Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Потанин Михаил Борисович
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГИПОТАЛАМУСА
В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ
(экспериментальное исследование)
03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Волгоград - 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич
доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич
доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия
им. И.М.Сеченова Росздрава
Защита состоится _____ _________________ 2008 года в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан л___ ___________ 2008 года.
Ученый секретарь
диссертационного Совета,
доктор медицинских наук Н.В. Григорьева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность.
Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информационная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора общения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека - вот далеко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982; Судаков К.В., 1997, 2002; Крыжановский Г.Н., 1999, 2004; Пшенникова М.Г., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Глазачев О.С., 2006; Oliver G., Wardle J., 1999; Bell M.E. et al., 2002; Sivukhina E.V. et al., 2006; Gibson L.E., 2006].
С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи Синдром, вызываемый разными повреждающими агентами, теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса раскрыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс-активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кардиотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффекты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Котов А.В., 1999; Судаков К.В., 2003; Devries A.C., et al., 1997; Berridge M.J., et al., 1998; Hamano H., et al., 2002; Dube L, et al., 2005; Wu Y.H. et al., 2006; Stone EA, et al., 2006; McCormick CM, et al., 2007].
В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и определяет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002; Бадыштов Б.А., 1998; Соколова Е.Б., с соавт., 2000; Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001; Bremner J.D., et al., 1996; Kelley A.E., Berridge K.C., 2002; Pecoraro N., et al., 2004; Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувствительности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000; Анохин К.В., Судаков К.В., 2003; Маркина Н.В., с соавт., 2003; Bartolomucci A., et al., 2003; Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003; McGill, et al., 2006; Centeno M.L. et al., 2007; Goto S., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].
Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом - прежде всего в организации церебральных структур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000; Yehuda R., et al., 1991; Avishai-Eliner S., et al., 2001; Morin SM, et al., 2001; Krady J.K., et al., 2002; Bluthe R.M., et al., 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Inoue K., et al., 2003; Dallman M.F., et al., 2004; Badowska-Szalewska E., et al., 2006; Girotti M., et al., 2006].
Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при конституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распространенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм. Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность организма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопатологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006; Баннов А.Н., 1994; Ерофеев А.Ю., 1995; Смирнов А.В., 1998, 2005; Гуров Д.Ю., 1999, 2005; Фролов В.И., 2004; Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007; Морозова З.Ч., 2006; Загребин В.Л., 2007].
За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998; Thompson R.H., Swanson L.W., 2003; Okere C.O., Waterhouse B.D., 2004; Kwon M.S., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Kiss A., 2007; Lowry C.A., et al., 2007].
За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практически важная проблема, как определение особенностей стресс-ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у животных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его воспроизведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.
Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светооптического исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроскопии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Боголепов Н.Н., 2002; Николлс Дж.Г., с соавт., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2007; Bonini P., et al., 2004; Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Block M.L., et al., 2007; Ma S., et al., 2007]. С теоретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодополняющие при выполнении подобного исследования.
С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфофункциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых структур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.
Цель работы - установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституциональной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипоталамуса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.
Задачи исследования.
1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных изменений в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.
5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрессорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения гипоталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.
Научная новизна.
На основании сопоставления результатов светооптического, иммуногистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и привлечения методов современного математического анализа результатов морфометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции формирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо общепризнанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипоталамическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейроны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком - сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов.
Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных градиентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной конституциональной стресс-реактивности животных.
На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс-реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с построением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферентации, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конституциональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют имеющиеся представления о структурных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной нейроморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существенно проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у различных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.
Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и полной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.
Положения, выносимые на защиту.
1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое - в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью.
2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.
3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005); Международном конгрессе Проблемы вегетативной дисрегуляции (Донецк, 2005); Российской научной конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии (Курск, 2006); Всероссийской конференции Новые медицинские технологии (Волгоград, 2007).
Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 25 апреля 2008 года.
По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах Морфология, Морфологические ведомости, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины и Вестник Волгоградского государственного медицинского университета, включенных в действующий Перечень Е ВАК (медицинские науки, редакция апрель 2008).
Реализация и внедрение результатов исследования.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете, Волгоградском государственном университете, Волгоградской государственной академии физической культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской государственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного патолого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Список использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отечественных и 233 зарубежных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Специфика настоящего исследования потребовала решения нескольких методических задач:
- максимально адекватного выделения животных с доказанными конституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения головного мозга;
- выделение из большого числа нейроморфологических методик доступного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернативной стресс-реактивностью;
- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при котором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количественно оценивать различия между группами;
- выбор адекватного математического подхода для описания происходящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.
Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекомендациями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993] и согласован с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от 21 декабря 2004 года).
На основании изложенных принципов после скрининга в основной части работы было проведено сравнительное изучение головного мозга у 20 крыс: по пять в каждой подгруппе в зависимости от стресс-реактивности, вне стресса и после его воспроизведения (табл. 1).
Таблица 1
Общая характеристика материала исследования по сериям
Серии экспериментов | Характеристика серии | Кол-во животных |
Скрининговый этап (неинвазивные тесты) | ||
определение уровня общей неспецифической реактивности организма | низкий уровень | 18 |
средний уровень | 91 | |
высокий уровень | 15 | |
определение уровня хемоиндуцированной стресс-реактивности | низкий уровень | 20 |
средний уровень | 82 | |
высокий уровень | 22 | |
Основной этап | ||
интактные животные | высокая реактивность | 5 |
низкая реактивность | 5 | |
Моделирование 24-часового иммобилизационного стресса | высокая реактивность | 5 |
низкая реактивность | 5 | |
Первым тестом для разделения животных на группы было определение универсального критерия стандартизации биомоделей - уровня общей неспецифической реактивности организма. Метод основан на определении болевой (ноцицептивной) чувствительности посредством дозированного электроболевого воздействия [Мулик А.Б., 1993, 2002]. Вторым относительно малоинвазивным тестом стало определение термолабильности животных при действии сверхмалых доз бактериального липополисахарида. Для такого свойства организма предложено соответствующее название - уровень хемоиндуцированной стресс-реактивности [Горизонтов П.Д., 1984]. В результате этого тестирования для исследования было выделено 20 крыс с низким и 22 - с высоким уровнем реактивности.
Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности организма (конкордантность - 68%).
Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспроизведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с максимальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электроболевой вокализации и максимальной термолабильностью - для группы животных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характеристиками - для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).
Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР путем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопическое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечников.
Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуференного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 по Сентаготаи и тангенциальной - от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципитальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщиной 5-7 микрон - 200-240 для блока В и 100-150 - для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали. Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы промежуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).
Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоптического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).
В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части. Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.
атеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляющие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.
Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, обнаруживали в сечениях Р3,0 - P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) части премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В связи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.
Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.
Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений Видеотест-Морфо (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм3 ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм3), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала после окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.
Результаты при исследовании областей, наиболее лактуальных по результатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разбивала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон - всего 360 участков (рис. 2). В качестве первичного материала получали матрицу секторального и радиального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончательного - коэффициенты, характеризующие графическую функцию распределения:
K1 Ц тангенс угла подъема кривой в восходящей части графика,
K1 Ц тангенс угла снижения кривой в восходящей части графика,
Im Ц максимальная интенсивность окраски в кольцевой зоне, усл. ед.,
R Ц расстояние от центра ядрышка до зоны с Im
Vm Ц максимальная вариабельность интенсивности по секторам, усл. ед.
Полученные количественные показатели достаточно полно характеризуют изменения нейронов в динамике повреждения [Новочадов В.В., 2005].
На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень стрессорного поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]. Производился подсчет нейронов коры, которые разделили на 4 группы:
- нейроны нормальные, неизмененные (НН);
- слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (острое набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия);
- грубо измененные нейроны (ГН) (сморщивание, тяжелое изменение, гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени);
- нейроны отсутствующие (ОН).
Степень поражения нейронов вычисляли по формуле: СП=(2ОН+2ГН+СН)x100/2(ГН+ОН+СН+НН) и выражали в процентах. Выделяли 4 степени поражения: легкая (менее 20%), средняя (20-50%), тяжелая (более 50%), распространенный некроз. Исследование проводили в 5 полях зрения на 4 срезах для каждой области ГМ (100-120 измерений на серию).
Иммуногистохимическое исследование производили с использованием следующих моноклональных мышиных антител коммерческими наборами фирмы Dako Cytomation (Дания):
- к макрофагальному антигену, окрашивающий микроглию (HAM-56);
- к кислому глиальному протеину (GFAP);
- к тирозингидроксилазе (TH)
- к глутаматному рецептору (GR-2)
- к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1);
- к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3).
Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по современными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключевым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002; Kotake Y., et al. 2002].
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Экспрессию оценивали по разделению нейронов на классы в зависимости от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах. Соотношение экспрессий определяли через их удельные яркости в сопоставимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предметном стекле. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004; Kelman Z., 1997; Rosa M.A., et al. 2000; Paunesku T. et al., 2001].
Для электронно-микроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию кусочков размером 1 мм3 производили в течение 12 часов в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия в 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4оС [12]. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50о этаноле в течение 40 минут и 0,3 % растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Документирование производили с использованием фотопластинок Для ядерных исследований. Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге Унибром 160 БП.
Сканированные ультрамикрофотографии анализировали в программе AM Lab Hesperus v3.0 beta. В качестве показателей для структурного анализа использовались такие показатели, как объемная доля митохондрий в перикарионе, отношение яркостей эухроматин/гетерохроматин, эухроматин/матрикс цитоплазмы, матрикс митохондрий/матрикс цитоплазмы и матрикс цитоплазмы/содержимое синаптосом в трехмерной системе координат RGB. Также анализировали фактор формы кариолеммы, наружной мембраны митохондрий, показатель выраженности крист митохондрий.
Вариационно-статистическую обработку результатов проводили в среде электронных таблиц MS Excel. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с достоверностью различий. Затем, руководствуясь закономерностями, принятыми для медико-биологических исследований (объем выборок, характер распределения, непараметрические критерии), оценивали достоверность различий выборок. Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В преоптической области у животных с высокой стресс-реактивностью для POM характерно более редкое расположение относительно крупных нейронов с большим объемом окружения и количеством граничных астроглиоцитов; в PeV выявляются более мелкие, но плотнее расположенные нейроны с большим числом граничных нейронов и малым представительством микроглии, а строение POL не отличалось от такового у животных с низкой стресс-реактивностью. Полученные данные в целом свидетельствуют о неоднородности строения ядер преоптической группы переднего гипоталамуса в срезе конституциональной реактивности.
В собственно переднем гипоталамусе для крыс с высокой стресс-реактивностью были характерны относительно более крупные размеры нейронов, их ядер и нейронного окружения (более всего - для SCh). Но для SCh характерна более высокая ОД нейронов, а для SO и PV - относительно более низкая. Интересно, что в триггерном ядре стресса - паравентрикулярном - отличия между группами интактных крыс были минимально выражены. Животные с высокой стресс-реактивностью имеют в передней гипоталамической области меньшее представительство астро- и микроглии (SCh < PV < SO) и неодинаково выраженное, но относительно высокие экспрессии нитроксидсинтаз (максимальные - в SO), рис. 1.
Исследования, проведенные в медиальной и латеральной гипоталамической области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование целого ряда существенных отличий различий только в двух ядрах - дорсомедиальном и аркуатном, а также в латеральной гипоталамической области. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.
Супраоптическое ядро
Супрахиазматическое ядро
Паравентрикулярное ядро
Рис. 1. Особенности строения ядер передней гипоталамической области крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
Принципиальные различия в отношении дорсомедиального и вентромедиального ядра гипоталамуса (первое имеет яркие отличия, зависящие от стресс-реактивности, второе - практически отличий не имеет) может иметь ключевое значение в участии этой области гипоталамуса при развитии стресса. Также удалось показать, что нейроны аркуатного и дорсомедиального ядер гипоталамуса обладают общей особенностью у крыс с высокой стресс-реактивностью. Она заключается в более высоком представительстве катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрессовой реакции (рис. 2).
Вентромедиальное ядро
Дорсомедиальное ядро
Рис. 2. Особенности строения ядер медиальной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
Большая сложность организации латеральной гипоталамической области (но не серого бугра) является одним из доказательств большего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравнении с нервными связями между ядрами гипоталамуса (рис. 3).
Более сложное строение нейропиля было характерно для ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической области животных с высокой стресс-реактивностью.
Аркуатное ядро
атеральное гипоталамическое ядро
Рис. 3. Особенности строения ядер латеральной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
На уровне маммилярного комплекса показана максимальная вариабельность строения SuM и PMv, для которых были характерны более плотная нейронная упаковка, относительно большие размеры нейронов и их ядер, большое количество микроглии.
Математический анализ методом определения асимметрии выборок, цензурированных по признаку реактивности, выявил многочисленные сцепления данных показателей строения нейронов и их окружения со стресс-реактивностью животных. Практически те же показатели выявлялись как связанные с реактивностью при корреляционном анализе.
Обобщая представления о строении ядер у интактных животных, мы предположили их реакцию при стрессе с учетом строения нейронов, их окружения, астроглиального и микроглиального представительства, картирования ряда изученных медиаторов, а для SO и SCh - ультрамикроскопического строения. Все исследованные ядра гипоталамуса были разделены на пять групп (рис. 4).
слабые ядра с низкой потенциальной резистентностью Ц POM | практические не зависящие от реактивности Ц POL, VM, PMd и ML | слабые ядра с высокой потенциальной резистентностью Ц PeV и SO | |
сильные ядра с низкой потенциальной резистентностью Ц PV и DM | сильные ядра с высокой потенциальной резистентностью Ц SCh, ARC, SuM, и PMv | ||
Рис. 4. Распределение вариабельных ядер гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью на основании математического анализа.
1. К сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению у животных с высокой стресс-реактивностью отнесены супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентральная часть премамиллярного ядра.
2. Сильными, но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению для животных ВСР группы были признаны триггерные ядра стресса - паравентрикулярное и дорсомедиальное.
3. К слабым структурам, но с высокой резистентностью к повреждению были отнесены супраоптическое и перивентрикулярное ядро.
4. Медиальное преоптическое ядро было единственным, расцененным как слабое с низкой резистентностью.
5. Латеральное преоптическое ядро, вентромедиальное ядро, медиальная часть премамиллярного ядра и латеральное мамиллярное ядро - ядра, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависели.
Безусловно, проводя такое разделение, мы отдавали себе отчет в том, что при развитии стресса на реальные изменения в ядре будет оказывать влияние не только особенности его нейронного окружения или устройства самих нейронов, но также общая и специфическая функциональная нагруженность в реализации работы стрессорной системы.
Подобный анализ возможен только в сопоставлении изменений по отдельным ядрам применительно к их установленной функции, рецепторному аппарату, медиаторному представительству и вовлеченности в развитие стрессорных реакций.
В преоптической зоне гипоталамуса, помимо развитого нейропиля, определялись три основных ядра, из которых максимально вариабельным от стресс-реактивности оказалось POM. Эта структура связана с терморегуляцией и участвует в регуляции секреции половых гормонов, сексуального поведения, имеет выраженные различия у самцов и самок [Yoshida K. et al., 2002; Lowry C.A. et al., 2007]. Предполагается также участие этой зоны и в интеграции импульсов сердечно-сосудистой системы [Акмаев И.Г., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006], реакциях гипоталамуса на хроническую эндогенную интоксикацию [Фролов В.И., 2004].
На основе нашего анализа POM интактных животных было отнесено к слабым ядрам с низкой резистентностью. Это определялось относительно меньшими размерами перикарионов и ядер нейронов, менее плотной их упаковкой в ядре с относительно малым количеством граничных клеток и относительно низким микроглиальным представительством. В POM животных ВСР группы определялся относительно высокий исходный уровень экспрессии нейрональной нитроксидсинтазы.
В то же время, при стрессе это ядро оказалось поврежденным в относительно малой степени (около 5,0%), причем в равной степени в группах с различной стресс-реактивностью. Аналогичные факты были выявлены и при последующем анализе строения ядра после стресса.
По-видимому, POM не относится к ядрам, в значительной степени включающимся в реализацию стресс-системы, в связи с чем его изменения в нашей модели стресса оказываются менее ожидаемых и в малой степени зависят от стресс-реактивности. Определенную роль в этом может играть и общая картина защитного торможения, описанная для стресса в отношении преоптических структур в целом [Crowder R.J., Freeman R.S., 1998; Stone E.A., et al., 2006], равно как и относительно умеренная реализации сосудистых нарушений за счет активации нитроксидсинтаз и ФНО-зависимого апоптоза нейронов [Куликов В.П. с соавт., 2005; Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Schuler M., Green D.R., 2001; Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003; Mattson M.P., Kroemer G., 2003 ].
Перивентрикулярное ядро гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью было нами отнесено к слабым, но с высокой резистентностью к повреждению. Этот прогноз полностью подтвердился. Степень повреждения нейронов в PeV была чуть более 5% в ВСР группе, более 11% - в НСР группе. Изменения других показателей, в том числе незначительная активация нитроксидсинтаз, хорошо согласуются с известными из литературы сведениями об относительно малом участии PeV в стрессорной реакции, умеренной выраженности ФНО-зависимого апоптоза при стрессе [Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Figueiredo H.F. et al., 2003; Badowska-Szalewska E., et al., 2006]. Локальное повреждение PeV способно предотвратить стрессорное ограничение секреции тиротропного гормона и гормона роста [Лычкова А.Э., Смирнов В.М., 2002; Campbell R.E. et al., 2003].
Таким образом, мы подтвердили предположение о том, что у животных с высокой конституциональной стресс-реактивностью имеется исходно большая вероятность стрессорного повреждения POM, тогда как PeV повреждается в меньшей степени и обладает высокой резистентностью к повреждению.
Супраоптическое ядро рассматривается как наиболее поражаемое ядро при хроническом стрессе самой разной этиологии [Писарев В.Б., 1990; Писарев В.Б., с соавт., 1998, 2006; Фролов В.И., 2004]. Нейроэндокринные клетки SO и PV являются источниками кортиколиберина, тиролиберина и ряда других нейрогормонов, непосредственно вовлекающихся в стартовые (триггерные) механизмы стресса [Казакова с Т.Б. соавт., 2000; Рыбникова Е.А. с соавт., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Jorgensen H. et al., 2003; Inoue T. et al., 2004].
В отношении этой структуры анализ выявил несколько противоречивых данных. С одной стороны, при стрессе данное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью повреждалось сильнее, ОД нейронов в SO у животных ВСР группы уменьшалась на 22,3%, тогда как в НСР группе - только на 14%. Изменение размеров нейронов, сложности их окружения и количества нейроглии в принципе свидетельствовали, что SO ядро является сильным звеном главным образом у крыс с низкой конституциональной стресс-реактивностью. В то же время существенные различия в экспрессии нитроксидсинтаз, отсутствие существенных корреляционных доказательств между степенью повреждения и другими морфометрическими показателями не позволили считать резистентность этого ядра сниженной. В итоге SO у животных с высокой стресс-реактивностью следовало отнести к группе слабых ядер с высокой резистентностью к повреждению.
При ультрамикроскопическом исследовании были выявлены еще несколько особенностей SO у крыс с высоким уровнем стресс-реактивности: относительно более высокий удельный объем митохондрий в перикарионах с их более функционально активной организацией.
Исходя из ключевых функций SO, результаты нашего анализа можно интерпретировать следующим образом.
1. Супраоптическое ядро способно к медленноволновой секреции кортиколиберина, является основным продуцентом вазопрессина. Продукцию окситоцина и половых стероидов следует отнести скорее к минорным функциям ядра [Patel K.P., et al., 2000; Nomura M. et al., 2003]. Наряду с прямым своим действием, вазопрессин и окситоцин через местные механизмы модулируют секрецию кортиколиберина и запуск секреции АКТГ [Sun Y. et al., 2001; Wotjak C.T. et al., 2002].
2. При стрессе в SO происходит резкое уменьшение секреции вазопрессина, и данный эффект нередко приводит к развитию сосудистого коллапса с переходом в шоковое состояние [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Giusti-Paiva A., et al., 2002]. Подъем синтеза и секреции кортиколиберина начинается не сразу после стресса, а через 6-12 часов, обеспечивая закрепление и определенную пролонгацию стрессовой реакции. Синтез окситоцина при стрессе в SO практически не меняется, а половых стероидов (что не столь существенно для гормонального пула в целом) - снижается [Berciano M.T. et al., 2002].
3. Следовательно, у животных с высокой стресс-реактивностью за счет существования особенностей строения SO в полной мере не обеспечивается адекватное развитие второй, более медленной волны выброса кортиколиберина и соответствующих колебаний секреции стресс-лимитирующих гормонов. Это и придает стрессу скоротечность и остроту, выдаваемую по внешним признакам за высокую реактивность.
Супрахиазматическое ядро было отнесено нами к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к повреждению.
Наличие в SCh интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.
В нейронах SCh крыс ВСР группы также выявлено преобладание гетерохроматина, преимущественно рядом с ядерной оболочкой, отсутствие инвагинаций кариолеммы и высокая электронная плотность кариоплазмы. Для них характерно обилие органелл в цитоплазме перикариона, мономорфность митохондрий и относительно малая плотность их матрикса. В своей совокупности эти особенности также рассматривались как субстрат большей функциональной активности и лабильности SCh у животных с высокой стресс-реактивностью.
При стрессе в SCh развивались относительно малые изменения, и минимальные - у животных с высокой стресс-реактивностью. Наличие в SCh стрессированных крыс ВСР группы относительно небольшого прироста NOS-1-позитивных нейронов и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его резистентности к стрессорному повреждению. Электронно-микроскопическое исследование нейронов выявило сохранение структуры ядерного хроматина и кариолеммы, небольшое увеличение числа митохондрий без структурных особенностей в них. В перинуклеарной области части нейронов наблюдалась отчетливая вакуолизация, но мембранные органеллы были многочисленны и структурно не повреждены.
Гуморальная активность SCh многообразна - это секреция вазопрессина, окситоцина, опиатов, гонадолиберина, бомбезина [Владимиров С.В., Угрюмов М.В., 1995; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].
Сопоставление этих особенностей SCh у интактных животных и стресс-индуцированных изменений позволило с функциональным предназначением ядра позволило сделать следующее логическое построение.
1. SCh является центром циркадианных ритмов, которое воспроизводится даже на удаленных из организма плоскостных срезах-культурах гипоталамуса, содержащих данное ядро. Важным входом этого ядра является проекция глаза, после разрушения SCh у крыс теряется способнность настраивать эндогенный ритм на частонту чередования свет/темнота [Николс Дж. Г., 2003; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].
2. При стрессе и шоке с сохранением активности SCh связывают основные механизмы резистентности. Происходит учащение спонтанной импульсации нейронов SCH, не связанных с суточной активностью, секреция коритиколиберина и окситоцина при этом увеличивается, гонадолиберина и опиоидов - уменьшается [Демко П.С. с соавт., 2002; Кузнецов И.Э., 2003; Sharkey J. et al., 2000; Fonnum F., Lock E.A., 2004; Slikker W.Jr. et al., 2005].
3. Следовательно, наличие сильного относительно мало повреждаемого SCh у животных с высокой стресс-реактивностью способно модулировать триггерные эффекты стресса, тонически повышая активность многих структур ЦНС и более жестко блокируя основные гормональные оси, затормаживаемые при остром стрессе (половых гормонов, гормона роста и др.). Этим и достигается более очерченная яркая картина стрессовой реакции у животных с высокой стресс-реактивностью.
Наконец, паравентрикулярное ядро занимало в наших исследованиях особое место. Детально изученное, оно справедливо называется ключевым триггерным ядром стресса. В первую фазу стресса оно выбрасывает большие количества кортиколиберина, оказывающего дальнейшее влияние на деятельность симпатико-адреналовой системы и, соответственно, изменение коронарного кровотока, артериального давления, частоты сердечных сокращений, сосудистой проницаемости [Кузнецов И.Э., 2003; Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Куликов В.П. с соавт., 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2006; М.Ю.Капитонова с соавт., 2008]. Известно, что при стрессе кортиколиберин может непосредственно использоваться в ткани гипоталамуса в качестве нейротрансмиттера для модуляции высших поведенческих реакций [Shumake J. et al., 2001; Boutahricht M. et al. 2005].
У интактных животных мы не выявили существенных особенностей строения самих нейронов PV в связи со стресс-реактивностью. В то же время, на один нейрон в PV животных ВСР группы приходилось в среднем меньше граничных нейронов и астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными показателями в НСР группе. Мы предположили, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столько филогенетически закрепленным для данного вида строением PV, сколько особенностями относительно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамических связей (нейропиля).
В то же время, наличие в PV интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его более высокой реактивности при развитии стресса. На основании математического анализа связей со стресс-реактивностью PV было отнесено к сильным, но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессу.
Действительно, при моделировании стресса у животных ВСР группы мы обнаружили большую степень поражения нейронов (25,6% против 13,8% в НСР группе). ОД нейронов в PV у животных с высокой стресс-реактивностью уменьшалась почти вдвое, а в НСР группе - только на 37%, аналогично более интенсивные изменения были определены и для размеров ядер нейронов, прироста коэффициента окружение/нейрон и микроглиальной реакции.
При сопоставлении полученных данных о строении интактного PV в связи со стресс-реактивностью и его стресс-индуцированных изменений, мы построили следующее логическое заключение.
1. Основной функцией PV является секреция окситоцина и вазопрессина крупноклеточной частью нейронов, мелкоклеточная часть ядра модулирует эти функции и секретирует кортиколиберин [Акмаев И.Г., 2001; Евсеев В.А., с соавт. 2001; Stern J.E., Zhang W., 2003]. Кроме этого, в PV происходит синтез эндорфинов, ангиотензина, соматостатина, соматолиберина и пролактолиберина [Campbell R.E. et al., 2003]. Ассоциативные нейроны PV имеют в основном пептидергическую природу и обеспечивают взаимодействие пулов основных клеток-гормонопродуцентов, и на местном уровне акцептируют результат [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Лискина Е.Б., 2003; Кузнецов И.Э., 2003; Kc P. et al. 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Jingyi M.A. et al., 1994; Jorgensen H. et al., 2003; Nomura M. et al., 2003; Dallman M.F. et al., 2005].
2. PV непосредственно участвует в запуске стрессовых реакций. Выброс кортиколиберина и молекулярные изменения в нейронах PV показаны уже спустя несколько секунд от начала стрессорного повреждения - раньше всех других изменений секреции в ЦНС [Корнева Е.А., 2000; Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т., 2002; Reyes T.M. et al., 2003; Campbell R.E. et al., 2003; Girotti M. et al., 2006; McCormick C.M. et al., 2007]. Нейроны PV, синтезирующие вазопрессин и соматостатин, также являются стресс-реактивными с ответом на стрессорное раздражение через 3-6 мин от его начала [Kc P. et al. 2002; Girotti M. et al., 2006; Dallman M.F. et al., 2005].
3. Соответственно, у животных с высокой стресс-реактивностью мы наблюдаем не столько повреждение, сколько истощение PV при стрессе, обеспечивающее максимально выраженный характер стрессорной активации с выбросом кортиколиберина и других модулирующих стрессорные реакции гормонов. Это, безусловно, сильное ядро у животных с высокой стресс-реактивностью. Его весьма высокая степень повреждения при развитии стресса преимущественно определяются функциональной нагрузкой PV и слабостью его микроглиального представительства.
Завершая описание переднего гипоталамуса в нашей работе, мы не можем не коснуться и не обсудить результатов нового метода исследования в нейроморфологии - радиальной морфометрии биологических объектов с использованием биологически актуальной системы координат.
Принцип радиальной морфометрии основан на классических концептах нейроморфологии, благодаря которым и были, собственно говоря, выделены, ядра гипоталамуса [Автандилов Г.Г., 1973; Боголепов Н.Н, 1980; Писарев В.Б., 1990; Thompson R.H., Swanson L.W., 2002]. Компьютерная морфометрия, основанная на построении осевых градиентов (трансверсального, дорсовентрального и краниокаудального) тинкториальных свойств нервной ткани является эффективным подходом к анализу конституциональных особенностей морфологии ЦНС. С помощью формализованных показателей функции распределения интенсивности при морфометрии препаратов, окрашенных классическим для нейроморфологии методом - тионином по Нисслю, нам удалось показать особенности, свойственные SO, SCh, PV у животных с различной стресс-реактивностью.
1. У животных с высокой стресс-реактивностью, структуры переднего гипоталамуса, расположенные краниально, имели меньшее соотношение нейрон/глия, а структуры, расположенные каудальнее - большее, в сравнении с НСР группой.
2. У интактных крыс с высокой стресс-реактивностью плотность расположения нейронов в SO оказывалась достоверно выше в вентральной части ядра и имела флуктуации плотности (идентифицируемые как нейронные ансамбли), тогда как у крыс НСР группы нейроны располагались более равномерно по всему объему SO. При стрессе наблюдалось выравнивание (гомогенизация) плотности, более показательное у животных с высокой стресс-реактивностью.
3. У животных ВСР группы вне стресса нейроны плотнее располагались к дорсомедиальной части SCh, в то время как у крыс с конституционально низкой реактивностью - к медиальной части, часто образуя при этом нейронные ансамбли. При стрессе у животных ВСР группы снижались медиолатеральный и дорсовентральный градиенты, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью сохранялось относительно плотное и гомогенное расположение нейронных ансамблей со склонностью к концентрации в дорсомедиальном направлении от центра ядра.
4. В PV интактных животных ВСР группы нейроны располагались равномерно, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью их плотность нарастала к центру ядра. При стрессе дорсовентральный градиент плотности нейронов выравнивался, появлялось четкое понижение плотности к латеральной периферии ядра, более выраженные в ВСР группе.
В настоящее время все чаще звучит мысль о том, что современная количественная морфология с введением в практику компьютерного анализа образов должна перейти от механической лоцифровки численных показателей, описывающих структуры, к более сложным, интерпретирующим связям между элементами единой системы гистиона [Автандилов Г.Г., 2002; Писарев В.Б., с соавт., 2006; Hamano H. et al., 2002].
В переднем гипоталамусе удалось проанализировать и NO-зависимый механизм повреждения нейронов.
Окись азота участвует в механизмах повреждения нейронов при травме, острой ишемии мозга, стрессе и шоке. Любые процессы, ведущие к накоплению ионов Са2+ в клетке (энергетический дефицит, изменения активного ионного транспорнта, глутаматная лэксайтотоксичность, оксидантный стресс), сопровожданются повышением уровня NO [Марков Х.М., 2006; Yamamoto F. et al., 2007; Gingerich S., Krukoff T.L., 2006].
Возбуждение NMDA рецепторов приводит к активации NOS-1 и повыншенному высвобождению NO. В настоящее время нет однозначного мненния о роли оксида азота в механизме токсического действия глутамата. Его токсическое действие связано с нарушением митохондриального окислинтельного фосфорилирования и метаболизма рибонуклеотидредуктазы, обнразованием свободнорадикального соединения пероксинитрит-аниона, конторое блокирует ряд нейрональных рецепторов, инактивирует фермент супероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисленния, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [Лискина Е.Б., 2003; Zanchi A. et al., 1995; Brenman J.E., Bredt D.S., 1996; Eliasson M.J. et al., 1999; Han H.S. et al., 2002; Meini A. et al., 2006].
В то же время, имеются сведения о том, что NO, активируя растворимую гуанилатциклазу, повышает синтез циклического гуанозинмонофосфата и может занщищать нейроны при токсическом воздействии глутамата. Формирование нитрозониума-иона NO+, связывающего регуляторный центр NMDA рецепторов, уменьшает их возбудимость и снижает чувствительность к повреждению [Недоспасов А.А., 1998; Тотолян А.А., 2003; Малышев И.Ю., с соавт., 2004; Pringle A.K. et al. 1999; Golde S. et al., 2002; Yamamoto F. et al., 2007].
Таким образом, проявляется двойственная природа окиси азота, принсущая многим природным модуляторам.
Результаты наших экспериментов свидетельствуют о неодинаковой экспрессии нитроксидсинтазы в переднем гипоталамусе.
У интактных крыс ВСР группы относительно высокий процент иммунопозитивных нейронов выявлялся в медиальном преоптическом, паравентиркулярном и супраоптическом ядрах, несколько меньше была экспрессия в POl, PeV и SCh. Экспрессия NOS-3 была относительно невелика, в сравнении с НСР группой. Наличие относительно высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, свидетельствующий о более высоком представительстве эндотелиальной нитроксидсинтазы, мы отнесли к предикторам более высокой стресс-реактивности. По-видимому, исходно низкое представительство эндотелиальной изоформы NOS имеет прямое отношение к последующей динамике стрессорного повреждения нейронов в этом участке ГМ и может быть использовано при разработке новых подходов к нейропротекции.
Действительно, при стрессе мы увидели различия в экспрессии нитроксидсинтаз по отдельным ядрам.
1. В SO и PV крыс ВСР группы при стрессе наблюдался относительно больший прирост NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, что отражало более высоком участие эндотелиальной нитроксидсинтазы в развитии стрессорного повреждения нейронов.
2. В SCh стрессированных крыс ВСР группы наблюдался относительно меньший прироста NOS-1 и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3, что соответствовало меньшему повреждению нейронов.
В то же время, интенсивность повреждения нейронов при стрессе, зависящая от стресс-реактивности животных, в преоптической группе ядер, по-видимому, в малой степени была связана с местными механизмами взаимодействия двух изоформ нитроксидсинтаз.
Вентромедиальное ядро особенностей, связанных со стресс-реактивностью, практически не имело. Лишь у крыс ВСР группы нейроны VM имели несколько большие размеры ядра и меньшее отношение перикарион/ядро, среднее количество граничных астроглиоцитов было больше примерно на треть аналогичного показателя у крыс с низкой стресс-реактивностью.
При стрессе степень повреждения нейронов в VM также не различалась между группами, была относительно высокой, составляя около 22%.
Как известно, вентромедиальное ядро функционально является лцентром насыщения и через свои многочисленные связи с различными структурами ЦНС и внутри гипоталамуса является классически модулирующим для большинства других ядер [Акмаев И.Г., 2003; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Bowie A., OТNeill L.A., 2000; Tran P.V., et al., 2006; Goto S. et al., 2007].
По-видимому, фенотипически проявляющаяся высокая стресс-реактивность не требует каких-либо особенностей от строения VM, равно как она и не отражается на его вовлеченности в стресс-индуцированное повреждение гипоталамуса.
Дорсомедиальное ядро у интактных крыс имело многочисленные особенности в связи с их стресс-реактивностью. Для животных ВСР группы были характерны относительно более плотно расположенные крупные нейроны с большим ядром и объемом перикариона, малым объемом перикарионного окружения. Для таких нейронов характерно большое число граничных нейронов, микроглии и, в особенности, - астроглии. Процент катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов был достоверно больше. На основании математического анализа мы отнесли DM у крыс с высокой стресс-реактивностью к числу сильных, но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению.
При стрессе степень повреждения нейронов в DM существенно различалась между группами: 7,2% в ВСР и 15,2% - в НСР группе.
У животных с высокой стресс-реактивностью ОД нейронов уменьшалась 10,7%, у крыс НСР группы - на 15%. Объемное отношение нейронного окружения к перикариону увеличивалось при стрессе в ВСР группе в 1,4 раза, в НСР группе - в 1,1раза. Коэффициент микроглия/нейрон возрастал на 23,9% в ВСР группе, на 81,3% - в НСР группе. При иммуногистохимическом выявлении тирозингидроксилазы зафиксировано частичное истощение синтетической активности катехоламинергических нейронов, более выраженное у животных с низкой стресс-реактивностью. В противовес этому, экспрессия GR2 увеличивалась без каких-либо существенных различий между группами.
Для объяснения подобного несовпадения между изначальным прогнозом и степенью стрессорных изменений нами были проанализированы возможные дополнительные факторы, имеющие значения для повреждения DM в связи с его функцией и участием в развитии стрессовой системы.
1. Как известно, DM относится к структурам, осуществляющим на уровне гипоталамуса коммуникацию между нейроэндокринными, вегетативными и поведенческими реакциями, включая участие в болевой (ноцицептивной) системе. Это обеспечивается наличием весьма широкого спектра медиаторов: норадреналина, серотонина, дофамина, ГАМК, ряда пептидов [Westphal R.S. et al., 1999; Morin S.M. et al., 2001; Lay A.J. et al., 2007; Goswami C. et al., 2007]. Не следует забывать о сексуальном диморфизме ядра и о его участии в регуляции полового поведения [Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006].
2. При стрессе в DM происходит многократное увеличение (взрыв) медиаторной активности, причем описано генетическое детерминирование силы ответа [Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996; Paskitti M.E. et al., 2000; Lowry C.A. et al., 2003]. Сама территория DM при стрессе относится к уязвимым, и становится местом выраженных микроциркулярторных нарушений, отека и гибели нейронов [Смирнов А.В., 2003, 2005; Nedungadi T.P. et al., 2006].
3. Следовательно, объяснение столь мощного повреждения DM у животных с высокой стресс-реактивностью следует искать не столько в особенностях строения ядра до начала стресса, сколько в его более интенсивном вовлечении в развитие стрессовой системы при активации сильных триггерных ядер, прежде всего - PV. Это позволяет отнести механизм большего стресс-индуцированного повреждения DM у животных с высокой стресс-реактивностью к вторичным.
Аркуатное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью имело ряд особенностей. Прежде всего, для него были характерны относительно большая ОД нейронов, с несколько меньшие размеры ядер нейронов, но большие размеры перикарионов. При относительно небольшом объеме перикарионного окружения нейроны ARC у животных с высокой стресс-реактивностью имели большее число граничных астроглиоцитов и меньшее - микроглиоцитов. Для них характерны более низкие экспрессии тирозингидроксилазы и рецепторов глутамата. По результатам математического анализа ARC было отнесено к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению.
Как и большинство ядер переднего и среднего гипоталамуса, ARC имеет множественное медиаторное представительство (дофамин, серотонин, брадикинин, ГАМК, нейропептид Y, субстанция Р, эндорфин), и выполняет ассоциативные и гормональные функции. Основные гормоны, происходящие из ARC - меланокортин и гонадолиберины, частично разделенные в ядре пространственно [Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006; Boche D. et al. 2003; Balkan B. et al., 2003; Wu Y.H., et al., 2006; Lowry C.A. et al., 2007].
При стрессе одни авторы указывают на умеренное [Демко П.С. с соавт., 2002; Кузнецов И.Э., 2003; Sharkey J. et al., 2000; Fonnum F., Lock E.A., 2004; Slikker W.Jr. et al., 2005], другие - на весьма высокое повреждение ARC [Писарев В.Б., 1990; Казакова Т.Б. с соавт., 2000; Смирнов А.В., 2003; Фролов В.И., 2004; Копылова Г.Н., с соавт., 2007].
В наших исследованиях, при стрессе степень повреждения нейронов в ARC достоверно различалась между группами: 2,6% в ВСР и 9,2% - в НСР группе. Аналогичные доказательства были получены и при корреляционном анализе основных морфометрических показателей.
Для дополнительного обоснования этого факта мы приняли во внимание несколько известных данных.
Во-первых, наибольшая концентрации рецепторов к кортиколиберину за пределами гипофиза выявлена в аркуатном ядре гипоталамуса [Slikker W.Jr. et al., 2005]. Это свидетельствует в пользу его быстрого вовлечения в работу стрессовой системы.
Далее (это уже наши находки), нейроны аркуатного ядра обладают у крыс с высокой стресс-реактивностью более высоким представительством катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрессовой реакции.
Еще одна особенность лежала в специфичности ядра в связи с его участием в регуляции секреции половых гормонов. Освобождаемый из нейронов гонадолиберин только по классической схеме избирательно действует на клетки аденогипофиза. Реально локальное выделение этого релизинг-гормона в гипоталамунсе сопряжено с активностью и секрецией не только половых гормонов, но и норадреналина, дофамина, гистамина, глутамата, ГАМК. Они обладают мощными связями с циркадианной ритмикой, акцепцией боли, и многими другими вегетативными функциями, а также иммунологической реактивностью организма [Николс Дж. Г., 2003; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004]. Эти факты лежат в основе прямого доказательства параллелей между иммуносупрессивным и гипорепродуктивными эффектами хронического стресса [Клименко В.М., 1993; Friedman E.M., Irwin M.R., 1995; Dufourny L., Skinner D.C., 2002].
В мамиллярном комплексе наше внимание привлекли в основном две структуры: супрамамиллярное ядро и дорсальная часть премамиллярного ядра.
У животных с высокой стресс-реактивностью в супрамамиллярном ядре ОД нейронов, СО ядер и перикарионов нейронов, объемы нейронного окружения, среднее число граничных клеток на 12%-25% превышали аналогичные показатели у крыс НСР группы. При высоком микроглиальном представительстве в целом, коэффициент микроглия/нейрон был на 25% меньше в ВСР группе.
При стрессе у животных ВСР группы степень повреждения нейронов в SuM оказывалась значительно выше, чем в НСР группе (29,8% против 12,1%). Такие важнейшие для определения стресс-индуцированного повреждения ядра показатели морфометрии, как снижение ОД нейронов, увеличение СО ядер нейронов и увеличение коэффициента микроглия/нейрон были выражены в SuM у животных с высокой стресс-реактивностью значительно ярче, в сравнении с альтернативной группой.
В PMd объемная доля нейронов у крыс с высокой стресс-реактивностью на 24,9% превышала аналогичный показатель в НСР группе с низкой стресс-реактивностью, среднее число нейронов и средние размеры их ядер - на 20%. На каждый нейрон PMd у животных с высокой стресс-реактивностью приходилось на 39,6% больше граничных нейронов и на 51% больше граничных астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными показателями в НСР группе. Остальные показатели существенно не отличались между группами.
При стрессе в PMd различий между группами в степени повреждения нейронов не было отмечено (около 12%). Не было различий у степени снижения ОД нейронов, изменения СО ядер нейронов, отношения окружение/перикарион и коэффициента микроглия/нейрон.
На основании математического анализа мы пришли к выводу, что SuM относится к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессовому повреждению, а PMd - к ядрам, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависит.
Для объяснения феноменов, развивающихся в мамиллярном комплексе при стрессе, мы приняли во внимание следующие факты.
1. Мамиллярный комплекс относится к наиболее древним образованиям гипоталамуса и функционально связан скорее с другими отделами лимбической системы (прежде всего - гиппокампом), нежели с вентральными ядрами и секреторной частью гипоталамуса. Нейроны SuM и PMd этого комплекса оказывают тормозное ГАМК-ергическое влияние на кору, ретикулярную формацию и элементы лимбической системы. На основании наличия этих связей предполагают участие структур мамиллярной области в выявлении образов памяти и формировании эмоциональной окраски поведения, в том числе - при стрессе [Писарев В.Б. с соавт., 2006; Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996; Wirtshafter D., 1998; Nakamura M., et al., 2007].
2. Исследуя PMd при хроническом стрессе, В.Б.Писарев с соавт. (1995) описали нейроны этих ядер как максимально резистентные к повреждению среди всех структур маммилярного комплекса, а нейроны SuM - как наименее резистентные. Предварительное повреждение мамиллярных тел сопровождается снижением скорости принятия решений при стрессорных нагрузках и усиливает степень стрессорного повреждения внутренних органов [Тарабрина Н.В. с соавт., 1996; Beracochea D.J., Jaffard R., 1995]
3. Следовательно, элементы мамиллярного комплекса не могут, за исключением SuM, быть отнесены к ключевым структурам, определяющим на уровне гипоталамуса стресс-реактивность и уровень стрессорного повреждения. Их собственное повреждение носит скорее перегрузочный характер и определяется относительно большей интенсивностью стрессорной афферентации лимбической системы у животных с высокой стресс-реактивностью.
Таким образом, проведя детальный анализ по отдельным ядрам гипоталамуса, мы можем утверждать, что на ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое Ц в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, в котором можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью. С другой стороны, наличие (предсуществование) этих особенностей только частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.
Изменения гипоталамуса при стрессе развиваются не во всех ядрах и носят комплексный характер, в качестве обязательных компонентов включая в себя сосудистые нарушения, повреждение и компенсаторную перестройку нейронов, изменения нервных проводников и реакцию нейроглиальных элементов (табл.2).
В целом, можно подтвердить, что конституционально высокая стресс-реактивность является фактором, обеспечивающим при стрессе относительно более высокое повреждение нейронов в супраоптическом, паравентрикулярном и супрамамиллярном ядрах и ретрохиазмальной области гипоталамуса, но меньшее повреждение нейронов в перивентрикулярном, супрахиазматичеком, дорсомедиальном ядрах и латеральной гипоталамической области. Эти различия не обязательно наблюдались только в ядрах с высокой интенсивностью стресс-индуцированных повреждений.
Обнаруженный полиморфизм изменений основных ядер гипоталамической области выявил ряд специфических черт, характерных для высокоорганизованных структур ЦНС:
- высокий процент клеток с сохранной структурой, находящихся в состоянии повышенной функциональной активности;
- большую зависимость изменений от локализации и функционального предназначения ядра, нежели от его васкуляризации и глиального представительства;
- выраженный краниокаудальный и дорсо-вентральный градиент поражения при полном отсутствии билатеральной асимметрии (рис. 5).
Таблица 2
Степень повреждения нейронов (%, Mm) при 24-часовом иммобилизационном стрессе крыс с различной стресс-реактивностью
| Ядра и поля Гипоталамуса | Группы животных | |||
ВСР | НСР | |||
Интактные | Стресс | Интактные | Стресс | |
Передняя группа | ||||
Мед. преоптическое (POM) ат. преоптическое (POL) Перивентрикулярное (PeV) Супраоптическое (SO) Супрахиазматическое (SCh) Паравентрикулярное (PV) Преоптическая область (APO) Ретрохиазмальная область (RCh) | 0 0 0,90,1 2,70,2 0 3,50,2 0 0,50,1 | 4,50,3* 2,30,2* 6,10,5* 22,01,2* 3,40,2* 25,61,3* 3,80,3* 9,10,7* | 0 0 1,00,2 0,60,1# 0 0,50,1# 0 0 | 5,00,4* 2,60,3* 11,00,2*# 14,31,1*# 7,10,5*# 13,81,4*# 4,00,3* 6,20,5*# |
Медиальная и латеральная группы | ||||
Дорсомедиальное (DM) Вентромедиальное (VM) Аркуатное (ARC) ат. гипоталамическое ядро (NHL) атеральное поле (AHL) Серый бугор (TGr) | 0,60,1 1,30,2 0 0 0,60,1 0 | 7,20,5* 21,81,6* 2,60,2* 11,20,7* 9,10,6* 3,30,4* | 0 0 0 0 0 0 | 16,51,3*# 22,02,1* 9,20,8*# 11,01,2* 12,51,6*# 3,20,4* |
Задняя группа | ||||
Супрамамиллярное (SuM) ат. мамиллярное (ML) Мед. часть медиального мамиллярного (MMm) ат. часть медиального мамиллярного MMl) Дорсальная часть премамиллярного (PMd) Вентральная часть премамиллярного (PMv) | 2,10,2 0 0 0 1,10,2 1,00,2 | 29,82,3* 2,90,2* 2,80,2* 3,10,2* 11,81,0* 3,60,4* | 1,10,2# 0 0 0 0,50,1# 0 | 14,81,1*# 3,00,3* 3,20,3* 3,30,3* 12,11,0* 3,90,5* |
* - достоверные различия между интактными и после стресса,
# - между ВСР и НСР группами
Дорсовентральный градиент
Медиолатеральный градиент
Рис. 5. Дорсовентральный и медиолатеральный градиенты плотности нейронов в супраоптическом ядре гипоталамуса при стрессе крыс с высокой стресс-реактивностью. Ось абсцисс Ц доли в масштабах ядра, ось ординат - удельная плотность нейронов.
При прочих равных в гипоталамусе в большей степени подвергаются морфофункциональным преобразованиям эволюционно молодые, лучше васкуляризованные и более функционально нагруженные области. Выявленные закономерности в целом не противоречат общим представлениям о нейроморфологии стресса [Крыжановский Г.Н., 2001; Зиматкин С.М., с соавт., 2003; Schiltz J.C., Sawchenko P.E., 2002; Ajmone-Cat M.A., et al., 2002; McGill B.E., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006].
Следующий вопрос, требующий обсуждения, - возможные пути и механизмы деплеции нейронов при стрессорном повреждении.
Во-первых, наблюдаемая в наших опытах при стрессе степень повреждения нейронов ни в одном из ядер и полей гипоталамуса не была фатальной. Оставшийся объем нейронов был вполне достаточен для выполнения функции ядра и поддержания его структурно-функциональной целостности. При этом степень повреждения существенно варьировала (от 2,9%-5,0% (то есть статистически недостоверного), до 25%-30%, что могло рассматриваться как повреждение средней степени с серьезными последствиями для самого ядра и организма в целом.
У животных НСР группы максимальные изменения фиксировались в VM (22%), DM (16,5%), PeV, SO, PV, SuM, PMd и латеральном гипоталамическом поле (все в пределах 11% -14,3%). У животных с высокой стресс-реактивностью степень повреждения в VM (21,8%) и PMd (12,1%) была аналогичной, в SO (22%), PV (25,6%), SuM (29,8%) - оказывалось значительно выше, а в PeV, SCh и DM - достоверно ниже, в сравнении с этими же показателями в НСР группе.
Таким образом, анализ степени стрессорного повреждения выявил несколько структур гипоталамуса, лактуальных с точки зрения стресс-реактивности. Наиболее поражаемыми при стрессе являлись нейроны (в порядке убывания) в следующих ядрах гипоталамуса: паравентрикулярное, супрамамиллярное, вентромедиальное, супраоптическое.
Нами на основании математического анализа были выделены несколько ключевых изменений, связанных как со стрессом, так и различиями в стресс-реактивности животных.
1. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с увеличением степени повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что характерно для SO, PV, SuM, PMd.
2. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с уменьшением степени повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что характерно для SCh и DM.
3. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с более выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для SO, PV и SuM.
4. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с менее выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для DM и PMd.
Интересно, что такие исследованные показатели, как тканевое распределение нейрональной нитроксидсинтазы и ее соотношение с эндотелиальной изоформой, тирозингидроксилазы (дофаминергического представительства) и глутаматного рецептора не позволили прийти к сколько-нибудь однозначному заключению об их роли в нейрональном повреждении при стрессе, тем более - о его зависимости от стресс-реактивности.
При наличии стрессорного повреждения основная реакция в ядрах гипотатамуса, на наш взгляд, связана с изменением межклеточного взаимодействия микроглия Ц нейрон.
Большая сложность организации нейропиля ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической области является одним из доказательств большего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравнении с нервными внутригипотамическими связями.
Изменения нервных волокон и нервных проводников характеризовались набуханием, гомогенизацией, избыточной аргирофилией и частичной фрагментацией. Максимальным изменениям подвергались нисходящие таламические волокна и эфферентные пути самого гипоталамуса, меньшему повреждению - афферентные восходящие волокна и гипоталамо-гипофизарные связи. На всем протяжении гипоталамуса, с постепенным уменьшением к преоптической области и усилением в вентральных отделах, обнаруживались мелкие и более крупные участки микроглиоза. В зонах максимального повреждения нейронов (PV, VM, SuM) возможно было появление мелких групп гипертрофированных микроглиоцитов, иногда с образованием зернистых шаров. Степень микроглиальной реакции была пропорционально степени нейронального повреждения и, соответственно, убывала в ряду PV, SO, VM, SuM > передняя и наружная группы ядер > PeV, RCh, AHL, PMd > POM, DM, ARC > остальные ядра преоптической области и мамиллярного комплекса.
При иммуногистохимическом окрашиванием на кислый глиальный протеин мы показали, что при стрессе наблюдается уменьшение фактора формы проводников, снижение отношения яркостей GLAP/матрикс более чем на треть в ВСР группе и на 45% - в ВСР, а также снижение объемной доли GLAP-позитивного материала.
Как известно, именно в сохранности проводников усматривается пролонгация работы стресс-системы на высоком уровне активности. При стрессе нейроны латеральной области быстро истощаются и становятся гипосекреторными [Талалаенко А.Н. с соавт., 2001; Bruses J.L., Rutishauser U., 1998; Kiss A., 2007; McCormick C.M., et al., 2007].
В любом ядре ГМ астроглия, олигодендроглия и микроглиоциты весьма плотно упакованы, но взаимодействие между этими клетаками не в полной мере определяется плотностью этой упаковки [Krasowska-Zoladek A., et al., 2007].
Обычно астроциты и микроглия клетнки реагируют на повреждение нейронов репликацией. Они участвуют в удалении продуктов распада и восстановлении тканевых взаимоотношений. На пернвом этапе микроглиальные клетнки и макрофаги, которые проникают в понврежденный участок ЦНС из крови, соответственно делятся и удаляют продукты распада умирающих клеток [Block M.L. et al., 2007; Taner D.,а et al., 2007].
Сразу после повреждения ЦНС микроглиальнные клетки мигрируют к месту повреждения со скоростью около 300 мкм/час, аккумулинруются на этом месте и фагоцитируют повренжденную ткань. Гибридизация in situ и иммунохимические реакции показали, что микронглиальные клетки продуцируют в месте понвреждения ламинин Ч молекулу экстраклеточного матрикса, которая способнствует росту нейритов в культуре и in vivo.
Интересно, что глиальные клетки играют важную роль в захвате медиаторов в ЦНС, как при физиологических, так и при патонлогических условиях. Система транспорта, сосредоточеннная в глиальных клетках, играет ключевую роль в предотвращении избыточного накопнления глутамата во внеклеточном пространнстве и гибели нейронов от эксайтотоксичности [Москалева Е. Ю., Северин С. Е., 2006].
При повреждении ГМ, в том числе стрессорном, глиальные клетнки начинают выделять глутамат во внекленточное пространство. Поврежденные и погибанющие нервные клетки освобождают глутанмат и К+, деполяризуют глиальные клетки и другие нейроны, котонрые в свою очередь освобождают еще больше глутамата [Чехонин В.П., с соавт., 2007; Block M.L. et al., 2007].
В подтверждение этому, в структурах медиального гипоталамуса (DM, VM), имеющих высокий процент глутаматцептивных нейронов, мы наблюдали максимальную степень повреждения нейронов при стрессе.
Еще одним из механизмов участия глиальных клеток в стрессорном повреждении нейронов гипоталамуса является их близкое расположение к элементам гематоэнцефалического барьера. Он располагается в местах сонединения между эндотелиальными клетками кронвеносных капилляров в мозге. Для того, чтобы проникнуть из крови в мозг, молекулы должны пройти ченрез эндотелиальные клетки, а не между ними. Взаимодействия между астроцитами и эндотелиальными клетками мозгонвых капилляров носят специфический харакнтер [Kwon M.S., et al., 2006; Taner D.,а et al., 2007; Lay A.J., et al., 2007].
Анализ эффектов, вызываемых гипоталамусом, крайне сложен ввиду разннообразия рецепторов и большого числа пептидов и непептидных медиаторов. Гипоталамус является областью мозга, управляющей общей активностью вегетантивной нервной системы, а также регулинрующей секрецию гормонов. Но и сам он подвержен многоступенчатому влиянию со стороны высших центров ЦНС, периферических афферентов и горнмонов.
Тем не менее, мы считаем, что выявленные нами особенности строения гипоталамуса в связи со стресс-реактивностью и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.
Гипоталамус регулирует практически все интегративные вегетативные функции, включая температунру тела, аппетит, потребление воды, дефеканцию, мочеиспускание, частоту сердечных сонкращений, артериальное давление, половую деятельность, лактацию, а также, в более меднленной временной шкале, рост тела. Именно в нем эмоции сопрягаются с вегетативными ответами: мысль о пище приводит к секренции слюны, ожидание физической нагрузнки - к повышению симпатической активнности и т. д. Одним из механизмов такого сопряжения является нормирование силы и скорости ответа, то есть формирование ритмики жизнедеятельности [Акмаев И.Г. с соавт., 2003, 2005; Gibson L.E. et al., 2006; Lowry C.A. et al., 2007; Stone E.A., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M., et al., 2007].
В одном исследовании проследить и спрогнозировать вовлеченность стресс-реактивности во все перечисленные процессы практически невозможно. Однако сопоставление особенностей строения ядер с их функцией позволяет считать, что животные с высокой стресс-реактивностью в силу особеностей строения PV, SO и SuM обладают более выраженным и относистельно непродолжительным эндокринным пиком, известным как триггерная реакция стресса. Изменения в этих ядрах при стрессе преимущественно определяются не их исходным строением, а повышенной нагрузкой на них в первую фазу стресса. Особенности строения SCh, DM и PMd обеспечивают у них же устойчивое развитие тормозных реакций и стресс-лимитацию. Изменения в других структурах гипоталамуса, равно как и особенности их строения, скорее всего, вторичны, и не носят принципиального характера с точки зрения морфологического субстрата стресс-реактивности.
Сами же по себе стресс-индуцированные изменения в нейронах любой области гипоталамуса при стрессе, как и следует из концепции этого процесса, строго неспецифичны, укладываются в общую схему патоморфологии нервной системы и могут иметь аналитическое значение только при их сопоставлении по локализации, интенсивности и по времени возникновения, а также в сравнении с изменениями других органов и систем.
ВЫВОДЫ
1. Животные с высоким и низким уровнем стресс-реактивности имеют предсуществующие (вне стрессового воздействия) особенности строения отдельных ядер и полей гипоталамуса. Наиболее вариабельными структурами гипоталамуса в связи со стресс-реактивностью у интактных животных в отношении плотности и размеров расположения нейронов, объема нейронного окружения, количества астро- и микроглии являются медиальное преоптическое, супраоптическое, супрахиазматическое, дорсомедиальное, супрамамиллярное ядра, а также нейропиль ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической областей.
2. В зависимости от выявленных различий в строении нейронов, сложности организации и характера нейронного окружения, основные (актуальные) ядра гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью могут быть отнесены к одной из четырех групп: сложноорганизованные сильные ядра с потенциально высокой устойчивостью к повреждению (супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентральная часть премамиллярного ядра), сильные со сниженной потенциальной резистентностью (паравентрикулярное и дорсомедиальное), слабые с высокой резистентностью (супраоптическое и перивентрикулярное ядра) и слабое с низкой резистентностью (медиальное преоптическое ядро).
3. Нейроны супрахиазматическиого и супраоптического ядер гипоталамуса животных с высокой стресс-реактивностью обладают общими ультраструктурными особенностями, заключающимися в относительно большей доли эухроматина в структуре ядра, в отсутствии инвагинаций кариолеммы, большей плотности органелл в цитоплазме перикариона, мономорфности митохондрий и относительно меньшей плотности их матрикса. Эти особенности в своей совокупности отражают более высокую функциональную активность и лабильность этих клеток при стрессорных стимулах.
4. Относительно высокая экспрессия нейрональной нитроксидсинтазы NOS-1 при сниженной экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы NOS-3 является одним из ключевых особенностей ядер переднего гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью. Наиболее выраженная вариабельность в экспрессии нитроксидсинтаз в зависимости от стресс-реактивности характерна для медиального преоптического, супраоптического и паравентрикулярного ядер.
5. Сочетание относительно высокой экспрессии тирозингидроксилазы (катехоламинергическое представительство) и низкой экспрессии рецептора GR2 (глутаматцептивное представительство) относятся к ключевым особенностям ядер среднего гипоталамуса, что в максимальной степени характерно для дорсомедиального ядра.
6. Наибольшая вариабельность строения нейропиля животных с различной стресс-реактивностью характерна для ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической областей, и заключается в его более сложной организации, более плотном расположении волокон, почти вдвое большем показателе извитости волокон и большей экспрессии кислого глиального протеина GFAP.
7. При стрессе у крыс слабая или умеренная степень повреждения регистрируется не во всех ядрах гипоталамуса. Изменения в нейронах имеют неспецифический характер и мозаичны по выраженности у соседних клеток, причем различия в степени повреждения у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью не полностью совпадают с различиями в строении этих ядер. В большей степени при стрессе у животных с высокой стресс-реактивностью повреждаются супраоптическое ядро (ВСР - 22%, НСР - 14,3%), паравентрикулярное ядро (ВСР - 25,6%, НСР - 13,8%) и супрамамиллярное ядро (ВСР -29,8%, НСР - 14,8%). Меньшая степень повреждения для животных с высокой стресс-реактивностью характерна для перивентрикулярного ядра (ВСР - 6,1%, НСР - 11%), супрахиазматического ядра (ВСР - 3,4%, НСР - 7,1%), дорсомедиального ядра (ВСР - 7,2%, НСР - 16,5%). При относительно высокой степени повреждения в вентромедиальном ядре (22%) и умеренной - в дорсальной части премамиллярного ядра (12%), они от стресс-реактивности не зависели.
8. На ультраструктурном уровне изменения в нейронах супраоптического и супрахиазматического ядер гипоталамуса при стрессе заключаются в основном в увеличении числа митохондрий, увеличении структурированности их крист, возрастании зернистости матрикса, увеличении числа рибосом и элементов эндоплазматического ретикулума. Эти изменения вместе с признаками истощения секреторных гранул были более выражены у крыс с высокой стресс-реактивностью.
9. У крыс с высокой стресс-реактивностью исходно высокая экспрессия нейрональной нитроксидсинтазы при низком содержании эндотелиальной изоформы NOS-3 в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса сопровождается при стрессе еще большим приростом экспрессии нейрональной изоформы NOS-1 (до 70% позитивных нейронов), что соответствует более высокой степени повреждения нейронов в этих ядрах, которое было подтверждено морфологически.
10. По данным корреляционного анализа, выявлены многочисленные связи между морфометрическими характеристиками ключевых ядер гипоталамуса и количественными показателями стресс-реактивности. У животных с высокой стресс-реактивностью значение более плотного расположения нейронов выявлено у супрахиазматического, дорсомедиального, аркуатного, супрамамиллярного ядер и вентральной части премамиллярного ядра. Менее плотное расположение нейронов оказалось значимым у медиального преоптического, перивентрикулярного и супраоптического ядер. Значение более сложной организации микроокружения было доказано для супраоптического, супрахиазматического, паравентрикулярного, дорсомедиального и аркуатного ядер, менее сложно организованной - для перивентрикулярного ядра.
11. Более высокое количество микроглии оказалось значимым у крыс с высокой стресс-реактивностью только в дорсомедиальном ядре и дорсальной части премамиллярного ядра. Относительно малое количество микроглии было характерно для всех остальных исследованных ядер гипоталамуса.
12. При сохранении общего характера минимальных изменений или умеренного повреждения нейронов в конкретном ядре гипоталамуса стресс-индуцированные изменения определяются, при прочих равных условиях, сложностью его исходной организации, микроглиальным представительством, эволюционной зрелостью, медиаторным представительством и функциональным предназначением в стрессовой системе.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Писарев В.Б., Ерофеев А.Ю., Потанин М.Б. Морфофункциональная харакнтеристика коры и подкорковых структур головного мозга крыс при стрессе // Вестник Волгоградской медицинской академии. - 1995. - №1. - С.15-17.
2. Писарев В.Б., Туманнов В.П., Ерофеев А.Ю., Потанин М.Б. Роль различных иерархических структур головного мозга при психоэмоциональном перенанпряжении // Бюлл. эксп. биол. и медицины. - 1995. - №5. - С. 29-33*. 3. Потанин М.Б. Морфофункциональная характеристика коры головного мозга интактных крыс // Морфология компенсаторно-приспособительных процессов при различных патологических состояниях: Труды Волгоградской мед. академии. - Т. 54, вып. 2. - Волгоград: ВМА, 1998. - С. 123-146.
4. Потанин М.Б. Морфофункциональная характеристика коры головного мозга крыс, подвергнутых хроническому эмоциональному стрессу // Морфология компенсаторно-приспособительных процессов при различных патологических состояниях: Труды Волгоградской мед. академии.- Т. 54, вып. 2. - Волгоград: ВМА, 1998. - С. 147-159
5. Писарев В.Б., Ерофеев А.Ю., Потанин М.Б. Участие структур головного мозга в развитии психоэмоционального стресса // Теоретические и практинческие вопросы медициннской профилактики: Сб. научных работ, посвящ. 50-летию Волгограднского ОЦМП. - Волгоград, 1998. - С.105-107.
6. Писарев В.Б., Потанин М.Б. Морфофункциональное состояние головного мозга стресс-неустойчивых животных при иммобилизационном стрессе // Морфология компенсаторных и приспособительных процессов при действии стрессорно-повреждающих факторов внешней среды: Труды Волгоградской мед. академии. - Т. 57, вып.2. - Волгоград: ВМА, 2001. - С.101-112.
7. Потанин М.Б., Писарев В.Б., Гуров Д.Ю. Патоморфологические изменения в центральной нервной системе при наркотической зависимости // Морфология компенсаторных и приспособительных процессов при действии стрессорно-повреждающих факторов внешней среды: Труды Волгоградской мед. - Т.57, вып.2. - Волгоград: ВМА, 2001. - С.112-115.
8. Писарев В.Б., Гуров Д.Ю., Потанин М.Б. Морфологичеcкое и иммуногистохимическое исследование стриопаллидарной и лимбической систем головного мозга крыс с индивидуальной предрасположенностью к алкогольной зависимости // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2004. - №10. - С. 3-6*.
9. Потанин М.Б., Писарев В.Б. Морфофункциональная характеристика центральной нервной системы в норме и при токсикологическом эксперименте // Морфол. ведомости. - 2004. - N1-2 (прилож.). - С. 83*.
10. Потанин М.Б., Писарев В.Б. Характеристика изменений в центральной нервной системе при наркотической зависимости // Морфология - 2004. - N4. - С. 101*.
11. Писарев В.Б., Гуров Д.Ю., Потанин М.Б., Смирнов А.В. Вариативность индивидуальной организации подкорковых образований головного крыс, конституционально склонных и не склонных к наркотизации // Тез. докл. III Росс. Конгресса по патофизиологии России. - М., 2004. - C. 16.
12. Смирнов А.В., Писарев В.Б., Гуров Д.Ю., Потанин М.Б. Стереометрические и иммуногистохимические изменения в гигантоклеточных ретикулярных ядрах ствола головного мозга растущих крыс под влиянием стрессового воздействия // Тез. докл. III Росс. Конгресса по патофизиологии России. - М., 2004. - C. 159.
13. Писарев В.Б., Новочадов В.В., Гуров Д.Ю., Потанин М.Б. Современные подходы к оценке морфологии промежуточного мозга при конституциональной предрасположенности к алкогольной зависимости // Морф. ведомости. - 2004. - N3-4. - С. 23-24*.
14. Потанин М.Б. Нейроглиальные взаимоотношения в ядрах передней гипоталамической области животных с конституциональной склонностью к потреблению этанола // Бюлл. Волгоградского научного центра РАМН. - 2004. - N3. - С. 12-13.
15. Потанин М.Б. Особенности нейро-глиальных взаимоотношений в гипоталамической области животных с конституциональной склонностью к потреблению этанола // Нейронауки: теоретические и клинические аспекты (Украина). - 2005. - N1. - С. 43-44.
16. Писарев В.Б., Гуров Д.Ю., Потанин М.Б., Новочадов В.В. Новые подходы к изучению структурных основ конституционального аддиктивного поведения // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - Т. 4 (прил. 1). - С. 75.
17. Гуров Д.Ю., Писарев В.Б., Новочадов В.В., Потанин М.Б. Радиальная морфометрия нейронов в оценке конституционально обусловленных особенностей структур промежуточного мозга // Вестник ВоГМУ - 2005. - N1. - С. 6-8*.
18. Потанин М.Б. Супрахиазматическое ядро гипоталамической области: особенности строения, связанные с выской неспецифичексой резистентностью организма // Вестник ВоГМУ. - 2005. - №4. - С. 45-47*.
19. Потанин М.Б. Структурная вариабельность нейронов маммилярного комплекса крыс с различной конституциональной стресс-реактивностью // Вестник ВоГМУ. - 2007. - №2. - С. 24-28*.
20. Потанин М.В., Туманов В.П., Писарев В.Б. Особенности ультраструктуры нейронов супрахиазматического ядра гипоталамуса у крыс с различной стресс-реактивностью // Бюл. экспер. биол. и медицины. - 2007. - №11. - №11. - С. 495-500*.
* - журналы, рекомендуемые ВАК РФ для опубликования материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (медицинские науки)
Подп. в печать 30.04.08. Формат 60 х 84/16 Бум. пл. 80 г/м2.
Печать офсетная. Усл. печ. л. 2.0 Тираж 100. Заказ 58.
Волгоградский государственный медицинский университет,
400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии