Н И К О В А ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ И МЕХАНИЗМЫ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ Специальность 03.03.01 - физиология А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2010

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П.ПАВЛОВА

На правах рукописи

Р Ы Б Н И К О В А

ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ И МЕХАНИЗМЫ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ

Специальность 03.03.01 - физиология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ доктор медицинских наук

профессор М.О.САМОЙЛОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор биологических наук

И.А. ЖУРАВИН

доктор биологических наук

доцент М.П. ЧЕРНЫШЕВА

доктор биологических наук

.П.ФИЛАРЕТОВА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Институт нормальной

физиологии им. П.К.Анохина РАМН

Защита состоится л___ ___________________2010 года в_____часов______ минут на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

(Д 002.020.01) при Институте физиологии им.И.П.Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им.

И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан л_____________________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Н.Э.Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из центральных проблем биологии и медицины является выяснение влияния внешней среды на организм, особенно при действии неблагоприятных повреждающих факторов. Решение этой проблемы имеет важное значение для раскрытия эндогенных защитных механизмов, лежащих в основе приспособительных реакций организма к факторам среды, с целью разработки новых эффективных способов повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям (гипоксии/ишемии, различным стрессорам и др.). Эти экстремальные воздействия приводят к структурно-функциональным повреждениям нейронов чувствительных образований мозга и развитию патологий, в частности, постгипоксических состояний и постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств. Такие патологические состояния отличаются высокой распространенностью, их частота в мире неуклонно возрастает. Поэтому повышение устойчивости мозга к повреждающим факторам является крайне актуальной задачей. В настоящее время существует два подхода к решению этой задачи: использование медикаментозных (фармакологических) средств и немедикаментозных способов, направленных на мобилизацию эндогенных зволюционно приобретенных генетически-детерминированных защитных механизмов. Одним из наиболее эффективных немедикаментозных способов является прекондиционирование. Прекондиционирование Ц это предъявление кратковременных умеренных доз повреждающих факторов, повышающее резистентность мозга к неблагоприятным воздействиям. Выделяют несколько видов прекондиционирующих воздействий, в частности, гипоксическое/ишемическое, химическое (фармакологическое), термическое и др. Наиболее распространенный и достаточно хорошо изученный вид прекондиционирования - гипоксическое/ишемическое, впервые использованное на сердце в 1986 (Murry et al., 1986). Гипоксическое/ишемическое прекондиционирование активно применяется в кардиохирургии и кардиологии в качестве эффективного кардиопротективного способа (Ратманова, 2008; Rezkalla and Kloner, 2007).

Обнаружение и расшифровка феномена ишемической/гипоксической толерантности мозга - повышения резистентности нейронов путем тренировки прекондиционирующими умеренными гипоксическими/ишемическими воздействиями явилось одним из важнейших достижений нейробиологии конца XX столетия. На гиппокампе монгольских песчанок было продемонстрировано, что кратковременные воздействия сублетальной ишемией предотвращают гибель чувствительных пирамидных нейронов области СА1 в ответ на последующую глобальную ишемию (Kitagawa et al.,1990). Впоследствии этот феномен был воспроизведен в моделях гипоксии/ишемии на нейронах других уязвимых образованиях мозга различных животных (неокортексе, стриатуме), как in situ, так и in vitro (Самойлов и др., 2001; Kato et al., 1992; Miashita et al., 1994; Simon et al., 1993; Bruer et al., 1997; Hassen et al., 2004). В отличие от сердца, где гипоксическое/ишемическое прекондиционирование представляет собой одну из наиболее хорошо изученных кардиопротективных стратегий, механизмы толерантности мозга, индуцируемые гипоксическим/ишемическим прекондиционированием, исследован значительно хуже.

Согласно современным представлениям, в процессе формирования нейропротективных эффектов прекондиционирования выделяются две фазы. Начальная фаза - фаза индукции гипоксической толерантности мозга, обусловлена быстрой умеренной активацией глутаматергической сигнальной трансдукции и ключевых внутриклеточных регуляторных систем (кальциевой, фосфоинозитидной, цАМФ) (Самойлов и др., 1992, 1994; Самойлов, Мокрушин, 1997; Semenov et al., 2000; Самойлов и др., 2001; Semenov et al., 2002), а также умеренной активацией внутриклеточной прооксидативной системы (образование активных форм кислорода, свободных радикалов) (Ravati et al., 2000; Mori T et al., 2000; Furuichi T et al., 2005; Perez-Pinzon M et al., 2005). Инициация фазы индукции, очевидно, обусловлена изменениями как внутриклеточного редокс-состояния, содержания внутриклеточного кальция (Самойлов, 1999), так и регуляторной функции митохондрий (Лукьянова, 2008). Эти быстро индуцируемые прекондиционированием механизмы являются необходимым звеном для индукции отсроченных геном-зависимых механизмов (фаза экспрессии гипоксической толерантности), благодаря которым развивается полноценный протективный эффект гипоксического/ишемического прекондиционирования (Самойлов и др., 2003; Steiger and Hanggi, 2007; Obrenovitch, 2008). Однако до настоящего времени отсроченные геном-зависимые механизмы гипоксического/ишемического прекондиционирования исследованы недостаточно, а работы по этой проблеме носят разрозненный характер. Концептуальное осмысление имеющихся сведений осложняется тем, что эти данные получены в различных моделях ишемии и гипоксии. Требуется последовательное и комплексное изучение геном-зависимых механизмов протективных эффектов прекондиционирования в одной модели на всех уровнях, начиная от сигнальных каскадов и активности транскрипционных факторов и до экспрессии регулируемых ими генов и их продуктов. Необходимо также оценить характер протективного действия гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга, индуцируемые не только тяжелыми гипоксическими/ишемическими, но и различными стрессорными воздействиями (т.е. кросс-толерантность), что несомненно имеет важное значение для определения возможного спектра применения этого вида прекондиционирования в клинической практике. Удобной экспериментальной моделью для подобного исследования является гипобарическая гипоксия, создаваемая в барокамере, поскольку она легко контролируется и дозируется, что создает возможности для ее применения в различных режимах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования явилось изучение нейропротективных эффектов и молекулярных механизмов, индуцируемых прекондиционирующим воздействием умеренной гипобарической гипоксии.

В основные задачи работы входило:

1. Разработать способ гипоксического прекондиционирования с применением умеренной гипобарической гипоксии на экспериментальных животных - крысах.

2. Определить выраженность протективных эффектов гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга, вызываемые тяжелой гипоксией.

3. Охарактеризовать эффективность антидепрессивного и анксиолитического действия гипоксического прекондиционирования в моделях постстрессовых тревожно-депрессивных патологий у крыс.

4. Изучить молекулярные нейропротективные механизмы прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией при предъявлении тяжелой повреждающей гипоксии: влияние прекондиционирования на модификацию активности МАП-киназного каскада, факторов регуляции апоптоза семейства генов bcl-2, транскрипционных факторов, генов раннего и позднего действия и их продуктов, вовлекаемых во внутриклеточные процессы нейропластичности, выживания/гибели нейронов.

5. Исследовать гормон-зависимые механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования, включающие особенности функционирования гипофизарно-адренокортикальной, кортиколиберин-ергической и вазопрессин-ергической систем у прекондиционированных и непрекондиционированных животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказывает выраженные нейропротективные эффекты, предотвращая структурно-функциональные повреждения мозга, вызываемые тяжелой гипоксией.
Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией обладает выраженным антидепрессивным и анксиолитическим действием, корректируя формирование постстрессовых тревожно-депрессивных патологий.
Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией вызывает активацию внутриклеточных молекулярных механизмов, повышающих резистентность мозга к повреждающим воздействиям. Ключевым звеном этих механизмов является кооперативная активация транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию про-адаптивных генов и их продуктов, играющих важную роль в процессах нейропротекции и нейропластичности.
В формирование протективных эффектов прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией вовлекаются гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма. Повышение стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и стимуляция механизмов ее регуляции по принципу обратной связи, индуцируемые гипоксическим прекондиционированием, способствуют повышению адаптивных возможностей организма.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ Предложен новый оригинальный способ прекондиционирования с использованием умеренной гипобарической гипоксии, эффективно повышающий толерантность мозга к повреждающим факторам различной природы (тяжелая гипоксия, психоэмоциональный и травматический стресс). Впервые изучены как нейропротективное действие гипоксического прекондиционирования в условиях тяжелой гипоксии, так и его антидепрессивные и анксиолитические эффекты в экспериментальных моделях депрессии и тревожного расстройства. Установлено, что воздействие умеренной гипоксией в определенном режиме предотвращает структурно-функциональные повреждения нейронов мозга вслед за тяжелой гипоксией и препятствует развитию постстрессовых тревожно-депрессивных патологий у крыс, что свидетельствует об универсальности механизмов индуцируемого гипоксическим прекондиционированием повышения резистентности мозга к различным повреждающим воздействиям. Сравнительный анализ выраженности антидепрессивного и анскиолитического действия гипоксического прекондиционирования относительно эффективности известных фармакологических препаратов (антидепрессантов, анксиолитиков), проведенный в экспериментальных моделях депрессии и тревожных расстройств, впервые продемонстрировал широкие возможности использования гипоксического прекондиционирования для профилактики и лечения тревожно-депрессивных расстройств.

Впервые с использованием единой экспериментальной модели в значительной мере раскрыты нейрональные молекулярные механизмы, лежащие в основе нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования у крыс. Установлено, что гипоксическое прекондиционирование индуцирует базисные геном-зависимые механизмы адаптации, нейропластичности и нейропротекции, направленные на репрограммирование экспрессии участвующих в процессах выживания/гибели нейронов внутриклеточных регуляторных компонентов и проадаптивных белков в условиях предъявления повреждающих воздействий. В частности, прекондиционирующее воздействие модифицирует соотношение факторов регуляции апоптоза, обеспечивая преобладание антиапоптотических белков, а также способствует устойчивой кооперативной активации транскрипционных факторов CREB, NF-kB, NGFI-A, c-Fos, HIF-1 и их генов-мишеней, кодирующих белки, широко вовлекающиеся в адаптивные реакции - антиоксиданты, нейрогормоны, стероидные рецепторы, металлопротеазы. Кроме того, прекондиционирование, очевидно, предотвращает развитие нейродегенеративных процессов путем стимуляции неамилоидогенного процессинга белка-предшественника -амилоида.

Получены новые данные о важной роли гормон-зависимых механизмов адаптации в формировании толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием. Впервые показано, что прекондиционирование умеренной гипоксией предотвращает возникновение нарушений динамики активации гипофизарно-адренокортикальной системы и ее регуляции по механизмам обратной связи в условиях тяжелых патогенных воздействий (тяжелой гипоксии, психоэмоциональных и травматических стрессов). Обнаружено, что это осуществляется посредством индуцируемых прекондиционированием устойчивых модификаций механизмов нейроэндокринной регуляции (активности кортиколиберин- и вазопрессинергической систем мозга, стероид-рецептирующей функции гиппокампа), способствующих переводу эндокринной системы в новый режим функционирования. Этот режим характеризуется усилением стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и потенциацией механизмов глюкокортикоидной обратной связи, что отражает повышение адаптивных возможностей гипофизарно-адренокортикальной системы и организма в целом в условиях действия повреждающих факторов.

В целом, полученные в данном исследовании новые сведения и сформулированные на их основе представления об универсальных принципах формирования толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием, носят приоритетный характер и в значительной мере опережают аналогичные разработки как в России, так и за рубежом.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы нейробиологии, связанной с расшифровкой эндогенных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышение резистентности мозга и организма в целом к патогенному действию неблагоприятных факторов. Совокупность полученных данных имеет весомое значение для развития современных представлений о феномене толерантности и кросс-толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием, и раскрытие лежащих в основе ее формирования внутриклеточных процессов. На основании проведенных исследований обосновывается представление о том, что прекондиционирование - это воздействие, подготавливающее мозг и организм в целом к эффективному противодействию неблагоприятным факторам путем стимуляции молекулярных и гормональных механизмов адаптации. Это представление не только выявляет общность феномена прекондиционирования и предупредительной сигнализации по И.П.Павлову, но и вносит значительный вклад в понимание молекулярно-клеточных основ такого рода сигнализаций.

Большая теоретическая значимость проведенного исследования также связана с тем, что удалось не только установить широкий спектр нейропротективных эффектов предложенного способа гипоксического прекондиционирования на различных уровнях (от морфологических изменений нейронов до поведения и гормональных функций), но и выявить внутриклеточные каскадные механизмы, посредством которых реализуется нейропротективное действие гипоксического прекондиционирования. Эти сведения существенно расширяют современные представления о нейрональных механизмах фенотипической пластичности, лежащей в основе повышения адаптивных возможностей организма к экстремальным воздействиям.

Важное значение имеют новые факты, свидетельствующие об эффективности протективного действия гипоксического прекондиционирования от патологических последствий тяжелых психоэмоциональных и травматических стрессов. Эти сведения существенно углубляют представления об обусловленной им кросс-толерантности мозга, а также возможностях повышения устойчивости мозга к стрессам различной природы и механизмах, реализующих антидепрессивные и анксиолитические эффекты гипоксического прекондиционирования. Кроме того, полученные в ходе выполнения работы приоритетные данные о вовлечении базисных гормональных механизмов адаптации впервые раскрывают важную роль эндокринной и нейроэндокринной системы в формировании гипоксической толерантности.

Высокая практическая значимость работы определяется необходимостью разработки эффективных стратегий повышения толерантности мозга и профилактики развития неврологических и нервно-психических патологий, возникающих в результате действия внутренних и внешних повреждающих факторов. В проведенных исследованиях впервые был продемонстрирован высокий нейропротективный потенциал оригинального способа гипоксического прекондиционирования с использованием умеренной гипобарической гипоксии, что открывает широкие возможности для внедрения предложенного способа в медицинскую практику в качестве новой, эффективной немедикаментозной стратегии, направленной на комплексную активацию эволюционно-приобретенных, генетически детерминированных нейропротективных механизмов. Согласно результатам полученных исследований, способ гипоксического прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией может представлять несомненный интерес для практического применения с целью профилактики постгипоксических патологий, постстрессовых депрессивных и тревожных расстройств. Вместе с тем, выявленные эндогенные механизмы нейропротективного действия прекондиционирования могут способствовать созданию нового поколения эффективных фармакологических препаратов, оказывающих направленное действие на ключевые звенья внутриклеточных защитных механизмов.

Основные положения и выводы работы могут быть полезны при чтении лекционных курсов по физиологии, патофизиологии, нейробиологии и теоретическим основам адаптационной медицины для студентов биологических и медицинских специальностей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы исследования были представлены на: Российско-Польском симпозиуме Механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа нейрональной пластичности при адаптивных и патологических состояниях (Санкт-Петербург, 2001); Третьей всероссийской конференции Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция (Москва, 2002); BioScience 2004: from molecule to organism (18-22 July 2004. Glasgow, UK); 7th International conference:ФProtective strategies for neurodegenerative diseasesФ (August 14-17, 2004. Vancouver, Canada); Всероссийской научно-практической конференции по психоэндокринологии памяти профессора А.И.Белкина (Москва, 24-26 мая 2004), конференции Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты (14-16 марта 2005 г. Москва); Всероссийской конференции молодых ученых Физиология и медицина (Санкт-Петербург, 2005); Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция (Москва, 12-14 октября 2005); Международном симпозиуме Mechanisms of adaptive behavior (Санкт-Петербург, декабрь 2005); научной сессии молодых ученых, посвященной 80-летию Института физиологии им.И.П.Павлова РАН Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе приспособления к условиям среды (Санкт-Петербург, декабрь 2005); VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (21-24 June, 2006, Moscow); International Congress "Molecular basis of neurological and psychiatric disorders", (September 6-10, 2006, Martin, Slovak Republic); Российской конференции Современные принципы терапии и реабилитации психически больных (Москва, 11-13 октября 2006); Третьей международной выставки МЕДБИОТЕК-2006 "Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине" (Москва, 4-5 декабря 2006), XX Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 4-8 июня, 2007); Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию акад. В.Н.Черниговского (Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2007); Российской конференции "Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии" (Москва, 9-11 октября. 2007); Российско-Польском симпозиуме в рамках Дней Польской Науки в России Hypoxic, ischemic preconditioning of brain (Санкт-Петербург, 11-14 декабря 2008 г.); международных рабочих семинаров УNeuroprotective mechanisms of hypoxic preconditioningФ в Institute of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds (Leeds, UK, 2005, 2008); Всероссийской конференции с международным участием Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга (Санкт-Петербург, сентябрь, 2008); VII Всероссийской конференции с международным участием Механизмы функционирования висцеральных систем (29 сентября - 02 октября 2009, Санкт-Петербург).

СТРУКТУРА ДИССЕРАТЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографии. Диссертация изложена на 260 страницах печатного текста, иллюстрирована 80 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 71 русских и 521 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на 754 самцах крыс линии Вистар весом 200-250 г. Для создания условий тяжелой гипоксии животных помещали в барокамеру проточного типа и ступенчато понижали давление до 180 мм.рт.ст. (продолжительность воздействия - 3 часа). Прекондиционирование осуществлялось путем трехкратного воздействия умеренной гипобарической гипоксией (давление в барокамере - 360 мм рт.ст.) Крысы подвергались умеренной гипобарической гипоксии трижды (продолжительность воздействия - 2 часа), с интервалом 24 часа. Через сутки после последнего сеанса прекондиционирования крысы подвергались тяжелой гипоксии или различным формам стресса.

Для морфологических исследований животных декапитировали, быстро извлекали мозг и фиксировали его в 4% параформальдегиде, формалине или молекулярном фиксаторе FineFix (Milestone, Italy) в течение 24 часов. Далее после стандартных гистологических процедур проводки и заливки в парафин изготавливали и монтировали на стекла срезы толщиной 7 мкм на уровне -2.80 мм от брегмы (Paxinos, Watson, 1986). Окрашивание по методу Ниссля производили в водном 0.1% -растворе толуидинового синего. Для выявления апоптоза в нейронах мозга крыс использовали NeuroTACs Apoptosis Detection kit (R&D Systems, Abingdon, UK), основанный на TUNEL методе. Для иммуноцитохимического анализа депарафинизированные срезы подвергали высокотемпературной демаскировке в цитратному буфере, после чего инкубировали с первичными поликлональными антителами к NGFI-A, HIF-1α, pERK, pJNK, p-p38, кортиколиберину, АDAM15, ADAM17 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA), sAPP, pCREB (1:50, 1:100, Sigma), NF-kB (1:100, Calbiochem, UK), c-Fos, вазопрессину (1:500, Abcam, UK), глюкокортикоидным рецепторам (1:100, Calbiochem, UK; Santa Cruz Biotechnology, USA), тиоредоксину-1 и Mn-/Cu,Zn-супероксиддисмутазам (1:2000, StressGen Biotechnologies Corp), тиоредоксину-2 (предоставленные проф. G.Spyrou, Sweden) при +4С в течение ночи. Далее проводили визуализацию реакции с использованием вторичной системы детекции Vectastain ABC system (Vector Labs., USA) и диаминобензидина (DAB Substrate kit, Vector Labs, USA). Для контрстейнинга часть срезов дополнительно окрашивали красителем Blue Counterstain (TAGS, UK).

Радиоактивную гибридизацию in situ проводили по методу Kononen, Pelto-Huikko (1997). Гибридизационные пробы антиоксидантов, ранних генов и металлопротеаз, представлявшие собой 45-членные олигонуклеотиды, были любезно предоставлены профессорами M.Pelto-Huikko (University of Tampere, Finland) и Ari Huovilla (FinnMed, Tampere, Finland). Для РТ-ПЦР выделенные области мозга крыс хранились при -20 С в RNAlater (Ambion, USA). Тотальную РНК выделяли согласно протоколу Chromszynski и Sacchi (1987), возможную примесь ДНК удаляли инкубацией с ДНКазой I (1 час, 37 С), обратную транскрипцию РНК в кДНК производили с использованием Superscript reverse transcriptase (Gibco-BRL) с поли-dT праймерами, РНК-матрицу разрушали РНКазой Н. ПЦР-ампплификация кДНК производилась с праймерами ADAM15 и ADAM17, предоставленными проф. Ари Хуовила (FINNMEDI, Tampere, Finland) и охарактеризованными подробно в публикации Karkkainen et al., 2000. Использовали полимеразу Dynazyme II (Finnzymes, Finland). Результаты ПЦР анализировались в агарозном геле. Идентификация продуктов ПЦР была подтверждена рестрикционным анализом и/или прямым сиквенсингом, для чего после электрофореза ПЦР-продукты были очищены от агарозного геля, используя экстракционные реагенты QIAquick (Qiagen).

Для Вестерн блот-гибридизационного анализа с использованием антител к pJNK (1:1000) и p-р38 (1:1000), sAPP (1:1000) крыс декапитировали и быстро извлекали исследуемые отделы мозга. Белок экстрагировался из образцов, содержащих в каждой эксперименальной группе гомогенизированную ткань от 4-х животных с использованием буфера RIPA. Надосадочную жидкость отбирали после центрифугирования в течение 30 мин при 15 000g, 40С. Концентрацию белка в экстрактах определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорда. После чего экстракты нервной ткани, содержащие искомые белки, разделяли электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле (система Лэмли), на трис-глициновом буфере (pH 8.3) в присутствии 0.1% SDS. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры, используя аппарат для проведения полусухого блотинга. Нитроцеллюлозные фильтры последовательно инкубировали в растворах, содержащих первичные и вторичные (коньюгированные с пероксидазой хрена) антитела, согласно протоколу (система ECL, фирма Amersham). Экспонирование мембран с рентгеновской плёнкой проводили при комнатной температуре 1Ц20 мин, в зависимости от интенсивности свечения.

В качестве моделей психоэмоциональных стрессов, вызывающих развитие постстрессовых патологий, использовали модель эндогенной депрессии - парадигму выученной беспомощности (ВБ) и модель посттравматического стрессового расстройства - стресс-рестресс. Для выработки ВБ крыс подвергали неизбегаемому электрокожному раздражению в клетках размером 13х16х26 см с токопроводящим полом с переменными временными интервалами раздражения и отдыха так, чтобы каждая крыса в течение часа получила по 60 ударов током (1мА, 50 Гц) каждый длительностью 15 с. В парадигме стресс-рестресс (Liberzon et al., 1997) животные подвергались воздействию тяжелого травматического стресса состоящего из 2-часовой иммобилизации, 20-минутного вынужденного плавания и, после 15-минутного перерыва, эфирного стресса. Триггером для развития тревожного патологического состояния являлся рестресс, заключавшийся в 30-минутном иммобилизационном стрессе. Для фармакологической коррекции применяли антидепрессанты людиомил (Novartis Pharma, USA, 15 мкг/кг, трехкратно) и паксил (GlaxoSmithKline, UK, 20 мг/кг, трехкратно).

Поведение животных исследовали с использованием стандартных методов - лоткрытого поля (Holl, 1936), приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) (Pellow et al., 1985), обучения условному рефлексу пассивного избегания (Ватаева и др.,2004).

О стрессореактивности ГАС судили по динамике ее активации в ответ на 20- и 30-мин иммобилизационный стресс. Для изучения регуляции ГАС по механизмам глюкокортикоидной обратной связи применяли классический дексаметазоновый тест (Zhukov, 1993) и собственную модификацию теста на быструю обратную связь (заявка на патент № 2009110630/14). Содержание кортикостерона в плазме крови определяли радиоиммунным методом с использованием собственных антисывороток (Ordyan et al., 2001).

Результаты иммуноцитохимических исследований и in situ гибридизации анализировались и обрабатывались количественно с помощью морфометрической установки, компьютерной системы анализа изображений и программ Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) и ВидеоТест Мастер Морфология (ООО УВидео ТестФ, Санкт-Петербург). Данные обрабатывали статистически по критериям Стьюдента, Вилкоксона, Манна-Уитни или методами дисперсионного анализа ANOVA (программы Statistica 6.0, Statsoft Inc., USA; SPSS, SPSS Inc., USA), с достоверностью различий при p<0.05. Применяли также методы post-hoc анализа, в частности тест Даннета для неоднородных выборок. Данные представлены в виде: среднее значение стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нейропротективные эффекты прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией

Тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГ) приводит к выраженным структурным повреждениям нейронов СА1, СА2, СА3, СА4 областей гиппокампа и неокортекса крысы. В гиппокампе и фронто-париетальном неокортексе непрекондиционированных (не-ГП) животных после ТГ обнаруживалось большое количество нейронов с признаками хроматолиза, вакуолизации цитоплазмы или гиперхроматоза, пикноза. К 7-суточному сроку после ТГ отмечалось снижение общего числа выживших нейронов в этих образованиях мозга, в частности, в СА1 гиппокампа потеря нейронов составляла 35%. Наряду с морфологическим анализом деструктивных изменений нейронов чувствительных областей после ТГ проводилась детекция поврежденных по типу апоптоза нейронов с применением метода TUNEL. У не-ГП крыс через 3 суток после ТГ обнаруживалось большое количество TUNEL-позитивных клеток во всех исследованных областях мозга - СА1, СА2-СА3, СА4 полях гиппокампа и фронто-париетальном неокортексе (рис.1). У прекондиционированных (ГП-) животных после ТГ значительно снижалось количество поврежденных и погибших нейронов во всех исследуемых образованиях мозга. Вместе с тем, нужно отметить, что как в гиппокампе, так и неокортексе встречались единичные диффузно локализованные гиперхромные и пикнотические нейроны. Экспозиция животных прекондиционирующей умеренной гипоксии существенно снижала количество TUNEL-позитивных клеток в ответ на ТГ (рис.1). Таким образом, ГП с использованием умеренной

гипобарической гипоксии по предложенной схеме оказывает выраженный нейропротективный эффект, предотвращая повреждения и гибель нейронов чувствительных областей мозга, а также запуск апоптоза после воздействия ТГ.

Рис.1. Количество TUNEL-позитивных клеток после ТГ у непрекондиционированных (n=8, черные столбики) и прекондиционированных (n=6, белые столбики) крыс.

* - различия статистически достоверны по сравнению с контролем (Р0,05).

Наряду с этим установлено, что ГП предотвращает не только структурные повреждения, но и нарушения высших функций мозга, в частности способствует сохранению следов памяти в условияха ТГ, что оценивали по показателям условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Воспроизведение навыка УРПИ, приобретенного за 60 мин до экспозиции ТГ, ГП-крысами практически не отличалось от контрольной группы, в то время как у не-ГП крыс ТГ значительно нарушала воспроизведение и удержание навыка. Таким образом, ГП предотвращало нарушения воспроизведения и удержания приобретенного навыка, возникающие вследствие действия ТГ.

Большую группу неблагоприятных факторов, доля которых неуклонно возрастает, составляют различные психоэмоциональные стрессы и психотравмирующие ситуации, которые в тяжелых случаях приводят к возникновению острых дезадаптивных состояний с последующим развитием постстрессорных патологий, в первую очередь тревожно-депрессивных. Нередко тревожно-депрессивные расстройства возникают вследствие влияния не психоэмоциональных, а физических повреждающих воздействий, в частности гипоксии/ишемии. Нами была выдвинута гипотеза о возможной кросс-толерантности мозга, формирующейся в результате ГП, к тяжелым патогенным формам психоэмоциональных стрессов. С целью проверки этого предположения мы исследовали устойчивость ГП-животных к тяжелым формам стресса - психоэмоциональному стрессу и травматическому стрессу в экспериментальных моделях выученной беспомощности и стресс-рестресс, соответственно. Неизбегаемый неконтролируемый стресс в парадигме выученной беспомощности у не-ГПкрыс приводил к развитию устойчивого депрессивноподобного состояния (стойком снижении горизонтальной и вертикальной двигательной активности, увеличении времени замираний) в лоткрытом поле (рис.2, А-В), увеличению тревожности в ПКЛ (рис.2, Г), а также повышению базального уровня кортикостерона в крови и нарушению торможения гипофизарно-адренокортикальной системы в дексаметазоновом тесте (рис.2, Д, Е). Введение антидепрессанта людиомила (15 мг/кг, в/б, 3 дня) эффективно корректировало депрессивноподобное состояние, индуцируемое у крыс в этой парадигме. Однако при этом отмечался ряд побочных эффектов антидепрессанта - резкое снижение груминга и редукция уровня кортикостерона в крови.

ГП полностью предотвращало развитие патологических последствий психоэмоционального стресса. ГП-крысы достоверно не отличались от контрольных особей по уровню двигательной активности, продолжительности замирания и коэффициенту тревожности (рис.2). Наряду с выраженным антидепрессивным эффектом на поведение, ГП восстанавливало нормальный уровень глюкокортикодов в крови и показатели дексаметазонового теста (рис.2), что свидетельствует о нормализации функции ГАС. При использовании ГП значение всех регистрируемых в эксперименте показателей нормализовалось, то есть ГП не оказывало нежелательных побочных эффектов.

Особую форму стресса представляет собой травматический стресс. Этим понятием определяют воздействия психотравмирующих стрессоров высокой интенсивности, несущие реальную или осознаваемую угрозу жизни. В результате такого сверхэкстремального воздействия развиваются острые или отсроченные тревожные патологии, объединяемые в группу посттравматических стрессовых расстройств (ПТСР).

В стресс-рестресс модели ПТСР предъявление животным, ранее пережившим тяжелый травматический стресс, кратковременного иммобилизационного стресса (рестресс) приводила к формированию у них устойчивого тревожного состояния, проявлявшегося в резком снижении центральной и общей двигательной активности в лоткрытом поле и еще более значительном увеличении тревожности в ПКЛ (рис. 3). Антидепрессант паксил оказывал заметный анксиолитический эффект, в значительной мере предотвращая снижение двигательной активности в лоткрытом поле на 1-е сутки после рестресса и возвращая к норме уровень тревожности в ПКЛ на 5-е сутки, однако одновременно с этим паксил вызывал ряд побочных эффектов. С целью изучения возможного протективного действия ГП нами применялись две схемы воздействия умеренной гипобарической гипоксией в отработанном режиме. В эксперименте 1 ГП производили перед первым (тяжелым травматическим) стрессом, а в эксперименте 2 ГП предшествовало второму стрессу (рестрессу). Было установлено, что ГП эффективно корректировало развитие экспериментального тревожного состояния у крыс в парадигме стресс-рестресс, причем этот протективный эффект проявлялся в обоих экспериментах, хотя его выраженность была различной.

Рис.2. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает развитие депрессивноподобного состояния (А, Б, В, Г) и нарушения функции гипофиз-адреналовой системы (Д, Е) у крыс в парадигме выученной беспомощности. А, горизонтальная двигательная активность в лоткрытом поле; Б, вертикальная двигательная активность в лоткрытом поле; В, время неподвижности в лоткрытом поле; Г - уровень тревожности; Д, уровень кортикостерона в плазме крови; Е, величина подавления стрессорного уровня кортикостерона () в дексаметазоновом тесте. ДЕКС, дексаметазон, 5 мкг/кг. ВБ, выученная беспомощность (n=7); ПК+ВБ, ВБ у прекондиционированных крыс (n=6); контрольная группа (n=8). * - различия достоверны по отношению к контролю (Р0,05); **- различия достоверны по отношению к ВБ (Р0,05).

В эксперименте 1 ГП полностью предотвращало развитие тревожного состояния, в то время как в эксперименте 2 анксиолитический эффект ГП оказался более значительным - уровень тревожности животных снижался ниже контрольного уровня (рис.3). Кроме того, в отличие от антидепрессанта, ГП не снижало двигательную активность и не оказывало побочного эффекта на груминг в использованных тестах.

.Рис.3. Влияние ГП на поведение крыс в лоткрытом поле (А) и приподнятом крестообразном лабиринте (Б) после стресса-рестресса в экспериментальной модели ПТСР. Эксперимент 1 ЦГП предшествовало травматическому стрессу; эксперимент 2 - ГП предъявлялось перед рестрессом. ЛАц, центральная активность; ЛА, периферическая горизонтальная двигательная активность; центр, время пребывания в центре; ОР, время в открытых рукавах; ЗР, время в закрытых рукавах.

Таким образом, ГП в предложенном нами режиме оказывает выраженное нейропротективное действие, предотвращая структурные и функциональные повреждения мозга в условиях тяжелых повреждающих воздействий различной природы. Исключительно важным как с теоретической, так и с практической точки зрения представляется тот факт, что нейропротективное действие ГП проявляется вне зависимости от модальности предъявляемого повреждающего фактора. Ранее было известно проявление кросс-толерантности мозга к гипоксии, ишемии и токсинам, то есть факторам, механизмы повреждающего действия которых, включающие оксидативный стресс, во многом родственны (Gidday et al. (1994, 1999), Tauskela et al., 2006). В нашей работе удалось впервые продемонстрировать эффективность гипоксического прекондиционирования мозга по отношению к действию принципиально других повреждающих факторов - психоэмоциональных и травматических стрессов, патогенное действие которых основано на расстройствах системных и неспецифических механизмов адаптации. Исходя из этого становится очевидным, что индуцируемая гипоксическим прекондиционированием кросс-толерантность мозга - явление универсальное, представляющее собой неспецифическое повышение резистентности нейронов мозга к различным вредным факторам.

Полученные результаты имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Прикладной аспект связан с тем, что наши данные существенно расширяют современные представления о терапевтическом потенциале гипобарической гипоксии, используемой в режиме ГП. Как хорошо известно, умеренная гипобарическая гипоксия - это естественное воздействие, встречающееся в условиях пребывания в горах на определенной высоте. Гипобарическая гипоксия в режиме долговременной адаптации (тренировки многократными сеансами слабой гипоксии) применяется в клинике для гипобаротерапии различных заболеваний, включающих бронхиальную астму, аллергию, сердечно-сосудистые заболевания (Колчинская, 1991; Ушаков и др., 2004). Используемый нами режим ГП умеренной гипобарической гипоксией имеет принципиальные отличия от этого способа так как вызывает срочную активацию эндогенных протективных механизмов, обеспечивающих повышение устойчивости мозга. В наших исследованиях показано, что ГП с использованием умеренной гипобарической гипоксии может использоваться не только для профилактики постгипоксических или постишемических нарушений, но и патологий, вызываемых различными формами стресса. Кроме того, существенным моментом является то, что ГП оказалось достаточно эффективным как в качестве превентивного воздействия, так и в качестве терапевтического средства для коррекции развития постстрессорных патологий у особей, переживших психотравматизацию. Все вышеизложенное свидетельствует о большом терапевтическом потенциале ГП и широких возможностях его использования в клинике в качестве немедикаментозного способа, повышающего устойчивость мозга к действию различных повреждающих факторов (гипоксии/ишемии, психоэмоциональных и травматических стрессов). Необходимо проведение тщательного изучения молекулярно-клеточных и гормональных механизмов, активируемых умеренной гипобарической гипоксией в режиме ГП и лежащих в основе ее протективного эффекта. В этом и заключается важнейший теоретический аспект исследуемой проблемы, поскольку раскрытие механизмов, активируемых ГП, должно внести существенный вклад в современные представления о ключевых эндогенных механизмах нейропротекции, на основании которых может быть разработана стратегия создания фармакологических средств нового поколения для профилактики и лечения неврологических и психиатрических болезней.

Молекулярно-клеточные механизмы повышения устойчивости мозга, активируемые гипоксическим прекондиционированием

Согласно современным представлениям, процесс формирования толерантности мозга, индуцируемой прекондиционированием, включает фазы индукции и экспрессии. Быстро индуцируемые механизмы (фаза индукции), проявляемые в первые 60 мин, связаны с активацией протеинкиназ и протеаз и последующей посттрансляционной модификацией белков ионных каналов и рецепторов (Nakase et al., 2000; Steiger, Hangii, 2007; Shpargel, 2008). Фаза экспрессии, определяющая устойчивую толерантность, выявляемую через 24 часа и более, связана с экспрессией генов и синтезом de novo защитных белков (Самойлов и др., 2004; Kirino, 2002; Stenzel-Poore et al., 2007; Shpargel, 2008; Obrenovitch, 2008). Фаза экспрессии была описана во всех известных моделях прекондиционирования как in vivo, так и in vitro и ее длительность составляет от 7 до 14 дней (Ueda and Novak, 2005).

Ранее в лаборатории регуляции функций нейронов мозга Института физиологии им. И.П. Павлова РАН были детально исследованы нейрональные перестройки, происходящие в раннюю фазу формирования толерантности мозга, вызываемой ГП. В частности, на переживающих срезах обонятельной коры было показано, что предъявление кратковременной прекондиционирующей аноксии (2 мин) предотвращает подавление фокальных постсинаптических потенциалов, вызываемое долговременной аноксией (10 мин) (Самойлов, Мокрушин, 1998). Наряду с этим выявлено, что ГП нивелирует индуцируемые долговременной аноксией изменения содержания внутриклеточного связанного и свободного кальция, а также метаболизма фосфоинозитидов, отражающие патологическую гиперактивацию кальциевой и фосфоинозитидной регуляторных систем (Тюлькова и др., 1998; Самойлов и др., 2001; Semenov et al., 2002). Было предположено, что активация указанных быстро индуцируемых механизмов необходима для формирования отсроченных геном-зависимых механизмов, обеспечивающих развития долговременной толерантности (Самойлов и др., 2001).

Описанные выше работы послужили стимулом для проведения наших исследований, являющихся логическим продолжением этих работ и сфокусированных на изучении механизмов долговременной толерантности мозга. В используемой нами экспериментальной модели ГП умеренной гипобарической гипоксией, которая, как описано выше, оказывает выраженное долговременное нейропротективное действие, был исследован ряд отсроченных базисных молекулярных механизмов формирования толерантности мозга. Ставилась задача оценить роль в реализации описанных выше нейропротективных эффектов ГП ключевых внутриклеточных механизмов, участвующих в формировании адаптивных и патологических реакций нейронов наиболее чувствительных к гипоксии/ишемии, стрессорным воздействиям образований мозга (гиппокампа, неокортекса).

МАП киназы. Учитывая важную роль митоген-активируемых протеинкиназ (MAП киназ) в сигнальной трансдукции от плазмалеммы клеток в ядро и регуляции клеточной смерти или выживания (Pearson et al., 2001), нами была исследована экспрессия и распределение активных (фосфорилированных) форм MAП киназ (рJNK1/2, р-р38, рERK) в мозге вслед за ТГ у не-ГП и ГП-животных. Методом Вестерн-блот анализа выявлено повышение активности JNK1/2 в гиппокампе не-ГП крыс, а у ГП-крыс - ее подавление на 30 мин и 72 ч. после ТГ. Количественный иммуноцитохимический анализ показал, что у не-ГП и ГП-крыс экспрессия pJNK1/2 повышается или угнетается, соответственно, после ТГ преимущественно в нейронах дорзального (области СА1/СА2), но не вентрального (области СА3/СА4) гиппокампа (рис.4). В неокортексе ГП также нивелировало индукцию pJNK1/2 в ответ на ТГ.

Наряду с этим методами иммуноцитохимии и Вестерн блот анализа была выявлена отсроченная активация протеинкиназы р38 в ответ на ТГ, проявляющаяся в значительном повышении содержания в гиппокампе (СА1, СА3, СА4) фосфорилированной формы р-р38 к 72 часам после воздействия гипоксии. ГП предотвращало эту активацию. Как полагают, активация МАП киназ JNK и p38 в нейронах является важным звеном апоптотических каскадов (Dhanasekaran and Reddy, 2008).

Известно, что киназа ERK является одним из ключевых компонентов про-адаптивного сигналлинга в нейронах (Sweatt, 2004). У не-ГП крыс фосфорилированная форма ERK (pERK) практически отсутствовала через 30 мин.- 72 ч. после ТГ. У ГП крыс отмечалось появление единичных или собранных в группы иммунореактивных к pERK клеток, главным образом, в СА1/СА2, к 30 мин после ТГ. На сроках 3 ч. и 24 ч. иммунопозитивные клетки практически не выявлялись как у не-ГП, так и у ГП крыс, но на 72 ч. у ГП крыс обнаруживалось значительное количество иммунореактивных клеток в областях СА1/СА2. В СА3/СА4 встречались единичные клетки, иммунореактивные к pERK.

Рис.4. Влияние прекондиционированной и непрекондиционированной тяжелой гипобарической гипоксии на экспрессию фосфорилированной JNK (pJNK) в гиппокампе крыс. А, Вестерн блот; Б, иммуноцитохимия. К, контроль; П, прекондиционирование; Г, тяжелая гипоксия. На графиках: светлые столбики - контроль (n=4), черные столбики - тяжелая гипоксия (n=4), заштрихованные столбики - прекондиционированная тяжелая гипоксия (n=4), 30 мин, 72 часа Ч время после воздействия тяжелой гипоксии. * - различия достоверны по отношению к контролю, # - различия достоверны по отношению к тяжелой гипоксии.

Таким образом, используемое прекондиционирующее воздействие эффективно подавляет экспрессию фосфорилированных форм JNK, р38 и активирует ERK вслед за ТГ, что может быть одним из важных факторов, способствующих переживанию нейронов чувствительных образований мозга. В экспериментах с использованием ишемического прекондиционирования также было показано, что подавление фосфорилирования JNK и активация ERK в дорзальном гиппокампе предотвращает повреждение уязвимых нейронов после тяжелой гипоксии/ишемии (Gu et al., 2000, 2001; Colangelo et al., 2004; Miao et al., 2005). Ингибиторы активности JNK (SP600125, AS6011245) также увеличивают постишемическое выживание нейронов гиппокампа, подавляя экспрессию рJNK (Carboni et al., 2004; Guan et al., 2005) и активацию путей апоптоза, опосредуемых рецепторами смерти и митохондрия-зависимыми механизмами (Carboni et al., 2005). Очевидно, что р38 также вовлекается в процесс гибели нейронов гиппокампа, хотя данные о повышении его активности вслед за ишемией противоречивы (Takagi et al., 2000; Wu et al., 2000; Sugino, 2000; Hicks et al., 2000; He et al., 2003), однако известно, что ингибитор р38 подавляет активность р38 и способствует редукции гибели нейронов в СА1 вслед за ишемией (Sugino, 2000).

Согласно современным представлениям, в механизмы нейропластичности, выживания/гибели нейронов мозга вовлекается ряд семейств активационных и индуцибельных транскрипционных факторов, в частности, CREB, NF-κB, продукты ранних генов c-Fos, c-Jun, NGFI-A, HIF-1α и др. (Morgan and Curran, 1991; Robertson, 1992; Mattson and Camandola, 2001; Zhang et al., 2002; Kitagawa, 2007; Obrenovitch, 2008; Weidemann and Johnson, 2008).

Активационные транскрипционные факторы - CREB и NF-κB.

В различных ишемических моделях показано, что прекондиционирование вызывает выраженную и пролонгированную активацию CREB, о чем свидетельствует его фосфорилирование по Ser113 и промоторная активность на CRE генов-мишеней (Mabuchi et al., 2001; Nakajima et al., 2002; Hara et al., 2003; Lee et al., 2004; Meller et al., 2005). Применение маскирующих CRE олигонуклеотидов или анти-CREB полностью нейтрализовало толерантность, индуцируемую ишемическим прекондиционированием (Hara et al., 2003; Lee et al., 2004).

Наряду с CREB, при ишемическом прекондиционировании было обнаружено увеличение ДНК-связывающей активности и транслокации в ядро другого фактора - NF-kB (Blondeau et al., 2001). Ингибирование трансактивации NF-kB как с использованием фармакологических ингибиторов, так и олигонуклеотидов-ловушек, нивелировало нейропротекцию, индуцированную прекондиционированием (Blondeau et al., 2001). В нашем исследовании впервые выполнен сравнительный анализ эффекта ГП на оба эти транскрипционных фактора при предъявлении гипоксического прекондиционирования. Исследована экспрессия активированной формы CREB (рCREB) и NF-κB вслед за ТГ в неокортексе и гиппокампе ГП- и не-ГП крыс. Через 3 ч. и 24 ч. после ТГ у не-ГП крыс количество рCREB иммунореактивных клеток в неокортексе редуцировалось, составляя соответственно 50% и 25% от контрольных значений (рис.5).

Рис.5. Количественная оценка изменений pCREB и NF-κB иммунореактивности в неокортексе не-ГП (ТГ, n=6) и ГП крыс (ГП+ТГ, n=6) через 24 ч. после ТГ: общее количество иммунореактивных клеток. *, различия достоверны по сравнению с контрольными значениями.

Принципиально иной паттерн иммунореактивности наблюдался у ГП-крыс. Заметное увеличение иммунореактивных клеток (примерно на 200%) было выявлено в неокортексе ГП-крыс через 3 ч. и 24 ч. после ТГ (рис.5). Большое количество иммунореактивных клеток появлялось в нижних слоях неокортекса, где в контроле они практически отсутствовали.

В гиппокампе контрольной группы животных практически отсутствовали рСREB-иммунопозитивные клетки в зонах гиппокампа СА1, СА2, СА3, СА4 и встречались лишь единичные - в зубчатой извилине. Воздействие ТГ не изменяло уровень рСREB- иммунореактивности ни через 3 ч., ни через сутки. Иной характер иммунореактивности был отмечен после ТГ у ГП-животных. В большинстве зон гиппокампа этих животных (СА2, СА3, СА4, зубчатая извилина) уже к 3 ч. сроку значительно возрастало количество иммунопозитивных клеток. К 24 ч. существенно повышалась интенсивность экспрессии рСREB в этих отделах гиппокампа.

У не-ГП животных количество иммунореактивных к NF-κB клеток в неокортексе через 3 ч. после ТГ существенно не отличалось от контрольных значений, а к 24 ч. доля иммунореактивных клеток редуцировалась до 25%. Напротив, у ГП-крыс ТГ вызывала 6-кратное увеличение числа иммунореактивных клеток в неокортексе на 3-ч сроке. К 24 ч. число иммунореактивных клеток снижалось, но все еще оставалось существенно выше контроля (рис.5). В гиппокампе через 3 ч. после ТГ уровень экспрессии иммунореактивного NF-κB незначительно повышался, однако к 24 ч. сроку уже вновь был неотличим от контроля. ГП-крысы реагировали на ТГ быстрым и значительным увеличением NF-κB-иммунореактивности в гиппокампе, особенно в зонах СА1, СА2, СА3, к 3-ч сроку. К 24 ч. после ТГ уровень экспрессии NF-κB у ГП-животных также снижался до контрольного уровня.

Обобщая вышеизложенные экспериментальные результаты по изменениям экспрессии активационных транскрипционных факторов рСREB и NF-κB вслед за ТГ у не-ГП и ГП-крыс, следует отметить, что несмотря на различия в базальном уровне активности этих факторов в различных областях мозга (неокортекса и гиппокампа), отчетливо проявляются закономерности их экспрессии, активируемой ГП. В частности, важно отметить, что ГП вызывает устойчивую активацию обоих этих факторов в неокортексе и селективную - в различных отделах гиппокампа. Полученные данные представляют собой экспериментальное доказательство, подтверждающее современные представления о том, что устойчивая активация транскрипционных факторов CREB и NF-kB может быть важным этапом формирования долговременной толерантности мозга к гипоксии/ишемии и другим повреждающим воздействиям. Полагают, что в результате активации NF-kB происходит ап-регуляция нескольких ключевых регуляторов выживания, таких, в частности, как пептидный антиоксидант Mn-SOD и белки-ингибиторы апоптоза IAPs (Mattson and Meffert, 2006), а также продукты антиапоптотических генов bcl-2, bcl-xL (Ivanov et al., 1995; Grilli and Memo, 1998; Bui et al., 2001; Karin and Lin, 2002; BentiresЦAlj et al., 2002). В свою очередь, рCREB активирует гены пептидных антиоксидантов, в частности, Trx-1 (Chiuch et al., 2005), анти-апоптотических генов bcl-2, bcl-xL (Riccio et al., 1990; Sugiura et al., 2004; Meller et al., 2005, Chiueh et al., 2005), а также гены c-fos, zif268(ngfi-a) (Hata et al., 1998; Sguambato et al., 1998). Последние относятся к семейству ранних генов, их продукты - белки c-Fos и NGFI-A, также являются транскрипционными факторами, регулирующими ряд поздних генов, вовлекаемых в адаптивные процессы, обучение и нейропластичность, контроль клеточной пролиферации и смерти.

Ранние гены и их продукты - индуцибельные транскрипционные факторы. Большую группу транскрипционных факторов составляют белки, кодируемые ранними генами семейств fos, jun, zif. Предполагают, что индуцибельные гены c-fos and ngfi-a являются ключевыми элементами кода третичных мессенджеров (от англ. third messenger code), который реализует клеточные ответы на внешние сигналы на уровне генома (Morgan, Curran, 1991; Richardson et al., 1992; Robertson, 1992). Нами исследовалась у не-ГП и ГП крыс вслед за ТГ экспрессия представителей этих семейств ранних генов, играющих важную роль в процессах нейрональной пластичности, обучения, выживания/гибели нейронов мозга. Установлено, что ТГ оказывает двухфазный эффект на транскрипцию гена zif268 (ngfi-a) в структурах переднего мозга. Быстрая продукция ngfi-a мРНК, выявляемая на 3 ч сроке, сменяется продолжительной (через 24-72 ч.) и выраженной редукцией ее уровня в наиболее чувствительных отделах мозга (неокортексе, СА1 гиппокампа (рис.6), а также пириформной коре и неостриатуме). В более устойчивой зоне - зубчатой извилине гиппокампа - после первоначальной индукции (на 3 ч) к 24 ч сроку после ТГ уровень ngfi-a мРНК понижался, однако оставался выше контрольного уровня (рис.6). У ГП-крыс паттерн экспрессии ngfi-a мРНК после тяжелой гипоксии существенно модифицировался, в частности, отсутствовала прогрессирующая редукция уровней ngfi-a мРНК в уязвимых образованиях, а пик экспрессии этого гена смещался на более поздний срок (24 ч) (рис.6).

Рис. 6. Количественная оценка динамики экспрессии ngfi-a мРНК в мозге непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (серые столбики) крыс в ответ на тяжелую гипоксию. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; A, неокортекс; Б, СА1; В, зубчатая извилина. *, различия достоверны по сравнению с тяжелой гипоксией, p≤0.05.

Интерес представляют данные о динамике экспрессии в нашей парадигме двух представителей генов jun семейства - c-jun и junB, находящихся, как полагают, в антагонистических отношениях, определяющих гибель/выживание клеток (Sheng, Greenberg, 1990; Sommer et al., 1995). Как и в случае ngfi-a мРНК, ранняя экспрессия junB мРНК вслед за ТГ затем сменяется ее подавлением в чувствительных образованиях мозга (СА1-СА3 гиппокампа, неокортексе, стриатуме и др.). У ГП крыс в СА1 и зубчатой извилине отмечается схожая картина с экспрессией ngfi-a - подавление к 3 ч и существенное увеличение к 24 ч. Принципиально иные изменения после ТГ были выявлены для гена c-jun - уровни c-jun мРНК в исследованных структурах мозга градуально нарастали к 72 ч. ГП в значительной мере ингибировало устойчивую и нарастающую оверэкспрессию c-jun, способствуя нормализации уровней его мРНК в гиппокампе.

Наряду с этим нами была исследована экспрессия в мозге крыс мРНК гена, кодирующего α субъединицу гетеродимера гипоксия-индуцибельного фактора-1 (HIF-1), являющегося важнейшим белком внутриклеточного сигналлинга при гипоксии (Weidemann and Johnson, 2008). В контроле в различных образованиях мозга обнаруживалась невысокая экспрессия мРНК hif-1α. На раннем сроке после ТГ наблюдалась тенденция к незначительному снижению уровня мРНК hif-1α в большинстве исследуемых структур, включая неокортекс и гиппокамп, однако затем выявлялась ее ап-регуляция в различных отделах мозга, достигающая максимальной интенсивности на отдаленных сроках - к 72 часам. У ГП крыс выявлена заметная ап-регуляция гена hif-1α на ранних сроках. Вместе с тем, происходило подавление отсроченной экспрессии HIF-1α мРНК, выявленной после ТГ у не-ГП крыс.

Таким образом, ТГ индуцировала специфический паттерн экспрессии ранних генов, который существенно модифицировался при предварительном применении ГП. Однако к настоящему времени накоплено много фактов о том, что в ряде случаев на посттранскрипционном уровне нарушается сцепка между экспрессией мРНК и последующей ее трансляцией. В частности, подавление экспрессии белков транскрипционных факторов на фоне оверэкспрессии их генов описано после тяжелой ишемии (Kiessling et al., 1993). В связи с этим, функциональная трактовка вышеизложенных данных о модификациях паттерна экспрессии генов невозможна без оценки изменений, происходящих на уровне трансляции белка и посттрансляционных процессов, в частности, фосфорилирования - в тех случаях, когда это необходимо для активации данного фактора. Поэтому наряду с экспрессией мРНК ранних генов нами были проанализированы эффекты ТГ и ГП на уровни продуктов этих генов - индуцибельных транскрипционных факторов. Нами были исследованы изменения экспрессии белков NGFI-A, c-Fos и фосфорилированной (активной) формы c-Jun в чувствительных к гипоксии областях мозга крыс. У контрольных животных выявляется умеренная реактивность к белку NGFI-A нейронов гиппокампа и неокортекса. У не-ГП крыс ТГ вызывает подавление иммунореактивности к NGFI-A в исследуемых образованиях мозга на сроках 3 час и 24 час после воздействия. Напротив, у ГП-животных в этих образованиях мозга отмечается выраженное усиление по сравнению с контролем экспрессии NGFI-A к 3 час после ТГ (рис. 7). К 24 час повышенная иммунореактивность сохраняется.

Рис.7. Гистограммы, иллюстрирующие NGFI-A-иммунореактивность в СА1 области гиппокампа (I) и неокортексе (II) контрольных животных (светлые столбики, n=8), непрекондиционированных животных (черные столбики, n=5), прекондиционированных животных (серые столбики, n=6) после тяжелой гипоксии. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; a, общее число иммунопозитивных клеток; b, количество интенсивно NGFI-A-реактивных клеток; Показатели контрольной группы приняты за 100%; *, различия с контролем достоверны, p≤0.05; #, различия с тяжелой гипоксией достоверны, p≤0.05.

Иммунореактивность к белку c-Fos у контрольных животных в гиппокампе и неокортексе проявляется слабо. У не-ГП животных через 3 и 24 часа после ТГ иммунопозитивные к c-Fos клетки в гиппокампе и неокортексе либо отсутствуют либо встречаются редко, в основном, в медиальной части СА1. Вместе с тем, у ГП-крыс до 24 ч. после воздействия тяжелой гипоксии обнаруживается повышенный в значительной степени уровень экспрессии c-Fos в нейронах исследуемых образований мозга, особенно в СА4 и зубчатой извилине гиппокампа, неокортексе.

Обобщая полученные нами данные и имеющиеся в литературе сведения, можно заключить, что эффект гипоксического/ишемического прекондиционирования на экспрессию ранних генов и их белков выражается в значительной ап-регуляции нейрональной экспрессии белков NGFI-A и c-Fos, нейропротективная роль которых в настоящее время убедительно показана. Так, имеется много данных о том, что ап-регуляция с-Fos и NGFI-A вовлечена в механизмы выживания нейронов мозга при тяжелых формах ишемии/гипоксии. В частности, установлено, что после тяжелой ишемии происходит индукция экспрессии с-Fos и NGFI-A в переживающих нейронах зубчатой извилины и СА3 гиппокампа, но отсутствует в гибнущих нейронах области СА1 (Takemoto et al., 1995; Cho et al., 2001; Kiessling et al., 1993, Tseng et al., 1997). Обнаружена индукция с-Fos до 24 час после неонатальной гипоксии/ишемии в переживающих нейронах зубчатой извилины и СА3 гиппокампа (Ness et al., 2008). Также показано, что вслед за фокальной ишемией (1-4 часа) происходит экспрессия с-Fos и NGFI-A только в выживающих нейронах пограничной с очагом зоны, но не в гибнущих нейронах в очаге инсульта (Johansson et al., 2000).

Рис.8. Изменения экспрессии рс-Jun в гиппокампе крыс в различные сроки после тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (заштрихованные столбики). Светлые столбики - контроль. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; А - СА1, Б - СА2, В - СА3, Г - СА4, * - различия достоверны по отношению к контролю, # - различия достоверны по отношению к тяжелой гипоксии. В каждой группе n=6.

При иммуноцитохимическом изучении характера иммунореактивности активной (фосфорилированной) формы другого фактора из семейства АР-1 - c-Jun, у не-ГП крыс обнаружено выраженное увеличение экспрессии pc-Jun в областях СА1, СА2 с пиком на 24 час после ТГ (Рис. 8). В области СА1 отмечается устойчивое повышение экспрессии до 72 час. В вентральном гиппокампе (СА3/СА4) эти изменения значительно менее выражены. У ГП-крыс экспрессия pc-Jun, индуцируемая ТГ, подавляется (Рис. 8). Полагают, что устойчивая активация c-Jun, являющегося одним из ключевых эффекторов смерти клеток и участвующего в контроле путей апоптоза, связанных с рецепторами смерти в плазмалемме и митохондриями, вносит существенный вклад в развитие апоптоза и смерти клеток (Lin 2003; Zablocka e.a., 2003; Vlahopoulos, Zoumpourlis, 2004). У ГП-крыс экспрессия pc-Jun, индуцируемая ТГ, подавляется (Рис. 8).

Как уже отмечалось, ГП существенно изменяло динамику экспрессии гена hif-1α, кодирующего регуляторную субъединицу другого важного транскрипционного фактора - HIF-1, способствуя более ранней его индукции и предотвращая отсроченную оверэкспрессию этого гена после ТГ. Аналогичный эффект ГП, однако с иным временным профилем, выявлялся и на уровне экспрессии продукта этого гена - белка HIF-1α. Ранее HIF-1 считали фактором периферической адаптации, реализующим свое про-адаптивное влияние за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и васкуляризации, утилизации глюкозы и др. Однако в последние годы появляется все больше работ о вероятной нейропротективной роли HIF-1 в мозге, где нервными и глиальными клетками продуцируется не только сам этот белок, но и его основная транскрипционная мишень - цитокин эритропоетин, оказывающий в мозге протективный эффект (Paschos et al., 2008). Более того, установлено, что нарушения активации HIF-1 связано с возникновением ряда неврологических патологий. В частности, недостаточная активация HIF-1-зависимого каскада способствует развитию постишемических расстройств и амиотропного латерального склероза (Brown and Robberecht, 2001; Oosthuyse et al., 2001), в то время как его чрезмерная и длительная активация, согласно современным представлениям, формирует патогенетический базис болезни Альцгеймера (Shi et al., 2000; Zhang et al., 2007), а у нокаутных мышей с дефицитом HIF-1 в мозге гипоксическая толерантность после ГП не формируется (Taie et al., 2009). Это полностью согласуется с результатами наших исследований, свидетельствующими, что поддерживающаяся отсроченная экспрессия HIF-1α как на уровне мРНК, так и на уровне белка носит патологический характер и связана с развитием патологии (как постгипоксической, так и постстрессорной). Напротив, быстрая но преходящая активация транскрипционного фактора HIF-1, весьма вероятно, является важным звеном нейропротективных механизмов, активируемых ГП.

Таким образом, ГП значительно модифицирует паттерн экспрессии ранних генов в ответ на ТГ, а также индуцирует кооперативную ап-регуляцию про-адаптивных транскрипционных факторов (NGFI-A, c-Fos, HIF-1) и подавляет ТГ-индуцированную активацию c-Jun, являющегося важным звеном про-апоптотических каскадов, в частности, JNK каскада.

Факторы регуляции апоптоза семейства генов bcl-2. Ключевую роль в процессах, определяющих гибель или выживание клетки, играет соотношение про- и антиапоптотических факторов, включающих белки семейства генов bcl-2 (Fadeel, Orrenius, 2005). Выше были изложены результаты наших морфологических исследований, свидетельствующие о том, что ГП предотвращает структурные повреждения нейронов и очевидно препятствует запуску апоптоза в условиях ТГ. Для того, чтобы оценить возможный вклад факторов-регуляторов апоптоза в эти процессы нами были изучены изменения уровней про - и анти-апоптотических белков (Bax и Bcl-2, Bcl-xL, соответственно) в гиппокампе и неокортексе ГП- и не-ГП крыс в различные периоды после ТГ.

В уязвимых образованиях мозга (СА1-СА4 гиппокампа, неокортекс) не-ГП животных ТГ индуцировала значительное повышение числа Bax-иммунореактивных клеток (рис.9). Это повышение проявлялось уже через 3 ч после экспозиции ТГ, достигая максимальных значений к 24 ч., и сохранялось до 72 ч. Наибольшая амплитуда ТГ-индуцированной экспрессии Bax (сверх 500% от контроля) наблюдалась в СА4 области Аммонового рога. У ГП-крыс доля гиппокампальных и неокортикальных клеток, экспрессирующих Bax-иммунореактивность после ТГ статистически не отличалась от контрольных значений (рис.9). В менее уязвимом к гипоксии отделе гиппокампа - зубчатой извилине, достоверных изменений выявлено не было.

Рис. 9. Эффект тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (белые столбики) на экспрессию Bax в гиппокампе и неокортексе крыс. *, изменения достоверны относительно контроля, р≤0,05.; по оси Х - время после тяжелой гипоксии

В отношении иммунореактивности к Bcl-2 были обнаружены противоположные изменения. Экспрессия Bcl-2 в уязвимых образованиях гиппокампа (СА1-СА4) и неокортексе либо не изменялась, либо в некоторой степени снижалась после экспозиции ТГ. Однако ГП заметно повышало количество Bcl-2-иммунопозитивных клеток в этих отделах мозга вслед за ТГ (рис.10). Выявленная ап-регуляция была быстрой, поскольку уже к 3 ч после ТГ наблюдался резкий скачок Bcl-2-иммунореактивности в гиппокампе и неокортексе, которая впоследствии нарастала в некоторых областях (СА1, СА4) или снижалась - в других (СА2, СА3, неокортекс). Уровни иммунореактивного Bcl-2 в гиппокампе оставались повышенными вплоть до 72 ч. Принципиально иной эффект был зарегистрирован в устойчивой к гипоксии зубчатой извилине, где экспрессия Bcl-2 в гранулярных клетках имела тенденцию к повышению в отдаленные сроки после ТГ и не изменялась при предварительном ГП (рис.10). Характер изменения экспрессии другого антиапоптотического белка - Bcl-xL был сходен с паттерном экспрессии Bcl-2, хотя проявлялись временные особенности его экспрессии. Обобщая вышеизложенные результаты можно заключить, что ГП вызывает оверэкспрессию Bcl-2 и Bcl-xL, а также модифицирует соотношение факторов регуляции апоптоза в гиппокампе и неокортексе вслед за ТГ. У не-ГП животных после ТГ наблюдается сдвиг соотношения Bax/Bcl-2,Bcl-xL в сторону преобладания про-апоптотического белка Bax, а у ГП особей это соотношение меняется в пользу антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL, что очевидно препятствует запуску апоптоза в гиппокампе и неокортексе у этих животных.

Изменения уровней Bax, Bcl-2, Bcl-xL также были зарегистрированы в различных моделях ишемии и ишемического прекондиционирования. Показано, что в протекции, создаваемом ишемическим прекондиционированием, ведущая роль принадлежит ап-регуляции Bcl-2, Bcl-xL на фоне редукции Bax (Wu et al., 2003). Обнаружно, что прекондиционирующая 5-мин ишемия переднего мозга повышала толерантность нейронов региона СА1 за счет подавления высвобождения цитохрома с из митохондрий (участвующего в механизмах индукции апоптоза) посредством увеличения соотношения Bcl-2/Bax (Nakatsuka et al., 2000), а введение анти-Bcl-2 олигонуклеотидов предотвращало развитие ишемической толерантности (Shimizu et al., 2001).

Рис.10. Эффект тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (белые столбики) на экспрессию Bcl-2 в гиппокампе крыс. *, изменения достоверны относительно контроля, р≤0,05.; по оси Х - время после тяжелой гипоксии

Аналогичный механизм, включающий изменение баланса про- и антиапоптотических факторов, был выявлен для нейропротективного эффекта химического прекондиционирования с использованием 3-нитропропионовой кислоты. Установлено, что прекондиционирующие аппликации 3-нитропропионовой кислоты вызывали повышение Bcl-2 иммунореактивности в нейронах СА1, СА3, СА4 полей гиппокампа, но не СА2 и зубчатой извилины (Brambrink et al., 2004). Гипотермия, используемая в качестве физического прекондиционирующего воздействия, также снижала экспрессию Bax в ответ на ишемию (Eberspacher et al., 2003). Формирование толерантности мозга в модели гипербарической оксигенации сопровождалось значительным повышением экспрессии Bcl-2 (Wada et al., 2001). Воздействие интервальной гипобарической гипоксией (5000м, 6 ч ежедневно, 42 дня), приводящее к кардиопротекции от повреждающего действия ишемии/реперфузии, также существенно увеличивает соотношение Bcl-2/Bax (Dong et al., 2003). Как указывалось выше, ГП в ответ на ТГ индуцирует в чувствительных образованиях мозга экспрессию активационных и индуцибельных транскрипционных факторов, мишенями которых являются семейства генов bcl-2, гормональных рецепторов, стресс-белков (Hsp70), а также генов позднего действия, экспрессия которых также обеспечивает про-адаптивные внутриклеточные молекулярные перестройки, лежащие в основе формирования толерантности мозга. Нами были изучены изменения экспрессии вслед за ТГ у не-ГП и ГП-животных нескольких групп поздних генов (мишеней исследуемых транскрипционных факторов) и их продуктов, вовлекаемых в нейропротективные и нейродегенеративные процессы.

Пептидные антиоксиданты. В основе деструктивного действия большинства повреждающих факторов лежит мощное усиленное образование свободных радикалов, индуцирующих внутриклеточный окислительный стресс. Поэтому первая линия защиты от свободно-радикальных повреждений связана с активностью эндогенных антиоксидантных систем, наиболее важными из которых являются митохондриальные (Freeman, 1982; Koehler et al., 2006). В 1997 году G.Spyrou и коллегами был обнаружен новый митохондриальный антиоксидант - тиоредоксин-2 (Trx2) (Spyrou et al., 1997). На основании выполненного нами картирования (Rybnikova et al., 2000) было установлено, что Trx2 мРНК широко экспрессируется в нейронах во всех отделах мозга крыс, причем наиболее интенсивно - во фронтальном, фронто-париетальном неокортексе, гиппокампе, пириформной коре, клетках Пуркинье мозжечка, и др. После ТГ в ряде структур, в том числе СА1 поле гиппокампа и неокортексе, наблюдалось умеренное (до 130%) увеличение экспрессии к 3-24 ч, которое в большинстве случаев нивелировалось к 72 ч (в стриатуме, миндалине, неокортексе и СА3 гиппокампа), либо снижалось ниже контрольного уровня (СА1 гиппокампа) (рис.11).

Рис.11. Изменения экспрессии Trx2 мРНК в гиппокампе (поле СА1) и неокортексе прекондиционированных (n=6, серые столбики) и непрекондиционированных (n=6, черные столбики) животных после тяжелой гипоксии. По оси Х - время после тяжелой гипоксии (ч.); *, дотсоверные отличия от контроля; #, достоверные отличия от непрекондиционированных животных.

Воздействие ГП существенно усиливало экспрессию мРНК Trx2 в большинстве областей мозга, за исключением зубчатой извилины. Так к 24-72 ч в пириформной коре, неокортексе, стриатуме, миндалине экспрессия повышена по сравнению с контролем на 50-120%. В зоне СА1 гиппокампа, где ТГ редуцировала экспрессию мРНК Trx2 в отсроченный период до 80%, ГП устраняло этот эффект (рис. 11). Схожие качественные изменения активности были выявлены относительно другого митохондриального антиоксиданта - Mn-супероксиддисмутазы (Mn-SOD), однако в целом выраженность изменений уровней ее мРНК значительно ниже, чем для Trx2. Таким образом, выявлено, что ГП, повышающее резистентность нейронов мозга, в различной степени способствует индукции генов митохондриальных антиоксидантов в чувствительных образованиях мозга в ответ на тяжелое повреждающее воздействие. В дальнейшем в наших совместных исследованиях с С.А. Строевым и коллегами было обнаружено, что ГП выраженно усиливает экспрессию митохондриальных и цитозольных белков-антиоксидантов (Trx1/2, Mn/Cu,Zn-SOD) после ТГ (Stroev et al., 2004; Строев и др., 2005).

Металлопротеазы АDAM. Другую обширную группу исследуемых генов позднего действия составляют гены семейства ADAM (a disintegrin and metalloprotease), кодирующие белки, участвующие в нормальных и патологических процессах в ЦНС - факторы нейрональной пластичности, протеолиза, а также α-секретазы - ферменты процессинга белка-предшественника β-амилоида (АРР) (обзоры Turner, Nalivaeva, 2007; Duffy MJ et al., 2009). Семейство металлопротеаз-дисинтегринов ADAM обнаружено сравнительно недавно, поэтому с использованием методов РТ-ПЦР и гибридизации in situ мы детально исследовали общий уровень экспрессии и региональную локализацию некоторых представителей этого семейства, потенциально важных для формирования механизмов нейропротекции, в областях взрослого и развивающегося мозга на примере грызунов (Karkainen et al., 2000; Rybnikova et al., 2002). В результате было установлено, что среди всех исследованных генов (adam 1,2,3,4,5,7,9,10,11,12,15,17,19,21,22,23) в мозге грызунов обнаруживаются лишь мРНК adam 1,9,10,11,12,17,19,23, однако их базальные уровни достаточно низкие. Наиболее интенсивно в отсутствии стимуляции экспрессируются гены, кодирующие α-секретазы ADAM17 и ADAM10, и дисинтегрин ADAM15. Причем для ADAM17, известного также как фермент ТАСЕ, выявлен специфический паттерн базальной экспрессии гена. В пределах переднего мозга определяемые количества его мРНК выявляются лишь в гиппокампе и пириформной коре. Методом иммуноцитохимии нам удалось установить, что в гиппокампе белок ADAM17 распределен неравномерно - наибольшее его количество обнаруживается в клетках СА2 зоны гиппокампа и, в меньшей степени, в неокортексе (V слой) и стриатуме.

На сердце недавно показано, что белки ADAM вовлекаются в механизмы ишемического прекондиционирования (Ichikawa et al., 2004). Однако практически отсутствуют данные о вовлечении их в механизмы гипоксического повреждения и прекондиционирования в различных образованиях мозга. Методами РТ-ПЦР и иммуноцитохимии нами исследованы изменения экспрессии генов и белков двух представителей этого семейства - ADAM15 и ADAM17, у ГП- и не-ГП животных. ТГ длительно (до 72 ч.) подавляла экспрессию гена adam17 в гиппокампе и пириформной коре и в отсроченный период - в париетальном неокортексе. У ГП-крыс на раннем сроке (3 ч.) также отмечалось понижение уровня ADAM17 мРНК в гиппокампе, однако к суткам оно нивелировалось. Кроме того, в этот период проявлялась ап-регуляция гена adam17 в различных областях неокортекса и пириформной коре. Вслед за ТГ также наблюдалось отчетливое снижение содержания белка ADAM17 в структурах мозга, наиболее выраженное в вентральном гиппокампе. ГП значительно изменяло характер ADAM17-иммунореактивности в исследуемых образованиях мозга крыс после ТГ. У ГП-крыс на всех сроках после ТГ обнаруживалось не снижение, а увеличение содержания иммунореактивного белка, однако динамика несколько различалась в гиппокампе и неокортексе. В CA1 и зубчатой извилине гиппокампа ГП-крыс происходило быстрое и резкое повышение экспрессии ADAM17 уже к 3 ч., достигающее максимальных значении к суткам, которое затем несколько снижается к 3-х дневному сроку, однако остается существенно выше контрольных значений. В неокортексе иммунореактивность к ADAM17 постепенно нарастала к 3 суткам. Это свидетельствует о том, что ГП стимулирует α-секретазную активность нейронов мозга, способствуя образованию растворимых (непатогенных) форм β-амилоида, что препятствует развитию нейродегенеративных процессов (Turner et al., 2003).

Распределение белка ADAM15 в мозге крыс в целом не отличалось от локализации ADAM17. Наиболее высокие базальные уровни ADAM15 выявлялись в СА1, СА2, СА3 полях гиппокампа, неокортексе и пириформной коре. Однако в отличие от adam17, экспрессия которого редуцировалась после ТГ, ген adam15 демонстрировал выраженную активацию в некоторых областях мозга в ответ на ТГ. В частности, экспрессия мРНК adam15 устойчиво ап-регулировалась в гиппокампе и областях неокортекса через 3-24 ч после ТГ, затем следовала некоторая редукция уровней мРНК ADAM15 в этих структурах мозга. Экспрессия белка ADAM15 также индуцировалась в ответ на ТГ, причем динамика была сходной в различных областях гиппокампа и неокортексе. Как в гиппокампальных областях СА1-СА4, так и в неокортексе максимальный уровень белка достигался к 24 часам после ТГ.

ГП нивелировало ап-регуляцию adam15 мРНК вслед за ТГ. Наряду с этим у ГП-крыс отмечалась более заначительная редукция уровней мРНК ADAM15 к 3-м суткам, причем в отличие от не-ГП животных, в данном случае down-регуляция затрагивала не только неокортекс и гиппокамп, но и другие образования мозга - гипоталамусе, таламусе и пириформной коре. Эффект ГП на ТГ-индуцированную экспрессию ADAM15, также как и его мРНК, в целом сводился к нивелированию ап-регуляции экспрессии на ранних сроках и потенцированию редукции - на поздних. В частности, ГП либо полностью предотвращало индукцию ADAM15 в ответ на ТГ (в СА1, СА2, неокортексе), либо значительно снижало величину реакции (в СА3 и зубчатой извилине). К 3 суткам уровень ADAM15 иммунореактивности в исследуемых областях мозга ГП-крыс понижался значительнее, чем у не-ГП животных. Таким образом, выявлены существенные различия в экспрессии как мРНК генов adam15 и 17, так и их белков ADAM15 и ADAM17 в различных образованиях мозга у не-ГП и ГП крыс в ответ на ТГ, что отражает очевидно различное функциональное предназначение белков семейства ADAM в процессах повреждения и выживания нейронов мозга.

Белок-предшественник -амилоидного пептида. Как уже упоминалось, повышение продукции ADAM17 способствует стимуляции α-процессинга белка-предшественника β-амилоидного пептида (АРР). β-амилоидный пептид - это 40-43-аминокислотный нейротоксичный фрагмент протеолиза АРР, образующийся в результате последовательного расщепления - и -секретазами. В норме преобладает другой путь процессинга АРР, связанный с последовательным расщеплением - и -секретазами. -секретазы атакуют АРР внутри последовательности β-амилоида, предотвращая таким образом его образование. Кроме того, в результате -процессинга высвобождается растворимый N-концевой эктодомен АРР (sAPP), обладающий собственными нейротрофическими, нейропротективными свойствами и участвующий в процессах пластичности (Turner et al., 2003). Показано, что sAPP усиливает долговременную посттетаническую потенциацию (простую форму обучения), а в поведенческих экспериментах sAPP улучшает память (Meziane et al., 1998; Bour et al., 2004).

Накопление β-амилоида в ткани мозга с образованием амилоидных бляшек приводит к нейротоксичности и нейродегенеративным процессам, в том числе связанным с патогенеза болезни Альцгеймера (Selkoe, 2001). При этом одной из самых распространенных причин возникновения спорадических форм этого заболевания является ишемия мозга (Pluta and Amek, 2008). В настоящее время ишемическая теория патогенеза болезни Альцгеймера, подкрепленная обширными экспериментальными доказательствами, является одной из доминирующих (Pluta 2004, 2006, 2007). Учитывая тот факт, что в нашей модели ГП обнаружена гиперпродукция α-секретазы ADAM17 после ТГ, было сделано предположение, что у ГП-животных, вероятно, повышается α-процессинг АРР с образованием его растворимой формы. Поэтому нами были исследованы изменения содержания sAPP в гиппокампе и неокортексе ГП и не-ГП животных после ТГ.

Установлено, что у не-ГП крыс ТГ снижала уровень sАРР в Аммоновом роге гиппокампа к 24 ч. (рис.12), в то время как у ГП-животных происходило значительное повышение содержания sАРРβ как в СА1, СА2, СА3 областях гиппокампа, так и в неокортексе (рис.12). В зубчатой извилине изменений иммунореактивного sAPP не выявлено.

Таким образом, проведенные серии экспериментов позволили в значительной степени раскрыть молекулярно-клеточные механизмы долговременных нейропротективных эффектов ГП с использованием умеренной гипобарической гипоксии. Установлено, что реализация протективного действия ГП, приводящего к формированию устойчивой гипоксической толерантности мозга, представляет собой многоуровневый процесс, требующий не только вовлечения внутриклеточных сигнальных каскадов и транскрипционных факторов, но и модификаций активности генов раннего и позднего действия и экспрессии их продуктов. В основе этого процесса лежит индуцируемое ГП репрограммирование внутриклеточных механизмов гибели/выживания нервных клеток мозга при повреждающих воздействиях (тяжелой гипоксии, психоэмоционального и травматического стресса), приводящее к повышению адаптивных возможностей мозга, связанного с оверэкспрессией продуктов про-адаптивных генов и подавлением образования белков, вовлекаемых в процессы повреждения нейронов.

Рис.12. Изменения числа sAPP-иммунопозитивных клеток в гиппокампе и неокортексе непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (серые столбики) крыс вслед за тяжелой гипоксией. Белые столбики - контроль. А, СА1; Б, СА2; В, СА3; Г, неокортекс. *, изменения достоверны по отношению к контролю (р≤0,05); **, различия между тяжелой гипоксией и прекондиционированной тяжелой гипоксией достоверны (р≤0,05).

Гормон-зависимые механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования. В процессах адаптации к патогенным воздействиям большую роль играют механизмы эндокринной регуляции. Как упоминалось выше, антидепрессивные и анксиолитические эффекты ГП в наших экспериментах сопровождались нормализацией гормональных показателей у экспериментальных животных. На этом основании было выдвинуто предположение о том, что, наряду с описанными выше молекулярно-клеточными, гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма могут представлять собой важное звено протективных механизмов, индуцируемых ГП. С целью экспериментальной проверки этого предположения мы исследовали параметры функции гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС), а также экспрессию гормональных (глюкокортикоидных) рецепторов и нейрогормонов (кортиколиберина и вазопрессина) у ГП-крыс в используемых нами экспериментальных моделях.

Тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГ) индуцировала умеренную активацию ГАС с постепенным повышением уровня кортикостерона в крови к 24 ч. (Рис.13). Трехкратное ГП значительно модифицировало реакцию ГАС на ТГ. В этом случае наблюдалась резкая активация ГАС с 5-кратным подъемом уровня кортикостерона уже на 3 ч., с последующим снижением уровня гормона (Рис.13). Сходная динамика реакции ГАС, с пиком на 3 ч., но с меньшей амплитудой, обнаруживалась и после самого ГП. При этом трехкратное ГП вызывало заметную активацию ГАС с 3-х кратным повышением уровня гормона на пике, а однократный сеанс прекондиционирующей умеренной гипоксии, недостаточный для создания нейропротекции, индуцировал лишь незначительное повышение уровня кортикостерона в крови в 3-х часовой период (Рис.13). Через 24 ч. после ГП (то есть в тот период, когда производилась экспозиция ТГ) уровень кортикостерона в крови оставался достоверно повышенным (рис.13), однако в последующем нормализовывался и на 5-й - 10й день не отличался от контроля.

Установлено, что наряду с повышением базального уровня глюкокортикоидов, ГП значительно модифицировало реактивность ГАС на иммобилизационный стресс. Так, у прекондиционированных крыс, по сравнению с контрольными, наблюдалось резкое повышение стрессореактивности ГАС, особенно выраженное на ранних сроках после начала действия стрессора (рис.14). При этом пик активности ГАС смещался уже к 20 мин и существенно возрастал по амплитуде, однако несмотря на это к 24-часовому сроку уровень кортикостерона возвращался к норме.

Рис.13. Изменения активности ГАС после тяжелой гипоксии (ТГ), тяжелой гипоксии у прекондиционированных крыс (ГПТГ), одно- и трехкратного прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией (ГП(1) и ГП(3), соответственно). По оси Y - уровень кортикостерона в плазме крови, по оси Х - время после воздействия. *, изменения достоверны относительно ТГ, p≤0.05.

Рис.14. Кривая стрессореактивности ГАС. По оси Y - содержание кортикостерона в плазме крови, нмоль/л., по оси Х - время после стресса. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс (пунктирная линия), p≤0.05.

Учитывая выраженность изменений на раннем сроке, в следующей серии экспериментов применяли тест на быструю стрессореактивность ГАС, отличающийся от классического большей длительностью иммобилизационного стресса (30 мин) и более ранними точками забора крови - 0, 10, 30, 60 мин после начала стрессирования. Установлено, что у ГП-крыс, в отличие от контрольных, стрессорный уровень кортикостерона (около 600 нмоль/л) достигался уже на 10-й минуте. Затем наблюдалось дальнейшее значимое повышение стрессорного выброса глюкокортикоидов, вплоть до 60 мин. Его амплитуда у ГП-животных достигала свыше 900 нмоль/л, в то время как у контрольных она едва превышала показатель 400 нмоль/л.

Таким образом, трехкратное ГП существенно повышало как базальную активность ГАС в ранний период, так и ее реактивность при предъявлении ТГ и иммобилизационный стресс. При этом сохранялась двухфазная динамика уровня глюкокортикоидов в крови, характеризующая нормальную регуляцию ГАС по механизму глюкокортикоидной отрицательной обратной связи. Это свидетельствует о том, что использованное ГП оптимально активизирует гормональные механизмы повышения адаптивных возможностей. Быстрая активация ГАС в ответ на стресс, во многом предопределяющая адаптацию к стрессору, является индикатором того, что гомеостатические защитные механизмы организма работают эффективно (Derijk RH, de Kloet ER., 2008).

Следует отметить, что после ТГ, приводящей к гибели 50% животных и значительным структурным и функциональным повреждениям мозга у выживших крыс, двухфазная динамика ГАС нарушалась. Содержание кортикостерона в крови крыс, подвергнутых ТГ, градуально возрастало к суткам, что свидетельствует о нарушении торможения ГАС по принципу обратной связи и ее переходу в дезадаптационный режим. Трехкратное ГП оказывало выраженный протективный эффект, нормализуя фазность реакции ГАС (активация-торможение). Вероятно, ГП оказывает такое комплексное действие на функцию ГАС за счет модификации ее регуляции на различных уровнях, включающих нейросекреторные центры гипоталамуса и механизмы глюкокортикоидной обратной связи.

Глюкокортикоидные рецепторы. В основе глюкокортикоидного торможения ГАС по принципу отрицательной обратной связи лежит взаимодействие циркулирующих в крови глюкокортикоидов с кортикостероидными рецепторами гиппокампа, в особенности его вентральных отделов (Sapolsky et al., 1990) Главную роль в опосредовании глюкокортикоидного торможения играют стероидные рецепторы II типа - глюкокортикоидные, ГР (Keller-Wood and Dallman, 1884; De Kloet, 1991). Поддержание экспрессии ГР на высоком уровне имеет решающее значение для обеспечения работы механизмов обратной связи. Поэтому можно полагать, что нормализация обратной регуляции ГАС, описанная нами у ГП-животных, связана с модификациями уровня ГР в гиппокампе. С целью выяснения этого вопроса методом количественной иммуноцитохимии исследовали уровни ГР в гиппокампе ГП-крыс. Значимые изменения ГР-иммунореактивности после ГП были выявлены в вентральном гиппокампе - СА3, СА4 и зубчатой извилине. В частности, число ГР-иммунопозитивных клеток достоверно увеличивалось в гиппокампальных полях СА3 и СА4 (до 363 и 250% на 2-е сутки, соответственно), однако это повышение нивелировалось к 11-ти дневному сроку. В нейронах области СА4 увеличение числа иммунопозитивных клеток сопровождалось усилением уровня их иммунореактивности (до 325%). В зубчатой извилине количество ГР-иммунопозитивных клеток достоверно не менялось, однако наблюдалось значительное усиление их иммунореактивности - количество интенсивно экспрессирующих ГР клеток в этой области гиппокампа достигало максимума на ранних сроках и затем постепенно снижалось к 11 дню до контрольного уровня. Данные свидетельствуют о том, что ГП вызывает умеренное, но достаточно устойчивое повышение содержания ГР в отделах вентрального гиппокампа - областях, играющих ключевую роль в поддержании механизмов обратной регуляции ГАС. Для того чтобы проанализировать, каким образом изменяется содержание ГР у ГП-животных не в базальных условиях, а в ответ на стресс, была проведена следующая экспериментальная серия, в которой осуществляли сравнительный анализ ГР-иммунореактивности в гиппокампе ГП- и не-ГП животных в различные сроки после психоэмоционального стресса в модели выученная беспомощность. Как описано выше, у не-ГП животных в этих условиях развивалось депрессивноподобное состояние, а ГП предотвращало этот патогенный эффект стрессорного воздействия и одновременно нормализовывало функционирование глюкокортикоидной обратной связи.

У не-ГП крыс развитие депрессивноподобного состояния сопровождалось резкой и выраженной редукцией ГР-иммунореактивности в вентральном гиппокампе (рис.15). В поле СА4 снижалась интенсивность экспрессии ГР (максимально - на 95% на 5-й день), а в области СА3 и зубчатой извилине существенно понижалась как интенсивность экспрессии, так и общее число иммунореактивных клеток. При этом в СА3 все показатели восстанавливались к 10-му постстрессорному дню, а в зубчатой извилине эффект оказался более устойчивым и сохранялся на всех сроках (рис.15). У ГП-животных обнаружена значительная модификация постстрессорного паттерна экспрессии ГР в вентральном гиппокампе. Во всех исследованных областях наблюдалось резкое увеличение ГР-иммунореактивности, достигающее максимальных значений на 1-й и 5-й день (рис.15).

Рис.15. Динамика содержания ГР в образованиях вентрального гиппокампа прекондиционированных и непрекондиционированных крыс после стресса в парадигме выученной беспомощности. N, общее число ГР-иммунопозитивных клеток; Ni, число клеток, интенсивно экспрессирующих ГР. Контроль - 100%. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс, p≤0.05; #, изменения достоверны относительно непрекондиционированных крыс, p≤0.05.

Таким образом, ГП не только вызвает умеренное увеличение ГР в вентральном гиппокампе, но и потенциирует их оверэкспрессию в условиях тяжелого патогенного стресса. Эти результаты представляют особый интерес, поскольку глюкокортикоидная рецепция гиппокампа является важной частью стресс-лимитирующей системы, дисбаланс которой способствует повышению уязвимости организма к стрессам и развитию различных постстрессовых патологий (Sapolsky et al., 2000). К мишеням транскрипционных факторов ГР относятся множество генов, в том числе кодирующих HIF-1α, нейрогормоны кортиколиберин и вазопрессин, антиоксиданты (тиоредоксин-2) (Kodama et al., 2003). Глюкокортикоиды, связываясь с ГР и действуя на GRE в промоторном регионе гена ВП, подавляют экспрессию гена ВП при стрессе (Kim et al., 2001). ГР также взаимодействует на посттранскрипционном уровне с транскрипционными факторами HIF-1, NF-kB и AP-1, регулируя их активность (Leonard et al., 2005; Derijk RH, de Kloet ER. 2008).

Кортиколиберин. Как уже отмечалось, помимо стимуляции механизмов обратной регуляции ГАС, эффект ГП на эту эндокринную систему заключается в повышении ее реактивности в условиях стресса. Согласно литературным сведениям, в основе повышения стрессореактивности ГАС может лежать гипертонус (hyperdrive) кортиколиберинергической системы мозга, поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали изменения экспрессии нейрогормона кортиколиберина - ведущего активатора ГАС, у прекондиционированных крыс. Исходя из современных представлений о двух контурах кортиколиберинергической системы (гипоталамическом и экстрагипоталамическом) изменения иммунореактивности к кортиколиберину изучались в паравентрикулярном ядре гипоталамуса (мелкоклеточном - мПВЯ, и крупноклеточном - кПВЯ), а также в различных отделах гиппокампа (СА1, СА3/4, зубчатая извилина) и неокортексе (II и V слой).

Содержание иммунореактивного кортиколиберина в гиппокампе и неокортексе контрольных крыс было низким - наблюдались лишь единичные иммунопозитивные клетки. ГП с применением трехкратной умеренной гипобарической гипоксии приводило к незначительному, но устойчивому повышению иммунореактивности к кортиколиберину в областях вентрального гиппокампа (CA3) и достаточно выраженному повышению - в неокортексе. Ко 2-м суткам после последнего сеанса ГП интенсивность иммунореактивности к кортиколиберину в неокортексе увеличивалась до 315% от контрольного уровня, затем количество иммунопозитивных клеток снижалось, но оставалось высоким и через 11 суток. В гипоталамусе ГП крыс, в частности мелкоклеточной и крупноклеточной части ПВЯ, значимых изменений иммунореактивности к кортиколиберину в период 2-11 суток не выявлялось.

Формирование депрессивноподобного состояния у не-ГП крыс сопровождалось изменениями содержания иммунореактивного кортиколиберина, наиболее выраженными в вентральном гиппокампе и гипоталамусе. В СА3 области гиппокампа и зубчатой извилине наблюдалось устойчивое повышение уровня кортиколиберина. В гипоталамусе не-ГП крыс наблюдалось постепенное увеличение экспрессии кортиколиберина в мПВЯ в ходе развития депрессивного состояния. При этом количество иммунопозитивных клеток к 10-му дню повышалось до 200%, а интенсивность экспрессии - до 350%. (рис. 16). У ГП-животных, у которых постстрессовое депрессивноподобное состояние не формировалось, динамика экспрессии кортиколиберина в ответ на стресс значительно модифицировалась. В частности, в СА3 и зубчатой извилине ГП-крыс иммунореактивность к кортиколиберину после стресса не повышалась, либо даже снижалась ниже контрольного уровня. В зоне СА4 у ГП-крыс также предотвращалась волна ранней постстрессовой экспрессии кортиколиберина, и вместе с тем нормализовался уровень кортиколиберина в отдаленный период, сниженный у не-ГП животных. В неокортексе ГП-крыс после стресса обнаруживалось устойчивое и выраженное повышение уровня иммунореактивного кортиколиберина как относительно постстрессового уровня у не-ГП крыс, так и контрольных показателей. В мПВЯ гипоталамуса ГП-крыс происходило отчетливое повышение интенсивности экспрессии нейрогормона на раннем сроке (1-е сутки после стресса), однако в отдаленный период показатели иммунореактивности к кортиколиберину у этих крыс были значительно снижены по сравнению с не-ГП особями (рис.16).

Рис. 16. Количественная оценка иммунореактивности к кортиколиберину в зубчатой извилине гиппокампе и мПВЯ гипоталамуса непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (белые столбики) крыс в ответ на тяжелый психоэмоциональный стресс. N, общее число иммунопозитивных клеток; Ni, число клеток, интенсивно экспрессирующих кортиколиберин. Контроль - 100%. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс, p≤0.05; #, изменения достоверны относительно непрекондиционированных крыс, p≤0.05.

Вазопрессин. Поскольку наряду с кортиколиберином важнейшим нейроэндокринным регулятором ГАС является нейрогормон вазопрессин, нами были исследованы изменения его содержания в гиппокампе, неокортексе и гипоталамусе после ГП. В контроле был отмечен низкий уровень иммунореактивного вазопрессина в большинстве исследуемых образований мозга. Наличие вазопрессин-иммунопозитивных клеток исходно регистрировалось лишь в V слое неокортекса и ПВЯ гипоталамуса, однако в последнем случае уровень вазопрессин-иммунореактивности был достаточно высок.

После ГП наблюдалось резкое повышение экспрессии вазопрессина на раннем сроке (2 суток) в экстрагипоталамических отделах мозга (гиппокамп, неокортекс), которое затем нивелировалось к 11-му дню. В ПВЯ гипоталамуса после ГП значимых изменений не обнаруживалось. Вызываемые тяжелым стрессом изменения содержания иммунореактивного вазопрессина в исследуемых образованиях мозга имели транзиторный характер - они регистрировались лишь в ранний постстрессовый период и практически нивелировались к 10-му постстрессорному дню, когда формировалось устойчивое депрессивноподобное состояние. При этом психоэмоциональный стресс в парадигме выученной беспомощности оказывал неодинаковый эффект на экспрессию вазопрессина в гипоталамусе и экстрагипоталамических областях мозга. В частности, стрессорное воздействие резко редуцировало содержание вазопрессина в ПВЯ гипоталамуса, но повышало его уровень в вентральном гиппокампе и неокортексе через сутки после психоэмоционального стресса. К 10-ти суточному сроку эти стресс-индуцированные изменения нивелировались. У ГП-крыс паттерн стресс-индуцированной экспрессии вазопрессина оказался иным. Так, у них не наблюдалось постстрессового снижения содержания этого нейрогормона в гипоталамическом ПВЯ. Вместе с тем после ГП в значительной мере предотвращалась ап-регуляция уровней вазопрессина в вентральном гиппокампе (СА4 и зубчатой извилине) и, напротив, усиливалась его экспрессия в неокортексе (слои II-III, V).

Таким образом, ГП модифицирует центральные уровни нейрогормонов-регуляторов ГАС - кортиколиберина и вазопрессина как в базальных условиях, так и в ответ на стресс. При этом модификации активности кортиколиберинергической системы носили более устойчивый характер, в то время как изменения в системе вазопрессина были транзиторными и регистрировались лишь в ранние сроки после воздействий. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что реализация про-адаптивных эффектов ГП происходит с вовлечением как молекулярно-клеточных протективных механизмов мозга, так и механизмов эндокринной регуляции адаптивных функций организма. Очевидно, индуцируемые ГП устойчивые модификации активности ГАС и механизмов ее нейроэндокринной регуляции (экспрессия нейрогормонов, уровни кортикостероидных рецепторов) обеспечивают переход этой основной эндокринной системы адаптации в новый режим, определяющий большую устойчивость организма к повреждающим факторам.

В заключении следует отметить, что проведенные нами многосторонние исследования феномена ГП вносят вклад в разработку проблемы повышения адаптивных возможностей мозга и организма в целом. Разработан оригинальный способ ГП умеренной гипобарической гипоксией, который оказывает выраженные нейропротективные и адаптогенные эффекты при действии повреждающих факторов различной природы (тяжелых форм гипоксии, стрессов). Согласно полученным экспериментальным результатам, в основе формирования ГП-индуцируемой долговременной (фаза экспрессии) толерантности мозга к повреждающим воздействиям лежит активация эволюционно-приобретенных, генетически детерминированных защитных механизмов, связанных с репрограммированием генетического аппарата нейронов мозга и выраженным устойчивым увеличением синтеза про-адаптивных белков. Этот эффект осуществляется посредством влияния ГП на процессы внутриклеточной сигнальной трансдукции, приводящие к кооперативной активации транскрипционных факторов, мишенями которых являются про-адаптивные нейропротективные гены.

Установлено, что используемый способ ГП индуцирует повышение резистентности мозга не только к факторам гипоксической природы, но и к другим повреждающим воздействиям, т.е. обладает свойством кросс-толерантности. Существенная роль в проявлении этого свойства ГП принадлежит, очевидно, запуску механизмов перекрестной адаптации или неспецифической резистентности по Ф.З.Меерсону (Меерсон, 1994), обусловленных модификациями гормональной регуляции адаптивных процессов, направленных на эффективную мобилизацию гормон-зависимых защитных механизмов.

Полученные в работе данные могут быть полезны при разработке нейропротекторов и адаптогенов нового поколения, оказывающих направленное действие на активацию внутриклеточных компонентов защитных механизмов мозга. Наряду с этим, проведенные нами исследования должны способствовать внедрению ГП в качестве одного из эффективных немедикаментозных способов нейропротекции в клиническую неврологическую и нейрохирургическую практику для предупреждения и лечения гипоксических, постстрессовых и нейродегенеративных повреждений нервной системы.

ВЫВОДЫ

1. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказывает
выраженные нейропротективные эффекты, предотвращая структурно-функциональные
повреждения мозга крыс в условиях тяжелой гипобарической гипоксии. Это
проявляется существенным повышением структурной резистентности нейронов
наиболее чувствительных к гипоксии образований мозга (гиппокампа,
неокортекса) и нивелированием нарушения воспроизведения приобретенного навыка, вызываемого тяжелой гипобарической гипоксией.

2. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией предотвращает
развитие постстрессовых тревожно-депрессивных патологий, индуцируемых
тяжелыми формами психоэмоционального и травматического стресса.
Гипоксическое прекондиционирование обладает антидепрессивным действием,
предотвращая формирование депрессивноподобного состояния у крыс в модели выученная беспомощность, и оказывает анксиолитический эффект при развитии
тревожного состоянияа у крыс в модели посттравматического стрессового
расстройства.

3. У прекондиционированных животных подавляется развитие апоптоза в нейронах гиппокампа и неокортекса мозга крыс вслед за тяжелой гипобарической гипоксией путем активации экспрессии внутриклеточных антиапоптотических факторов (белков Bcl-2, Bcl-xL, митоген-активируемой киназы ERK) и редукции экспрессии проапоптотических факторов (белков Bax, pc-Jun, митогенактивируемых киназ JNK и р38).

4. У непрекондиционированных и прекондиционированных умеренной гипобарической гипоксией крыс проявляются существенные различия паттерна активации ранних генов ngfi-a, junB, c-jun, hif-1 в уязвимых образованиях мозга (гиппокампе, неокортексе, стриатуме) в ранние (3 ч.) и поздние (24-72 ч.) сроки после тяжелой гипобарической гипоксии.

5. У прекондиционированных особей, в отличие от непрекондиционированных, при предъявлении тяжелой гипобарической гипоксии обнаружена кооперативная активация экспрессии как активационных (CREB, NF-kB), так и индуцибельных (NGFI-A, c-Fos, HIF-1) транскрипционных факторов, вовлекаемых в механизмы индукции процессов адаптации и выживания клеток мозга при повреждающих воздействиях.

6. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией в ответ на тяжелую гипобарическую гипоксию повышает экспрессию ряда генов позднего действия и их продуктов, участвующих в механизмах нейропротекции и нейропластичности, в частности, генов антиоксидантов mn-sod, trx2, белков цитозольных и митохондриальных супероксиддисмутаз и тиоредоксинов, а также белка амилоидного метаболизма - -секретазы ADAM17, стимулирующей образование неамилоидогенной формы белка-предшественника -амилоидного пептида sAPP.

7. В реализацию протективных, антидепрессивных и анксиолитических эффектов прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией вовлекаются гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма, что проявляется в:

а)а повышенииа стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и
оптимизации механизмов ее регуляции по принципу отрицательной обратной связи;

б)апредотвращении нарушения функции гипофизарно-адренокортикальной системы в условиях тяжелых повреждающих воздействий (тяжелой гипобарической гипоксии, психоэмоциональных и травматических стрессов);

в) умеренном повышении продукции кортиколиберина и вазопрессина, являющихся нейрогормональными регуляторами гипофизарно-адренокортикальной системы, в гиппокампе и неокортексе прекондиционированных животных; при этом гипоксическое прекондиционирование препятствует возникновению нарушений экспрессии нейрогормонов в гипоталамусе и гиппокампе ва ответ на тяжелый психоэмоциональный стресс;

г) увеличении содержания глюкокортикоидных рецепторов в вентральном гиппокампе и существенном повышении их экспрессии в ответ на тяжелый психоэмоциональный стресс, что лежит в основе стимуляции механизмов глюкокортикоидной обратной связи.

8. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией представляет собой эффективный немедикаментозный способ повышения резистентности мозга и организма в целом к повреждающим воздействиям за счет индукции базисных эндогенных протективных механизмов, включающих оптимизацию функции гипофизарно-адренокортикальной системы, модификацию активности про-адаптивных генов и повышение экспрессии кодируемых ими белков.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Шаляпина В.Г., Рыбникова Е.А., Ракицкая В.В. Кортиколиберинергические механизмы неостриатума в нейроэндокринной регуляции стресса // Росс. физиол. журн. им. И.М.Сеченова.-2000.- Т.86, № 11.- С.1435-1440.
Rybnikova E., Damdimopoulos A.E, Gustafsson J.-Е, Spyrou G., Pelto-Huikko М. Expression of novel antioxidant thioredoxin-2 in the rat brain // Eur.J.Neuroscience.-2000.-V.12, N.5.- P.1669-78.
Karkkainen I., Rybnikova E.,Pelto-Huikko M., Huovila A-P.J. Expression of metalloprotease-disintegrin (ADAM) genes in the adult mouse and rat brain // Mol. Cell Neurosci.-2000.-V.15. P.547-560.
Рыбникова Е.А., Пелто-Хьюкко М., Ракицкая В.В., Шаляпина В.Г. Локализация кортиколибериновых рецепторов в мозге // Росс. физиол. журнал им. И.М.Сеченова.- 2001.- Т.87, №12.-С.1595-1602. (переведено в Neurosci Behav Physiol.-2003.-V.33, N4.-P.399-404).
Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Тюлькова Е.И., Ватаева Л.А., Отелин В.А., Хожай Л.И., Пелто-Хьюкко М. Влияние гипобарической гипоксии на поведенческие реакции и экспрессию ранних генов в мозге крыс: корректирующий эффект прекондиционирующего воздействия // Доклады АН.-2001.-Т.381, №1.-С.1-3. (переведено в Dokl Biol Sci.- 2001.-V. 381.- P.513-5).
Rybnikova E., Tulkova E., Pelto-Huikko M., and Samoilov M. Mild preconditioning hypoxia modificates NGFI-A mRNA expression in the rat brain induced by severe hypoxia // Neuroscience Letters.-2002.- V.329, N1.- P.49-52.
Rybnikova E., Karkkainen I., Pelto-Huikko M., Huovila A.P. Developmental regulation and neuronal expression of the cellular disintegrin ADAM11 gene in mouse nervous system // Neuroscience.-2002.-V.112, N4.-P.921-34.
Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Тюлькова Е.И., Спирау Я., Пелто-Хьюкко М. Митохондриальные антиоксиданты тиоредоксин-2 и Mn-супероскиддисмутаза вовлекаются в механизмы гипоксической толерантности мозга // Доклады АН.-2002.- Т.387, №3.-С.1-4 (переведено в Dokl Biol Sci.- 2002.-V.387. P.498-500).
Шаляпина В.Г., Ракицкая В.В., Рыбникова Е.А. Кортикотропин-рилизинг гормон в интеграции эндокринных функций и поведения // Успехи физиол. наук.-2003.-Т. 34, №4.- С.75-92.
Строев С.А., Глущенко Т.С., Тюлькова Е.И., Рыбникова Е.А., Самойлов М.О., Пелто-Хьюкко М. Экспрессия и ферментативная активность Сu,Zn-супероксиддисмутазы после тяжелой гипоксии в мозге крыс. Эффект прекондиционирования // Нейрохимия.-2003.- Т.20, № 3.-С.190-195.
Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Тюлькова Е.И., Рыбникова Е.А., Ватаева Л.А., Глущенко Т.С., Строев С.А., Миллер О.Л. Молекулярные механизмы кратко- и долговременных эффектов гипоксического прекондиционирования // "Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспектыФ: Коллективная монография/ Под.ред. Л.Д.Лукьяновой, И.Б. Ушакова.-М.: Истоки, 2003. С.96-111.
Миронова В.И., Рыбникова Е.А., Ракицкая В.В., Шаляпина В.Г. Содержание кортиколиберина в гипоталамусе крыс с различной стратегией поведения при постстрессорной депрессии // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2004.- Т. 90, № 9.-С. 1161-1169.
Nalivaeva N., Rybnikova E., Fisk L., Galeeva A., Tuilkova E., Makava N., Huovila A., Pelto-Huikko M. and Turner A., Samoilov M. Effect of hypoxia and hypoxic preconditioning on brain metalloproteases // BioScience 2004: From molecule to organism. Abstr.book of International Conference.- Glasgow, UK, 2004. P.R606.
Рыбникова Е.А., Хожай Л.И., Тюлькова Е.И., Глущенко Т.С., Ситник Н.А., Отеллин В.А., Самойлов М.О. Влияние гипобарической гипоксии на экспрессию белков ранних генов и структурные изменения нейронов мозга: корректирующий эффект прекондиционирования // Морфология.-2004.-Т.125, №2.-С.10-15. (переведено в Neurosci Behav Physiol.- 2005.-V.35, N4.-P.383-388).
Stroev S.A., Gluschenko T.S., Tjulkova E.I., Spyrou G., Rybnikova E.A., Samoilov M.O., Pelto-Huikko M. Preconditioning enhances the expression of mitochondrial antioxidant thioredoxin-2 in forebrain of rats exposed to server hypobaric hypoxia // J. Neurosci. Res.-2004.-V.78.-P. 563-569.
Stroev S.A., Tjulkova E.I., Gluschenko T.S., Rybnikova E.A., Samoilov M.O., Pelto-Huikko M. The augmentation of brain thioredoxin-1 expression after sever hypobaric hypoxia by the preconditioning in rats // Neurosci. Lett.-2004.-V.370.-P. 224-229.
Самойлов М.О., Ситник Н.А., Рыбникова Е.А., Глущенко Т.С., Тюлькова Е.И. Особенности экспрессии про- и антиапоптических белков Bax и Bcl-2 в нейронах мозга крыс в ответ на тяжелую гипобарическую гипоксию: корректирующий эффект гипоксического прекондиционирования // Доклады АН.-2005.-Т. 402, № 4.-С.1-3. (переведено в Dokl Biol Sci.-2005.- V.402. P.176-8).
Миронова В.И., Рыбникова Е.А., Ракицкая В.В. Экспрессия вазопрессина в гипоталамусе активных и пассивных крыс при развитии постстрессорной депрессии // Бюлл. эксп. биол. мед. 2005.-Т.140.- С.618-621.
Rybnikova E., Vataeva L., Tyulkova E., Gluschenko T., Otellin V., Pelto-Huikko M., and Samoilov M. Preconditioning prevents impairment of passive avoidance learning and suppression of brain NGFI-A expression induced by severe hypoxia // Beh. Brain. Res.-2005.- V.160, № 1.-P.107-14.
Stroev S.A., Gluschenko T.S., Tjulkova E.I., Rybnikova E.A., Samoilov M.O., Pelto-Huikko M. The effect of preconditioning on the Cu, Zn superoxide dismutase expression and enzyme activity in rat brain at the early period after severe hypobaric hypoxia // J. Neurosci. Res.-2005.-V. 53, № 1.- P.39-47.
Ситник Н.А., Рыбникова Е.А. Влияние прекондиционирования на экспрессию белков Bcl-2 и Bax в мозге крыс после воздействия тяжелой гипобарической гипоксии // Вестник молодых ученых: Материалы Всероссийской конференции молодых ученых Физиология и медицина.- Санкт-Петербург, 2005. С.110.
Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Семенов Д.Г., Мокрушин А.А., Тюлькова Е.И., Глущенко Т.С., Строев С.А., Ситник Н.А. Нейрохимические механизмы толерантности мозга к гипоксии // Материалы конфер. Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты.- Москва, 2005. С. 191.
Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Глущенко Т.С., Тюлькова Е.И., Строев С.А., Ситник Н.А. Нейропротективные эффекты гипоксического прекондиционирования:вовлечение факторов регуляции апоптоза // Материалы конф. Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция.- Москва, 2005. С.100.
Рыбникова Е.А. Новый подход к коррекции тревожно-депрессивных расстройств с использованием гипоксического прекондиционирования // Материалы Междунар. симпозиума Механизмы адаптивного поведения.-Санкт-Петербург, 2005. С.69.
Самойлов М.О., Семенов Д.Г., Мокрушин А.А. , Рыбникова Е.А. , Тюлькова Е.И. , Глущенко Т.С. , Гринкевич Л.Н. , Строев С.А. , Любимов Я.Е. , Ситник Н.А. , Лазаревич Е., Пелто-Хьюкко М. , Галеева А.Ю. ,Отеллин В.А. , Ватаева Л.Н. , Наливаева Н.Н. , Тернер А. Адаптивные эффекты гипоксического прекондиционирования // Материалы Междунар. симпозиума Механизмы адаптивного поведения.-Санкт-Петербург, 2005. С. 72.
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Пивина С.Г., Ордян Н.Э., Тюлькова Е.И, Самойлов М.О. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает развитие постстрессорных депрессивных состояний у крыс // Доклады АН.-2006.-Т.411, №1.-С.1-3. (переведено в Dokl. Biol. Sci.- 2006.-V. 411.- P. 431-3).
Рыбникова Е.А., Самойлов М.О., Миронова В.И., Тюлькова Е.И., Ордян Н.Э., Наливаева Н.Н., Тернер Э. Применение гипоксического прекондиционирования в качестве немедикаментозного способа профилактики и лечения тревожно-депрессивных состояний // Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине: Тезисы третьей международной выставки МЕДБИОТЕК-2006.- Москва, 2006.
Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Участие экстрагипоталамического звена регуляции гипофизарно-адренокортикальной системы в развитии разных форм депрессий у крыс // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2006.-Т. 92, № 9.- С.1111-1123.
Rybnikova E, Sitnik N, Gluschenko T, Tjulkova E and Samoilov M The preconditioning modified neuronal expression of apoptosis-related proteins of Bcl-2 superfamily following severe hypobaric hypoxia in rats // Brain Res.- 2006.- V.1089, № 1.- P.195-202.
Samoilov M., Rybnikova E., Tulkova E., Gluschenko E., Mironova V., Pivina S., Ordyan N., Stroev S., Pelto-Huikko M., Nalivaeva N., Turner A. Adaptive neuroprotective effects of hypoxic preconditioning // Abstr. book of VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine.- Moscow, 2006. P.45.
Rybnikova E., Mironova V., Pivina S., Ordyan N., Tulkova E., Nalivarva N., Turner A., Samoilov M. Antidepressant-like effects of mild hypoxic preconditioning in experimental models of depression in rats // Molecular basis of neurological and psychiatric disorders: Abstract book of the International Congress, organized in the frame of 11th meeting of Czech and Slovak Neurochemical Society. - Martin, Slovak Republic, 2006. P. 90.
Рыбникова Е. А., Самойлов М.О., Миронова В. И., Тюлькова Е. И., Пивина С. Г., Ватаева Л.А., Ордян Н.Э., Абриталин Е.Ю., Колчев А.И. Возможности использования гипоксического прекондиционирования для профилактики постстрессовых депрессивных эпизодов // Журн. невропатол. психиатрии им. С.С. Корсакова.- 2007.- № 3-4.- С.43-48 (переведено в Neurosci Behav Physiol.-2008.- V. 38, N7.-P.721-6).
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Самойлов М.О. Перспективы использования гипоксического прекондиционирования для профилактики и лечения постстрессовых патологий // Материалы XX Съезда физиологического общества им. И.П.Павлова.- Москва, 2007. С.81.
Рыбникова Е.А. Нейроэндокринные механизмы протективных эффектов гипоксического прекондиционирования // Материалы Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию акад. В.Н.Черниговского.-Санкт-Петербург - Колтуши, 2007. С.69.
Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Нейроэндокринные механизмы эндогенной депрессии: исследования в моделях на крысах // Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии: Материалы Российской конференции.- Москва, 2007.С.365-366.
Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Ситник Н.А., Глущенко Т.С., Тюлькова Е.И., Гринкевич Л.Н. Прекондиционирование модифицирует активность митоген-активируемых протеинкиназ и транскрипционного фактора c-jun в гиппокампе крыс вслед за тяжелой гипобарической гипоксией // Нейрохимия.- 2007.- Т.24, №1.- С.52-59. (переведено в Neurochemical Journal.-2007.-V.1, N3.-P.219-226).
Rybnikova E, Mironova V, Pivina S, Tulkova E, Ordyan N, Vataeva L, Vershinina E, Abritalin E, Kolchev A, Nalivaeva N, Turner AJ, Samoilov M. Antidepressant-like effects of mild hypoxia preconditioning in the learned helplessness model in rats // Neurosci. Lett.-2007.- V.417, N3.- Р. 234-239.
Rybnikova E., Mironova V., Pivina S., Tulkova E., Ordyan N., Nalivaeva N., Turner A., Samoilov M. Involvement of hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the antidepressant-like effects of mild hypoxic preconditioning in rats // Psychoneuroendocrinology.-2007.-V. 32, N 7.- P. 812-823.
Rybnikova E., Gluschenko T., Tulkova E., Churilova A., Baranova K., Jaroshevich O., Samoilov M. Preconditioning induces prolonged expression of transcription factors pCREB and NF-kappaB in the neocortex of rats before and following severe hypobaric hypoxia // Journal of Neurochemistry.- 2008.-V.106.-P.1450-1458.
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Пивина С.Г., Ордян Н.Э., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О. Гормональные механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования у крыс // Доклады РАН.-2008.-Т.421, №5.- C.1Ц3 (переведено в Dokl Biol Sci.-2008.- V. 421.-P.239-40).
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О. Анксиолитический эффект гипоксического прекондиционирования у крыс в модели постстравматического стрессового расстройства // Журнал ВНД.-2008.- Т.58, № 4.- С. 475Ц482.
Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Устойчивые модификации экспрессии нейрогормонов в гипоталамусе крыс в модели выученная беспомощность // Бюлл. эксперим. биол. мед.- 2008.- Т.145, №10.-С. 371-376.
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Наливаева Н.Н., Тернер А.Дж. Антидепрессант-подобные эффекты гипоксического прекондиционирования // Гипоксическое, ишемическое прекондиционирование мозга: Материалы Российско-Польского рабочего симпозиума.- Санкт-Петербург, 2008. С.78-83.
Баранова К.А., Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Самойлов М.О. Эффект гипоксического прекондиционирования на экспрессию транскрипционного фактора NGFI-A в мозге крыс после неизбегаемого стресса в модели выученная беспомощность // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2009.- Т.95, №4.- С.405-416.
Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Самойлов М.О. Эндокринные механизмы толерантности к стрессам, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием // Механизмы функционирования висцеральных систем: Материалы VII Всероссийской конференции с международным участием.- Санкт-Петербург, 2009. С.377.
Rybnikova E., Glushchenko T., Tyulkova E., Baranova K., and Samoilov M. Mild hypobaric hypoxia preconditioning up-regulates expression of transcription factors c-Fos and NGFI-A in rat neocortex and hippocampus // Neurosci. Res.- 2009.- V.65.- P.360-366.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog