Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству  

На правах рукописи

амажапова Галина Петровна

МОРФОЛОГИЯ ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА нерпы байкальской

И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ

ЕЕ ЛИПИДОВ ПРИ РАЗНЫХ ПАТОЛОГИЯХ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Благовещенск - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет

Научный консультант	доктор биологических наук, профессор Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна
Официальные оппоненты:	доктор ветеринарных наук, профессор Кухаренко Наталья Степановна
	доктор биологических наук, профессор Абидуева Елена Юрьевна
	доктор биологических наук, профессор Рядинская Нина Ильинична
Ведущая организация	ФГОУ ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Защита диссертации состоится  30 _ноября_  2011 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГОУ ВПО Дальневосточный государственный аграрный университет в Институте ветеринарной медицины и зоотехнии  в  аудитории  2(а)  5 корпуса  по  адресу:  675005, г. Благовещенск,

ул. Политехническая, 86. E-mail: ivmz_dalgau@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО Дальневосточный государственный аграрный университет.

Автореферат диссертации опубликован на сайте ВАК РФ http//vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан  ____ __________  2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета                                               Самусенко О.Л.

1. Общая характеристика работы

Актуальность работы. Уникальность экологической системы озера Байкал несомненна и признана мировым и российским обществом юридически. В 1996 году озеро и непосредственно примыкающие к нему территории были включены в Список природных объектов Всемирного наследия ЮНЕСКО. В 1999 году принят Закон Российской Федерации Об охране озера Байкал. В связи с этим, значительное внимание ученых и специалистов, работающих на Байкале в последние годы, уделено исследованию загрязнения озера Байкал, в том числе его биоты. По данным двух независимых групп исследователей (Японии и США, 1991-2000 гг.) байкальские воды можно отнести к чистым. Оказалось, что концентрации основных экотоксикантов в водах Байкала по порядку величин были такими же, как найденные в Северном Ледовитом океане, и сопоставимы с теми, которые были найдены в озерах Верхнее и Гурон из системы Великих озер Северной Америки (Грачев М.А., 2002). 

Имеющиеся наблюдения по динамике численности живых организмов на протяжении длительного времени не выявили достоверных изменений населяющих Байкал популяций за время, прошедшее с начала промышленной революции. Можно предполагать, что эти популяции существенно не изменяются и не изменятся под действием химических антропогенных факторов и в ближайшие десятилетия. Регулярный мониторинг фито- и зоопланктона пока не дал информации, которая требовала бы принятия неотложных практических решений (Грачев М.А., 2002). Несмотря на это, никак нельзя рекомендовать его прекращение. Более того, по нашему мнению, необходимо расширение и углубление разработок и исследований по поиску более чувствительных и интегральных методов мониторинга экосистемы озера.

Уникальной особенностью пресноводной экосистемы Байкала является наличие в ней эндемичного байкальского тюленя - нерпы (Pusa (Phoca) sibirica Gmel.), единственного млекопитающего, и, поэтому, высшего звена пищевой цепи. В последние годы биология байкальской нерпы достаточно хорошо изучена, в особенности благодаря работам В.Д. Пастухова (1993) и его учеников (Петров Е.А., 1997; 1998 и др.). Численность нерпы, определенная по методике Пастухова В.Д. (1993) в модификации Петрова Е.А. (1998), после 1972 года варьирует в пределах от 70 до 140 тысяч особей.

Большое внимание общественности к благополучию популяции байкальской нерпы было привлечено осенью 1987 - зимой 1988 гг., так как в это время произошла массовая гибель этих животных. Возникли подозрения, что гибель нерпы вызвана поступившими в Байкал неизвестными ядовитыми веществами. Но применение методов молекулярной биологии позволило однозначно установить, что причиной массовой гибели являлся мoрбилливирус, аналогичный вирусу чумы плотоядных и родственный вирусу кори человека.

В литературе иногда высказываются предположения, что байкальские тюлени в те годы были поражены морбилливирусами по причине ослабления их иммунитета из-за накопления высоких концентраций хлорорганических веществ (Nakata Sh. et al., 1997). Такое предположение имеет право на существование, поскольку известно, что хлорорганические вещества относятся к иммунотоксикантам, так как органами-мишенями являются органы иммунной системы. Однако убедительных доказательств взаимосвязи морбилливирусных эпизоотий с накоплением хлорорганических веществ в тканях животных до настоящего времени не получено.

В этой связи состояние иммунной системы, ответственной за поддержание внутренней среды организма, является чувствительным показателем влияния химического и биологического загрязнения. В настоящее время иммунный статус байкальской нерпы практически остается не изученным. По-прежнему отсутствует четкая картина по морфологии и цитоархитектонике органов иммунной системы. Имеющиеся в литературе данные отрывочны и недостаточны для решения проблем охраны здоровья, сохранения и рационального использования данного вида тюленей.

Для сохранения биоразнообразия и биоравновесия экосистемы озера Байкал популяция байкальской нерпы поддерживается в определенных пределах путем санитарного отлова строго ограниченного количества животных - в пределах от 1-3 до 6 тысяч особей в год. Животное добывается с целью получения меха, а остальная часть (жир и внутренние органы) в лучшем случае направляется на зверофермы. Вместе с тем, ткани байкальской нерпы (подкожное сало и печень) являются перспективными источниками биологически активных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Исследования химического состава показали, что они содержат достаточное количество -6 и -3 ПНЖК в оптимальных соотношениях - 3.19:1 (в печени) и 0.77 (в жире).

Исследованиями многих ученых (Антонов В.Ф., 1982; Vaugn, D.M., 1994; Левачев М.М., 1999; Тутельян В.А., 1999; Погожева А.В., 2004; Wijendran V., Hayes K.C., 2004; Титов В.Н., 2005; Chaplin S., 2005; Sampath H., Ntambi J.V., 2005; Шендеров Б.А., 2008 и др.) доказана роль ПНЖК в поддержании нормальной деятельности клеточных мембран как обязательных компонентов клетки, а также в оптимизации мембранных и других клеточных процессов, и соответственно, в развитии адаптационных реакций при различных патологических состояниях.

Создание супрамолекулярных наноразмерных систем, таких как липосом на основе липидов нерпы, содержащих ПНЖК, решает задачи целенаправленной доставки биологически активных соединений в патологические очаги организма. Наличие тропности и других свойств у липосомальных форм биологически активных веществ и лекарственных препаратов дает ряд преимуществ по сравнению с применением их в интактном виде, что изучено многими учеными (Торчилин В.П., 1982; Грегориадис Г., Аллисон Л., 1983; Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Zhang L. et al., 1997; Каплун А.П. с соавт., 1999; Ramadas M. et al., 2000; Манаенков О.В., 2006; Баллюзек Ф.В. с соавт., 2008; Селина О.Е. с соавт., 2008; Швец В.И. с соавт., 2008; Зайцев С.Ю., 2010 Сейфулла Р.Д., 2010 и др.). Эффективность воздействия липосом обусловлена возможностью их проникновения в ткани и клетки-мишени. Таким путем может быть обеспечена доставка не только полезных для организма липидов, из которых состоит липосомальная мембрана, но и других веществ, транспортируемых липосомами.

Значимость и необходимость исследований по данной работе подтверждается государственной поддержкой в следующих грантах и программах:

- Исследование иммунного статуса байкальской нерпы в системе биомониторинга озера Байкал (гранты по приоритетным направлениям науки для молодых ученых ВСГТУ, 2000 и 2005 гг.);

- Получение гистоморфологических показателей органов иммунной системы байкальской нерпы (Федеральные целевые программы Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки на 1997-2000 гг., 1999 г. и Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы, 2003 г.);

- Разработать способы получения и использования вторичных источников местного сырья животного и растительного происхождения в качестве иммунопротекторов, 1996-2000 гг. и Разработка и исследование эффективности новых липосомальных форм биологически активных веществ, 2003-2005 гг. (Региональная научно-техническая программа Бурятия. Наука и техника);

- Проведение экспедиционных исследований эндемиков озера Байкал как биоиндикаторов его системы (Федеральная целевая программа Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы, 2001 г.);

- Проведение экспедиционных исследований эндемиков озера Байкал (Международный экспедиционный проект СО РАН, 2002 г.);

- Разработка рекомендаций по использованию нетрадиционных индикаторов в практике государственного экологического контроля и мониторинга окружающей среды на основе анализа влияния загрязнений озера Байкал на состояние особо ценных биологических компонентов экосистем (Федеральная целевая программа Экология и природные ресурсы России, подпрограмма Охрана озера Байкал и Байкальской природной территории, 2003 г.);

- РИ-111/001/009 Выполнение разработки метода получения пролипосом, содержащих жир байкальской нерпы (Федеральная целевая научно-техническая программа Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы), 2005 г.;

- Иммуноморфологические особенности организма при воздействии компонентов функционального питания, 2006-2007 гг., Разработка наноформ биологически активных веществ природного происхождения, 2008-2010 гг. (Аналитическая ведомственная целевая программа Развитие научного потенциала высшей школы Мероприятие 1).

Целью настоящей работы явилось исследование морфологии органов иммунной системы и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы, а также оценка эффективности липосом на основе липидов нерпы при различных патологиях.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить гистоморфологические особенности структурной организации органов иммунной системы (тимуса, селезенки, лимфатических узлов) и лимфоидной ткани, ассоциированной со стенками кишечника, байкальской нерпы.

2. Установить особенности развития органов иммуногенеза и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы в постнатальном онтогенезе.

3. Определить характер изменения иммуноморфологических реакций в лимфоидных структурах кишечника байкальской нерпы под влиянием биогенных факторов среды (сапрофитной микрофлоры кишечника и паразитофауны желудочно-кишечного тракта).

4. Исследовать биологическую активность липосом из вторичного липидного сырья байкальской нерпы (покровного жира и жира печени), содержащего уникальное соотношение -6/-3 жирных кислот.

5. Исследовать фармакотерапевтическую эффективность (гепатопротекторное, ранозаживляющее и адаптогенное действие) липосомальных биологически активных средств на основе липидов нерпы.

6. Исследовать возможность использования липосом на основе ПНЖК жира нерпы для повышения эффективности биологически активных средств (пептидного биорегулятора и растительных средств, обладающих противовоспалительным, ранозаживляющим и адаптогенным действиями).

Научная новизна работы.

Впервые исследованы морфология и цитоархитектоника тимуса, селезенки, брыжеечных лимфатических узлов, а также структурных элементов диффузной лимфоидной ткани, ассоциированной со стенками пищеварительного тракта байкальской нерпы (Pusa sibirica Gmel.). Впервые раскрыты особенности строения, возрастные и половые различия органов иммунопоэза байкальской нерпы. Изучены изменения в лимфоидных структурах пищеварительного тракта нерпы, связанные с глистной инвазией и влиянием сапрофитной микрофлоры.

Теоретически обоснована возможность использования ценного по оптимальному содержанию -3 и -6 жирных кислот вторичного липидного сырья (покровного жира и жира печени) байкальской нерпы при создании супрамолекулярных наноразмерных систем. Способы получения липосом, содержащих биологически активные липиды байкальской нерпы, защищены патентами РФ. В модельных экспериментах по воспроизведению различных патологических состояний выявлена биологическая активность и фармакотерапевтическая эффективность разработанных липосомальных средств. Установлена иммуномодулирующая, мембраностабилизирующая, антиоксидантная, гиполипидемическая и противовоспалительная активность липосом на основе липидов нерпы. Выявлено, что липосомальное средство, содержащее липиды нерпы, обладает адаптогенным, гепатопротекторным и ранозаживляющим действиями.

Показано, что применение биологически активных средств в липосомальных структурах, содержащих эссенциальные -3 и -6 жирные кислоты в оптимальном соотношении, способствует усилению фармакологической активности и фармакотерапевтической эффективности исследуемых средств.

Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований содержат сведения по морфологии и клеточному составу некоторых органов иммунной системы уникального пресноводного млекопитающего - байкальской нерпы и могут быть рекомендованы для оценки состояния популяции этого животного в системе биомониторинга экосистемы озера Байкал. Оперативная оценка состояния иммунных органов нерпы позволит разработать меры по сохранению биоразнообразия озера.

Разработаны липосомальные средства с добавлением жира байкальской нерпы, а также липосомальное ранозаживляющее средство на основе липидов нерпы. Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно-профилактических средств нового поколения на основе нанокапсул из вторичных природных липидов и получения липосомальных форм лекарственных средств с использованием триацилглицеролов, содержащих оптимальное соотношение -6/-3 жирных кислот.

Результаты исследований могут быть использованы:

- при написании разделов справочной и учебной литературы по видовой и возрастной сравнительной морфологии и лимфологии;

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по анатомии и гистологии животных на биологических, охотоведческих и ветеринарных факультетах высших учебных заведений.

Теоретические и прикладные результаты работы применяются при чтении курса лекций и проведении лабораторно-практических занятий в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете, изложены в методических указаниях для студентов специальностей Технология мяса и мясных продуктов и Биотехнология, в 2 монографиях, а также выпускных квалификационных и научно-исследовательских работах студентов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности морфологии и цитоархитектоники органов иммунной системы и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы.

2. Онтогенетические особенности структурной организации органов иммуногенеза байкальской нерпы.

3. Иммуноморфологические изменения в лимфоидных структурах пищеварительной системы байкальской нерпы под влиянием биогенных факторов среды как чувствительный показатель состояния иммунной системы организма.

4. Высокая фармакологическая активность и выраженная фармакотерапевтическая эффективность липосомальных средств на основе липидов нерпы при различных патологиях в эксперименте.

5. Усиление биологической активности и повышение фармакотерапевтической эффективности биологически активных средств при включении в липосомальные структуры, полученные на основе жира нерпы, обусловленное действием эссенциальных -3 и -6 жирных кислот и адресной доставкой в организм.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались, обсуждались и одобрены на международных и российских научных конференциях и симпозиумах: Международной конференции молодых ученых От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии (Тверь, 2001); Международной научной конференции Биотехнология на рубеже двух тысячелетий (Саранск, 2001); Международной научной конференции Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами (Улан-Удэ, Улан-Батор, 2004); Международной научно-практической конференции - 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов Биотехнология - 2005 (Пущино, 2005); II Международной научно-технической конференции молодых ученых Актуальные проблемы технологии живых систем (Владивосток, 2007); Четвертом и Шестом Московских международных конгрессах Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2007, 2011); IX Международной конференции Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию проф. И.А. Спирюхова Актуальные вопросы экологической, сравнительной, возрастной и экспериментальной морфологии (Улан-Удэ, 2007); Всероссийской конференции молодых ученых Экология в современном мире: взгляд научной молодежи (Улан-Удэ, 2007); 3rd International Symposium in Chemistry Chemistry and Food Safety-2008 (Ulaаnbaatаr, Mongolia, 2008); Международной научно-практической конференции Биотехнология: Вода и пищевые продукты (Москва, 2008); III Международной научной конференции Traditional Medicine: a current Situation and Perspectives of Development (Ulan-Ude, 2008); Erdos Forum on Development of International Traditional Medicine (Erdos, China, 2009); III Международной научно-технической конференции молодых ученых Актуальные проблемы технологии живых систем (Владивосток, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых Жас-Галым-2009 (Тараз, Казахстан, 2009); Международной школе-семинаре Current Problems of Food Engineering and Biotechnology (Ulan-Ude, 2009); International Conference on Innovation in food and nutrition science (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); I Всероссийской научно-практической конференции Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и дальнего Востока (Улан-Удэ, 2010); XI Международной конференции молодых ученых Пищевые технологии и биотехнологии (Казань, 2010); XIII Международной научно-технической конференции Наукоемкие химические технологии - 2010 (Иваново, 2010); Международной научной конференции Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова (Иркутск, 2010) и других (Иркутск, 1999; Элиста, 2000; Чита, 2000; Улан-Удэ, 2003, 2004; Москва, 2005; Оренбург, 2009).

Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получено 3 патента РФ на изобретения, опубликованы 2 монографии.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 290 страницах, содержит 45 таблиц, 91 рисунок и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 348 источников, из них иностранных авторов - 119.

В соответствии с поставленными задачами диссертационной работы были проведены исследования по схемам, представленным на рисунках 1 и 2.

	Количество исследованных животных
	Возрастные группы байкальской нерпы	Количество животных (самцов /самок)
	Новорожденные особи	19 (9/10)
	Молодые особи	26 (10/16)
	Половозрелые особи	23 (11/12)
	Пожилые особи	19 (10/9)
	Всего	87 (40/47)

Рис. 1. Схема исследования иммунного статуса байкальской нерпы и количество исследованных особей

	Объем проведенных исследований
	Вид проведенного исследования	Исследовано животных (голов) in vivo	Всего проведено исследований in vitro
	1. 1.1	Мыши (250)	50
	1.2	Крысы (90)	-
	1.3	-	100
	2. 2.1	Мыши (200)	50
	2.2	Крысы (80)	-
	2.3	-	100
	2.4	Крысы (60)	-
	2.5	Крысы (30)	-
	3. 3.1	Крысы (50)	-
	3.2	Крысы (60)	-
	3.3	Крысы (30)	-
	4. 4.1	Мыши (250)	50
	4.2	Мыши (250) Крысы (90)	50
	4.3	-	100
	5. 5.1	Крысы (30)	-
	5.2	Крысы (30)	-
	Всего	1300	500

Рис. 2. Схема исследований по экспериментальной оценке эффективности липидов байкальской нерпы

и объем проведенных исследований

2. Материал и методы исследования

2.1. Исследование иммунной системы байкальской нерпы

Исследования структурной организации и клеточного состава органов лимфопоэза байкальской нерпы проводились в Проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного технологического университета и лаборатории функциональной анатомии Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН (г. Москва).

Отбор материала производился от особей байкальской нерпы в ходе комплексных научных экспедиций, приуроченных к промысловой добыче байкальской нерпы, в период с 2000 по 2009 гг. Отлов животных производился 2 раза в год (весенний и осенний периоды) в районе Среднего Байкала.

При исследовании материала учитывалась принадлежность особей байкальской нерпы к той или иной возрастной группе. Возрастные группы выделяли согласно возрастной периодизации байкальской нерпы, предложенной Е.А. Петровым (2003). В соответствии с ней, были выделены следующие возрастные группы особей байкальской нерпы: 1) особи в возрасте 1 месяца, 2) особи в возрасте до 1 года, 3) особи в возрасте от 2 до 4 лет, 4) особи в возрасте от 4 до 12 лет, 5) особи в возрасте от 13 до 19 лет.

У каждой особи для исследований отбирался тимус, селезенка, брыжеечные лимфатические узлы, принимающие лимфу от тонкого кишечника, участки подвздошной кишки с групповыми лимфоидными узелками и участки прямой кишки.

Для исследований использовали материал только от тех особей байкальской нерпы, которые не имели внешних признаков заболеваний и патологических изменений внутренних органов.

Определение возраста животных проводили по роговым валикам на когтях по методу, предложенному Чапским К.К. (1941) и по годовым слоям в тканях зубов (Клевезаль Г.А., Клейненберг С.Е., 1967).

Кусочки органов (объемом 1-2 см3) фиксировали в 10%-ом водном растворе нейтрального формалина и, после стандартной спиртовой проводки, заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон (для морфологической оценки препарата и изучения площадей структурных компонентов). Подсчет клеток проводили на срезах, окрашенных азур-II-эозином. Метод окрашивания клеток метиловым зеленым пиронином по Браше, позволяющий выявить клеточные формы, богатые нуклеиновыми кислотами, использовался для более точной дифференцировки бластных форм лимфоцитов, а также для определения степени зрелости и функциональной активности плазматических клеток.

Изучение микротопографии лимфоидных органов проводили при помощи бинокулярной лупы МБИ-1 (увеличение: ок. х12.5; об. х4.0) методом точечного счета (Глаголева А.А., 1941) в модификации Стефанова С.Б. (1974), позволяющим в относительных величинах определить площади, занимаемые структурными компонентами органа (в % от общей площади среза). Для измерения применяли стандартную сетку с шагом 1 мм.

При изучении цитоконструкции структурно-функциональных компонентов органов иммунной системы животного подсчет клеток проводили при помощи микроскопа МБИ-3 при увеличении объектива - х90 под масляной иммерсией по методу Стефанова С.Б. (1974) с использованием 25-узловой морфометрической сетки с шагом 10 мкм, вмонтированной в окуляр (х10) микроскопа. Подсчитывали следующие виды клеток: бластные формы, большие, средние и малые лимфоциты, клетки с картинами митоза, незрелые и зрелые плазматические клетки, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, эпителио-ретикулоциты, макрофаги, деструктивно измененные клетки. Подсчет клеток проводили на условной единице площади  гистологического  среза

(880 мкм2). Полученный цифровой материал подвергали компьютерной статистической обработке по программе Statistika 6.0 и Excel.

2.2. Получение и исследование эффективности липосом

на основе липидов нерпы

Материалом исследований служили липосомы из яичных фосфолипидов; липосомы из фосфолипидов печени нерпы; липосомы из яичных фосфолипидов, загруженные активной фракцией тимуса, отваром противовоспалительного фитосбора; липосомы из фосфолипидов печени нерпы, загруженные водным раствором экстракта какалии копьевидной, водным раствором экстракта черных листьев бадана толстолистного. Все полученные липосомы содержали жир байкальской нерпы в концентрации 3 мг/мл и антиоксидант -токоферола ацетат в концентрации 1% (по отношению к липидному компоненту), соответствующий требованиям ФС 42-2654-89-8.10. Жир нерпы получен согласно ТУ 9281-017-02069473-2001.

Экстракцию фосфолипидов из яичных желтков производили по классическому методу Фолча (Биохимия, 1989), из печени нерпы - по методу, предложенному М. Кейтс (1975). Липосомальные структуры готовили по методу, предложенному Bangham A.D. et al. (1964). Ультрамикроскопирование липосомальных частиц производили с помощью электронного просвечивающего микроскопа JEOL JEM-2000 FXII. Количество малонового диальдегида (МДА) как конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липосомах определяли методом пробы с 2-тиобарбитуровой кислотой (Сорокоумова Г.М., 2000).

Активную фракцию тимуса получали из вилочковой железы молодняка крупного рогатого скота модифицированным методом В.Я. Ариона (1982). Экстракты какалии копьевидной (ЭКК) (Патент РФ №2206333), черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ) (Лубсандоржиева П-Н.Б., 2002), комплексный противовоспалительный фитосбор (Самбатова Э.И., 2001) получены в химико-фармацевтической лаборатории Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (ИОЭБ СО РАН). Отвар фитосбора готовили согласно требованиям ГФ XI.

Экспериментальные исследования проводились на: 1) половозрелых мышах обоего пола линии СВА и гибридах (СВАхС57Bl/6) массой 20-22 г, полученных из питомника РАМН Столбовая; 2) белых беспородных крысах обоего пола массой 150-250 г, полученных из питомника филиала №5 ГН - Институт биофизики федерального управления Медбиоэкстрем при Минздраве России г. Ангарск. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии на обычном рационе. Эксперименты осуществляли в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.).

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей в отношении Staph. aureus в системе in vitro исследовали по методике И.С. Фрейдлин (1976). Макрофагальное звено иммунного ответа исследовали в реакциях Fc-розеткообразования и определения антигенпрезентирующей активности макрофагов (Имельбаева Э.А., 1996). Иммуномодулирующую активность липосомальных средств изучали в реакциях, опосредующих клеточный (в реакциях Гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ (Методические рекомендации, 1992) и трансплантат против хозяина - РТПХ (Тессенев В., 1979)) и гуморальный (в реакции антителообразования (Методические рекомендации, 1992)) иммунитет. Ростстимулирующую активность тимоцитов морской свинки оценивали в реакции лактивного розеткообразования с эритроцитами кролика (Nekam K. et al., 1982).

Для гистоморфологического исследования участки слепой кишки подопытных мышей и раневые участки крыс фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина, депарафинированные гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон (Меркулов Г.А., 1969).

Изучение противовоспалительной активности исследуемых средств проводили на стандартных моделях асептического воспаления, ватной гранулемы согласно Методическим рекомендациям (1983) и формалинового отека лапок крыс (Тринус Ф.П., 1975). Также определение противовоспалительной активности проводили на двух моделях острого перитонита (Александров П.Н. с соавт., 1986; Методические рекомендации Е, 1989). Острый адреналиновый отек у мышей вызывали введением раствора адреналина гидрохлорида подкожно (Томчин А.Б. с соавт., 1997).

Оценку мембраностабилизирующей активности липосомальных средств осуществляли по выраженности степени гемолиза эритроцитов, вызываемого реактивом Фентона (перекисный гемолиз), и добавлением дистиллированной воды (осмотический гемолиз) (Ковалев И. Е. с соавт., 1986).

Степень выраженности окислительных процессов в организме экспериментальных животных определяли по содержанию малонового диальдегида в сыворотке крови (Клебанов Г.И. с соавт., 1988) и печени животных (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) в модификации Строева Е.А. и Макаровой В.Г. (1986), а также уровня окисленного и восстановленного глутатиона в сыворотке крови (Anderson M.E., 1989).

С целью оценки состояния антиоксидантной системы у животных в сыворотке крови определяли активность глутатионпероксидазы (по методу Stults F.H. et al., 1977), глутатионредуктазы (по методу Racker E., 1955), каталазы (Королюк М.А. и др., 1988) и супероксиддисмутазы (Чевари С. и др., 1985).

Уровни содержания в крови животных липидов (общего холестерина, холестерина липопротеидов низкой и очень низкой плотности, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов) определяли стандартизированными биохимическими методами с помощью наборов реагентов производства ЗАО Вектор-Бест: Новохол, ЛВП-Холестерин-Ново и Триглицериды-Ново.

Гепатопротекторное действие липосомальных средств было изучено на животных c токсическим гепатитом, который вызывали пероральным введением тетрахлорметана согласно (Олейник А.Н., 1984). Желчь для исследования получали в условиях острых опытов по методике Н.П. Скакуна и А.Н. Олейника (1967). Оценку желчеобразовательной и желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, концентрации желчных кислот (Карбач Я.И., 1961), а концентрацию холестерина в желчи определяли по методу С.М. Дроговоз (1971), билирубина - по методу Ван ден Берга в модификации Н.П. Скакуна (1956).

Для воспроизведения раневых повреждений были использованы модели линейной, плоскостной кожно-мышечной кожной раны и модель химического ожога кожи (Клюев М.А., 1989; Пономарева-Астраханцева Л.З., 1954; Ойвин И.А., Шетель С.Л., 1961). Прочность образовавшегося рубца определяли методом тензиометрии (Коваленко И.В., 1984); проводили планиметрическое, цитологическое и гистологическое исследования раны (Шалимов С.А., 1989).

Реакции поверхностной иммунофлуоресценции выполняли на клетках, прикрепленных к стеклу с помощью поли-L-лизина (Иммунологические методы, 1987).

Об адаптогенных свойствах липосомальных средств судили по времени выносливости крыс в стандартном тесте плавания до полного утомления (Dawson C.A., Horvath S.M., 1970), по ориентировочно-исследовательскому поведению и суммарной двигательной активности животных в тестах лоткрытое поле (Калуев А.В., 1998) и Т-образный лабиринт (Буреш Я. с соавт., 1991).

Для оценки влияния средств на состояние гематологических показателей у животных определяли концентрацию гемоглобина унифицированным гемоглобинцианидным методом (Пупочная В.И., 2003) с помощью набора реагентов Диагем-Т (НПО РЕНАМ) и вычисляли лейкоцитарную формулу крови общепринятым методом (Меньшиков В.В. с соавт., 1987).

Полученные цифровые данные обрабатывали статистически с применением непараметрических (Вилкоксона-Манна-Уитни) (Гублер И.В., 1973) и параметрических (Стьюдента - с помощью компьютерной программы Jandel SigmaPlot32) критериев. Рассчитывали достоверность отличий данных в группах. Достоверными считались отличия с вероятностью p<0.05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Особенности структурной организации

органов иммуногенеза байкальской нерпы в постнатальном онтогенезе

Проведенные исследования по оценке микроанатомических и морфологических характеристик органов иммунной системы байкальской нерпы позволили выявить некоторые особенности их строения как на макро-, так и на микроанатомическом уровнях.

Так, тимус байкальской нерпы, в отличие от тимуса других млекопитающих, состоит не из двух, а из четырех долей. Две доли грудные, расположены за грудиной и лежат на сердце. Две другие доли - шейные, охватывают трахею.

Микроанатомическое строение тимуса нерпы имеет типичный для млекопитающих вид. К видоспецифическим особенностям микроструктуры можно отнести наличие толстой фиброзной капсулы и интенсивное развитие в строме органа волокнистой соединительной ткани, что, по-видимому, объясняется особенностями биологии развития и среды обитания этого животного. Кроме того, по нашим данным, в мозговом веществе тимуса нерпы наблюдается высокое содержание гранулоцитарных лейкоцитов (нейтрофилов и эозинофилов) - более 2%.

Сравнительный морфометрический анализ показал, что в тимусе новорожденных и молодых нерп преобладает корковое вещество, тогда как у взрослых животных - мозговое. Поэтому кортико-медуллярный индекс, отражающий соотношение площадей коркового и мозгового вещества, с возрастом уменьшается (рис. 3).

Рис. 3. Относительная площадь (%) и кортико-медуллярный индекс структурных компонентов тимуса байкальской нерпы в различные возрасты

Исследования показали, что в тимусе половозрелых нерп возрастает доля соединительнотканных элементов и сосудистого русла. Площадь капсулы увеличивается в 1.6 раза, а площадь сосудов - в 3 раза по сравнению с молодыми животными. У взрослых нерп также увеличивается площадь, занимаемая на гистологических срезах тимическими тельцами (в 1.8 раза). Причем, как показали исследования, происходит это не за счет увеличения их количества, а за счет их укрупнения и появления кистоподобных структур. Тем самым, с возрастом у нерп появляются признаки возрастной инволюции.

Исследования морфологии и микротопографии селезенки байкальской нерпы показали, что орган имеет типичную для млекопитающих структурную организацию. Появление в селезенке молодых животных большего, чем у новорожденных, числа лимфоидных узелков с центрами размножения связано с созреванием лимфоидной ткани, усилением ее функциональной активности. Появление высокого содержания плазматических клеток, особенно зрелых (антителопродуцирующих) форм, указывает на резкое усиление гуморального иммунитета с возрастом. При этом слабая морфологическая выраженность зон накопления Т-клеток в периартериальных лимфоидных муфтах (ПАЛМ) связана, видимо, с компенсаторным усилением и преобладающей функцией гуморального иммунитета у этих животных, что объясняется, по-видимому, условиями обитания животных.

Выявлено, что у половозрелых животных, по сравнению с молодыми, четко выявляются признаки возрастной инволюции лимфоидной ткани и органа в целом: резко увеличивается содержание соединительной ткани в селезенке и склерозируются сосуды. В сравнении с молодыми, у половозрелых нерп заметно увеличивается (на 14.8 клетки) плотность клеток в функционально активных лимфоидных узелках с центрами размножения (в центрах размножения и в мантии) (рис. 4), что в значительной степени связано с изменением в соотношении лимфоидных клеток в сторону общего снижения процесса лимфоцитопоэза.

Рис. 4. Соотношение плотности распределения клеток на единице площади гистологического среза (880 мкм2) в структурных зонах селезенки нерп в различные возрастные периоды

У половозрелых нерп, по сравнению с молодыми, в лимфоидных структурах селезенки резко уменьшается количество (вдвое - в центрах размножения) или исчезают (в ПАЛМ и красной пульпе) малодифференцированные формы лимфоцитов. Исключение составляет красная пульпа, где отмечено усиление пролиферации клеток в 1.8 раза. К половозрелому возрасту, по сравнению с молодыми, отмечается тенденция в увеличении содержания зрелых форм лимфоцитов в белой пульпе. При этом у молодых и половозрелых животных практически не изменяется интенсивность процессов деструкции клеток, но несколько снижается макрофагальная активность клеток в центрах размножения и в мантии узелков.

Изучение структурной организации брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы, принимающих лимфу от тонкого отдела кишечника, выявило следующие особенности: сильное развитие соединительной ткани; большая площадь, занимаемая лимфоидными узелками, высокое содержание среди них вторичных лимфоидных узелков; большая доля, занимаемая мозговым веществом; наличие широких межклеточных пространств.

Клеточный состав брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы, принимающих лимфу от тонкого отдела кишечника, во всех возрастных группах характеризуется наличием большого числа малодифференцированных форм клеток (лимфобластов и больших лимфоцитов) в центрах размножения лимфоидных узелков; исключительно высоким содержанием плазматических клеток; превышением количества плазмобластов над количеством плазмоцитов; превышением числа малых лимфоцитов над числом средних лимфоцитов почти во всех структурно-функциональных зонах; преобладанием средних и малых лимфоцитов в корковом веществе, по сравнению с мозговым; высоким содержанием ретикулярных клеток; наличием небольшого числа эозинофилов; более высокой плотностью распределения клеток в корковом веществе, по сравнению с мозговым веществом.

В постнатальном онтогенезе брыжеечные лимфатические узлы байкальской нерпы, принимающие лимфу от тонкого отдела кишечника, претерпевают следующие возрастные изменения структурной организации: увеличение относительной площади соединительнотканного компонента; уменьшение доли, занимаемой корковым веществом; уменьшение относительной площади лимфоидных узелков, в том числе вторичных лимфоидных узелков. Проявляется тенденция к возрастному снижению корково-мозгового индекса (рис. 5).

В брыжеечных лимфатических узлах байкальской нерпы, принимающих лимфу от тонкого кишечника, в процессе постнатального онтогенеза происходит снижение числа средних лимфоцитов и ретикулярных клеток, увеличение числа плазматических клеток; уменьшение числа больших лимфоцитов, увеличение содержания малых лимфоцитов в корковом веществе; снижение числа деструктивно измененных и разрушенных клеток в центрах размножения лимфоидных узелков; уменьшение числа малых лимфоцитов в мозговом веществе.

Рис. 5. Динамика возрастных изменений относительной площади основных морфо-функциональных зон брыжеечных лимфатических узлов, принимающих лимфу от тонкого кишечника байкальской нерпы.

Состояние и закономерности развития лимфоидной ткани пищеварительной системы у нерп в значительной мере могут являться показателями особенностей питания и воздействия изменений среды обитания.

Исследованиями особенностей строения и развития лимфоидной ткани, ассоциированной со стенками тонкого кишечника, у байкальских нерп установлено, что имфоидные бляшки располагаются по всей длине тонкой кишки, но большее их количество находится в подвздошной кишке. Групповые лимфоидные узелки у этих животных встречаются также и в начальном отделе толстого кишечника (по 2-3), что отличает их от других млекопитающих. Как показали наши наблюдения, у нерп в тонкой кишке в разные возрастные периоды выявлено различное количество лимфоидных бляшек. Колебания в количестве лимфоидных бляшек в течение жизни байкальской нерпы совпадают с таковыми у человека. Как и у людей, лимфоидные бляшки у нерпы начинают формироваться еще на стадии внутриутробного развития. Их количество в этом периоде, как и в старческом возрасте, наименьшее, по сравнению с другими периодами жизни.

Макроскопически бляшки байкальской нерпы со стороны просвета кишки слабо возвышаются над уровнем слизистой оболочки и имеют гладкую поверхность в отличие от человека и грызунов. Специфичность микротопографии лимфоидных бляшек подвздошной кишки нерпы проявляется в том, что все лимфоидные узелки имеют широкие центры размножения, вокруг которых отсутствует типичная мантийная зона. Отличительным признаком в морфологии лимфоидных бляшек у байкальских нерп, является развитие плотного соединительнотканного каркаса вокруг лимфоидных узелков, развитие которого, по мнению некоторых авторов, объясняется особенностями влияния температурного режима на их организм, в частности, холодных вод (Кондратьева И.А., 2001; 2002). Нами отмечено также слабое развитие межузелковой зоны в лимфоидных бляшках у молодых животных и появление типичной обширной межузелковой зоны только у взрослых нерп. Увеличение площади межузелковой зоны у половозрелых нерп свидетельствует, видимо, о развитии с возрастом Т-зависимой зоны, зоны локализации лимфоцитов, участвующих в регуляции клеточного иммунитета (Петров Р.В., 1976). Выявленные возрастные изменения в микротопографии лимфоидных бляшек у нерп соответствуют возрастным изменениям иммунных органов у некоторых экспериментальных животных (крыс, мышей, кролика) и человека (Сапин М.Р., 1987; Григоренко Д.Е., 2004).

имфоидная ткань в слизистой оболочке стенок прямой кишки нерпы различных возрастов, как и у других млекопитающих, представлена как одиночными лимфоидными узелками, находящимися в собственной пластинке, так и групповыми образованиями, расположенными в 2-3 слоя в подслизистой основе слизистой оболочки кишки и заходящими в собственную пластинку органа. Особенностью слизистой оболочки прямой кишки нерп является присутствие в ней огромного количества глубоко расположенных крипт, среди которых встречаются ветвящиеся формы. В отличие от крипт прямой кишки человека, у нерпы крипты имеют разный диаметр, пронизывают скопления лимфоидной ткани и выстланы столбчатым (цилиндрическим) реснитчатым эпителием. В просвете крипт постоянно обнаруживаются конгломераты, состоящие из лимфоцитов и десквамированного эпителия.

В онтогенезе лимфоидная ткань прямой кишки нерпы претерпевает характерные для млекопитающих возрастные изменения, которые сводятся к разрастанию соединительной ткани и началу постепенного склерозирования лимфоидных узелков, что ведет к ослаблению функции клеточного воспроизводства. Деструктивные процессы в лимфоидных узелках (за исключением центральной зоны) с возрастом становятся менее выраженными, а в собственной пластинке слизистой оболочки сохраняются на прежнем уровне.

Таким образом, несмотря на эндемический характер байкальской фауны вообще, и нерпы в частности, проведенные исследования показали схожую закономерность структурной организации лимфоидных органов, присущую для человека и млекопитающих. В то же время выявлено, что морфологические и микроанатомические характеристики исследуемых органов байкальской нерпы имеют некоторые отличительные особенности. Видоспецифические признаки конструкции органов иммунопоэза и лимфоидных структур у нерпы объясняются, по-видимому, особыми условиями существования животного, к которым относятся постоянное воздействие низких температур и длительное пребывание организма глубоко под водой.

Выявленные возрастные изменения в строении органов лимфопоэза нерпы отвечают общим для всех млекопитающих закономерностям онтогенетического развития иммунной системы. Анализ возрастных изменений структуры и клеточного состава органов иммунной системы показал, что с возрастом у животных превалирует функция гуморального иммунитета, о чем свидетельствует наличие большого количества крупных, хорошо развитых лимфоидных узелков с центрами размножения во всех исследованных органах, а также резкое усиление плазматической реакции. Уменьшение площади, занимаемой паренхимой тимуса, периартериальными лимфоидными муфтами в селезенке и паракортикальной зоной в лимфатических узлах, характеризует снижение клеточного иммунитета нерп с увеличением их возраста.

3.2. Влияние биогенных экологических факторов

на морфофункциональное состояние лимфоидных органов

байкальской нерпы

Известно, что развитие патогенной микрофлоры и заселение различных органов паразитами у млекопитающих приводит к изменению иммунного статуса животных (Соколова О.В., Денисенко Т.Е., 2004), которое выражается в структурной перестройке органов иммунной системы.

Были отобраны пробы брыжеечных лимфатических узлов от особей байкальской нерпы в возрасте до 1 года, в содержимом кишечника которых были обнаружены микроорганизмы-сапрофиты, являющиеся патогенными для белых мышей. Исследованные микроорганизмы относятся к грамотрицательным стафилококкам (Хандажапова Б.Б., 2005). Было отмечено, что у особей байкальской нерпы, в кишечнике которых присутствовали данные микроорганизмы, в брыжеечных лимфатических узлах происходило увеличение деструктивных изменений, усиление пролиферативных процессов с одновременным разрастанием соединительнотканных элементов и повышением антителообразующей активности.

По данным исследований сотрудников Лаборатории паразитологии ИОЭБ СО РАН, одним из распространенных паразитических гельминтов, поражающих позвоночных гидробионтов Байкала, является нематода Contracaecum osculatum baikalensis. Заселение прямой кишки нерпы нематодами приводило к нарушению целостности слизистой оболочки органа. В местах нахождения паразита, в первую очередь, поражался эпителий. Эпителиальные клетки набухали, вакуолизировались и вследствие нарастания дистрофических процессов подвергались распаду и вместе с подлежащей тканью отслаивались, попадая в просвет органа. В этом месте оставался логоленный участок ткани в виде микроэрозии, покрытой толстым слоем слизи. В области дна крипт клетки эпителия растягивались настолько, что образовывали синцитий, который местами прерывался, и окружающая лимфоидная ткань оказывалась открытой для непосредственного контакта с внешней средой. В области эрозий, расположенных на поверхности слизистой оболочки кишки и в криптах, наблюдался более активный выход лимфоцитов в просвет кишки.

Инвазия нематодами в прямой кишке нерпы приводила к существенной перестройке соотношений клеток разных популяций. В лимфоидных узелках происходило уплотнение в распределении клеток на стандартной площади гистологического среза за счет увеличения числа малых лимфоцитов и стромальных клеток. В центральных зонах узелков отмечалась слабая тенденция к активизации митотической активности клеток лимфоидного ряда. При мало меняющихся процессах разрушения клеток в составе всего узелка в нем отмечалось незначительное ослабление макрофагальной активности. В то же время отличительной особенностью собственной пластинки слизистой оболочки явилось значительное увеличение содержания макрофагов и практически удвоение количества эозинофилов, что осуществлялось на фоне снижения числа плазмоцитов и малых лимфоцитов. Плотность в распределении клеток в собственной пластинке слизистой оболочки уменьшалась. Все эти процессы являются отражением реакции организма животного на органические изменения в стенке кишки и токсическое воздействие паразита на морфологическом уровне.

Полученные данные свидетельствовали о напряженности иммунной системы обследуемых особей. Однако данная напряженность является результатом нормального функционирования иммунной системы организма животных как ответ на предъявленные условия.

Таким образом, состояние иммунной системы байкальской нерпы, ответственной за адаптацию животного к изменяющимся внешним факторам и являющейся интегральным индикатором состояния всего организма Pusa sibirica, может быть использовано в системе биомониторинга Байкала, поскольку нерпа находится на вершине пищевой цепи экосистемы озера и является основным кумулятором экотоксикантов и объектом воздействия биогенных экологических факторов.

Результаты исследования морфофункциональных особенностей индивидуального развития и факторов, влияющих на защитные силы организма байкальской нерпы, легли в основу разработки научно-методических рекомендаций рационального использования вторичного липидного сырья, остающегося после добычи животного. С целью эффективной доставки биологически активных липидов нерпы в организм были разработаны способы получения липосомальных средств на их основе.

3.3. Биологическая активность липосом

на основе вторичных липидов нерпы

Основной проблемой эффективного использования биологически активных липидов нерпы является разработка способов целенаправленной доставки их в органы- и клетки-мишени. Наличие тропности и других свойств у липосомальных форм биологически активных веществ и лекарственных препаратов дает ряд преимуществ по сравнению с применением их в интактном виде, что изучено многими учеными. Таким путем может быть обеспечена не только доставка полезных для организма липидов, из которых состоит липосомальная мембрана, но и других веществ, транспортируемых липосомами.

Свойства липосом как искусственных липидных мембранообразующих конструкций уникальны. Фосфолипиды мембраны липосом не токсичны, после введения в организм вступают в обменные процессы и не накапливаются в организме. Следует отметить, что существующие методы получения липосом позволяют легко заключать в фосфолипидные везикулы как гидрофильные, так и липофильные лекарственные препараты и биологически активные вещества. Модифицируя модельные липидные мембраны фосфолипидами, содержащими полиеновые жирные кислоты, можно добиться увеличения их биологической ценности и, тем самым, повышения эффективности липосомальной технологии (Грегориадис Г., 1983).

Жир байкальской нерпы как типичный представитель морского жира имеет триглицеридную структуру с высокой степенью ненасыщенности кислотных цепей, что обуславливает его высокую биологическую активность. Исследования химического состава жира нерпы, проведенные совместно с сотрудниками БИП СО РАН и учеными Норвегии и Финляндии, выявили 60 жирных кислот, из которых на долю полиненасыщенных приходится 22-23% (в том числе наиболее важных - эйкозапентаеновой - 2.65%, - докозагексаеновой - 6.28%). Следует отметить, что соотношение жирных кислот семейства -6/-3 в жире нерпы составляет 0.77:1.

Нами был разработан способ получения липосомальных структур с добавлением в качестве функционального ингредиента жира байкальской нерпы. На способ получения липосом был получен Патент РФ на изобретение (№ 2153328). В качестве мембранообразующего компонента в липосомах первоначально были использованы фосфолипиды яичного желтка.

Создание и разработка оптимальных технологий липосомальных средств требует следования многим требованиям по стандартизации и контролю их качества, в том числе определению размера частиц и оценке безопасности разрабатываемых средств.

Средний размер частиц в полученных липосомальных суспензиях, вычисленный теоретически методом спектротурбидиметрии, составил 100.5 нм. Расчетные данные были подтверждены электронной микроскопией (рис. 6).

Рис. 6. Электронная микрофотография суспензии с липосомами (  ).

Увел. х15000.

Как известно, жиры рыб и морских млекопитающих очень нестойки при хранении в силу окислительных процессов, происходящих в жирных кислотах. Поэтому при разработке и хранении липидных препаратов важно учитывать сохранность жиров. Одним из показателей окислительной порчи является определение конечного продукта свободнорадикального окисления - малонового диальдегида (МДА). Применение антиоксиданта -токоферола ацетата в концентрации 1% в липосомах продлевало срок их хранения до 6-ти месяцев, о чем свидетельствовало то, что интенсивное накопление МДА в липосомах наблюдалось, начиная только с этого срока.

ипосомальное средство исследовали на санитарно-микробиолоические показатели безопасности и качества по требованиям, предъявляемым к пищевым продуктам на основе переработки животного сырья в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01. Данные бактериологического анализа липосомального средства при получении и хранении при T=420C в течение 1, 3 и 6 месяцев хранения со дня изготовления показали, что рост числа тестируемых микроорганизмов в исследуемых образцах не превышал нормативных показателей.

Таким образом, нами установлено, что полученные липосомы можно отнести к бионанокапсулам, безопасным по микробиологическим показателям.

3.3.1. Биологическая активность липосом с жиром нерпы

Наличие в составе жира нерпы -3 и -6 ПНЖК в оптимальном для организма соотношении предполагает наличие у липосом на его основе высокой биологической ценности.

В экспериментах на лабораторных животных была установлена выраженная иммунобиологическая активность липосом на основе жира нерпы в отношении макрофагального, клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа на фоне азатиоприновой иммуносупрессии. Это проявлялось в достоверном увеличении показателей активности перитонеальных макрофагов и интенсивности фагоцитоза в отношении Staphylococcus aureus, а также повышении антигенпредставляющей и Fc-розеткообразующей активности (РОА) перитонеальных макрофагов; в увеличении показателя индекса реакции Трансплантат против хозяина (РТПХ); и, повышении антителообразующей активности (АОА) спленоцитов мышей (рис. 7).

Гистоморфологическими исследованиями показано, что иммунокорригирующее действие липосом характеризовалось восстановлением морфологических структур в собственной пластинке слизистой оболочки и в лимфоидных образованиях в стенках слепой кишки мышей на фоне иммунной супрессии, вызванной азатиоприном.

Рис. 7. Влияние липосом на основе жира нерпы на показатели различных звеньев иммунитета экспериментальных мышей

Известно, что любое повреждение тканей независимо от причины, вызвавшей его, сопровождается воспалительным процессом. В физиологических условиях воспалительная реакция является неотъемлемой частью защитных свойств организма и носит адаптивный характер (Тринус Ф.П., 1975).

Развитие воспалительной реакции в пораженном месте протекает в несколько стадий. В экспериментах на крысах было установлено, что липосомальное средство с включением жира нерпы обладало выраженным противовоспалительным действием на всех стадиях процесса воспаления, проявляя антиульцерогенные свойства, антиэкссудативное действие и пролиферативную активность.

Кроме того, при воспроизведении моделей острого перитонита было выявлено, что применение липосом приводило к уменьшению отека в брюшной полости за счет стимулирования грануляции тучных клеток, а также снижения проницаемость сосудов перитонеальной полости.

В опыте по воспроизведению острого адреналинового отека легких у мышей была выявлена значительная противоотечная активность исследуемых липосом, что выражалось в увеличении продолжительности жизни животных и уменьшении легочного коэффициента.

Как известно, мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток. В зависимости от жирно-кислотного состава фосфолипидного бислоя мембран форменных элементов крови может меняться деформируемость и пластичность эритроцитов и тромбоцитов. На текучесть мембран в значительной мере оказывает влияние степень ненасыщенности высших жирных кислот. Известно, что -3 ПНЖК в значительно большей степени влияют на повышение текучести, чем ПНЖК ряда -6.

В экспериментах in vitro нами была установлена выраженная мембраностабилизирующая активность липосом, содержащих ПНЖК жира нерпы. Как показали исследования, липосомы оказывали протекторное действие на мембраны эритроцитов при их повреждении на моделях перекисного и осмотического гемолиза.

3.3.2. Биологическая активность липосом на основе липидов печени нерпы

С целью усиления фармакологических свойств липосом и более полного использования липидного сырья байкальской нерпы яичные фосфолипиды были заменены на фосфолипиды, выделенные из печени нерпы (Патент РФ №2308940). Преимуществом жира, содержащегося во внутренних органах, перед покровным, является наличие в нем фосфолипидов. Содержание фосфолипидов в печени нерпы составляет 4.7% от сухого остатка. Жирнокислотный состав липидов печени нерпы включает в себя более 25 ПНЖК, на их долю приходится 35.7% (в том числе эйкозапентаеновой - 0.44%, докозагексаеновой - 6.73%). При этом соотношение жирных кислот семейства -6/-3 составляет 3.19:1, что позволяет отнести печень байкальской нерпы к числу перспективных источников биологически активных веществ (Кабирова И.Р., 2005).

В проведенных экспериментах было выявлено, что включение в состав липосом липидов печени нерпы приводило к усилению их иммуномодулирующей активности по сравнению с липосомами на основе яичных фосфолипидов. Причем максимальное увеличение иммуностимулирующего действия липосом на основе липидов печени было обнаружено в отношении антителообразования у спленоцитов (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительная оценка иммунобиологической активности липосом

на основе различных фосфолипидов. За 100% приняты показатели иммунитета интактной группы животных

Проведенные исследования по оценке противовоспалительных свойств при воспроизведении двух моделей острого перитонита у крыс показали, что липосомы на основе фосфолипидов печени с добавлением жира нерпы, оказывали более сильное действие по сравнению с липосомами, полученными на основе яичных фосфолипидов, а также по сравнению с липосомами с добавлением рыбьего жира.

Установлено, что показатели стабилизации мембран эритроцитов под воздействием липосом из липидов печени при воспроизведении перекисного и осмотического гемолиза были достоверно выше (на 50% и 37.5% соответственно), чем в аналогичных опытах при введении липосом на основе яичных фосфолипидов, используемых в той же концентрации, что и фосфолипиды печени нерпы. Влияние липосом, полученных из фосфолипидов печени нерпы с жиром нерпы, на предотвращение осмотического гемолиза было достоверно эффективнее (на 26.5%) по сравнению с действием липосом с фармакопейным препаратом - рыбьим жиром, взятым в тех же концентрациях.

Известно, что в регуляции клеточных функций ведущее место играют про- и антиокислительные процессы. В эксперименте на лабораторных животных показано, что длительный холодовой стресс у крыс сопровождался накоплением МДА в крови и печени, а также повышением редокс-коэффициента (соотношения окисленного глутатиона к восстановленному) в крови. Выявлено, что введение экспериментальным животным липосомальной формы ПНЖК нерпы приводило к замедлению процессов ПОЛ в тканях крыс, при этом способствовало восстановлению глутатиона в крови и повышению активности основных ферментных биоантиоксидантов (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы).

На модели экспериментальной гиперхолестеринемии было выявлено, что введение крысам разработанных липосом способствовало регуляции липидного состава крови животных, при этом происходило понижение уровня как общего холестерина, так и холестерина липопротеинов низкой и очень низкой плотности с одновременным повышением уровня холестерина липопротеинов высокой плотности. Тем самым, коррекция дислипидемического состояния сопровождалась снижением риска атерогенности и агрегационного состояния тромбоцитарной системы крови.

3.4. Фармакотерапевтическая эффективность

ипосомальной формы липидов нерпы

В опытах по воспроизведению токсического гепатита у крыс была установлена выраженная холеретическая активность липосом, приготовленных на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы, что выражалось в ускорении желчевыделительной функции печени крыс и повышении общего количества выделенной животными желчи. Наряду с ускорением холереза под влиянием липосом отмечены позитивные изменения и в биохимическом составе желчи, выражавшиеся в повышении концентрации общих желчных кислот и содержания билирубина в секретируемой желчи. Следует отметить, что липосомы проявляли выраженное гепатопротекторное действие, начиная с 7-х суток наблюдения, тогда как положительное действие фармакопейного препарата сравнения Холосас проявлялось только с 14-ти суток.

ипосомы широко применяют в лечебных мазях и косметике. С целью изучения ранозаживляющего действия липосом было разработано трансдермальное средство, содержащее липосомы с ПНЖК жира нерпы (Патент РФ на изобретение №2417075). Учитывая основные патогенетические факторы развития раневых повреждений, были использованы модели линейной и плоскостной кожно-мышечной раны, а также модель химического ожога кожи. Животным опытных групп после операции на рану накладывали гель, приготовленный на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) и содержащий липосомы. Установлено положительное влияние липосомального средства на укрепление межклеточных структур при регенеративных процессах в поврежденных тканях, выражавшееся в увеличении прочности рубца на разрыв после лечения гелем линейной раны. Выраженное ранозаживляющее действие липосом проявлялось и в существенном уменьшении площадей плоскостной и постожоговой ран (рис. 9) в ранние сроки эксперимента, и в положительной динамике структурной реорганизации новообразованной после асептического повреждения ткани, и в ускорении процессов заживления ран по срокам эпителизации.

Рис. 9. Изменение площадей плоскостной и постожоговой ран и прочности рубца после линейной раны при воздействии геля с липосомами

Результаты исследования разработанной лекарственной формы в течение 4 месяцев на присутствие патогенных и условно патогенных микроорганизмов позволяют расценить испытуемое средство как микробиологически безопасное согласно требованиям, предъявляемым к парфюмерно-косметической продукции по действующим СанПиН 1.2.681-97.

Исследованиями эффективности липосом при формировании адаптационного ответа крыс к длительному холодовому стрессу было выявлено увеличение физической выносливости животных в тесте плавания до изнеможения. При этом наступало снятие психо-эмоционального напряжения, проявлявшееся повышением мотивационных характеристик поведения и уровня ориентировочно-исследовательского поведения, а также снижением уровня тревоги, страха, неуверенности в тестах Открытое поле и Т-образный лабиринт.

3.5. Транспортная способность липосом на основе липидов нерпы

Известно, что липосомы являются эффективной транспортной системой для различных биологически активных соединений (Каплун А.П., 1999).

Вычисления модифицированным методом мечения красителем (Heiati H. et al., 1996) объема внутренней водной фазы в разработанных липосомальных структурах позволили заключить, что внутрь липидных везикул, содержащих триацилглицеролы жира нерпы, включалось от 14.7% до 49.9% водного компонента от исходно взятого. В проведенных экспериментах были использованы суспензии, состоящие из липосомальных структур на основе вторичных липидов нерпы с заключенными внутрь и не включившимися в липосомы водными растворами пептидного биорегулятора или растительных экстрактов.

Были проведены эксперименты по исследованию иммунобиологической активности липосомальных средств, содержащих в своем составе жир байкальской нерпы, с включением активной фракции тимуса крупного рогатого скота и противовоспалительного пятикомпонентного фитосбора.

Результаты исследований показали (рис. 10), что полученные комплексы с липосомальными структурами стимулируют функциональную активность перитонеальных макрофагов, Т-лимфоцитов и антителообразующих клеток в иммунологических тестах с моделируемой супрессией. При этом выявлено, что применение как пептидного биорегулятора, так и фитосбора в комплексе с липосомами способствует усилению иммуномодулирующих свойств исследуемых биологически активных средств.

Рис. 10. Иммунобиологическая активность липосомальной формы противовоспалительного фитосбора. За 100% приняты показатели иммунитета интактной группы животных

Установлено, что противовоспалительная активность комплексного фитосбора при включении его в липосомальные структуры, содержащие жир байкальской нерпы, повышалась по сравнению со свободной формой растительного средства.

Аналогичные результаты были получены при исследовании мембраностабилизирующей активности экстракта какалии копьевидной. Способность к восстановлению мембран эритроцитов у растительного средства повышалась на 7.5% в случае перекисного гемолиза и на 18% в случае осмотического гемолиза при включении его в липосомальные средства.

Показано, что включение экстракта какалии копьевидной в липосомальное трансдермальное средство, содержащее ПНЖК нерпы, способствовало повышению ранозаживляющего действия фитоэкстракта (по сравнению с линиментной формой растительного средства на основе вазелина). При этом применение липосомальной формы растительного средства сопровождалось и восстановлением показателей иммунитета у животных с раневым повреждением.

Введение экстракта черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ) в липосомальной форме сопровождалось положительной динамикой показателей неспецифической адаптации организма к холодовому воздействию.

Таким образом, показано, что при включении ПНЖК в липосомальные структуры сохраняется функция липосом как контейнеров для транспортной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств, обуславливая пролонгированное действие последних и увеличивая их фармакологическую эффективность.

4. Выводы

1. Структура органов иммуногенеза (тимуса, селезенки, брыжеечного лимфатического узла) и лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой пищеварительного тракта, байкальской нерпы (Pusa sibirica Gmel.) соответствует общим закономерностям строения аналогичных органов человека и других млекопитающих.
2. Отличительные особенности микротопографии и клеточного состава органов иммунной системы байкальской нерпы касаются отдельных деталей структуры органов иммунной системы. Тимус, в отличие от тимуса человека, имеет 4 доли, а длина пакетов брыжеечных лимфатических узлов достигает 8 см. Отмечено более интенсивное развитие лимфоидных структур в кишечнике байкальской нерпы по сравнению с человеком и другими животными.
3. Характерной чертой микроскопического строения исследованных органов является обильное разрастание соединительной ткани в виде мощных трабекул (в тимусе, селезенке, лимфатическом узле) или отдельных пучков коллагеновых волокон внутри пейеровых бляшек и лимфоидных структурах в стенке прямой кишки. В селезенке нерпы слабо развиты периартериальные лимфоидные муфты; количество лимфоидных узелков в органе небольшое, но они большие с крупными центрами размножения. У пейеровых бляшек узкая мантия и слабо развитая межузелковая зона. Крипты в прямой кишке проникают глубоко в скопления лимфоидной ткани. В тимусе отмечено наличие большого количества макрофагов в корковом веществе, особенно у молодых животных.
4. С возрастом изменения, происходящие в строении органов лимфопоэза байкальской нерпы, отвечают общим для всех млекопитающих закономерностям онтогенетического развития органов иммунной системы. Во всех изученных органах с возрастом происходит разрастание соединительной ткани, сопровождающееся склерозированием кровеносных сосудов. С увеличением возраста в лимфоидных органах байкальской нерпы наблюдается превалирование функции гуморального иммунитета с одновременным снижением клеточного иммунитета. В красной пульпе селезенки с возрастом отмечается компенсаторное увеличение содержания малодифференцированных (бластов и больших лимфоцитов) и делящихся клеток. В мозговом веществе тимуса, в мякотных тяжах лимфатических узлов и в пейеровых бляшках повышается количество плазматических клеток, а в прямой кишке их доля снижается.
5. Для всех структур лимфоидной ткани свойственно относительно небольшое содержание макрофагов (за исключением тимуса), число которых с возрастом уменьшается. На фоне общего снижения доли макрофагов в мозговом веществе тимуса и в собственной пластинке слизистой оболочки прямой кишки наблюдается увеличение числа эозинофилов. В отличие от человека и лабораторных животных, уровень деструкции клеток в органах иммуногенеза нерпы с возрастом практически остается без изменений.

6. Под воздействием биогенных факторов окружающей среды оценена степень напряженности лимфоидных структур пищеварительного тракта байкальской нерпы. Выявлено что в прямой кишке при глистной инвазии нарушается целостность эпителиального покрова, развиваются микроэрозии, в основании крипт эпителий уплощается, принимает синцитиальный вид, что благоприятствует выходу лимфоцитов. Общее число лимфоцитов и малодифференцированных клеток в лимфоидных узелках при этом увеличивается, а содержание макрофагов и плазматических клеток сокращается. В собственной пластинке слизистой оболочки прямой кишки нерпы вдвое увеличивается доля эозинофилов и в 3 раза - макрофагов. Количество лимфоцитов и плазматических клеток уменьшается.

7. В брыжеечных лимфатических узлах животных, в кишечнике которых были обнаружены микроорганизмы, патогенные для белых мышей, в 1.5 раза увеличивается площадь лимфоидных узелков с центрами размножения и в 8 раз сокращается площадь, занимаемая лимфоидными узелками, не содержащими центров размножения. На цитологическом уровне происходит значительное уменьшение числа бластов и больших лимфоцитов (в 4 раза), исчезают митотически делящиеся клетки, в два раза увеличивается содержание плазмобластов, макрофагов, усиливается деструкция клеток.

8. Установлены иммуномодулирующая, противовоспалительная и мембраностабилизирующая активности липосомальной формы покровного жира нерпы в модельных экспериментах по воспроизведению иммунодефицитного состояния, воспалительных процессов в тканях лабораторных животных и деструкции мембран эритроцитов.

9. Замена яичных фосфолипидов на липиды печени нерпы, содержащие оптимальное соотношение -6/-3 ПНЖК, в рецептуре липосом приводит к усилению их иммунобиологической и мембраностабилизирующей активности. Выявлена антиоксидантная активность липосом на основе липидов печени нерпы, проявляющаяся в повышении уровня и активности антиокислительных ферментов. Липосомы проявляют выраженный противовоспалительный эффект при воспроизведении острого перитонита и гиполипидемическую активность на модели гиперхолестеринемии.

10. Установлена фармакотерапевтическая эффективность липосомальных средств, содержащих ПНЖК жира нерпы. Применение липосом способствует усилению секреции и улучшению биохимического состава желчи экспериментальных животных с токсическим гепатитом. В условиях длительного холодового стресса введение животным исследуемых липосом приводит к повышению физической работоспособности, улучшению психо-эмоционального состояния и стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения, что указывает на адаптогенные свойства разработанного средства.

11. На моделях раневых повреждений у крыс при применении ранозаживляющего геля, содержащего липосомальную форму липидов нерпы, отмечено ускорение по сравнению с контролем развития грануляционной ткани и созревания рубца после линейных кожных ран, а также ранняя эпителизация раневых дефектов при заживлении плоскостных кожно-мышечных ран и химических ожогов кожи.

12. При использовании в липосомальных структурах ПНЖК липидов нерпы сохраняется функция липосом как контейнеров для транспортной доставки биологически активных средств. При включении пептидного биорегулятора и растительных средств в липосомы, содержащие липиды нерпы, повышается их фармакологическая и фармакотерапевтическая эффективность. В экспериментах на животных выявлено усиление иммунокорригирующих свойств активной фракции тимуса крупного рогатого скота при включении в липосомальные структуры. Включение комплексного противовоспалительного фитосбора в липосомы, содержащие жир нерпы, повышает его иммуномодулирующую и противовоспалительную активности. Отмечено ускорение протекания регенеративных процессов в ранах при применении липосомальной формы экстракта какалии копьевидной по сравнению со свободной формой растительного средства. Липосомальная форма экстракта из черных листьев бадана толстолистного оказывает более выраженное стресспротекторное действие, чем его свободная форма.

5. Практические предложения

1. Данные по гистоморфологическому исследованию органов иммунной системы байкальской нерпы рекомендовать в качестве биоиндикаторных характеристик экосистемы озера, используя их как исходную базу данных для оценки степени влияния различных внешних факторов на иммунную систему организма, проводимой в рамках биологического мониторинга.

2. Регистрируемую динамику изменений морфофункциональных показателей иммунной системы байкальской нерпы использовать для характеристики состояния экосистемы Байкала при разработке мер по сохранению биоразнообразия озера.

3. Разработанные липосомальные средства на основе биологически активных липидов байкальской нерпы рекомендовать фармацевтической промышленности для создания новых высокотехнологичных лекарственных средств, а также биологически активных добавок к пище и кормам с использованием наноразмерных систем.

4. Липосомальное ранозаживляющее средство рекомендовать к внедрению в производство трансдермальных препаратов нового поколения в виде гелей и мазей, обладающих высокой эффективностью.

5. Сведения по морфологии и клеточному составу органов иммуногенеза байкальской нерпы использовать в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на биологических, охотоведческих и ветеринарных факультетах и написании учебников, учебных пособий и справочных руководств по видовой и возрастной сравнительной морфологии животных для студентов вузов.

6. Список публикаций по теме диссертации

Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов диссертации

1. Сапин М.Р., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Григоренко Д.Е., Ерофеева Л.М. Лимфоидные структуры в стенке слепой кишки мышей в условиях иммунной депрессии и ее коррекция липосомальными средствами // Морфология. - 2001. - Т.120. - №4. - С. 42-45.

2. амажапова Г.П., Григоренко Д.Е., Ерофеева Л.М., Сапин М.Р., Жамсаранова С.Д. Восстановление иммунитета липосомами из жира байкальской нерпы // Российские морфологические ведомости. - 2001. - № 3-4. - С. 41-43.

3.  Аверина Е.С., Бодоев Н.В., Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П., Раднаева Л.Д. Иммуномодулирующая активность липосомальных средств, полученных из концентратов жира байкальской нерпы // Вестник новых медицинских технологий. - 2003. - Т.Х. - №3. - С. 84-86.

4. амажапова Г.П., Кутырев И.А., Жамсаранова С.Д. Некоторые особенности морфогенеза тимуса и лимфоидной бляшки байкальской нерпы в возрастном аспекте // Бюллетень Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН Сердечно-сосудистые заболевания. - 2003. - Т.4. - №5. - С. 30.

5.  Ерофеева Л.М., Жамсаранова С.Д., Кутырев И.А., амажапова Г.П., Сапин М.Р. Особенности морфологии и цитоархитектоники брыжеечных лимфатических узлов у взрослых особей байкальской нерпы // Вестник новых медицинских технологий. - 2004. - Т. XI. - № 3. - С. 18-20.

6.  Кутырев И.А., амажапова Г.П., Ерофеева Л.М., Жамсаранова С.Д. Сравнение микроанатомических и цитологических характеристик брыжеечного лимфатического узла полувзрослых и взрослых особей байкальской нерпы (Phoca sibirica) // Зоологический журнал. - 2006. - Т. 85. - № 7. - С. 886-892.

7. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Структурная организация брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы Phoca sibirica Gmel. в постнатальном онтогенезе // Известия РАН. Серия биологическая. - 2008. - № 4. - С. 453-458.
8. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Клеточный состав коркового вещества брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы в постнатальном онтогенезе // Морфология. - 2008. - Т. 134. - №6. - С. 38-42.
9. Kutyrev I.A., Lamazhapova G.P., Zhamsaranova S.D. Structural organization of Mesenteric Lymph Nodes in postnatal development of the Baikal seal, Pusa sibirica Gmel. // Biology Bulletin. - 2008. - Т.35. - №4. - Р. 389-393.
10. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Хандаева А.Ц. Исследование противовоспалительной активности липосомальных средств из природных липидов // Вестник новых медицинских технологий. - Тула: Изд-во НИИ НМТ, 2009. - Т. XVI, №3 - С. 179-180.
11. Большунова Е.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Исследование влияния липосомальной формы экстракта бадана толстолистного на формирование адаптационного потенциала организма // Вестник Восточно-Сибирского государственного технологического университета. - 2010. - №4. - С. 83-88.

Монографии

1. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Брыжеечные лимфатические узлы байкальской нерпы: гистоморфология в постнатальном онтогенезе. - Berlin: LAP Lambert Academic Publishing, 2011. - 176 с.
2. амажапова Г.П., Григоренко Д.Е., Аминова Г.Г., Ерофеева Л.М., Жамсаранова С.Д., Кутырев И.А., Дондитов Э.В. Органы иммунной системы байкальской нерпы (Pusa sibirica Gmel.). - М.: Издательство Спутник+, 2011. - 132 с.

Патенты

1. Тыхеева Н.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Способ получения липосом. Патент РФ на изобретение № 2153328, опубл. 27.07.2000. Бюл. № 21.

2. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Цыренжапов А.В., Николаев С.М. Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием. Патент РФ на изобретение № 2308940, опубл. 27.10.2007. Бюл. № 30.

3. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Способ получения липосомального средства, обладающего ранозаживляющим действием. Патент РФ на изобретение № 2417075, опубл. 27.04.2011. Бюл. № 12.

Статьи в других периодических изданиях

1. Тыхеева Н.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Изучение иммунокорригирующих свойств липосомальных средств, полученных на основе жира нерпы // Вестник Восточно-Сибирского государственного технологического университета. - 2001. - №3. - С. 51-58.

2. Lamazhapova G.P., Hunhinov A.M., Zhamsaranova S.D. Research of Influence of Liposomal Form of Polyunsaturated Fatty Acibs from the Baikal Seal Fat on Transport of Antituberculosis Means // New Research on Biotechnology in Biology and Medicine. - Nova Science Publishers, Inc., New York, 2006. - Р. 189-192.

3. Кутырев И.А., Хандажапова Б.Б., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Цыдыпов В.Ц. Гистоморфологические показатели брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы (Pusa sibirica) при обнаружении и отсутствии в кишечнике микроорганизмов, патогенных для белых мышей // Вестник Бурятского государственного университета. Серия Химия, биология, география. Вып. 3. - 2007. - Улан-Удэ: Изд-во БГУ. - С. 301-303.
4. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П. Перспективы использования наноразмерных форм в биотехнологии и медицине // Вестник Восточно-Сибирского государственного технологического университета. - 2007. - №1. - С. 35-38.
5. Хандаева А.Ц., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Сравнительная оценка противовоспалительной эффективности липосом, полученных на основе разных фосфолипидов // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2008. - №4 (13). - С. 13-17.
6. Zhamsaranova S.D., Lamazhapova G.P. Research of reparation properties of liposomal form of biogenic lipids // Journal of International Research Publications: Materials, Methods & Technologies. - 2009. - Volume 3. - Part 1. - Р. 431-441.
7. амажапова Г.П., Большунова Е.А., Жамсаранова С.Д. Экспериментальное исследование адаптогенных свойств липосомальной формы экстракта бадана толстолистного // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2009. - № 2 (66) - С. 268-270.
8. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Иммунофармакологический эффект комплексных средств, содержащих биогенные полиненасыщенные жирные кислоты // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2009. - №3 (67). - С. 192-196.
9. Lamazhapova G.P., Zhamsaranova S.D. Research of antioxidant activity of liposomal form of extract from Bergenia crassifoliaТ black leaf in experiment // Мэс засал сэтгyyл (Journal of surgery, Ulaanbaatar, Mongolia). - 2011. - № 13. - C. 152-154.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов и материалах Международных и Всероссийских конференций

1. Самбатова Э.И., амажапова Г.П. Исследование иммунологической активности комплексного фитосбора // Тез. докл. Всеросс. научно-практич. молодежного симпозиума Экология Байкала и Прибайкалья. - Иркутск, 1999. - С. 59.
2. Самбатова Э.И., амажапова Г.П., Баханова Е.М., Николаев С.М., Жамсаранова С.Д. Фармакологическое действие комплексного фитосбора // Сб. матер. Междунар. конгресса Традиционная медицина - 2000. - Элиста, 2000. - С. 262-265.
3. амажапова Г.П., Самбатова Э.И., Жамсаранова С.Д., Николаев С.М. Противоотечная активность липосомальной формы комплексного фитосбора // Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья. - Чита, 2000. - С. 96-99.
4. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Биологическая активность липосом, полученных на основе триацилглицеринов жира байкальской нерпы // Матер. Междунар. конф. молодых ученых От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии. - Тверь, ТГТУ, 2001. - С. 21-22.
5. амажапова Г.П., Самбатова Э.И., Жамсаранова С.Д., Николаев С.М. Оценка эффективности использования липосом из жира нерпы в качестве носителя комплексного фитосбора // Матер. Междунар. науч. конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий". - Саранск: Изд-во Мордов. Ун-та, 2001. - С. 186-188.
6. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Влияние липосом из жира байкальской нерпы на активность макрофагов // Успехи современного естествознания. - 2003. - №6. Ц - С. 63-64.

7. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Морфология тимуса и лимфоидной бляшки байкальской нерпы // Сб. науч. тр. Актуальные проблемы морфологии. - Красноярск, 2003. - С. 119-121.
8. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Возрастные изменения гистоморфологических показателей органов иммунной системы байкальской нерпы // Матер. Всеросс. молод. науч.-практ. конф. Молодые ученые Сибири. - Улан-Удэ, 2003. - С. 34-36.
9. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Ерофеева Л.М., Жамсаранова С.Д. Цитологические особенности брыжеечного лимфатического узла подростков байкальской нерпы // Сб. науч. тр. Актуальные проблемы морфологии, Красноярск, 2004. - С. 161-162.
10. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Ерофеева Л.М., Григоренко Д.Е., Жамсаранова С.Д. Микроанатомические особенности лимфоидных органов нерпы - эндемика экосистемы озера Байкал // Матер. Междунар. науч. конф. Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами. - Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004. - С. 156-157.
11. амажапова Г.П., Хунхинов А.М., Жамсаранова С.Д. О перспективности рационального использования жира байкальской нерпы в лечебных целях // Матер. Всеросс. науч.-техн. конф. с междунар. участием Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений (г. Улан-Удэ, 26-30 июля 2004 г.). - Улан-Удэ: Изд-во БН - СО РАН, 2004. - С. 153-154.
12. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П. Разработка новых лекарственных средств на основе природных источников сырья с использованием высоких технологий // Матер. Междунар. науч.-практ. конф. - 8-го Междунар. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов Биотехнология - 2005, Пущино, 18-19 ноября 2005 г. (под ред. Решетиловой Т.А., Музафарова Е.Н.) - ЗАО А-Принт, 2005. - С. 47-50.
13. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П., Цыренжапов А.В. Оценка гепатопротекторной эффективности природных фосфолипидов // Сб. матер. Третьей юбилейной выставки-конференции с междунар. участием Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. - М.: Изд-во МГУПП. - 2005. - С. 202-203.
14. Корбутова Н., амажапова Г.П., Сорокоумова Г.М., Швец В.И. Получение коллоидных систем (эмульсий, липосом), содержащих, как функциональный ингредиент, жир байкальской нерпы // XI Международная научно-техническая конференция Наукоемкие химические технологии-2006: Тез. докл. Т.I. - Самара, 2006. - С. 168.
15. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П. Перспективы использования липосомальной формы природных эссенциальных нутриентов при оптимизации питания // Диетология: проблемы и горизонты I съезд диетологов и нутрициологов России (5-6 декабря 2006 г., г. Москва). - С. 36-37.
16. Муратова Т.С., амажапова Г.П. Исследование желчегонной активности липосом на основе природных фосфолипидов // Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов: Мат-лы Всерос. науч. молод. конф. с междунар. участием. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. - С. 49-50.
17. Дружинина Д.Н., Хандаева А.Ц., амажапова Г.П. Исследование биологической активности природных липидов в эксперименте // Актуальные проблемы технологии живых систем: Сб. матер. II Междунар. науч.-техн. конф. молодых ученых, Владивосток. Изд-во ТГЭУ, 2007. С. 23-26.
18. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П., Хандаева А.Ц. Исследование биологической активности природных липидов в липосомальной форме // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. Четвертого Московского междунар. конгресса, М., Изд-во ЗАО Экспо-биохим-технологии, 2007. - Ч. 1. - С. 158.
19. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Некоторые характеристики наносомальных структур из природного сырья // Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы Труды IX Междунар. конф. - Ульяновск: УГУ, 2007. - С. 125.
20. Хандаева А.Ц., амажапова Г.П. Эффективность лекарственных средств на основе биологически активных компонентов тканей байкальской нерпы // Экология в современном мире: взгляд научной молодежи: Матер. Всеросс. конф. молодых ученых, Улан-Удэ, 24-27 апреля 2007 г. - Улан-Удэ: Изд-во ГУЗ РЦМП МЗ РБ, 2007. - С. 390-391.
21. Дондитов Э.В., амажапова Г.П. Особенности микроскопической анатомии тимуса байкальской нерпы // Экология в современном мире: взгляд научной молодежи: Матер. Всеросс. конф. молодых ученых, Улан-Удэ, 24-27 апреля 2007 г. - Улан-Удэ: Изд-во ГУЗ РЦМП МЗ РБ, 2007. - С. 23-24.
22. Дондитов Э.В., Ерофеева Л.М., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Возрастные изменения морфологии тимуса байкальской нерпы // Актуальные вопросы экологической, сравнительной, возрастной и экспериментальной морфологии: Матер. Междунар. науч.-практ. конфер., посвященной 100-летию проф. И.А. Спирюхова. - Улан-Удэ: Изд-во ФГОУ ВПО БГСХА им. В.Р. Филиппова, 2007. - С. 27-28.
23. Кутырев И.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Общие закономерности изменения клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов байкальской нерпы в постнатальном онтогенезе // Актуальные вопросы экологической, сравнительной, возрастной и экспериментальной морфологии: Матер. Междунар. науч.-практ. конфер., посвященной 100-летию проф. И.А. Спирюхова. - Улан-Удэ: Изд-во ФГОУ ВПО БГСХА им. В.Р. Филиппова, 2007. - С. 37-39.
24. Zhamsaranova S.D., Lamazhapova G.P. Nanosystems on the Base of Natural Lipids as Perspective Drugs for Treatment of Different Diseases // Proceedings of 3rd International Symposium in Chemistry УChemistry and Food Safety-2008Ф. - October 02-04, 2008. Ulaаnbaatаr, Mongolia. - Р. 35.

25. Жамсаранова С.Д., амажапова Г.П. О возможности использования наноформ природных липидов как компонентов питания // Биотехнология: Вода и пищевые продукты: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., М.: Изд-во ЗАО Экспо-биохим-технологии, 2008. - С. 204.
26. Zhamsaranova S.D., Lamazhapova G.P. Ways of Integration of Modern Technologies and Achievements of Traditional Medicine // Materials of the III International Scientific Conference Traditional Medicine: a current Situation and Perspectives of Development. - Ulan-Ude: The Publishing House of the Ministry of Health of Buryatia, 2008. - P. 74-75.
27. Zhamsaranova S.D., Lamazhapova G.P. Research of Efficiency of Natural Polyunsaturated Fatty Acids in Liposomal Form // Abstract Book of Erdos Forum on Development of International Traditional Medicine, China, Erdos, 2009. - Р. 85.
28. Большунова Е.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Исследование влияния липосомальной формы экстракта из черных листьев бадана толстолистного на иммунный статус лабораторных животных при холодовом стрессе // International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (September, 28 - October, 2, 2009): Abstracts, Moscow - Pushchino, 2009. - Vol. 1. Ц - P. 141-142.
29. Жамсаранова С.Д., Большунова Е.А., амажапова Г.П. Влияние липосомальной формы экстракта черных листов бадана толстолистного на физическую выносливость лабораторных животных в условиях солодового воздействия // Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы. - Оренбург: ИПК ГОУ ОГУ, 2009. - С. 133-136.
30. Большунова Е.А., амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Влияние липосомальной формы экстракта листьев бадана толстолистного на ориентировочно-исследовательское поведение лабораторных животных в условиях холодового воздействия // Сб. матер. III Междунар. науч.-техн. конф. молодых ученых Актуальные проблемы технологии живых систем. - Владивосток: Изд-во ТГЭУ, 2009. - С. 192-194.
31. амажапова Г.П., Халматов А.В. Репаративная активность липосомальной формы природных полиненасыщенных жирных кислот // Матер. III Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых Жас-Галым-2009. - Тараз, Казахстан, 2009. - С. 169-173.
32. Lamazhapova G.P., Zhamsaranova S.D. Reparation properties of liposomal form of Cacalia hastate L. // Current Problems of Food Engineering and Biotechnology: Proceedings of the International Workshop, July 4-7, 2009, Ulan-Ude (Russia). - Ulan-Ude: The Publishing House of East Siberian State University of Technology, 2010. - P. 86-92.
33. Bolschunova E.A., Lamaschapova G.P., Schamsaranova S.D. Die Effektivitt der Nutzung der Liposomenform des Extraktes aus Schwarzen Blttern des dickblttrigen Badans (Bergenia crassifolia (L) Fritsch) bei der Kltebewirkung. // Current Problems of Food Engineering and Biotechnology: Proceedings of the International Workshop, July 4-7, 2009, Ulan-Ude (Russia). - Ulan-Ude: The Publishing House of East Siberian State University of Technology, 2010. - S. 72-77.
34. Galina P. Lamazhapova, Sesegma D. Zhamsaranova Adaptogenic activity of polyunsaturated fatty acids in liposomal form // International Conference on УInnovation in Food and Nutrition ScienceФ, July 7-11, 2010, Ulaanbaatar, Mongolia, 2010. - P. 213-217.
35. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Разработка и исследование фармакологической активности нанокомплексов на основе природных биологически активных веществ // Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и дальнего Востока: матер. I Всеросс. науч.-практ. конф. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2010. - С. 70-75.
36. амажапова Г.П., Дондитов Э.В., Жамсаранова С.Д. О необходимости иммуномониторинга байкальской нерпы // Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова: Тез. докл. междунар. науч. конф. и междунар. шк. для мол. ученых (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.). - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 424.
37. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Новая биологически активная форма природных нутриентов // XI Междунар. конф. молодых ученых Пищевые технологии и биотехнологии (г. Казань, 13-16 апреля 2010 г.). Сб. тез. докл. Часть 2. - Казань: Изд-во Отечество, 2010. - С. 137.
38. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Антиоксидантный эффект фитоэкстракта в липосомах // Матер. XIII Междунар. науч.-тех. конф. Наукоемкие химические технологии - 2010 (Иваново, 29 июня - 2 июля 2010 г.) - ГОУВПО Иван. гос. хим.-технол. ун-т. Иваново, 2010. - С. 246.
39. амажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Сорокоумова Г.М., Каплун А.П., Польшаков В.И. Характеристика липосомальных структур из нетрадиционного липидного сырья // Нетрадиционные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сб. науч. тр. РАЕН. - Выпуск 18. - М.: РАЕН, 2010. - С. 107-112.
40. Galina P. Lamazhapova, Sesegma D. Zhamsaranova. Prospects for the use of liposomal form of natural polyunsaturated fatty acids in geriatrics // Chemistry in Medicine: Booklet of International Conference. - Ulaanbaatar, Mongolia, 2010. - P. 18-19.
41. амажапова Г.П., Бальхаев М.И., Жамсаранова С.Д., Лубсандоржиева П.-Н.Б., Николаев С.М. Ранозаживляющая активность липосомальной формы растительного средства // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. VI Московского междунар. конгресса. - М.: Экспо-биохим-технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2011. - Часть 1. - С. 81-82.

7. Список используемых сокращений

АОА - антителообразующая активность

БАД - биологически активная добавка

БИП СО РАН - Байкальский институт природопользования СО РАН

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ИОЭБ СО РАН - Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской Академии Наук

МДА - малоновый диальдегид

ПАЛМ - периартериальные лимфоидные муфты

ПМ - перитонеальные макрофаги

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РОА - розеткообразующая активность

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

ЭБТ - экстракт из черных листьев бадана толстолистного

ЭКК - экстракт какалии копьевидной

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству