Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
Печенкин Михаил Александрович
МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ИНСУЛИНОВ
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Изумрудов Владимир Алексеевич кандидат химических наук, доцент Балабушевич Надежда Георгиевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович Центр Биоинженерия РАН
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится л_____ ноября 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам в Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова, Фундаментальная библиотека (Ломоносовский просп. 27).
Автореферат разослан л_____ октября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Сахарным диабетом в мире болеют более 300 миллионов человек, причем 10 - 15 % из них страдают диабетом первого типа, при котором инсулин в поджелудочной железе не синтезируется совсем или вырабатывается, но в недостаточном количестве. Больные вынуждены строго контролировать уровень глюкозы в крови путем постоянных инъекций инсулина, что, в свою очередь, может привести к таким нежелательным последствиям, как гиперинсулинемия и липоатрофия.
Пероральная доставка является наиболее естественным и удобным способом введения инсулина, а ключевым доводом в пользу такой схемы является явное предпочтение большинством пациентов таблеток перед инъекциями. Пероральное введение обладает еще одним важным преимуществом. В норме секретируемый в поджелудочной железе инсулин попадает в печень, которая контролирует количество гормона, достигающего остальных органов и тканей. При пероральном введении инсулин из тонкого кишечника через брыжеечную и воротную вены также в первую очередь попадает в печень. Иными словами, и в этом случае осуществляется контроль количества инсулина, отсутствующий при инвазивном введении или при доставке гормона другими путями.
Однако, несмотря на множество предложенных систем пероральной доставки и даже наличия препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний, в настоящее время на рынке имеется лишь одна клиническая форма неинвазивного инсулина - буккальная (т.е. вводимая через внутреннюю сторону щеки). Серьезным тормозом на пути создания лекарственных средств является крайне незначительная биодоступность белков, вводимых перорально, которая не превышает 1 - 2 %. Это обусловлено гидролизом белка при экстремальных значениях pH желудочного сока, расщеплением белка под действием протеолитических ферментов желудка и тонкого кишечника и, наконец, плохой проницаемостью эпителия кишечника для больших белковых молекул. В связи с этим особенно актуальна разработка пероральной системы доставки, обеспечивающей относительно высокую биодоступность гормона. Перспективным развитием этого направления является использование полиэлектролитных микро- и наночастиц, позволяющих осуществлять направленную доставку гормона в тонкий кишечник с последующим его высвобождением при минимуме побочных эффектов. В целях обеспечения безопасности при пероральном введении следует применять биосовместимые и биодеградируемые полимеры, среди которых важное место занимает катионный полисахарид хитозан, обладающий мукоадгезивными свойствами, усиливающими абсорбцию веществ эпителием кишечника.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение полиэлектролитных микрочастиц, обеспечивающих повышенную биодоступность рекомбинантных инсулинов при пероральном применении.
Микрокапсулирование инсулина осуществляли последовательной адсорбцией разноименно заряженных полисахаридов на микроагрегатах нерастворимого комплекса белокполианион [Балабушевич Н.Г. и др., 2010]. Подход не требует сложного аппаратурного оформления и осуществляется в мягких условиях, способствующих сохранению биологической активности белков [Балабушевич Н.Г. и др. 2004; Balabushevich N.G. et al., 2005]. В основе метода лежит электростатическое взаимодействие молекул белка с противоположно заряженным полиэлектролитом и полиэлектролитов друг с другом.
В работе были поставлены следующие задачи:
Получить и охарактеризовать полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантные инсулины.
Выявить свойства микрочастиц, обеспечивающие увеличение биодоступности инсулина при пероральном введении.
Включить в полиэлектролитные микрочастицы белковые ингибиторы протеолитических ферментов для защиты микрокапсулированного инсулина от воздействия протеаз желудочно-кишечного тракта.
Оценить in vivo биологическое действие препарата микрокапсулированного инсулина.
Научная новизна работы.
Впервые постадийной адсорбцией анионного полисахарида декстрансульфата и катионного полисахарида хитозана на микроагрегатах нерастворимого комплекса инсулиндекстрансульфат получены микрочастицы, содержащие рекомбинантные инсулины (инсулин человека и его быстродействующие аналоги аспарт и лизпро). Изучено изменение характеристик микрочастиц в условиях прохождения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а именно, рН-чувствительности, мукоадгезивных свойств и эффективности связывания частицами ионов кальция. Продемонстрировано сочетанное воздействие мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц с четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов (на последней стадии сорбции нанесен хитозан) на основные факторы, повышающие биодоступность инсулина при пероральной доставке.
Разработаны способы включения белковых ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы. Исследовано одновременное воздействие микрокапсулирования и введения белковых ингибиторов протеаз в низких дозах на предотвращение протеолиза рекомбинантных инсулинов.
Практическая значимость работы.
Микрочастицы, полученные четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов, обладали мукоадгезивными свойствами и защищали микрокапсулированный инсулин от действия пепсина, трипсина и химотрипсина. Наличие в микрочастицах белковых ингибиторов протеаз, в частности соевого ингибитора типа Баумана-Бирк в концентрациях, не превышающих 2 - 3 % от массы препарата, полностью предотвращало протеолиз инсулина человека протеазами ЖКТ.
In vivo показано сохранение активности инсулина в процессе инкапсулирования белка.
После перорального введения микрокапсулированного гормона крысам со стрептозотоцининдуцированным диабетом продемонстрировано наличие инсулина человека в крови и гипогликемическое действие в низких дозах 10 и 25 МЕ/кг.
Для характеристики микрочастиц разработана простая спектрофотометрическая методика определения концентрации хитозана в смесях с белками и декстрансульфатом. Показана применимость методики для определения хитозана в смесях при условии независимого определения концентрации белка.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Пятой и Шестой Курчатовских молодежных научных школах (Москва, 2007; 2008), XV и XVII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов (Москва, 2008; 2010), 9, 10 и 11 Международных конференциях Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Ставрополь, 2008; Нижний Новгород, 2010; Мурманск, 2012), V и VI Московских международных конгрессах Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2009;
2011), выставке инновационных проектов Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2009), 2nd PharmSciFair (Ницца, Франция, 2009), Young pharmaceutical scientists meet in Nice (Ницца, Франция, 2009), International conference Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications (Архангельск, 2009), Первом и Втором Международных симпозиумах Биофарма: от науки к промышленности (Анталия, Турция, 2009;
Ереван, Армения, 2010), the 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Валетта, Мальта, 2010), the 1st Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young ScientistТs School Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues (Ираклион, Греция, 2010), Московской международной научно-практической конференции Фармацевтические и медицинские биотехнологии (Москва, 2012).
По результатам конкурса Российского хитинового общества в 2010 г. работа была удостоена премии имени академика П.П. Шорыгина.
Связь работы с научными программами и проектами. Представленные результаты получены в ходе исследований, проводившихся в рамках Грантов РФФИ № 05-04-48747-а и №09-04-01431-а, участником которых был соискатель.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы, из них 3 статьи и 20 тезисов докладов на конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы (главы 1 - 3), постановки задачи, экспериментальной части (глава 4), результатов и обсуждения (главы 5 - 7), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 244 ссылки. Работа изложена на 157 страницах и содержит 54 рисунка и 27 таблиц.
Список использованных сокращений приведен на странице 20 автореферата.
*** Автор выражает благодарность своему первому научному руководителю, ныне покойной профессору, доктору химических наук Ларионовой Наталье Ивановне.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Разработка метода определения хитозана в смеси с белком и декстрансульфатом Поскольку при получении полиэлектролитных микрочастиц планировалось использовать катионный полисахарид хитозан (Хит), со всей остротой встала проблема определения его содержания в препаратах, содержащих белки и полианионы. В основе разработанной методики лежит известный способ определения первичных аминогрупп, основанный на их взаимодействии с ортофталевым альдегидом (о-ФА) и тиольным реагентом N-ацетил цистеином (А) с образованием хромофорных соединений, поглощающих при 340 нм (рис. 1) [Гуранда Д.Т. и др., 2004].
= 340 нм Рис. 1. Схема фотометрической реакции, лежащей в основе методики определения первичных аминогрупп.
Так как молекулы инсулина (Инс) и хитозана содержат первичные аминогруппы, оба компонента участвуют в фотометрической реакции. Предварительно установив концентрацию белка независимым методом и рассчитав спектрофотометрически суммарное содержание инсулина и хитозана в анализируемом образце, определяли концентрацию хитозана в системе.
При проведении реакции в 0,2 М боратном буферном растворе, pH 9,6, и одинаковой молярной концентрации аминогрупп оптическая плотность хромофорного соединения с инсулином была втрое выше, чем с хитозаном. При рН 8,9 чувствительность метода к аминогруппам понижалась, а вклад инсулина в значение оптической плотности хромофорных соединений уменьшался (рис. 2).
1,Хитозан 400 кДа 1,D-глюкозамин 1,Инсулин 1,0,0,0,0,0,0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,с, мг/мл Рис. 2. Градуировочные графики определения концентрации хитозана, инсулина и D-глюкозамина по спектрофотометрической методике. 0,2 М боратный буфер, pH 8,9, [о-ФА] = 410-3 М, [А] = 2,610-3 М, 0,25 М NaCl, время инкубации 1 ч.
Введение в реакционную смесь анионного полисахарида декстрансульфата (ДС) сопровождалось понижением оптической плотности, причем рассчитанное содержание хитозана оказывалось в 2,5 - 3 раза меньше ожидаемого. Для подавления электростатических взаимодействий декстрансульфата с хитозаном и белком анализ проводили в 0,25 М NaCl.
Нижний предел определения хитозана составил около 10 мкг/мл.
Концентрацию хитозана в модельной смеси, состоявшей из инсулина и декстрансульфата, рассчитывали по формуле:
мг/мл, где: tgИнс и tgХит - тангенс угла наклона градуировочного графика соответственно для инсулина и хитозана, [Инс] - концентрация инсулина, мг/мл; Асмеси - значение оптической плотности модельной смеси за вычетом оптической плотности реагента при 340 нм после 1 ч инкубации.
Таблица 1. Результаты определения концентрации хитозана в модельных смесях по разработанной методике.
Состав смеси, мг/мл Определенное содержание Погрешность Инс ДС Хит хитозана, мг/мл 0,460 0,170 0,085 0,090 +6 % 0,125 0,040 0,080 0,086 +7 % 0,125 0,040 0,040 0,038 -5 % A3Рассчитанная таким образом концентрация хитозана отличалась от реальной не более чем на 7 % в трех модельных смесях (табл. 1). Метод использовали для определения содержания хитозана в полиэлектролитных микрочастицах, после их разрушения при рН 12.
2. Полиэлектролитные микрочастицы с рекомбинантными инсулинами В полиэлектролитные микрочастицы включали рекомбинантный инсулин человека и его быстродействующие аналоги аспарт и лизпро, имеющие различия в 28 и 29 положениях В-цепи и менее склонные к образованию гексамеров (табл. 2). Препараты белков предоставлены опытнобиотехнологическим производством Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Таблица 2. Характеристики рекомбинантных инсулинов, использованных для микрокапсулирования.
Инсулин Характеристика Человека Аспарт Лизпро Аминокислотные изменения ProB28, LysB29 AspB28, LysB29 LysB28, ProBМолекулярная масса, Да 5808 5826 58pI 5,35 5,10 5,Микрокапсулирование осуществляли при pH 3,0 в 0,15 М NaCl в два этапа (рис. 3).
Вначале смешением растворов инсулина и полианиона готовили микроагрегаты нерастворимого полиэлектролитного комплекса (белок-полианион), на который затем последовательно адсорбировали поликатион и полианион, получая микрочастицы с заданным числом стадий сорбции полиэлектролитов (s).
Рис. 3. Схема получения инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц.
ПА - полианион, ПК - поликатион, s - число стадий сорбции полиэлектролитов.
Использовали поликатион хитозан (400 кДа, степень деацетилирования 85%, Fluka, Швейцария) и декстрансульфат (500 кДа, 2,3 сульфатных группы на звено, Fluka, Швейцария), выбранный в качестве полианиона по сравнению с альгинатом средней вязкости из-за образования микрочастиц меньшего размера, сохраняющих целостность при pH 6,0.
На первом этапе готовили нерастворимые микроагрегаты (Инс-ДС) при различных соотношениях белок:полианион (табл. 3).
Таблица 3. Характеристика микроагрегатов нерастворимого полиэлектролитного комплекса (инсулин-декстрансульфат).
Инс:ДС Эффективность -потенциал, Средний размер в смеси (вес.) включения Инс, % мВ частиц, мкм 7:1 381 192 35:1 942 71 34:1 983 - 293 5Инверсия знака заряда частиц наступала вблизи соотношения 5:1, а дальнейшее введение декстрансульфата приводило к существенному возрастанию отрицательного заряда. При соотношении 4:1 эффективность включения обоих компонентов была максимальной, средний размер частиц составил 5 мкм, а отрицательный -потенциал поверхности позволял проводить дальнейшую адсорбцию полиэлектролитов. В среднем, с одной молекулой декстрансульфата связывалось около 60 гексамеров инсулина человека.
На втором этапе микроагрегаты нерастворимого комплекса, приготовленные при оптимальном соотношении Инс:ДС = 4:1, обрабатывали растворами полиэлектролитов до достижения числа стадий сорбции от 2 до 4 (табл. 4).
Таблица 4. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц с инсулином.
Число Эффективность Содержание, % масс.
Размер, -потенциал, Микрочастицы стадий включения Инс, Инс ДС Хит мкм мВ сорбции (s) % (Инс-ДС) 1 973 814 175 - 52 -29(Инс-ДС)-Хит 2 672 633 213 192 62 22(Инс-ДС)-Хит-ДС 3 653 572 285 152 53 -39(Инс-ДС)-Хит-ДС-Хит 4 653 574 263 172 63 29Вторая стадия характеризовалась значительными потерями белка из-за конкурентного воздействия вводимого хитозана. Будучи более сильным полиэлектролитом, хитозан частично вытеснял инсулин из его комплекса с декстрансульфатом, образуя более стабильный полиэлектролитный комплекс (ДС-Хит). Последующие стадии обработки микрочастиц полиэлектролитами практически не оказывали влияния на эффективность включения белка.
Содержание полиэлектролитов в комплексах возрастало с каждой стадией сорбции, а -потенциал микрочастиц менял знак в зависимости от того, какой полиэлектролит использовали последним.
По данным конфокальной и растровой электронной микроскопий (рис. 4) микрочастицы представляли собой образования неправильной формы среднего размера 2 - 10 мкм. Размер и вид частиц мало зависели от числа стадий сорбции полиэлектролитов, и они повторяли форму микроагрегатов (Инс-ДС), на которых были сформированы.
А Б Рис. 4. Конфокальная (А) и растровая электронная (Б) микрофотографии инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц (s = 4), образованных с использованием декстрансульфата и хитозана.
По величине и знаку -потенциала можно судить о полноте сорбции полиэлектролитов и проявлении мукоадгезивных свойств микрочастиц. Благодаря концевым остаткам сиаловых кислот мукополисахаридов слизистая тонкого кишечника заряжена отрицательно.
Соответственно, положительный заряд микрочастиц, покрытых хитозаном (s = 2, 4), должен способствовать проявлению их мукоадгезивных свойств. Поскольку микрочастицы, полученные на второй стадии сорбции (s = 2), частично высвобождали белок в кислых средах, для дальнейших исследований отобрали более стабильные частицы с четырьмя стадиями сорбции (s = 4), в которых соотношение Инс:ДС:Хит составляло 3,5:1,5:1. Суспензия микрочастиц оставалась стабильной во время хранения при 4 С, а после лиофильного высушивания микрочастицы легко ресуспендировались в 0,15 М NaCl при pH 3,0, восстанавливая первоначальные форму и размер.
Аналогичным образом готовили полиэлектролитные микрочастицы, содержащие лизпро и аспарт. Несмотря на более кислое значение pI аспарта (табл. 2), различия инсулинов не привели к заметным изменениям состава, -потенциала и размера микрочастиц (табл. 5).
Таблица 5. Характеристики полиэлектролитных микрочастиц (s = 4) из декстрансульфата и хитозана с включенными рекомбинантными инсулинами.
Содержание, % масс.
Эффективность -потенциал, Средний размер Инсулин включения, % мВ частиц, мкм Белок ДС Хит Человека 653 574 263 172 293 6Аспарт 688 562 271 163 333 5Лизпро 643 571 262 173 303 53. Включение ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы Для защиты доставляемого инсулина от действия протеаз тонкого кишечника использовали хорошо известные белковые ингибиторы протеаз (ИП), к которым относятся апротинин (Апр), ингибитор типа Баумана-Бирк (ИББ) и овомукоид (Овм) (табл. 6). Ингибиторы различались значением изоэлектрической точки (щелочной апротинин, кислые ИББ и овомукоид), молекулярной массой (ИББ и апротинин по размеру примерно соответствуют мономеру инсулина, а овомукоид - гексамеру), количеством активных центров (соответственно, 1, 2 и 3) и эффективностью подавления активности основных протеаз сока поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина, эластазы).
Таблица 6. Физико-химические свойства ингибиторов протеаз, использованных для микрокапсулирования.
Mw, Ki, M-Белок pI кДа Трипсин -Химотрипсин Эластаза Апротинин 6,5 10,5 610-14 1,510-9 3,510-из легких быка (Апр) Овомукоид 28 3,8 6,110-9 2,210-9 2,410-из утиных яиц (Овм) Ингибитор из сои типа 8 4,2 910-9 6,410-9 210-Баумана-Бирк (ИББ) Исследовали два способа включения ИП в полиэлектролитные микрочастицы, а именно, их использование вместо хитозана на второй стадии сорбции или включение в момент образования нерастворимого комплекса (белок-декстрансульфат).
При первом способе, который изучали на примере апротинина, эффективность включения ингибитора была невысока и составляла всего 102 %. Относительно малая по сравнению с инсулином эффективность иммобилизации может быть вызвана разницей в расположении белков в микрочастице. Количество инсулина, включаемого в комплекс с декстрансульфатом, в среднем пропорционально объему частиц (кубу диаметра), а количество ингибитора, адсорбированного на поверхности уже сформировавшихся частиц, пропорционально площади (квадрату диаметра). По-видимому, по той же причине затруднен контроль соотношения Инс:ИП в частицах, различающихся по размеру.
Включение овомукоида в комплекс с декстрансульфатом при соотношении Инс:Овм = 20:1 составило лишь 242 %, что вчетверо уступает эффективности включения инсулина.
Относительно низкое значение pI = 3,8 этого гликопротеина, которое лишь незначительно отличается от pH = 3,0 среды приготовления микрочастиц, обуславливает сравнительно небольшой положительный заряд белка и, как следствие, слабое взаимодействие с полианионом.
Из-за низкой эффективности включения овомукоид в дальнейших экспериментах не использовали.
Ингибиторы апротинин и ИББ с более высокими значениями pI формировали комплексы при весовых соотношениях Инс:ИП от 40:1 до 10:1. При этом эффективность включения ингибиторов в комплекс составила 97 - 99 %, что близко к эффективности включения инсулина (табл. 4).
Таблица 7. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц (s = 4) с инсулином и ингибиторами протеаз, включенными на стадии образования нерастворимого комплекса (белокдекстрансульфат).
Инс:ИП Эффективность Содержание, Ингибитор (масс.) включения, % % от массы протеаз При В частицах Инс ИП Инс ИП ДС Хит получении - - - 653 - 574 - 263 1720:1 25,4:1 644 505 545 2,20,2 244 20Апр 10:1 13,4:1 625 465 524 3,90,4 276 1740:1 37,9:1 624 657 565 1,50,2 255 18ИББ 20:1 19,6:1 606 616 526 2,70,3 305 15Микрочастицы s = 4 (табл. 7), полученные адсорбцией полиэлектролитов на комплекс декстрансульфата с инсулином и ингибиторами протеаз, обладали положительным -потенциалом (около +30 мВ) и размером 1 - 10 мкм, что соответствовало тем же характеристикам частиц с инсулином (табл. 4). Как и ранее, основные потери наблюдались на стадии сорбции хитозана на комплекс в результате конкурентного вытеснения белка, причем апротинин вытеснялся сильнее, чем ИББ или инсулин. Эффективность включения в микрочастицы инсулина и ИББ практически совпадала, составляя величину порядка 60 %, тогда как для апротинина она была несколько ниже. Состав компонентов в микрочастицах практически не менялся и составлял 52 - 58 % инсулина, 24 - 30 % декстрансульфата и 14 - 20 % хитозана.
Содержание апротинина и ИББ варьировалось от 1,5 до 4 %, возрастая с увеличением количества ингибитора, использованного при образовании комплекса.
4. Высвобождение белков из полиэлектролитных микрочастиц Кинетику высвобождения рекомбинантных инсулинов из микрочастиц (s = 4) изучали в условиях, имитирующих прохождение ЖКТ человека натощак (рис. 5А). Частицы выдерживали 2 ч при pH 1,1, соответствующем кислой среде желудка, 2 ч при pH 6,0, имитирующем верхние отделы тонкого кишечника, и, наконец, 4 ч при pH 7,4, характерном для средних и нижних отделов тонкого кишечника. Кривые высвобождения обоих аналогов инсулина оказались практически идентичными кривой высвобождения инсулина человека. Инсулины не выделялись из частиц при pH 1,1, оставаясь защищенными от агрессивной среды желудка. При pH 6,наблюдалось весьма незначительное (не более 2 %) высвобождение белка, тогда как при pH 7,оно протекало интенсивно, составляя 90 % за 1 ч с постепенным высвобождением остатков гормона в течение последующих 3 ч.
100 А Б pH 1,1 pH 6,0 pH 7,pH 1,1 pH 6,0 pH 7,Время, ч Инс 0 2 4 6 -Аспарт -Лизпро --0 2 4 6 Время, ч Рис. 5. Кинетика высвобождения рекомбинантных инсулинов (А) и изменение -потенциала полиэлектролитных микрочастиц (Б) в условиях, моделирующих прохождение желудочнокишечного тракта человека.
Параллельно изучению высвобождения инсулина измеряли -потенциал поверхности микрочастиц (рис. 5Б), который оставался практически неизменным и равным +30 мВ при pH 1,и менял знак заряда на противоположный при pH 6,0 (-20 мВ). В слабокислых средах при значениях рН близких рКа хитозана и pI инсулина, основной вклад в заряд частиц вносит полианион декстрансульфат. При pH 7,4, когда инсулин приобретал более высокий отрицательный заряд и выделялся в раствор, -потенциал остатков полиэлектролитных микрочастиц становился сильно отрицательным (-40 мВ), что должно способствовать их удалению с отрицательно заряженной поверхности слизистой тонкого кишечника.
Инсулин из микрочастиц с ингибиторами протеаз при моделировании прохождения ЖКТ (рис. 6) высвобождался так же, как и из частиц без ингибиторов (рис. 5А). Ингибиторы не высвобождались при pH 6,0, т.е. в условиях, соответствующих кислотности верхних отделов потенциал, мВ Высвобождение белка, % кишечника, где концентрация протеолитических ферментов, выделяемых поджелудочной железой, наиболее высока. При значении pH 7,4 скорости высвобождение инсулина и ИББ совпадали, а апротинин выделялся медленнее.
11А Б рН 1,1 рН 6,0 рН 7,рН 1,1 рН 6,0 рН 7,Инс Инс 40 Апр 40 ИББ 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 Время, ч Время, ч Рис. 6. Кинетика высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и апротинин (А) или ингибитор типа Баумана-Бирк (Б) в условиях, моделирующих прохождение желудочно-кишечного тракта человека.
С помощью гель-фильтрации исследовали форму высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц при pH 7,4, соответствующем нижним отделам тонкого кишечника (рис. 7А). Все рекомбинантные инсулины, высвободившиеся из микрочастиц, удерживались в колонке одинаковое время с соответствующими нативными гормонами, то есть выделялись из микрочастиц в несвязанном с полиэлектролитами виде. По сравнению с инсулином человека время удерживания в колонке инсулинов лизпро и аспарт было меньше, что указывает на их присутствие в виде мономеров. Из результатов анализа ингибиторов протеаз, высвободившихся из микрочастиц (рис. 7Б) следует, что ИББ, аналогично инсулину, выделяется как свободный белок, а апротинин - в виде высокомолекулярного полиэлектролитного комплекса с декстрансульфатом.
Человека Инс Апр А Б 60 Аспарт ИББ Лизпро 50 Апр из м/ч Инс из м/ч ИББ из м/ч Аспарт из м/ч ДС (500 кДа) Лизпро из м/ч 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12 Объем, мл Объем, мл Рис. 7. Данные гель-фильтрации белков и декстрансульфата в растворе и после высвобождения из полиэлектролитных микрочастиц с рекомбинантными инсулинами (А) и с ингибиторами протеаз (Б). Сефадекс G-50sf, pH 7,4. М/ч - микрочастицы.
Высвобождение, % Высвобождение, % Доля фракции, % Доля фракции, % 5. Мукоадгезивные свойства полиэлектролитных микрочастиц Мукоадгезивные свойства оценивали по способности микрочастиц сорбировать муцин, представляющий собой высокомолекулярный гликопротеин (до 2103 кДа), богатый сиаловыми кислотами (pI 2,0 - 3,0) и являющийся основным компонентом слизистой кишечника (табл. 8). С возрастанием количества муцина до 200 мкг/мг частиц его связывание возрастало, а затем оставалось практически неизменным. Насыщение поверхности микрочастиц муцином подтверждалось изменением -потенциала частиц на отрицательный (около -40 мВ).
Таблица 8. Адсорбция муцина полиэлектролитными микрочастицами с инсулином человека при рН 6,0.
Количество добавленного муцина, мкг/мг частиц Число стадий 100 200 300 4сорбции (s) Адсорбция муцина, мкг/мг частиц 3 181 248 227 224 451 506 484 53Микрочастицы s = 3, поверхность которых имеет отрицательный заряд, связывали вдвое меньшее количество муцина по сравнению с микрочастицами s = 4, покрытыми катионным хитозаном. Адсорбция муцина микрочастицами s = 4, содержащими инсулины человека, аспарт и лизпро, составила соответственно 506, 366 и 461 мкг/мг высушенных частиц. Следует отметить, что мукоадгезивность полиэлектролитных микрочастиц была практически идентична мукоадгезивности частиц схожих размеров (~ 50 мкг/мг частиц, 3 - 12 мкм), полученных распылительной сушкой и состоящих полностью из хитозана [He P. et al., 1998].
Установлено, что присутствие муцина (80 мкг/мл) во всех растворах, использованных для моделирования прохождения ЖКТ (условия аналогичны рис. 5А), лишь незначительно увеличило высвобождение белка при pH 1,1 и 6,0 (до 10 % за первые 4 ч).
6. Са2+-связывающая способность полиэлектролитных микрочастиц Известно, что уменьшение концентрации ионов Са2+ вблизи эпителия кишечника приводит к раскрытию плотных клеточных контактов (epithelial cell tight junctions, ПКК) и увеличению проницаемости эпителия для лекарственных веществ [Langguth P. et al., 1994].
Полиэлектролитные микрочастицы, покрытые хитозаном (s = 4), были способны связывать 4,4 мкг Са2+/мг частиц, что в 2,5 раза меньше по сравнению с микрочастицами, покрытыми декстрансульфатом (s = 3). Разница объяснима тем, что связывание Са2+ хитозаном осуществляется за счет свободной электронной пары на атоме азота, тогда как связывание декстрансульфатом происходит за счет сильных электростатических взаимодействий двухзарядного катиона Са2+ с отрицательно заряженными сульфатными группами полианиона.
После инкубации микрочастиц в условиях, моделирующих прохождение ЖКТ, количество Са2+, сорбированного частицами s = 4, возросло от 4,4 мкг до 10,6 мкг/мг, т.е. достигло аналогичной величины для частиц с s = 3. Как уже отмечалось, многоступенчатая инкубация влияла на -потенциал микрочастиц (рис. 6). Вероятно, на конечной стадии при pH 7,4 часть отрицательно заряженных молекул декстрансульфата выходит на поверхность частиц, внося свой вклад в их Са2+-связывающую способность.
Раскрытие ПКК эпителия тонкого кишечника происходит при снижении концентрации Са2+ на 4 мкг/мл [Kassab F. Jr et al., 2002]. Микрочастицы s = 4 массой 1 мг при прохождении ЖКТ могут связать 10,6 мкг Са2+ и понизить концентрацию Са2+ на 4 мкг/мл в объеме 2,5 мл, что в 100 раз превышает объем самих частиц в набухшем состоянии ( ~ 25 мкл).
7. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц от протеолитических ферментов В работе показано, что благодаря составу и строению полиэлектролитные микрочастицы способны уменьшать активность основных протеолитических ферментов тонкого кишечника (трипсина, химотрипсина) одновременно за счет следующих воздействий: связывания протеаз на поверхности микрочастиц, ингибирования протеаз декстрансульфатом, высвобождающимся из микрочастиц, и уменьшения активности трипсина за счет связывания Са2+.
Способность микрочастиц защищать инсулин человека от протеолиза исследовали в трех средах, моделирующих соки желудка, поджелудочной железы и средних отделов тонкого кишечника при концентрации гормона 0,5 мг/мл (табл. 9). Анализ расщепления белка проводили совместно с сотрудником Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, к.х.н.
Зоровым И.Н. методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке С (4250 мм) с детекцией при 210 нм по модифицированной методике [Sarmento B. et al., 2006].
Остальные компоненты микрочастиц анализу не мешали, так как имели сравнительно низкую концентрацию и отличались по времени удержания в колонке. Деградацию инсулина оценивали, сравнивая площади пика белка до и после инкубации.
Таблица 9. Модельные среды различных отделов желудочно-кишечного тракта человека.
Моделируемая среда Условия Пепсин 2,88 ед./мл, Сок желудка pH 1,2, 37С Трипсин, 700 БАЭЭ ед./мл, химотрипсин, 4 БTЭЭ ед./мл, Сок поджелудочной железы pH 7,1, 37С Просвет нижних отделов Трипсин, 140 БТЭЭ-ед./мл, тонкого кишечника pH 7,8, 37С В условиях, соответствующих желудочному соку, пепсин расщеплял инсулин человека в растворе на 99 % за 1 ч, тогда как микрокапсулированный инсулин не высвобождался из микрочастиц. После разрушения микрочастиц установлено, что только 2 % гормона подверглось деградации. В условиях сока поджелудочной железы, содержащего трипсин и химотрипсин в высоких концентрациях, за 1 ч происходил полный гидролиз инсулина человека в растворе и 60 % микрокапсулированного гормона (рис. 8А). Следует учитывать, что из-за разбавления и переваривания высокие концентрации протеаз сохраняются в тонком кишечнике только короткое время. В условиях просвета нижних отделов тонкого кишечника гидролиз инсулина в растворе за 4 ч составил 63 %, тогда как микрокапсулированный инсулин сохранился более чем наполовину (рис. 8Б).
100 92 1А Б 180 57 60 40 20 0 Раствор Микрочастицы Раствор Микрочастицы Инс Инс:Апр 10:1 Инс:ИББ 40:1 Инс Инс:Апр 20:1 Инс:ИББ 40:Инс Инс:Апр = 10:1 Инс:ИББ = 40:1 Инс Инс:Апр = 20:1 Инс:ИББ = 40:Рис. 8. Влияние ингибиторов протеаз на расщепление инсулина человека в растворе и в полиэлектролитных микрочастицах (0,5 мг/мл) в условиях сока поджелудочной железы, 1 ч (А) и просвета нижних отделов тонкого кишечника, 4 ч (Б). Подробные характеристики сред приведены в табл. 9.
Микрокапсулирование инсулина человека позволило значительно сократить, но не предотвратить полностью протеолиз гормона в тонком кишечнике. Поэтому в тех же средах исследовали деградацию микрочастиц с инсулином, содержащих ингибиторы протеаз при весовом соотношении Инс:ИП = 10:1 и 20:1 для апротинина и 40:1 для ИББ. Для контроля использовали растворы инсулина и ингибиторов, приготовленные при тех же соотношениях. В условиях сока поджелудочной железы в микрочастицах ИББ при соотношении Инс:ИП = 40:более эффективно предотвращал деградацию гормона, чем апротинин при соотношении 10:(рис. 8А). Находясь в растворе в тех же соотношениях, апротинин за счет большего количества оказывал более выраженное защитное действие. По-видимому, при высокой концентрации протеаз и относительно коротком периоде инкубации определяющую роль играет различие в кинетике высвобождения инсулина и ингибитора протеаз из микрочастиц. Апротинин выделялся Недеградированный инсулин, % Недеградированный инсулин, % из микрочастиц медленнее инсулина, тогда как выделение ИББ происходило одновременно с инсулином (рис. 6), делая действие ИББ более эффективным. Уменьшение соотношения Инс:ИББ в микрочастицах от 40:1 до 20:1 приводило к росту количества недеградированного гормона от 72 до 99 % (рис. 8А, 9).
В условиях длительного воздействия трипсина в нижних отделах тонкого кишечника, наличие ингибиторов протеаз в растворе ослабило протеолиз инсулина человека на 40 - 45 %, а включение аналогичных количеств ингибиторов в микрочастицы полностью защитило гормон от протеолиза (рис. 8Б).
1Человека Аспарт Лизпро Микрочастицы без ингибитора Микрочастицы с ИББ (20:1) Рис. 9. Протеолиз микрокапсулированных рекомбинантных инсулинов в условиях сока поджелудочной железы, 1 ч. Подробно условия см. табл. 9.
Быстродействующие аналоги инсулина, высвобождающиеся из микрочастиц в виде мономеров (рис. 7А), были подвержены гидролизу под действием протеаз в большей степени по сравнению с инсулином человека. В условиях, соответствующих соку поджелудочной железы, инсулины аспарт и лизпро в растворе были гидролизованы практически полностью, тогда как наличие в микрочастицах ИББ в соотношении Инс:ИББ = 20:1 ослабило действие протеаз соответственно на 48 и 43 % (рис. 9) по сравнению с микрочастицами без ингибитора.
8. Исследование биологического действия микрокапсулированного инсулина Эксперименты in vivo проводили совместно с сотрудником НИИ Физико-химической медицины, д.б.н. Михальчик Е.В. и сотрудником Эндокринологического научного центра, проф., д.б.н. Старосельцевой Л.К.
Для оценки сохранности биологической активности инсулина, включенного в полиэлектролитные частицы, здоровым кроликам шиншилла (самцы, 2,5 - 3,0 кг) подкожно вводили препараты инсулина (частицы s = 4 или раствор гормона в 0,15 М NaCl, pH 3,0) в дозе 4 МЕ/кг (рис. 10). В обоих случаях через 1 ч после инъекции наблюдали снижение уровня Недеградированный инсулин, % глюкозы в крови животных на 40 %. Сопоставление уровней снижения глюкозы инсулином в составе микрочастиц и инсулином в растворе показало сохранение биологической активности гормона в процессе микрокапсулирования.
1Микрочастицы с Инс 14 Контроль Контроль 20 Инс в растворе Микрочастицы с Инс 0 30 60 90 120 150 10 1 2 3 4 5 Время, мин Время, ч Рис. 10. Гипогликемическое действие Рис. 11. Изменение уровня инсулина человека в препаратов инсулина при подкожном крови крыс с диабетом после перорального введении здоровым кроликам в дозе 4 МЕ/кг введения микрокапсулированного инсулина в (n 4). Контроль - раствор 0,15 M NaCl, дозе 100 МЕ/кг (n = 6). Контроль - раствор pH 3,0. 0,15 M NaCl, pH 3,0.
Эффективность действия микрокапсулированного инсулина при пероральном введении изучали на модели стрептозотоцин-индуцированного диабета у крыс Вистар (самцы, 250-350 г).
Экспериментальные группы включали в себя животных с подтвержденным диабетом (уровень глюкозы в крови натощак составлял не менее 13 мМ через 7 и 14 дней после введения стептозотоцина в дозе 50 мг/кг веса животного).
При свободном доступе животных к еде, т.е. в условиях, когда перорально введенный в дозе 100 МЕ/кг инсулин подвергался действию всех протеолитических ферментов ЖКТ, определяли концентрацию инсулина человека в крови крыс методом иммуноферментного анализа. С использованием набора Insulin ELISA Monobind был зарегистрирован рост содержания инсулина в плазме животных через 1 и 6 ч на 1,5 и 2,9 нг/мл соответственно (рис. 11). При этом показатели уровня содержания инсулина в крови животных контрольной группы колебались в пределах случайного разброса. Это свидетельствует о проникновении микрокапсулированного инсулина в кровоток при пероральном введении.
Использованная при пероральном введении доза инсулина 100 МЕ/кг соответствовала 3,5 мг/кг, т.е. около 100 нг/мл плазмы крови (средний объем крови у крыс 6010 мл/кг, процентное содержание плазмы в крови 55 %). Таким образом, обнаруженное в крови через 6 ч после введения количество свободного инсулина (2,9 нг/мл) составляет 3 % от введенной дозы.
Эта величина была относительно высока, поскольку часть инсулина могла быть уже утилизирована, другая часть еще не поступила из ЖКТ животного, а еще часть белка связана с рецепторами в организме крысы.
Глюкоза в крови, % Инсулин человека, нг/мл Гипогликемическое действие инсулина в модели диабета у крыс было исследовано при введении натощак микрокапсулированного препарата в дозах 10 и 25 МЕ/кг (рис. 12). Обе дозы вызывали заметное снижение уровня глюкозы в крови через 2 и 4 ч после введения препарата.
Для дозы 25 Ед/кг в этих точках отличие от контрольной группы было достоверным (по критерию Манна-Уитни). При этом максимальное снижение наблюдали через 2 ч (при дозе 25 МЕ/кг уровень глюкозы падал на 50 %), а в течение последующих 10 ч показатели опытных групп постепенно приближались к показателям контрольной группы животных, получавших перорально 0,15 М раствор NaCl (pH 3,0). Максимальное снижение уровня глюкозы в крови при дозе 10 МЕ/кг составляло 38 %.
Для оценки биодоступности микрокапсулированного инсулина крысам в группе сравнения подкожно вводили раствор инсулина в дозе 2,5 МЕ/кг. Биодоступность перорально введенного микрокапсулированного инсулина, рассчитанная как отношение площадей над кривыми уровня глюкозы в плазме крови после перорального введения препарата и подкожного введения раствора инсулина с учетом различия в дозах, составила 10,7 %. Данное значение относительно велико и сравнимо с биодоступностью коммерческого препарата ингаляционного пульмонарного инсулина Exubera, равной 10 % [Cefalu T.W. et al, 2001].
111* * Контроль Микрочастицы с Инс, 10 МЕ/кг, перорально Микрочастицы с Инс, 25 МЕ/кг, перорально Инс 4 МЕ/кг, подкожно 0 3 6 9 12 15 18 21 Время, ч Рис. 12. Гипогликемическое действие препаратов инсулина на крысах с диабетом (n 5).
Контроль - раствор 0,15 M NaCl, pH 3,0.
* - статистически значимое отличие группы, получившей перорально 25 МЕ/кг микрокапсулированного инсулина, от контрольной (p < 0,05).
9. Принцип действия мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц с инсулином при пероральном применении Обобщая полученные результаты, можно сформулировать принцип действия полученных микрочастиц, содержащих инсулин и ингибиторы протеаз (s = 4) (рис. 13). Микрочастицы защищают капсулированный белок от воздействия кислой среды желудка, содержащей пепсин. В Глюкоза в плазме крови, % среде тонкого кишечника положительный -потенциал микрочастиц усиливает их адгезию к отрицательно заряженной поверхности эпителия.
С увеличением pH по мере продвижения по кишечнику происходит одновременное высвобождение из микрочастиц ингибитора и инсулина. Локальное выделение ингибитора защищает белок от воздействия протеаз сока поджелудочной железы, не нарушая процесса пищеварения в целом. Поскольку мукоадгезивность микрочастиц обеспечивает их прочный и продолжительный контакт со слизистой, инсулин высвобождается в непосредственной близости от места сорбции, обеспечивая высокий градиент концентрации благодаря его большому содержанию в частицах.
Рис. 13. Схема действия мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и ингибитор протеаз.
Как известно, в месте контакта с эпителием хитозан за счет специфических взаимодействий с белками ПКК (окклюдином, актином и ZO-1) способен обратимо повысить межклеточную проницаемость [Dodane V. et al., 1999]. Ca2+-Связывающее действие микрочастиц усиливает раскрытие ПКК [Kriwet B. et al., 1996] и ослабляет адгезионные контакты, обеспеченные кадгерином [Avdeef A., 2001]. Одновременное действие этих факторов должно способствовать эффективному транспорту белка.
Размеры межклеточного пространства в эпителии кишечника в норме составляют от 1 до 5 нм [Salama N.N. et al., 2006], а ослабление плотных клеточных контактов должно их увеличить.
Поэтому вероятность парацеллюлярного транспорта мономерных аналогов инсулина, имеющих средний размер 2,3 нм, выше, чем у гексамера инсулина человека размером 5 нм. Мономерные формы инсулина более подвержены протеолизу, однако использование ингибиторов позволяет в значительной мере их защитить.
При высвобождении белков поверхностный заряд остатков микрочастиц, содержащих хитозан и декстрансульфат, меняется с положительного на отрицательный. Это должно способствовать их удалению с поверхности слизистой и дальнейшему выведению из кишечника.
Список использованных сокращений:
s - стадия сорбции полиэлектролитов, Апр - апротинин, АЦ - - N-ацетил-L-цистеин, ДС - декстрансульфат натрия, ЖКТ - желудочно-кишечный тракт, ИББ - ингибитор трипсина и химотрипсина из сои типа Баумана-Бирк, Инс - инсулин человека, ИП - ингибитор протеаз, Овм - овомукоид из утиных яиц, о-ФА - ортофталевый альдегид, ПКК - плотные контакты клеток эпителия, Хит - хитозан.
ВЫВОДЫ 1. Разработан и оптимизирован метод получения микрочастиц с рекомбинантными инсулинами (человека, аспарт и лизпро) путем последовательной адсорбции хитозана и декстрансульфата на микроагрегатах нерастворимого полиэлектролитного комплекса.
Частицы характеризуются небольшими размерами 3 - 9 мкм, высокой эффективностью включения (62 - 68 %) и значительным содержанием (57 - 63 %) инсулина.
2. Выявлено мультифункциональное действие микрочастиц с четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов на факторы, повышающие биодоступность микрокапсулированного белка при пероральной доставке. Действие состоит в защите от агрессивной среды желудочного сока, проявлении мукоадгезивных свойств, высвобождении микрокапсулированных инсулинов в условиях тонкого кишечника, связывании ионов кальция и уменьшении протеолиза белков под действием ферментов желудочно-кишечного тракта человека.
3. Впервые в состав полиэлектролитных микрочастиц одновременно включены мономерные инсулины и различные белковые ингибиторы протеаз. Наличие в микрочастицах 2 - 3 % соевого ингибитора типа Баумана-Бирк полностью предотвращает деградацию инсулина человека протеазами тонкого кишечника человека и значительно ослабляет деградацию мономерных инсулинов аспарт и лизпро, которые являются более перспективными для пероральной доставки.
4. В биологических экспериментах подтверждено сохранение активности инсулина при его включении в микрочастицы. По гипогликемическому действию при подкожном введении кроликам микрокапсулированный инсулин не отличался от инсулина в растворе в той же дозе (4 МЕ/кг). Однократное пероральное введение микрокапсулированного инсулина в низких дозах (10 и 25 МЕ/кг) крысам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом вызывало пролонгированный (до 12 ч) гипогликемический эффект. При этом биодоступность микрокапсулированного инсулина составила 10,7 %. Иммуноферментный анализ показал рост содержания инсулина в крови крыс при пероральном введении микрокапсулированного инсулина.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Pechenkin M.A., Balabushevich N.G., Zorov I.N., Staroseltseva L.K., Mikhalchik E.V., Izumrudov V.A., Larionova N.I. Design, in vitro and in vivo characterization of chitosan - dextran sulfate microparticles for oral delivery of insulin // Journal of Bioequivalence & Bioavailability.
2011. V. 3. No 10. Р. 244 - 250.
2. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Зоров И.Н., Шибанова Е.Д., Ларионова Н.И.
Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантный инсулин человека и его аналоги Аспарт и Лизпро // Биохимия. 2011. Т. 76. № 3. С. 400 - 405.
3. Larionova N.I., Zubaerova D.K., Guranda D.T., Pechyonkin M.A., Balabushevich N.G.
Colorimetric assay of chitosan in presence of proteins and polyelectrolytes by using ophthalaldehyde // Carbohydrate Polymers. 2009. V. 75. No 4. P. 724 - 727.
4. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Старосельцева Л.К., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И.
Хитозан-содержащие наноструктурированные микрочастицы для пероральной доставки инсулина // Материалы 11-ой Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Мурманск, 25 - 29 июня 2012. С. 261 - 265.
5. Печенкин М.А., Балабушевич Н.Г., Зоров И.Н., Изумрудов В.А., Клячко Н.Л., Кабанов А.В., Ларионова Н.И. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц с ингибиторами протеаз при пероральной доставке белков // Материалы Московской международной научно - практической конференции Фармацевтические и медицинские биотехнологии, Москва, 20 - 22 марта, 2012. С. 55 - 56.
6. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Зоров И.Н., Шибанова Е.Д., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И. Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантный инсулин человека и его аналоги // Материалы VI Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, - 25 марта, 2011. Ч. 1. С. 46 - 47.
7. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Вихорева Г.А., Ларионова Н.И. Хитозан - содержащие наноструктурированные микрочастицы с инсулином // Материалы 10-ой Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Нижний Новгород, 29 июня - 2 июля, 2010. С. 162 - 165.
8. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Михальчик Е.В., Шибанова Е.Д., Ларионова Н.И.
Перспективы использования мукоадгезивных полиэлектролитных микрочастиц с инсулином // Сборник тезисов второго Международного симпозиума Биофарма - 2010: от науки к промышленности, Ереван, Армения, 17 - 20 мая, 2010. С. 7.
9. Pechenkin M.A., Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Polyelectrolyte complex microparticles for oral drug delivery // Proceedings of the 1st Russian - Hellenic Symposium with International Participation and Young ScientistТs School Biomaterials and Bionanomaterials:
Recent Advances Safety and Toxicology Issues, Heraklion, Crete - Greece, May 3 - 9, 2010.
P. 40.
10. Печенкин М.А., Решетняк Б.С. Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки инсулина // Материалы XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов, Химия, Москва, 12 - 15 апреля, 2010. / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов.
[Электронный ресурс] Ч М.: МАКС Пресс, 2010. Ч 1 электрон. опт. диск (CD-ROM); 12 см.
11. Larionova N., Pechenkin M., Balabushevich N., Mikhalchik E. Multifunctional polyelectrolyte complex microparticles for oral protein delivery // Proceedings of the 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Valletta, Malta, March 8 - 11, 2010. # 105.
12. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А. Многофункциональные стимул - чувствительные микро- и наноматериалы для фармации и биотехнологии // Сборник тезисов.
Химический факультет. Выставка инновационных проектов, Москва, 24 ноября, 2009.
С. 73 - 75.
13. Larionova N.I., Balabushevich N.G., Pechenkin M.A., Borzenkova N.V. Nanostructured mucoadhesive multilayer microparticles with pH-triggered protein release as potential oral delivery systems // International conference Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications, Arkhangelsk, Russia, June 19 - 24, 2009. P. 44.
14. Reshetniak B.S., Pechenkin M.A. // Comparison of different multilayer chitosan - dextran sulfate microparticles containing insulin. Composition, Z-potential & Ca2+ binding // International conference Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications, Arkhangelsk, Russia, June 19 - 24, 2009. P. 84.
15. Pechenkin M.A., Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Development, characterization and in vivo evaluation of polyelectrolyte microparticles for oral insulin delivery // International conference Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications, Arkhangelsk, Russia, June 19 - 24, 2009. P. 133.
16. Pechenkin M.A., Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Dextran sulfate - chitosan microparticles as an oral insulin delivery system: characterization and in vivo evaluation // Book of Abstracts. 2nd PharmSciFair, Nice, France, June 8 - 12, 2009. P. 180.
17. Pechenkin M.A., Balabushevich N.G., Larionova N.I. The use of protease inhibitors to improve enzymatic resistance of insulin-loaded pH-sensitive polyelectrolyte microparticles // Young pharmaceutical scientists meet in Nice, Nice, France, June 7 - 8, 2009. P. 31.
18. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Борзенкова Н.В. Мукоадгезивные полиэлектролитные частицы для пероральной доставки белков // Сборник тезисов Международного симпозиума Биофарма - 2009: от науки к промышленности, Анталия, Турция, 25 - 27 мая, 2009. С. 23 - 24.
19. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Ларионова Н.И. Биоадгезивные инсулин-содержащие микрочастицы для перорального применения // Материалы пятого Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 16 - 20 марта, 2009. Ч. 1, С. 54.
20. Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Михальчик Е.В., Печенкин М.А. Исследование биологического действия полиэлектролитной системы доставки инсулина // 6-я Курчатовская молодежная научная школа, Сборник аннотаций, Москва, 17 - 19 ноября, 2008. С. 221.
21. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Зоров И.Н., Ларионова Н.И. Перспективы использования хитозан-содежащих микрочастиц для пероральной доставки белков // Материалы 9-ой Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Ставрополь, 13 - 17 октября, 2008. С. 135 - 138.
22. Печенкин М.А. Получение и свойства полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и соевый ингибитор протеиназ типа Баумана - Бирк // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам Ломоносов - 2008, Химия, Москва, 8 - 11 апреля, 2008. С. 287.
23. Аверин П.С., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Печенкин М.А. Наноструктурированные пероральные системы доставки белка, содержащие ингибиторы протеиназ // 5-я Курчатовская молодежная научная школа, Сборник аннотаций, Москва, 19 - 21 ноября, 2007. С. 137.