Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ПОМОРГАЙЛО

Елена Геннадьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

ПРИ ЕЕ КОЛОНИЗАЦИИ HELICOBACTER PYLORI

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНОТИПА ВОЗБУДИТЕЛЯ И ХОЗЯИНА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Кононов Алексей Владимирович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Медицинского института ФГБОУ ВПО Орловский государственный университет

Ноздрин Владимир Иванович

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией генетики нарушений репродукции ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН

Курило Любовь Федоровна

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник патоморфологической группы клинического отдела ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Щербаков Иван Тимофеевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцпазвития РФ

Защита диссертации состоится л20 декабря 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук (117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан л___ _______________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук                                Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследования по проблеме реактивности тканей составляют часть более широкой общебиологической проблемы реактивности организма. Конкретные формы проявления тканевой реактивности, изменений клеточного дифферона, механизмы регуляции этих процессов составляют важную и перспективную задачу гистологии (Клишов А. А., 2010). На самые разнообразные воздействия ткани реагируют, прежде всего, трансформацией регенерации с изменением пролиферативной активности клеток, а затем и апоптоза. Степень изменения этих показателей зависит как от свойств хозяина, так и от свойств самого повреждающего фактора. Особенно если этот фактор является биологическим, например, таким как бактерия Helicobacter pylori.

С наличием в организме человека Helicobacter pylori связывают развитие хронического воспаления и нарушение клеточного обновления слизистой оболочки желудка. В 1994 году Helicobacter pylori был объявлен Международным агентством по изучению рака канцерогенным фактором I типа для рака желудка человека. Однако Helicobacter pylori инфицирована почти половина человечества, а в России - 70-80 % населения, что делает нереальной всеобщую эрадикацию (удаление) инфекта в качестве основного метода борьбы с раком желудка и необходимость тотальной эрадикации сомнительна.

В последнее время появились данные о том, что не столько свойства бактерии определяют развитие реактивных изменений слизистой оболочки желудка, сколько генетические особенности инфицированного человека (лхозяина) (Аруин Л. И., 2004; Кононов А. В., 2006, 2009; Day A. S., Sherman P. M., 2000; El-Omar E. M., 2001-2008; Peek R. M., 2008; Farshad S. et al., 2010). Функциональный полиморфизм генов, ответственных за распознавание патогена и реализующих свое действие на начальных этапах воспаления, влияет на характер протекания защитных реакций и физиологию слизистой оболочки желудка (Симбирцев А. С., Громова А. Ю., 2005). Предполагают, что высокий уровень интерлейкина (ИЛ) - 1 определяет выраженное воспаление в слизистой оболочке, а также снижает секрецию соляной кислоты в желудке (El-Omar E. M., 2006). Эти свойства цитокина обусловливают развитие в желудке гипохлоргидрии и распространение инфекции из антрального отдела в тело желудка с нарушением регенерации (развитием атрофии) в обоих отделах, что является стартовой площадкой опухолевого роста. Следовательно, генетические особенности инфицированного Helicobacter pylori организма, которые определяют уровень секреции ИЛ-1, могут объяснить биологию взаимодействия инфекта и хозяина. Исследования полиморфизма гена ИЛ-1 при Helicobacter pylori-ассоциированной патологии начаты в Америке (El-Omar E. M. et al., 2000). В дальнейшем подобные исследования были проведены в различных странах мира, но получены весьма противоречивые данные (Camargo M. C. et al., 2006; Loh M. et al., 2009; Xue H. et al., 2010; Persson C. et al., 2011; Zhang B. B. et al, 2012). В России такие исследования буквально единичны (Чернова О. А. и др., 2005; Иванов В. П. и др., 2006; Маев И. В. И др., 2008; Штыгашева О. В. И др., 2010).

Таким образом, вопрос о том, как факторы вирулентности Helicobacter pylori и генетический полиморфизм хозяина влияет на системное функционирование и, особенно на регенерационную способность слизистой оболочки желудка человека, остается до сих пор открытым. Сегодня представляется важным сформировать парадигму адаптации тканевых элементов слизистой оболочки желудка к Helicobacter pylori с учетом генетических особенностей, как бактерии, так и инфицированного человека.

Цель исследования

Определить особенности адаптации тканевых элементов слизистой оболочки желудка при взаимодействии с Helicobacter pylori, определяемые генетическими характеристиками бактерии и хозяина.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ гистоархитектоники слизистой оболочки желудка и параметров физиологической регенерации эпителия слизистой оболочки желудка и ее репаративной регенерации при инфицировании Helicobacter pylori.
2. Дать сравнительную характеристику структурных компартментов мукозального иммунитета слизистой оболочки желудка в условиях инфицирования Helicobacter pylori и после эрадикации инфекта.
3. Установить зависимость репаративной регенерации эпителия слизистой оболочки желудка от генетических особенностей штаммов Helicobacter pylori.
4. Оценить зависимость дифференцировки эпителия слизистой оболочки желудка от уровня мукозального иммунитета, генетических особенностей штаммов Helicobacter pylori и генетической регуляции цитокинового ответа хозяина.
5. Проследить эволюцию преобразований эпителиального дифферона слизистой оболочки желудка через 1-2 и 12 месяцев после эрадикации инфекта в зависимости от генетической характеристики цитокинового ответа хозяина.
6. Установить зависимость морфологических эквивалентов мукозального иммунитета от особенностей генетической регуляции цитокинового ответа хозяина при инфицировании Helicobacter pylori и через 1-2 и 12 месяцев после успешной эрадикации инфекта.

Новизна исследования

Впервые с помощью иммуногистохимических методов с детекцией молекул клеточной дифференцировки определены закономерности строения эпителиального дифферона слизистой оболочки желудка и особенности регенерационного гистогенеза при воздействии биологического фактора (Helicobacter pylori). В условиях взаимодействия двух функциональных систем организмов - эпителия слизистой оболочки желудка и Helicobacter pylori (с его генетическими штаммовыми вариантами) установлена перманентная пролиферация и апоптоз эпителия, расширение пролиферативного компартмента, его транслокация в направлении просвета желудка либо в направлении дна желез, в сочетании с выраженным апоптозом покровно-ямочного эпителии и эпителия желез.

Уточнена топография эпителиальных клеток, продуцирующих белки, отражающих уровень их дифференцировки, в условиях колонизации Helicobacter pylori: белок Shh (условно считающийся маркером желудочной дифференцировки эпителия) присутствует в клетках, выстилающих желудочные ямки и валики, а также в эпителии глубоких отделов фундальных и пилорических желез, MUC5AC (желудочный протекторный муцин) - вырабатывается клетками покровно-ямочного эпителия желез и отдельными клетками перешеечной зоны, MUC6 (желудочный протекторный муцин) - локализуется в клетках слизистой оболочки желудка исключительно в базальной части желез. Топография этих клеток отличается от расположения в неизмененной слизистой оболочке, что отражает изменение функционирования эпителиального дифферона при биологическом (Helicobacter pylori) воздействии.

Установлены особенности межклеточных взаимоотношений (эпителий - лимфоциты - макрофаги) и определена их роль в адаптивной изменчивости организации слизистой оболочки желудка при инфекционном воспалении, вызванном бактериями с разными генетическими штаммовыми характеристиками. Выделена генетическая основа индивидуального иммунного ответа через определение взаимосвязи между полиморфными аллелями генов цитокинов и структурными характеристиками мукозального иммунитета. При анализе взаимоотношений клеток выявлена положительная корреляционная связь между числом пролиферирующих и апоптозных клеток и уровнем лимфо-макрофагальной инфильтрации слизистой оболочки желудка.

Определена взаимосвязь регенерационного гистогенеза слизистой оболочки желудка со штаммоспецифическими особенностями Helicobacter pylori: увеличение пролиферации и апоптоза покровно-ямочного и железистого эпителия слизистой оболочки желудка отмечается при инфицировании хозяина cagA(+) и babA2(+) штаммами Helicobacter pylori; значительное увеличение только индекса апоптоза в эпителиальном диффероне типично для инфицирования vacAs1(+) или vacAs2(+) штаммами Helicobacter pylori, при этом возникает дефицит клеточных форм дифферона - неполная репаративная регенерация.

Установлены закономерности структурных изменений эпителиального дифферона и мукозального иммунитета слизистой оболочки желудка после успешной эрадикации бактерии: восстановление физиологической регенерации эпителия, уменьшение числа клеток с фенотипом CD4+, CD8+, CD20+ и CD68+ и увеличение показателя соотношения популяций CD4/CD8 за счет снижения количества CD8-лимфоцитов (цитотоксических).

В 25 % наблюдений через 12 месяцев после успешной эрадикации инфекта клеточная инфильтрация собственной пластинки иммунокомпетентными клетками и пролиферативная, а также апоптозная активность желудочных эпителиоцитов остается высокой. Отмечается снижение продукции желудочного протекторного муцина MUC5AC клетками покровно-ямочного эпителия, что может отражать уменьшение защитных свойств слизистой оболочки желудка в условиях длительного существующего воспаления даже в отсутствии Helicobacter pylori.

Доказана взаимосвязь полиморфизма генов цитокинов и неблагоприятного течения восстановительного периода (сохранение инфильтрации собственной пластинки иммунокомпетентными клетками) после успешной эрадикации Helicobacter pylori.

Теоретическая и практическая значимость

Данные об особенностях гистологического строения и клеточного обновления слизистой оболочки желудка в норме и при инфицировании человека Helicobacter pylori являются частью фундаментальных исследований в области гистологии, патологической анатомии и гастроэнтерологии. Результаты проведенного исследования расширяют представления о механизмах репаративной регенерации эпителия слизистой оболочки желудка, и могут использоваться в образовательном процессе биологических и медицинских ВУЗов на кафедрах гистологии и патологической анатомии, при подготовке учебных пособий, лекций по клеточной биологии, гистологии, патологической анатомии, а также могут служить основой разработки и внедрения в клиническую практику мероприятий, направленных на диагностику, лечение и профилактику хронических заболеваний слизистой оболочки желудка, связанных с инфекцией Helicobacter pylori.

Полученные данные послужат теоретической базой для разработки патогенетически обоснованной профилактики и терапии Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний человека. Результаты диссертационного исследования свидетельствуют о значимости диагностики генотипирования возбудителя и хозяина для изучения клеточного обновления и воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка, а определение штаммоспецифических характеристик бактерии и генетических особенностей пациента, позволит выработать максимально возможный индивидуальный подход к прогнозу результирующего эффекта взаимодействия инфект-хозяин.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на выездном заседании Проблемной комиссии 56.04 Общая патология и экология человека Научного совета № 56 РАМН Минздравсоцразвития РФ по медицинским проблемам Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера (Омск, 2006 г.); на совместных семинарах сотрудников ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России и ИХБФМ СО РАН (Омск, Новосибирск, 2006 - 2008 гг.); на юбилейной научной конференции Зиновьевские чтения (Омск, 2006 г.); на III Российской научной конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера (Новосибирск, 2006 г.); на III пленуме Президиума Российского общества патологоанатомов Актуальные вопросы молекулярной патологии (Омск, 2007 г.); на Всероссийской научно-практической патологоанатомической конференции Актуальные проблемы патологоанатомической службы муниципальных учреждений здравоохранения. Вопросы экологической патологии. Современные методы морфологической диагностики в патологоанатомической практике (Челябинск, 2008 г.); на 52 осенней сессии национальной школы гастроэнтерологов, гепатологов Энциклопедия современной гастроэнтерологии - IV (Москва, 2008 г.); на Сибирском научном гастроэнтерологическом форуме Новые рубежи гастроэнтерологии (Новосибирск, 2008 г.); на III съезде Российского общества патологоанатомов Актуальные вопросы патологической анатомии (Самара, 2009 г.); на четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов (Новосибирск, 2009 г.); на Сибирском гастроэнтерологическом научном форуме Новые рубежи гастроэнтерологии, посвященном 75-летию НГМУ и 40-летию СО РАМН (Новосибирск, 2010 г.), на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010 г.), на V пленуме Российского общества патологоанатомов (Ростов на Дону, 2011).

Внедрение результатов работы

Результаты исследований и выводы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологи, патологической анатомии, педиатрии и в курсе последипломного образования Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России): в лекционных курсах и на практических занятиях со студентами, клиническими ординаторами и интернами, врачами-гастроэнтерологами.

По результатам диссертационного исследования Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации утверждена новая медицинская технология Молекулярно-генетическая методика прогноза и патоморфологический мониторинг риска развития рака желудка кишечного типа при Helicobacter pylori инфекции (ФС № 2010/220 от 10 июня 2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту по результатам исследований

1. Взаимодействие клеток Helicobacter pylori и клеток покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки желудка запускает репаративную регенерацию эпителия, проявляющуюся модификацией дифференцировки и изменением скорости клеточного обновления в пределах эпителиального дифферона, которые определяются генетическими характеристиками патогена.
2. Колонизация слизистой оболочки желудка, как правило, осуществляется одновременно несколькими штаммами Helicobacter pylori, и изменения в эпителиальном диффероне являются результирующей комбинации продуктов генов бактериальных штаммов и уровня мукозального иммунитета, детерминированного генами цитокинов хозяина.
3. Структурные проявления локального иммунитета, при инфицировании Helicobacter pylori, характеризуются абсолютным увеличением количества иммунокомпетентных клеток. У носителей аллеля Т полиморфного локуса C -511 T гена ИЛ-1 нарастает преимущественно количество клеток с фенотипом CD20+, CD4+ и CD8+. При заражении агрессивными штаммами Helicobacter pylori (cagA(+) и babA2(+)) в сочетании провоспалительным генотипом хозяина (ИЛ-1 -511 *T) отмечены самые значительные показатели структурных эквивалентов мукозального иммунитета перечисленных выше.
4. Вне зависимости от биологических свойств бактерии неблагоприятное течение восстановительного периода (12 месяцев после успешной эрадикации Helicobacter pylori) развивается у хозяина, имеющего комбинацию аллелей ИЛ-1 -511 *Т / ИЛ-1RN *2 и ИЛ-1 +3953 *Т / ИЛ-1RN *2. У носителей комбинации аллелей ИЛ-1 -511 *С / ИЛ-1RN *4 и ИЛ-1 +3953 *С / ИЛ-1RN *4, напротив, через 12 месяцев после эрадикации бактерии репаративная регенерация эпителия сменяется на физиологическую.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 15 научных статьях, из них в журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации - 12.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 311 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 45 таблицами и 68 рисунками. Состоит из введения (2 страницы), обзора литературы (29 страниц), описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований (153 страницы), главы Обсуждение полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 308 литературных источников, в том числе 204 публикации в зарубежных журналах (изданиях).

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России, номер государственной регистрации 0120.0601311. Тема диссертации утверждена Ученым советом при Омской государственной медицинской академии, протокол № 10 от 15 декабря 2005 г. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России, протокол № 15 от 18.04.2006 г.

ичный вклад автора

Автором были выполнены следующие этапы работ: анализ данных отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, гистохимическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов слизистой оболочки желудка, диагностика Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции и его генотипирование, исследование полиморфизма генов ИЛ-1 и ИЛ-1RN хозяина, морфометрический анализ результатов гистологического и иммуногистохимического исследований, статистическая обработка полученных результатов.

Материал и методы исследования

Объектом исследования были биоптаты слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка и венозная кровь подростков в возрасте от 12 до 15 лет.

Критерии включения: биоптаты слизистой оболочки желудка подростков в возрасте 12-15 лет, с наличием клинического синдрома диспепсии (эпигастральная боль, тошнота, изжога, чувство переполнения желудка, рвота), с информированным согласием на проведение исследования от их законных представителей. Из исследования были исключены биоптаты слизистой оболочки желудка подростков, принимающих антибактериальные, антисекреторные или нестероидные противовоспалительные препараты в предшествующие исследованию 3 месяца, а также биоптаты больных с сопутствующими аллергическими или иммунопатологическими заболеваниями, способными оказать влияние на эффект взаимодействия инфект-хозяин.

Все исследуемые были жителями Омска, не состояли в родстве и считали себя этнически русскими.

В соответствии с целью и задачами исследование носило характер когортного, проспективного, контролируемого, сравнительного с элементами ретроспективного анализа (Власов В. В., 2001). Динамическое наблюдение за больными проводили в двух контрольных точках: через 1-2 (для контроля эрадикации Helicobacter pylori) и 12 месяцев (для контроля реинфекции) после лечения.

Были сформированы 2 основных группы и группы сравнения и контроля.

I группа (основная) - 229 биоптатов слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка, колонизованной Helicobacter pylori.

II группа (основная) - 75 биоптатов слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка, колонизованной Helicobacter pylori, с эрозивно-язвенными повреждениями слизистой оболочки антрального отдела.

III группа (сравнения) - 132 биоптата слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка, без колонизации Helicobacter pylori (неизмененная слизистая оболочка или минимальные изменения).

Для генетического исследования у всех подростков исследуемых групп были взяты образцы венозной крови.

IV группа (контрольная) - образцы венозной крови 152 подростков. Группа сформирована методом случайной выборки для анализа результатов генетического исследования.

Возрастной и половой состав исследуемых подростков в группах не имели статистически значимых различий. Средний стаж заболевания составлял 3,5-4 года.

Helicobacter pylori инфекция была диагностирована в соответствии с рекомендациями Маастрихтского консенсуса-II (2000) с использованием трех диагностических методов: гистопатологического исследования биоптатов слизистой оболочки желудка, быстрого уреазного Helpil - теста и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого фиброгастродуоденоскопия сопровождалась прицельной биопсией 2-х фрагментов слизистой оболочки из антрального отдела желудка для гистологического исследования и для выявления Helicobacter pylori методом ПЦР и 1-го кусочка слизистой оболочки из тела желудка для гистологического исследования.

При установлении Helicobacter pyloriЦпозитивного гастрита в случае согласия родственников проводили антихеликобактерную терапию, которая базировались на положениях, утвержденных Маастрихтскими соглашениями II (2000) и III (2005) и Российскими рекомендациями по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у детей, принятыми на VIII съезде педиатров России (Морозов И. А. и др., 2001; Исаков В. А., Щербаков П. Л., 2002; Malfertheiner P. et al., 2002, 2007).

При формировании исследуемых групп были исключены случаи с неэффективной эрадикацией инфекта через 1-2 месяца и реинфекцией через 12 месяцев. 1

Гистологические методы. Фрагменты слизистой оболочки (300 биоптатов антрального отдела и тела желудка) фиксировали в 10 %-ном нейтральном забуференном (рН 7,2-7,4) формалине на протяжении 12-24 часов. Проводку биоптатов, заливку в парафин и приготовление парафиновых срезов проводили по общепринятой методике. С одного блока готовили 15-20 предметных стекол с серийными срезами.

1 Автор выражает признательность доктору мед. наук, профессору, зав. кафедрой педиатрии ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России Е. А. Потроховой за помощь в формировании групп подростков для исследования.

Толщина парафиновых срезов не превышала 5-7 мкм. Состояние слизистой оболочки желудка оценивали по гистологическим препаратам, окрашенным гематоксилином и эозином.

Для оценки морфологических изменений слизистой оболочки желудка использовали разработанную на основе модифицированной Сиднейской системы (классификации хронического гастрита) визуально-аналоговую шкалу для полуколичественного определения признаков - отсутствие признака, слабая, умеренная и выраженная степень проявления признака (Dixon M. F., 1996). 2

Гистохимические методы. Определяли состав муцинов в слизистой оболочке желудка. Для этого использовали методики окрашивания с комбинацией красителей, предложенные С. И. Мозговым (2009): альциановый синий рН 2,5 в сочетании с ШИК реакцией для выявления сиаломуцинов и нейтральных муцинов. Сиаломуцины окрашивались в сине-голубой цвет, нейтральные муцины и щеточная каемка абсорбтивных клеток - в красный цвет, цитоплазма клеток, содержащих оба муцина - в различные оттенки фиолетового. Использовали реакцию с диамином железа в сочетании с альциановым синим рН 2,5 для выявления сульфамуцинов, которые окрашивались в черно-коричневый цвет. Для выявления участков соединительной ткани использовали реакцию пикрофуксином по ван Гизону.

Иммуногистохимические методы. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода (визуализирующая система LSAB2 Systems, HRP, DAKO, Дания) (табл. 1). Исследовано 90 биоптатов антрального отдела и тела желудка.

Серийные срезы тех же парафиновых блоков, которые использовали для гистологического исследования, толщиной 4-5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые силаном (лDAKO, Дания) и выдерживали в термостате при 370 С в течение ночи.

Далее срезы инкубировали с антителами в рабочих разведениях в режиме согласно инструкциям фирм-производителей. После окончания инкубации с первичными антителами препараты отмывали в 0,05 М трис-НСl буфера (рН 7,4-7,6), обрабатывали сначала вторичными биотинилированными, затем третичными стрептавидиновыми антителами.

2 Автор выражает благодарность сотрудникам кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России и заведующей патоморфологическим отделом БУЗ ОО КДЦ канд. мед. наук, врачу-патологоанатому высшей квалификационной категории Т. В. Васькиной за выполнение гистологического исследования и оформление патологоанатомического заключения по гастробиоптатам.

По окончании инкубации и отмывки в 0,05 М трис-НСl буфера (рН 7,4-7,6) клетки визуализировали с помощью 3,3-диаминобензидина тетрахлорида в трис NaCl буферном растворе.

Таблица 1

Список антител, используемых в исследовании

Название антитела	Клон	Природа, биологическая роль, функции белка, интерпретация	Рабочее разведение
Ki671	MIB-1	Ядерный негистоновый белок, маркер пролиферации	Ready to use
Cрр322	JHM62	Белок каспаза 3 - фермент эффекторной фазы апоптоза, маркер апоптоза	1 : 25
Bcl-21	124	Мембранный белок, маркер подавления апоптоза	Ready to use
CD42	CD4-1F6	Мембранный маркер субпопуляции Т-лимфоцитов - хелперов	Ready to use
CD82	CD8-295	Мембранный маркер субпопуляции Т-лимфоцитов с цитотоксическими свойствами	Ready to use
CD201	L26	Мембранный маркер В-лимфоцитов	Ready to use
CD681	PG-M1	Мембранный маркер моноцитов/макрофагов	Ready to use
CD252	4С9	-цепь рецептора интерлейкин-2, продуцируется активированными Т- и В-лимфоцитами, активированными моноцитами	1 : 100
HLA-DR2	NCL-LN3	Детерминанта HLA класса II, продуцируется моноцитами, клетками Лангерганса, дендритными и интердигитирующими ретикулярными клетками	1 : 50
MUC5AC2	CLH2	Нейтральный муцин* поверхностных отделов слизистой оболочки желудка, обладающий протективным действием	1 : 100
MUC62	CLH5	Кислый муцин* глубоких отделов желез слизистой оболочки желудка, обладающий протективным действием	1 : 100
MUC22	Ccp58	Кислый муцин* кишечного типа	1 : 200

Таблица 1 (продолжение)

CDX-23	CDX2-88	Фактор транскрипции, обеспечивающий кишечную дифференцировку эпителия	1 : 150
Shh4	поликлональные	Фактор, обеспечивающий желудочную дифференцировку эпителия	1 : 100

Примечание: 1 - DAKO, Дания, 2 - Novocastra, Великобритания, 3 - Cell Mark, США, 4 - Spring, США; * - антитела к апопротеину.

Морфометрические методы. При отборе биоптатов для морфометрического исследования учитывали следующие требования: правильная ориентировка срезов, обязательное наличие мышечной пластинки, не менее 5 валиков и ямок, присутствие полей сохраненного покровного эпителия.

С помощью окуляр-микрометра была проведена линейная морфометрия (в мкм) толщины слизистой оболочки, глубины желудочной ямки, высоты покровного эпителия и ямочного эпителия. С помощью сетки Г. Г. Автандилова был проанализирован клеточный состав (в том числе субпопуляции лимфоцитов после проведения иммуногистохимической реакции - маркеры CD4, CD8, CD20, CD68, CD25 и HLA-DR) и клеточная плотность инфильтрата в 1 мм2 слизистой оболочки желудка, объемная доля в процентах покровно-ямочного эпителия, желез, межэпителиальных лимфоцитов (отдельно в покровно-ямочном эпителии и перешейке желез), стромы и клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки и лимфоидных узелков. (Автандилов Г. Г., 1990).

После проведения иммуногистохимической реакции в срезах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли ИП (ядерная метка Ki67), ИА (перинуклеарная или цитоплазматическая метка СРР32), ИМ (цитоплазматическая метка Bcl-2) и продукцию кишечного фактора транскрипции (CDX-2) как долю (в %) положительно окрашенных эпителиоцитов к общему числу подсчитанных эпителиальных клеток в железе слизистой оболочки желудка. Обычно просматривали от 100 до 300 эпителиоцитов. Подсчет проводили во всех железах, представленных в биоптате.

Поскольку мы отмечали мозаичность в расположении меченых клеток в слизистой оболочке желудка, дополнительно оценка индексов всех меток проводили отдельно в трех функциональных зонах: I - покровно-ямочный (ПЯЭ), II - перешеечная зона - ПЗ (истмический отдел, генеративный, пролиферативный компартмент); (ГЗ) и III - основание желез - ОЖ (средняя и нижняя треть желез до базальных отделов).

Продукцию фактора желудочной дифференцировки Shh учитывали как показатель интенсивности окрашивания цитоплазмы: 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - выраженная, а также вычисляли процент позитивно окрашенных клеток от общего числа эпителиоцитов ( 500 клеток) с подразделением на 5 градаций (0 - до 5 %, 1 - 5-25 %, 2 - 26-50 %, 3 - 51-75 %, 4 - 75 % и более) позитивно меченых клеток. Оценку индекса продукции Shh вычисляли путем умножения показателя интенсивности окрашивания (1-3) на полуколичественную оценку градации (0-4).

Для оценки уровня продукции муцинов в слизистой оболочке желудка применяли полуколичественную шкалу оценки интенсивности метки (0 Цотсутствие, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - выраженная). При этом поле зрения микроскопа считали пригодным для оценки признака при наличии в нем не менее 60 % позитивно окрашенных клеток.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 с использованием цифровой фотокамеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.7.2 (Carl Zeiss, Германия).

Метод ПЦР. Диагностику Helicobacter pylori методом ПЦР проводили в патоморфологическом отделе Бюджетного учреждения здравоохранения Омской области Клинический диагностический центр.

Выделение ДНК Helicobacter pylori из 136 биоптатов антрального отдела желудка осуществляли с помощью комплекта реагентов Хеликопол (НПФ Литех, Россия). Вначале в пробах определяли наличие или отсутствие ДНК Helicobacter pylori с использованием набора Хеликопол II, а затем при положительном результате генотипировали штаммы (82 образца) с помощью наборов Хеликопол СА, Хеликопол VA, Хеликопол IA и Хеликопол BA (НПФ Литех, Россия). Определяли генотипы cagA, babA, vacA (s и m регион) и iceA (подтипы А1 и А2). Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей DNA Analyzer (НПФ Литех, Россия).

Определение полиморфизма генов ИЛ-1 -511 C>T и +3953 C>T и ИЛ-1RN (VNTR во 2 интроне) в 302 образцах периферической крови проводили в лаборатории на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России, совместно с группой фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (рук. группы канд. биол. наук М. Л. Филипенко).

Для определения полиморфизма генов ИЛ-1βb и ИЛ-1RN проводили забор венозной крови (4-5 мл) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом фенол-хлороформной экстракции с этанольным осаждением (Johns M., Paulus-Thomas J., 1989).

Использовали олигонуклеотидные праймеры, синтезированные в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Структура праймеров, состав амплификационного буфера и программа амплификации подробно описаны в статье в журнале Молекулярная медицина, 2010, №. 1.

Исследование полиморфизма гена ИЛ-1RN проводили с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится вариабельное число тандемных повторов - 86 п.н. (variable number of tandem repeats - VNTR). В результате амплификации определяли фрагменты ДНК размером 438 п. н., 524 п. н., 610 п. н., 696 п. н. и 782 п. н. с 2, 3, 4, 5 или 6 тандемными повторами, соответственно. Для удобства анализа, а также, поскольку аллели с повторами 3, 5 и 6 встречались редко, полиморфизм гена ИЛ-1RN описывали, учитывая только аллели с 2 и 4 повторами.

Для определения полиморфных вариантов гена ИЛ-1 использовали ПЦР с дальнейшей рестрикцией ампликонов эндонуклеазами рестрикции: TaqI - для генотипирования полиморфного локуса С +3953 Т и Ama87I - для генотипирования полиморфного локуса С -511 Т. При гидролизе амплификационного фрагмента гена ИЛ-1 эндонуклеазой рестрикции TaqI выявляли три фрагмента размером 550 п. н., 146 п. н. и 404 п. н. Фрагмент 550 п. н. соответствовал амплификацонному фрагменту, не подвернувшемуся гидролизу, что указывает на присутствие аллеля +3953 Т гена ИЛ-1. При наличии аллеля С происходит разрезание амплификационного фрагмента ДНК на два, размером 146 п. н. и 404 п. н. При гидролизе амплификационного фрагмента гена ИЛ-1 эндонуклеазой рестрикции Ama87I выявляли фрагменты размером 520 п. н., 80 п. н. и 440 п. н. Фрагмент 520 п.н. указывал на присутствие аллеля -511 Т гена ИЛ-1. При наличии аллеля С определяли два фрагмента размером 80 п. н. и 440 п. н.

Анализ рестрикционных смесей проводили с помощью электрофореза в 1,8 %-м агарозном геле с бромистым этидием. Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей DNA Analyzer (НПФ Литех, Россия).

Статистические методы. При нормальном типе распределения в качестве основных характеристик описательной статистики использовали: среднюю арифметическую и стандартное отклонение (). Для нормального распределения использовали параметрические критерии: парный критерий Стьюдента для двух связанных выборок (группа подростков до и после проведения эрадикационной терапии) и критерий Стьюдента для двух независимых выборок (основные группы и группа сравнения до лечения). Для сравнительной оценки переменных 3-х групп вводили поправочный коэффициент Бонферони, который составил 1,7 % (критический уровень значимости - 5 % / количество независимых групп сравнения - 3) (Банержи А., 2007).

В случае если распределение отличалось от нормального, использовали непараметрические критерии: категориальные данные - критерий хи-квадрат (2) с поправкой на непрерывность Иэйтса для таблицы сопряженности 2 x 2, числовые данные - U-критерий Манна - Уитни для 2-х независимых выборок (основные группы и группа сравнения), критерий ранговых сумм Вилкоксона - для 2-х связанных выборок (биоптаты слизистой оболочки желудка до и после проведения эрадикационной терапии). При множественном сравнении (3 группы) применяли непараметрический критерий Данна. При корреляционном анализе использовали определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена (). При сравнении альтернативных переменных (долей признака) использовали метод альтернативного варьирования (Гланц С., 1998). Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принимали р=0,05.

Силу связей оценивали в значениях показателя отношения шансов (odds ration, OR) (Банержи А., 2007). Вычисление OR и 95 % доверительного интервала (CI) проводили при помощи он-лайн калькулятора, доступного по ссылке: ConfidOR.htm.

Оценку распределения наблюдаемых частот встречаемости аллелей генов ИЛ-1 и ИЛ-1RN по закону Харди - Вайнберга проводили при помощи калькулятора, доступного по электронному адресу: www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/Court%20lab%20-20HW%20calculator.xls.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эпителиальный дифферон слизистой оболочки желудка

при взаимодействии с различными генетическими вариантами Helicobacter pylori

Особенности строения и клеточного обновления слизистой оболочки желудка при инфицировании Helicobacter pylori. При гистологическом исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка, колонизованной Helicobacter pylori, в поверхностно-ямочном эпителии отмечали признаки гиперсекреции. Гиперсекреция слизи проявлялась наложением слизи на поверхности клеток и на вершине валиков и в ямках, иногда с кистозным их расширением. В биоптатах с эрозивно-язвенными поражениями слизистой оболочки отмечали снижение слизеобразования по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой, что свидетельствует об уменьшении защитной функции и вероятно обусловливает изменение морфофункционального состояния основных структурных компонентов слизистой оболочки желудка. Признаков атрофии и дисплазии пилорических и фундальных желез обнаружено не было.

Морфометрический анализ структуры эпителиального дифферона слизистой оболочки желудка, колонизованной Helicobacter pylori, показал достоверное удлинение желудочных ямок (в биоптатах III группы - 291,0 17,3 мкм, в биоптатах I группы - 309,5 19,9 мкм, в биоптатах II группы - 324,3 20,6 мкм, р = 0,042) и уменьшение высоты покровно-ямочного эпителия (в биоптатах III группы - 32,0 4,7 мкм, ямочного - 29,8 5,1 мкм, соответственно, в биоптатах I группы - 23,7 5,7 (р = 0,034) и 24,3 4,3 мкм, соответственно, в биоптатах II группы - 20,3 3,8 (р = 0,024) и 23,1 3,8 мкм, соответственно) в антральном отделе желудка. В биоптатах при инфицировании бактерией отмечали уменьшение объема пилорических железы (в биоптатах III группы - 47,3 %, в биоптатах I группы - 38,0 %, в биоптатах II группы - 33,1 %, р = 0,023) наряду с увеличением относительного объема клеточного инфильтрата (в биоптатах III группы - 18,1 %, в биоптатах I группы - 25,9 %, р = 0,026), в биоптатах II группы - 32,7 %, р = 0,019).

Иммуногистохимическое исследование клеточного обновления слизистой оболочки желудка показало, что при колонизации ее Helicobacter pylori средний индекс пролиферации эпителиоцитов в антральном отделе, оцениваемый по уровню продукции белка Ki67, был достоверно выше по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой. В теле желудка этот показатель был во всех исследуемых группах меньше, что вполне ожидаемо, так как антральный отдел желудка из-за более выраженной колонизации бактерией в большей степени подвержен воздействию патогенных свойств микроорганизма. В биоптатах с неизмененной слизистой оболочкой желудка (III группа) средний индекс пролиферации в процентах составлял в антральном отделе 20,3 3,0, в теле желудка - 18,6 3,2. В биоптатах слизистой оболочки желудка при колонизации ее Helicobacter pylori средний индекс пролиферации был выше как в антральном отделе, так и в теле желудка и составлял в процентах в I группе - 28,6 5,2 (р = 0,028) и 21,6 4,3, во II группе - 32,0 5,2 (р = 0,008) и 22,5 2,9, соответственно.

При воздействии Helicobacter pylori в эпителиальном слое отмечали расширение зоны пролиферации в строну покровно-ямочного эпителия и в глубокие отделы желез по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой. Ki67 меченые клетки обнаруживали практически в каждой ямке, они занимали верхнюю треть в I группе и половину ямки во II группе с эрозивно-язвенными поражениями, в отдельных случаях клетки обнаруживали на вершинах валиков. Высокий уровень пролиферации отмечался также в центре лимфоидных узелков собственной пластинки слизистой оболочки желудка, а также в минимальных количествах в клетках диффузного воспалительного инфильтрата (рис. 1).

Рис. 1. Продукция Ki67 (стрелки) в лимфоцитах центральной зоны лимфоидного узелка и эпителиоцитах слизистой оболочки антрального отдела желудка при колонизации ее Helicobacter pylori. Стрептавидин-биотиновый метод, докраска ядер метиловым синим, ув. 150.

Активации пролиферации эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка в условиях хеликобактериоза сопутствует изменение индекса апоптоза, оцениваемого по уровню продукции белка CPP32. В биоптатах слизистой оболочки желудка основных исследуемых групп средний индекс апоптоза в процентах был статистически достоверно выше и в антральном отделе и в теле желудка, как в I группе (14,1 2,7 и 10,1 3,1, соответственно, р = 0,001), так и во II группе (27,3 4,8 и 10,3 4,0, соответственно, р = 0,001) по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой II группы (6,4 2,5 и 5,6 1,9, соответственно).

В биоптатах слизистой оболочки желудка, колонизованной Helicobacter pylori количество CPP32 - меченых клеток по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой увеличивалось в области покровно-ямочного эпителия, особенно в группе II с эрозивно-язвенными повреждениями, и в глубоких отделах желез и уменьшалось в перешеечной зоне. Различия в расположении апоптотических клеток, по-видимому, связаны с особенностями строения слизистой оболочки желудка в разных отделах. Пилорические железы по своему составу более однородны и представлены в основном мукоцитами, тогда как фундальные железы по строению полиморфны, и содержат большее разнообразие клеток, которые различаются по скорости клеточного обновления.

Выявленные нами изменения параметров клеточного обновления слизистой оболочки желудка при инфицировании хозяина Helicobacter pylori вероятно отражают нарушение физиологической регенерации эпителиального дифферона и свидетельствуют о начале репаративной регенерации эпителиоцитов.

Антиапоптотическая роль отводится белку Bcl-2, локализующемуся на внутренней мембране митохондрий. Некоторые авторы сообщают об ограниченной способности только эпителиоцитов генеративной зоны продуцировать данный маркер (Bronner M. P. et al., 1995), другие свидетельствуют об отсутствии такой способности эпителиоцитов желудка (Аруин Л. И., 2000, Потрохова Е. А., 2004, Мозговой С. И., 2011). В проведенном нами исследовании мы не обнаружили продукции Bcl-2 маркера в эпителиоцитах слизистой оболочки и антрального отдела и тела желудка ни в одной из исследуемых групп. Метку Bcl-2 определяли исключительно в клетках воспалительного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки желудка.

Продукцию желудочного муцина MUC5AC во всех биоптатах слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка I группы оценивали полуколичественно как умеренную и выраженную, тогда как в биоптатах III группы (неизмененная слизистая оболочка) экспрессию этого муцина оценивали преимущественно как умеренную или слабую. В биоптатах II группы с эрозивно-язвенными повреждениями в антральном отделе продукция этого муцина была несколько снижена, однако достоверных отличий выявлено не было. Продукция желудочного муцина в биоптатах слизистой оболочки желудка, колонизованной Helicobacter pylori, характеризовалась мозаичностью распределения и определялась в эпителиальном диффероне преимущественно в клетках покровно-ямочного эпителия желез и в отдельных клетках перешеечной зоны (рис. 2).

Метка MUC6 локализовалась в биоптатах слизистой оболочки желудка, колонизованной бактерией, исключительно в базальной части желез (рис. 2), тогда как в биоптатах группы сравнения (неизмененная слизистая оболочка) локализовалась в средней и нижней трети желез, включая базальные отделы, а также в меньшей степени в перешеечной зоне.

Отмеченное распределение MUC5AC и MUC6 вероятно свидетельствует о нарушении дифференцировки эпителиального дифферона слизистой оболочки желудка при взаимодействии с клетками Helicobacter pylori.

Рис. 2. Муцин в эпителиоцитах слизистой оболочки антрального отдела желудка при колонизации ее Helicobacter pylori. А - продукция MUC5AC в покровно-ямочном эпителии и эпителии перешейка желез. Б - продукция MUC6 в донных отделах желез. Стрептавидин-биотиновый иммуногистохимический метод, докраска ядер гематоксилином, ув. 200.

Экспрессию Shh выявляли в виде цитоплазматической метки различной интенсивности. В отличие от группы сравнения в биоптатах слизистой оболочки желудка, колонизованной бактерией, отмечали наличие более выраженной продукции белка Shh в желудочных эпителиоцитах. Такой характер экспрессии можно оценивать как сохранение контроля дифференцировки в условиях активно пролиферирующей клеточной популяции (Wang L.-H. et al., 2006, Mutoh H. et al., 2010).

ишь в одном биоптате из I группы в очагах полной кишечной метаплазии практически во всех бокаловидных и каемчатых цилиндрических клетках определялась метка CDX-2 (фактор транскрипции кишечного эпителия), в них же при гистохимическом исследовании выявляли преимущественно кислые сиаломуцины, а иммуногистохимически - продукцию кишечного муцина MUC2, что свидетельствует о нарушении дифференцировки клеток в эпителиальном диффероне.

Таким образом, при взаимодействии Helicobacter pylori с клетками эпителиального дифферона изменяется скорость клеточного обновления (повышение индексов пролиферации и апоптоза) и дифференцировка эпителиоцитов (увеличение продукции MUC5AC - желудочного муцина и Shh - белка желудочной дифференцировки, снижение выработки протекторного муцина MUC6 в клетках перешейка желез, выявление в очагах полной кишечной метаплазии CDX-2 - фактора транскрипции кишечного эпителия и MUC2 - кишечного муцина) слизистой оболочки желудка, что свидетельствует об изменении физиологической регенерации эпителиоцитов на репаративную.

Характеристика слизистой оболочки желудка в зависимости от штаммоспецифических особенностей Helicobacter pylori. Генотипирование Helicobacter pylori осуществляли из 58 биоптатов антрального отдела желудка из I группы и из 24 биоптатов из II группы. Десять образцов (9 из I группы и 1 из II группы) не были генотипированы из-за деградации ДНК бактерии. У 14 подростков из I группы дополнительный биоптат для генотипирования из антрального отдела желудка не был взят по техническим причинам.

При сопоставлении морфологических изменений и данных, полученных после генотипирования штаммов Helicobacter pylori выяснилось, что морфологические изменения слизистой оболочки желудка зависят от характеристики штамма бактерии, которым инфицирован хозяин.

В биоптатах II группы (с эрозивно-язвенными повреждениями слизистой оболочки) чаще определялись штаммы, содержащие гены cagA (50 %), babA2 (25 %), iceA (80 %, преимущественно генотип iceA1) Helicobacter pylori, тогда как в биоптатах I группы эти гены выявлялись в 34 %, 12 %, 58 % случаев, соответственно. При этом babA2 положительный генотип Helicobacter pylori был в 100 % случаев связан с генотипом cagA в обеих исследуемых группах. Однако необходимо отметить, что в исследованных нами биоптатах обеих групп чаще определялись менее цитотоксичные штаммы Helicobacter pylori - vacAs2/m1 vacAs2/m2. При этом исследования, проведенные в других регионах России зарегистрировали высокие показатели наличия высокотоксичных штаммов vacAs1 Helicobacter pylori. Их распространенность варьировала от 73-75 % в г. Казани и до 82 % в Центральном регионе (Насыбуллина Э. Р. и др., 2004; Mamynaliev K. T. et al., 2002). Вероятно, это является следствием неодинаковой выборки больных (различные по степени выраженности заболевания желудка), что подтверждается данными Matsunari O. С. и соавт. (2012) или же следствием генетически детерминированной восприимчивости к тем или иным штаммам Helicobacter pylori пациентов, проживающих в различных географических зонах.

Кроме того, при инфицировании саgА(+), babA2(+), iceA1(+), vacAs1/m1 и vacAs1/m2 штаммами Helicobacter pylori в собственной пластинке слизистой оболочки антрального отдела желудка при полуколичественной оценке определяли воспалительный инфильтрат из лимфоцитов, макрофагов и нейтрофильных лейкоцитов, оцененный полуколичественно как выраженной, либо умеренной степени, тогда как при инфицировании cagA(-), babA2(-), iceA2(+), vacAs2/m1 и vacAs2/m2 штаммами бактерии - как умеренной и слабой степени.

Результаты иммуногистохимического исследования клеточного обновления слизистой оболочки желудка в зависимости от штаммоспецифических особенностей Helicobacter pylori представлены в таблице 2. Так наибольшие изменения показателей клеточного обновления отмечали при инфицировании cagA(+) и babA2(+) штаммами Helicobacter pylori. Значительное увеличение индекса апоптоза эпителиоцитов наблюдали также в слизистой оболочке желудка при инфицировании vacAs1(+) или vacAs2(+) штаммами Helicobacter pylori, что, однако не сопровождается параллельным увеличением пролиферации этих клеток.

Таблица 2

Средний индекс пролиферации (ИП) и апоптоза (ИА)

эпителиоцитов слизистой оболочки антрального отдела желудка

при инфицировании разными штаммами Helicobacter pylori (в процентах)

Индексы	I группа, n=58		II группа, n=24
	cagA+, n=20	cagA-, n=38	cagA+, n=12	cagA-, n=12
ИП	26,9 7,5	12,8 6,3*	30,1 7,1	14,2 4,3*
ИА	12,0 3,3	6,0 2,5*	24,4 5,6	11,0 5,3*
	babA2+, n=7	babA2-, n=51	babA2+, n=6	babA2-,n=18
ИП	23,6 7,3	12,2 3,9*	26,5 7,9	16,6 6,1*
ИА	13,4 3,4	10,0 3,1	25,5 6,6	15,0 5,7*
	vacAs1+, n=19	vacAs1-, n=39	vacAs1+, n=10	vacAs1-, n=14
ИП	22,5 3,8	13,8 3,2	23,6 5,5	18,8 3,8
ИА	17,2 2,0*	8,6 2,9	15,2 4,0*	7,4 2,8
	vacAs2+, n=39	vacAs2-, n=19	vacAs2+, n=14	vacAs2-, n=10
ИП	12,1 2,1	9,6 6,3	20,2 5,1	17,8 5,2
ИА	12,2 4,0*	7,4 1,3	14,2 3,0*	7,0 4,3
	vacAm1+,n=17	vacAm1-, n=41	vacAm1+, n=6	vacAm1-, n=18
ИП	17,9 4,7	13,9 5,0	19,8 4,8	16,1 5,0
ИА	12,4 3,8	13,0 2,9	17,8 1,9	15,2 2,3
	vacAm2+,n=41	vacAm2-, n=17	vacAm2+,n=18	vacAm2-, n=6
ИП	18,3 3,8	19,1 7,1	23,4 5,5	24,7 5,1
ИА	9,8 3,4	10,7 4,8	16,3 4,1	13,8 3,4
	iceA1+, n=13	iceA1-, n=45	iceA1+, n=10	iceA1-, n=14

Таблица 2 (продолжение)

ИП	21,7 6,8	17,8 4,7	28,1 6,7	26,0 7,2
ИА	10,3 4,7	11,6 3,3	21,7 5,1	19,7 3,8
	iceA2+, n=21	iceA2-, n=37	iceA2+, n=9	iceA2-, n=15
ИП	20,0 5,3	20,7 3,6	27,9 8,1	20,8 8,1
ИА	10,0 6,1	11,7 2,0	20,1 7,7	19,4 4,3

Примечание: * - достоверность различий между положительными и отрицательными штаммами Helicobacter pylori в исследуемых группах, р < 0,05.

Таким образом, наиболее выраженные изменения клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка связаны с наличием генов cagA, babA2, vacAs1 и vacAs2 Helicobacter pylori.

Эпителиальный дифферон и комбинированное воздействие продуктов нескольких вариантов сочетания генов лостровка патогенности Helicobacter pylori

Неоднозначность каждого из вышеуказанных факторов патогенности Helicobacter pylori в развитии реакции хозяина определила появление гипотезы об их комбинированном воздействии (Graham D. Y., Yamaoka Y., 2000; Momynaliev K. et al., 2003). Сочетание у одного хозяина нескольких штаммов Helicobacter pylori с разными биологическими свойствами является скорее не исключением, а правилом. Согласно возможным комбинациям вариантов генов патогенности, у штаммов Helicobacter pylori может быть 28 генотипов. На основе полученных нами результатов были выделены 22 комбинации генотипов vacA, cagA, babA2, iceA Helicobacter pylori (табл. 3). В исследуемых биоптатах из I и II групп наиболее часто встречали штаммы Helicobacter pylori с генотипом vacAs2/m2, cagA(-), iceA1 и vacAs2/m2, cagA(-), iceA2.

Таблица 3

Генотипы штаммов Helicobacter pylori

выделенные из биоптатов слизистой оболочки желудка

№	Генотипы Helicobacter pylori	I группа, n=58 абс. (%)	II группа, n=24 абс. (%)	Итого, n=82 абс. (%)
1	vacAs1/m1; cagA+	2 (3)	1 (4)	3 (4)
2	vacAs1/m1; cagA+; iceA1	1 (2)	0	1 (1)
3	vacAs1/m1; cagA+; babA2; iceA1	0	1 (4)	1 (1)
4	vacAs1/m1; cagA-; iceA1	1 (2)	1 (4)	2 (2)
5	vacAs1/m1; cagA-; iceA2	1 (2)	0	1 (1)
6	vacAs1/m2; cagA+; babA2	2 (3)	2 (8)	4 (5)
7	vacAs1/m2; cagA+; iceA1	1 (2)	2 (8)	3 (4)
8	vacAs1/m2; cagA+; babA2; iceA2	2 (3)	1 (4)	3 (4)
9	vacAs1/m2; cagA-	4 (7)	0	4 (5)

Таблица 3 (продолжение)

10	vacAs1/m2; cagA-; iceA2	5 (9)	2 (8)	7 (8)
11	vacAs2/m1; cagA+	1 (2)	0	1 (1)
12	vacAs2/m1; cagA+; babA2	1 (2)	0	1 (1)
13	vacAs2/m1; cagA+; iceA1	1 (2)	1 (4)	2 (2)
14	vacAs2/m1; cagA+; babA2; iceA1	0	1 (4)	1 (1)
15	vacAs2/m1; cagA-	7 (12)	0	7 (8)
16	vacAs2/m1; cagA-; iceA2	2 (3)	1 (4)	3 (4)
17	vacAs2/m2; cagA+; babA2	2 (3)	1 (4)	3 (4)
18	vacAs2/m2; cagA+; iceA1	3 (5)	2 (8)	5 (6)
19	vacAs2/m2; cagA+; iceA2	4 (7)	0	4 (5)
20	vacAs2/m2; cagA-	5 (9)	1 (4)	6 (7)
21	vacAs2/m2; cagA-; iceA1	6 (11)	2 (8)	8 (11)
22	vacAs2/m2; cagA-; iceA2	7 (12)	5 (21)	12 (15)

Статистически значимые различия индексов пролиферации в процентах отмечали при инфицировании сочетанием штаммов cagA(+)vacAs1(+) и cagA(+)vacAs1(-) в биоптатах I группы (24,4 5,3 и 12,9 3,5, соответственно, p = 0,004) и II группы (28,7 7,2 и 15,4 3,7, соответственно, p = 0,007). При этом индекс апоптоза в процентах был примерно одинаковый вне зависимости от наличия cagA(+)vacAs1(+) или cagA(-)vacAs1(+) штаммов Helicobacter pylori и в I группе исследуемых (13,6 3,4 и 13,4 4,2, соответственно) и во II группе (20,8 5,0 и 17,6 3,8, соответственно).

При анализе клеточного обновления слизистой оболочки желудка при инфицировании несколькими патогенными штаммами Helicobacter pylori выявлены некоторые закономерности в распределении меченных иммуногистохимически клеток в пределах эпителиального дифферона (рис. 3).

В биоптатах слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка с неизмененной слизистой оболочкой метка Ki67 (маркер пролиферации) определяли преимущественно в зоне перешейка желез. При наличии бактерии в эпителиальном диффероне отмечали расширение зоны окрашивания маркером Ki67 в сторону ямки и в глубокие отделы желез. Меченые Ki67 клетки в некоторых случаях выявляли на вершинах валиков. Количество меченых CPP32 клеток в биоптатах антрального отдела желудка при колонизации слизистой оболочки Helicobacter pylori (I и II группы) по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой увеличивалось в области покровно-ямочного эпителия и в глубоких отделах желез и уменьшалось в зоне перешейка. В слизистой оболочке тела желудка подобной закономерности не отмечали. Продукции Bcl-2 маркера определяли в клеточном инфильтрате собственной пластинки, как в неизмененной слизистой оболочке желудка, так и при колонизации ее бактерией и в антральном отделе и в теле желудка.

Антральный отдел желудка.

Тело желудка.

Рис. 3. Схема расположения клеток, продуцирующих белки дифференцировки, пролиферации и апоптоза, в эпителиальном диффероне тела и антрального отдела желудка неизмененной слизистой оболочки и в условиях взаимодействия с Helicobacter pylori. А - без Helicobacter pylori инфекции, Б - при инфицировании Helicobacter pylori.

Продукцию белка MUC5AC в биоптатах из I и II групп определяли практически во всех клетках покровно-ямочного эпителия желез, примерно в 25-30 % случаях в клетках перешеечной зоны и в 5-10 % в клетках дна желез.

Подобное распределение муцина мы отмечали и в биоптатах с неизмененной слизистой оболочкой желудка из группы сравнения. Данная особенность распределения белка была присуща биоптатам слизистой оболочки и антрального отдела и тела желудка. Метка MUC6 (кислый желудочный муцин) локализовалась в биоптатах слизистой оболочке желудка при колонизации ее бактерией (I и II группы) в дне желез, тогда как в биоптатах с неизмененной слизистой оболочкой определялась в средней и нижней трети желез, включая базальные отделы, а также в перешеечной зоне. Продукцию Shh - фактора, обеспечивающего желудочную дифференцировку эпителия, выявляли во всех клетках эпителиального дифферона слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка. Однако в отличие от группы с неизмененной слизистой оболочкой в биоптатах слизистой оболочки желудка при колонизации ее бактерией (I и II группы) отмечали более выраженную экспрессию белка Shh в желудочных эпителиоцитах. Метку MUC2 (кислый муцин кишечного типа) выявляли исключительно в очагах полной кишечной метаплазии в сочетании с продукцией белка CDX-2 - фактора транскрипции, обеспечивающего кишечную дифференцировку эпителия, в зоне перешейка желез в слизистой оболочке желудка, колонизованной Helicobacter pylori.

Таким образом, колонизация слизистой оболочки желудка, как правило, осуществляется одновременно несколькими штаммами Helicobacter pylori и изменения клеточного обновления и дифференцировки эпителиального дифферона являются комплексной реакцией на воздействие комбинации продуктов генов всех штаммов Helicobacter pylori, выделенных у хозяина.

Однако отмеченные ассоциации штаммовых вариантов Helicobacter pylori и морфологических изменений слизистой оболочки желудка не дают ответа на вопрос: структурные изменения обусловлены только генотипом бактерии или особенностью реагирования иммунной системы хозяина или их результатирующей?

Структурные эквиваленты локального иммунитета и генетический полиморфизм генов цитокинов хозяина

Местный иммунитет слизистой оболочки желудка. Клеточный инфильтрат был наиболее плотным на 1 мм2 слизистой оболочки в биоптатах при инфицировании хозяина Helicobacter pylori (I группа: антральный отдел -2967 ± 321 клеток (р = 0,027), тело желудка - 2220 ± 123 клеток (р = 0,024); II группа: антральный отдел - 3132 ± 412 клеток (р = 0,007); тело желудка - 2380 ± 141 клеток (р = 0,006)) по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой (в антральный отдел - 1822 ± 312 клеток; тело желудка - 1261 ± 107 клеток). Лимфо-макрофагальный инфильтрат располагался при колонизации слизистой оболочки желудка бактерией диффузно по всей протяженности собственной пластики, тогда как в биоптатах с неизмененной слизистой оболочкой иммунокомпетентные клетки определялись лишь в поверхностных отделах.

При инфицировании хозяина и в I группе и во II в антральном отделе и теле в составе клеточного инфильтрата возрастало количество лимфоцитов и плазматических клеток, эозинофилов, нейтрофильных лейкоцитов и увеличивалось количество межэпителиальных лимфоцитов по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой. По данным морфометрического исследования в собственной пластинке преобладали лимфоциты (44,1 - 46,5 %) и плазматические клетки (33,8 - 37,0 %), остальные клетки были представлены нейтрофильными лейкоцитами (6,0 - 6,5 %), макрофагами (3,1 - 3,9 %), эозинофильными гранулоцитами (7,9 - 8,3 %) и фибробластами (5,1 - 5,8 %). Кроме того, в биоптатах I группы, отмечали более выраженную лимфоцитарную инфильтрацию эпителия слизистой оболочки антрального отдела желудка по сравнению с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой. При этом наблюдали снижение миграции лимфоцитов в поверхностный эпителий при одновременном нарастании их количества в перешейке желез. Объемная доля в % межэпителиальных лимфоцитов в этих отделах составляла в среднем - 1,1 и 2,4, соответственно, по сравнению с группой сравнения - 2,8 и 1,5 соответственно. В биоптатах II группы с эрозивно-язвенными повреждениями слизистой оболочки ситуация была иная - в перешейке желез отмечали небольшую инфильтрацию эпителия лимфоцитами (объемная доля - 3,0 %), тогда как в поверхностном эпителии доля межэпителиальных лимфоцитов составляла - 4,8 %) значительно возрастала по сравнению с биоптатами группы I и группы с неизмененной слизистой оболочкой желудка.

В большинстве биоптатов при колонизации слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori степень воспаления расценивали в полуколичественном отношении как умеренную, у четверти инфильтрат из иммунокомпетентных клеток был слабо выражен, у примерно 15 % определяли выраженный воспалительный ответ, тогда как в биоптатах с неизмененной слизистой оболочкой лимфо-макрофагальная инфильтрация собственной пластинки была слабо выражена, а инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами отсутствовала у большинства исследуемых.

Сравнение показателей из группы III и групп I и II показало, что в биоптатах из групп с колонизацией слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori отмечали статистически значимое увеличение в 1 мм2 собственной пластинки количества лимфоцитов, продуцирующих CD8 и CD4--рецепторы, как в антральном отделе желудка, так и в теле, с преобладанием последних, а также CD20-лимфоцитов. Субтипы Т-клеток распределялись в собственной пластинке слизистой оболочки желудка неоднородно: CD4-позитивные Т-клетки располагались диффузно, тогда как клетки, расположенные в интерфовеолярном и межэпителиальном пространстве были представлены в основном CD8-лимфоцитами. Полученные данные свидетельствуют об активации в слизистой оболочке желудка Th-1 иммунного ответа в ответ на колонизацию ее Helicobacter pylori.

Таким образом, структурные изменения локального иммунитета слизистой оболочки желудка при инфицировании человека Helicobacter pylori характеризуются повышением плотности клеточного инфильтрата собственной пластинки с абсолютным увеличением количества иммунокомпетентных клеток преимущественно с фенотипом CD8+, CD4+ и CD20+, появлением лимфоидных узелков различного размера с активированными реактивными центрами и увеличением в эпителиальном слое числа межэпителиальных лимфоцитов.

Биология лимфоэпителиальных взаимоотношений в слизистой оболочке желудка при взаимодействии с Helicobacter pylori в аспекте полиморфизма генов цитокинов хозяина. В процессе репаративной регенерации возникают новые межклеточные взаимоотношения между клеточными дифферонами. Клеточный инфильтрат из иммунокомпетентных клеток, который формируется в собственной пластинке слизистой оболочки желудка при инфицировании хозяина Helicobacter pylori по данным некоторых авторов в значительной степени влияет на регенерационный гистогенез (Shirin H. et al., 2001). Косвенным подтверждением этого факта являются и полученные нами данные о положительной корреляционной связи между числом пролиферирующих и апоптозных клеток эпителиального дифферона и уровнем лимфо-макрофагальной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка (r = 0,56 и r = 0,52 соответственно).

Предполагается, что роль носителя регенераторной информации принадлежит клеточному иммунитету (Бабаева А. Г., 1985 - 2009; Храмцова Ю. С., 2004). К показателям, иллюстрирующим морфогенетический эффект клеточного иммунитета, следует, вероятно, отнести увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов в перешейке желез - генеративных зонах в биоптатах слизистой оболочки желудка, колонизованной Helicobacter pylori, по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой. Следует отметить, что основную массу межэпителиальных лимфоцитов представляли собой CD8-лимфоциты. Количество CD8-лимфоцитов, расположенных между эпителиальными клетками, составляло в антральном отделе в биоптатах I группы 11,2 1,7 на 100 эпителиальных клеток, в биоптатах II группы - 18,4 2,9, в теле желудка 9,1 1,7 и 16,5 2,1, соответственно. В основополагающей работе, не утратившей своего значения до сегодняшнего дня, расположение лимфоцитов между эпителиальными клетками, для которых характерно интенсивное клеточное обновление, оценивается с позиции участия межэпителиальных лимфоцитов в регуляции регенерации эпителия (Аруин Л. И., Шаталова О. Л., 1982).

Исследование полиморфного локуса С -511 Т гена ИЛ-1 показало у что среди инфицированных Helicobacter pylori по сравнению с контрольной группой статистически достоверно чаще встречались носители аллеля Т (2 = 14,006; р = 0,001, OR = 2,0376; 95 % CI = 1,41-2,94). Анализ данных генотипирования полиморфизма гена ИЛ-1 (С +3953 Т) и VNTR полиморфизма во 2 интроне гена ИЛ-1RN показал, что распределение генотипов и аллелей этих генов не отличалось в группе подростков, инфицированных Helicobacter pylori, от контрольной группы.

При сопоставлении данных морфологического и молекулярно-генетического исследований обнаружено, что в собственной пластинке слизистой оболочки желудка воспалительная реакция, оцененная полуколичественно как слабой степени, определялась достоверно чаще у носителей генотипа С/С гена ИЛ-1 (С -511 Т) (2 = 10,165; р = 0,001), умеренная степень инфильтрации лимфоцитами и макрофагами - у носителей С/Т генотипа (2 = 22,243; р = 0,001), тогда как выраженный инфильтрат из иммунокомпетентных клеток имели преимущественно носители генотипа Т/Т (2 = 19,260; р = 0,001). Кроме того, выраженное воспаление слизистой оболочки статистически достоверно чаще определяли у носителей аллеля Т по сравнению с носителями С аллеля (2 = 4,041; р = 0,044), что позволяет говорить об ассоциации аллеля Т с более тяжелым течением хронического воспаления (OR = 3,2088; CI = 1,21-8,52). Фенотипически клетки лимфо-макрофагального инфильтрата были представлены преимущественно CD20+, CD4+ и CD8+-лимфоцитами. CD8-лимфоциты присутствовали преимущественно в зоне перешейка желез, единичные - в поверхностном эпителии. У носителей этого аллеля в большинстве биоптатов слизистой оболочки желудка в собственной пластинке определяли лимфоидные узелки.

В то же время другой полиморфизм гена ИЛ-1 (С +3953 Т) не был ассоциирован с выраженностью воспалительного ответа в собственной пластинке слизистой оболочки желудка. У большинства носителей и С и Т аллелей отмечали умеренную инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами собственной пластинки (56 и 61 % соответственно).

Кроме того, не выявлено ассоциаций и аллелей полиморфного локуса гена ИЛ-1RN с интенсивностью воспалительного ответа. У большинства носителей аллеля 4R и 2R обнаруживали умеренно выраженную инфильтрацию иммунокомпетентными клетками слизистой оболочки желудка (58 и 66 %, соответственно).

При заражении агрессивными штаммами Helicobacter pylori (cagA+ и babA2+) в сочетании с провоспалительным генотипом хозяина (ИЛ-1 -511 *T) отмечены самые значительные показатели структурных изменений локального иммунитета. Вероятно, это связано с тем, что инфицирование babA2(+) штаммами обеспечивает максимальную адгезию бактерии к эпителиоцитам, а cagA-позитивные штаммы вызывают наиболее высокий уровень продукции в слизистой оболочке желудка провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-8. Цитокины действуют как местные хемоаттрактанты для полиморфноядерных лейкоцитов, которые в свою очередь участвуют в повреждении эпителиального барьера. Носительство ИЛ-1 -511 *T аллеля в сочетании с инфицированием этими штаммами Helicobacter pylori может сыграть синергический эффект в развитии желудочно-кишечных заболеваний человека (Chiurillo M. A. et al., 2011).

Таким образом, у носителей аллеля Т полиморфного локуса C -511 T гена ИЛ-1 нарастает преимущественно количество клеток с фенотипом CD20+, CD4+ и CD8+ в сочетании с максимальными значениями площади лимфоидных узелков со светлыми центрами. При носительстве аллеля С полиморфного локуса C -511 T гена ИЛ-1 лимфоидные узелки практически не встречаются, умеренное количество лимфоцитов CD20+, CD4+ и межэпителиальные (CD8+) лимфоциты присутствуют в большинстве случаев в генеративной зоне.

Однако как решить окончательно, чем же определяется реагирование слизистой оболочки желудка в ответ на инфицирование Helicobacter pylori - генетическими характеристиками бактерии или иммунной системы хозяина? Вероятно, этот вопрос можно разрешить, рассмотрев регенерационный гистогенез через 12 месяцев после удаления инфекта.

имфоэпителиальные взаимоотношения в слизистой оболочке желудка после успешной эрадикации Helicobacter pylori

После окончания эрадикационной терапии проводили оценку адаптационных процессов слизистой оболочки желудка через 1-2 и 12 месяцев после начала восстановительного периода. Морфологические изменения, которые происходят после успешной эрадикации инфекта, детально описаны в литературе (Аруин Л. И. и др., 1998; Кононов А. В. и др., 2005, Ливзан М. А. и др., 2007; Tari A. et al., 2003; Zhou L. et al., 2003; Megraud F. et al., 2010).

После эрадикации Helicobacter pylori слизистая оболочка желудка демонстрировала хорошие восстановительные способности. В ранние и поздние сроки восстановительного периода отмечали снижение плотности лимфо-макрофагального инфильтрата, исчезновение количества лимфоидных узелков в собственной пластинке слизистой оболочки желудка и восстановление показателей клеточного обновления эпителия, что в нашем исследовании оценивалось с достоверными различиями между всеми тремя исследовательскими точками (рис. 4).

Однако не у всех исследуемых наблюдали положительную динамику восстановительного периода. Имеются сообщения о сохранении в течение нескольких месяцев, и даже лет инфильтрации иммуннокомпетентными клетками собственной пластинки слизистой оболочки желудка и сохранение повышенных показателей клеточного обновления эпителиоцитов после эрадикации инфекта (Потрохова Е. А., 2004; Кононов А. В. и др., 2005; Kuipers E. J., Grool T. A., 2001; Koelz R. et al., 2003; Ohkura Y. et al., 2003; Tari A et al., 2003, Megraud F. et al., 2010).

Среднее значение

0,95 Доверительный интервал

Рис. 4. Динамика индекса пролиферации (верхние графики) и апоптоза (нижние графики) эпителиоцитов слизистой оболочки антрального отдела желудка из первой (А) и второй (Б) исследуемых групп исходно (1), через один-два (2) и двенадцать (3) месяцев после эрадикации Helicobacter pylori.

В нашем исследовании получены подобные результаты. В 64 биоптатах (75,0 % исследуемых) через 12 месяцев после уничтожения инфекта выявляли минимальные изменения слизистой оболочки желудка (регресс клеточного инфильтрата). В 22 (25,0 %) биоптатах через 12 месяцев сохранялась большая клеточная плотность инфильтрата собственной пластинки антрального отдела (табл. 4), а также большее количество в составе инфильтрата CD20+ и CD8+ лимфоцитов и уменьшение соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов, что расценивалось нами как неблагоприятное течение восстановительного периода.

В 2 (9,8 %) случаях в собственной пластинке оставались лимфоидные узелки со светлыми центрами. Определялись межэпителиальные лимфоциты с преобладанием объемной доли этих структур в перешейке желез. Объемная доля межэпителиальных лимфоцитов в покровно-ямочном эпителии и в перешейке желез составляла в биоптатах с регрессом воспалительного инфильтрата - 2,0 и 1,8 %, соответственно, с сохранением клеточного инфильтрата - 1,4 и 2,1 %. Вероятно, сохранение межэпителиальных лимфоцитов в биоптатах с неблагоприятным течением восстановительного периода связано с нарушением клеточного обновления в слизистой оболочке желудка. Уже в ранний период восстановительного роста лимфоциты способны стимулировать пролиферативные процессы в тканях (Бабаева А. Г., 1998; 1999).

Таблица 4

Морфометрические показатели клеточного состава и клеточной плотности инфильтрата в 1 мм2 собственной пластинки слизистой оболочки антрального отдела желудка с сохранением и регрессом клеточного инфильтрата после эрадикации Helicobacter pylori

Морфометрические показатели	Биоптаты слизистой оболочки желудка с сохранением клеточного инфильтрата, n=22	Биоптаты слизистой оболочки желудка с регрессом клеточного инфильтрата, n=64	Р
Клеточная плотность	2767±349	1732±412	р = 0,23
Клеточный состав:
имфоциты	991±182	570±106	р = 0,043
Нейтрофильные лейкоциты	148±47	125±35	р =0,163
Плазматические клетки	876±277	474±176	р = 0,035
Эозинофильные гранулоциты	113±102	82±36	р = 0,098
Моноциты / макрофаги	148±22	62±31	р = 0,008
Фибробласты	491±259	319±190	р = 0,126

Примечание: Р - достоверность различий между группами.

И действительно, через 12 месяцев после проведенного лечения, значения индексов пролиферации и апоптоза в группе с сохранением инфильтрата собственной пластики слизистой оболочки желудка иммунокомпетентными клетками оставались достоверно выше аналогичных показателей в неизмененной слизистой оболочке без Helicobacter pylori инфекции (рис. 5). Усугублялся дисбаланс между процессами пролиферации и апоптоза эпителиоцитов в сторону преобладания последнего, о чем свидетельствует падение величины интегративного показателя индекс пролиферации / индекс апоптоза в ряду - биоптаты с неизмененной слизистой оболочкой, биоптаты с регрессом и сохранением клеточного инфильтрата в собственной пластинки слизистой оболочки желудка (3,2 0,8, 3,1 1,1 и 2,2 0,7, соответственно).

       Рис. 5. Значения средних индексов пролиферации (ИП) и апоптоза (ИА) в эпителиоцитах слизистой оболочки антрального отдела желудка через 12 месяцев после эрадикации Helicobacter pylori в биоптатах с регрессом (2) и сохранением (3) клеточного инфильтрата в собственной пластинке в сравнении с биоптатами с неизмененной слизистой оболочкой (1); * - достоверность различий показателей между биоптатами с сохранением клеточного инфильтрата и с неизмененной слизистой оболочкой желудка, р < 0,05.

В биоптатах слизистой оболочки антрального отдела желудка с неблагоприятным течением восстановительного периода отмечали снижение продукции желудочного протекторного муцина MUC5AC клетками покровно-ямочного эпителия с обнаружением достоверных отличий от группы благоприятным течением восстановительного периода (регресс клеточного инфильтрата в собственной пластинке), что может отражать снижение протективных свойств слизистой оболочки желудка в условиях длительного существующего воспаления (Kang H. M. et al., 2008). Кроме того, в биоптатах с сохранением клеточного инфильтрата отмечали снижение продукции белка желудочной дифференцировки Shh в эпителиальных клетках слизистой оболочки антрального отдела желудка.

Вероятно, активация регенераторных процессов зависит и от особенностей регуляции иммунной системы хозяина (уровень цитокинов в слизистой оболочке желудка) и иммуногенных свойств бактерии, связанных со штаммоспецифическими особенностями инфекта. В связи с этим мы проанализировали гистологическую картину слизистой оболочки антрального отдела желудка и показатели клеточного обновления в зависимости от генетической характеристики штаммов Helicobacter pylori и инфицированного человека.

Ретроспективный анализ генотипирования Helicobacter pylori в биоптатах с регрессом и сохранением клеточного инфильтрата через 12 месяцев после лечения показал, что в группах с сохранением лимфо-макрофагального инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки антрального отдела желудка и с благополучным течением восстановительного периода статистических различий в распределении штаммов Helicobacter pylori не обнаружено.

Уровень цитокинов, выделяемых иммуннокомпетентными клетками воспалительного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки желудка, зависит от генетических особенностей инфицированного.

При исследовании полиморфного локуса С -511 Т гена ИЛ-1 выявлено статистически достоверное увеличение частоты аллеля Т в группе с сохранением клеточного инфильтрата по сравнению с группой, в которой через год после эрадикации Helicobacter pylori в биоптатах отмечали минимальные изменения слизистой оболочки желудка (2 = 4,067; р = 0,044; OR = 1,814; 95 % CI = 1,08-3,05). Генетическое исследование полиморфизма гена ИЛ-1 (С +3953 Т) показало, что у носителей аллеля Т статистически достоверно чаще также определяется неблагоприятное течение восстановительного периода (2 = 4,356; р = 0,037, OR = 1,9066; 95 % CI = 1,07-3,37). При исследовании VNTR полиморфизма во 2 интроне гена ИЛ-1RN связи, какого либо генотипа или аллеля, с сохранением клеточного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки желудка после удаления инфекта не обнаружено. При анализе сочетания аллелей оказалось, что неблагоприятное течение восстановительного периода характеризуется носительством преимущественно комбинации ИЛ-1 -511 *Т / ИЛ-1RN *2 и ИЛ-1 +3953 *Т / ИЛ-1RN *2.

Таким образом, неблагоприятное течение восстановительного периода, характеризующееся сохранением в собственной пластинке слизистой оболочки желудка иммунокомпетентных клеток в сочетании с высоким уровнем клеточного обновления, наиболее часто определяется у носителей аллеля Т полиморфных локусов C -511 T и С +3953 Т гена ИЛ-1 и комбинации аллелей ИЛ-1 -511 *Т / ИЛ-1RN *2 и ИЛ-1 +3953 *Т / ИЛ-1RN *2, что позволяет говорить о их провоспалительной роли в развитии иммунного ответа хозяина.

При анализе ассоциации полиморфизма генов цитокинов со структурными изменениями слизистой оболочки желудка, происходящими при инфицировании Helicobacter pylori и после удаления инфекта, и штаммоспецифическими особенностями Helicobacter pylori выявлены следующие закономерности (рис. 6).

Рис. 6. Схема, отражающая ассоциацию полиморфных вариантов генов цитокинов со структурными изменения слизистой оболочки желудка, происходящими при инфицировании Helicobacter pylori и после удаления инфекта, и штаммоспецифическими особенностями бактерии.

Оценив степень выраженности воспалительного ответа в собственной пластинке слизистой оболочки желудка, мы получили данные, представленные на первом цилиндре. Все биоптаты были разделены на 3 группы - выраженная, умеренная и слабая степень воспаления слизистой оболочки желудка. Далее, проанализировав штаммоспецифические особенности Helicobacter pylori и выявив агрессивные штаммы бактерии (cagA+ и babA2+), мы обнаружили, что эти штаммы чаще определяются у лиц, в биоптатах слизистой оболочки желудка которых определяется выраженная и умеренная степень воспаления (второй цилиндр). После эрадикации бактерии оказалось, что лица, с сохранением клеточного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки желудка через 12 месяцев (третий цилиндр), являются носителями преимущественно гаплотипа ИЛ-1*Т / ИЛ-1RN*2R (четвертый цилиндр) и при этом были в одинаковой мере инфицированы как агрессивными (cagA+ и babA2+), так и другими штаммами Helicobacter pylori. Однако, ретроспективный анализ показал, что у лиц носителей гаплотипа ИЛ-1*Т / ИЛ-1RN*2R в первой исследовательской точке в биоптатах слизистой оболочки желудка в собственной пластинке определялся преимущественно выраженный и умеренный клеточный инфильтрат (сектор, выделенный красными линиями). Таким образом, нам удалось показать наличие провоспалительного гаплотипа, который обусловливает высокий и продолжительный мукозальный иммунитет у хозяина, вне зависимости от особенностей штаммов Helicobacter pylori, которыми он был инфицирован. Поскольку иммунной системе отводится морфогенетическая функция (Бабаева А. Г. и др., 2009) можно полагать, что высокие показатели локального иммунитета будут обусловливать у лиц с генотипом ИЛ-1*Т / ИЛ-1RN*2R более выраженные изменения в клеточном обновлении эпителиального дифферона, проявляющиеся в увеличении индексов пролиферации и апоптоза, расширении пролиферативного и апоптозного компартментов и транслокацией его в направлении просвета желудка, либо в направлении дна желез.

Заключение

Взаимоотношение макро- и микроорганизма имеют характер взаимодействия двух биологических систем, каждая из которых имеет индивидуальные генетические особенности. Морфофункциональные изменения слизистой оболочки желудка при инфицировании человека Helicobacter pylori характеризуются комплексом реакций, основными из которых являются изменение пролиферации и дифференцировки эпителиоцитов, трансформацией межклеточных взаимодействий, реструктуризацией стромы с изменением клеточного состава собственной пластинки слизистой оболочки. Структурные изменения слизистой оболочки желудка, происходящие при возникновении отношений паразит-хозяин, обусловлены не только и не столько экспрессией цитотоксических генов бактерии, сколько различной реактивностью иммунной системы хозяина. Вне зависимости от биологических свойств штаммов Helicobacter pylori после их успешной эрадикации в реакциях эпителиального дифферона и локального иммунитета можно выделить два варианта реагирования: первый характеризуется сохранением иммунокомпетентных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки, репаративной регенерацией эпителия и ассоциирован с носительством полиморфных вариантов генов цитокинов, а второй - редукцией клеточного инфильтрата, физиологической регенерацией эпителия и не связан с генетическим полиморфизмом генов цитокинов хозяина.

Изучение хеликобактериоза служит моделью изучения регенерации клеток и отношений макро- и микроорганизмов в контексте открытых биологических систем. Оценка регенераторных процессов эпителиального дифферона, происходящих при воздействии Helicobacter pylori, позволяет глубже понять биологию слизистой оболочки желудка и приблизиться к пониманию проблемы репаративного гистогенеза.

ВЫВОДЫ

1. В слизистой оболочке желудка при колонизации ее Helicobacter pylori отмечается нарушение паренхиматозно-стромальных отношений в антральном отделе желудка: уменьшение относительного объема желез при нарастании объема клеточного инфильтрата из лимфоцитов, макрофагов и нейтрофильных лейкоцитов, удлинение желудочных ямок, уменьшение высоты покровно-ямочного эпителия, расцененные как нарушение физиологической регенерации.
2. Структурные изменения мукозального иммунитета слизистой оболочки желудка в условиях инфицирования Helicobacter pylori характеризуются абсолютным увеличением количества иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD20+, CD4+ и CD8+, формированием лимфоидных узелков со светлыми центрами и обнаружением межэпителиальных лимфоцитов (CD8+) в генеративной зоне эпителиального дифферона по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой.
3. При взаимодействии Helicobacter pylori с клетками покровно-ямочного эпителия наблюдается изменение темпов клеточного обновления эпителиального дифферона. Повышается индекс пролиферации в клетках генеративной зоны и расширяется пролиферативный компартмент слизистой оболочки. В клетках покровно-ямочного эпителия увеличивается индекс апоптоза и происходит расширение зоны апоптотической гибели клеток, что свидетельствует о смене физиологической регенерации эпителия на репаративную.
4. Наиболее выраженные изменения показателей репаративной регенерации эпителиального дифферона (увеличение индексов пролиферации и апоптоза) и дифференцировки эпителия (увеличение продукции Shh - белка желудочной дифференцировки и MUC5AC - желудочного муцина, снижение выработки протекторного муцина MUC6 клетками перешейка желез) отмечаются при колонизации слизистой оболочки желудка cagA(+) и babA2(+) штаммами Helicobacter pylori. Наличие генов vacAs1 и vacAs2 Helicobacter pylori определяет высокий уровень апоптоза эпителиальных клеток без ускорения пролиферации - дефицит клеточных форм эпителиального дифферона.
5. Изменения в эпителиальном диффероне являются результирующим ответом слизистой оболочки желудка, определяемым комбинацией продуктов генов штаммов Helicobacter pylori, выделенных у инфицированного субъекта, и уровнем мукозального иммунитета, детерминированного генетическим полиморфизмом ИЛ-1 (С -511Т и С +3953 Т) и ИЛ-1RN (VNTR во 2 интроне) хозяина.
6. Через 12 месяцев после проведения успешной эрадикационной терапии (устранение бактерии) в 75% биоптатов отмечается физиологическая регенерация с восстановлением структуры слизистой оболочки желудка: снижение показателей пролиферации и апоптоза в покровно-ямочном эпителии и генеративной зоне, восстановление зонального распределения протекторных муцинов MUC5AC и MUC6, свидетельствующее о появлении дифференцированных форм эпителиальных клеток в этих зонах, снижение плотности клеточного инфильтрата, а также восстановление длины желудочных ямок и высоты покровно-ямочного эпителия, до уровня морфометрических показателей неизмененной слизистой оболочки желудки.
7. Через 12 месяцев после эрадикации Helicobacter pylori в 25 % биоптатов сохраняются признаки репаративной регенерации слизистой оболочки желудка, проявляющиеся в сохранении высоких индексов пролиферации и апоптоза эпителиоцитов антрального отдела желудка в сочетании с высоким уровнем локального иммунного ответа (выраженная инфильтрация собственной пластинки иммунокомпетентными клетками). При этом персистенция репаративной регенерации и высокий уровень мукозального иммунитета не зависят от генетических особенностей штаммов Helicobacter pylori, которыми прежде был инфицирован хозяин.
8. Регенерационный гистогенез в слизистой оболочке желудка в условиях длительно существующего высокого уровня локального иммунитета проявляется снижением продукции белков желудочной дифференцировки Shh и желудочного муцина MUC5АС, что свидетельствует о модификации дифференцировки клеток эпителиального дифферона.
9. Вне зависимости от биологических свойств бактерии неблагоприятное течение восстановительного периода через 12 месяцев после успешной эрадикации Helicobacter pylori развивается у хозяина, имеющего комбинацию аллелей ИЛ-1 -511 *Т / ИЛ-1RN *2 и ИЛ-1 +3953 *Т / ИЛ-1RN *2, и характеризуется сохранением в собственной пластинке слизистой оболочки желудка иммунокомпетентных клеток в сочетании с высоким уровнем обновления в эпителиальном диффероне.

СПИСОК НАУЧНЫХ СТАТЕЙ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клинические варианты течения постэрадикационного периода у детей с Н. pylori - ассоциированным гастритом / Е. А. Потрохова, А. В. Кононов, Н. В. Соботюк, Т. А. Сыкчина, Е. Г. Поморгайло, Ю. А. Стройлова // Омский научный вестник - 2005. - №6 (34). - С. 92-94.
2. Влияние аллельных полиморфизмов патогенных штаммов Helicobacter pylori на течение постэрадикационного периода при хроническом геликобактерном гастрите у детей / Е. А. Потрохова, Н. В. Соботюк, А. В. Кононов, Е. Г. Поморгайло // Вопросы современной педиатрии. - 2006. - Т.5, №4. - С. 91-93.*
3. Клеточное обновление слизистой оболочки желудка у детей с функциональной диспепсией в отсутствии Helicobacter pylori инфекции / Е. А. Потрохова, Н. В. Соботюк, Е. Г. Поморгайло, А. В. Кононов // Омский научный вестник. - 2006. - №3 (37), Ч.III. - С. 102-105.
4. Полиморфизм генов Helicobacter pylori у детей / Ю. А. Стройлова, Е. А. Потрохова, Е. Г. Поморгайло, Н. В. Соботюк, А. В. Кононов // Омский научный вестник. - 2006. - №3 (36). - С. 240Ц244.*
5. Клеточное обновление слизистой оболочки желудка у детей с функциональной диспепсией в отсутствии Helicobacter pylori инфекции / Е А. Потрохова, Н. В. Соботюк, Е. Г. Поморгайло, А. В. Кононов // Омский научный вестник. - 2006. - №3 (37) (приложение). - С. 102Ц105.
6. Поморгайло Е. Г. Полиморфизм генов цитокинов у детей с персистенцией воспалительного инфильтрата после эрадикации Helicobacter pylori / Е. Г. Поморгайло // Уральский медицинский журнал. - 2009. - №. 4 (58) - С. 27-30.*
7. Патология гастодуоденальной зоны у подростков с инфекцией, вызванной различными штаммами Нelicobacter pylori / Ю. А. Стройлова, Е. А. Потрохова, Е. Г. Поморгайло, Н. В. Соботюк // Российский медицинский журнал. - 2010. - №. 2 - С. 31-34.*
8. Полиморфизм генов цитокинов в развитии Нelicobacter pylori-инфекции / А. В. Кононов, Е. Г. Поморгайло, Е. А. Потрохова, М. Л. Филипенко // Вестник РАМН. - 2010. - №. 2 - С. 8-12.*
9. Полиморфизм генов IL-1, антагониста его рецепторов и фенотип воспалительной реакции слизистой оболочки желудка при хеликобактерной инфекции / А. В. Кононов, Е. Г. Поморгайло, М. Л. Филипенко, Е. Н. Воронина, А. И. Шевела // Молекулярная медицина. - 2010. - №. 1 - С. 42-45.*
10. Поморгайло Е. Г. Особенности клеточного обновления эпителия слизистой оболочки желудка при ее колонизации различными штаммами Helicobacter pylori / Е. Г. Поморгайло // Морфологические ведомости. - 2010. - №. 2 - С. 91-95.*
11. Поморгайло Е. Г. Особенности регенерации эпителия слизистой оболочки желудка в условиях инфицирования Helicobacter pylori / Е. Г. Поморгайло // Морфология. - 2010. - №. 4 (137) - С. 156.*
12. Поморгайло Е.Г. Особенности клеточного обновления эпителия слизистой оболочки желудка у подростков, инфицированных Helicobacter pylori, в зависимости от полиморфизма генов цитокинов / Е.Г. Поморгайло // Омский научный вестник. - 2010. - №. 1 (94) - С. 123-125.*
13. Поморгайло Е. Г. Оценка клеточного обновления и муцинпродуцирующей активности эпителия слизистой оболочки желудка при инвазии Helicobacter pylori / Е. Г. Поморгайло, С. И. Мозговой, А. В. Кононов // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - Т. 12, № 1-3. - С. 49-51.*
14. Поморгайло Е. Г. Реактивные изменения слизистой оболочки желудка человека при инфицировании Helicobacter pylori в аспекте генетической характеристики воспалительного ответа / Е. Г. Поморгайло, А. В.Кононов, Е. А. Потрохова // Морфология. - 2011. - Т. 139, № 2. - С. 55-58.*
15. Потрохова Е. А. Варианты течения H. pylori-ассоциированного гастрита у подростков после эрадикации возбудителя / Е. А. Потрохова, Е. Г. Поморгайло, А. В. Кононов // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2012. - № 2. - С. 46-.49.*

Примечание: * - статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Соискатель:                                                        Е. Г. Поморгайло

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии