НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ-СИНБИОТИКОВ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ 03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

На правах рукописи

АМЕРХАНОВА

Аделаида Михайловна

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА

НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ-СИНБИОТИКОВ И

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

03.00.07 Ц микробиология

03.00.23 Ц биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

МОСКВА Ц 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор биологических наук,
профессор Алешкин Владимир Андрианович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Бондаренко Виктор Михайлович

доктор биологических наук,

профессор Осипова Ирина Григорьевна

доктор биологических наук Лахтин Владимир Михайлович

Ведущая организация:

Российский Государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится л___ ____________2009 г. в ______час. на заседании диссертационного Совета Д 208.046.01 в Федеральном государственном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212,

г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габри-чевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан л____ ___________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук С. Ю. Комбарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время становится реальностью нависшая над планетой угроза глобального экологического кризиса, существование в условиях которого приводит к развитию нарушений микробной экологии человека, сопровождающихся возникновением иммунодефицитных состояний, нарушением метаболических процессов и аллергизацией макроорганизма.

Наиболее восприимчивым к этим воздействиям является микробиоценоз кишечника, который реагирует на неблагоприятные факторы задолго до клинических проявлений снижением уровня индигенной микрофлоры и возрастанием содержания условно-патогенных микроорганизмов, т.е. состоянием дисбаланса микрофлоры - дисбиозом ( Куваева И.Б., 1991, Пинегин Б.В., 1984, Воробьев А.А.,1997, Шендеров Б.А, 1998, Коршунов В.М., 2000, Eckburg P.B., 2005, Бондаренко В.М., 2007). Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз. Ведущее место среди них принадлежит препаратам на основе микроорганизмов - представителей нормофлоры, что обусловлено их многофункциональным воздействием, включая нормализацию микробиоценоза, иммунного и метаболитного статуса организма, процессов электролитного обмена и т.д. (Поспелова В.В., 2000, Онищенко Г.Г., 2002, Воробьев А.А., 2004, Грачева Н.М., 2004, Мазанкова Л.Н., 2004, Новокшенов А.А., Учайкин В.Ф., 2004, Кафарская Л.И., 2005, Осипова И.Г., 2006, Парфенов А.И., 2006, Бондаренко В.М., 2007, Феклисова Л.В., 2007 г., Лахтин В.М., 2008, Callaway T.R, 2008, Fotiadis C.I, 2008, Francavilla R.,2008, Myllyoma E., 2008).

В связи с широкой распространенностью дисбиотических состояний важное научное и прикладное значение имеет установление закономерностей, связанных с процессами формирования и стабилизации нормобиоценоза, причин, вызывающих его нарушения. Вместе с тем, в настоящее время наши представления об индигенной микрофлоре в полной мере не отражают как всего многообразия отношений внутри микробного сообщества биотопа, так и его взаимосвязей с макроорганизмом.

Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964, Бигон М., Харпер Дж., 1989, Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии (Разумовский С.М., 1999). Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающего с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен (Гончарова Г.И., 1982; Козлова Э.П., 1986, Леванова Л.А., 2003, Rambaud J.C. et al., 2006, Лахтин В.М., 2008).

Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Соколова К.Я., 1999, Мухина Ю.Г., 2005, Кафарская Л.И., 2006, Smehilova, 2008). Становление микробиоценоза ЖКТ в младенческом возрасте во многом определяет физиологический и иммунный статус организма в будущем, поэтому нарушения в ходе этого процесса требуют коррекции. Конструирование препаратов, представляющих собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу ЖКТ человека в определенный возрастной период, является обоснованным подходом к решению данной актуальной проблемы.

Усиление эффекта применяемых средств можно прогнозировать также от сочетанного использования рационально подобранного состава пробиотических микроорганизмов, пребиотиков и функционально активных ингредиентов, дефицит которых является следствием дисбиоза (Gibson G.R., 1995, Тутельян В.А., 2002, Лахтин В.М., 2008, Шендеров Б.А., 2008). Такие препараты относятся к группе синбиотиков (Collins M.D., 1999). Данное перспективное направление также открыто для дальнейших исследований.

Таким образом, выбор темы настоящего исследования определяется актуальностью разработки высокоэффективных средств нового поколения для коррекции микроэкологических нарушений у детей и взрослых.

Цель исследования

Научное обоснование, биотехнологическая разработка и клинико-лабораторное подтверждение эффективности новых подходов к коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ с помощью препаратов-синбиотиков на основе консорциумов бифидобактерий, комплементарных микробиоценозу различных возрастных групп людей, лактобацилл, пребиотиков и функционально значимых ингредиентов, дефицит которых возникает при дисбиозе.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические, культуральные, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов бифидобактерий, оценить их производственную перспективность и отобрать виды, которые относятся к основным представителям бифидофлоры ЖКТ человека.

2. Разработать условия совместного культивирования биомассы бифидобактерий, имеющей многовидовой состав.

3. Оптимизировать методы обезвоживания биомассы бифидобактерий и лактобацилл - распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое.

4. Изучить пребиотические и технологические свойства различных растворимых пищевых волокон и оценить перспективность их включения в состав препаратов-синбиотиков.

5. Разработать рецептуру, технологическую документацию, изготовить экспериментально-производственные серии препаратов-синбиотиков. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов при хранения. Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.

6. Изучить эффективность и безопасность разработанных препаратов при использовании в практике профилактической и восстановительной медицины у людей, относящихся к различным возрастным категориям людей.

Научная новизна

Впервые предложен алгоритм рецептуростроения препаратов нормофлоры, основанный на принципе видового доминирования бифидобактерий в ЖКТ у различных возрастных групп людей (Патенты РФ 2180348, 2180914, 2180915). Разработаны биотехнологические приемы конструирования препаратов-синбиотиков нового поколения Бифидум-Мульти и Нормоспектрум на основе консорциумов бифидобактерий, лактобацилл и ингредиентов, обладающих иммуностимулирующим, метаболическим и пребиотическим действием.

Теоретическая значимость

Выявленная в научных исследованиях смена видового состава бифидо-флоры в процессе онтогенеза явилась теоретическим обоснованием нового подхода к конструированию и применению средств коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ - использованию консорциумов микроорганизмов нормофлоры, видовой состав которых моделирует сукцессионные ряды, меняющиеся в течение жизни человека. Это обеспечивает их комплементарность микробиоценозам ЖКТ конкретных возрастных групп пациентов и обеспечивает высокую эффективность при применении.

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в практику новые оригинальные препараты-синбиотики, высокоэффективные при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ и дифференцированно подобранные для различных возрастных групп людей. Разработаны новые биотехнологические приемы совместного культивирования консорциумов бифидобактерий. Разработаны методы распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое для получения препаратов с высоким содержанием пробиотических микроорганизмов, длительно сохраняющих жизнеспособность. Подтверждена пребиотическая активность ингредиентов - источников пищевых волокон (порошок клубней топинамбура, цикория, яблочного пектина) и показана их технологическая значимость для увеличения сроков и температурного диапазона хранения препаратов.

Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав, санитарно-гигиенические документы и производственные регламенты позволили обеспечить прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и документации и государственной регистрации Федеральной службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище:

1. Бифидум-Мульти-1 для детей от рождения до 3-х лет -

СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000085.10.05.

2. Бифидум-Мульти-2 для детей от 3-х до 12-ти лет -

СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000086.10.05.

3. Бифидум-Мульти-3 для взрослых - СЭЗ № 77.99.03.919.Б.000087.10.05

( ТУ 9197-003-38989935-03, изменения к ТУ 9197-003-38989935-03 № 1.

4. Нормоспектрум ® для детей - СГР № 77.99.23.3.У.10079.9.05

5. Нормоспектрум® для взрослых и детей старше 14-ти лет

- СГР № 77.99.23.3.У.10080.9.05 - ( ТУ 9197-004-38989935-05)

Впервые организовано производство и начат серийный выпуск перечисленных препаратов на предприятии биотехнологического профиля Амфита.

Внедрение в практику

Разработанные препараты используются с профилактической целью и для реабилитации пациентов в следующих учреждениях:

1. Бифидум-Мульти-1 в ГУ л Федеральное агентство высокотехнологичной медицинской помощи Научный Центр Акушерства, гинекологии и перинатологии с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у новорожденных группы риска.

2. Бифидум-Мульти-1 в условиях детской консультации для профилактики микроэкологических и функциональных нарушений ЖКТ у детей первых 18 месяцев жизни.

3. Бифидум-Мульти-1 в условиях стационара НИИ детской гастроэнтерологии (г. Нижний Новгород) у детей с нарушениями пищеварения и микрофлоры кишечника.

4. Бифидум-Мульти-1,2,3 в аллергологическом Центре КНИИЭМ (г.Казань) у детей с аллергодерматозами.

5. Бифидум-Мульти-2 и Нормоспектрум для детей для профилактики острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей, посещающих детские дошкольные учреждения.

6. Бифидум-Мульти-1,2,3 в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микрофлоры и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

7. Нормоспектрум для детей и Нормоспектрум для взрослых в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы
№ 1 (г. Москва) для восстановления микроэкологии и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

8. Бифидум-Мульти-1,2 в Оренбургской государственной медицинской академии в комплексной схеме восстановления микрофлоры у девочек с неспецифическими вульвовагинитами.

9. Нормоспектрум для взрослых в Федеральном агентстве НИИ иммунологии для коррекции дисбиотических нарушений у больных после перенесенных аллергических заболеваний (г. Москва).

10. Нормоспектрум для взрослых на кафедре гастроэнтерологии ФГУ УНМЦ Управления делами Президента РФ для коррекции микрофлоры ЖКТ у пациентов с функциональными заболеваниями кишечника (синдром раздраженного кишечника, функциональный запор) с синдромом дисбактериоза.

11. Нормоспектрум для взрослых в клинической онкологической больнице
№ 62 (г. Москва ) для профилактики ГГСИ у больных, оперированных по поводу колоректального рака.

12. Нормоспектрум для взрослых в Астраханской государственной медицинской академии дл восстановления микрофлоты ЖКТ у больных язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, гастродуоденита после проведения специфической антихеликобактериальной терапии.

Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, актах клинических наблюдений.

Награды за разработку и внедрение:

Получены: знак РОСТЕСТ ГОССТАНДАРТА РОССИИ - За высокое качество с правом маркировки продукции ЗНАКОМ КАЧЕСТВА ВСЕ ЛУЧШЕЕ ЗДОРОВЬЮ; золотая медаль ВВЦ, 2002 г.; золотая медаль им. И.И.Мечникова Российской Академии естесственных наук За практический вклад в укрепление здоровья нации - 2003 г.; серебряная медаль III Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2003 г.; серебряная медаль Всероссийского научно-промышленного форума Россия-единая - 2003; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2004 г.; бронзовая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2006 г.; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2008 г.; медаль Международного фонда биотехнологий им. академика И.Н.Блохиной за участие в конкурсе Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 24 января 2008 г.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: Международная научно-практическая конференция Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования (Москва, 2002), Всероссийский симпозиум Современные аспекты здорового образа жизни (Москва, 2003), Всероссийский форум Великие реки в рамках конкурса Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека (Нижний Новгород, 2003), Международная конференция Технологии и продукты здорового питания (Москва, 2003), 7-ой Международный Конгресс Здоровое питание (Москва, 2003), Международная научно-практическая конференция Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы (Москва, 2004), 6-ая Международная ассамблея Новые медицинские технологии (Москва, 2006), Международный конгресс Новые технологии в детском питании (Москва, 2006), Международный научно-практический конгресс Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация (Москва, 2006), Международный симпозиум Иммунобиологические препараты в педиатрии (Москва, 2006), Всероссийская конференция детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2006), Международный конгресс Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические проблемы (Санкт-Петербург, 2007), Российский национальный конгресс Человек и лекарство ( Москва, 2007, 2008, 2009), Международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2009).

Положения, выносимые на защиту

1. Отбор видов бифидобактерий по признаку доминирования в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей представляет собой новый концептуальный подход к конструированию препаратов для коррекции микрофлоры кишечника.

2. Устойчивые консорциумы - продукт совместного культивирования симбиотической ассоциации технологичных и высокоэффективных видов бифидобактерий являются основой для получения препаратов нового поколения.

3. Распылительная сушка при низкой температуре теплоносителя и сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое перспективны для получения высокоактивных препаратов на основе пробиотических микроорганизмов длительного хранения в широком диапазоне температур.

4. Новый концептуальный подход в разработке и принципе рецептуростроения оригинальных препаратов-синбиотиков Бифидум-мульти и Нормоспектрум.

5. Преимущества по клинико-лабораторным показателям синбиотиков Бифидум-Мульти и Нормоспектрум при использовании в профилактической и восстановительной медицине у разных возрастных групп пациентов по сравнению с аналогичными препаратами моновидового состава.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 64 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ Ц8, в других изданиях - 45, в патентах на изобретение - 11.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 416 наименований, в том числе, 208 зарубежных и 208 отечественных работ. Диссертация изложена на 280 страницах основного текста, содержит 31 рисунок и 79 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы, объем проведенных исследований Исследования проведены в 2000-2008 годах в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИЭМ им. Г. Н. Габричевского в рамках НИР (Рег. номер 01.2.006 08847 ).

Объектами исследований служили культуры бифидобактерий и лактобацилл, в т.ч.: из международных коллекций -13; из отечественных коллекций - 40. В ходе работы было выделено и идентифицировано 270 культур бифидобактерий и лактобацилл, из них 40 идентифицировано до вида, 230 - до рода.

Исследования проводились как традиционными методиками, разработанными в лаборатории биологии бифидобактерий (Гончарова Г.И., 1968, Лянная А.М., 1981), так и с помощью модифицированных и современных методов исследования (Жиленкова О.Г., 2004, Воронина О.Л., 2008).

Для исследования антибиотикочувствительности был применен модифицированный диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890-04 Методические рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL, 2002 г., США. Использовали диски с антибиотиками производства НИИ ЭМ (Россия, Санкт-Петербург).

Таксономию изолятов устанавливали по морфологическим, культуральным, физиологическим и ферментативным свойствам. Для изучения спектра биохимической активности культур применялись коммерческие тест-системы: API-20CHL и API-50CHL (bioMerieux, Франция) и АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).

Видовая идентификация бифидобактерий проводилась молекулярно-биологическими методами, разработанными группой исследователей под руководством к.б.н. Ворониной О.Л. и к.б.н. Лунина В.Г. (ИНБИ РАН им.А.Н.Баха, ВНИИСБ РАСХН).

Параметры распылительной сушки при низкой температуре теплоносителя изучали на полупромышленной установке Мобильный Минор, модернизированной для целей данной работы сотрудниками ОАО Биохиммаш к.т.н. Астафьевым Е.И. и к.т.н. Коноваловым Н.А.

Изучение параметров сушки в псевдоожиженном слое проводилось на лабораторной установке, сконструированной сотрудниками ЦКБ Боеприпасы к.т.н. Шереметом А.П. и к.т.н. Островским В.Г.

В ходе исследований было изготовлено 143 образца биомассы, высушенной распылительным методом и 117 образцов биомассы, обезвоженной сушкой-гранулированием в псевдоожиженном слое. 112 образцов биомассы в качестве контрольной было высушено сублимационным методом.

Для изучения динамики культивирования - как монокультур, так и культур многовидового состава - произведено 360 образцов КЖ на средах различного состава. В работе применяли стандартные лабораторные и производственные питательные среды, используемые для культивирования, селекции и контроля бифидобактерий и лактобацилл и разработанные нами оригинальные среды на основе растительного сырья (Патент РФ № 2214454).

Содержание жизнеспособных микроорганизмов в образцах определяли методом посева и последующего инкубирования десятикратных разведений КЖ и образцов сухой биомассы и готовых препаратов в полужидких средах.

В ходе подготовки к экспертизе и государственной регистрации изготовлено 36 экспериментально-производственных серий препаратов, изучены их санитарно-гигиенические, микробиологические и технологические параметры, определены сроки и условия хранения.

Исследования в области экспериментальной медицины, направленные на изучение профилактического действия разработанных БАД, проводились на следующих группах:

- больные в стационарах инфекционного и гастроэнтерологического профиля - 125 человек в возрасте старше 18-ти лет; дети от 4 до 6 лет в детских дошкольных учреждениях - 98 человек; дети от 3 месяцев до 14 лет в стационарах гастроэнтерологического и инфекционного профиля - 164 человека; новорожденные в отделении перинатологии - 61 человек; онкологические больные - 200 человек.

Проведение данных исследований и анализ полученных результатов осуществлялись на базе КИБ №1 г. Москвы совместно с сотрудниками клинического отдела МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством д.м.н., заслуженного деятеля науки, профессора Грачевой Н.М.; на базе обсервационного детского отделения ГУ Н - АГиП РАМН совместно с зав.отделением. д.м.н., профессором Пономаревой Л.П., к.м.н. Бондарь О.Е., зав. лабораторией микробиологии ,д.м.н., профессором Анкирской А.С.; в детских дошкольных учреждениях под руководством зав.отделением детских инфекций МОНИКИ им. М.Ф.Владимир-ского, д.м.н., профессором Феклисовой Л.В. и к.м.н. Мескиной Е.Р.; на базе хирургического стационара 62-ой клинической онкологической больницы совместно с руководителем кабинета клинической фармакологии, д.м.н., профессором Митрохиным С.Д.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием методов вариационной и описательной статистики; для оценки достоверности различий между показателями использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение и отбор производственно-перспективных видов бифидобактерий

Задачей данного раздела работы был отбор штаммов бифидобактерий по признаку видового доминирования в микробиоценозе различных возрастных групп людей. Согласно данным исследований 60-80 гг., основными представителями бифидофлоры ЖКТ человека являются B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis (Reuter G., 1963), видовое присутствие и долевое участие которых, вместе с тем, меняется в процессе онтогенеза (Рис.1).

Виды B. bifidum и B. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид B.adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды B.infantis и B. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста (Biavati B., 1984, Козлова Э.П., 1986), при этом вид B.infantis данные исследователи относили к преобладающему, а значит, наиболее значимому для организма в этот возрастной период.

Исследования, проведенные в последнее десятилетие, благодаря открытию высокочувствительных молекулярно-биологических методов, существенно расширили знания в области видового разнообразия бифидобактерий (Satokari R.M., 2000, Reuter G., 2001, Ефимов Б.А., 2005, Шкопоров А.Н., 2007 и др.). Открыто уже 43 вида бифидобактерий (Okamoto M, 2008), но состав видов, являющихся доминантными в ЖКТ человека, по данным ряда авторов (Matsuki T., 2004, Бондаренко В.М., 2007) не меняется. При этом, результаты ряда исследований приводят к заключению о влиянии неблагоприятной экологии, отсутствия грудного вскармливания и широкого применения заменителей грудного молока в развитых странах на процесс онтогенеза в младенческий период, в том числе, на становление нормофлоры ЖКТ.

Рис. 1. Видовой состав бифидофлоры у людей разных возрастных групп (по данным Гончаровой Г.И., 1986 )

Так, в ряде европейских странах у обследованных детей отмечалось полное отсутствие вида B.infantis. На этом фоне у детей республики Гана, где в силу экономических причин дети находятся только на грудном вскармливании, бифидобактерии этого вида выделялись в 72% (Young S.L., 2004).

У искусственно вскармливаемых младенцев отмечается пролиферация видов B.adolescentis и B.animalis, нехарактерных для детей этого возраста (Козлова Э.П., 1986, Mah K.W., 2007, Smehilova M., 2008), т.е. идет формированию другого сукцессионного ряда. Таким образом, закономерное формирование микробиоценоза ЖКТ младенца определяется присутствием доминантных видов бифидобактерий (Ventura M., 2007). В связи с представленными данными совершенно очевидно, что для выполнения поставленной задачи - конструирования препаратов, предназначенных для разных возрастных групп людей, видовой спектр бифидобактерий должен быть представлен доминантными видами бифидобактерий B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis, как наиболее физиологичными для организма человека в разные периоды жизни. С этой целью были отобраны штаммы, относящиеся к вышеперечисленным видам; для сравнения использовали типовые штаммы из международных коллекций.

Для выбора высокоэффективных и технологичных культур были изучены 24 культуры бифидобактерий, изучены их морфологические, физиолого-биохимические, культуральные, антагонистические свойства, определен спектр чувствительности к 15 антибиотикам, относящимся к 7 группам антибактериальных препаратов, определена безвредность на лабораторных животных. В результате проведенных исследований отобрано 11 производственно-перспективных штаммов.

Предварительная видовая идентификация в наших исследованиях основывалась на микробиологических и биохимических тестах. Однако неоднозначность результатов, трудоемкость данных методов стимулировали поиск иных подходов для решения поставленных задач.

Анализ литературы показал, что типирование на основе секвенирования одной и более мишеней в геноме бифидобактерий позволяет провести видовую идентификацию штаммов и дифференцировать виды (Новикова Н.А., Соколова К.Я., 2004, Шкопоров, 2006, Бондаренко В.М., 2006, Gill S. R., 2006, Kazuyoshi N, 2008, Namba K., 2008 и др.). В настоящей работе видовую принадлежность штаммов определяли на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal). Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Видовая идентификация выборки коллекционных штаммов бифидобактерий

№	Штамм бифидо-бактерий	Видовая идентификация по:
№	Штамм бифидо-бактерий	фенотипическим признакам	гену 16S рРНК	Гену tal
1.	ГКНМ: ГО-13	B. adolescentis	B. adolescentis	B. adolescentis
2.	ГКНМ: Г 75-13	B. adolescentis	B. longum/ infantis	B. longum
3.	ГКНМ: МС-42	B. adolescentis	B. longum/ infantis	B. breve
4.	ГКНМ: 40	B. adolescentis	B. adolescentis	B. animalis
5.	ГКНМ: 536	B. bifidum	B. bifidum	bifidum
6.	ГКНМ: 791	B. bifidum	B. bifidum	bifidum
7.	ГКНМ: 35	B. bifidum	B. bifidum	B. breve
8.	ГКНМ: ЛВА-3	B. bifidum	B. bifidum	B. breve
9.	ГКНМ: 1	B. bifidum	B. bifidum	B. bifidum clone 1
9.	ГКНМ: 1	B. bifidum	B. bifidum	B. breve clone 2
10.	ГКНМ:79-119	B. breve	B. breve	B. breve
11.	ГКНМ:79-88	B. breve	B. breve	B. breve
12.	ГКНМ: 23	B. breve	B. breve	B. animalis
13.	ГКНМ: 73-15	B. infantis	B. longum/ infantis	B. infantis
14.	ГКНМ: 11-45	B. infantis	B. longum/ infantis	B. infantis
15.	ГКНМ: 302-87	B. infantis	B. longum/ infantis	B. animalis
16.	ГКНМ: B379M	B. longum	B. longum/ infantis	B. longum
17.	ГКНМ: 46	B. longum	B. longum/ infantis	B. infantis
18.	ГКНМ: Я-3	B. longum	B. longum/ infantis	B. adolescentis
19.	ГКНМ: 8	B. longum	B. longum/ infantis	B. breve clone 1
19.	ГКНМ: 8	B. longum	B. longum/ infantis	B. animalis clone 2

* Полужирным шрифтом выделены штаммы, идентифицированные одинаково по результатам секвенирования и по фенотипическим признакам

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что различить виды B. longum и B. infantis позволяет только анализ второй мишени, фрагмента гена трансальдолазы. Результаты генотипирования и фенотипической идентификации совпали для восьми штаммов. В таблице они выделены полужирным шрифтом.

Штаммы ГКНМ: Г75-13 и ГКНМ: 46 идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам.

Штаммы ГКНМ: МС-42, ГКНМ: 40, ГКНМ: 35, ГКНМ: ЛВА-3, ГКНМ: 23, ГКНМ: 302-87 и ГКНМ: Я-3 оказались природными рекомбинантами. Штаммы ГКНМ: 1 и ГКНМ: 8 - генетически неоднородные.

Проведенный анализ позволяет сделать вывод, что генотипирование по фрагменту 16S рРНК не различает все виды бифидобактерий. Таким образом, предложенный подход - анализ штаммов бифидобактерий и по фрагменту гена трансальдолазы дает более полное представление об их видовых различиях.

Уточненные данные видовой принадлежности позволили провести отбор производственно-перспективных штаммов по признаку видового доминирова-

ния в микробиоценозе разных возрастных групп для дальнейших исследований в направлении конструирования ассоциаций бифидобактерий - как основы для препаратов целевого назначения.

2. Изучение динамики глубинного культивирования бифидобактерий в монокультурах и в составе смешанной культуры

2.1. Культивирование монокультур бифидобактерий

В настоящее время в промышленном масштабе производится биомасса только трех штаммов - видов B.bifidum 1 и B.bifidum 791 для фармацевтической промышленности и B.adolescentis МС-42 для молочной промышленности. В связи с этим для решения поставленной задачи - создания устойчивых многовидовых консорциумов впервые предстояло изучить кинетику роста разных видов бифидобактерий - сначала в монокультурах, а затем подобрать условия для их совместного культивирования.

В настоящей экспериментальной работе в качестве модели были использованы следующие штаммы: Bifidobacterium bifidum 791, B. breve 79-119, B.infantis 73-15, B. longum В379М, B. adolescentis ГО-13. В качестве среды выращивания использовали ГМ-среду. Начальный рН среды культивирования составлял 6,7. Инокулят вносился в количестве 5 % от общего объема среды. Пробы из ферментера отбирались с интервалом в один час на протяжении всего цикла культивирования и анализировали их по показателям оптичекой плотности, значению числа КОЕ/мл после культивирования, значение активной кислотности. На основании полученных данных рассчитывали удельную скорость роста , время генерации g по формулам [Ильницкая И.Ю., 1986]:

= lgX1- lgX0 Х 2,3 и g = 0,693,

t1 - t0

где: X0 и X1 - концентрация биомассы (оптическая плотность культуры в начале и в конце отрезка времени); 2,3 - коэффициент перехода от десятичных логарифмов к натуральным. Показатели, характеризующие динамику процесса культивирования, представлены на рис. 2,3,4 логарифмическими кривыми.

Рис.2. Изменение числа КОЕ/мл бифидобактерий

Рис. 3. Изменение оптической плотности КЖ

Рис 4. Изменение активной кислотности (рН)

Как видно из представленных данных, в заданных условиях культивирования отсутствовала лаг-фаза. Длительность экспоненциальной фазы составляла у различных культур от 6 до 12 часов. В течение этого времени происходил равномерный прирост биомассы, что подтверждалось наблюдающейся корреляцией нарастания оптической плотности, активной кислотности и числа КОЕ/мл бифидобактерий. При этом для каждой культуры в идентичных условиях была характерна своя динамика роста. Так, для каждого штамма было отмечено свое значение соотношения числа КОЕ/мл к оптической плотности, что связано с морфологическими и физиологическими особенностями каждого штамма.

Было также показано, что большое значение имеет возраст и количество посевного материала: оптимальным вариантом является засев культурой в период экспоненциальной фазы роста. Инокулят, взятый на стационарной фазе роста, задерживает адаптацию и развитие культуры. Интересно отметить, что пост-экспоненциальная фаза роста культуры имеет ступенчатый характер, что можно объяснить продукцией метаболитов, тормозящих рост культуры [Бандоян А.К., 1984, Вахитов Т.Я., 2000, 2006 ].

Таким образом, полученные нами данные культивирования различных штаммов бифидобактерий показали, что, каждый из них имеет свои особенности культивирования, которые проявляются, прежде всего, в длительности экспоненциальной фазы развития. Если процесс не подвергается искусственной регуляции, пределом развития популяции является содержание бифидобактерий в 1 мл не более lg 9 КОЕ/мл.

2.2. Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации

Решение данной задачи представляет большую важность как с технологической, так и с медико-биологической точек зрения.

С одной стороны, совместное культивирование существенно удешевляет и упрощает производственный процесс. С другой стороны, принцип консорциума пробиотических штаммов, оказывающих взаимное синергидное действие на этапах изготовления препарата и в условиях последующего персистирования in vivo, должен быть приоритетным в создании микробных биопрепаратов. Правомочность такого подхода подтверждает высокая эффективность препарата Ацилакт на основе трех штаммов ацидофильных лактобацилл, сконструированный с учетом межвидового синергизма [Поспелова В.В., 1990].

В эксперименте были использованы те же штаммы бифидобактерий, что и в предыдущем исследовании. Культуры данных штаммов отличаются морфологией колоний, выросших на полужидкой среде, настолько, что была возможна их визуальная дифференциация в составе смешанной популяции. Для проведения совместного культивирования подбирали строго количественно соотношение посевного материала каждого из штаммов. Посев культур проводили поэтапно, с периодичностью в 1 час, регулируя рН культуральной жидкости перед засевом нового штамма до рH 6,7, создавая этим для него оптимальные стартовые условия. Очередность засева зависела от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов: 1 час - B. longum В379М; 2 час - B. breve 79-119; 3 час - B.infantis 73-15; 4 час - B. bifidum 791; 5 час - B. adolescentis Г0-13.

Процесс культивирования вели 12 часов при стандартных условиях.

Как видно из представленных на рис. 5 данных эксперимента, при предложенной схеме внесения посевного материала не происходило взаимного ингибирования культур. Кроме того, у отдельных культур (B.breve, B.infantis, B.adolescentis) показатели числа КОЕ/мл были выше, чем при раздельном выращивании, что подтверждает синергидный эффект в консорциуме. Число КОЕ/мл бифидобактерий в консорциуме составило 5,6х109, т.е. сумму из числа КОЕ/мл каждой из пяти культур.

Рис 5. Сравнительные результаты совместного и раздельного культивирования бифидобактерий

Таким образом, исходя из полученных данных, алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование определенных штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

Рис.6. Сравнительные данные числа КОЕ/мл бифидобактерий в консорциуме и в монокультурах после хранения в течение 15 дней

Еще одним преимуществом совместного выращивания явилась лучшая выживаемость в процессе хранения: в консорциуме отдельные виды сохранялись в жизнеспособном состоянии дольше (рис.6).

Полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий, но и синергидном эффекте и большей стабильности при хранении консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

3. Разработка новых производственных приемов обезвоживания биомассы

Используемый в настоящее время сублимационный метод высушивания биомассы микроорганизмов требует дорогостоящего оборудования, обладает низкой производительностью и большой энергоемкостью, что и определяет перспективность поисков альтернативных методов высушивания.

3.1. Отработка режима распылительного высушивания пробиотических микроорганизмов при низкой температуре теплоносителя

Распылительные сушилки широко применяются в пищевой промышленности, однако, их применение для высушивания препаратов на основе вегетативных культур микроорганизмов до настоящего времени весьма ограничено. Это связано с недостаточно изученным влиянием повреждающих факторов при распылительном высушивании на выживаемость микроорганизмов и отсутствием конструктивного решения для эффективного ведения процесса сушки. Негативное воздействие на клетки микроорганизмов начинает проявляться при температурах, превышающих температуру их культивирования, а также при длительном температурном воздействии. Поэтому губительное влияние на клетки микроорганизмов можно свести к минимуму, если поддерживать температуру на выходе из сушильной камеры, равную или близкую к 370С. Помимо модернизации сушильной

установки с целью снижения температуры и сокращения времени воздействия

был изучен ряд факторов, от которых зависит качество конечного продукта сушки: подобраны защитные среды, выбран оптимальный состав среды культивирования, определена фаза роста культуры, в которой она наиболее устойчива к повреждающим воздействиям в процессе сушки.

Так, было показано, что на ход процесса сушки и качество полученных препаратов влияет такой фактор, как возраст культуры и ее морфологическое состояние (рис. 7).

Как видно на рисунке 7, пробы культуральной жидкости штамма B.bifidum 791, полученные путем глубинного культивирования в ферментере в течение 5 и 7 часов, т.е. во время экспоненциальной фазы роста, высушивались с лучшими показателями числа жизнеспособных клеток и наименьшими потерями - 56,5%+3% и 53,6%+4 % соответственно. Для культуры на третьем часу роста (лаг-фаза) потери были существенными - 85,7%+5%. В стационарной фазе роста (15 часов роста) потери жизнеспособности оказались самыми существенными и составили 90,2%+1%. Таким образом, культура в экспоненциальной фазе роста наиболее устойчива к механическим и температурным воздействиям в процессе сушки.

Рис. 7. Зависимость числа КОЕ/г бифидобактерий в высушенных образцах от морфологического состояния культуры

Было показано, что на качестве процесса сказывается и состав среды выращивания. Сравнительный анализ параметров готового продукта - биомассы, выращенной на производственных и опытных средах, позволил разработать состав среды на основе водного экстракта топинамбура, которая при удовлетворительных показателях остаточной влажности (9,0 %) обладала удовлетворительными ростовыми качествами и высушивалась распылительно с содержанием жизнеспособных бифидобактерий lg КОЕ/г 2,4х109.

Не менее важным этапом данного раздела явилось изучение выживаемости пробиотических микроорганизмов в готовом препарате в процессе длительного хранения. Поиск методов улучшения сохраняемости препаратов распылительной сушки привел к заключению, что в препарат необходимо ввести модифицирующую добавку, снижающую уровень остаточной влаги и улучшающую физико-механические свойства препарата (сыпучесть, гигроскопичность). Помимо влияния на сохранность микроорганизмов, выбранный ингредиент должен обладать также полезным действием на организм человека. К таким ингредиентам можно отнести яблочный пектин. Пектины благотворно влияют на процессы пищеварения, регулируют моторную функцию ЖКТ, стимулируют рост нормофлоры, угнетают УПМ (Лазарева Е.Б., 2007). Молекулы пектина способны связывать катионы поливалентных металлов (кадмия, цинка, свинца, кобальта, стронция и др.).

Пектин добавлялся к сухой биомассе в соотношении 1:1. Поскольку влажность пектина не превышала 3,0%, результирующая влажность смеси биомассы с пектином была около 6,0%. В смеси с пектином заметно улучшились технологические свойства сухого препарата. Данные по хранению сухого препарата бифидобактерий распылительной сушки в смеси с пектином приведены в виде логарифмических кривых роста (рис.8).

Рис. 8. Выживаемость бифидобактерий в смеси с пектином при

разных температурах хранения

Представленные данные иллюстрируют выживаемость бифидобактерий как при стандартных условиях (50С), так и при комнатной температуре (220С) .

Введение модифицирующей добавки в виде яблочного пектина позволило получить сухой препарат на основе бифидобактерий, устойчивый к хранению в широком интервале температур и с улучшенными физико-механическими свойствами. При повышенной температуре хранения (400С) препарат не хранился дольше 7 суток.

Таким образом, благодаря биотехнологическим приемам, разработанным в рамках данного исследования, показана перспективность использования метода распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя для производства пробиотических препаратов.

3.2. Разработка методических подходов к высушиванию пробиотических микроорганизмов на сушильной установке в псевдоожиженном слое

Перспективным методом высушивания пробиотических микроорганизмов является конверсионная технология сушки-гранулирования в псевдоожиженном слое. Четкое конструктивное разделение зоны подачи горячего воздуха и рабочей зоны продукта, находящегося в псевдоожиженном слое, практически исключает перегрев биомассы при установившемся режиме (Островский В.Г., 2002). Суспензия культуральной жидкости, распыляемая форсунками в псевдоожиженном слое, в виде мелких капель осаждается на частицы носителя и высыхает на них.

В данном фрагменте работы проведено изучение ряда производственных питательных сред на пригодность использования для производства сухого препарата по данной технологии: в сравнительных экспериментальных исследованиях ряда производственных сред показано, что наиболее перспективной является кукурузно-лактозная среда.

Для снижения воздействия различных повреждающих факторов, связанных с диспергированием культуральной жидкости, резкими колебаниями давления при входе в распыляющее устройство и при выходе из него, увеличением концентрации электролитов и токсичных веществ в окружающей клетку среде, были подобраны вещества для снижения влияния этих факторов - стабилизирующих рН, изменяющих физико-химические и реологические свойства жидкой субстанции, обладающих антиоксидантным действием, т.е. защитные среды.

Важной технологической составляющей данного раздела явилось изучение возможности использования различных вариантов носителей для нанесения на них жидкой культуры бифидобактерий. Особенное внимание представляло растительное сырье с высоким содержанием ФОС; к ним можно отнести клубни топинамбура, цикория и сою. КЖ штамма B.bifidum 791 наносилась на порошок сои, топинамбура и цикория (для сравнения использовалась лактоза). Полученные данные представлены на рис.9.

Рис. 9. Результаты высушивания биомассы бифидобактерий в псевдоожиженом слое на различных носителях

Как видно на рис.9, все партии готового сухого препарата удовлетворяют предъявляемым требованиям к препаратам по количественному содержанию пробиотических микроорганизмов. Наилучшие результаты получены в пробе, где в качестве носителя использовался порошок из клубней топинамбура, а также порошком цикория - субстратами, содержащими биогенный инулин. Таким образом, метод высушивания биомассы пробиотических микроорганизмов в псевдоожиженном слое является перспективным технологическим приемом: путем напыления биомассы бифидобактерий на функционально значимые ингредиенты возможно получение готовых форм препаратов-синбиотиков. Готовый продукт имеет вид мелких, равномерных гранул, которые можно использовать как самостоятельную форму препарата, а также полуфабрикат для изготовления капсул и таблеток.

4. Изучение пребиотических и биотехнологических свойств топинамбура, цикория и смолы акации

Больший интерес при разработке препаратов-синбиотиков представляют ФОС - растворимые пищевые волокна, сочетающие комплекс технологических свойств со способностью оказывать позитивное влияние на ряд физиологических функций организма: нормализацию микробиоты, усвоение минералов, снижение уровня глюкозы (Gibson G.R., 1995, Van den Heuvel E., 1999, Caers.W., 2004, Шендеров Б.А., 2008).

Основными источниками ФОС являются топинамбур и цикорий - природные кладовые инулина - органического вещества из группы полисахаридов, полимера D-фруктозы, молекула которого состоит из 30-36 остатков фруктозы в фуранозной форме. Олигофруктоза содержит до 10 молекул фруктозы.

Смола акации - это также растворимое волокно, с химической точки зрения представляющее собой полисахарид с молекулярным весом более 200000 дальтон, состоящий главным образом из арабиногалактана и глюкуроновой кислоты.

Задачей данного раздела явилось сравнительное изучение перспективности этих веществ для включения в состав препаратов-синбиотиков.

Из порошка топинамбура готовили водный экстракт в качестве углеводной основы питательной среды для культивирования бифидобактерий. В данном питательном субстрате определяли состав редуцирующих сахаров. В инулиновом компоненте преобладали фракции со степенью полимеризации фруктозы 5-14, т.е. смесь инулина и олигофруктозы. В качестве среды контроля использовали субстрат того же состава, но вместо фильтрата топинамбура в качестве источника углеводов добавляли лактозу. Обе среды стерилизовали и параллельно засевали культурой штамма B.bifidum 791. Сравнительные результаты показателей, характеризующих процесс культивирования на средах, в состав которых входят разные углеводы, представлены на рис. 10 в виде графиков 1,2.

График 1

График 2

Рис. 10. Сравнительные результаты культивирования бифидобактерий

на субстратах, содержащих различные источники углеводов

Сравнение логарифмических кривых роста показывает, что при выращивании на среде с топинамбуром ярко выражена и значительно удлиняется лаг-фаза и, в общей сложности, время культивирования увеличивается на 3 часа. При этом конечный выход биомассы бифидобактерий остается на том же уровне, что и при культивировании на среде с лактозой. Динамика потребления редуцирующих сахаров на среде с топинамбуром подтверждает, что бифидобактерии обладают ферментной системой бета-фруктозидаз, позволяющей им расщеплять инулин, что и объясняет его пребиотический эффект. Как наглядно демонстрирует график 2на рис.10, после того, как происходит заметное нарастание биомассы бифидобактерий, наблюдается скачок на кривой, что должно свидетельствовать, на наш взгляд, об активном усвоении инулина.

Сравнение микроскопических препаратов из культур, выращенных на разных средах, показало, что при выращивании на среде с топинамбуром культура более однородна по морфологии; не отмечалось тенденций к агрегации и образованию скоплений клеток. Результаты вискозиметрии также показали, что КЖ этой среды обладает меньшей вязкостью.

Рис. 11. Показатели содержания жизнеспособных бифидобактерий в

препаратах (КОЕ/г) после высушивания

Эти данные позволяют думать о возможном получении менее гигроскопичного сухого препарата и увеличении сроков его хранения, что получило подтверждение в наших исследованиях: результаты сравнительного анализа образцов биомассы после сублимационной сушки показали, что наилучшие показатели по числу КОЕ/г жизнеспособных бифидобактерий и остаточной влажности были в образцах, выращенных на среде, содержащей экстракт топинамбура (рис.11). Таким образом, топинамбур является ценным и перспективным сырьем для производства препаратов пробиотического назначения, и как источник ФОС, и как технологическая добавка.

Было проведено сравнительное изучение влияния растворимых пищевых волокон на скорость накопления и конечный выход биомассы, а также сохранность пробиотических микроорганизмов при хранения.

В наших исследованиях использовался комплексный продукт (инулин с олигофруктозой) бельгийской фирмы ORAFTI, полученный путем водной экстракции из клубней цикория (торговая марка Raftilosa Sinergy) и коммерческий продукт из смолы акации (торговая марка Fibregum) в виде порошка.

Изучение влияния растворимых волокон на динамику роста и накопления биомассы пробиотических культур проводили на модели штаммов B. bifidum 791, B. longum B379M, L. plantarum 8-PA-3, внося добавки Fibregum и Raftilosa Sinergy в разных концентрациях в среды выращивания. После засева испытуемыми культурами и инкубации определяли число КОЕ/мл КЖ. На рисунке 12 представлены результаты влияния добавок на результаты культивирования штамма L. plantarum 8-PA-3.

Рис. 12. Влияние растворимых пищевых волокон на динамику роста L.plantarum 8-PA-3

Как показали наши эксперименты, добавление в среду выращивания растворимых пищевых волокон Fibregum и Raftilosa Sinergy стимулирует рост бифидобактерий и лактобацилл. Выход биомассы бифидобактерий при этом увеличивается в 5-6 раза. На лактобациллы (штамм L.plantarum 8-PA-3) Fibregum и Raftilosa Sinergy оказывали более выраженный стимулирующий эффект, увеличивая выход биомассы не менее, чем на порядок.

Интересно отметить увеличение длительности экспоненциальной фазы роста на среде с добавлением Raftilosa Sinergy. Это можно объяснить различиями в углеводном составе опытных и контрольной сред и включением в метаболический процесс разных групп ферментов, как уже отмечалось в эксперименте с топинамбуром. Молекула Fibregum представляет собой однородный по составу полисахарид в соединении с более разнородными гликопротеинами.

Было изучено влияние добавок Raftilosa Sinergy и Fibregum на сохранность сухой биомассы бифидобактерий. Исходное содержание бифидобактерий составляло 3,0х108 КОЕ/г.

В условиях пониженной температуры (4-60С) к концу 60 дней исходную концентрацию бифидобактерий сохранили все образцы.

При хранении проб при t 22-24 0С, как показывает рисунке 13, уже к концу второй недели в контрольных образцах и образцах с Fibregum показатели числа КОЕ/г снизились в два раза, а к концу срока хранения - в контрольном - на два порядка, с добавкой Fibregum - на порядок. При этом в пробах, содержащих Raftilosa Sinergy, число жизнеспособных бифидобактерий осталось неизменным в течение всего срока хранения. При хранении всех образцов при температуре 300С каждую неделю активность микроорганизмов падала на один порядок

Рис. 13. Результаты определения количества жизнеспособных бифидобактерий на разных сроках хранения в препаратах с различными добавками при температуре 22-24 0С

Проведенные исследования показали, что Raftilosa Sinergy, так же, как и порошок топинамбура и яблочный пектин, оказывают стабилизирующее действие: в сочетании с ними препараты бактерий сохранялись дольше и проявляли устойчивость к температурным воздействиям в широком диапазоне температур. Наряду с этим, в смеси с Fibregum происходило быстрое отмирание клеток.

Таким образом, результаты исследований технологических параметров культивирования биомассы, разработка схемы культивирования консорциумов бифидобактерий, применение молекулярно-биологических методов для видовой идентификации и отбора штаммов, разработка режимов новых способов высушивания биомассы с целью ее консервации, изучение перспективных с позиций функциональной ценности для организма человека ингредиентов, послужили основанием к разработке оптимального состава препаратов-синбиотиков, предназначенных для различных возрастных групп людей.

5. Разработка рецептуры и технологической документации препаратов-синбиотиков

5.1. Серия Бифидум-Мульти

Основной задачей при конструировании биопрепаратов-синбиотиков Бифидум-Мульти было создание консорциумов бифидобактерий, которые доминируют в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей и предопределяют функции нормальной микрофлоры. Исходя из алгоритма, разработанного в рамках данной работы, были созданы консорциумы для трех возрастных групп, как основы для серии препаратов:

1. Возрастная группа от рождения до 3 лет - Бифидум-Мульти-1 - B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. breve 79-119, B. breve 79-88, B. infantis 73-15, B. infantis 79-43, B. longum В379М.

2. Возрастная группа от 3 до 12 лет - Бифидум-Мульти 2 для детей от 3 до 14 лет- B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. breve 79-88, B. infantis 79-43, B. longum В379М, B. longum Я-3.

3. Возрастная группа от 12 лет и старше - Бифидум-Мульти 3 - B. bifidum 791, B. bifidum ЛВА-3, B. longum В379М, B. longum Я-3, B. adolescentis Г7513, B. adolescentis ГО-13.

Данные по изучению спектра биохимической активности, антибиотикорезистентности, антагонистических свойств, сроков сохранности свидетельствуют о том, что в консорциуму не только суммируется биологический потенциал отдельных штаммов, но и наблюдается синергидный эффект. Так, уровень антагонистической активности в консорциумах выше, чем у отдельных штаммов (табл.2)

Таблица 2

Антагонистическая активность монокультур бифидобактерий и их консорциумов (зоны задержки роста тест-культур (в мм)

Объект исследования	S.sonnei5063	S.flexnery170	E.coli157	S.aureus 209	Pr. Vulgar.177
B. bifidum 1	15,0+2	17,2+3	14,5+1	27,1+2	16,8+4
B. bifidum 791,	16,7+3	15,3+2	15,1+3	14,5+1	17,3+2
B. bifidum ЛВА-3	16,2+2	16,9+1	15,5+2	13,8+1	16,0+3
B. breve 79-88	29,0+2	25,0+2	27+3	25+3	31+1
B. breve 79-119	30,5+1	27+2	29,5+2	30,1+1	28,4+1
B. infantis 79-43	11+1	12+1	16+2	12,5+2	16,5+2
B. infantis 7315	12,1+2	12+1	15,2+2	13,1+2	17,2+2
B. longum В379М	24,2+2	20,1+2	23,0+2	17,9+3	25,6+3
B. longum Я-3	21,3+3	19,8+1	24,2+2	19,0+1	27,1+2
B.adolescentis Г7513	23,2+2	25,5+3	27,2+2	27,5+2	25,7+1
B. adolescentis ГО-13	32,0+2	26,2+1	29,1+2	26,4+1	25,3+1
Консорциум от 0 до 3 лет	34+2	28,5+2	31+2	33,7+1	35+1
Консорциум от 3 до 12 лет	35,1+2	32,9+1	33,3+3	33,2+2	36,4+2
Консорциум для взрослых	35,5+1	36,2+2	34,8+2	35,7+1	35,6+1

Изучение биотехнологических и биологических свойств порошка из клубней топинамбура и яблочного пектина позволили выбрать эти вещества в качестве ингредиентов для включения в состав препаратов Бифидум-Мульти-2 и Бифидум-Мульти-3. В Бифидум-Мульти-1 в качестве технологического и функционального ингредиента, рекомендуемого для детей младшего возраста, помимо биомассы бифидобактерий включен мальтодекстрин. Он состоит из глюкозы, олигосахаридов и солодового сахара, является легко перевариваемой формой углевода; способствует выработке организмом инсулина и широко применяется и рекомендуется к применению детям младшего возраста, в том числе, в составе питательных смесей для детей грудного возраста (Мухина Ю.Г, 2006, Хавкин А.И, 2007).

Формы выпуска также предусматривали удобство приема для пациентов разных возрастных групп:

Бифидум-Мульти-1 - порошок, дозируется мерной ложечкой 0,5 г ;
Бифидум -Мульти-2 - капсулы 0,25 г;
Бифидум-Мульти-3 - капсулы 0,4 г.

Высушивание биомассы производилась параллельно тремя способами - сублимационным, распылительным и в псевдоожиженном слое. Согласно разработанной рецептуре, были изготовлены экспериментально-производственные серии препаратов и заложены на хранение при 4+20С с периодической проверкой жизнеспособности бифидобактерий (рис. 14).

Рис. 14. Показатели содержания жизнеспособных бифидобактерий (КОЕ/г) при хранении

Показано, что во всех образцах бифидобактерии сохранялись в жизнеспособном состоянии без значимых потерь в течение 12 месяцев (при сравнении значений КОЕ/г в процессе хранения различия недостоверны, p>0,5). Препараты, включающие биомассу, высушенную сублимационным и распылительным методами, сохраняли высокие показатели числа КОЕ/г бифидобактерий в течение 18 месяцев, в псевдоожиженном слое - в течение 1 года (при содержании в 1 г готовой продукции не менее lg8), что соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01. Таким образом, по сохранности биомасса распылительного высушивания не уступает высушенной сублимационно. Сроки хранения биомассы, высушенной сушкой-гранулированием в псевдоожиженном слое, также можно признать удовлетворительными.

5.2. Серия Нормоспектрумо

Одной из ведущих причин, приводящих к дефициту витаминов и минералов в организме, является нарушение микробной экологии человеческого организма, возникающее под влиянием целого ряда неблагоприятных факторов. Снижение уровня индигенной микрофлоры приводит к преимущественному размножению УПМ, конкурентному потреблению ими питательных субстратов, в том числе, витаминов и минералов, что еще более усугубляет состояние дисбиоза, с одной стороны, и приводит к дефициту микронутриентов, с другой. Продукты метаболизма патогенных микроорганизмов меняют кислотно-электролитный баланс среды, нарушают проницаемость кишечной стенки, нарушают метаболизм. Без восстановления внутреннего гомеостаза не происходит полноценного усвоения витаминов и минералов. Установлено, что циркуляция в организме и участие в сложных биохимических процессах находится под регулирующим влиянием микрофлоры пищеварительного тракта (Eckburg P.B.,2005, Шендеров Б.А., 2005, 2009). Микроорганизмы, присутствующие в кишечнике, оказывают прямое или опосредованное действие практически на все факторы, определяющие биоусвояемость поступающих в организм микронутриентов. В связи с этим целесообразно при дисбиотических состояниях использовать сочетанно микронутриенты и пробиотические микроорганизмы. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов, что, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболитного баланса в организме.

Для решения данной задачи была разработана серия синбиотиков Нормоспектрум для разных возрастных групп людей. Их основой являются консорциумы бифидобактерий, комплементарные микробиоте ЖКТ различных возрастных групп людей и сконструированные в соответствии с алгоритмом, разработанным в ходе данной работы. В их состав были включены производственно значимые штаммы лактобацилл, витаминно-минеральный комплексом, инулином и олигофруктоза.

В качестве пробиотических составляющих были выбраны следующие штаммы бифидобактерий и лактобацилл из Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора:

Нормоспектрум для детей - живые культуры (не менее 500 млн КОЕ/г): B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. longum B379M, B. breve 79-88, B. infantis 79-43, L. plantarum 8-РА-3, L. acidophilus NK-1, L. casei КНМ-12;

Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14 лет - живые культуры,

не менее 500 млн - B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. longum B379M, B. longum Я-3,

B. adolescentis ГО-13, L. plantarum 8-РА-3, L. acidophilus NK-1,

L. acidophilus К3ш24, L. casei КНМ-12.

В препарат был включен витаминно-минеральный комплекс:

-Витамин Е (токоферол), -Витамин В1 (тиамин), - Витамин В2 - рибофлавин, - Витамин В6 - пиридоксин, - Витамин В12 - кобаламин, - Витамин Вс - фолиевая кислота, - Витамин В5 - пантотеновая кислота, - Витамин РР - ниацинамид, - Витамин Н - биотин, - Витамин С - аскорбиновая к-та, -Цинк, -Селен.

Содержание суточной дозы витаминно-минерального премикса, вводимой в препараты, составляет, в соответствии с рекомендациями Института Питания РАМН, 30-50% от суточной нормы потребления и зависит от возраста (Спиричев В.Б., 2000, Коденцова В.М., 2006).

Формы выпуска также предусматривают удобство приема для пациентов разных возрастных групп:

- Нормоспектрум для детей от 1 до 3 лет - порошок, дозируется мерной ложечкой по 0,5 г ;

- Нормоспектрум для детей от 3 до 14 лет - капсулы 0,25 г;

- Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14 лет - капсулы - 0,34 г.

Были изготовлены, согласно рецептуре, экспериментально-производственные серии препаратов и заложены на хранение при 4+20С с периодической проверкой жизнеспособности бифидобактерий и лактобацилл (рис.15 и 16).

Рис.15. Показатели содержания жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл (КОЕ/г) при хранении в препарате Нормоспектрум для детей

Рис.16. . Показатели содержания жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл (КОЕ/г) при хранении в препарате Нормоспектрум для взрослых

Было установлено, что во всех образцах бифидобактерии и лактобациллы сохранялись в жизнеспособном состоянии без значимых потерь в течение 18 месяцев (при сравнении значений КОЕ/г в процессе хранения различия недостоверны, p>0,5).

Исследования, проведенные в аккредитованных лабораториях, подтвердили соответствие разработанных продуктов требованиям основных нормативных документов - СанПин 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов и СанПиН 2.3.2.1290-03 Гигиенические требования к организации производства и оборота БАД по показателям специфической активности, санитарно-бактериологической и физико-химической безопасности.

Разработаны технические условия ТУ 9197-003-38989935-03, БАД к пище Бифидум-Мульти, ТУ 91979197-005-38989935-05, БАД к пище Нормоспектрум, технологические регламенты производства, проекты потребительских этикеток и рекомендации по применению. Разработанная документация и образцы продукции были представлены на экспертизу в Институт питания РАМН и Центр Экспертиза Роспотребнадзора. После получения положительного решения данная продукция зарегистрирована в Государственном реестре биологически активных добавок к пище, как средства для нормализации микрофлоры и функционального состояния ЖКТ - дополнительные источники пробиотических микроорганизмов; Нормоспектрум, кроме того, как источник витаминов, цинка и селена.

6. Использование разработанных препаратов-синбиотиков в различных областях профилактической и восстановительной медицины

Для оценки эффективности препаратов-синбиотиков и подтверждения заявленной концепции был проведен ряд исследований в различных областях профилактической и восстановительной медицины на базе клинических стационаров, в амбулаториях, в детских дошкольных учреждениях. В исследование были включены пациенты различных возрастных групп. Контрольные группы оставляли пациенты, принимавшие препараты моновидового состава.

Первоначально было проведено изучение эффективности и безопасности Нормоспектрума для взрослых и Бифидум-Мульти-3 у взрослых с вторичными дисбиозами, возникшими на фоне острых и хронических заболеваний ЖКТ; исследования проводились на базе КИП № 1 г.Москвы.

Под наблюдением находилось 65 взрослых больных обоего пола. Все пациенты принимали базовую терапию. Для коррекции дисбиотических нарушений, возникших на фоне основного заболевания, пациенты были разбиты на группы: две опытные группы: 25 пациентов принимали Нормоспектрум для взрослых, 20 - Бифидум-Мульти-3; 20 пациентов (контрольная группа) получали моновидовой препарат Бифидумбактерин. Все препараты принимались 2-3 раза в день в течение 2-3 недель во время еды.

У всех обследованных после курса принимаемых препаратов отмечались положительные сдвиги в состоянии микробиоценоза кишечника и купирование симптомов дисбактериоза. При этом в группах пациентов, принимавших Нормоспектрум и Бифидум-Мульти-3, эти показатели были достоверно выше, чем в группе контроля, в которой был назначен Бифидумбактерин. Аллергических реакций не было отмечено, препараты хорошо переносились больными.

Клинико-лабораторные исследования подтвердили экспериментальные данные о преимуществах в антагонистической активности препаратов комплексного состава. Хорошая переносимость и отсутствие аллергических проявлений можно аргументировать большим содержанием гидролаз в консорциумах, что способствует более полному расщеплению белков и лучшему их усвоению.

Полученные результаты позволили расширить спектр исследований и возрастные границы обследуемых пациентов.

Так, результаты исследования БАД Бифидум-Мульти-1 в перинатологии с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций показали, что у детей группы высокого инфекционного риска применение Бифидум-Мульти-1 способствовало формированию микробиоценоза с более высоким содержанием основных представителей нормофлоры - бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью и в более ранние сроки, чем это отмечалось после приема препарата Бифидумбактерин (рис. 17).

бифидобактерии (109) лактобациллы (109)

Рис. 17. Сравнительные показатели содержания КОЕ/г бифидобактерий и лактобацилл у детей групп риска по развитию ГСГИ после приема препаратов

Более высокие показатели содержания бифидобактерий к 5-6 дню были отмечены у подавляющего большинства детей, получавших Бифидум-Мульти-1 (75%), в то время как в группе контроля таких детей было 16,7%. Лактобациллы в основной группе также встречались в более высоких концентрациях, чем в контроле (на 3 сутки - 106,2+0,4 КОЕ/г в основной группе и 104,6+0,3 КОЕ/г в контроле, на 5-6 сутки - 108,1+0,3 КОЕ/г в основной группе и 106,9+0,3 КОЕ/г в контроле). При этом число новорожденных основной группы, у которых выделялись лактобациллы. составляло 45,9%; в контрольной группе этот показатель составил 20,8%.

Колонизация кишечника условно патогенной флорой была менее выражена у новорожденных, получавших Бифидум-Мульти-1 (Рис.18)

Рис. 18. Колонизация кишечника условно- патогенной флорой у детей групп риска после приема препаратов

Как следствие этого, уменьшалась интоксикация, что проявлялось в более ранней нормализации показателей гемограммы. Перекрест в лейкоцитарной формуле в основной группе детей происходил раньше, реже отмечались аллергические проявления в виде неонатальной токсической эритемы.

Данное исследование показало, что применение БАД Бифидум-Мульти-1 у новорожденных детей группы высокого перинатального инфекционного риска способствует более благоприятному протеканию периода адаптации, чем после применения однокомпонентного препарата Бифидумбактерин, за счет раннего формирования микробиоценоза кишечника с высокими количественными показателями содержания основных представителей нормальной микрофлоры.

Исследования, проведенные в стационаре гастроэнтерологического профиля, показали, что у детей в возрасте 2 - 18 месяцев, получавших Бифидум-Мульти-1, клинические проявления нарушения пищеварения в виде срыгиваний, метеоризма, кишечных колик, запора, нарушения характера стула, купировались на 2-7 дней раньше, чем у пациентов контрольной группы, получавших альтернативные бактерийные препараты (рис.19).

основная

Контрольная

Рис.19. Динамика клинических симптомов нарушений функции пищеварения у детей основной и контрольной групп (день терапии)

Положительная клиническая динамика способствовала повышению массо-ростовых показателей у детей основной группы. В среднем за период наблюдения прирост массы составил 435,0+65,3 г, прирост роста - 0,57+0,12 см. Та же закономерность касалась повышения уровня гемоглобина и эритроцитов в крови.

Исследование микробного пейзажа толстой кишки так же выявило положительные изменения у обследованных детей (рис.20). Так, у детей на фоне приема Бифидум-Мульти-1 отмечалось статистически значимое повышение содержание бифидобактерий (р<0,05), также зарегистрировано уменьшение удельного веса условно-патогенной флоры.

1	Дефицит бифидобактерий	5	актозонегативн. кишечн. пал.
2	Стафилококки	6	Энтерококк
3	Гемолизир. кишечная пал.	7	Грибы рода Candida
4	lac+. кишечн.палочка	8	Клебсиелла
		9	Синегнойная палочка

основная

контрольная

Рис. 20. Сравнительная характеристика микробного пейзажа толстой кишки у детей до и после приема Бифидум -Мульти-1 (в процентах)

Таким образом, сравнение клинико-лабораторных показателей основной и контрольной групп показало, что применение синбиотика Бифидум-Мульти-1 способствовало существенно более раннему восстановлению функционального и микроэкологического статуса ЖКТ детей.

В отделении детских инфекций МИБ № 1 было проведено изучение корригирующего влияния синбиотика Нормоспектрум для детей (всего 45 детей) на клинической состояние и микробиоценоз ЖКТ у детей с дисбактериозом кишечника, возникшем на фоне других заболеваний. Возрастной диапазон пациентов был от 1 до 14 лет. Группу контроля составляли дети, принимавшие Бифидумбактерин (46 детей). Все группы были сопоставимы по возрасту пациентов, тяжести заболевания, срокам начала лечения, а также по характеру дисбиотических нарушений.

Клинические наблюдения за больными, получавшими Нормоспектрум, позволили выявить его более выраженное положительное действие по сравнению с контрольной группой, которое проявлялось в более раннем уменьшении явлений желудочно-кишечного дискомфорта и нормализации стула (рис. 21).

При наличии диарейного синдрома у детей к 3-4 дню от начала лечения уменьшалась кратность стула, улучшалась его консистенция, исчезали патологические примеси в фекалиях. У детей с функциональными запорами, начиная с 6-8 дня, стул становился регулярным. У части больных наблюдалось восстановление аппетита к 4,80,4 дню от начала терапии, уменьшение явлений метеоризма к 2,80.4 дню.

основная

контрольная

Рис. 21. Функциональное состояние ЖКТ после приема препаратов

Изучение кишечной флоры в динамике показало, что после курса применения БАД Нормоспектрум у наблюдавшихся детей выявлено достоверное уменьшение доли пациентов с дисбактериозом кишечника II-III степени с 82, 57,9% до 32,57,4 %, возрастанием числа детей с I степенью дисбактериоза с 7,5,06,0 % до 52,57,8 %. У 15,05,6 % пациентов отмечалась нормализация показателей микрофлоры кишечника (разница показателей достоверна, р<0,05).

В контрольной группе применение Бифидумбактерина также сопровождалось улучшением состояния кишечной микрофлоры, что выражалось увеличением числа детей с дисбактериозом кишечника I степени с 4,34,2 % до 26,09,1%) и уменьшением доли детей с дисбактериозами II степени с 95,74,2% до 65,29,9% (р<0,05). Однако, в отличие от основной, у 26,19,1% детей контрольной группы сохранялись дисбиотические нарушения III степени.

Применение Нормоспектрума у большинства детей повышало содержание как бифидобактерий, так и лактобацилл, при этом выявлена более выраженная положительная динамика на фоне применения препарата в основной группе (рис. 22, 23).

до приема после приема

Рис.22. Содержание бифидобактерий в фекалиях обследованных детей

Рис.23. Содержание лактобацилл в фекалиях обследованных детей до и после приема препаратов

Параллельно росту содержания бифидобактерий в микрофлоре кишечника под влиянием Нормоспектрума наблюдался рост нормальных эшерихий (рис.24). Достоверно снижалось число детей с дефицитом кишечной палочки ниже 300 млн/г фекалий и повышалось число детей с их нормальным содержанием.

до приема после приема

Рис.24. Содержание эшерихий в фекалиях обследованных детей

Существенным результатом применения Нормоспектрума явилась элиминация условно-патогенных бактерий, в том числе S.aureus и грибов рода Candida, что согласуется с данными других авторов о достоверно более эффективном ингибировании роста клинических штаммов С.albicans препаратами, содержащими лектины бифидобактерий и лактобацилл, чем препаратами одних лактобацилл (Лахтин В.М., 2009).

Обсеменённость УПМ и грибами под влиянием Нормоспектрума снизилась в 2,5 раза, в то время как в контрольной группе - в 1,7 раза (рис. 25).

основная

контрольная

Рис.25. Обсемененность кишечника условно-патогенными бактериями и грибами в основной и контрольной группах (до и после приема препаратов)

Таким образом, эффективность препарата Нормоспектрум, проявляющееся в коррекции кишечную микрофлоры и нормализующем влиянии на функциональные расстройства со стороны ЖКТ, значительно превышает таковую при использовании препарата Бифидумбактерин.

Известно (Куваева И.Б., 1991, Коршунов В.М., 2000, Ефимов Е.И., Соколова К.Я., 2004, Дубровская М.И, 2006, Ezindam J., 2008, Bailey., 2009), что микрофлора кишечника выполняет главенствующую роль в формировании как системного иммунитета, так и иммунной системы, ассоциированной с лимфоидной тканью желудочно-кишечного тракта. Являясь самым значимым биотопом в макроорганизме и выполняя роль своеобразного биосорбента, он связан как с внешней средой, так и находится во взаимодействии со всеми остальными биотопами. Ведущая роль микрофлоры кишечника сказывается на состоянии колонизационной резистентности других биотопов, в частности, ротоглотки. Поэтому при организации профилактических мероприятий по снижению заболеваемости, прежде всего, детской, острыми респираторными инфекциями различной этиологии напрашивается вывод о необходимости проведения обязательной коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта. С этой целью были использован синбиотик для детей возрастной группы от 3 до 12 лет Бифидум-Мульти-2.

Исследования проводились в период повышенной сезонной респираторной заболеваемости в 3-х территориально не связанных детских садах. У всех детей одновременно были проведены бактериологические исследования ротоглотки и кишечника. Анализ состояния микрофлоры ротоглотки у детей показал, что оно коррелировало с показателями респираторной заболеваемости: если в анамнезе присутствовали сведения о перенесенных накануне ОРВИ, тонзиллите и пр., в микрофлоре ротоглотки этих детей обнаруживались дисбиотические изменения - золотистый стафилококк с интенсивным обсеменением (105 - 106), а также наличие ассоциаций микроорганизмов, несвойственных данному биотопу (эшерихий, клебсиелл, псевдомонад, грибов рода Candida) (табл.3).

Таблица 3

Частота обнаружения различных бактерий на слизистой ротоглотки

Бактерии	Детский сад №1 N=39 , Абс., (%)	Детский сад №2 n=29, Абс. (%)
Streptococcus spp., 5-7 lg КОЕ/мл, в том числе в кол-ве 8 lg КОЕ/мл	39 (100) 1 (2,5)	28 (96,6) 1 (3,4)
Neisseria spp. 5-7 lg КОЕ/мл	39 (100)	28 (96,6)
Staphylococcus spp., в том числе S. aureus 5-6 lg КОЕ/мл	12 (30,8) 8 (20,5) 3 (7,6%)	11 (37,9) 8 (37,6) 3 (10,3)
E. coli	-	3 (10,3)
Klebsiella spp.	1 (2,5)	1 (3,4)
P. aeruginosa	-	2 (6,8)
Candida albicans	-	1 (3,4)

В табл. 4 представлены показатели состояния микробиоты ЖКТ у наблюдавшихся детей, которые также носили дисбиотический характер.

Таблица 4

Показатели микробиоты кишечника у наблюдавшихся детей

Бактерии	Детский сад №1 n=39, Абс., (%)	Детский сад №2 n=29, Абс., (%)
Bifidobacterium ниже 8 lg КОЕ/г	3 (7,6)	2(6,8)
Lactobacillus ниже 6 lg КОЕ/г	8 (20,5)	4 (13,8)
Общее количество Е. coli ниже 7 lg КОЕ/г	7 (17,9)	5 (17,2)
Е. coli Lac-*	10 (25,6)	8 (27,6)
Е. coli Hly+**	10 (25,6)	11 (37,9)
Грамотрицательные энтеробактерии	4 (10,3)	2 (6,8)
Staphylococcus spp. в том числе S. aureus	9 (23,1) 7 (17,9)	8 (27,6) 6 (20,1)
Candida albicans	3 (7,6)	3 (10,3)

Таким образом, нарушения в обоих биотопах носили количественный и качественный характер, проявлялись одновременно, но имея присущую каждому специфику. Однако, были отмечены также группы микроорганизмов, одновременно встречающиеся в обоих биотопах (рис.26).

Рис. 26. Частота обнаружения стафилококков, грибов и энтеробактерий на биотопах ротоглотки и кишечника и частота совпадения выделенных культур

Обследованные дети были разделены на две подгруппы. Одной из них назначали синбиотик Бифидум-Мульти-2 в течение 14 дней. Вторая подгруппа, не получавшая препарат, служила группой сравнения.

По окончании приема препарата в течение трех месяцев продолжалось наблюдение за детьми: регистрировались случаи заболеваемости ОРВИ, особенности клинических проявлений заболевания, частота возникновения осложнений, случаи назначения антибиотиков, а также учитывалось число дней, пропущенных ребенком из-за болезни.

Результаты сравнительного наблюдения за детьми, получавшими и не получавшими синбиотик Бифидум-Мульти-2, наглядно свидетельствовали о существенно более низком уровне заболеваемости ОРВИ, облегченном их течении после курса приема препарата, в то время как в группе сравнения был зарегистрирован высокий уровень заболеваемости, зачастую с осложненным течением, отмечены интеркурентные заболевания. Период болезни длился значительно дольше и, соответственно, было больше пропущено дней. На этом фоне сравнение результатов первичного и повторного бактериологического обследования группы детей, не принимавших Бифидум-Мульти-2, показал отрицательную динамику в состоянии микрофлоры ротоглотки и кишечника.

Существенным результатом применения Бифидум-Мульти-2 явилось снижение уровня кишечной палочки с атипичными свойствами: в группе, принимавшей Бифидум-Мульти-2 на 61,7 %, в то время, как в контрольной группе этот показатель снизился только на 9,7 % (р>0,001).

Полученные результаты подтвердили тот факт, что состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта играет исключительно важную роль в защите от различных инфекций, а проведенное исследование показало, что применение синбиотика Бифидум-Мульти-2, улучшающего состояние микрофлоры кишечника и ротоглотки, приводит к снижению уровня заболеваемости детей в детском коллективе.

Целью следующего исследования, проведенного на базе онкологической клинической больницы № 62 г. Москвы, был выбор наиболее рациональной и эффективной схемы предоперационной подготовки и послеоперационного ведения больных колоректальным раком, применение которой позволило бы достоверно снизить уровень госпитальных гнойно-септических инфекций у этой категории больных.

С этой целью был апробирован синбиотик Нормоспектрум для взрослых. В исследование были включены четыре группы сравнения: 1) - пациенты получали стандартные предоперационную подготовку и ведение в послеоперационном периоде; 2) - пациенты, принимавшие сорбент Ирмалакс; 3) пациенты, получавшие сорбент в сочетании с Бифидумбактерином; 4) пациенты, получавшие сорбент в сочетании с Нормоспектрумом.

Послеоперационный период у 59 (30%) пациентов из 200 наблюдаемых нами больных с колоректальным раком осложнился развитием той или иной нозологической формы ГГСИ.

Анализ частоты встречаемости случаев ГГСИ в каждой из сформирован-ных нами группе больных, представлен на рис.27.

Рис. 27. Частота встречаемости случаев заболевания в зависимости от схемы профилактики

Наиболее часто инфекционные осложнения в послеоперационном периоде встречались у больных из контрольной группы, которым проводилась лишь стандартная подготовка к операции - у 60 %. Во второй группе, частота осложнений снизилась в два раза, в третьей - в три раза по сравнению с первой группой. Самая низкая частота встречаемости инфекционных осложнений в послеоперационном периоде больных с колоректальным раком была в четвертой группе, где применялся препарат - синбиотик Нормоспектрум. Разница в частоте встречаемости инфекционных осложнений у пациентов из первой и четвертой опытной групп составляла 4, 5 раза (p<0,01).

Эффективность данной схемы обусловлена нормализацией микроэкологии толстой кишки, наступающей благодаря высокой эффективности биопрепарата Нормоспектрум, входящего в данную схему. В Нормоспектрум, помимо штаммов - представителей нормальной микрофлоры входит витаминно-минеральный комплекс, восполняющий их дефицит и активизирующий иммунную систему и нормализующий обмен веществ в организме больного.

Проводя коррекцию дисбактериоза, мы тем самым повышаем колонизационную резистентность организма пациента к эндогенной и экзогенной условно - патогенной микрофлоре - этиологическому агенту ГГСИ. В данном исследовании Нормоспектрум проявляет свойства статика и консерванта метаболизма толстого кишечника, что можно рассматривать как новое, важное направление экстремальной медицины.

Таким образом, Нормоспектрум является новым препаратом - синбиотиком с широкими показаниями для профилактики и лечения госпитальных инфекций у онкологических больных. Это подтвердил и опыт применения Нормоспектрума для взрослых в лечении больных злокачественными лимфопролиферативными заболеваниями. Его включение в схему стандартного химио-лучевого лечения больных из опытной группы оказало положительное влияние на динамику астеновегетативного, абдоминального болевого синдрома и симптомы поражения кишечника по сравнению с контрольной группой, что говорит о целесообразности его назначения больным с онкогематологической и другой онкологической патологией в ходе лечения - проведения лучевой и полихимиотерапии, а также целесообразно их использование в восстановительных программах этой значительной группы больных.

Подводя итог проведенной работе, можно констатировать, что клинические наблюдения за применением новых препаратов-синбиотиков Бифидум-Мульти и Нормоспектрум в различных областях профилактической и восстановительной медицины продемонстрировали их выраженную лечебно-профилактическую эффективность, оцениваемую по совокупности клинико-лабораторных показателей. Сопоставление с препаратами моновидового состава, составлявшими группы сравнения во всех проведенных клинических исследованиях, подтвердило неоспоримые преимущества выбранного подхода - применение для коррекции микроэкологических нарушений консорциумов микроорганизмов нормофлоры в сочетании с функционально значимыми ингредиентами - ФОС, пектином, витаминами и минералами. Особенно важно то, что препараты можно применять целенаправленно для разных возрастных групп людей, обеспечивая индивидуализацию подхода к коррекции микрофлоры и повышая ее эффективность.

ВЫВОДЫ

1. Изучены технологические, пробиотические и молекулярно-биологические свойства бифидобактерий и произведен отбор промышленно-перспективных штаммов, относящихся к видам, доминирующим в микробиоценозе ЖКТ человека.

2.Разработан метод совместного культивирования высокоэффективных и технологичных штаммов бифидобактерий разных видов с целью получения устойчивых консорциумов - основы для препаратов нового поколения. Показано, что в консорциуме не только суммируются количественные (число КОЕ/мл бифидобактерий) и качественные (индивидуальные свойства штаммов) показатели, но проявляется синергидный эффект, что подтверждалось усилением антагонистической активности и повышением устойчивости при хранении по сравнению с отдельными культурами.

3.Разработаны методические подходы, подобраны питательные и защитные среды, технологические добавки (порошок топинамбура, цикория, яблочный пектин), позволяющие использовать современные методы высушивания - распылительную сушку при низкой температуре теплоносителя и сушку-гранулирование в псевдоожиженном слое - для получения биомассы пробиотических микроорганизмов с высокой степенью жизнеспособности, устойчивости к длительному хранению в широком диапазоне температур.

4. Предложен новый концептуальный подход к конструированию и назначению препаратов нормофлоры целевого назначения пациентам разных возрастных групп, основанный на видах бифидобактерий, доминирующих в микробиоценозе этих возрастных категорий: у детей от рождения до 3-х лет: B.infantis, B.breve, B.bifidum, B.longum, у детей от 3 до 14 лет - B.breve, B.bifidum, B.longum, у подростков и взрослых - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis.

5.На основе предложенного принципа рецептуростроения и новых технологических приемов разработаны и зарегистрированы в Федеральном реестре Роспотребнадзора препараты-синбиотики нового поколения Бифидум-Мульти и Нормоспектрум для разных возрастных групп людей, сочетающие в себе устойчивые консорциумы бифидобактерий, лактобациллы и функциональные добавки, оказывающие метаболический, иммуностимулирующий и защитный эффект.

6. При использовании в различных областях профилактической и восстановительной медицины у пациентов, относящихся к разным возрастным группам: у новорожденных высокого риска развития эндо- и экзогенных инфекций (61 ребенок), детей с нарушениями пищеварения (26 детей), пациентов с вторичными дисбиозами после перенесенных заболеваний (68 детей и 65 взрослых), часто болеющих детей в детских дошкольных учреждениях (90 детей), онкобольных хирургического отделения с высоким риском развития инфекционных осложнений (200 больных) - была подтверждена высокая эффективность, безвредность синбиотиков Бифидум-Мульти и Нормоспектрум, а также доказано их преимущество по клиническим и лабораторным показателям перед аналогичными препаратами моновидового состава.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Журналы, рекомендованные ВАК РФ

1. Островский В.Г., Шеремет С.П., Амерханова А.М. Получение сухих гранулированных микробиологических препаратов по конверсионной технологии. // Конверсия в машиностроении - 2003. - №5.- С.6-10.

2. Амерханова А.М., Лаврова А.Е., Дмитриева Г.В., Пырикова И.А., Зубкова Е.С., Жиленкова О.Г., Кураленко А.А. Опыт применения БАД к пище Бифидумбактерин Мульти в педиатрической практике. // Вестник Российской АМН. - № 12. - 2005. - С.30-32.

3. Амерханова А.М., Пономарева Л.П., Анкирская А.С., Бондарь О.Е., Лисунова С.А., Фурсова С.А., Жиленкова О.Г., Зубкова Е.С., Кураленко А.А. Новые биопрепараты-синбиотики и их использование в неонаталогии с профилактической целью. // Вопросы детской диетологии. - М.- 2006. - Т.4.-№ 4. - С.66-69.

4. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S pРНК и трансальдолазы .//Сборник докладов Россельхозакадемии. - М. - 2006. - № 5. - С.9-12.

5. Амерханова А.М., Алешкин В.А., Грачева Н.М., Петрова М.С., Попова О.П., Зубкова Е.С., Жиленкова О.Г., Кураленко А.А., Соловьева А.И. Принципы конструирования препаратов-синбиотиков и оценка их клинической эффективности. // Вестник Российской АМН. - 2006. - № 6. - С.38-45.

6. Феклисова Л.В, Амерханова А.М., Жиленкова О.Г, Мескина Е.Р., Воропаева Е.А., Пожалостина Л.В., Зубкова Е.С., Кураленко А.А., Моисеева К.Д. Возможности применения синбиотиков для снижения заболеваемости часто болеющих детей, посещающих дошкольные учреждения. //Вопросы практической педиатрии. - М.-2007.- т.2.-№ 6.- С.53-59.

7. Амерханова А.М., Алешкин В.А., Митрохин С.Д., Соколов А.А., Жиленкова О.Г., Лисунова С.А., Зубкова Е.С., Кураленко А.А.. Возможности использования препарата Нормоспектрум в профилактике госпитальных гнойно-септических осложнений у больных колоректальным раком. // Инфекционные болезни. - М.- 2007. - том 5.- № 1.- С.3-6.

8. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Анализ видового разнообразия бифидофлоры и влияние синбиотика Бифидум-Мульти-1 на становление и развитие бифидобактерий у детей раннего возраста. // Вопросы детской диетологии. М.- 2008.- т.6 - № 5.- С.59-64.

Другие издания

9. Амерханова А.М., Алешкин В.А. БАДы Полибактерин - новые препараты-пробиотики. //Материалы IV Международного симпозиума Биологически активные добавки к пище: ХХI век. - С-Петербург. - 2000. - С.8-9.

10. Бандоян А.К., Амерханова А.М., Алешкин В.А. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков на основе бифидобактерий. // Cборник статей Проблемы инфекционных болезней. - М. - 2000. - ч.2. - С.284-286.

11. Амерханова А.М., Алешкин В.А., Шендеров Б.А. Комплексные препараты-пробиотики, моделирующие микробиоценоз людей различных возрастных групп. // Cборник трудов Европейского конгресса по астме. - М.-2001.- т.2. - № 1.- С.259-260.

12. Алешкин В.А., Амерханова А.М., Бандоян А.К., Бояркина Л.А. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков. //Сборник материалов IV Международной конференции Пожилой больной. Качество жизни. - М. - 2001.- т.7. - № 8. - С.74-75.

13. Амерханова А.М., Бандоян А.К., Бояркина Л.А., Хачатрян Г.В. Использование топинамбура в составе препаратов и продуктов пробиотической направленности. //Сборник материалов IV Международная конференция Пожилой больной. Качество жизни. - М. - 2001.- т.7. - № 8. - С.75.

14.Амерханова А.М., Бандоян А.К., Бояркина Л.А., Зубкова Е.С., Кононков П.Ф., Гинс М.С., Кропова Ю.Г., Гинс В.К. Использование растительного сырья в составе препаратов и продуктов пробиотической направленности. //Сборник материалов IV Международной научно-технической конференции Пища, экология, человек. - М. - 2001.- С. 75-76.

15. Зубкова Е.С., Амерханова А.М., Гинс В.К. Растение амарант - перспективное сырье для продуктов функционального питания. //Сборник материалов международной конференции Пробиотические микроорганизмы - состояние вопроса и перспективы использования. - М.- 2002. - C.76-77.

16.Хачатрян Г.В., Амерханова А.М., Бандоян А.К. Поиск методических подходов к оптимизации глубинного культивирования бифидобактерий.

//Сборник материалов международной конференции Пробиотические микроорганизмы - состояние вопроса и перспективы использования. - М.- 2002. - С.69-70.

17. Амерханова А.М., Астафьев Е.И., Коновалов Н.А., Хачатрян Г.В., Бояркина Л.А., Хачатрян А.В., Зубкова Е.С. Разработка технологии получения сухой формы бифидумбактерина распылительным методом высушивания. // Там же - C.67-68.

18. Алешкин В.А., Тихонова Н.Т., Амерханова А.М., Левченко Т.А. Новое направление бактериотерапии - комплексные препараты - пробиотики. // Там же - C.47.

19. Амерханова А.М. Бифидобактерии - история вопроса, основные итоги изучения, перспективы использования (в аспекте деятельности лаборатории биологии бифидобактерий ГУ МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского МЗ РФ).// Там же - C.6-8.

20. Амерханова А.М. Комплексные фитопробиотики. //Парафармацевтика. - 2002. - № 10. - С.17-18.

21. Амерханова А.М., Поспелова В.В., Манвелова М.А. Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского - основоположник концепции бактериотерапии. //Сборник Новые лекарственные средства. - М. -2003. - № 7. - С.3-8.

22. Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Амерханова А.М., Соловьева А.И., Зубкова Е.С., Маркелова В.П., Звонарева С.В. Новые препараты Бифидумбактерин-Мульти в практике лечения дисбактериозов кишечника у детей. // Материалы VII всероссийского конгресса Здоровое питание населения России. - М. - 2003. - т.1.- С.137-139.

23. Амерханова А.М., Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А., Зубкова Е.С., Соловьева А.И. Дисбактериоз и индивидуализация коррекции микрофлоры. // Сборник докладов симпозиума Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса. М. - 2003.- С.34-38.

24. Амерханова А.М. Дифференцированный подход к возрастным группам больных - залог эффективного применения пробиотических средств. // Новые лекарственные средства. - М. - 2003. - №7. ЦС. 9-12.

25.Алешкин В.А., Шендеров Б.А., Афанасьев С.С., Амерханова А.М., Поспелова В.В. Пробиотики и интерферон в поддержании здоровья населения. //Сборник материалов международной конференции Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. - М. - 2004. - С.3-5.

26. Галкина Л.А., Феклисова Л.В., Казакова С.П., Амерханова А.М., Машаланчук И.А., Ермаков А.Ф. Результаты применения биологически активной добавки Полибактерин в комплексной терапии больных ангинами. // Там же - С.62-63.

27. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Машаланчук И.А., Ермаков А.Ф., Волохович Т.Т. Динамика показателей микробиоценоза толстой кишки у детей с острыми кишечными инфекциями, получавшими новый поликомпонентный отечественный синбиотик. //. Там же - C.70-71.

28. Алешкин В.А., Амерханова А.М., Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Аваков А.А., Гаврилов А.Ф., Зубкова Е.С., Соловьева А.И. Комбинированные пробиотические препараты - оптимизация профилактики дисбактериозов. //. Там же- C.84-85.

29. Лаврова А.Е., Дмитриева Г.В., Амерханова А.М., Зубкова Е.С., Пырикова И.А. Бифидумбактерин Мульти-1 - новый пробиотик для коррекции дисбиоза у детей. // Сборник материалов V съезда научного общества гастроэнтерологов России . - М.- 2005. - C.427-438.

30. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В., Жиленкова О.Г. Сопоставление результатов клинико-лабораторного изучения микробиоценоза ротоглотки детей с острой респираторной патологией. //Сборник научно-практических работ Современные подходы к профилактике, диагностике и лечению детей в амбулаторных условиях. - М. -2006. - С.104-112.

31.Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Мескина Е.Р., Жиленкова О.Г. Пожалостина Л.В. Состояние микробиоценоза кишечника у детей, посещающих дошкольные учреждения, и возможность коррекции нарушений при использовании синбиотика Бифидум-Мульти-2. //Cборник работ Всероссийской научно-практической конференции Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей. - С-Петербург. - 2006. - С.75.

32.Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г., Воропаева Е.А., Пожалостина Л.В., Моисеева К.Д. и.др. Микробиоценоз слизистых оболочек ротоглотки и кишечника у детей, посещающих детские сады. // там же. - С.76.

33. Амерханова А.М., Алешкин В.А., Грачева Н.М., Петрова М.С., Попова О.П. Принципы конструирования и оценка клинической эффективности нового синбиотика Нормоспектрумо. // Практическая медицина. - Казань. - 2006. - № 4(18). - С.46-47.

34. Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г. Новые препараты-синбиотики для коррекции микрофлоры у детей разных возрастных групп. // Ремедиум Приволжья. - Н.Новгород. -2006.- № 6.-С 53.

35. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В., Жиленкова О.Г., Моисеева К.Д. Состояние микрофлоры кишечника у детей, посещающих детское дошкольное учреждение. // Сборник научно-практических работ под редакцией Л.В.Феклисовой. - М.- 2006. - С.104-112.

36. Троицкая Н.Б., Феклисова Л.В., Савицкая Н.А., Амерханова А.М., Моисеева К.Д., Воропаева Е.А., Мескина Е.Р. Микробиологическая и терапевтическая коррекция при использовании пробиотиков в лечении больных острой респираторной патологией и у здоровых детей. // Сб. материалов научно-практической конференции Современные вопросы лечебной и практической медицины. - М.-2006.- С.202-206.

37. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г., Пожалостина Л.В. Новые пути оптимальной коррекции микробиологических нарушений кишечника у детей. //Сборник материалов III ежегодной Московской конференции Гнойно-септические заболевания у детей с участием регионов России и стран СНГ. - М. - 2007. - С.107-108.

38. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Оценка эффективности использования препаратов Бифидум-Мульти-1 и Бифидум-Мульти-2 в комплексе реабилитационных мероприятий у детей с дисбиотическими нарушениями кишечника. // Сборник тезисов докладов ХIV Российского конгресса Человек и лекарство. - М. -2007. - С.718

39.Амерханова А.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Жиленкова О.Г., Лисунова С.А., Зубкова Е.С., Кураленко А.А.. Роль пробиотических микроорганизмов в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины и возможности повышения эффективности препаратов на их основе. // Новые лекарственные средства. - М.- 2007.- вып.4. - С. 4-7.

40. Алешкин В.А., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г., Лисунова С.С., Зубкова Е.С., Кураленко А.А.. Синбиотики и их роль в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины. // Клиническое питание. - С-Петербург.- 2007.- № 1-2. - стр.А19.

41. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S pPНК и трансальдолазы . // Там же - стр.А31.

42. Жиленкова О.Г., Лисунова С.А., Амерханова А.М., Зубкова Е.С., Кураленко А.А. Чувствительность к антибактериальным препаратам производственных штаммов бифидо- и лактобактерий. //Там же. - стр.А41.

43. Пономарева Л.П., Бондарь О.Е., Анкирская А.С., Амерханова А.М., Лисунова С.А., Жиленкова О.Г. Применение бактерийного препарата Бифидум-Мульти у новорожденных группы высокого инфекционного риска. // Там же. - стр. А 63.

44. Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Мескина Е.Р., Жиленкова О.Г, Зубкова Е.С., Кураленко А.А., Пожалостина Л.В., Воропаева Е.А., Моисеева К.Д. Состояние микрофлоры кишечника и ротоглотки у детей детских дошкольных учреждений, возможность коррекции синбиотиком Бифидум-Мульти-2// Там же.-.С.20-22.

45. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Лечебное питание, как фактор коррекции параметров микробиоценоза толстой кишки у детей с учетом его возрастных особенностей. // Сборник материалов научно-практической конференции педиатров России Фармакология и диетология в педиатрии. М.- 2007.- С.113.

46. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Эффективность коррекции нарушения микробиоценоза толстой кишки у детей с учетом его возрастных особенностей. // Там же. - С.114.

47. Пономарева Л.В., Анкирская А.С., Бондарь О.Г., Амерханова А.М., Лисунова С.А., Фурсова С.А., Жиленкова О.Г. Сравнительная оценка эффективности использования препаратов Бифидум-Мульти-1 и Бифидумбактерин с целью профилактики у новорожденных высокого перинатального риска по реализации внутриутробных инфекций. // Сб. материалов конгресса Человек и лекарство. - М.-2007.-С.730.

48. Соколов А.А., Митрохин С.Д., Минаев В.И., Забазный Н.П., Сергеев С.А., Широкорад В.И., Сергеев В.П., Амерханова А.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Современные подходы к антибиотикопрофилактике госпитальных инфекций у больных, находящихся в отделениях хирургического профиля онкологического стационара. //Методические указания № 24.-М.- 2007.- 26 C.

49. Пожалостина Л.В., Амерханова А.М., Феклисова Л.В., Лиханская Е.И. Распространение криптоспоридий среди детей, посещающих дошкольные учреждения. // 4 Международная конференция Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. С-Петербург.- 2008. - С.135.

50. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В., Воропаева Е.А., Жиленкова О.Г. Некоторые клинические аспекты состояния микробиологических биотопов ротоглотки и кишечника у организованных дошкольников.// Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ. - М.-2008.-200-207.

51. Aleshkin V.A., Amerhanova A.M., Pospelova V.V., Afanasiev S.S., Shenderov B.A. History, present situation, and prospects of probiotic research conducted in the G.N.Gabrichevsky Institute for Epidemiology and Microbiology. // Microbial ecology in Yealth and Disease. - 2008. - 20.- Р.113-115.

Патенты

52. Патент РФ № 2180915 Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте до 3-х лет; Заявка № 2001111553 от 28.04.2001 г. Опубл. 27.03.2002 г.

53. Патент РФ № 2180348 Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 12-ти лет. Заявка № 2001111552 от 28.04.2001 г. Опубл. 10.03.2002 г.

54. Патент РФ № 2180914 Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в возрасте от 12-ти лет и старше. Заявка № 2001111551 от 28.04.2001. Опубл. 27.03.2002 г.

55. Патент РФ № 2214454 Питательная среда для культивирования бифидобактерий. Заявка № 2001135502 от 29.12.2001 г. Опубл. 20.10.2003 г.

56. Патент РФ № 2260042 Штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка № 2002128794 от 28.10.2002 г. Опубл. 28.10.2002 г.

57. Патент РФ № 2244745 Штамм Bifidobacterium longum 379-ИН, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка № 2003106129 от 05.03.2003 г. Опубл. 05.03.2003 г.

58. Патент РФ № 2264451 Биопрепарат Бифистим от 3 месяцев до 3 лет для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет, биологически активная добавка к пище Бифистим от 3 месяцев до 3 лет для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибиотикотерапии и других неблагоприятных воздействий у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет. Заявка № 2003129798 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

59. Патент РФ № 2264452 Биопрепарат Бифистим от 3 до 12 для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 до 12 лет, биологически активная добавка к пище Бифистим от 3 до 12 для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибиотикотерапии и других неблагоприятных воздействий у детей в возрасте от 3 до 12 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 до 12 лет. Заявка № 2003129799 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

60. Патент РФ № 2264450 Биопрепарат Бифистим для взрослых для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у людей старше 12 лет, биологически активная добавка к пище Бифистим для взрослых для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибиотикотерапии и других неблагоприятных воздействий у людей старше 12 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у людей старше 12 лет. Заявка № 2003129797 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

61. Патент РФ № 2301828 Штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы. Заявка № 2006101729 от 23.01.2006 г. Опубл. 27.06.2007 г.

62. Патент РФ № 2268929 Штамм Bifidobacterium bifidum 79-26, используемый для получения кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128814 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

63. Патент РФ № 2268930 Штамм Bifidobacterium bifidum 79-50, используемый для получени кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128815 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

64. Патент РФ № 2268931 Штамм Bifidobacterium bifidum 79-37, используемый дл получения кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128816 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

Список сокращений

БАД - биологически активная добавка к пище

БГКП - бактерии группы кишечных палочек

БС - среда для культивирования бифидобактерий производства

ГКНМ МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского - Государственная коллекция нормальной микрофлоры Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского

ГМ- среда - гидролизатно-молочная среда

НИИ прикладной микробиологии, г.Оболенск

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующая единица

Lac+ Ц- лактозопозитивные штаммы

Lac Ц - лактозонегативные штаммы

аг-фаза - период между посевом культуры бактерий и

началом ее размножения

ЖК - летучие жирные кислоты

МК - - микрокристаллическая целлюлоза

М - среднее

M - стандартная ошибка среднего

ОСМ - оптический стандарт мутности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РАМН - Российская академия медицинских наук

p - критический уровень значимости

0Т - градусы Тернера

t - критерий Стьюдента

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ГГСИ - госпитальные гнойно-септические инфекции

ФОС - фруктоолигосахариды

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog