Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Хомутов Максим Алексеевич
Новые биологически активные эфиры гидроксиламина и С-метилированные аналоги полиаминов
03.01.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Научный консультант:
Заведующий Лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН С.Н.Кочетков
Официальные оппоненты:
Заведующий Лабораторией органического синтеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова Российской академии наук, доктор химических наук А.А.Формановский Заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук, профессор С.Н.Михайлов
Ведущая организация:
Научно-исследовательский Институт физико-химической биологии им А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.
омоносова
Защита диссертации состоится л ____ _____________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта Российской академии наук Автореферат разослан л ____ _____________ 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук А.М. Крицын
Актуальность проблемы. Выбор метаболизма биогенных полиаминов в качестве биохимической мишени обусловлен участием спермина и спермидина в регуляции роста нормальных и опухолевых клеток - последние имеют повышенное содержание полиаминов, а также необходимостью спермидина для размножения многих болезнетворных трипаносоматидов. Соответственно поиск новых подходов к регуляции метаболизма полиаминов, в том числе и создание новых химических соединений, позволяющих избирательно снижать уровень спермина и спермидина в клетке, представляется весьма актуальным.
Среди О-замещенных гидроксиламинов найдены высокоэффективные необратимые ингибиторы карбонил-зависимых декарбоксилаз S-аденозилметионина и орнитина, являющихся скорость-определяющими ферментами на путях биосинтеза спермина и спермидина. Избирательность действия этих соединений обусловлена структурным соответствием фермент-ингибиторного комплекса (оксим фермента) и промежуточного соединения ферментативной реакции (основание Шиффа), что было прямо показано рентгеноструктурными исследованиями как для декарбоксилазы S-аденозилметионина (McCloskey D.E., et al. 2009. J.Med. Chem., 52, 1388-1407), так и декарбоксилазы орнитина (Dufe V.T., et al. 2007. Biochem.J., 405, 261-268). Широкое применение О-замещенных гидроксиламинов для получения разнообразных конъюгатов (см. обзор: Iha R.K., et al. 2009. Chem.Rev., 109, 5620-5686), аминооксиадсорбентов (Nishimura Sh-I., et al, 2005. Angew.
Chem.Int.Ed., 44, 91-96) и аминооксинаночастиц (Nagahori N., et al. 2009. Biochemistry, 48, 583-594) также требует создания спектра функционально-замещенных эфиров гидроксиламина. Все это делает поиск новых методов синтеза таких структур, включая и новые гидроксиламин-содержащие регуляторы метаболизма полиаминов, весьма актуальным.
Аналоги спермина и спермидина, в основном их антиметаболиты, находят широкое применение в изучении клеточных функций полиаминов, а также ферментов их биосинтеза и деградации (см.обзор: Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov. 6, 373-390). Соответственно расширение семейства биологически-активных производных полиаминов и, в особенности, создание оригинальной системы аналогов, способных частично или полностью выполнять клеточные функции спермина и спермидина, представляется весьма актульным.
Цели и задачи работы.
Целью работы являлось создание новых биологически активных эфиров гидроксиламина, а также неизвестных ранее С-метилированных аналогов полиаминов. Для достижения поставленной цели были сформулированы и реализованы следующие задачи: разработка удобного синтеза функционально-замещенных эфиров гидроксиламинов, исходя из соответствующих спиртов, и получение неизвестного ранее С-метилированного производного1-гуанидиноокси-3аминопропана, являющегося эффективным ингибитором размножения L.donovani; синтез системы не описанных ранее С-метилированных аналогов спермидина, а также их N1-ацетильных производных; синтез неизвестных ранее 2-метилированных аналогов спермина; получение 2,11бис-метилиден-спермина - потенциального фермент-активируемого ингибитора сперминоксидазы; синтез неизвестных ранее (R)- и (S)-изомеров 3-метилспермидина.
Научная новизна. Предложен удобный метод синтеза функционально-замещенных эфиров гидроксиламина, исходя из мезилатов соответствующих спиртов и этилового эфира ацетгидгидроксимовой кислоты. Синтезирована система новых С-метилированных аналогов спермидина, спермина, а также N1-Ac-спермидина, биохимические свойства которых определяются положением метильной группы. Использование этих соединений открывает новые возможности для исследования клеточных функций легко взаимопревращающихся и частично взаимозаменяемых спермина и спермидина, а также антизим-зависимых путей регуляции гомеостаза полиаминов в клетке.
Получены неизвестные ранее (R)- и (S)-изомеры 3-метилспермидина, позволяющие регулировать биохимические свойства этого аналога, изменяя конфигурацию хирального центра.
Практическая ценность работы. Жизненная необходимость спермидина для возбудителей малярии, сонной болезни и лейшманиоза формируют одну из прикладных составляющих исследования клеточных функций полиаминов и поиска новых регуляторов их метаболизма.
Правомерность подобного подхода подтверждается, например, успешным использованием -дифторметилорнитина для лечения поздних стадий сонной болезни (Burri C.C., et al. 2003. Parasitol.
Res., 90, 49-52). Существенным для практической полиаминотерапии является создание ингибиторов биосинтеза полиаминов, избирательно действующих на ферменты трипаносоматидов или избирательно доставляемых в организмы этих болезнетворных паразитов. Однако, лишь для T.brucei известен эффективно действующий in vitro ингибитор декарбоксилазы S-аденозилметионина, аминооксианалог декарбоксилированного S-аденозилметионина, проникающий в этот паразит при помощи специального пуринового транспортера, отсутствующего в клетках млекопитающих (Guo J.Q., et al. 1995. J.Med.Chem., 38, 1770-1777). Одной из альтернатив подобного подхода могут быть вещества, защищающие клетки больного от негативных последствий полиаминотерапии в системе хозяин-патоген. В настоящей работе на примере L.donovani впервые показана возможность создания антидота полиаминной природы - 1-метилспермидина, который полностью заменяет спермидин in vivo и in vitro, но, в отличие от 2-ме-тилспермидина, не способен поддерживать рост L.donovani с истощенным пулом спермидина и путресцина.
Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на: International Conference УPolyamines: Forty Years of Mammalian Ornithine DecarboxylaseФ (Kuopio, Finland, June 2008); XI International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Vienna, Austria, August 2009); 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases (Tivoli-Rome, Italy, December 2010); Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 3 тезиса докладов на международных конференциях.
Объем диссертации. Диссертация изложена на ____ стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ____ таблицами, ____ рисунками и ____ схемами.
Список цитированной литературы включает ____ наименования.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ: 09-04-01272, 10-04-92661Инд; а также Федеральной целевой программой УНаучные и научно-педагогические кадры инновационной РоссииФ (Госконтракт № 02.740.11.5134 от 09 марта 2010 г.) и Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
Список использованных сокращений:
AdoMetDC ЦS-аденозилметиониндекарбоксилаза (КФ 4.1.1.50);
AG Цаминогуанидин;
Agm - агматин (1-гуанидино-4-аминобутан);
APA - 1-аминоокси-3-аминопропан;
APAO - ацетилполиаминоксидаза (КФ 1.5.3.13);
ArgDC - аргининдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.17);
AZ - антизим;
DFMO - -дифторметилорнитин;
DHS - дезоксигипузинсинтаза (КФ 2.5.1.46);
eIF5A - фактор инициации трансляции 5А;
GAPA - 1-гуанидиноокси-3-аминопропан;
Me-Agm - метилагматин (1-гуанидино-4-аминопентан);
Me-GAPA - 1-гуанидиноокси-3-аминобутан;
1-MeSpd - 1-метилспермидин (1,8-диамино-5-азанонан);
2-MeSpd - 2-метилспермидин (1,8-диамино-2-метил-4-азаоктан);
3-MeSpd - 3-метилспермидин (1,8-диамино-3-метил-4-азаоктан);
8-MeSpd - 8-метилспермидин (1,8-диамино-4-азанонан);
1,8-Me2Spd - 1,8-диметилспермидин (2,9-диамино-5-азадекан);
2,2-Me2Spd - 2,2-диметилспермидин (1,8-диамино-2,2-диметил-4-азаоктан);
2-MeSpm - 2-метилспермин (1,12-диамино-2-метил-4,9-диазадодекан);
2,2-Me2Spm - 2,2-диметилспермин (1,12-диамино-2,2-диметил-4,9-диазадодекан);
2,10-Me2Spm - 2,10-диметилспермин (1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан);
N1-Ac-2-MeSpd - N1-ацетил-2-метилспермидин (N1-(ацетил)-1,8-диамино-2-метил-4-азаоктан);
N1-Ac-3-MeSpd - N1-ацетил-3-метилспермидин (N1-(ацетил)-1,8-диамино-3-метил-4-азаоктан);
N1-Ac-8-MeSpd - N1-ацетил-8-метилспермидин (N1-(ацетил)-1,8-диамино-4-азанонан);
Ns - о-нитрофенилсульфонил;
ODC - орнитиндекарбоксилаза (КФ 4.1.1.17) Pht - фталоил;
Put - путресцин (1,4-диаминобутан);
SMO - сперминоксидаза (КФ 1.5.3.16);
Spd - спермидин (1,8-диамино-4-азаоктан);
Spm - спермин (1,12-диамино-4,9-диазадодекан);
SSAT - спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.57).
ВВЕДЕНИЕ Полиамины спермин (Spm) и cпермидин (Spd) присутствуют в значительных количествах в клетках всех типов и необходимы для их нормального роста. Ключевыми ферментами биосинтеза полиаминов (Рис.1) являются пиридоксаль-5'-фосфат зависимая орнитиндекарбоксилаза (ODC), обеспечивающая образование путресцина (Put) у эукариот, и пируват-зависимая декарбоксилаза S-аденозилметионина (AdoMetDC), ответственная за образование универсального донора трехуглеродного остатка. При этом у бактерий широко растространен альтернативный путь биосинтеза Put через агматин (Рис. 1). Ацетилирование Spd и Spm, катализируемое спермин/спермидин-N1-ацетилтрансферазой (SSAT), является скорость лимитирующей стадией катаболизма полиаминов и обеспечивает, наряду сo сперминоксидазой (SMO), превращение Spm в Spd (Рис. 1). Биосинтез этих ферментов тонко регулируется на транскрипционном и трансляционном уровнях, причем основные принципы регуляции установлены как для нормальных, так и опухолевых клеток (см.обзор: Casero R.A. & Marton L.J. 2007. Nat.Rev.Drug Discov., 6, 373-390).
NHNH O NH N N O NHH2N N OH H2N N S H N N H NHHO O Аргинин Агматин NHOH OH O S-аденозилметионин NH2 NH2 H2N OH H2N NHN Орнитин N Путресцин S N N O O NH2 NHN N OH OH H H N1-Ацетилсперминдин Декарбоксилированный S-аденозилметионин OH O H 11, N 13, NH2 H2N H2N N Гипузин eIF5A HN H NH2 O H Спермидин HO N O N H O O NH HS O (CH2)H N NHNH N N H H (CH )HS N1-Ацетилспермин O O NH H N HO N O H H N NHNH2 O H2N N H Трипанотион Спермин Рис. 1. Метаболизм полиаминов. 1- Аргиназа; 2- Аргининдекарбоксилаза; 3- Агматиназа; 4- декарбоксилаза S-аденозилметионина; 5- Орнитин декарбоксилаза; 6- Спермидинсинтаза; 7- Сперминсинтаза; 8- Спермин/спермидин N1-ацетилтрансфераза; 9- Полиаминоксидаза; 10- Сперминоксидаза; 11- Дезоксигипузинсинтаза; 12- Гипузинсинтаза (дезоксигипузинмонооксигеназа); 13- Глутатионилспермидинсинтетаза; 14- Трипанотинсинтетаза. Превращения, характерные для млекопитающих (>), бактерий (--->) и болезне-творных трипаносоматидов (==>).
Создание избирательно действующих химических регуляторов активности ферментов метаболизма полиаминов представляет собой сложную, но перспективную задачу, поскольку опухолевые клетки, в отличие от нормальных, имеют повышенный уровень полиаминов, и возможность получения препаратов, действующих на путях метаболизма полиаминов, служит хорошим стимулом для подобных исследований (Wallace H.M. 2007. Expert.Opin.Pharmacother., 8, 2109-2116). Традиционно различают две фазы истощения пула полиаминов в клетке. Острый дефицит Spm и Spd обусловлен частичным снижением их внутриклеточной концентрации, что, в основном, сказывается на функциях, обусловленных взаимодействиями протонированных при физиологических значениях рН полиаминов с отрицательно заряженными макромолекулами и специфическими сайтами связывания. В этих условиях достаточно разнообразные аналоги Spm и Spd способны восстанавливать рост клеток. При хроническом дефиците полиаминов наблююдается практически полное истощение пула Spd, что делает невозможным жизненно важные превращения, происходящие с его участием. У эукариот выделяют, затрагиваемую в самую последнюю очередь, посттрансляционную модификацию фактора инициации трансляции 5А (eIF5A) (Рис. 1), а у трипаносоматидов - биосинтез трипанотиона (Рис. 1). Дезоксигипузинсинтаза обладает высокой субстратной специфичностью и в литературе описаны лишь два аналога Spd, которые являются донорами аминобутильного остатка - (S)-изомер 1-MeSpd (Hyvonen M.T.
et al. 2007. J.Biol.Chem., 282, 34700-34706) и цис-1,8-диамино-5-азаоктен-2 (Chattopadhyay M.K. et al.
2008. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 105, 6554-6559). Соответственно, использование этих соединений позволяет преодолевать хронический дефицит полиаминов в клетках млекопитающих, хотя возможность гидроксилирования N-(цис-1-аминобутенил-2)-L-лизина в третье положение химически совсем не очевидна.
Развитие и совершенствование методов избирательного регулирования внутриклеточного уровня полиаминов тесно связано с исследованием индивидуальных клеточных функций Spm и Spd. Относительно простым решением, позволяющим дискриминировать клеточные эффекты частично взаимозаменяемых Spm и Spd, может быть истощение внутриклеточного пула полиаминов и использование функционально-активных миметиков Spm и Spd неспособных к взаимопревращениям. Однако, такая достаточно очевидная задача требует неординарных решений, так как аналоги Spm/Spd в полной мере соответствующие вышеуказанным критериям неизвестны.
Мы предположили, что такие вещества могут быть найдены среди С-монометилированных аналогов Spd, причем положение метильной группы, будет влиять на взаимодействие аналогов с ферментами метаболизма полиаминов, а также определять активность этих соединений в культуре клеток. В соответствии с этим, бльшая часть диссертационной работы посвящена синтезу не описанных ранее С-монометилированных аналогов Spd и Spm, включая и изомеры 3-МеSpd, а также изучению биохимических свойств полученных производных - последнее выполнено совместно с зарубежными коллегами.
Гидроксиламин-содержащие ингибиторы ODC и AdoMetDC весьма эффективны in vitrо по отношению к болезнетворным паразитам, вызывающих сонную болезнь, малярию и лейшманиоз. Так S-(5'-дезокси-5'-аденозил)-1-аминоокси-4-метансульфонилциклопентен-2 (IC50 0.мкМ) подавлял размножение T.brucei (Guo J.Q., et al. 1995. J.Med.Chem., 38, 1770-1777); 1-амиоокси-3-аминопропан (АРА) в случае P.falciparum имел IC50 1 мкM (DasGupta R., et al. 2005.
Antimicrob.Agents Chemother., 49, 2857-2864) и IC50 5 мкM в случае амастигот L.donovani (Singh S., et al. 2007. Antimicrob.Agents Chemother. 51, 528-534). Дважды протонированный при физиологических значениях рН 1-гуанидиноокси-3-аминопропан (GAPA) проникал в L.donovani, используя систему транспорта Put, (Singh S. et al. 2008. Biochem.Biophys.Res.Commun., 375, 168-172) и, в противоположность АРА, был активен (IC50 9 мкM) даже в отношении форм паразита, устойчивых к широко используемому антилейшманиозному препарату Солюсурьмино. Однако аминогруппа при первичном атоме углерода a priori предопределяет возможность легкого расщепления GAPA аминооксидазами. Поэтому в настоящей работе GAPA был трансформирован в 1-гуанидиноокси-3-аминобутан (Ме-GAPA), который, подобно 1-метилированным полиаминам (Lakanen J.R., et al. 1992. J.Med.Chem., 35, 724-734), должен обладать катаболической устойчивостью.
Соответственно, одной из задач этого раздела работы был синтез неизвестных ранее Ме-GAPA и изостерного ему 1-гуанидино-4-аминопентана (Me-Agm), что привело к необходимости разработки нового способа получения О-замещенных гидроксиламинов.
I. Новый метод синтеза функционально-замещенных эфиров гидроксиламина Классические методы синтеза О-замещенных гидроксиламинов предусматривают алкилирование N-защищенных производных гидроксиламина алкилгалогенидами (Zeeh B. et al. 1971.
In: Houben-Weyl. Methoden der Org.Chemie, 10/1, 1181-1201), но в ряде случаев для получения функционально-замещенных эфиров гидроксиламина удобнее исходить не из алкилгалогенидов, а из соответствующих спиртов, которые, как правило, более доступны. Использование фталоксима в реакции Мицунобу является наиболее распространенным способом получения эфиров гидроксиламина, исходя из спиртов (Hughes D.L. 1992. In: Organic Reactions, 42, 337-636). Однако, фталоксимная защита оптимальна лишь в тех случаях, когда защищенная аминооксигруппа вводится на одной из последних стадий синтеза и УфункционализацияФ радикала не предусматривается.
Такие ограничения связаны с легкостью раскрытия N-алкоксифталимидного цикла, что делает невозможным даже замену галоида на меркаптогруппу (Bauer L. et al. 1963. J.Org.Chem., 28, 16041608) и позволяет удалять защиту алкиламинами и аммиаком (Maillard L.T., et al. 2005. J.Org.Chem.
70, 6303-6312).
Алкилирование N-защищенных производных гидроксиламина алкилсульфонатами является хорошей альтернативой реакции Мицунобу для получении эфиров гидроксиламинов. Однако такие примеры весьма немногочисленны - алкилирование фталоксима 2Т-трифлатом 5Т,3Тзащищенных нуклеозидов (Karpeisky A., et al. 1998. Tetrahedron Lett., 39, 1131-1134) и алкилирова- ние N-Boc-гидроксиламина незамещенными алкиловыми и аралкиловыми эфирами метансуль- фокислоты (Albrecht S., et al. 2006. Synthesis, 1635-1638).
Сравнение свойств фталильной, трет-бутилоксикарбонильной и этоксиэтилиденовой защит аминооксигруппы показывает, что последняя из них позволяет проводить ши-рокий спектр превращений в радикале (Foillard S., et al. 2008. J.Org.Chem., 73, 983-991), а условия ее удаления мягким кислотным гидролизом таковы, что кислотолабильные N-Boc-аминогруппы не затрагиваются (Симонян А.Р. и соавт. 2006. Биоорган.Химия, 32, 643-650). Таким образом, по совокупности свойств этоксиэтилиденовая защита является оптимальной для синтеза эфиров гидроксиламина. Однако для получения О-замещенных гидроксиламинов, исходя из спиртов, этиловый эфир ацетгидроксимовой кислоты (оксииминоэфир) ранее не использовался. Поэтому представлялось вполне оправданным использовать алкилирование оксииминоэфира мезилатами спиртов для получения функционально-замещенных эфиров гидроксиламина.
На первом этапе работы методом 1Н-ЯМР-спектроскопии была проведена оценка скоростей реакций алкилирования Na-соли оксииминоэфира (1) мезилатом н-бутанола (2) и мезилатом изопропанола (3) в сравнении с алкилированием оксииминоэфира н-бутилбромидом (4) (Схема 1). Все три реакции гладко приводили к искомым О-замещенным гидроксиламинам (5) и (6).
Схема 1.
CH3ONa/CH3OH OH O + R X O N O N R (1) (2): R= n-Bu; X= OMs (5): R= n-Bu;
(3): R= i-Pr; X= OMs (6): R= i-Pr (4): R= n-Bu; X= Br Для определения скорости образования этоксиэтилиденового производного (5) ( 4 ч 30 мин) было использовано изменяющееся во времени соотношение хорошо разрешенных сигналов протонов =NОСН2-группы продукта реакции (5) и суммы частично перекрывающихся сигналов СН2протонов этоксигрупп оксииминоэфира (1) и 1-(этоксиэтилиденаминоокси)-бутана (5) (Рис. 2А).
Рис. 2. Накопление продуктов реакций алкилирования (фрагмент ЯМР-спектра) оксииминоэфира мезилатом н-бутанола (A) и мезилатом изопропанола (Б). Реакционная смесь (20С) содержала 1 М C2H5OC(CH3)=NONa и 1 М н-BuO-Ms (А) или 1 М i-PrO-Ms (Б) в CD3OD.
Аналогично, изменение величины сигнала протона -СН-группы 2-(этоксиэтилиденами- ноокси)пропана (6) во времени (Рис. 2Б) было использовано для оценки скорости образования соединения (6). В этом случае составляет 22 ч. Таким образом, даже мезилат изопропанола алкилировал оксииминоэфир быстрее, чем н-бутилбромид ( 48 ч) - в последнем случае для завершения реакции требовалось нагревание.
На следующем этапе в реакцию с оксииминоэфиром были введены стерически затрудненненный мезилат циклогексанола и мезилаты ряда функционально-замещенных спиртов (Схема 2) В качестве исходных спиртов использовались коммерчески доступные 6-хлоргексанол-1, диэтиловый эфир оксиметилфосфоновой кислоты и 3-аминопропанол-1. 3-Аминобутанол-1 был синтезирован восстановлением этилового эфира 3-аминомасляной кислоты LiAlH4/THF, а не описанный ранее 6-(этоксиэтилиденаминоокси)-гексанол-1 был получен алкилированием Na-соли оксииминоэфира 6-хлоргексанолом-1 в кипящем спирте с выходом 68%. Образование мезилатов (7)-(12) проходило в стандартных условиях (Truce W.E. et al. 1968. J.Org.Chem., 33, 2261-2266) с выходами, близкими к количественным, что позволило использовать высококипящие производные (9) и (12)*) без выделения.
Схема 2.
i ii O.HCl R O Ms R O NHR N O (7): R= Cyclohexyl; (13): R= Cyclohexyl; (19): R= Cyclohexyl;
(8): R= CbzNHCH2CH2CH2-; (14): R= CbzNHCH2CH2CH2-; (20): R= CbzNHCH2CH2CH2-;
(9): R= C2H5OC(CH3)=NO(CH2)5CH2-; (15): R= C2H5OC(CH3)=NO(CH2)5CH2-;(21): R= HCl*H2NO(CH2)5CH2-;
(10): R= BocNHCH(CH3)CH2CH2-; (16): R= BocNHCH(CH3)CH2CH2-; (22): R= HCl*H2NCH(CH3)CH2CH2-;
(11): R= Cl(CH2)5CH2-; (17): R= Cl(CH2)5CH2-; (23): R= Cl(CH2)5CH2(12): R= (C2H5)2P(O)CH2 (18): R= (C2H5)2P(O)CHi- С2H5OC(CH3)=NONa/CH3OH; ii- HCl/H2O Алкилирование Na-соли оксииминоэфира (2 М раствор в МеОН или i-PrOH) мезилатами (7)-(12) проходило гладко и, в основном, заканчивалось за 16-48 ч (для мезилата (7) - за 7 сут) при 20С. Промежуточные этоксиэтилиденовые производные (13)-(18) были выделены перегонкой или кристаллизацией, выходы составляли 70-95% (в случае соединения (13) - 58%, а для соединения (18) - 49%). Удаление этоксиэтилиденовой защиты мягким кислотным гидролизом привело к кристаллическим хлоргидратам (19)-(23) с выходами 85-95%.
Исходя из этоксиэтилиденового производного (16), был синтезирован неизвестный ранее 1-гуанидиноокси-3-аминобутан (Me-GAPA), представляющий собой -метилированное производное GAPA (Схема 3), являющийся in vitro эффективным ингибитором размножения L.dono- vani. Ключевой стадией синтеза Me-GAPA (26) было избирательное удаление этоксиэтилиденовой защиты в присутствии N-Boc-аминогруппы, что достигалось обработкой соединения (16) 1.2 экв NaHSO4 или, что удобнее, 0.75 экв H2SO4 в водном спирте в течение 3-5 мин.
_______________________________ *) Мезилат (12), в противоположность тозилату диэтилового эфира оксиметилфосфоновой кислоты, неустойчив во влажных бензоле и хлористом метилене.
Схема 3.
vi, iii H H H iv Boc N Boc N N N NH2* 2HBr N N H2N Boc H H (28) (27) N NH Me-Agm (29) Boc v i ii Boc Ms Boc N O Boc NH2 iii N O N O N O H H H (24) (16) (10) H H H iv Boc N N N NH2 * 2HBr N O Boc H2N O H N NH Me-GAPA (26) (25) Boc i- С2H5OC(CH3)=NONa/MeOH; ii- H2SO4/H2O/MeOH; iii- Tf-Boc2-Guanidine; iv- HBr/AcOH; v- NaCN/DMSO/40C vi- LiAlH4/Et2O/0C.
Гидроксиламин (24) образовывался с количественным выходом и без выделения вводился в реакцию с трифлатом ди-Вос-гуанидина, что после удаления защитных групп привело к MeGAPA (26) с суммарным выходом 35%, считая на Вос-производное (16). Неизвестный ранее Me-Agm (29), представляющий собой изостер Me-GAPA (26), был приготовлен, исходя из мезилата (10), который сначала был превращен в нитрил (27) (Схема 3). Восстановление цианогруппы LiAlH4/Et2O при 0С и гуанидинилирование образовавщегося Вос-диамина привело к триВос-производному (28). Последующее удаление Вос-защитных групп позволило получить MeAgm (29) с суммарным выходом 48.5%, считая на мезилат (10).
Таким образом, было впервые показано, что алкилирование оксииминоэфира мезилатами разнообразных спиртов является удобным способом синтеза функционально-замещенных эфиров гидроксиламина, позволяющих получать данные соединения в препаративных количествах. Неизвестные ранее Me-GAPA и изостерный ему Me-Agm были синтезированы Умезилатным способомФ с высокими суммарными выходами, исходя из метансульфоната N(трет-бутилоксикарбонил)-3-аминобутанола-1.
II. Синтез С-метилированных аналогов спермидина и их N1-моноацетильных производных Среди аналогов полиаминов особое место занимают гем-диметильные производные Spm и Spd, а также 1-метилированные производные Spm и Spd. Некоторые из них представляют собой достаточно удачные миметики полиаминов. Так 1-МеSpd способен выполнять основные функции Spd in vitro и in vivo и эффективно предотвращает развитие острого панкреатита у SSAT-трансгенных крыс (Rasanen T.L., et al. 2002. J.Biol.Chem., 277, 39867-39872). При этом эффективность взаимодействия 1-метилированных аналогов полиаминов с ферментами их метаболизма зависит от конфигурации хирального центра, поскольку ацетилполиаминооксидаза (АРАО), SMO и дезоксигипузинсинтаза (DHS) обладают стереоспецифичностью (Jarvinen A.J., et al. 2006.
J.Med.Chem., 49, 399-406; Jarvinen A., et al. 2006. J.Biol.Chem., 281(8), 4589-4595; Hyvonen M.T., et al.
2007. J.Biol.Chem., 282, 34700-34706). (S)-изомер 1-МеSpd оказался способен преодолевать как острый, так и хронической дефицит полиаминов в клетке, вызванный инкубацией клеток с ингибиторами биосинтеза полиаминов (Hyvonen M.T., et al. 2007. J.Biol.Chem., 282, 34700-34706).
Введение второй метильной группы в -положение аналогов приводит к тому, что 1,1-Ме2Spd не является субстратом ферментов метаболизма полиаминов и способен восстанавливать рост клеток лишь с острым дефицитом полиаминов, т.е. выполняет лишь те функции Spd, для которых доминантной является правильное расположение трех протонированных при физиологическом значении рН аминогрупп. Подобными биохимическими свойствами обладают и другие гем-диметильные производные Spd (Nagarajan S., et al. 1988. Biochem.J., 254, 373-378).
Соответственно, можно было предположить, что и среди С-монометильных производных Spd, отличных от 1-Ме-Spd, будут найдены субстраты ферментов метаболизма полиаминов, а биохимические свойства этих соединений будут определяться еще и положением метильной группы. Основываясь на этих соображений был осуществлен синтез системы неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd и их N1-Ac-производных (Рис 5).
R1 RO RNHNHH2N N N N H H H R2 RR1 R2-MeSpd: R2=CH3; R1=R3=R4=H N1-Ac-2-MeSpd: R1=CH3; R2=R3=H 3-MeSpd: R3=CH3; R1=R2=R4=H N1-Ac-3-MeSpd: R2=CH3; R1=R3=H 8-MeSpd: R4=CH3; R1=R2=R3=H N1-Ac-8-MeSpd: R3=CH3; R1=R2=H 1,8-MeSpd: R1=R4=CH3; R2=R3=H Рис. 5. Новые С-метилированные аналоги Spd и N1-Ac-Spd.
Исходным соединением для получения 8-Ме-Spd (37) и 1,8-Me2Spd (38) (Схема 4) был Вос-нитрил (27), промежуточное соединение в синтезе Ме-Agm (29), описанный в предыдущем разделе.
Для создания С-N-связи использовали нозилатный метод, хорошо зарекомендовавший себя в синтезах (R)- и (S)-изомеров 1-MeSpd и 1-MeSpm (Grigorenko N.A. et al, 2007, Tetrahedron, 63, 22572262). Соответственно, Вос-диамин (30) был превращен в Вос-нозилат (31), который в DMF реа- Схема H i ii iii, iv Boc N Boc N Boc NHN N Ns N H H H (31) (30) (27) H H H vi, vii, viii Boc N N N NH2 * 3HCl N Cbz H2N H R R (35): R=H 8-Me-Spd (37): R=H (36): R=CH3 1,8-Me2Spd (38): R=CHR R v Cbz Ms Cbz N O N Br H H (8): R=H (33): R=H (32): R=CH3 (34): R=CHi- LiAlH4/Et2O/0C; ii- NsCl/CH2Cl2/Et3N; iii- (33)/DMF/K2CO3/45C или (34)/DMF/K2CO3/45C;
iv- PhSH/DMF/K2CO3; v- LiBr/THF; vi- HCl/EtOH; vii- H2/Pd/MeOH/AcOH; viii- HCl/MeOH.
гировал с N-Cbz-аминопропилбромидом (33), полученным из описанного в предыдущем разделе метансульфоната (18), или N-Cbz-аминобутилбромидом (34) (Схема 4). Затем, без выделения промежуточных тризащищенных 8-МеSpd и 1,8-Me2Spd нозильную защиту удаляли PhSH, а бис-защищенные 8-МеSpd (35) и 1,8-Me2Spd (36) очищали колоночной хроматографией на SiO2.
Последовательное удаление Вос- и Сbz-защитных групп HCl/EtOH и гидрогенолизом над Pdчернью привело к целевым 8-МеSpd (37) и1,8-Me2Spd (38) c суммарными выходами 17% и 12%, соответственно на 8 стадий, считая на Вос-аминонитрил (27).
Первоначально мы планировали получать 2-МеSpd и 3-MeSpd восстановлением легко доступных диаминонитрилов (41) и (42) водородом над Ni-Ренея или PtO2. Однако, в наших руках подобное превращение проходило неоднозначно, вследствие чего выделение 2-МеSpd и 3-МеSpd, требовало многоэтапной очистки хроматографией на SiO2 или Al2O3. Поэтому, основываясь на описанном выше успешном восстановлении Вос-нитрила (27) LiAlH4 в эфире при 0С до Вос-диамина (30), нитрилы (41) и (42) были превращены в ди-Вос-нитрилы (43) и (44), которые и были гладко восстановлены до соответствующих аминов (45) и (46) (Схема 5).
Ди-Вос-триамины (45) и (46) очищали колоночной хроматографией на SiO2 и после удаления защитных групп искомые 2-МеSpd (47) и 3-МеSpd (48) были получены с суммарными выходами 27%*) и 45%, соответственно.
Схема R1 Boc RRH ii iii i N N Boc N N R2 N H2N N H R2 R(39) (41): R1= CH3; R2=H (43): R1= CH3; R2=H : R1= CH3; R2=H (42): R1=H; R2=CH3 (44): R1=H; R2=CH(40): R1=H; R2=CHRBoc RH Boc N NH2 iv N NH*3HCl H2N N H RR(45) 2-MeSpd (47) : R1= CH3; R2=H : R1=CH3; R2=H (46): R1=H; R2=CH3 3-MeSpd (48): R1=H; R2=CHi- NH2(CH2)4NH2/EtOH/20C80C; ii- Boc2O/THF; iii- - LiAlH4/Et2O/-5C; iv- HCl/EtOH Таким образом, неизвестные ранее 2-МеSpd и 3-MeSpd были синтезированы восстановлением соответствующих нитрилов, а для получения не описанных 8-MeSpd и 1,8-Me2Spd было использовано алкилирование нозильных производных.
Однако, 12-ти стадийный, считая на этиловый эфир 3-аминомаслянной кислоты, из которого в 4 стадии было получено соединение (27), синтез 8-МеSpd безусловно требовал упрощения. Поэтому на следующем этапе для построения скелета 8-МеSpd было использовано ал- _______________________________ *) Условия присоединения путресцина к метакрилонитрилу не оптимизировались и 8-амино-2-метил-4-азаоктанитрил (41) был получен лишь с 47% выходом, тогда как в аналогичных условиях присоединение путресцина к кротононитрилу проходило с 85% выходом.
килирование избытка 1,3-диаминопропана соответствующим метансульфонатом (Схема 6). Ис- ходным соединением служил 4-аминопентанол-1 (49), который был получен присоединением нитроэтана к этилакрилату с последующим одновременным восстановлением нитро- и сложноэфирной групп LiAlH4 (Elderfield R.C., et al. 1955. J.Am.Chem.Soc., 77, 4819-4822) и который, в отличие от большинства низших алифатических аминоспиртов, оказался трудно растворим в THF.
Аминоспирт (49) был превращен в соответствующий N-Cbz-метансульфонат, которым алкилировали избыток 1,3-диаминопропана, и Cbz-триамин (51) выделяли колоночной хроматографией на SiO2. Последующее удаление Cbz-группы каталитическим гидрированием над Pd-чернью привело к 8-МеSpd с суммарным выходом 34.5%, считая на 4-аминопентанол-1 (49).
Схема R R RR Ri, ii, iii iv, v H H OH Cbz N NH2 NH2 *3HCl N H2N N H2N H (49): R= CH3 (51): R= CH3; R1=H 8-MeSpd (53): R= CH3; R1=H (50): R=H (52): R=H; R1=CH2-MeSpd (41): R=H; R1=CHi- CbzCl/H2O/NaHCO3; ii- MsCl/C6H6/Et3N; iii- H2N(CH2)3NH2/THF для (53) и H2NCH2СН(СН)3CH2NH2/THF для (41);
iv- H2/Pd/MeOH/AcOH; v- HCl/MeOH.
Мезилатный способ создания С-N-связи оказался удобным и для получения 2-МеSpd в стадии, исходя из 4-аминобутанола-1 (50). Промежуточный Cbz-триамин (52) был приготовлен алкилированием избытка 2-метил-1,3-диаминопропана (Схема 6) мезилатом N-Cbz-аминобутанола с высоким выходом, а последующее удаление защиты аминогруппы привело к 2-МеSpd с суммарным выходом 41%, считая на аминоспирт (50).
Синтез 3-МеSpd (Схема 7) был осуществлен, исходя из 4-аминобутанола-2 (54), который был превращен в соответствующий Вос-защищенный мезилат (55). Последний без выделения был использован для алкилирования избытка путресцина, гладко проходившего при 20С, что привело к Вос-триамину (56), из которого и был получен целевой 3-МеSpd с суммарным выходом 31%, считая на аминоспирт (54).
Схема i ii iii Boc Boc Ms H2N OH N OH N O H H (54) (55) Boc NH2 iv NH2 * 3HCl N N H2N N H H H (56) 3-MeSpd (48) i- Boc2O/THF; ii- MsCl/C6H6/Et3N; iii- H2N(CH2)4NH2/THF; iv- H2/Pd Показано, что мезилатный способ создания C-N связи является универсальным для получения препаративных количеств неизвестных ранее С-метилированных аналогов Spd.
Неизвестные ранее ацетильные производные С-метилированных аналогов Spd были получены, исходя из ортогонально-защищенных промежуточных соединений в синтезах 2-MeSpd, 3-MeSpd и 8-MeSpd. Так, N1-Ac-2-MeSpd и N1-Ac-3-MeSpd были приготовлены из N,NТ-ди-Востриамина (57) и N-Вос-триамина (59), соответственно (Схема 8). Первое из них обрабатывали АсСl в THF и после удаления Вос-защитных групп получили N1-Ac-2-MeSpd (58) с 66.4 % выходом, считая на соединение (57).
Схема O H i, ii NH2 *2HCl N H2N N Boc N N H H (57) N1-Ac-2-Me-Spd (58) Boc i, iv, ii H Boc NH2 iii, ii N N N H2N N Cbz H H (60) (59) Cbz O NH2 *2HCl N N H H N1-Ac-3-Me-Spd (61) i- AcCl/Et3N/THF; ii- HCl/EtOH; iii- CbzCl/Et3N/THF; iv- H2/Pd/MeOH/AcOH.
Для получения N1-Ac-3-MeSpd (Схема 8) исходный N-Вос-триамин (59) сначала карбобензоксилировали по первичной и вторичной аминогруппам, а затем избирательно удаляли Восзащитную группу, что приводило к ди-Сbz-триамину (60). В результате последующего ацетилирования первичной аминогруппы и удаления Cbz-защитных групп был получен N1-Ac-3-MeSpd (61) с выходом 36.9 %, считая на соединение (59).
Для получения N1-Ac-8-MeSpd из N8-Cbz-триамина (62) на первой стадии синтеза необходимо было дискриминировать первичную и вторичную аминогруппы (Схема 9). Для этого был использован салициловый альдегид, который количественно реагировал с первичной аминогруппой с образованием желтого салицилиденого производного, что позволило избирательно ввести Вос-защиту по вторичной аминогруппе и затем, обработав CH3ONH2-основанием, получить промежуточный N4-Boc-N8-Сbz-триамин (63) с высоким выходом, проведя все 3 стадии Уone potФ (Схема 9). Ацетилирование первичной аминогруппы и последующее удаление Вос- и Cbz-защитных групп привели к целевому N1-Ac-8-MeSpd (64) с выходом 46%, считая на Cbzтриамин (62).
Схема H H i, ii, iii iv, v, vi N N H2N N Cbz H2N N Cbz H Boc (63) (62) O NH2 * 3HCl N N H H N1-Ac-8-MeSpd (64) i- o-C6H4(OH)CHO/THF; ii- Boc2O/THF; iii- MeONH2/THF; iv- AcCl/Et3N/THF; v- H2/Pd/; vi- HCl/EtOH Таким образом, в дополнение к неизвестным ранее 2-MeSpd, 3-MeSpd, 8-MeSpd, 1,8Me2Spd, были синтезированы не описанные в литературе N1-Ac-2-MeSpd, N1-Ac-3-MeSpd и N1Ac-8-MeSpd, необходимые для исследования ферментов метаболизма полиаминов и активности аналогов в культуре клеток.
III. 3-Метилспермидин - новый метаболически устойчивый функционально-активный миметик спермидина *) Исследование биохимических свойств С-метилированных аналогов Spd было начато с изучения их взаимодействия с SSAT, так как именно невозможность N1-ацетилирования является одним из основных факторов, определяющих катаболическую устойчивость аналога полиамина в клетке. Оказалось, что 3-MeSpd, подобно 1-MeSpd (Lakanen J.R., et al. 1992.
J.Med.Chem., 35, 724-734), практически не проявляет субстратных свойств в спермин/спермидинN1-ацетил-трансферазной реакции. Включение [14С]-Ас-группы в 3-MeSpd было лишь ~ в 3 раза лучше, чем в случае 1-MeSpd (Рис.3). Следует отметить, что 3-MeSpd оказался неплохим ингибитором SSAT (Кi 50 мкМ), а 2-МеSpd и 8-МеSpd были субстратами SSAT (данные не приведены). Следовательно, перемещение метильной группы даже на одно положение кардинально сказывается на взаимодействии аналога с ферментом.
Рис.3. Включение [14С]-ацетильной группы Ас-СоА в Spd, 1-MeSpd и 3-MeSpd, катализируемое спермин/спермидин-N1-ацетилтрансферазой (SSAT) в зависимости от количества фермента.
Исследование взаимодействия 3-MeSpd с клетками DU145 проводилось в присутствии аминогуанидина (AG) - ингибитора сывороточных аминоококсидаз, предотвращающего неспецифическую деградацию Spd в среде. 3-MeSpd эффективно проникал в клетки, конкурируя за транспорт со Spd (данные не приведены), а его внутриклеточное содержание было сравнимо с таковым для 1-MeSpd и Spd (Табл. 1). Оба аналога снижали уровень Put и Spd в клетках DU145, а влияние 3-MeSpd на уровень Spm сопоставимо с эффектом собственно Spd, но заметно слабее, чем у 1-MeSpd (Табл. 1). Последнее может быть связано с тем, что в клетках DU145 около 20% 1-MeSpd превращается в 1-MeSpm, являющийся метаболически компетентным аналогом Spm.
Анализ внутриклеточного пула полиаминов показал, что в клетках DU1_______________________ *) совместно с Dr. M.Hyvonen, Dr. T.Keinanen и Prof. J.Vepsalainen (University of Eastern Finland, Kuopio) 3-MeSpm не образовывался (Табл. 1), т.е.3- MeSpd был метаболитически устойчив, тогда как 2МеSpd и 8-МеSpd эффективно превращались в соответствующие аналоги Spm (данные не приведены). Более того, 3-MeSpd, подобно 1-MeSpd (этот аналог выполняет основные функции Spd не только in vitro, но и in vivo), восстанавливал рост клеток DU145 с пониженным в результате 72 ч инкубации с -дифторметилорнитином (DFMO) содержанием Put и Spd (Табл. 1).
Табл. 1. Влияние аналогов Spd на рост клеток DU145 и внутриклеточное содержание полиаминов.
Рост Содержание полиаминов в клетках Клетки DU145 клеток Put Spd Spm MeSpd MeSpm (%) (пкмоль/106 клеток) AG 100 4 93 25 1065 58 1513 AG+Spd 94 3 48 21 2416 103 976 AG+1-MeSpd 97 3 34 14 115 12 549 20 3053 47 858 AG+3-MeSpd 101 4 20 4 136 14 1026 59 3030 160 n.d.
AG+DFMO 49 2 59 25 55 6 1197 AG+DFMO+Spd 89 4 35 3 2567 196 831 AG+DFMO+1-MeSpd 86 4 21 2 47 5 246 26 4223 509 959 1AG+DFMO+3-MeSpd 91 5 18 1 n.d. 486 36 5131 159 n.d.
Клетки выращивали 72 ч в присутствии 1 мM AG, 0.1 мM Spd, или 0.1 мM 1-Spd, или 0.1 мM 3-Spd в присутствии 5 мM DFMO, или без него. n.d. - не детектируется Таким образом, 3-MeSpd представляет собой первый метаболически устойчивый функционально-активный миметик Spd, что делает его весьма перспективным инструментом для исследования индивидуальных клеточных функций легко взаимопревращающихся Spm и Spd.
IV. L.donovani: структурные аспекты узнавания метилированных аналогов спермидина в качестве природного полиамина *) Вызываемые болезнетворными трипаносоматидами заболевания, такие как лейшманиоз, малярия, сонная болезнь и т.п. весьма широко распространены в странах Утретьего мираФ, а наиболее крупные очаги лейшманиоза расположены преимущественно на территории Индии и Пакистана. Cолюсурьмино (сурьмяная кислота, этерифицированная двумя молекулами глюконата натрия) является одним из основных средств терапии лейшманиоза. Од-нако, многолетнее и успешное использование этого препарата привело к возникновению резистентных форм L.donovani, что сделало поиск новых метаболических мишеней, перспективных для создания лекарственных средств еще более актуальным (Croft S.L., et al. 2006. Clin.Microbiol.
Rev., 19, 111-126). Биогенные полиамины Put и Spd (Spm, как правило, отсутствует у протозойных паразитов) совершенно необходимы для жизненного цикла L.donovani, что послужило рациональной основой для изучения антилейшманиозной активности ингибиторов ферментов биосинтеза Put и Spd (см.обзор: Birkholtz L-M., et al. 2011. Biochem.J., 438, 229-244). Одним из недостатков большинства из этих ингибиторов является невысокая селективность, приводящая к истощению пула полиаминов не только в L.donovani, но и в клетках хозяина. Возможным реше- __________________________ *) совместно Prof. R.Madhubala (J.Nehru University of New Delhi, India) этой проблемы может быть использование веществ, избирательно ингибирующих ферменты паразита и при этом малоактивных по отношению к соответствующим ферментам хозяина, или ингибиторов, избирательно доставляемых в L.donovani. Однако соединения, полностью соответствующие этим критериям, до настоящего времени неизвестны (см.обзор: Romero E.L. & Maria Jose Morilla M.J. 2008. Expert Opin.Drug Deliv., 5, 805-823). Одна из альтернатив состоит в создании аналогов Spd, способных выполнять основные функции полиаминов в организме хозяина, но при этом не поддерживающих рост L.donovani с истощенным пулом Put и Spd, т.е.
получение оригинальных антидотов полиаминной природы.
Синтезированные в Разделе II С-метилированные аналоги Spd обладают весьма умеренной токсичностью в отношении L.donovani (Табл. 2). Так как a priori трудно предсказать, какие из четырех С-метилированных производных Spd окажутся субстратами ферментов биосинтеза трипанотиона (N1,N8-бис(глутатионил)спермидин, см. Рис.1), обеспечивающего, в том числе, и защиту паразита от активных форм кислорода, то сначала мы исследовали возможность восстановления роста промастигот L.donovani, обработанных GAPA, т.е. в тех условиях, когда внутриклеточное содержание Spd понижено, а уровень трипанотиона мало отличается от контрольного (Singh S., et al. 2008. Biochem.Biophys.Res.Commun., 375, 168Ц172).
Табл. 2. Ингибирование роста промастигот L.donovani С-метилированными аналогами спермидина С-метилированные аналоги Spd IC50, мM 1-MeSpd 0.9 0.2-MeSpd 0.26 0.3-MeSpd 0.7 0.8-MeSpd 0.6 0.Оказалось, что из всех аналогов Spd лишь 2-MeSpd восстанавливал рост L.donovani (Рис.
4). Восстановление роста было неполным, по-видимому, из-за того, что использованная концентрация 2-MeSpd составляла от IC50. Напротив, остальные аналоги Spd, включая и 1-MeSpd, взятые в концентрациях, соответствующих от их IC50, не восстанавливали рост L.donovani с пониженным уровнем Spd, но с практически нормальным содержанием трипанотиона (Рис. 4).
Вызываемое АРА ингибирование роста промастигот L.donovani приводило к снижению не только уровня Put и Spd, но и к значительному падению внутриклеточного содержания три- панотиона (Singh S. et al. 2007. Antimicrob.Agents.Chemother. 51, 528Ц534). В этом случае 3-MeSpd, 8MeSpd и (S)-изомер 1-MeSpd, как и в случае промастигот L.donovani, обработанных GAPA, не восстанавливали рост L.donovani, тогда как 2-MeSpd был весьма эффективен (данные не приведены). Таким образом, возникли косвенные указания на возможность биосинтеза функционально-активного аналога трипанотиона из 2-MeSpd.
Рис. 4. Восстановление роста промастигот L.donovani С-метилированными аналогами спермидина.
Внутриклеточное содержание Put и Spd снижено при помощи GAPA. контроль (1); GAPA мкM + -MeSpd (0.1 мM) (2); GAPA 40 мкM (3); GAPA 40 мкM + -MeSpd (0.45 мM) (4);
GAPA 40 мкM + -MeSpd (0.35 мM) (5); GAPA 40мкM + -MeSpd (0.3 мM) (6).
Поскольку (S)-изомер 1-MeSpd заменяет Spd in vivo и in vitro, но не поддерживает рост L.donovani с истощенным пулом Spd, то этот аналог можно рассматривать в качестве первого антидота полиаминной природы, пригодного для совместного использования с ингибиторами биосинтеза полиаминов при терапии лейшманиоза в системе хозяин-патоген.
V. Синтез R- и S-изомеров 3-метилспермидина Рацемические С-метилированные аналоги Spd восстанавливали рост клеток DU145 с острым дефицитом полиаминов, вызванным инкубацией клеток с DFMO в течение 3 сут (Pис. 5).
Однако при хроническом дефиците Spd, т.е. при инкубации клеток с DFMO в течение 12 сут и более, 3-МеSpd, в противоположность 1- и 2-МеSpd, был неактивен (Pис. 5), хотя in vitro все три аналога были субстратами дезоксигипузинсинтазы (DHS) (Табл. 3).
Рис. 5. Способность C-метилированных аналогов Spd (100 мкМ) поддерживать рост клеток DU145 с истощенным в результате инкубации с DFMO (5 мМ) пулом полиаминов. D - DFMO.
Возможное объяснение подобных различий может быть связано с тем, что лишь один из стереоизомеров 3-МеSpd является субстратом дезоксигипузинсинтазы, но этот стереоизомер не проникает в клетки DU145. Подобное предположение основано на стереоспецифичности фермента, показанной для (R)- и (S)-изомеров 1-МеSpd (Табл. 3), а также на способности системы транспорта полиаминов дискриминировать стереоизомеры 1-МеSpd (Hyvonen M.T. et al. 2009.
Biochem.J., 422(2), 321-328). Однако (R)- и (S)-изомеры 3-МеSpd неизвестны и поэтому для проверки этой гипотезы мы осуществили их синтез.
Табл. 3 Субстратные свойства метилированных аналогов Spd в дезоксигипузинсинтазной реакции Spd (R)-1-MeSpd (S)-1-MeSpd 2-MeSpd 3-MeSpd Активность DHS 100% 16.66% 87.5% 40% 30% Исходными соединениями в синтезе (R)- и (S)-изомеров 3-МеSpd служили коммерчески доступные (R)- и (S)-аланинолы, из которых через метансульфонаты N-(трет-бутилоксикарбонил)-2-аминопропанола-1 с высоким выходом были приготовлены нитрилы N-(трет-бутилоксикарбонил)-3-аминомасляной кислоты (65) и (66), соответственно (Схема 10). Восстановление нитрилов (65) и (66) LiAlH4 в эфире при 0С гладко приводило к N3-Вос-1,3-диаминобутанам (67) и (68).
Схема i,ii,iii iv v, vi Boc OH Boc N N H2N N NHH H (65): (R)-изомер (67): (R)-изомер (66): (S)-изомер (68): (S)-изомер vii viii, ix Cbz Ns Cbz H2N N N N H H H (69): (R)-изомер (71): (R)-изомер (70): (S)-изомер (72): (S)-изомер x, xi, xii N Cbz H2N N N 3HCl Pht N NH* H H H (75): (R)-изомер (73): (R)-изомер (76): (S)-изомер (74): (S)-изомер i- Boc2O/THF; ii- MsCl/C6H6/Et3N;iii- NaCN/DMSO/40С; iv- LiAlH4/Et2O/-5C; v- CbzCl/Et3N/THF;
vi- HCl/EtOH/H2O; vii- NsCl/CH2Cl2/Et3N; viii- J(CH2)4NPht/DMF/K2CO3; ix- PhSH/DMF/K2CO3; x- N2H4/EtOH/;
xi- H2/Pd/MeOH/AcOH; xii- HCl/MeOH Последующее карбобензоксилирование свободной аминогруппы и избирательное удаление Boc-группы действием HCl/EtOH позволило получить ключевые интермедиаты - N1-Cbz-1,3диаминобутаны (69) и (70), из которых были синтезированы соответствующие нозилаты (71) и (72). Алкилирование соединений (71) и (72) N-(4-йодбутил)-фталимидом в DMF и последующее удаление нозильной защиты без выделения промежуточного тризащищенного Spd с высоким выходом привело к N1-Cbz-N8-фталоил-триаминам (73) и (74), которые очищали хроматографией на SiO2. Последовательным удалением Pht- и Cbz-групп гидразинолизом и каталитическим гидрированием над Pd-чернью были получены целевые неизвестные ранее (R)- и (S)-изомеры 3МеSpd (75) и (76) с суммарными выходами 30 % и 25 %, считая на (R)- и (S)-аланинолы.
VI. Синтез 2-метилспермина, 2,2-диметилспермина и 2,11- диметилспермина Полиамин-опосредованная индукция биосинтеза небольшого белка антизима (AZ) явля- ется одним из основных механизмов поддержания гомеостаза Spm и Spd в клетке. AZ регулирует транспорт полиаминов в клетки, а также, имея высокое сродство к ODC, вызывает диссоциацию фермента на субъединицы и обеспечивает их доставку в 26S протеосомы. Соответственно, инкубация клеток с полиаминами и подавляющим большинством их аналогов и производных*) приводит к снижению внутриклеточной активности ODC. Однако, инкубация клеток DU145 с 2-МеSpd, в противоположность Spd и другим его С-метилированным аналогам, практически не вызывала снижения активности ODC (Табл. 4), что было совершенно неожиданным.
Табл. 4. Влияние С-метилированными аналогами Spd (100 мкM) на активность орнитиндекарбоксилазы в клетках DU145 (24 ч инкубации с аналогами).
Контроль 1-MeSpd 2-MeSpd 3-MeSpd 8-MeSpd Активность ODC 29.31.4 4.30.3 21.71.4 8.80.3 4.70.(пмоль/мкг ДНК) Оказалось, что эти свойства 2-MeSpd связаны с его неспособностью (по данным Western blotting) индуцировать биосинтез AZ в клетке, причем аналогично действовал и 2,2-Ме2Spd (данные любезно предоставлены Dr. M. Hyvonen, University of Eastern Finland, Kuopio). Образование активного AZ возможно лишь после Spm/Spd индуцированного +1 сдвига рамки считывания мРНК AZ (Kurain L., et al. 2011. Nature, 477, 490-494). Для исследования влияния 2-МеSpd на собственно сдвиг рамки считывания были использованы мутанты Saccharomices cerivisiae, в которых ген люциферазы находился под контролем промотора AZ. Оказалось, что 2-МеSpd, в отличие от 1-МеSpd, не индуцирует биосинтез люциферазы, т.е. не способен вызывать +1 сдвиг рамки считывания (данные любезно предоставлены Dr. H.M.Wallace, University of Aberdeen, Scotland, UK).
Cоответственно, 2-МеSpd представляет собой первый функционально-активный миметик Spd, который, проникая в клетки, не способен индуцировать +1 сдвиг рамки считывания мРНК антизима, необходимый для биосинтеза функционально-активного белка.
Поэтому для выяснения вклада метильных заместителей во втором положении молекулы _______________________________ *) Исключение составляют 1,2-бис-(2,6-диаза-1-октил)-циклопентан (Mitchell J.L. et al. 2002. Biochem.J., 366, 663671) и N1,N12-диэтил-SpmTrien (Weisell J. et al. 2010. J.Med.Chem., 53(15), 5738-5748), которые в отличие от 2MeSpd, не способны поддерживать рост клеток с истощенным пулом полиаминов, т.е. не являются функционально-активными миметиками Spm.
полиамина в индукцию биосинтеза AZ в дополнение к 2-МеSpd были получены неизвестные ранее 1,12-диамино-2-метил-4,9-диазадодекан (2-МеSpm), 1,12-диамино-2,2-диметил-4,9-диазадодекан (2,2-Me2Spm) и 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан (2,11-Me2Spm).
Целевые 2-МеSpm и 2,2-Me2Spm были синтезированы последовательным наращиванием аминометиленовой цепи, алкилируя избыток аминов мезилатами соответствующих спиртов (Схема 11). Исходным соединением служил метансульфонат N-(бензилоксикарбонил)-3-аминопропанола-1 (8), который использовался в Разделе I для алкилирования оксииминоэфира и в разделе II для синтеза 8-MeSpd. Взаимодействие избытка 4-аминобутанола-1 с метанcульфонатом (8) в THF гладко приводило к N-Cbz-диаминоспирту (77), который карбобензоксилировали по вторичной аминогруппе и затем превращали в метансульфонат (78), являющийся ключевым интермедиатом в синтезах и 2-МеSpm, и 2,2-Me2-Spm. Алкилирование избытка коммерчески доступных 2-метил-1,3-диаминопропана или 2,2-диметил-1,3-диаминопропанана мезилатом (78) в THF гладко приводило к бис-Cbz-тетрааминам (79) и (80), соответственно, которые выделяли колоночной хроматографией на SiO2. Последующее удаление Cbz-групп позволило получить искомые 2-МеSpm (81) и 2,2-Me2Spm (82) в виде хорошо кристаллизующихся тетрагидрохлоридов с суммарными выходами 39.4 и 30.4 %, соответственно, считая на мезилат (8).
Cхема v, vi H H N NHN NH2 Cbz 4HCl* N N H2N N H H (79) (81) Cbz iv ii, iii i Cbz Ms Cbz O Cbz OH N O N N Ms N N H H H H (78) Cbz (8) (77) vii H v, vi H N NH2 Cbz N NHH2N N 4HCl* N N H H (80) Cbz (82) i- NH2(CH2)3OH/THF; ii- CbzCl/NaHCO3/Н2O/THF; iii- MsCl/C6H6/Et3N; iv- NH2CH2CH(CH3)CH2NH2/THF;
v- H2/Pd/AcOH/MeOH; vi- HCl/MeOH; vii- NH2CH2C(CH3)2CH2NH2/THF.
Первоначально, для получения 2,11-Me2Spm мы планировали использовать восстановление достаточно легкодоступного 3,10-диметил-4,9-диазадодекадинитрила водородом над PtOили Ni-Ренея. Однако, учитывая трудности, возникшие при выделении и очистке 2-MeSpd, полученного восстановлением 2-метил-8-амино-4-азаоктаннитрила (41) водородом над PtO2 или Ni-Ренея (cм. Раздел II), и основываясь на гладко протекающем восстановлении N4,N8-бис(трет-бутилоксикарбонил)-2-метил-8-амино-4-азаоктанитрила (43) LiAlH4 в эфире при 0-5С, (см. Раздел II) в качестве основного интермедиата для получения 2,11-Ме2Sрm, был использован N4,N9-бис-(трет-бутилоксикарбонил)-2,11-диметил-4,9-диазадодекадинитрил (Схема 12).
Оказалось, что ди-Вос-динитрил (83) плохо растворим в эфире, а проведение восстановления LiAlH4 в THF при 0-5С сопровождалось элиминированием метакрилонитрила. Соответственно, после удаления Вос-защитных групп и кристаллизации были получены в примерно равных количествах тетрахлоргидрат 2,11-Me2-Spm (84) с суммарным выходом 3.5%, считая на метак- Схема Boc H ii, iii i N N N N N N N H2N (83) (41) Boc (39) iv, v H N NH2 4HCl * H2N N H 2,11-Me2Spm (84) i- NH2(CH2)4NH2/EtOH/20C80C; ii- CH2C(CH3)CN/EtOH/20C80C; iii- Boc2O/THF; iv- LiAlH4/THF/-5C;
v-HCl/EtOH/H2O.
рилонитрил*) и трихлоргидрат 2-МеSpd.
Синтезированные в этом разделе неизвестные ранее 2-MeSpm, 2,2-Me2Spm и 2,11Ме2Spm, в сочетании с 2-МеSpd (cм Раздел II) представляют собой ценные инструменты исследования молекулярных механизмов индукции биосинтеза антизима.
VII. Синтез нового ингибитора сперминоксидазы Флавин-зависимая сперминоксидаза (SMO, см. Рис.1), которая наряду с SSAT является, ключевым ферментом катаболизма Spm, была обнаружена в животных клетках около 10 лет назад (Wang Y., et al. 2001. Canser.Res., 61, 5370-5373). Для этого фермента известен лишь один достаточно эффективный (IC50 10-7 М) ингибитор - цис-3,8,13,18,23,28,33,38,43,48-декаазапентаконтен-25 (Devereux W., et al. 2003. Cancer.Chem.Pharm., 52, 383-390) механизм действия которого не исследован. Проведенное нами изучение взаимодействия С-метилированных аналогов Spd с Табл. 5. Взаимодействие 2-МеSpd (100 мкМ) и Spd (100 мкМ) с АРАО в присутствии или без 5 мМ бензальдегида (БА) Spd c БА 1-MeSpd + БА 2-MeSpd + БА 2-MeSpd без БА Активность 100% 26.32% 268.43% 18.4% АРАО ацетилполиаминооксидазой (АРАО) показало, что в присутствии бензальдегида**) фермент расщепляет 2-Ме-Spd даже эффективнее, чем Spd (Табл. 5). Более того, даже в отсутствие бенз- альдегида 2-МеSpd проявлял слабые субстратные свойства, тогда как Spd вовсе не претерпевал окислительного расщепления (Табл. 5). Основываясь на этих данных и учитывая сходства SMO- и APAO-оксидазных реакций, мы синтезировали неизвестный ранее 1,12-диамино-2,11- бис-метилиден-4,9-диазадодекан (2,11-Met2Spm), который может оказаться фермент-активируемым ингибитором SMO или претерпевать субстратоподобное расщепление (Рис. 7). Исходным ___________________________ *) См. примечание на стр.**) В присутствии ароматических альдегидов АРАО эффективно расщепляет и неацетилированный Spd (Holtta E., 1977, Biochemistry, 16, 91-100; Jarvinen A., et al. 2006. J.Biol.Chem., 281, 4589-4595).
H N NHH2N N H SMO Субстратоподобное H H N NHN NH2 расщепление H2N H2N N Ингибирование SMO H N NHH2N N SMO : Nu H N NHH2N N SMO Рис. 7. Предполагаемый механизм взаимодействия 2,11-Met2Spm со сперминоксидазой соединением в синтезе 2,11-Met2Spm (88) был 3-хлор-2-хлорметилпропен-1, из которого в условиях реакции Габриэля был приготовлен N-(фталоил)-3-амино-2-хлорметилпропен-1 (85). Алкилирование бис-Ns-Put аллилхлоридом (85) и последующее удаления нозильной защиты PhSH привело к N1,N12-бис-(фталоил)-1,12-диамино-2,11-бис-(метилиден)-4,9-диазадодекану (86), который выделяли колоночной хроматографией на SiO2 (Схема 13). Затем соединение (86) превращали в ди-Вос-производное, что позволило после удаления фталильных защит гидразинолизом легко очистить ди-Вос-тетрамин (87) колоночной хроматографией на SiO2.
Схема O O O iv,v ii,iii H i N N N Cl N N Cl Cl H (85) (86) O O O Boc H N NH2 *4HCl N NH2 vi H2N N H2N N H (87) 2,11-Met2Spm (88) Boc i- PhtNK/DMF; ii- Ns2Put/DMF/K2CO3; iii- PhSH/DMF/K2CO3; iv- N2H4/EtOH/; v- HCl/MeOH Последующая обработка соединения (87) HCl/EtOH привела к хорошо кристаллизующемуся тетрагидрохлориду 2,11-Met2Spm (88), обладающего аномальной хроматографической подвижностю (Rf 0.53 в системе диоксан-25% NH4OH, 7:3) по сравнению с 2,11-Me2Spm (Rf 0.в той же системе). Неизвестный ранее 2,11-Met2Spm (88) был получен с суммарным выходом 18.8%, считая на исходный фталимид калия. Это производное Spm представляет безусловный интерес для изучения механизма действия и ингибирования сперминоксидазы.
Выводы 1. Предложен удобный способ синтеза биологически-активных О-замещенных гидроксиламинов, заключающийся в алкилировании оксииминоэфира мезилатами спиртов. Синтезирован ряд функционально-замещенных эфиров гидроксиламина, включая неизвестный ранее 1гуанидиноокси-3-аминобутан (Ме-GAPA). Получен не описанный ранее 1-гуанидино-4-аминопентан, являющийся изостером Ме-GAPA.
2. Для исследования клеточных функций Spd и ферментов его метаболизма предложено использовать систему не описанных ранее С-монометилированных производных Spd и N1-AcSpd, для получения которых были разработаны оригинальные схемы синтезов. Синтезированы неизвестные ранее рацемические 2-MeSpd, 3-MeSpd, 8-MeSpd, 18-Me2Spd, а также N1Ac-2-MeSpd, N1-Ac-3-MeSpd, N1-Ac-8-MeSpd.
3. Осуществлен синтез не описанных ранее (R)- и (S)-изомеров 3-МеSpd.
4. Впервые показано, что биохимические свойства С-монометилированных аналогов Spd определяются положением метильной группы. Так 3-МеSpd оказался новым метаболически-устойчивым функционально-активным миметиком Spd (2- и 8-MeSpd метаболизировали в клетке до соответствующих аналогов Spm), что открывает новые возможности для исследования клеточных функций легко взаимопревращающихся Spm и Spd.
5. Показано, что из всех синтезированных монометильных аналогов Spd, лишь 2-МеSpd способен восстанавливать рост L.donovani с истощенным пулом полиаминов, что позволяет рассматривать 1-МеSpd, выполняющий функции Spd in vitro и in vivo, в качестве первого антидота полиаминной природы пригодного для совместного использования с ингибиторами биосинтеза полиаминов при терапии лейшманиоза в системе хозяин-паразит.
6. Для изучения механизмов Spm/Spd-опосредованной регуляции биосинтеза антизима, обеспечивающего поддержание гомеостаза полиаминов в клетке, синтезирован набор неизвестных ранее 2-метилированных производных Spm - 2-MeSpm, 2,2-Me2Spm и 2,11-Me2Spm.
7. Основываясь на результатах взаимодействия 2-МеSpd с ацетилполиаминооксидазой, синтезирован неизвестный ранее 2,11-бис-метилиден-Spm - потенциальный фермент-активируемый ингибитор сперминоксидазы.
Основное содержание работы
отражено в следующих статьях:
1. Khomutov M.A., Mandal S., Weisell J., Saxena N., Simonian A.R., Vepsalainen J., Madhubala R., Kochetkov S.N. УNovel convenient synthesis of biologically active esters of hydroxylamineФ.
Amino Acids., 38(2), 509-517 (2010).
2. Хомутов М.А., Хивонен М.Т., Симонян А.Р., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Кочетков С.Н., Кейнанен Т.А. УНовый метаболически устойчивый функционально-активный миметик спермидинаФ. Биоорган.химия, 37(2), 253-258 (2011).
3. Hyvnen M.T., Keinnen T.A. Khomutov M., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepslinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. УThe use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolismФ. J.Med.Chem., 54(13), 46114618 (2011).
4. Мандал С., Хомутов М.А., Симонян А.Р., Кочетков С.Н., Мадхубала Р. УLeishmania donovani: Структурные аспекты узнавания С-метилированных аналогов спермидина в качестве при-родного полиаминаФ. Мол.биология, 45(4), 673Ц678 (2011).
Тезисы докладов:
5. Simonian A.R., Khomutov M.A., Weisell J., Soininen P., Vepsalainen J. УSyntheses of novel hydroxylamine containing derivatives of agmatine and GC7Ф. Abstracts of International Conference УPolyamines: Forty years of mammalian ornithine decarboxylaseФ. June 26-30, 2008. Kuopio, Finland. p. 26.
6. Khomutov M., Weisell J., Simonian A., Vepsalainen J. УNovel convenient synthesis of biologically active esters of hydroxylamineФ. Amino Acids, 37 (Suppl. 1), S52 (2009). Abstracts of 11th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins. August, 03-07, 2009. Vienna, Austria.
7. Khomutov M., Hyvnen M., Weisell J., Simonian A., Alhonen L., Vepslinen J., and Keinnen T.
УNovel methylated derivatives of spermidine and N1-acetylspermidineФ. Abstracts of 2nd International Conference on the УRole of Polyamines and their Analogs in Cancer and other DiseasesФ. December 01-06, 2010. Tivoli (Rome), Italy. p. 153.
8. Khomutov M., Simonian A., Weisell J., Hyvnen M., Alhonen L., Keinnen T., Vepslinen J., Kochetkov S. УNovel С-methylated derivatives of spermine and N1-acetylspermidineФ. Polyamine Gordon Research Conferences, June 18-24, 2011. Waterville Valley, NH, USA.