается наличие стеблей длиной до 30 см. При этом необходимо учесть, что само растение имеет размеры от 30 до 80 см, следовательно, при заготовке сырья надземные части могут быть срезаны под корень. В инструкциях по заготовке указано, что надземную часть следует срезать без нижних огрубевших стеблей. Однако практика показывает, что они часто не заметны у свежего растения. Поэтому большинство образцов зверобоя травы, заготовленных по всем правилам, имеет одревеснение в нижней части стеблей. При этом важно подчеркнуть, что в сырье других видов лекарственных растений с похожим габитусом регламентируемая длина стеблей гораздо меньше. Так, у душицы травы допускается наличие стеблей только до 20 см, а у тысячелистника травы собирают лишь верхушки стеблей до 15 см. Совершенно естественно, что в нижних одревесневших частях стеблей зверобоя травы можно прогнозировать невысокий уровень действующих веществ, хотя они значительно увеличивают массу сырья. Анализ образцов зверобоя травы, собранных по общим правилам, показал, что грубые одревесневшие части стеблей могут составлять примерно 25% от всей массы сырья.

Было проведено исследование содержания основных действующих веществ в различных видах сырья зверобоя, представляющих собой листья, цветки, плоды, стебли и корневища с корнями. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее содержание действующих веществ обнаружено в случае цветков и листьев зверобоя, причем если содержание флавоноидов в этих частях сырья примерно одинаково (6,93% и 5,90% соответственно), то содержание антраценпроизводных в цветках (0,810%) отличается от других видов сырья примерно в 3 раза. Следовательно, необходимо добиваться получения сырья с большим процентом листьев и цветков. Это можно достичь собирая цветущие верхушки растений (табл. 6).

Таблица 6

Содержание суммы флавоноидов и суммы антраценпроизводных в образцах зверобоя травы с различной длиной стеблей

№ п/п	Длина стеблей зверобоя травы (см)	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	5	5,30 0,08	0,719 0,028
2.	10	5,16 0,08	0,688 0,28
3.	15	4,77 0,07	0,568 0,023
4.	20	4,65 0,07	0,540 0,022
5.	30	4,55 0,07	0,489 0,020

Важно также подчеркнуть, что способ заготовки сырья зверобоя путем срезания всей надземной части может вредить и дикорастущим зарослям этого растения. Поэтому нами были проанализированы на содержание суммы флавоноидов и антраценпроизводных образцы сырья зверобоя травы с различной длиной стеблей. Анализ показал, что содержание основных действующих веществ - суммы антраценпроизводных и суммы флавоноидов снижается при увеличении длины стеблей зверобоя травы. Это связано с тем обстоятельством, что при увеличении длины стебля в сырье существенно снижается долю цветков и листьев, которые содержат основные количества действующих веществ. На наш взгляд, следует заготавливать надземные части зверобоя с длиной стебля не более 20 см.

4.2. Исследование динамики накопления БАС в надземных частях зверобоя продырявленного

С точки зрения получения сырья высокого качества и обоснования ресурсосберегающих технологий важным является исследование динамики накопления действующих веществ в надземных частях зверобоя продырявленного (табл. 7). Сбор осуществляли в течение всего вегетационного периода от растений, произрастающих на одной площадке в Ботаническом саду Самарского государственного университета. Наблюдения проводили в течение 2007-2009 гг. Стебли у собираемых нами надземных частей зверобоя не превышали 20 см. Собранное сырье высушивали на воздухе и проводили определение содержания действующих веществ по методикам количественного определения, разработанными нами ранее. Результаты, полученные нами, свидетельствуют о том, что содержание основных БАС увеличивается к моменту цветения растения и снижается на стадии плодоношения. Однако было замечено, что сбор растений с длиной стебля 20 см позволил растениям в тот же вегетационный период быстро развить новые цветущие побеги, что не всегда наблюдается при сборе по общим правилам (30 см). Побеги второй волны цветения имели длину 15-20 см. Они были также собраны на ответствующих фенофазах и проанализированы. Как видно из приведенных результатов исследования, собранные образцы надземных частей зверобоя продырявленного во вторую фазу цветения ничуть не уступают по содержанию флавоноидов и антраценпроизводных образцам сырья, собранных в первую фазу (табл. 8). Это говорит о возможности проведения двух укосов травы зверобоя в течение одного лета. При этом количество заготовленного сырья в течение года было несколько больше, чем при заготовке по общим правилам годом ранее.

Таблица 7

Содержание суммы флавоноидов и суммы антраценпроизводных в надземных частях Hypericum perforatum L. (первая фаза цветения)

№ п/п	Время сбора	Фенофаза растения	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	22.04.08	Начало вегетации	3,64 0,05	0,099 0,004
2.	21.05.08	Вегетация	4,41 0,06	0,147 0,006
3.	4.06.08	Начало бутонизации	5,15 0,08	0,160 0,006
4.	19.06.08	Окончание бутонизации	5,22 0,08	0,461 0.018
5.	30.06.08	Начало цветения	5,80 0,09	0,896 0,036
6.	9.07.08	Начало плодоношения	4,86 0,07	0,799 0,032
7.	22.07.08	Плодоношение	2,49 0,04	0,300 0,012

Таблица 8

Содержание суммы флавоноидов и суммы антраценпроизводных в надземных частях Hypericum perforatum L. (вторая фаза цветения)

№ п/п	Время сбора	Фенофаза растения	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	20.07.08	Начало бутонизации	4,01 0,06	0,230 0,009
2.	22.07.08	Начало цветения	5,31 0,08	0,650 0,026
3.	25.08.08	Плодоношение	3,02 0,04	0,478 0,019

Немаловажным вопросом является сушка сырья зверобоя. В соответствии с инструкцией сушить зверобоя траву необходимо либо без доступа прямых солнечных лучей при периодическом помешивании, либо в сушилках при температуре нагрева не выше 40 0С. Как показало наше исследование образцов травы зверобоя продырявленного, высушенных при различных температурных режимах, режим сушки существенно не влияет на наличие действующих веществ. Однако установлено, что более высокие значения содержания основных компонентов наблюдаются в случае сушки сырья в сушилках при температуре 60-90 0С. Возможно, при данной температуре происходит более быстрая инактивация ферментов, приводящих к деструкции основных фенольных компонентов.

Таблица 9

Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в надземной части зверобоя продырявленного, произрастающего различных регионах РФ

№ п/п	Название региона	Среднее содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Среднее содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	Республика Башкортостан	6,11 0,09	0,602 0,024
2.	Республика Мордовия	6,87 0,10	0,764 0,031
3.	Республика Марий Эл	7,17 0,11	0,684 0,027
4.	Оренбургская область	5,16 0,08	0,590 0,024
5.	Пензенская область	5,87 0,09	0,484 0,019
6.	Самарская область	6,31 0,09	0,598 0,024
7.	Ульяновская область	6,07 0,09	0,653 0,026
8.	Республика Татарстан	6,40 0,10	0,580 0,023
9.	Чувашская Республика	5,41 0,08	0,459 0,018

4.3. Сравнительное исследование образцов травы зверобоя продырявленного, произрастающего в РФ

Весьма актуальным является сравнительное исследование химического состава образцов травы зверобоя из различных регионов РФ (табл. 9). Результаты, приведенные в таблице 9, представляют собой усредненные данные за последние 5 лет и они наглядно показывают, что химический состав различных образцов сходен по содержанию суммы флавоноидов и суммы антраценпроизодных и соотношение флавоноидов и антраценпроизводных в сырье в среднем составляет 1:10.

4.4. Сравнительное исследование образцов надземных частей видов рода Hypericum L.

При заготовке сырья от дикорастущих растений необходимо учитывать, что на территории РФ в сходных экологических условиях, наряду со зверобоем продырявленным и зверобоем пятнистым могут произрастать два других вида зверобоя - зверобой жестковолосистый (волосистый) (Hypericum hirsutum L.) и зверобой изящный (Hypericum elegans Steph.). Последние два вида являются примесями и не допускаются для заготовки, однако, как показывает практика, бывают случаи ошибок при сборе. Особенно недопустимо с точки зрения охраны природных ресурсов уничтожение запасов зверобоя изящного - растения редкого и охраняемого.

Весьма актуальными представляются сравнительные исследования химического состава видов рода Hypericum L., культивируемых в РФ. Для исследования были использованы воздушно-сухие образцы надземной части, зверобоя олимпийского (Hypericum olympicum L.), зверобоя большого (Hypericum ascyron L.), зверобоя красивого (Hypericum androsaemum L.) заготовленные от растений, культивируемых в Ботаническом саду Самарского государственного университета. Так, в сырье Hypericum ascyron L. и Hypericum androsaemum L., наоборот, содержание гиперозида превышает содержание рутина. Следует отметить, что надземные части Hypericum olympicum L. значительно отличаются по химическому составу от других изучаемых видов.

С этой целью нами проводилось исследование образцов сырья, заготовленных от других видов зверобоя (табл. 10). Как показало исследование, все образцы содержат различные количества флавоноидов и антраценпроизводных. Отмечено, что все проанализированные образцы значительно уступают по содержанию основных БАС траве Hypericum perforatum L. Причем содержание флавоноидов в сырье различных видов находится в более узких пределах, чем содержание суммы антраценпроизводных. Анализ извлечений, проведенный методом ТСХ, также позволяет обнаружить отличия в химическом составе надземных частей различных видов рода Hypericum L. Причем, если общее содержание флавоноидов в различных образцах приблизительно одинаковое, то содержание отдельных компонентов может существенно отличаться. Так, в надземной части Hypericum perforatum L. и Hypericum hirsutum L. содержание рутина несколько превалирует над гиперозидом. В то же время в сырье Hypericum maculatum Crantz., наоборот, содержание гиперозида превышает содержание рутина. Следует отметить, что надземные части Hypericum elegans Steph. значительно отличаются по химическому составу от других видов.

Таблица 10

Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в надземных частях некоторых видов рода Hypericum

№ п/п	Название вида зверобоя	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	Hypericum perforatum L.	5,80 0,09	0,896 0,036
2.	Hypericum maculatum Crantz. (Hypericum quadrangulum L.)	3,16 0,05	0,166 0,006
3.	Hypericum hirsutum L.	3,09 0,05	0,070 0,003
4.	Hypericum elegans Steph.	2,89 0,04	0,262 0,01
5.	Hypericum olympicum L.	4,26 0,06	0,200 0,008
6.	Hypericum ascyron L.	4,77 0,07	0,059 0,002
7.	Hypericum androsaemum L.	4,27 0,06	0,038 0,002

5. Сравнитеьное морфолого-анатомическое исследование надземных частей видов рода Hypericum L.

Проведенное сравнительное исследование микроскопических признаков образцов надземной части для зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), зверобоя пятнистого (четырехгранного) (Hypericum maculatum Crantz.), зверобоя жестковолосистого (Hypericum hirsutum L.) и зверобоя изящного (Hypericum elegans Steph.) (рис. 6-8) показало, что основные диагностические признаки сосредоточены на листьях, лепестках и чашелистиках растений. Для листьев зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого характерным микроскопическим признаком является наличие пигментированных вместилищ округлой или овальной формы на листьях и лепестках. Причем вместилища со светлым содержимым на листьях зверобоя пятнистого встречаются гораздо реже, чем на листьях зверобоя продырявленного. На лепестках зверобоев обоих видов находятся вместилища с темным и светлым содержимым вытянутой формы, края чашелистиков ровные.

истовая пластинка зверобоя волосистого густо опушена с обеих сторон, однако вместилища на ней не встречаются. По краям лепестков имеются пигментированные железки округлой формы на коротких ножках. Аналогичные железки имеются и по краям чашелистиков. Листовая пластинка зверобоя изящного имеет редкие округлые вместилища с темным и прозрачным содержимым. По краю чашелистиков расположены пигментированные железки, которые оттянуты на длинных ножках. Пигментированные вместилища расположены преимущественно по краю лепестков.

Проведенные морфолого-анатомические исследования легли в основу проекта ФСП Зверобоя трава.

а			б
в			г
д			е
ж			з
и			к
Рисунок 6 - Диагностические признаки в анатомическом строении цельного сырья зверобоя продырявленного: а - эпидермис верхней стороны листа зверобоя продырявленного (увеличение 400); б - эпидермис нижней стороны листа зверобоя продырявленного (увеличение 400); в - пигментированные вместилища на листе зверобоя продырявленного (увеличение 100); г - бесцветные вместилища на листе зверобоя продырявленного (увеличение 100); д - поперечный разрез листа зверобоя продырявленного через пигментированное вместилище (увеличение 100); е - поперечный разрез листа зверобоя продырявленного через пигментированное вместилище (увеличение 400); ж - поперечный разрез стебля зверобоя продырявленного (увеличение 56); з - поперечный разрез листа зверобоя продырявленного через пигментированное вместилище, содержимое которого окрашено суданом III (увеличение 400); и - вместилища вытянутой формы на лепестке зверобоя продырявленного (увеличение 56); к - вместилища вытянутой формы на чашелистике зверобоя продырявленного (увеличение 56).
а	б
в	г
д	е
Рисунок 7 - Диагностические признаки в анатомическом строении сырья зверобоя волосистого: а - пигментированные железки по краю лепестка зверобоя волосистого (увеличение 100); б - пигментированные железки по краю чашелистика зверобоя волосистого (увеличение 100); в - волосок на листе зверобоя волосистого (увеличение 400); г - волоски на стебле зверобоя волосистого (увеличение 100); д - нижний эпидермис листа зверобоя волосистого (увеличение 400); е - поперечный срез стебля зверобоя волосистого (увеличение 100).
а		б
в		г
Рисунок 8 - Диагностические признаки в анатомическом строении сырья зверобоя изящного: а - пигментированные вместилища по краю лепестка зверобоя изящного (увеличение 100); б - пигментированные железки по краю чашелистика зверобоя изящного (увеличение 40); в - округлые вместилища по краю листа зверобоя изящного (увеличение 100); г- пигментированная железка по краю чашелистика зверобоя изящного (увеличение 400).

6. ОБОСНОВАНИЕ ЦелесообразностИ создания и использования в медицинской практике ИМПОРТОЗАМЕЩАЮЩИХ антидепрессантных лекарственных средств

Следует отметить, что в настоящее время уже существует препарат Зверобоя настойка, однако данный препарат получают из травы зверобоя на основе 40% этилового спирта и он предназначен для наружного использования в качестве антимикробного, противовоспалительного и ранозаживляющего средства. С целью создания импортозамещающего антидепрессантного препарата была поставлена задача оптимизировать методику получения препарата Зверобоя настойка. В своих исследованиях мы опирались на методики, изложенные ранее.

Как видно из приведенной таблицы 11, наибольшее содержание основных БАС отмечается в образцах препаратов, экстрагентом для которых служил 70% этиловый спирт. Как показали доклинические исследования фармакологических свойств на белых беспородных крысах, препарат Зверобоя настойка обладает антидепрессантной активностью, в отличие от промышленного образца препарата. Кроме того, следует отметить, что препарат, полученный нами, приближается по составу к импортным антидепрессантным средствам. Данные результаты отражены в патенте РФ на изобретение № 2327481 Способ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью (2008 г.).

Таблица 11

Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в водно-спиртовых препаратах зверобоя

№ п/п	Экстрагент	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %	Содержание суммы антраценпроизводных, в пересчете на гиперицин, %
1.	40 % этиловый спирт	0,28 0,01	0,002 0,0001
2.	40 % этиловый спирт	0,30 0,01	0,008 0,0003
3.	70 % этиловый спирт	0,55 0,02	0,018 0,0007
4.	90 % этиловый спирт	0,43 0,02	0,012 0,0004

Примечание: промышленный образец препарата

Проведенные исследования свидетельствуют о возможности создания конкурентоспособных отечественных антидепрессантных лекарственных средств на основе травы зверобоя, близких по химическому составу с зарубежными препаратами.

С целью разработки технологии получения жидкого экстракта травы зверобоя, был различными способами получен в лабораторных условиях ряд извлечений на 70 % этиловом спирте. Образцы жидких экстрактов травы зверобоя также отличаются по содержанию действующих веществ, но наибольшее содержание действующих веществ в препарате можно достичь, получая жидкий экстракт методом реперколяции и модифицированной мацерации. Жидкий экстракт может служить основой для получения сухого экстракта травы зверобоя, а тот в свою очередь может входить в состав таблетированных лекарственных препаратов.

Исследовались также вопросы получения сухого экстракта травы зверобоя. Для этого высушивали жидкий экстракт травы зверобоя до получения сухого порошка, влажность которого не превышала 5%. Полученные экстракты исследовали на содержание действующих веществ, результаты которых приведены в таблице 12. Полученный сухой экстракт использовали для получения в лабораторных условиях таблетированных лекарственных препаратов. Таблеточную массу получали смешиванием сухого экстракта травы зверобоя и различными вспомогательными веществами в соотношении 1:1. В качестве вспомогательных веществ были использованы лактоза, сорбит и микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ). Во всех полученных таблеточных массах определяли содержание основных БАС - флавоноидов и антраценпроизводных. Повторный анализ данных субстанций через год не выявил никаких изменений состава, что говорит о стабильности компонентов.

Полученный нами зверобоя сухой экстракт, зверобоя настойка и индивидуальные БАС, выделенные из травы зверобоя продырявленного прошли доклинические испытания (табл. 13 и 14). Препараты были исследованы на белых беспородных крысах на предмет выявления антидепрессантной и анксиолитической активности. Полученные результаты (табл. 13 и 14) наглядно свидетельствуют о выраженном антидепрессантном действии фитопрепаратов на основе зверобоя травы, сравнимом с эффектом амитриптилина. У исследуемых фитопрепаратов обнаружена также некоторая анксиолитическая активность. В случае сухого экстракта зверобоя и препарата Деприм в два раза возрастает время пребывания животных в открытых рукавах. Следует отметить, что разработанный нами препарат Зверобоя экстракт сухой обладает более выраженной нейротропной активностью по сравнению с зарубежным лекарственным средством Деприм, причем последний, с учетом содержания основных БАС в анализируемых лекарственных средствах, животным вводили в большей дозировке. Обнаруженная нами антидепресантная активность флавоноидного вещества бисапигенина показывает, что этот компонент также влияет на развитие фармакотерапевтического эффекта препаратов зверобоя. Следовательно, необходимым условием является обнаружение этого компонента при фитохимическом исследовании сырья и препаратов зверобоя травы. Кроме того, нами было доказано выраженное антидепрессантное действие для флавоноида гиперозида, однако не подтверждены данные зарубежных ученых относительно антидепрессантной активности для рутина.

Таблица 12

Сравнительная характеристика исследования препаратов по содержанию основных БАС в исследуемых препаратах

№ п/п	Препарат	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	Зверобоя настойка	0,61 0,03	0,011 0,0004
2.	Зверобоя экстракт сухой	17,50 0,31	0,515 0,0070
3.	Деприм	3,20 0,06	0,137 0,0020

Таблица 13

Результаты исследования поведения животных в методике теста Отчаяние для препаратов

№ п/п	Название препарата	Время активного движения
1.	Контроль	78,3 13,8
	Зверобоя настойка	97,9 15,2
2.	Контроль	63,6 8,6
	Зверобоя экстракт сухой	121,3 10,0**
3.	Контроль	63,6 8,6
	Деприм	119,3 14,8**
4.	Контроль	64,2 7,4
	Амитриптилин	138,3 11,9**

Примечание к табл. 1-5. * - различия достоверны по отношению опыта и контроля при Р < 0,05; ** при Р < 0,01.

Таблица 14

Результаты исследования поведения животных в методике теста Отчаяние для индивидуальных соединений

№ п/п	Название препарата	Время активного движения
1.	Контроль	64,2 7,4
2.	Бисапигенин	145,0 10,6*
3.	Амитриптилин	103,0 8,3

Таким образом, проведенные комплексные исследования свидетельствуют о возможности создания конкурентоспособных отечественных антидепрессантных лекарственных средств на основе сырья Зверобоя трава.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование сырья видов рода Hypericum L. позволило выявить общие и отличительные признаки для фармакопейных и примесных видов, необходимых для объективной идентификации сырья. На основе цифровых микрофотографий показано, что основные диагностические признаки расположены на листьях, цветках и чашелистиках сырья.

2. Сравнительное исследование видов рода Hypericum L. свидетельствует о разнообразной природе биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение для целей стандартизации имеют флавоноиды и антраценпроизводные.

3. Углубленное исследование химического состава травы зверобоя позволило выделить 9 индивидуальных соединений, относящихся к флавоноидам, флороглюцинам, фенилпропаноидам и стеринам.

4. На основе изучения данных ЯМР-спектроскопии, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, ТСХ-анализа установлено химическое строение всех выделенных веществ, среди которых бисапигенин, -ситостерин и эргостерин и гиперфорин выделены впервые в РФ, а дикверцетин является новым природным соединением.

5. Разработаны новые подходы к стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L., которые заключаются в определении двух групп действующих веществ - суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.

6. Разработаны методики качественного и количественного анализа для зверобоя травы, зверобоя настойки, зверобоя экстракта жидкого и зверобоя экстракта сухого.

7. Показатели качества сырья и препаратов включены в проекты ФСП Зверобоя трава, Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой.

8. На основе фармакогностического изучения видов рода Hypericum L. обоснована ресурсосберегающая технология заготовки сырья высокого качества, что нашло свое отражение в рекомендациях по заготовке сырья.

9. Обоснованы технологические подходы к созданию препаратов Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой, заключающиеся в использовании оптимального экстрагента (70% этилового спирта), позволяющего исчерпывающе извлекать весь комплекс БАС, обусловливающих нейротропный эффект (антидепрессантную и анксиолитическую активность).

10. Фармакологические исследования показали наличие более выраженной антидепрессантной и анксиолитической активности для новых препаратов Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой по сравнению с зарубежными аналогами.

11. Обоснована целесообразность применения в медицинской практике разработанных импортозамещающих препаратов Зверобоя настойка, Зверобоя экстракт жидкий и Зверобоя экстракт сухой на основе видов рода Hypericum L. в качестве антидепрессантных средств.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

Кадацкая Д.В., Дубищев А.В., Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Супильникова А.В., Егоров М.В., Купцова В.В. Экспериментальная оценка влияния фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, на центральную нервную систему // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2004. С. 277-278.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В. Поиск действующих веществ травы зверобоя продырявленного, обладающих нейротропным действием // Тезисы Международного съезда Фитофарм. - Микелли, Финляндия, 2004. С. 278-280.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Исследование химического состава травы зверобоя продырявленного // Науки о человеке (Сборник статей). Томск, 2004. С. 179.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Сравнительное фитохимическое исследование сырья и препаратов травы зверобоя продырявленного // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2004. С. 48-49.
Зимина Л.Н., Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Исследование химического состава травы зверобоя продырявленного методом колоночной хроматографии // Труды 1-го Международного форума (6-й Международной конференции). Самара, 2005. С. 17-19.
Зимина Л.Н., Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Новые подходы к стандартизации сырья зверобоя // Материалы 74-й итоговой научной конференции Молодежная наука и современность. Курск, 2009. С. 176-177.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В. Исследование нейротропной активности препаратов и веществ травы зверобоя продырявленного // Бюллетень сибирской медицины. 2005. Т. 4. Приложение 1. С. 28.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В., Запесочная Г.Г., Жданов И.П. Исследование сырья и препаратов зверобоя // Фармация. 2005. Т. 53. № 3. С. 23-25.
Правдивцева О.Е. Фитохимическое исследование сырья зверобоя продырявленного с целью создания новых лекарственных препаратов // Труды Х Всероссийского конгресса Экология и здоровье человека. Самара, 2005. С. 227-228.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В. Исследование активности препаратов и индивидуальных веществ травы зверобоя продырявленного // Медицинский вестник Башкортостана. 2006. Вып. 1. С. 114-115.
Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Перспективы создания антидепрессантных лекарственных средств на основе сырья зверобоя продырявленного // Труды XI Всероссийского конгресса Экология и здоровье человека. Самара, 2006. С. 210-211.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Фитохимическое исследование травы Hypericum perforatum L. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Томск, 2006. С. 282-285.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Исследование зверобоя травы на содержание суммы флавоноидов и антраценпроизводных // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2007. Вып. 63. С. 605-609.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Вопросы стандартизации сырья и препаратов зверобоя // Фармация. 2007. Т. 55. № 4. С. 12-14.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Изучение подходов к оптимизации методик анализа травы зверобоя // Материалы III Всероссийской конференции Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Барнаул, 2007. Кн. 2. С. 287-291.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Флавоноиды надземной части Hypericum perforatum // Химия природных соединений. 2007. № 5. С. 512-513. (Узбекистан). Chemistry of Natural Compounds. 2007. Vol. 43. No 5. P. 620-621.
Правдивцева О.Е. Изучение вопросов оптимизации методик получения и анализа препарата Зверобоя настойка // Известия Самарского научного центра Российской академии наук (Спец. Выпуск XII Конгресс УЭкология и здоровье человека). 2007. Т. 2. С. 191-194.
Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Исследования травы зверобоя продырявленного методом колоночной хроматографии // Тезисы докладов XII всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые в медицине. Казань: Отечество, 2007. С. 263-264.
Правдивцева О.Е. Исследование химического состава травы зверобоя // Химия и медицина тезисы докладов VI Всероссийского научного семинара с молодежной научной школой. Уфа, 2007. С. 206.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Проблемы стандартизации препаратов зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Пятигорск, 2007. С. 348-350.
Куркин В.А., Гладунова Е.П., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Анализ номенклатуры антидепрессантных лекарственных средств, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации // Фармацевтический менеджмент. 2008. № 3. С. 3-5.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Сравнительное исследование образцов травы зверобоя продырявленного // V Всероссийская научная конференция Химия и технология растительных веществ. Уфа, 2008. С. 182.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Сравнительное фитохимическое исследование сырья различных видов Hypericum L. // XII Съезд русского ботанического общества Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Петрозаводск, 2008. С. 292-294.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных средств. Самара: ГОУ ВПО СамГМУ; ООО Офорт, 2008. 127 с.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Сравнительное исследование содержания суммы флавоноидов и антраценпроизводных в препаратах травы зверобоя // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т. 42, № 10. С. 39-42.
Куркин В.А., Авдеева Е.В., Браславский В.Б., Правдивцева О.Е., Куркина А.В., Стеняева В.В., Рыжов В.М., Сатдарова Ф.Ш., Зимина Л.Н., Ламрини М.Х., Буланкин Д.Г., Анисимова М.М., Сулейманова Л.Р. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения // Тезисы докладов ХVI Российского национального конгресса Человек и лекарство. М., 2009. С. 690.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Дубищев А.В., Буланкин Д.Г., Корчагина Д.В. Актуальные аспекты создания нейротропных фитопрепаратов // Медицинский альманах. 2009. № 1. С. 46-49.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Буланкин Д.Г. Актуальные вопросы создания нейротропных фитопрепаратов // Материалы VII Международной конференции Медико-социальная экология личности состояние и перспективы. Минск, 2009. С. 268-270.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Актуальные проблемы рациональной заготовки и оценки качества травы зверобоя // Материалы IV Всероссийской конференции Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Барнаул, 2009. С. 224-225.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Буланкин Д.Г. Исследования по созданию новых нейротропных лекарственных фитопрепаратов // Научные труды VII Международного конгресса Традиционная медицина. М., 2009. С. 330-331.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Сравнительное микроскопическое исследование некоторых видов зверобоя // Фармация. 2009. Т. 57. № 3. С. 11-12.
Куркин В.А., Дубищев А.В., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Аюпова А.А., Боткин Е.А. Изучение нейротропной активности новых лекарственных препаратов зверобоя травы // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Издательство: Самарский научный центр Российской академии наук. 2009. Т. 11. № 1(6). С. 1300-1303.
Куркин В.А., Дубищев А.В., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Изучение нейротропной активности новых лекарственных препаратов из травы зверобоя // Медицинский альманах. 2009. № 4. С. 33-36.
Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование сырья некоторых видов рода Hypericum L. // Медицинский альманах. 2010. № 1. С. 207-209.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А., Зимина Л.Н. Исследование динамики накопления флавоноидов и антраценпроизводных в зверобоя траве // Материалы конференции Фармация и общественное здоровье. Екатеринбург. 2008. С. 262-264.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 81-86.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Обоснование ресурсосберегающих технологий производства и переработки сырья зверобоя // Известия Самарского научного центра Российской академии наук (Специальный выпуск УIII Всероссийская научно-практическая конференция Процессы, технологии, оборудование и опыт переработки отходов и вторичного сырья). Издательство: Самарский научный центр Российской академии наук. 2008. С. 156-158.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А., Зимина Л.Н. Ресурсосберегающие аспекты заготовки высококачественного сырья зверобоя. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук (Спец. Выпуск XII Конгресс УЭкология и здоровье человека). 2008. Т. 2. С. 258-260.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Вопросы рациональной заготовки и переработки сырья зверобоя // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Издательство: Самарский научный центр Российской академии наук. 2009. Т. 11. № 1(2). С. 135-137.
Правдивцева О.Е. Вопросы стандартизации препаратов зверобоя травы // Научные труды VII Международного конгресса Традиционная медицина. М., 2009. С. 331-333.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Методические и методологические подходы к созданию препаратов на основе сырья видов рода Hypericum L. // Материалы VII Международного симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. М., 2009. С. 225-226.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Создание отечественных антидепрессантов на основе сырья зверобоя // Материалы VIII Международного симпозиума Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. М., 2009. С. 408-410.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Сравнительное исследование надземных частей некоторых видов рода Hypericum L. // Материалы конференции Фармация и общественное здоровье. Екатеринбург, 2009. С. 111-113.
Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Куркин В.А. Сравнительное исследование сырья и препаратов Hypericum perforatum L. и Hypericum maculatum Crantz. // Научные труды I съезда натуротерапевтов России. М., 2009. С. 139-140.
Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Куркин В.А. Сравнительный анализ химического состава надземных частей некоторых видов рода Hypericum L. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2009. Вып. 64. С. 96-98.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Сравнительное исследование химического состава надземной части некоторых видов рода Hypericum L. // Химия растительного сырья. 2009. № 1. С. 79-82.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Рациональная заготовка травы зверобоя // Фармация. 2009. Т. 57. № 5. С. 10-12.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Актуальные аспекты оценки качества зверобоя травы // Материалы 74-й Итоговой научной конференции Молодежная наука и современность. Курск, 2009. С. 206.
Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Вопросы создания лекарственных препартов на основе сырья зверобоя // Известия Самарского научного центра российской академии наук. Издательство: Самарский научный центр Российской академии наук. 2010. Т. 12. № 1(8). С. 2094-2096.
Kurkin V.A., Zapesochnaya G.G., Avdeeva E.V., Braslavsky V.B., Pravdivtseva O.E., Supilnicova A.V., Egorov M.V., Stenyaeva V.V., Bontsevich A.I. The new possibilities in the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids // XXII International Conference on Polyphenols. Helsinki, Finland. 2004. P. 621-622.
Kurkina A.V., Pravdivtseva O.E., Kurkin V.A., Dubishchev A.V. Pharmacological activity of flavonoid-containing plants // Internationaler medizinischer Kongress. - Hannover, 2006. P. 37-38.
Kurkin V.A., Dubishchev A.V., Kulagin O.L., Avdeeva E.V., Braslavsky V.B., Pravdivtseva O.E., Kurkina A.V., Kadatskaya D.V., Dodonov N. S., Tsareva A.A., Dremova E.A., Bontsevich A.I. Phytochemical and pharmacological investigation of some medicinal plants containing // Polyphenols communications. - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006. P. 513-514.
Kurkin V.A., Avdeeva E.V., Braslavsky V.B., Pravdivtseva O.E., Kurkina A.V., Egorov M.V., Ryzhov V.M., Sharova O.V., Artamonova E.S., Satdarova F. Sh., Egorova A.V., Mohammed Lamrini, Zimina L.N., Anisimova M.M., Bulankin D.G., Smirnov A.V. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids and phenylpropanoids // XXIV International Cohfere on Polyphenols communications. Salamanca, 2008. P. 185-186.
Патент РФ № 2327481 на изобретение лСпособ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью А 61 К 36/38 Бюл. № 18 от 27.06.2008 (Авторы: Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В.)

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

Blog