Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
СТЕПАНИЧЕВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ
НАРУШЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ
Специальность 03.03.01 - Физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2010
Работа выполнена в Лаборатории функциональной биохимии нервной системы Учреждения Российской Академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Научный консультант:
Доктор биологических наук, профессор Наталия Валерьевна Гуляева
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ирина Николаевна Боголепова Доктор биологических наук Инга Игоревна Полетаева Доктор биологических наук Ара Саакович Базян Ведущая организация - НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН
Защита состоится 22 декабря 2010 в 14.00 на заседании Диссертационного совета Д.002.044.01 по защите докторских диссертаций при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (117485 Москва, ул. Бутлерова, 5а)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.
Автореферат разослан л______ ________ 2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор В.В. Раевский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Дизрегуляция динамического равновесия между процессами жизни и смерти на уровне клетки является причиной возникновения различных заболеваний. Гибель нервных клеток на ранних этапах индивидуального развития играет важную роль в процессах структурно-функционального созревания мозга. Вместе с тем большинство постмитотических нейронов по окончании периода созревания существуют на протяжении всей жизни организма. Аберрантная гибель нейронов является основной причиной нейродегенеративных болезней. Увеличение доли людей, страдающих этими заболеваниями, делает изучение причин и механизмов развития нейродегенеративных процессов одной из ведущих задач, стоящих перед биологией.
Несмотря на значительный, накопленный к настоящему времени, фактический материал, сегодня отсутствует ясное понимание механизмов, лежащих в основе этих заболеваний.
Исследование механизмов развития церебральных патологий невозможно без использования адекватных моделей, которые позволяют воспроизводить клиническую картину заболеваний человека. Успехи молекулярной генетики позволили выявить связь ряда нейродегенеративных болезней с мутациями в определенных генах (Иллариошкин, 2003; Шадрина, Сломинский, 2006; Григоренко, Рогаев, 2007; Thomas et al., 1995; Carrel, Lomas, 1997; Selkoe, 2001). Данные о связи мутаций в генах, кодирующих некоторые белки, с развитием патологии позволили создать модели нейродегенеративных заболеваний на животных с получением линий трансгенных мышей и крыс. В то же время большинство случаев таких заболеваний являются спорадическими, т.е. такими, при которых манифестация болезни и ее развитие не являются строго детерминированными нарушениями функции генов. Это обусловливает необходимость создания новых моделей, которые позволяли бы изучать механизмы нейродегенерации, не связанные с изменениями генома. В качестве подхода к моделированию нейродегенеративных нарушений может быть предложено использование токсических агентов, принимающих участие в патогенезе заболевания. Для болезни Альцгеймера (БА1) таким веществом может быть амилоидный пептид (А).
А является продуктом протеолитического расщепления крупного трансмембранного белка предшественника А (APP). В обычных условиях А может выполнять функции регуляторного пептида, который воздействует на процессы возбуждающей нейротрансмиссии (Kamenetz et al., 2003), синаптической (Walsh et al., 2002) и структурной (Morgan, 2007) нейропластичности. В то же время А наиболее известен как один из основных участников патогенеза БА (Hardy, Allsop, 1991; Hardy, Selkoe, 2002; Hardy, 2009). А представляет собой пептид массой 4 кДа, состоящий из 40-42 аминокислот. После расщепления APP - и -секретазами А секретируется в ликвор (Seubert et al., 1992). БА характеризуется накоплением в мозге нерастворимых бляшек, основным белковым компонентом которых и является А(1-42) (Glenner, Wong, 1984). В настоящее время установлено, что А(1-42), находящийся в составе бляшек, может подвергаться модификации (например, рацемизации), в результате чего он становится растворим и доступен действию различных протеаз (Kaneko et al., 2001; Kubo et al., 2002). Итогом такого протеолиза является образование укороченных фрагментов А, среди которых важное место занимает ундекапептид А(25-35).
Исследование физиологических и патологических аспектов биологической активности этого пептида является актуальным, поскольку это может открыть новые перспективы для понимания механизмов патогенеза БА и поиска путей патогенетически направленной коррекции этого заболевания.
Патологические процессы при нейродегенеративных заболеваниях протекают в разных структурах мозга и сопровождаются дисфункцией и дегенерацией специфических популяций нейронов, таких как холинергические нейроны при БА или дофаминергические нейроны при болезни Паркинсона. Активные исследования в этой области обнаружили комплексные патологические изменения в клетках, включая Список сокращений: АФК - активные формы кислорода; БА - болезнь Альцгеймера; ГАМК - аминомасляная кислота; КК - каиновая кислота; НАДФНд - НАДФН диафораза; СВЗ - субвентрикулярная зона; СГЗ - субгранулярная зона; СПА - супероксидперехватывающая активность; ТБКРП - продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой; УР - условный рефлекс; УРПИ - условная реакция пассивного избегания; ХАТ - холинацетилтрансфераза; А - -амилоидный пептид; ANOVA - дисперсионный анализ; APP - белок предшественник амилоида; BrdU - 5-бромо-2-дезоксиуридин; Dcx - доблкортин; IL-4 - интерлейкин-4;
ISI - промежуточное ядро перегородки; LSD - латрально-дорзальное ядро перегородки; MS - медиальное ядро перегородки; iNOS - индуцибельная синтаза окисда азота; nNOS - нейрональная синтаза окисда азота; PTZ - пентилентетразол; TNF - фактор некроза опухолей-; TUNEL - опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой присоединение дезоксиуридин трифосфата к 3'-ОН концу.
нарушения биохимических процессов, регуляции генов, ответов на внешние стимулы и т.д. Несмотря на различия в клинической картине нейродегенеративных болезней, избирательной гибели отдельных популяций нейронов, можно предположить, что на клеточном и молекулярном уровнях механизмы нейродегенерации, лежащие в основе этих болезней, являются сходными и затрагивают в первую очередь процессы нейропластичности (Угрюмов, 2010; Mesulam, 1999; 2000; Arendt, 2001). Известно, что при нейродегенеративных процессах различной природы наблюдаются признаки окислительного стресса, т.е. нарушения баланса между биохимическими механизмами образования и элиминации активных форм кислорода (АФК). Вместе с тем остается неясным, является ли окислительный стресс последствием дегенеративного процесса, вызванного другими факторами, или это одно из наиболее ранних проявлений патологии, которое вносит определенный вклад в этиологию болезни (Moreira et al., 2008; Sultana et al., 2009).
При изучении механизмов нейродегенерации важной является проблема взаимодействия процессов хронического окислительного стресса и нейровоспаления (Salminen et al., 2009). Нейровоспаление характеризуется активацией микроглии, которая выполняет роль резидентных макрофагов в мозге. Активированные микроглиоциты высвобождают наряду с супероксидным анион-радикалом оксид азота (NO). Накопление в ткани свободного NO и супероксида приводит к образованию высокореактивного соединения - пероксинитрита, который вместе с АФК вступает в реакции окисления и нитрования (нитрозативный стресс). Оксиданты вызывают экспрессию генов провоспалительных цитокинов в микроглии, создавая тем самым порочный круг.
Окислительный стресс и воспалительный каскад приводят к снижению когнитивных функций и репаративных возможностей нервной ткани. Существенный вклад в оба эти процесса вносит нейрогенез, включающий пролиферацию и дифференцировку новых нейронов в зрелом мозге (Gage, 2002; Gould, 2007).
Известно, что в мозге взрослых млекопитающих нейрогенез происходит в двух основных областях - субвентрикулярной зоне боковых желудочков и субгранулярной зоне зубчатой извилины. Предполагается, что образовавшиеся вновь нейроны способны мигрировать из этих областей в регионы повреждения, что может представлять значительный интерес с точки зрения использования способности мозга к самовосстановлению для терапии нейродегенеративных заболеваний. Принимая во внимание эти факты, были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель работы Учитывая актуальность изучения физиологических эффектов А, целью представленной работы явилось исследование влияния А(25-35) и других соединений, вызывающих нейродегенерацию, на поведение животных и механизмы, связанные с развитием изменений поведения, с применением комплекса нейрофизиологических, нейрохимических, и гистологических методов.
Задачи работы Исходя из указанной цели работы, были поставлены следующие конкретные задачи:
- изучить влияние А(25-35) на процессы обучения и памяти у крыс при его интрацеребровентрикулярном введении;
- оценить показатели свободнорадикального окисления в отделах мозга крыс при моделировании нейродегенерации, вызванной интрацеребровентрикулярным введением А(25-35), нейротоксина AF64A и системным введением каиновой кислоты или пентилентетразола;
- исследовать влияние А(25-35) на процессы пролиферации и дифференцировки клеток в мозге взрослых животных;
- провести сравнительный анализ провоспалительной и антивоспалительной модуляции нейродегенеративных изменений, вызванных интрагиппокампальным введением А(25-35).
Научная новизна В работе впервые проведено систематическое исследование эффектов А(2535) на обучение и память у крыс, установлены временные параметры возникновения изменений поведения. Показано, что наиболее чувствительными к действию А(2535) являются зависимые от гиппокампа формы пространственной памяти, а память, сформировавшаяся в результате выработки оборонительных форм поведения, является более устойчивой.
Впервые показано, что в условиях in vivo токсическое воздействие А(25-35) на структурные элементы ЦНС опосредовано окислительным стрессом.
Интенсивность и характер развития окислительного стресса различаются в исследованных отделах мозга. Наиболее сильно выражены процессы окислительного стресса в гиппокампе и неокортексе. Показано, что важная роль в повреждении нейронов при нейродегенерации принадлежит NO, синтезируемому нейронной изоформой NO-синтазы.
В работе показано, что окислительный стресс является основным звеном патогенеза нейродегенерации, вызванной не только А(25-35), но и другими нейротоксинами, такими как AF64A, каиновая кислота, или хемоконвульсант пентилентетразол.
Выявлено влияние А(25-35) на процессы нейрогенеза в пролиферативных отделах мозга взрослых животных. Установлено, что А(25-35) может ингибировать процессы пролиферации в гиппокампе и замедлять дифференцировку новообразованных клеток по нейронному фенотипу.
Впервые в экспериментах in vivo установлена возможность модуляции нейротоксических эффектов А(25-35) провоспалительным и антивоспалительным цитокинами. При этом установлено, что провоспалительный цитокин усиливает токсическое воздействие А(25-35), а антивоспалительный - снижает повреждающий эффект этого пептида.
Теоретическое и научно-практическое значение работы В результате проведенной работы предложена новая линъекционная модель амнезии Альцгеймеровского типа на крысах. Проведенный в работе экспериментальный анализ нарушений поведения животных после введения А(2535), а также нейродегенеративных изменений в мозге позволяет использовать предложенную модель в качестве модели ранних этапов БА.
В работе установлено, что окислительный стресс является центральным звеном патогенеза хронических нейродегенеративных процессов различной природы, что может служить теоретическим обоснованием разработки новых подходов к антиоксидантной терапии заболеваний подобного рода.
Новые данные о модуляции нейротоксичности А(25-35) провоспалительными и антивоспалительными цитокинами открывают новые возможности для разработки противовоспалительной терапии при БА.
Основные положения, выносимые на защиту 1. При моделировании нейродегенерации с использованием различных нейротоксических веществ -амилоидный пептид, холинотоксин AF64A, каиновая кислота и пентилентетразол индуцируют окислительный стресс, временная динамика и выраженность показателей которого специфичны для каждого вида воздействия и отдела мозга.
2. Введение -амилоидного пептида вызывает нарушения мнестических функций, которые на начальных этапах развития экспериментальной патологии сопровождаются нарушением нейрогенеза, а на более поздних этапах - нейродегенеративными изменениями в мозге.
3. Гибель нервных клеток, вызванная введением -амилоидного пептида, сопровождается усилением воспалительных процессов, проявляющихся в виде активации нейроглии и усиления генерации свободных радикалов, в том числе оксида азота. Развитие нейродегенерации зависит от баланса про- и антивоспалительных цитокинов, при этом антивоспалительные цитокины уменьшают степень нейродегенеративных изменений в мозге.
Апробация работы Основные результаты работы доложены на съезде федерации Европейских физиологических обществ (Маастрихт, 1995), 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), ХХХIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), конференциях Американского общества по нейронаукам (Вашингтон, 1996, Новый Орлеан, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (СанктПетербург, 1998), Европейском форуме по нейронаукам (Берлин, 1998), Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова Новое в концепциях о механизмах ассоциативного обучения и памяти (Москва, 1999), Международной школе по биокибернетике Память и эмоции (Неаполь, 1999), конференции Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты (Санкт-Петербург, 1999), ХХХ Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), 14, 15, 17, Съездах Европейского нейрохимического общества Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний (Перуджа, 2001, Варшава, 2003; Саламанка, 2007; Лейпциг, 2009), XVIII-XX Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004; Москва, 2007), I Съезде РНО Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2005), 20 Съезде Международного нейрохимического общества (Инсбрук, 2005), 5-7 Европейских Форумах по нейронаукам (Вена, 2006; Женева, 2008;
Амстердам, 2010), Международных симпозиумах Гиппокамп и память (Пущино, 2006, 2009) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН (Москва, 2010).
Публикации По теме диссертации опубликованы 33 статьи, из них 8 в международных изданиях.
Структура и объем диссертации Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, главу с описанием методов исследования, четыре главы, содержащие обзор данных литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (55) и иностранных (723) языках. Диссертация изложена на 312 страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 62 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа с животными. В экспериментах использовали половозрелых самцов крыс линии Вистар в возрасте 4-5 мес. массой 250-350 г.
Моделирование нейродегенеративных процессов. Индукцию нейродегенерации у крыс проводили с использованием интрацеребровентрикулярных инъекций А(2535) в количестве 15 или 30 нмоль и AF64A в количестве 1-3 нмоль или интраперитонеального введения пентилентетразола (13 инъекций в дозе 37,5 мг/кг) и каиновой кислоты (1 инъекция в дозе 10 мг/кг). В экспериментах с использованием провоспалительного и антивоспалительного цитокинов А(25-35) в количестве нмоль вводили непосредственно в гиппокамп.
Исследование поведения. Для оценки исследовательской активности и рабочей памяти у крыс использовали тест спонтанного чередования рукавов в Y-образном лабиринте (Anisman, 1975). Состояние пространственной рабочей памяти и референтной памяти оценивали, обучая крыс в восьмирукавном радиальном лабиринте (Chroback et al., 1988). С этой целью было использовано два типа задач:
стандартная задача состояла в обучении животного поиску пищи, находящейся во всех рукавах лабиринта; вторая задача состояла в поиске пищи, находящейся в пяти из восьми рукавов лабиринта. Состояние непространственной памяти у крыс оценивали, вырабатывая условную реакцию пассивного избегания и условноэмоциональную реакцию страха в разных методических модификациях (Буреш и соавт., 1988; Maren, 2008). Непроцедурную форму кратковременной памяти оценивали в тесте зоосоциального взаимодействия (Bohme et al., 1997).
Нейрохимические и молекулярно-биологические исследования. Состояние окислительного стресса оценивали по накоплению продуктов свободнорадикального окисления, реагирующих с 2-тиобарбитутровой кислотой (ТБКРП) (базальный уровень и накопление в результате индукции Fe2+/аскорбатом) по методам, предложенным H. Ohkawa et al. (1972) и В. Каганом и соавт. (1979). Величину супероксидперехватывающей активности (СПА) определяли спектрофотометрическим методом, основанным на генерации супероксидного радикала системой феназинметасульфат/НАДН и восстановлении нитросинего тетразолия с образованием синего формазана (Nishikimi et al., 1972, Gulyaeva et al., 1990). Для оценки генерации АФК применяли метод, основанный на использовании показателей индуцированной перекисью водорода люминол-зависимой хемилюминесценции (Моисеева и соавт., 1995). Для исследования активности NOсинтазы (NOS) применяли метод оценки синтеза [3H]L-цитруллина из [3H]L-аргинина (Bredt, Snyder, 1989) с небольшими модификациями (Iadecola et al., 1995; Онуфриев с соавт., 1999). Активность каспазы-3 оценивали с использованием искусственного флюорогенного субстрата ацетил-DEVD-аминометилкумарина, содержащего специфичную для этой протеазы последовательность аминокислот (Stefanis et al., 1996). Содержание белка в ткани определяли по методу М. Bradford (1976) с использованием красителя Кумасси голубого. Оценку экспрессии белков в мозге проводили методом вестерн-блот с применением специфических антител.
Гистологические и иммуногистохимические исследования.
Патоморфологическое исследование проводили, используя парафиновые фронтальные срезы мозга, которые окрашивали классическими гистологическими методами. Для оценки холинергической гипофункции использовали гистохимический метод определения холинацетилтрансферазы (ХАТ), предложенный A. Burt и A. Silver (1973), или иммуногистохимический метод. Экспрессию НАДФНдиафоразы определяли гистохимическим методом (Dawson et al., 1991). Присутствие разных изоформ NOS, экспрессию разных элементов глии, оценку типа клеточной смерти проводили иммуногистохимически, используя специфические антитела или соответствующие стандартные наборы реактивов.
Статистический анализ результатов. Полученные в работе данные обрабатывали, используя методы математической статистики. Различия между группами без учета градаций факторов определяли по t-критерию Стьюдента.
Влияние систематически действующих факторов на исследованные биохимические показатели или характеристики поведения определяли методом дисперсионного анализа (ANOVA). Наряду с указанными, использовались непараметрические методы анализа для оценки достоверности различий между группами (критерий инверсий Вилкоксона - Манна - Уитни). Для оценки статистической связи между исследованными показателями использовали коэффициент корреляции.
Использованные в работе методы статистики реализованы в пакете программ Statistica for Windows. Данные в тексте, таблицах и на рисунках представлены в виде М s.e.m., если не указано иначе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Нарушения памяти и нейродегенерация при интрацеребровентрикулярном введении фрагмента (25-35) -амилоидного пептида 1.1. Влияние -амилоидного пептида (25-35) на пространственную память у крыс. Влияние А(25-35) на пространственную память у крыс исследовали с помощью теста спонтанного чередования рукавов в Y-образном лабиринте и обучение стандартной задаче в восьмирукавном радиальном лабиринте. Тест спонтанного чередования позволяет в примитивной форме оценить реакцию животных на новизну и до некоторой степени отражает состояние рабочей памяти (Hughes, 2004). Введение 15 нмоль А(25-35) в боковые желудочки мозга крыс не влияло на общую активность животных, которую оценивали по числу входов в рукава Y-образного лабиринта (F(1, 13) = 0,94; p > 0,1). В то же время наблюдалось достоверное снижение числа чередований через 17, 36 и 180 дней после введения А(25-35) в среднем на 21% (F(1, 13) = 14,02; p < 0,01). Этот эффект не зависел от времени, прошедшего после введения пептида. Аналогичный эффект наблюдали при двукратном увеличении количества введенного А(25-35). В другой серии оценивали временной паттерн возникновения изменений этой формы поведения после интрацеребровентрикулярного введения А(25-35). Мы обнаружили, что достоверное снижение поведения чередования на 25% проявлялось не ранее, чем через две недели после введения А(25-35). Уровень чередования оставался на 27 и 32% ниже по сравнению с контрольными животными через 21 и 28 дней, соответственно (p < 0.05).
Влияние А(25-35) на сохранность пространственной памяти также оценивали у крыс, предварительно обученных поиску пищи в радиальном восьмирукавном лабиринте. Животных обучали находить пищу в рукавах радиального лабиринта и делили на группы, которые не различались по показателям обучения, после чего через 7 дней им вводили 15 или 30 нмоль А(25-35) в латеральные желудочки (группы А15 и А30). Через 60 дней после введения А(25-35) крыс повторно тестировали в тех же условиях, в которых проводили первоначальное обучение (рис. 1), и подсчитывали число ошибок рабочей памяти, т.е. повторных заходов в уже посещенные в течение этого сеанса рукава. При анализе полученных данных было установлено, что число ошибок рабочей памяти, совершенных животными, зависело от исследуемой группы (F(2,35) = 3.46, p = 0.05) и существенно изменялось после введения А(25-35) (F(3,105) = 22.0, p < 0.001). Наблюдалось достоверное взаимодействие между этими факторами (F(6,105) = 2.34, p < 0.05). Последующее множественное сравнение средних показало, что число ошибок рабочей памяти, совершенных контрольными крысами в ходе повторного тестирования, не отличалось достоверно от числа ошибок, сделанных этими крысами в конце периода обучения, что свидетельствует о хорошей сохранности реакции, приобретенной до воздействия, в течение длительного (67 суток) периода времени. В то же время, введение A(2535) в обеих дозах вызывало достоверное увеличение числа ошибок, совершенных крысами групп A15 и A30 в серии В1 по сравнению с числом ошибок, которое эти животные совершали в серии О3 (p<0.001 и p<0.005 соответственно). Следует также отметить, что в серии В1 (рис. 1Б) крысы групп A15 и A30 совершали достоверно большее число ошибок по сравнению с контрольными животными (p<0.005 для обеих групп). Число ошибок, которое делали крысы группы A15, было сравнимо с этим показателем поведения у крыс группы A30. Как видно из приведенных данных (рис.
1Б), наблюдалось достаточно быстрое снижение числа совершаемых ошибок у животных групп A15 и A30 до контрольного уровня. Иными словами, происходило довольно быстрое восстановление предварительно выученной реакции. После введения A(25-35) или растворителя животные всех экспериментальных групп затрачивали гораздо больше времени на выполнение задачи в радиальном лабиринте, чем до операции (F(3,105) = 76.4, p < 0.001). Этот показатель не зависел от принадлежности крыс к той или иной группе (F(2,35) = 0.86, p > 0.4).
Б А A2 A0 1 2 3 1 2 5 5 Рис. 1. Влияние A(25-35) на восстановление предварительно выработанной реакции поиска пищи в радиальном лабиринте. А - число ошибок рабочей памяти, допущенных животными в ходе предварительного обучения. Б - число ошибок рабочей памяти, допущенных животными в ходе восстановления реакции через 67 дней после введения A(25-35). О1, О2, О3 и В1, В2, В3 - серии обучения (О) и восстановления (В) реакции.
Таким образом, введение A(25-35) в дозе 15 или 30 нмоль вызывало достоверное нарушение воспроизведения предварительно усвоенной реакции поиска пищи в радиальном лабиринте, однако животные, получавшие A, довольно быстро восстанавливали нарушенную реакцию. Выявленные изменения поведения не зависели от использованной дозы A(25-35).
1.2. Влияние -амилоидного пептида (25-35) на другие формы обучения и памяти у крыс. Крысы способны обследовать и запоминать другую особь того же вида, помещенную в их домашнюю клетку. На этой способности крыс основан тест узнавания особи при социальном взаимодействии (social recognition), который представляет собой непроцедурную форму кратковременной памяти. Было установлено, что длительность взаимодействия между резидентом и линтрудером при первом контакте не различалась у контрольных крыс и крыс групп A15 или A30 (p > 0.1). При повторном подсаживании того же ювенильного самца у контрольных крыс время социальных контактов снижалось примерно вдвое, тогда как у животных, получавших A(25-35) в обеих дозах, время повторного исследования хотя и снижалось, но оставалось более длительным по сравнению с контрольной группой (p < 0.05). Таким образом, введение A(25-35) в обеих дозах приводило к нарушению непроцедурной формы кратковременной рабочей памяти у крыс.
Одним из наиболее принятых методов оценки непространственной долговременной памяти у крыс является выработка условной реакции пассивного избегания (УРПИ). Для выработки УРПИ использовали два подхода: обучение в камере с темным и светлым отсеками или в камере с безопасной платформой. В первом случае животным позволяли трижды перейти из светлого отсека камеры в темный и после третьего перехода давали электрошок. Среднее время, которое крысы затрачивали на переход после третьей попытки, не различалось у животных разных групп. Воспроизведение УРПИ через 1 или 7 дней после выработки показало, что латентный период входа в темный отсек был достоверно выше у всех животных и не зависел от введения A(25-35). Аналогичные результаты были получены и при исследовании выработки УРПИ в ситуации спуска с платформы. Таким образом, интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) не оказывало существенного влияния на выработку и/или сохранность УРПИ ни в одной из использованных моделей.
Через 5, 11, и 27 дней после введения A(25-35) у крыс вырабатывали условнорефлекторную реакцию (УР) замирания (contextual fear conditioning). Для этого крысу однократно помещали в камеру и по окончании периода адаптации апплицировали электрошок. На следующий день проверяли сохранность реакции, помещая животное в ту же камеру и регистрируя время замирания. Было установлено, что введение A(25-35) не влияло на способность крыс вырабатывать УР замирания.
Вместе с тем введение A(25-35) ухудшало воспроизведение УР замирания через дней после инъекции, снижая время замирания в 1.9 раза (p < 0.05), но не влияло на эту форму поведения крыс через 6 или 28 дней после введения.
1.3. -Амилоидный пептид (25-35) вызывает нарушения пространственной памяти у крыс, связанные с нейродегенеративными изменениями. Одной из причин нарушения обучения и памяти при введении А(25-35) может быть его способность вызывать повреждение нейронов в тех структурах мозга, которые по данным литературы играют важную роль в этих процессах. Нарушения памяти у крыс возникают в течение первого месяца после инъекции А(25-35) и сохраняются, по крайней мере, в течение полугода. Поэтому для исследования структурных изменений мозг животных фиксировали через 1 и 6 мес. после введения А(25-35).
Фронтальные срезы мозга окрашивали по Нисслю или ванадиево-кислым фуксиномтолуидиновым синим. Через 1 мес. после введения А(25-35) было обнаружено большое число хроматофильных и ацидофильных нейронов во фронто-париетальной моторной области неокортекса, гиппокампе, в ретросплениальной (цингулярной) коре, первичной обонятельной коре, а также в базальных ядрах переднего мозга, включая чечевицеобразное ядро. В неокортексе поврежденные нейроны были локализованы, главным образом, в III и V слоях. Примечательно, что в целом ряде случаев некротические нейроны в неокортексе были найдены вблизи кровеносных сосудов. Нам не удалось выявить отложений А, окрашенных тиофлавином S или конго красным, в структурах переднего мозга экспериментальных животных.
Через 6 мес. после интрацеребровентрикулярной инъекции А(25-35) также наблюдалось большое число хроматофильных нейронов в срезах мозга.
Хроматофильные нервные клетки были обнаружены, главным образом, в неокортексе и гиппокампе. В неокортексе животных, получивших А(25-35), наблюдалась активация сателлитной микроглии и нейронофагия. Эти изменения были еще более выражены в базальных ганглиях переднего мозга.
Количественный анализ числа интактных и поврежденных нервных клеток был проведен во фронто-париетальной и фронтальной коре и в поле СА1 гиппокампа.
Было установлено, что введение А(25-35) приводило к снижению числа нейронов на 19.8% в поле СА1 гиппокампа в сравнении с контрольными животными (р<0.05).
Аналогичный эффект наблюдался во фронтальной и фронто-париетальной коре.
Уменьшение числа нервных клеток здесь было даже более значительным, чем в гиппокампе. Так, число нервных клеток снизилось после введения А(25-35) во фронтальной коре на 25.7% и во фронто-париетальной коре на 23.9% (р<0.05). Кроме того, в указанных отделах мозга резко возрастало число поврежденных нервных клеток.
Следует отметить, что введение А(25-35) приводило к достоверному снижению числа нейронов, содержащих ХАТ, в медиальной септальной области. Оно составило 25.5, 35.9 и 52.6% через 6, 12 и 28 дней, соответственно от числа ХАТпозитивных клеток у контрольных крыс. В то же время нам не удалось выявить существенного влияния А(25-35) на число NeuN-позитивных клеток, т.е. нейронов, в этом отделе мозга. Таким образом, снижение числа ХАТ-позитивных клеток происходило не за счет дегенерации этих нейронов, а, по-видимому, за счет влияния А(25-35) на механизмы транкскрипции и/или трансляции ХАТ. Вместе с тем холинергический дефицит также мог служить причиной нарушений пространственной памяти, который наблюдался у крыс в это время.
Для того чтобы выяснить, связаны ли нарушения пространственной памяти у крыс с гибелью нейронов в гиппокампе, была проведена специальная серия экспериментов, в которой крыс начинали обучать поиску пищи в восьмирукавном радиальном лабиринте через 1 мес. после введения А(25-35). Пищевое подкрепление предъявляли в 5 из 8 рукавов лабиринта. В каждом сеансе обучения 6 2,Контроль Б А * A(25-35) * 5 2,* * * 4 1,3 1,2 0,0,0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 Серии из 5 сеансов Серии из 5 сеансов Рис. 2. Влияние A(25-35) на выработку реакции поиска пищи в радиальном лабиринте. А - число ошибок референтной памяти. Б - число ошибок рабочей памяти. * - достоверные отличия от контрольной группы, p < 0.05.
Ошибки Ошибки подсчитывали число ошибок референтной памяти (входы в неподкрепляемые рукава) и число ошибок рабочей памяти (повторные входы в подкрепляемые рукава в течение одного сеанса). Было установлено, что число ошибок референтной памяти (рис. 2А) было достоверно больше у крыс после введения А(25-35) (ANOVA, фактор группа F(1,11) = 10.6, p < 0.009), хотя постепенно число таких ошибок снижалось (фактор серия сеансов F(5, 55) = 2.9, p < 0.03). Взаимодействия между этими факторами не было обнаружено (F(5, 55) = 2.0, p = 0.09). Множественное сравнение средних по критерию Фишера показало, что животные контрольной группы совершали меньше ошибок по сравнению с крысами, которым был введен A(25-35) в двух последних сериях сеансов обучения (p < 0.05).
При анализе числа ошибок рабочей памяти (рис. 2Б) также был обнаружен эффект фактора группа (F(1, 11) = 16.2, p < 0.03). Обе группы животных демонстрировали значительное уменьшение числа ошибок рабочей памяти по мере обучения (фактор серия сеансов (F(5,55) = 9.2, p < 0.001). Наблюдалось также взаимодействие между указанными факторами (F(5, 55) = 4.1, p < 0.05), показывающее, что процесс обучения животных разных групп существенно различался. У контрольных крыс достоверное снижение числа ошибок этого вида наблюдалось после пятой серии сеансов. У крыс, обучавшихся после введения А(2535), наблюдалось ухудшение функции рабочей памяти, максимально выраженное в двух последних сериях сеансов (рис. 2Б).
Фронтальные срезы мозга этих крыс использовали для исследования нейродегенеративных изменений. Введение А(25-35) вызывало умеренную дегенерацию клеток в дорзальном гиппокампе (рис. 3), что выражалось в наличии эозинофильных нейронов измененной, часто треугольной формы. Измененные клетки чаще встречались в поле СА1 и реже в поле СА3 гиппокампа. Более того введение А(25-35) вызывало 16%-е снижение плотности клеток в поле СА1 (p < 0.05). В поле СА3 гиппокампа не наблюдалось подобного эффекта (p > 0.5).
Корреляционный анализ был проведен для каждой из исследованных групп поотдельности. В группе контрольных животных не было обнаружено ни одной корреляции между числом клеток и числом ошибок референтной или рабочей памяти (r = -0.08 - 0.64; p > 0.2). В группе крыс, получавших А(25-35), были Рис. 3. Влияние А(25-35) на морфологию гиппокампа. Представлены микрофотографии гиппокампа контрольных крыс (А, Б) и крыс, получавших А(25-35) (В, Г). Б, Г - микрофотографии поля СА1 контольных и подопытных крыс, соответственно. Окраска гематоксилином-эозином. Шкала: А -500 мкм; Б - 20 мкм.
установлены корреляционные связи между числом ошибок рабочей памяти в 5-й и 6й сериях сеансов с плотностью нейронов в поле СА1 гиппокампа (r = -0.71, p < 0.08 и r = -0.98, p < 0.001, соответственно). Сходные корреляции наблюдались и между числом ошибок референтной памяти в 5-й (r = -0.80, p < 0.003) и в 6-й сериях сеансов (r = -0.90, p < 0.001). Таким образом было показано, что нарушение поведения крыс в радиальном лабиринте после введения А(25-35) коррелировало с утратой нейронов в гиппокампе.
2. Окислительный стресс в механизмах развития нейродегенеративных процессов в мозге Цитотоксическое действие А считается одной из основных причин нейродегенерации, которая наблюдается при БА. Собранные данные, включая данные об известных генетических мутациях, предполагают, что А вовлечен в патогенез как семейной, так и спорадической форм БА (Рогаев, 1998; Selkoe, 1994, 2001). Одним из механизмов, опосредующих токсические эффекты А, является окислительный стресс. Вместе с тем прямых данных, которые подтверждали бы способность А(2535) вызывать окислительный стресс в условиях in vivo, в литературе нет. Поэтому была поставлена задача, исследовать особенности свободнорадикальных процессов в мозге животных после интрацеребровентрикулярного введения А(25-35).
Холинергический дефицит, вызванный А и наблюдавшийся в наших экспериментах, может сопровождаться и гибелью холинергических нейронов, которую наблюдали другие авторы (Yamaguchi, Kawashima, 2001). Поэтому было исследовано может ли действие холинотоксина AF64A, который также вызывает холинергический дефицит и последующую гибель холинергических нейронов, быть опосредовано свободнорадикальными процессами. С другой стороны, нейротоксичность А может быть связана с изменениями глутаматергической трансмиссии (Matos et al., 2008). В связи с этим мы исследовали показатели окислительного стресса в двух моделях эксайтотоксичности, вызванной введением каиновой кислоты или пентилентетразола.
2.1. Анализ свободнорадикальных процессов и активности NOS в мозге крыс после введения фрагмента (25-35) -амилоидного пептида.
Введение 15 нмоль агрегированного А(25-35) в латеральные желудочки мозга крыс вызывало усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), что выражалось в накоплении ТБКРП в церебральных структурах. Увеличение содержания ТБКРП было отмечено в гиппокампе крыс, получавших А(25-35), начиная с 3 дня после введения. Уровни ТБКРП оставались в среднем на 35-37% выше, чем в группе контрольных крыс на всех исследованных сроках (p < 0.05). В новой коре накопление ТБКРП начиналось с 5-го дня после введения и достигало максимального уровня к 30-му дню.
Изменения СПА после введения А(25-35) были более выражены в неокортексе, чем в гиппокампе. Так, резкое снижение перехвата супероксидного радикала (182% по сравнению с контрольной группой; p < 0.05) было обнаружено через 3 дня после введения А(25-35). Сходный процесс наблюдался и через 30 дней после введения (236% по сравнению с контрольной группой; p < 0.02). Аналогичная тенденция к усилению генерации и/или снижению перехвата супероксидного радикала была обнаружена и в гиппокампе через 30 дней после введения пептида (p < 0.08).
Введение А(25-35) приводило к медленному увеличению радикалообразования в неокортексе, которое было максимально выражено через дней после инъекции и составило 126% от уровня образования активных форм кислорода в контрольной группе (p < 0.05).
Введение А(25-35) вызывало изменения активности NOS в новой коре и гиппокампе крыс. Так, в гиппокампе после инъекции А(25-35) наблюдалось кратковременное достоверное снижение активности NOS на 40% по сравнению с контрольной группой (p<0.05). Активность NOS в гиппокампе постепенно восстанавливалась до уровня контрольной группы, а через 30 дней после инъекции увеличивалось на 43% по отношению к уровню контрольных животных, однако это увеличение не было достоверным из-за больших индивидуальных различий. В неокортексе существенное снижение активности NOS наблюдалось на 3-й день после введения пептида А(25-35) (на 38% по сравнению с контролем; p<0.03). На 5-й день после введения А(25-35) в этом отделе мозга было обнаружено достоверное увеличение активности NOS на 66% по сравнению с контролем.
2.2. Влияние А(25-35) на экспрессию и активность разных изоформ NOS в мозге крыс. Увеличение общей активности NOS, которое было обнаружено в предыдущей серии экспериментов, не позволяет сделать вывода о вкладе отдельных изоформ фермента в эффекты А(25-35). Тем не менее данные ряда экспериментов, проведенных в культурах клеток, позволяют предположить, что значительную роль в нейротоксичности А играет индуцибельная NOS (iNOS). Активация iNOS считается основным источником повышенной продукции NO в мозге в условиях различных патологий, включая нейродегенеративные болезни. В экспериментах in vivo повышенный уровень активности NOS был обнаружен в течение первой недели после введения A(1-42) (OТMahony et al., 1999) и в наших экспериментах с пептидом А(25-35), результаты которых изложены в предыдущем разделе. Для того чтобы исследовать ферментативный источник образования NO было изучено влияние введения А(25-35) в боковые желудочки на активность конститутивной nNOS и iNOS в мозге крыс через шесть дней после инъекции А(25-35). Введение растворителя (стерильной воды) или контрольного пептида А(35-25) не влияло существенно на активность nNOS. Инъекция А(25-35) в боковые желудочки приводила к достоверному увеличению активности nNOS в неокортексе и в гиппокампе крыс (рис. 4).
25 * @ А Б * 0 H2O A(35-25) A(25-35) A(25-35) H2O A(35-25) Рис. 4. Влияние введения A(25-35) на активность nNOS в новой коре (А) и гиппокампе (Б).
* - достоверные отличия от интактных животных p < 0.05; @ - достоверный отличия от группы A(35-25) p < 0.05 по t-критерию Стьюдента. Число животных в группах n = 5-6.
Мы не смогли зарегистрировать активность индуцибельной Ca2+-независимой NOS в отделах мозга интактных животных. Более того, активность iNOS не выявлялась в мозге крыс после введения растворителя, А(35-25) или А(25-35).
Анализ экспрессии nNOS и iNOS в новой коре и гиппокампе был проведен методом вестерн-блот. Для определения присутствия соответствующих белков в экстрактах мозга были использованы моноклональные антитела мыши к nNOS и iNOS. Антитела связывались с полосой, содержавшей белки с молекулярной массой 150 кДа, что соответствовало nNOS, в обоих исследованных отделах мозга (рис. 5).
Интенсивность окрашивания полос существенно не отличалась в разных экспериментальных группах.
Для того чтобы выявить присутствие iNOS в мозге крыс была применена процедура иммунопреципитации, которая позволяет существенно повысить чувствительность метода. В экстрактах новой коры и гиппокампа не удалось с помощью специфичных к iNOS антител выявить полосу с молекулярной массой 1кДа ни в группе контрольных животных, ни в группе крыс, инъецированных А(2535) (рис. 5). В то же время такая полоса была обнаружена в неокортексе мозга крыс, O, O, / / N S / / N S подвергнутых 2 ч окклюзии средней мозговой артерии (позитивный контроль) (рис. 5, дорожка 7).
A Б 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 <150 kDa> <135 kDa> Рис. 5. Анализ экспрессии nNOS и iNOS после введения A(25-35) методом вестерн-блот.
Дорожки 1 и 2 соответствуют интактным животным; 3, 4 - ложнооперированным контрольным крысам; 5, 6 - группе A(25-35); 7 - экстракт коры мозга крыс, подвергнутых ч окклюзии средней мозговой артерии. В экстрактах новой коры и гиппокампа наблюдалось присутствие белка массой 150 кДа, взаимодействующего с антителами к nNOS. Экспрессии белка массой 135 кДа, соответствующего iNOS, не было обнаружено.
Гистохимическое окрашивание на НАДФНд было использовано для определения ферментативной активности NOS in situ. В неокортексе крыс нейроны, содержавшие НАДФНд, легко обнаруживались по наличию плотных темно-синих преципитатов. Такие нейроны в значительном количестве присутствовали и у контрольных крыс, и у животных, получивших А(25-35). Эти нейроны имели плотно окрашенные тела и отростки и были локализованы во II-III и VI слоях неокортекса.
НАДФНд-позитивное окрашивание было характерно и для стенок сосудов. Введение А(25-35) не влияло на интенсивность и характер окраски в новой коре.
Только незначительное число нейронов гиппокампа проявляло тот же характер НАДФНд окрашивания, что и в неокортексе. Окрашенные мультиполярные интернейроны изредка встречались в пирамидном слое. В зубчатой фасции такие клетки были расположены в субгранулярном слое. Изредка НАДФНд-позитивные клетки наблюдались в гиппокампальном хилусе. А(25-35) достоверно снижал число НАДФНд-позитивных клеток в неокортексе на 16.5% (p < 0.05), но не влиял на этот показатель в гиппокампе.
Распределение клеток, экспрессирующих nNOS и iNOS, в мозге было исследовано у крыс, инъецированных водой (контроль) или А(25-35).
Иммунореактивность к nNOS наблюдалась в непирамидных нейронах, которые были расположены в слоях II-III и VI новой коры крыс контрольной группы. Эти нейроны имели окрашенное тело и отростки, которые пронизывали все слои коры. nNOSпозитивные нейроны были равномерно распределены в правом и левом полушариях, но их число было заметно ниже по сравнению с числом клеток, окрашенных на НАДФНд. Паттерн иммуногистохимического окрашивания на nNOS существенно не менялся через шесть дней после введения А(25-35). Нейроны, содержащие nNOS, имели крупные дендриты и коллатерали, которые находились во II-III и более глубоких слоях новой коры. Введение А(25-35) не влияло на число нейронов, экспрессирующих nNOS, в этом отделе мозга.
В гиппокампе контрольных крыс изредка наблюдались относительно небольшие по размеру нейроны с малым числом отростков, которые слабо окрашивались антителами к nNOS. Эти нейроны были расположены в пирамидном и радиальном слоях. Так же как и в неокортексе эти нейроны морфологически можно охарактеризовать как интернейроны. Однако в отличие от нейронов неокортекса, которые имели плотно окрашенные тела и проксимальные участки отростков, в нейронах гиппокампа nNOS была сосредоточена главным образом в перинуклеарной цитоплазме. А(25-35) не изменял паттерна окрашивания нейронов Аммонова рога и зубчатой фасции. Подсчет клеток не выявил каких-либо различий в гиппокампе животных обеих экспериментальных групп.
Иммунореактивность к iNOS была обнаружена только в области проникновения иглы микрошприца у крыс контрольной и подопытной групп.
Антитела к iNOS интенсивно окрашивали нейропиль и большое число микроглиальных клеток, экпрессирующих iNOS. Здесь были обнаружены отдельные iNOS-реактивные нейроны у крыс обеих экспериментальных групп. Интенсивность окрашивания нейропиля и активированной глии снижалась в ростро-каудальном и латерально-медиальном направлениях от места инъекции. Таким образом проведенный комплексный анализ позволил установить, что основные изменения в системе NO, которые вызывало введение А(25-35), были связаны с активацией изоформы nNOS.
2.3. Окислительный стресс в механизме холинергической дегенерации, вызванной холинотоксином AF64A. Имеющиеся в литературе данные позволяют сделать вывод о том, что высокая чувствительность холинергических нейронов к повреждающему действию АФК делает их одной из наиболее уязвимых мишеней окислительного стресса, который является неотъемлемой стороной как нормального старения, так и ряда нейродегенеративных заболеваний. Это связано в первую очередь с низким уровнем эндогенных антиоксидантов, например витамина Е (Fariello et al., 1988) в этих клетках, а также с возрастным снижением активности эндогенных ферментативных и неферментативных антиоксидантных систем (Jeandel et al., 1989; Ravindranath et al., 1989). Холинергический дефицит играет важную роль в возникновении когнитивных нарушений при БА. Введение аналога холина - горчичного азиридиния AF64A в латеральные желудочки мозга позволяет воспроизводить холинергический дефицит, который вначале сопровождается функциональными нарушениями системы синтеза ацетилхолина, а на более поздних сроках - с гибелью холинергических нейронов. Проведенные эксперименты показали, что у крысы введение AF64A приводит к существенному дозозависимому снижению числа клеток в дорзальном (LSD) и медиальном (MS) ядрах перегородки. При этом в первую очередь уменьшалось число холинергических нейронов: на 57.6% в MS, на 55.8% в LSD и на 37.4% в промежуточном ядре (LSI) (p < 0.05).
Для выяснения вопроса о том, участвует ли окислительный стресс в механизме токсического воздействия AF64A на нейроны, были исследованы содержание ТБКРП, СПА и генерация АФК в коре больших полушарий и гиппокампе крыс. Было установлено, что в течение первой недели после введения AF64A вызывал накопление ТБКРП. При этом наблюдался прирост как базального уровня ТБКРП, так и содержания ТБКРП после индукции ПОЛ в экстрактах структур мозга in vitro Fe2+/аскорбатом. Интересно, что введение искусственной спинномозговой жидкости контрольным животным оказывало сходное влияние на эти параметры, однако эффект AF64A был более выражен (рис. 6). Возрастание уровня ТБКРП в условиях А 14 Б AF64A * * # * * # # # 11 Рис. 6. Содержание ТБКРП (базальный уровень) в неокортексе (А) и гиппокампе (Б) в контроле (искусственная спинномозговая жидкость, ИСМЖ) и после введения AF64A.
Данные представлены в виде mS.E.M. По оси ординат - содержание ТБКРП в ед.
оптической плотности/мг белка. *- р<0.05; ** p<0.01 - достоверные отличия группы ИСМЖ от интактного контроля; а - р<0.05 - достоверность различий между группами AF64A и ИСМЖ.
индукции ПОЛ Fe2+/аскорбатом свидетельствует об увеличении потенциальной способности субстратов (прежде всего липидов) к свободнорадикальному окислению.
Накопление ТБКРП, вероятно было обусловлено существенным усилением генерации АФК во всех исследованных структурах мозга, начиная с 1-го дня после инъекции веществ. Активация процессов свободнорадикального окисления в мозге в первые дни после введения AF64A сопровождалась постепенным усилением СПА. Так, в гиппокампе СПА увеличивалась к 5-му дню после инъекции (p < 0.05) и сохранялась на более высоком уровне до 4-х месяцев после введения токсина (p < 0.05).
Увеличение способности ткани мозга к перехвату супероксидного радикала может отражать в данном случае компенсаторные изменения, связанные с развитием окислительного стресса.
Было установлено, что в гиппокампе крыс из группы AF64A происходило кратковременное снижение активности NOS, которое было максимальным на 3-й и 4й дни после введения токсина (p < 0.05). Этот эффект по времени совпадал с интенсивным окислительным стрессом. Активность NOS медленно возвращалась к OD/ OD/ контрольному уровню на 7-й день. Во фронтальной коре не было обнаружено изменений в активности NOS. На 4-й день после введения AF64A в париетальной коре наблюдалось достоверное увеличение активности NOS по сравнению с контрольной группой крыс (100 9,2 % и 126,7 5,9 % в группах, получавших искусственную спинномозговую жидкость и AF64A, соответственно; p < 0.05).
По данным литературы ингибирование NOS неспецифичным в отношении разных изоформ этого фермента ингибитором L-NAME способствует усилению холинотоксического эффекта AF64A (Lautenshlager et al., 2000). Ингибиторы нейронной и индуцибельной изоформ NOS не влияют существенно на нейротоксичность AF64A (Lautenshlager et al., 1998). Следует также отметить, что снижение активности NOS, вызванное AF64A, совпадало по времени с усилением окислительного стресса в мозге, который нам удалось зарегистрировать в течение первых дней после интрацеребровентрикулярной инъекции этого нейротоксина.
Таким образом, можно предположить, что в этой модели нейродегенерации снижение активности NOS способствует усилению токсичности AF64A.
Число клеток, содержащих НАДФНд - гистохимический маркер NOS - снижалось после введения AF64A по сравнению с контрольной группой в LSD (p < 0.01). Число НАДФНд-позитивных нейронов не изменялось в LSI (p > 0.05), а в MS - возрастало (p < 0.01). Интересно, что и в гиппокампе число нейронов, содержащих НАДФНд, также изменялось по-разному в отдельных клеточных областях. Например, в субикулуме число окрашенных нейронов снижалось с 15.5 0.3 в контрольной группе до 14.6 0.2 и 11.3 0.2 после введения 1 и 2 нмоль AF64A, соответственно (p < 0.02). В то же время в зубчатой фасции наблюдалось увеличение числа таких нейронов с 7.7 0.5 клеток у контрольных крыс до 11.4 0.7 после инъекции 1 нмоль и 20.5 1.1 клеток после инъекции 2 нмоль AF64A (p < 0.01). Это дополнительно свидетельствует о том, что в условиях окислительного стресса, вызванного введением AF64A, снижение активности NOS и экспрессии НАДФНд способствует развитию нейродегенерации.
2.4. Окислительный стресс как центральное звено эксайтотоксичности.
Одним из основных механизмов нейродегенерации является токсичность возбуждающих аминокислот или эксайтотоксичность (см. Forder, Tymianski, 2009).
Эксайтотоксичность связывают с увеличением уровня глутамата, который может быть следствием окислительной инактивации глутаматных транспортеров, как это наблюдается при БА (Lauderback et al., 2001). В эксперименте эксайтотоксичность может быть смоделирована действием агонистов глутаматных рецепторов и/или антагонистов тормозных рецепторов, например ГАМК-рецепторов. В наших экспериментах крысам вводили агонист ионотропных глутаматных рецепторов - каиновую кислоту (КК) или аллостерический ингибитор ГАМКА рецепторов - пентилентетразол (PTZ).
Введение КК в дозе 10 мг/кг приводило к появлению конвульсивных судорог, наблюдавшихся в течение 4-6 ч после инъекции. КК вызывала гибель нервных клеток в гиппокампе, амигдале, пириформной коре и структурах таламуса, которая была максимально выражена через 3 дня после введения. Нейродегенеративные изменения в мозге сопровождались появлением TUNEL-позитивных клеток, содержавших фрагментированный хроматин, что предполагает вовлеченность механизмов апоптоза в нейродегенеративные процессы. Через 2 дня после инъекции КК в гиппокампе было обнаружено более чем двукратное увеличение (p < 0.05) активности одного из ключевых ферментов апоптотического каскада - каспазы-3. Это сопровождалось достоверным снижением уровня свободных тиолов (p < 0.05), что отражает снижение антиоксидантной защиты в этом отделе мозга и является проявлением окислительного стресса. Таким образом, усиление глутаматной трансмиссии приводит к проявлению эксайтотоксичности. Следствием этого является сильное повреждение гиппокампа и некоторых других отделов лимбической системы, которое сопровождается индукцией окислительного стресса и активацией молекулярных механизмов, ведущих к гибели нейронов.
Многократное введение PTZ в субконвульсивной дозе (37,5 мг/кг) приводит к формированию повышенной судорожной готовности у крыс. Этот феномен получил название раскачка или киндлинг. Киндлинг приводит к формированию ответа в виде клонико-тонических судорог на инъекцию PTZ, которая не вызывала конвульсий при однократном введении. Было установлено, что у крыс, подвергнутых процедуре киндлинга, наблюдается гибель нейронов в гиппокампе, которая протекает по механизму, не связанному с апоптозом. При этом происходит 37%-е уменьшение числа нейронов в поле СА3 гиппокапа (p < 0.01). В гиппокампе наблюдается повышенный по сравнению с контролем уровень ТБКРП через 60 мин после последней инъекции PTZ. Аналогичная тенденция наблюдается и в мозжечке. В гиппокампе и мозжечке происходит достоверное снижение белковых SH-групп. Повидимому, после киндлинга в этих отделах мозга процессы ПОЛ протекают более интенсивно. Известно, что развитие киндлинга в значительной степени связано со сдвигом баланса нейромедиаторных систем в сторону преобладания возбуждающей трансмиссии (Parent et al., 1998). Таким образом гибель нейронов в результате пентилентетразолового киндлинга и развитие связанного с ним окислительного стресса является следствием эксайтотоксичности.
Подытоживая полученные результаты, можно отметить, что окислительный стресс является центральным звеном нейродегенеративных процессов, вызванных разными видами воздействия. Введение А(25-35) приводит к усилению свободнорадикального окисления в неокротексе и гиппокампе с последующей дегенерацией нейронов в этих структурах мозга. Холинергический дефицит, возникющий у крыс после введения А(25-35) также может быть последствием окислительного стресса. Окислительный стресс является причиной гибели нейронов после аппликации холинотоксина AF64A, что еще раз подтверждает уязвимость холинергическх нейронов для повреждающего действия АФК. Кроме того, окислительный стресс является важным звеном, опосредующим нейротоксические эффекты глутамата, как видно из экспериментов по модуляции глутаматергической трансмиссии. В то же время временные паттерны развития окислительного стресса и структурных изменений в мозге крыс и их интенсивность в каждой из использованных моделей существенно различались.
3. Изменения нейрогенеза при интрацеребровентрикулярном введении фрагмента (25-35) -амилоидного пептида.
Как уже было отмечено ранее, введение А(25-35) в боковые желудочки мозга крыс приводит к возникновению когнитивного дефицита, связанного с развитием нейродегенерации в гиппокампе и неокортексе. Вместе с тем нарушение функциональных возможностей мозга, в том числе и компенсаторных, может быть связано с изменением уровня нейрогенеза, который продолжается в субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков и субгранулярной зоне (СГЗ) зубчатой фасции гиппокампа в течение всей жизни (Gage, 2002). Известно, что воздействие А на культуру стволовых клеток, выделенных из СВЗ, вызывает усиление пролиферации и формирования нейросфер (Lopez-Toledano, Shelanski, 2004). Кроме того, усиление нейрогенеза было обнаружено в мозге пациентов, страдавших от БА (Jin et al., 2004). Аналогичные данные были получены и при исследовании мозга мутантных мышей с повышенной экспрессией APP (Jin et al., 2004). В то же время ряд авторов показали, что введение А угнетает нейрогенез в пролиферативных зонах мозга обычных и мутантных мышей с оверэкспрессией APP (Haughey et al., 2002). Неоднозначность данных, полученных на аутопсийном клиническом материале и мутантных мышах, обусловила необходимость постановки экспериментов на разработанной нами модели амнезии. Для этого было проведено исследование влияния А(25-35) на процессы пролиферации клеток и дифференцировку нейронов в мозге крыс.
3.1. Влияние А(25-35) на пролиферацию клеток в мозге крыс. Была исследована пролиферация клеток в СВЗ и СГЗ с использованием метода множественного мечения клеток с помощью десяти инъекций аналога тимидина - 5бромо-2Т-дезоксиуридина (BrdU). Использование метода множественного мечения репликации ДНК аналогом тимидина BrdU, позволяет выявить довольно большое число клеток, прошедших S-фазу клеточного цикла в СВЗ через 6 дней после операции (1 день после окончания введения BrdU). Это показывает относительно высокий уровень образования новых клеток в этом регионе мозга взрослых крыс.
Через 12 дней после операции (6 дней после последней инъекции BrdU) число клеток, которые окрашивались антителами, существенно уменьшалось у контрольных животных (рис. 7). Введение нетоксичного пептида с обратной аминокислотной последовательностью A(35-25) не изменяло уровень пролиферации в СВЗ по сравнению с контролем. Число BrdU-позитивных клеток в СВЗ через 6 дней после введения A(25-35) также было сравнимо с таковым у контрольных крыс. Через дней после введения A(25-35) в этой группе животных не было обнаружено характерного снижения числа новых клеток, которое наблюдалось у крыс, получавших инъекцию растворителя или пептида с обратной последовательностью.
Более того, число клеток, содержащих BrdU, было больше через 12 дней после введения A(25-35) по сравнению с двумя другими группами животных.
6 дней 6040012 дней 5030040+ ** 3020020++ * 100* 10Контроль А(35-25) А(25-35) Контроль А(35-25) А(25-35) Рис. 7. Влияние A(25-35) на пролиферацию клеток в СВЗ (левая панель) и СГЗ (правая панель). * - достоверные отличия от соответствующих контрольных животных (p < 0.05); # - достоверные отличия от соответствующих групп животных, получавших A(35-25) (p < 0.03).
Противоположный характер изменений наблюдался в СГЗ зубчатой фасции (рис. 7). Общий уровень пролиферации клеток в СГЗ был снижен и через 6, и через дней после введения A(25-35) по сравнению с крысами, которым вводили воду или А(35-25).
3.2. Влияние интрацеребровентрикулярного введения А(25-35) на нейрогенез в мозге крыс. Метод множественного мечения делящихся клеток позволяет оценить уровень пролиферации в герминативных зонах, но не дает возможности корректно исследовать процессы собственно нейрогенеза, т.к. BrdU включается в ДНК достаточно гетерогенной популяции клеток, которые дифференцируются неодновременно. Поэтому в специальной серии экспериментов BrdU вводили крысам на следующий день после интрацеребровентрикулярной инъекции A(25-35) или растворителя, а через 6, 12, и 28 дней после введения веществ в боковые желудочки исследовали процессы нейрогенеза, включая пролиферацию и дифференцировку клеток, в мозге животных. Введение BrdU на следующий день после операции позволяет максимально точно пронаблюдать судьбу конкретной популяции клеток, которая образовалась через 1 сутки после введения веществ. В СВЗ число BrdUпозитивных клеток было в 3.3 раза выше через 6 дней после введения A(25-35) по Число BrdU+ клеток Число BrdU+ клеток сравнению с контролем (p < 0.05). Через 12 и 28 дней после инъекции A(25-35) число BrdU-позитивных клеток снижалось в СВЗ, хотя оставалось несколько выше по сравнению с контрольной группой. Это, по-видимому, отражает усиление пролиферативных процессов в СВЗ в ответ на введение A(25-35) и/или замедление процесса миграции клеток из СВЗ в направлении обонятельных луковиц.
В СГЗ не наблюдалось существенного изменения числа пролиферирующих клеток после введения A(25-35), что отражалось в отсутствии различий в числе BrdU-позитивных клеток в этом отделе мозга. Для того чтобы исследовать влияние A(25-35) на дифференцировку клеток было проведено двойное окрашивание на BrdU и белок цитоскелета нейробластов - даблкортин (Dcx). Экспрессия Dcx является маркером ранней дифференцировки клеток по нейронному типу. Нам не удалось выявить существенной разницы в относительном числе BrdU/Dcx-позитивных нейронов на ранних этапах дифференцировки, но через 28 дней после введения A(25-35) число новых Dcx-позитивных клеток в СГЗ было в 2.7 раза больше (p < 0.05) по сравнению с контрольной группой крыс. Более того, введение A(25-35) приводило к снижению на 12% (p < 0.01) числа зрелых новых нейронов в СГЗ, которые одновременно окрашивались антителами к BrdU и ядерному белку зрелых нейронов NeuN. Таким образом A(25-35) не влиял существенно на пролиферацию клеток в СГЗ в 1-е сутки после введения в боковые желудочки, но значительно изменял скорость созревания этой популяции нейронов, снижая число NeuNпозитивных клеток в зубчатой извилине.
Сведения об изменении процессов нейрогенеза в мозге при развитии хронических нейродегенеративных процессов до настоящего времени остаются отрывочными. Имеются данные об увеличенной экспрессии маркеров ранних стадий нейрональной дифференцировки в гиппокампе пациентов с БА (Jin et al., 2004).
Вместе с тем данные, полученные на трансгенных моделях у мышей являются противоречивыми и свидетельствуют как об усиленном (Jin et al., 2004), так и сниженном (Donovan et al., 2006) нейрогенезе. По-видимому, эффекты повышенной экспрессии мутантного APP зависят от типа мутации, характера экспрессии и непосредственной процедуры исследования. Это подтверждается в определенной степени результатами наших экспериментов. Так, при субхроническом введении маркера репликации ДНК - BrdU, удается выявить выраженное снижение интенсивности образования новых клеток в СГЗ, тогда как в СВЗ наблюдается явное усиление пролиферативных процессов и/или нарушение миграции клеток, вызванные аппликацией A(25-35). В то же время эти изменения не наблюдаются в том случае, если BrdU вводить только в 1-е сутки после инъекции A(25-35). Вместе с тем последний протокол позволяет более корректно проследить судьбу конкретной части клеток, образовавшихся непосредственно после воздействия. Следует отметить, что усиление пролиферации после действия A(25-35) в СВЗ выявлялось при двух протоколах введения BrdU, тогда как в СГЗ в первом случае было обнаружено снижение числа новых клеток, а во втором случае отмечалось замедление созревания новых нейронов. Негативное влияние A при интрацеребровентрикулярном введении было замечено Haughey et al. (2002) при субхроническом введении BrdU. Можно предположить, что этот эффект как в этой, так и в нашей работе связан с длительностью воздействия A на относительно многочисленную популяцию делящихся клеток, которая включает в себя как стволовые клетки, так и незрелые пролиферирующие нейробласты. Интересно, что при этом в непосредственной близости от места введения, т.е. в СВЗ, A вызывает усиление пролиферации, что согласуется с данными о его влиянии на стволовые клетки в культуре (Lopez-Toledano, Shelanski, 2004). В то же время A нарушает гомеостаз Ca2+ и дифференцировку стволовых клеток по нейрональному типу (Haughey et al., 2002). Несомненно, что при любом экспериментальном протоколе выявляется биологическая активность A в отношении процессов нейрогенеза в мозге взрослых животных, что имеет важное значение для его нормальной деятельности.
4. Модуляция нейротоксичности -амилоидного пептида (25-35) про- и антивоспалительными цитокинами Повреждения нейронов, характерные для многих нейродегенеративных заболеваний, включая БА, болезнь Паркинсона, деменцию при СПИДе, рассеянный склероз, прионовые болезни и др., могут быть вызваны активацией иммунного ответа (Akiyama et al., 2000). Основными действующими факторами, определяющими судьбу нейрона при этом, наряду со свободными радикалами являются про- и антивоспалительные цитокины. Цитокины - широко распространенный класс белков, обладающих плейотропной активностью. В условиях патологии цитокины способны усиливать или ослаблять действие патогенных факторов в зависимости от их уровня и типа рецепторов, с которыми они взаимодействуют. Учитывая это, были поставлены задачи исследовать влияние цитокинов на нейротоксичность А(25-35). Для этого нмоль агрегированного А(25-35) вводили в гиппокамп крыс. Контрольные животные получали инъекцию растворителя (стерильной воды) или пептида с обратной последовательностью А(35-25). Одновременно в латеральные желудочки мозга вводили провоспалительный цитокин, фактор некроза опухоли- (TNF) человека, в дозе 0.5 мкг/желудочек или антивоспалительный цитокин, интерлейкин-4 (IL-4) крысы, в дозе 30 нг/желудочек.
4.1. Введение А(25-35) вызывает нейродегенерацию в гиппокампе крыс.
Введение стерильной воды в гиппокамп крыс приводило к существенной гибели клеток верхней ветви зубчатой фасции и менее выраженной - в поле СА1.
Повреждения максимально проявлялись в месте инъекции, и их выраженность постепенно уменьшалась по мере удаления от места введения вещества. Введение изотонического раствора в латеральные желудочки мозга крыс не вызывало никаких изменений в области, прилежащей к месту инъекции.
Интрагиппокампальное введение не нейротоксичного А(35-25) приводило к возникновению кавитационных повреждений в этом отделе мозга, значительному повреждению верхней, а иногда и нижней ветвей зубчатой фасции. Степень повреждения поля СА1 гиппокампа также была в среднем в 2.1 раза больше контрольной, но не отличалась от нее достоверно из-за высоких индивидуальных различий.
Введение токсичного агрегированного А(25-35) вызывало, наряду с указанными изменениями, существенно более выраженное повреждение в поле СА1.
Дисперсионный анализ показал зависимость размера поврежденной области в поле СА1 от действия А(25-35) (ANOVA Крускала-Уоллиса H(2, 16) = 8.9; p < 0.02).
Площадь поврежденного участка поля СА1 после введения А(25-35) была в 3.4 раза больше по сравнению с контралатеральным гиппокампом (p < 0.02), и в 1.6 раза по сравнению с животными, которым вводили нетоксичный пептид (p < 0.03). Для зубчатой фасции не выявлено зависимости размера повреждения от воздействия введенного пептида А(25-35) (H (2, 16) = 4.0; p = 0.1). Следовательно, нейроны поля СА1 были более чувствительны к токсическому действию А(25-35).
Несмотря на то, что не удалось выявить четких достоверных различий по числу TUNEL-позитивных клеток между исследованными группами, наблюдалась выраженная тенденция к увеличению размера участка, занятого апоптотическими клетками в поле СА1 и зубчатой фасции крыс после введения А(25-35) (p = 0.08).
4.2. Влияние TNF и IL-4 на вызванную А(25-35) нейродегенерацию в гиппокампе крыс. Инъекции TNF человека в боковые желудочки не вызывали заметных изменений морфологии нейронов в коре больших полушарий и гиппокампе крыс. Совместное введение А(25-35) и TNF вызывало повреждение гиппокампа, сходное по характеристикам с тем, что наблюдалось в группе крыс, получавших только А(25-35), но в этой группе разрушения имели более выраженный характер.
Кроме того имело место выраженное набухание нейронов V слоя неокортекса в непосредственной близости от дегенерирующего участка гиппокампа. Протяженность поврежденных участков поля СА1 гиппокампа была значительно более выражена в группе А(25-35) по сравнению с контрольной группой и группой, инъецированной TNF (F(3, 8) = 21.24; р < 0.001). Наиболее выраженные разрушения клеточного слоя поля СА1 наблюдались в группе А(25-35) + TNF: в 6.9 раз больше по сравнению с контролем и в 2 раза больше по сравнению с группой А(25-35).
Интрацеребровентрикулярное введение IL-4 само по себе также не оказывало заметного эффекта ни на состояние клеток неокортекса, ни на морфологию гиппокампа по сравнению с инъекциями изотонического раствора или воды.
Введение в гиппокамп крыс А(35-25) одновременно с интрацеребровентрикулярной инъекцией IL-4 также не влияло существенно на размеры поврежденной области (p = 0.2 по сравнению с группой А(35-25)).
Одновременное введение А(25-35) в комбинации с IL-4 также вызвало возникновение области дегенерации, размер которой был сопоставим с повреждениями, наблюдавшимися при введении нетоксичного пептида с обратной последовательностью (p = 0.4 в сравнении с группой А(35-25) + IL-4). Более того имела место тенденция (p = 0.06) к снижению размера повреждения в 1.9 раза в поле СА1 у крыс группы А(25-35) + IL-4 по сравнению с крысами, получавшими только А(25-35). Таким образом, само по себе введение IL-4 в латеральные желудочки мозга крыс не оказывало заметного влияния на размеры повреждений в поле СА1, возникших в результате инъекций воды и А(35-25), и способствовало снижению площади повреждения, вызванного введением токсичного фрагмента А(25-35) в гиппокамп крыс. В то же время не наблюдалось заметного воздействия IL-4 на нейродегенеративные процессы в зубчатой фасции.
Полученные результаты позволяют думать, что кратковременное повышение концентрации про- и антивоспалительных цитокинов в мозге не вызывает заметных морфологических изменений в гиппокампе и неокортексе. Вместе с тем было показано, что с помощью цитокинов можно модулировать нейротоксические эффекты А(25-35). При этом провоспалительный цитокин усиливает токсическое воздействие А(25-35), а антивоспалительный - снижает повреждающий эффект этого пептида.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Базируясь на имеющихся данных литературы и собственных исследованиях, можно изобразить совокупность событий, протекающих в мозге при развитии нейродегенеративного процесса, сопровождающего БА, в виде схемы (рис. 8). На ней изображены основные этапы патогенеза этого заболевания, часть из которых воспроизводится в модели амнезии Альцгеймеровского типа, исследованной в представленной работе. В наших экспериментах показано, что появление в мозге агрегатов A(25-35) после интрацеребровентрикулярного введения вызывает нарушение кратковременной пространственной и непространственной памяти у крыс.
Эти нарушения проявляются, спустя две недели после аппликации A(25-35), и сохраняются в течение длительного времени. В частности при обучении животных в радиальном лабиринте наблюдались нарушения как референтной, так и рабочей памяти. Кроме того, введение этого пептида затрудняло воспроизведение предварительно выработанной реакции поиска пищи. Необходимо отметить, что использование эмоционально-отрицательного безусловного стимула позволяло преодолеть амнестический эффект A(25-35), например, при выработке УРПИ, или сделать его менее выраженным, как в случае выработки УР замирания. Сходные изменения поведения у экспериментальных животных наблюдали позднее многие авторы (Муганцева, Подольский, 2009; Yamaguchi, Kawashima, 2001; Meunier et al., 2006; Klimentiev et al., 2007; Villard et al., 2009). Таким образом, присутствие в мозге агрегированного A(25-35) приводит к возникновению амнезии у экспериментальных Мутации генов Старение Генетические APP, PS1, PS2 Эпигенетические Травмы факторы ApoE факторы Сосудистые другие? патологии Гипоксия Протеолиз APP Накопление A Образование фибриллярных и олигомерных форм A Образование Изменение активности сенильных киназ/фосфатаз бляшек Гиперфосфорилирование тау-белка Нейрофибриллярные клубки Воспалительная Микроглиоз реакция Астроцитоз Дефицит ацетилхолина и др. медиаторов Нарушение метаболизма Эксайтотоксичность нейронов, ионного гомеостаза Окислительный стресс NO Повреждение и гибель нейронов Нарушение нейрогенеза Амнезия Рис. 8. Гипотетическая схема событий, ведущих к возникновению амнезии Альцгеймеровского типа. Жирным шрифтом выделены процессы, развитие которых можно наблюдать в предложенной модели.
животных. Отсутствие в паренхиме мозга животных конгофильных отложений A позволяет говорить о том, что наблюдаемые изменения могут рассматриваться в качестве модели ранних этапов БА, которые принято считать стадией преимущественно мнестических нарушений (Сметанников, 1997; Гаврилова, 2007;
2010).
Основой нарушения когнитивных функций при БА являются холинергический дефицит, связанный с угнетением активности ХАТ и/или гибелью специфических популяций нейронов гиппокампа и неокортекса. В представленной работе было продемонстрировано, что введение в мозг A(25-35) вызывало умеренную нейродегенерацию в гиппокампе и неокортексе и снижение числа клеток, содержащих ХАТ, в медиальной перегородке, что в определенной степени согласуется с имеющимися данными (Maurice et al., 1996; Yamaguchi, Kawashima, 2001). Более того, выраженность нейродегенеративных изменений в нашей работе коррелировала со степенью мнестических нарушений. Следует отметить, что непосредственное введение A(25-35) в гиппокамп также вызывало гибель нейронов, специфически выраженную в поле СА1 гиппокампа. Основной характеристикой этих процессов является их отставленность во времени от момента непосредственного появления A в мозге. Это в значительной степени согласуется с представлениями о том, что нарушение метаболизма APP и, как следствие, увеличение содержания A в мозге являются событиями необходимыми, но явно недостаточными для запуска клеточной гибели (Кудинова и соавт., 2007; Robakis, 2010).
В качестве механизма, опосредующего, нейротоксический эффект A(25-35), может выступать окислительный стресс. Хорошо известно, что повышенная продукция свободнорадикальных соединений кислорода и азота и/или снижение антиоксидантной защиты, которые и составляют суть механизмов окислительного стресса, оказывают патологическое влияние на функциональное состояние нейронов и влекут за собой повреждение нервных клеток и их гибель (Гуляева, Ерин, 1995;
Brera et al., 2000; Butterfield et al., 2001; Guglielmotto et al., 2009; 2010; Miranda et al., 2000; Moreira et al., 2008). В настоящей работе впервые было показано, что интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) приводит к усилению продукции свободнорадикальных продуктов окислительного метаболизма, таких как супероксидный анион-радикал и NO, и прослежена временная динамика изменений показателей окислительного стресса в разных структурах мозга крыс. Было установлено, что окислительный стресс может являться причиной нейродегенеративных изменений, связанных с токсическим действием возбуждающих аминокислот. Кроме того, было установлено, что специфическая гибель холинергических нейронов медиальной септум вследствие воздействия холинотоксина AF64A также является результатом усиления процессов свободнорадикального окисления. Следует отметить, что активация механизмов окислительного стресса происходила в ранние сроки после разных видов экспериментального воздействия и сохранялась в течение довольно длительного периода времени. Таким образом можно заключить, что окислительный стресс является наиболее ранним и важным событием, опосредующим гибель нервных клеток при развитии нейродегенеративных процессов в мозге.
Повреждение мозга при нейродегенерации сопровождается развитием нейровоспалительных процессов, которые выражаются в активации клеток глии, генерации различных воспалительных агентов, включая, про- и антивоспалительные цитокины, а также свободные радикалы. В частности, в пользу этого наряду с повышенным радикалообразованием свидетельствует усиление синтеза NO, обнаруженное в настоящем исследовании и подтвержденное работами других исследователей (Манухина и соавт., 2008; Limon et al., 2009; Lu et al., 2009). Наши эксперименты показали, что изменение уровня провоспалительного - TNF-, и антивоспалительного - IL-4, цитокинов в мозге существенно влияет на токсические свойства A(25-35). Так, одновременное введение TNF- и A(25-35) приводило к увеличению повреждения в гиппокампе, тогда как коинъекция IL-4 оказывала защитное действие. Эти данные позволяют говорить о наличии подходов к разработке новых форм терапии БА.
Немаловажным представляется тот факт, что снижение когнитивных способностей у людей на ранних этапах БА может быть связано не только с избирательной гибелью отдельных популяций нейронов, но и с воздействием патогенных факторов на процесс образования и созревания новых нейронов. Процесс нейрогенеза происходит в течение всей жизни и закономерно снижается при старении. Вместе с тем данные последних лет свидетельствуют об усилении нейрогенеза в мозге пациентов при БА. В наших экспериментах показано, что появление в мозге животных агрегатов A(25-35) оказывает двоякое влияние на процессы пролиферации и дифференцировки клеток в субвентрикулярной и субгранулярной пролиферативных зонах. При этом усиление пролиферации клеток и/или нарушение миграции нейробластов в направлении обонятельных луковиц в СВЗ боковых желудочков наблюдается как в течение первых суток после введения A(25-35), так и в течение всей первой недели после воздействия. В СГЗ зубчатой извилины эффект A(25-35) в первые сутки практически не выражен, но в течение первой недели после инъекции A(25-35) наблюдается ингибирование пролиферации.
Более того введение этого пептида приводит к увеличению числа незрелых нейронов в этой области мозга, демонстрируя влияние A(25-35) на процессы клеточной дифференцировки. Таким образом, снижение когнитивных функций на ранних этапах БА может быть обусловлено не только уже известными механизмами возникновения холинергического дефицита, но и существенным влиянием агрегатов A на процессы нейрогенеза.
Следует упомянуть и еще один важный аспект, котрый вытекает из проделанной работы. Известно, что A в мозге подвергается протеолизу многими протеазами и металлопептидазами (Наливаева и соавт., 2010; Nalivaeva et al., 2008).
Снижение активности металлопептидаз при некоторых патологических ситуациях, например при ишемии/гипоксии, может способствовать сдвигу метаболизма А в сторону амилоидогенного пути (Журавин и соавт., 2007). Было показано, что замещение L-Ser26 на D-Ser26 внутри молекулы А(1-40), которое наблюдается в сенильных бляшках в мозге пациентов с БА (Martineau et al., 2006), делает ее растворимой, нетоксичной и доступной для протеолиза. Эндогенные протеазы мозга, такие как химотрипсин-подобные протеазы и аминопептидазы, могут расщеплять этот пептид с образованием [D-Ser26] A(25/26-35) (Kaneko et al., 2001; Kubo et al., 2002). Особый интерес иссследователей привлек к себе этот ундекапептид, поскольку замещение в его составе Ser26 на рацемат D-Ser26 делает его устойчивым к расщеплению протеазами мозга (Kaneko et al., 2001). В то же время токсичность этого пептида остается на уровне нормального A(25-35). Иммуногистохимические исследования выявили присутствие [D-Ser26] A(25/26-35) в сердцевине сенильных бляшек в мозге больных БА, тогда как другой укороченный пептид [D-Ser26] A(25/26-40) содержался в нейронах, внутри которых наблюдались нейрофибриллярные клубки (Kubo et al., 2003). Эти данные дают основание предположить, что ундекапептид (25-35) играет важную роль в развитии нейродегенерации при БА. В пользу важной роли этого короткого пептида в патогенезе БА свидетельствуют и данные о наличии аутоантител к A(25-35) у больных БА (Gruden et al., 2007), а также снижение уровня антител к A(25-35) у мышей с когнитивными нарушениями, вызванными бульбэктомией (Бобкова и соавт., 2001). Эта гипотеза получила дальнейшее развитие в опубликованных недавно обзорных статьях (Каминский и соавт., 2007; Kaminsky et al., 2009), где авторы объединили и рассмотрели многочисленные работы, посвященные исследованию биологической активности A(25-35) in vitro. Можно предполагать, что вследствие активации серин рацемазы при БА происходит замещение L-аминокислот в составе A на D-аминокислоты, что делает A доступным для протеолиза. Это приводит к образованию более токсичного и устойчивого [D-Ser26] A(25-35/40), который вызывает гибель нейронов. Возможно это и является причиной длительной задержки между временем образования бляшек и выраженной нейродегенерацией, которая иногда составляет несколько десятков лет. Данные нашего исследования in vivo подтверждают, что A(25-35) может играть роль основного нейротоксичного соединения, вызывающего гибель нейронов и связанные с ней последствия при БА.
Подытоживая полученные в настоящей работе результаты, можно заключить, что интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) является подходящей моделью, позволяющей не только воспроизводить отдельные симптомы этого сложного заболевания, в частности мнестические нарушения, но и исследовать разнообразные механизмы, лежащие в основе их возникновения и ведущие к нейродегенерации.
ВЫВОДЫ 1. Интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) вызывает нарушение обучения и кратковременной памяти у крыс в отдаленные сроки после воздействия, при этом ухудшаются поведение в радиальном лабиринте, поведение чередования и память о социальных контактах. В то же время не нарушаются выработка и воспроизведение условной реакции пассивного избегания, но наблюдается временное нарушение воспроизведения условной реакции замирания.
2. Интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) приводит к нейродегенеративным изменениям в гиппокампе и неокортексе, которые развиваются через 1-3 мес и сохраняются до 6 мес после введения пептида.
3. Интрацеребровентрикулярное введение A(25-35) сопровождается развитием окислительного стресса, временной паттерн и интенсивность которого зависят от отдела мозга. Нейродегенеративные процессы, вызванные введением холинотоксина AF64A, сопровождаются окислительным стрессом, интенсивность которого наиболее выражена в гиппокампе. Гибель нейронов, связанная с нарушением глутаматной трансмиссии в результате введения каиновой кислоты или пентилентетразола, опосредована активацией свободнорадикальных процессов, наиболее выраженной в гиппокампе.
4. Окислительный стресс является центральным звеном патогенеза нейродегенеративных процессов различной этиологии, вызывает угнетение функции холинергических нейронов и нейрогенеза, опосредует возникновение когнитивных нарушений на начальных этапах развития экспериментальной патологии, а на более поздних этапах - гибель нервных клеток.
5. Хронические нейродегенеративные изменения, индуцированные исследованными факторами, связаны с активацией нейрональной NO-синтазы.
6. Введение A(25-35) в боковые желудочки мозга вызывает разнонаправленные изменения пролиферации и дифференцировки нейронов в разных пролиферативных зонах мозга взрослых крыс. Снижение нейрогенеза совпадает по времени с возникновением когнитивного дефицита, вызванного введением A(25-35).
7. Модуляция токсичности A(25-35) провоспалительным цитокином, фактором некроза опухоли-, приводит к усилению дегенеративных проявлений в гиппокампе, а антивоспалительный цитокин интерлейкин-4 снижает нейротоксичность A(25-35).
8. Разработанная в ходе выполнения исследования модель амнезии Альцгеймеровского типа может быть использована для изучения механизмов патогенеза болезни Альцгеймера и поиска новых подходов к его терапии.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Gulyaeva N.V., Lazareva N.A., Libe M.L., Mitrokhina O.S., Onufriev M.V., Stepanichev M.Yu., Chernyshevskaya I.A., Walsh T.J. Oxidative stress in the brain following intraventricular administration of ethylcholine aziridinium (AF64A) // Brain Res. 1996. V. 726. P. 174-180.
2. Степаничев М.Ю., Лазарева Н.А., Онуфриев М.В., Митрохина О.С., Моисеева Ю.В., Гуляева Н.В. Влияние введения фрагмента (25-35) бета-амилоидного пептида на поведение крыс // Журн. высш. нерв. деят. 1997. Т. 47. № 3. С. 597600. (Stepanichev M.Yu., Lazareva N.A., Onufriev M.V.,Mitrokhina O.S., Мoiseeva Yu.V., Gulyaeva N.V. Effects of doses of fragment (25-35) of beta-amyloid peptide on behavior in rats // Neurosci. Behav. Physiol. 1998. Vol. 28. P. 564-566.) 3. Gulyaeva N.V., Victorov I.V., Stepanichev M.Yu., Onufriev M.V., Mitrokhina O.S., Мoiseeva Yu.V., Lazareva N.A. Intracerebroventricular administration of betaamyloid peptide (25-35) induces oxidative stress and neurodegeneration in rat brain // Progress in AlzheimerТs and ParkinsonТs diseases. Fisher A. Et al. eds. New York, Plenum Press. 1998. P. 89-98.
4. Онуфриев М.В., Степаничев М.Ю., Митрохина О.С., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Влияние окислительного стресса на активность синтазы оксида мозга in vivo и in vitro // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.
1999. Т. 85. С. 531-538.
5. Митрохина О.С., Степаничев М.Ю., Лазарева Н.А., Моисеева Ю.В., Онуфриев М.В., Гуляева Н.В. Влияние интрацеребровентрикулярного введения фрагмента (25-35) бета-амилоидного пептида на уровни перекисного окисления липидов в структурах мозга и в крови крыс // Докл. Акад. наук. 1999. Т. 368. № 5. С. 711713.
6. Stepanichev M.Yu., Zdobnova I., Zarubenko I, Lazareva N.A., Onufriev M.V., Moiseeva Yu., Chernyavskaya L., Gulyaeva N.V. Seizure intensity correlates with oxidative stress and apoptosis in the hippocampus in the kainic acid model in rat // Нейрохимия. 2000. Т. 17. № 3. С. 189-191.
7. Stepanichev M.Yu., Onufriev M.V., Mitrokhina O.S., Moiseeva Yu., Lazareva N.A., Viktorov I.V., Gulyaeva N.V. Neurochemical, behavioral, and neuromorphological effects of central administration of beta-amyloid peptide (25-35) in rat // Нейрохимия. 2000. Т. 17. № 4. С. 291-306.
8. Трубецкая В.В., Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Лазарева Н.А., Маркевич В.А., Гуляева Н.В. Повышение активности NO-синтазы в гиппокампе крыс сопровождает длительную потенциацию in vivo // Нейрохимия. 2001. Т. 18. № 1.
С. 55-61.
9. Моисеева Ю.В., Онуфриев М.В., Лазарева Н.А., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В. Свободно-радикальные механизмы септо-гиппокампальной нейродегенерации, вызванной холинотоксином AF64A у крыс in vivo. // Нейрохимия. 2001. Т. 18. P. 287-289.
10. Трубецкая В.В., Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Лазарева Н.А., Маркевич В.А., Гуляева Н.В. Введение агрегированного бета-амилоидного пептида (25-35) вызывает изменение длительной потенциации в гиппокампе in vivo // Журн.
высш. нерв. деят. 2001. Т. 51. № 6. С. 701-704. (Trubetskaya VV, Stepanichev MY, Onufriev MV, Lazareva NA, Markevich VA, Gulyaeva NV. Administration of aggregated beta-amyloid peptide (25-35) induces changes in long-term potentiation in the hippocampus in vivo // Neurosci. Behav. Physiol. 2003. V. 33. P. 95-98.) 11. Здобнова И.М., Степаничев М.Ю., Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Егорова Л.К., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Мац В.Н., Гуляева Н.В. Взаимодействие нейротоксического фрагмента бета-амилоидного пептида и фактора некроза опухоли альфа при интрацеребральном введении крысам // Нейрохимия. 2002. Т.
19. С. 112-117.
12. Павлова Т.В., Яковлев А.А., Степаничев М.Ю., Менджерицкий А.М., Гуляева Н.В. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает окислительный стресс в мозге крыс // Нейрохимия. 2002. Т. 19. С. 118-121.
13. Степаничев М.Ю., Моисеева Ю.В., Гуляева Н.В. Инъекционные модели болезни Альцгеймера: окислительный стресс в механизме токсичности AF64A и -амилоидного пептида у грызунов // Нейрохимия. 2002. Т. 19. С. 165-175.
14. Onufriev M.V., Stepanichev M.Yu., Chernyavskaya L., Lazareva N.A., Moiseeva Yu., Gulyaeva N.V. Correlations between oxidative stress, apoptosis and seizures:
studies using kainic acid model in rat // Memory and Emotions. P. Calabrese, A.
Neugebauer eds. Singapore, New Jersey, London, Hong Kong, World Scientific. 2002.
P. 335-340.
15. Stepanichev M.Yu., Mitrokhina O.S., Viktorov I.V., Moiseeva Yu., Onufriev M.V., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. -Amyloid (25-35) induces impairment of working but not reference memory accompanied by neurodegeneration in rat brain // Memory and Emotions. P. Calabrese, A. Neugebauer eds. Singapore, New Jersey, London, Hong Kong, World Scientific. 2002. P. 445-452.
16. Stepanichev M.Yu., Zdobnova I.M., Yakovlev A.A., Onufriev M.V., Egorova L.K., Lazareva N.V., Zarubenko I.I., Gulyaeva N.V. Effects of tumor necrosis factor-alpha central administration on hippocampal damage in rat induced by amyloid beta-peptide (25-35) // J. Neurosci. Res. 2003. V. 71. P. 110-120.
17. Stepanichev M.Yu., Moiseeva Yu.V., Lazareva N.A., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V. Single intracerebroventricular administration of amyloid-beta (25-35) peptide induces impairment in short-term rather than long-term memory in rats // Brain Res.
Bull. 2003. V. 61. P. 197-205.
18. Stepanichev M.Yu., Zdobnova I.M., Zarubenko I.I., Moiseeva Y.V., Lazareva N.A., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V. Amyloid-beta(25Ц35)-induced memory impairments correlate with cell loss in rat hippocampus // Physiol. Behav. 2004. V. 80. P. 647-655.
19. Степаничев М.Ю., Моисеева Ю.В., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Исследование эффектов фрагмента (25-35) -амилоидного пептида на поведение крыс в радиальном лабиринте // Журн. высш. нерв. деят. 2004. Т. 54. № 3. С. 382-389.
(Stepanichev M.Y., Moiseeva Y.V., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. Studies of the effects of fragment (25-35) of beta-amyloid peptide on the behavior of rats in a radial maze // Neurosci. Behav. Physiol. 2005 V. 35. P. 511-518.) 20. Степаничев М.Ю., Здобнова И.М., Зарубенко И.И., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Исследование эффектов центрального введения -амилоидного пептида (25-35): патоморфологические изменения в гиппокампе и нарушение пространственной памяти // Журн. высш. нерв. деят. 2004. Т. 54. № 5. С. 705-711.
(Stepanichev M.Y., Zdobnova I.M., Zarubenko I.I., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V.
Studies of the effects of central administration of beta-amyloid peptide (25-35):
pathomorphological changes in the hippocampus and impairment of spatial memory // Neurosci. Behav. Physiol. 2006. V. 36. P. 101-106.) 21. Степаничев М.Ю. Цитокины как нейромодуляторы в центральной нервной системе // Нейрохимия. 2005. Т. 22. № 1. С. P. 6-11.
22. Хренов А.И., Воронцова О.Н., Перегуд Д.И., Лазарева Н.А., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В. Эффекты центрального введения фрагмента (25-35) бетаамилоидного пептида на нитрергическую систему мозга крыс// Нейрохимия.
2005. Т. 22. № 4. С. 279-285.
23. Степаничев М.Ю., Флегонтова О.В., Лазарева Н.А., Егорова Л.К., Гуляева Н.В. Влияние противовоспалительного цитокина интерлейкина-4 на нейродегенерацию у крыс, вызванную бета-амилоидным пептидом // Нейрохимия. 2006. Т. 23. № 1. С. 67-72.
24. Stepanichev M., Zdobnova I., Zarubenko I., Lazareva N., Gulyaeva N.V.
Differential effects of tumor necrosis factor-alpha co-administered with amyloid betapeptide (25-35) on memory function and hippocampal damage in rat // Behav. Brain Res. 2006. V. 175. P. 352-361.
25. Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Моисеева Ю.В., Яковлев А.А., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Влияние фактора некроза опухоли-альфа и бета-амилоидного пептида (25-35) на показатели свободнорадикального окисления и активность каспазы-3 в мозге крыс // Нейрохимия. 2006. Т. 23. № 3. С. 217-222.
26. Pavlova T., Stepanichev M., Gulyaeva N. Pentylenetetrazole kindling induces neuronal cyclin B1 expression in rat hippocampus// Neurosci. Let. 2006. 392. 154-158.
27. Степаничев М.Ю., Либе М.Л., Чернышевская И.А., Мойсеенок А.Г., Гуляева Н.В. Экспрессия НАДФН-диафоразы в мозге крыс в отдаленные сроки после введения холинотоксина AF64A // Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 2. С. 161-165.
28. Stepanichev M.Yu., Onufriev M.V., Yakovlev A.A., Khrenov A.I., Peregud D.I., Vorontsova O.N., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. Amyloid-beta (25-35) increases activity of neuronal NO-synthase in rat brain // Neurochem. Int. 2008. V. 52. № 6. P.
1114-1124.
29. Попова М.С., Степаничев М.Ю. Индукция клеточного цикла, амилоид-бета и свободные радикалы в механизме развития нейродегенеративных процессов в мозге // Нейрохимия. 2008. Т. 25. № 3. С. 170-178.
30. Степаничев М.Ю., Моисеева Ю.В., Онуфриев М.В., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Изменения пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне мозга у взрослых крыс при введении -амилоидного пептида (25-35) // Морфология.
2009. № 1. С. 13-16. (Stepanichev M.Yu., Moiseeva Yu.V. Lazareva N.A., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V. Changes in cell proliferation in the subventricular zone of the brain of adult rats given -amyloid peptide (25-35) // Neurosci. Behav. Physiol. 2010.
V. 40. P. 123-126.) 31. Павлова Т.В., Степаничев М.Ю., Гехт А.Б., Гуляева Н.В. Выработка реакции активного избегания у крыс и морфологические изменения в гиппокампе при пентилентетразоловом киндлинге // Журн. высш. нерв. деят. 2009. Т. 59. № 2. С.
213-220.
32. Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В. Инъекционные модели болезни Альцгеймера // Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты.
Под ред. Угрюмова М.В. М.: Наука, 2010. С. 364-380.
33. Gulyaeva N.V., Stepanichev M.Yu. Abeta(25-35) as proxyholder for amyloidogenic peptides: in vivo evidence // Exp. Neurol. 2010. V. 222. № 1. P. 6-9.