Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
ВИШНЯКОВ Александр Иванович
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ГЕМОПОЭЗА КУР ПРИ ДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Уфа - 2011
Работа выполнена в институте Биоэлементологии ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Дегтярев Владимир Васильевич
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Исмагилова Эльза Равильевна Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Баймишев Хамидулла Балтуханович доктор биологических наук Хисматуллина Зухра Рашидовна
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет
Защита состоится л3 февраля 2012 г. В 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.02 при ФГБОУ ВПО Башкирский государственный аграрный университет, 450001, г. Уфа, ул. 50 лет Октября, 34, корпус 4.
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГБОУ ВПО Башкирский государственный аграрный университет.
Автореферат размещен на сайте ВАК л ______________ 2011 г.
Автореферат разослан л_________________2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор Ф.А. Каримов 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Птицеводство является одной из наиболее эффективных, высокорентабельных и перспективных отраслей животноводства, так как в отличие от других отраслей не имеет сезонности и занимает ведущее место по удовлетворению населения продуктами питания в течение года (Болотников И.А., Михиева В.С., Олейник Е.К., 1983;
Кравченко В.М., 2000; Хохлов Р.Ю., Кузнецов С.И., 2009). Успешное воплощение целевой программы развития этой отрасли зависит от максимального использования потенциала высокопродуктивных кроссов сельскохозяйственной птицы (Фисинин В.И., 2005; Фомичв Ю.П., Никанова Л.А., Торшков А.А. и др., 2011).
Интенсивное развитие промышленности в последние годы привело к тому, что проблема загрязнения окружающей среды и выживания человечества в этих условиях стала центральной проблемой современности и коснулась всех сфер деятельности человека. В ряде случаев технологические процессы вышли из-под контроля, вследствие чего происходит стремительное накопление нехарактерных для биосферы веществ (радионуклидов, тяжелых металлов и других токсикантов) (Баимова С.Р., Редькина Н.Н., Лыкасова И.А., 2007; Романенко А.А., 2010).
В результате экологического неблагополучия окружающей среды (почвы, воды, воздушного бассейна, кормов) увеличивается заболеваемость и падеж сельскохозяйственных и диких животных, снижается их продуктивность. Систематическое воздействие токсических веществ вызывает патологические изменения в организме животных, приводит к нарушению обмена веществ, иммунологического статуса, нейрогуморальных систем, структуры органов и тканей и т.д. (Смирнов А.М. и др., 2001; Топурия Г.М., 2002, 2003).
Миграция токсических элементов в объектах внешней среды ведет к накоплению их в воде, почве, кормах, организмах животных и, через продукты питания, у человека (Авалиани С.Л., 1997; Алексеев Ю.В., 1987; Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде, 2000; Эйхлер В., 1993). В тоже время широкое использование различных форм металлов микроэлементов в промышленности и сельском хозяйстве предполагает необходимость изучения последствий их действия на живые системы.
В последние десятилетия появляется все больше фактов в отечественной и мировой практике о последствиях крупных радиационных катастроф: аварий на атомных электростанциях, утечек радиоактивного топлива (Швыдко Н.С. с соавт., 1994; Швыдко Н.С., Иванова Н.П., 1995; Nilsen T., Bohmer N., 1994; Медведев Ж., 2011). Эта проблема приобретает особую актуальность в связи с тем, что на территориях, загрязненных радионуклидами, проживают большие контингенты людей, выращиваются сельскохозяйственные животные и птица (Ярмоненко С.П., 1994, 1996; Семенова Е.Г., 1997; Антонов В.П., 1989; Старых О.Н., 2002; Сафонова В.А., Старых О.Н., 2002; Топурия Г.М., 2003). В то же время дозовые и временные параметры поражения и восстановления клеток крови не могут быть одинаковыми для всех животных, в том числе и для птицы (Alpen E.L., 1997).
Исходя из этого, совершенствование подходов к оценке костномозгового кроветворения должно происходить с учетом накопления информации о воздействии факторов экзогенного происхождения на биосистемы, ультраструктуру органов и систем организма, находящегося в состоянии функциональной нормы и патологии.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлось изучение функциональной морфологии системы гемопоэза при действии химических и физических факторов на клеточном и субклеточном уровнях; элементного статуса и крови кур.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Установить влияние уровня нутриентной обеспеченности на костномозговое кроветворение.
2. Определить корреляционную связь клеточного состава красного костного мозга с его элементным статусом, а также с содержанием химических элементов в теле птицы.
3. Дать электронно-микроскопическую, цитологическую и гематологическую оценку гемопоэза кур в различные периоды жизни в зависимости от уровня экологической нагрузки.
4. Оценить степень воздействия наночастиц меди на морфофункциональное состояние красного костного мозга и периферическую кровь птицы.
5. Изучить влияние физических факторов антропогенного происхождения (гамма-облучение в различных дозах) на гемопоэз кур.
6. Предложить математическую модель определения степени воздействия физических факторов на организм.
Научная новизна. Впервые, на основе дискриминантного анализа, получены функции, позволяющие определить степень воздействия физических факторов (гамма-облучение) на организм птицы.
Изучено влияние нутриентной обеспеченности рациона цыплят-бройлеров на гемопоэз, выявлены элементы, влияющие на него.
Установлены изменения концентрации химических элементов в красном костном мозге кур. Выявлена взаимосвязь между элементным статусом и клеточным составом красного костного мозга.
Представлены новые сведения о влиянии отдельных химических элементов (цинк, свинец) в виде солей на гемопоэтические клетки красного костного мозга на ультраструктурном уровне.
Впервые выявлены особенности влияния наночастиц меди при различных способах введения и дозировках на элементный статус, клеточный состав красного костного мозга и периферическую кровь птицы.
Показаны электронно-микроскопические изменения в миэлограмме птиц в первые сутки после воздействия гамма-облучения в различных дозах. Отмечены морфологические изменения в составе красного костного мозга и периферической крови при облучении животных различными дозами.
Практическая и теоретическая значимость работы Полученные результаты позволяют раскрыть некоторые стороны механизма действия факторов окружающей среды на гемопоэз птицы, вносят существенный вклад в изучение одного из важнейших разделов биологии - гематологии.
Выявленные на основе дискриминантного анализа переменные позволяют классифицировать особей по группам воздействия физических факторов. Установленные структурно-функциональные особенности красного костного мозга формируют основу для разработки рекомендаций коррекции нарушений гемопоэза птицы.
Полученные данные вошли в рекомендации:
Стимуляция гемопоэза птицы нанопорошками меди (рассмотрены и одобрены Ученым советом ВНИИВСГЭ и секцией Ветеринарная санитария, гигиена и экология Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол № 2/от л13 апреля 2011 г.).
Результаты научных исследований используются в учебном процессе и научной работе высших учебных заведений: Оренбургском государственном университете, Оренбургском государственном аграрном университете, Башкирском государственном аграрном университете, Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, Мордовском государственном университете, Кубанском государственном аграрном университете, Самарской государственной сельскохозяйственной академии, Уральской государственной академии ветеринарной медицины, Казанской государственной академии ветеринарной медицины, Уральской государственной сельскохозяйственной академии, Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им В.Р. Филиппова, Ставропольском государственном аграрном университете, Ярославской государственной сельскохозяйственной академии, Алтайском государственном аграрном университете, Белгородской государственной сельскохозяйственной академии и в работе научно-исследовательских институтов и центров: Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства Россельхозакадемии, Дальневосточном зональном научно-исследовательском ветеринарном институте Россельхозакадемии, Центре биотической медицины (г. Москва).
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийских и региональных научнопрактических конференциях молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2003 - 2009); Международных и Всероссийских конференциях и симпозиумах: Достижения ветеринарной медицины XXI веку (Барнаул, 2002), Проблемы регионального управления рисками на объектах агропромышленного комплекса (Оренбург, 2002), Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля с/х продукции (Москва, 2002), Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях (Пенза, 2003), Актуальные аспекты экологической, сравнительно-видовой, возрастной и экспериментальной морфологии (Улан-Удэ, 2004), Актуальные вопросы ветеринарной медицины (Новосибирск 2004), Актуальные проблемы АПК в XXI веке (Самара, 2004), Агропромышленный комплекс:
состояние и перспективы развития (Великие Луки, 2005), Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы (Ульяновск, 2005), Естествознание и гуманизм (Томск, 2005), Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных (Троицк, 2009), Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решении (Ульяновск, 2009), Проблемы экологии Южного Урала (Оренбург, 2009), Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы (Оренбург, 2009), Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения (Ульяновск, 2010), Актуальные проблемы охраны природы, окружающей природной среды и рационального природопользования (Чебоксары, 2010), Экология. Риск. Безопасность (Курган, 2010); на Международном совещании Млекопитающие как компонент аридных экосистем (ресурсы, фауна, экология, медицинское значение и охрана) (Москва, 2004); на V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2003); на 4th International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (St. Petersburg, 2010), Краснодар (2009), Казань (2010), Ярославль (2010), Москва (2010), Алма-Аты (2010); на расширенном заседании института Биоэлементологии ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет (протокол № 5 от 24 мая 2011 г).
Работа поддержана Комитетом администрации Оренбургской области по науке, высшей и средней профессиональной школе (грант № 5/03, 2003 г.), выполнялась в рамках научного проекта Российского гуманитарного научного фонда (РГНФ № 08-06-81603 а/У).
Основные научные разработки отмечены дипломом выставки научнотехнического творчества молодежи (Москва, 2002).
Публикации результатов исследований. Положения диссертационной работы отражены в 41 научных публикациях, в том числе в 15, опубликованных в журналах и изданиях рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 2страницах машинописного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа содержит 147 электроннограмм и графиков, 32 таблицы. Список литературы включает 458 источников, в том числе - 149 иностранных авторов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Зависимость клеточного состава красного костного мозга кур от нутриентной обеспеченности и элементного статуса организма.
2. Морфофункциональные изменения в системе гемопоэза птицы при воздействии химических и физических факторов.
3. Действие нанопорошков меди в различных дозировках и способах введения на клеточный состав красного костного мозга и периферическую кровь.
4. Определение степени воздействия физических факторов (гамма-облучение) на организм птицы.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования были проведены в период с 2002 по 2011 годы в условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет. Всего было проведено 5 лабораторных экспериментов на бройлерах кросса Смена - 7. Исследования на животных проводились в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.19г., № 755) и согласно рекомендациям ВНИТИП (2002).
На первом этапе с целью изучения влияния нутриентной обеспеченности на гемопоэз птицы было отобрано 120 десятидневных цыплят-бройлеров, из которых сформировали 4 группы (n=30) (табл. 1). Разница между группами состояла в уровне обменной энергии и содержании регламентируемых микроэлементов в рационе.
В начале и через 10, 20, 30, 40 суток экспериментальных исследований под эфирным рауш-наркозом проводили убой птицы (ВНИТИП, 2000) с последующим формированием проб красного костного мозга.
После окончания подготовительного периода птица I опытной группы была переведена на ламинеральный рацион. Бройлеры II опытной группы получали рацион с содержанием обменной энергии 13,2 МДж/кг СВ, не нормируемый по микроэлементам. Третья опытная группа - основной рацион с содержанием обменной энергии 13,4 МДж/кг СВ с добавлением минерального премикса, составленного по рекомендациям ВНИТИП (2004), с включением солей марганца, железа, цинка, меди, кобальта, йода и селена.
Таблица 1 - Схема первой серии исследований Период опыта подготовительный учетный Группа возраст, суток 10-20 21-контрольная ОРI опытная ОРОР II опытная ОРIII опытная ОРОР - основной рацион в подготовительный период;
Примечание:
ОР1 - основной рацион в учетный период;
ОР2 - ламинеральная диета;
ОР3 - основной рацион без минерального премикса;
ОР4 - рацион с минеральным премиксом.
Кормление опытной птицы проводилось 2 раза в сутки. Поение птицы осуществлялось без ограничений. Микроклимат в помещении соответствовал требованиям ОНТПЦ4Ц88.
На втором этапе с целью изучения влияния свинца на гемопоэз птицы было отобрано 140 суточных цыплят-бройлеров, из которых методом пар-аналогов были сформированы контрольная и опытная группы (n=70) (табл. 2).
С кормом птица опытной группы получала 1,5 МДУ свинца в виде азотнокислой соли, что соответствует 4,5 мг свинца на 1 кг корма.
Таблица 2 - Схема второй серии исследований Учетный период, возраст, суток Группа 2-контрольная ОРопытная ОРОР1 - основной рацион;
Примечание:
ОР2 - основной рацион + 4,5 мг. азотнокислого свинца на 1 кг корма.
На третьем этапе с целью изучения воздействия цинка на гемопоэз птицы однократно, в острых опытах, внутрибрюшинно вводили хлорид цинка в дозах мг/кг и 60 мг/кг массы животного. В эксперименте приняло участие 210 суточных цыплят-бройлеров, из которых методом пар-аналогов было сформировано 3 группы (n=70) (табл. 3).
На следующем этапе с целью изучения влияния нанопорошков меди на гемопоэз птицы было отобрано 150 десятидневных цыплят-бройлеров, из которых методом аналогов было сформировано 5 групп (n=30) (табл. 4). Отбор материала для исследования проводился вначале и в конце эксперимента.
Наночастицы меди типа Cu10x представляют собой сферические частицы размером 103,02,0 нм с оксидной пленкой толщиной 6 нм, полученные в Институте энергетических проблем химической физики РАН (Москва). Методом рентгенофазового анализа определен их состав: меди кристаллической 96%, меди оксида 4% (Глущенко Н.Н., 2007).
Таблица 3 - Схема третьей серии исследований Учетный период, возраст, суток Группа 2-контрольная - I опытная внутрибрюшинно однократно 40 мг/кг хлорида цинка II опытная внутрибрюшинно однократно 60 мг/кг хлорида цинка Таблица 4 - Схема четвертой серии исследований Период опыта подготовительный учетный Группа возраст, суток 10-20 21-I (контрольная) ОРII (I опытная) ОРIII (II опытная) ОР ОРIV (III опытная) ОРV (IV опытная) ОРОР - основной рацион в подготовительный период;
Примечание:
ОР1 - основной рацион в учетный период;
ОР2 - основной рацион + нч меди 1,7 мг/кг корма;
ОР3 - основной рацион + нч меди б0,7 мг/кг корма;
ОР4 - основной рацион + нч меди 2,0 мг/кг массы в/м;
ОР5 - основной рацион + нч меди 0,2 мг/кг массы в/м.
В ходе проведения пятой серии экспериментальных исследований было изучено влияние физического фактора на гемопоэз животных по схеме, представленной в таблице 5.
Таблица 5 - Схема пятой серии исследований Учетный период, возраст, суток Группа 2-контрольная - I опытная однократное гамма-облучение в дозе 0,5 Гр II опытная однократное гамма-облучение в дозе 1,0 Гр III опытная однократное гамма-облучение в дозе 6,0 Гр Для этого суточных цыплят подвергали общему однократному гаммаоблучению на телегамматерапевтической установке Агат Р-1, при мощности дозы 0,6 Гр/мин., в равномерном поле размером 0,2 х 0,2 м, расстояние от источника до поверхности - 0,75 м, источник Со-60.
Для оценки ранних последствий воздействия гамма-излучения на клетки красного костного мозга птицы производили убой через 1, 3, 6, 12 и 24 ч после облучения (по десять цыплят на каждый срок), материал брался для электронномикроскопических исследования.
В период проведения 2, 3 и 5 серий экспериментальных исследований убои проводились в начале и в возрасте 2, 5, 7, 15, 30, 45, 60 суток жизни цыплят под эфирным рауш-наркозом (ВНИТИП, 2000) с последующим формированием проб красного костного мозга.
Гематологические показатели изучали общепринятыми методами. В стабилизированной гепарином или трилоном Б крови определяли содержание лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов, процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Гистологический материал (костный мозг бедренной кости) анализировался по 400 клеткам в мазках, окрашенных по Паппенгейму, после чего подсчитывали численность клеток в красном костном мозге (миэлограмма).
Для ультратонкого исследования костный мозг фиксировали в 2,5 %-ном растворе глютаральдегида на фосфатном буфере с последующей часовой дофиксацией 1 %-ным раствором OsO4 на том же буфере. После обработки насыщенным раствором уранилацетата на 70 %-ном этаноле материал обезвоживали в спиртах восходящей крепости и заключали в эпон. Ультратонкие срезы изучали на просвечивающем электронном микроскопе JEM - 100 CX II (фирма JEOL, Япония).
Определение содержания химических элементов в биосубстратах проводилась методами атомно-эмиссионной спектрометрии (АЭСЦИСП) и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной аргоновой плазмой (МСЦИСП) (Онищенко Г.Г., Шестопалов Н.В., 1999) в лаборатории АНО Центр биотической медицины, г. Москва (аттестат аккредитации - ГСЭН. RU.ЦОА.311, регистрационный номер в государственном реестре - Росс. RU 0001.513118 от 29 мая 2003 г.; Registration Certificate of ISO 9001: 2000, Number 4017 - 5.04.06). При выполнении исследований методами АЭС - ИСП и МСЦИСП озоление биосубстратов проводили с использованием микроволновой системы разложения MDЦ2000 (США). Оценка содержания элементов в полученной золе осуществлялась с использованием масс-спектрометра Elan 9000 (Perkin Elmer, США) и атомно-эмиссионного спектрометра Optima 2000 V (Perkin Elmer, США).
Статистическая обработка полученного материала проводилась с применением общепринятых методик при помощи приложения Excel из программного пакета Office XP и Statistica 6.0, включая определение средней арифметической величины (х), стандартной ошибки средней (Sx). Для выявления статистически значимых различий использован критерий Стьюдента, сходства (различия) между средними значениями во всех группах - метод Краскела- Уоллиса, для классификации особей по воздействию различных факторов применялся дискриминантный анализ (Лакин Г.Ф., 1990; Платонов А.Е., 2000; Кобзарь А.И., 2006).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Изменение костномозгового кроветворения и периферической крови цыплят при их содержании на рационах с различной нутриентной обеспеченностью. Анализируя миэлограмму птицы при различных уровнях нутриентной обеспеченности мы установили, что численность клеток различных ростков кроветворения изменялась, как в зависимости от уровня нутриентной обеспеченности, так и от периода исследования.
У птицы третьей опытной группы общая численность клеток красного костного мозга на протяжении первых десяти суток эксперимента снижалась на 26,32 % (р<0.01), по нашему мнению, в данный период происходит адаптация организма к новому уровню кормления. В последующие возрастные периоды происходило повышение общей численности до уровня 2,8 - 3,0 млн. в 1 мм3 пунктата, а к концу эксперимента данный показатель составлял 1,485 млн. в 1 мм3 (р<0.001). Во второй опытной группе нами установлено стойкое увеличение данного показателя в первый месяц эксперимента, а к его концу снижение до аналогичного показателя у птицы контрольной группы. В отличие от рассмотренных групп в первой опытной мы выявили волнообразное изменение общего количества клеток с минимальными значениями на 10 и 30 и максимальными - на 20 и 40 сутки.
При рассмотрении отдельных ростков кроветворения нами обнаружена сходная динамика изменений у животных третьей опытной группы численности клеток грануляционной, эритроидной, лимфоидной и моноцитарной групп, причем в первые десять суток мы отмечали их снижение, в последующие два срока - повышение, а к концу эксперимента вновь снижение (р<0.01). Немного иная картина наблюдается в изменении концентрации клеток мегакариоцитарной группы: в первые два срока исследования мы отметили повышение их численности в 2,4 раза (р<0.001), а к концу эксперимента - снижение в 2,0 раза (р<0.001).
У бройлеров второй опытной группы изменение клеточного состава красного костного мозга выглядело так: в первый отрезок исследования значимых изменений нами не выявлено, к середине эксперимента отмечалось достоверное повышение численности клеток грануляционной, лимфоидной, моноцитарной и мегакариоцитарной групп (р<0.01) и снижение эритроидных клеток. Через месяц мы установили увеличение количества всех перечисленных клеток на 15,2 - 50,7 % (р<0.05), а к 40му дню - стойкое снижение в 1,8 - 2,5 раза (р<0.001).
Изменения концентрации отдельных клеток красного костного мозга у животных первой опытной группы носят аналогичный характер, что и колебание общей численности клеток.
Исследования количества гемоглобина в крови цыплят показало, что перед началом эксперимента, в возрасте десяти суток, его концентрация составляет в среднем 87,33 г/л. У животных третьей опытной группы минимальным значение данного показателя было на 40-е сутки жизни, а максимальным - в конце эксперимента и составляло 128,00 г/л. Во второй опытной группе концентрация гемоглобина колеблется в пределах от 84,67 г/л (в 20 суток) до 125,33 г/л (в 50 суток). В первой опытной группе максимальная концентрация гемоглобина зафиксирована в возрасте 40 суток и составляет 135,67 г/л. При этом в опытных группах содержание гемоглобина в различных возрастных группах на 5,51-21,11 % меньше, чем в контрольной, за исключением 40-суточного возраста, когда этот показатель в контрольной группе уступает опытным 14,75-33,43 % (р<0.05).
Возрастная динамика количества эритроцитов в крови цыплят, в общем, отражает таковую концентрации гемоглобина. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) в третьей опытной группе максимальным данный показатель нами регистрировался в 30-ти суточном возрасте (5, 67 мм/ч), что соответствует контрольным значениям на 20-е сутки. В течение всего опыта скорость оседания эритроцитов в крови цыплят второй опытной группы больше, чем у цыплят контрольной на 11,10-111,10 % (р<0.01). В первой опытной группе исследуемый показатель превышал аналогичный третьей опытной группы на 55,57-221,48 % (р<0.001), за исключением 20-суточного возраста, когда скорость оседания эритроцитов у цыплят, получающих рацион с дефицитом микроэлементов, на 23,54 % (р<0.05) меньше, чем у цыплят, получающих основной рацион.
Количество лейкоцитов в контрольной и опытных группах варьировало от 24,15 109/л до 59,10 109/л с максимумом в возрасте 40 суток в группе животных, получавших ламинеральную диету, и в 30 суток у цыплят второй опытной группы, аналогичные результаты были получены Мирошниковым С.А., Лебедевым С.В., Рахматуллиным Ш.Г., Кван О.В., Чепрасовой О.В. (2007). Доля различных форм лейкоцитов изменяется в зависимости от возраста и уровня кормления.
Таким образом, снижение нутриентной обеспеченности рациона цыплятбройлеров сопровождается снижением концентрации гемоглобина и количества эритроцитов в крови, увеличением СОЭ.
В дальнейшем мы провели изучение изменения элементного статуса тела и красного костного мозга птицы в зависимости от уровня кормления. К концу эксперимента содержание мышьяка в теле птицы достоверно повышается во всех группах, причем максимально - в 6,7 раза - в третьей (р<0.001), а минимально - в 1,раза - в первой (р<0.05). Несколько иная картина наблюдается в красном костном мозге: у животных в третьей и первой опытных группах отмечается повышение этого элемента в 2,1 и 1,7 раза, а в контроле и второй - снижение - в 3,1 и 2,6 раза соответственно (р<0.01) (рис. 1).
Концентрация кобальта, за исключением контрольной группы снижалась на 8,7 % - в теле и на 6,0 % - в красном костном мозге в третьей группе; на 26,09 % и в 4,2 раза - во второй (р<0.001); на 34,8 % и в 4,7 раза - в первой группе (р<0.001). В теле и красном костном мозге птицы к концу эксперимента достоверно во всех группах снижалось содержание меди в 2,0 - 4,0 раза (р<0.001); железа - на 28,6 % - в 3,4 раза; лития - в 2,0 - 9,0 раза (р<0.001); марганца - в 1,8 - 3,0 раза (р<0.01); калия - в 1,5 - 4,0 раза; алюминия - на 10,5 % - до следов; кадмия - в 1,5 - 5,0 раза (р<0.01).
Сходные изменения нами выявлены у никеля и кремния: во всех группах происходило снижение их концентрации, а в третьей в красном костном мозге - повышение в 2,3 - 2,8 раза (р<0.001).
Количество цинка и свинца в красном костном мозге первой группы повышалось на 65,0 % - в 2,0 раза (р<0.001), также отмечалось повышение содержания цинка в теле на 2,5 %, а во всех остальных группах - достоверное снижение.
При снижении уровня обеспеченности организма питательными веществами происходят следующие изменения концентрации химических элементов в теле птицы:
Zn,Cr, Na,Cu, Mn,V, Ca, As,Co,Cd, Se, Ni, Hg, Pb, Sn, Mg, P Zn,Cr, Na, P, B, Fe, Pb и в красном костном мозге:
Ca, As,Co,Cd, Se,Cu, Ni, Sr По элементному статусу тела кур наши данные подтверждают исследования Лебедева С.В., Бирюкова А.А. (2007).
I опытная/контрольная группа 2500,% 2000,1500,1000,500,0,Cu Ca Sr Co Se Ni P Sn Li Mg Cd Al K Na B Mn Zn Fe Hg I Cr Si As V Pb элементы III опытная/контрольная группа 1800,% 1600,1400,1200,1000,800,600,400,200,0,Li Sr Ca Se Co B Mg P Na Al Sn I K Zn Cu Cr V Mn Hg Fe Cd Ni Pb As Si элементы Рисунок 1 - Разница по содержанию химических элементов в красном костном мозге кур опытных групп относительно контроля.
В дальнейшем нами оценена зависимость между содержанием химических элементов в теле, красном костном мозге и миэлограммой. В результате установлено, что на общую численность клеток красного костного мозга, на клетки грануляционной и эритроидной групп достоверно влияет, с обратной зависимостью, концентрация Pb в красном костном мозге; на клетки моноцитарной группы в большей степени - количество Zn в красном костном мозге и кадмия в теле (с обратной зависимостью); на клетки мегакариоцитарной группы (с прямой связью) - Zn в теле и обратной Cu и Co в теле и на клетки в стадиях митоза (с прямой) - Cr в теле; Cd в теле и Cu в красном костном мозге (с обратной) (р<0.05).
Полученные в ходе проведения эксперимента данные наилучшим образом подходят для применения статистических алгоритмов. Для установления влияния условий кормления на элементный статус красного костного мозга подопытных животных мы выбрали метод Краскела-Уоллиса, который служит для проверки гипотезы H0: k выборок объемом n1, n2, Е, nk получены из одной генеральной совокупности.
Подводя итог статистическому анализу мы делаем вывод об эффективности эксперимента, т.е. различные условия кормления птицы оказывают влияние на элементный состав красного костного мозга.
На основании вышеизложенного для дальнейшего изучения влияния химических элементов на гемопоэз животных мы выделили три: свинец, цинк и медь.
3.2 Влияние свинцовой интоксикации на гемопоэз птицы. Уже через 1 сутки после попадания в организм цыплят азотнокислого свинца с кормом в дозе 1,МДУ в клетках костного мозга выявлялись признаки дистрофических изменений.
Наиболее выраженные нарушения определялись в макрофагах. Их цитоплазма была неоднородной, с большим количеством различной электроноплотности, крупных и мелких включений, а иногда содержащей многочисленные светлые вакуоли (рис. 2).
Большинство органелл в цитоплазме макрофагов разрушалось, поэтому они не просматривались. Перинуклеарные пространства в клетках расширялись. Гетерохроматин в ядрах макрофагов большей частью подвергался деструкции, в кариоплазме он определялся в виде расплывчатых островков.
В отдельных эритробластах подвергались деструкции рибосомы и полирибосомы, единичные митохондрии, часто гомогенизировалась цитоплазма, перинуклеарные пространства были отечными.
Рисунок 2 - Вакуолизация цитоплазмы макрофага костного мозга цыпленка через сутки после введения в организм азотнокислого свинца. Электронограмма. Увел.Х10000.
В промоноцитах разрушались органеллы цитоплазмы, вследствие этого она вакуолизировалась или определялся выраженный отек перинуклеарного пространства, а органеллы сохранялись. В цитоплазме зрелых моноцитов находились короткие каналы ГЭР, округлые темные митохондрии, много рибосом и полирибосом, выявлялись маленькие округлые лизосомы, был хорошо выражен пластинчатый комплекс Гольджи. Большинство промиелоцитов сохраняли свою структуру. В отдельных промиелоцитах в цитоплазме проявлялись дистрофические явления в виде деструкции крист в митохондриях и расширения перинуклеарного пространства.
Из клеток лимфопоэза встречались лимфобласты в виде крупных мононуклеарных клеток (до 25 мкм в диаметре), имеющие большое округлое или овальное ядро с многочисленными зернами гетерохроматина по периферии, иногда с 1-2 ядрышками. Лимфоциты почти при полной сохранности ядра имели широкую цитоплазму с выраженными дистрофическими изменениями в виде деструкции внутриклеточных органелл, просветления и расширения участков цитоплазмы.
Редко встречающиеся в поле зрения молодые клетки-предшественники (бластные клетки) округлой или несколько овальной формы, с крупным ядром. Наряду с сохранностью органелл внутри ядра часто выявлялись изменения в виде УтаянияФ ядрышек хроматина и ослабления плотности кариоплазмы.
У некоторых бластных клеток в разной степени выраженности расширялись перинуклеарные пространства, начиная от слабой степени до сильной. Дистрофическим изменениям подвергались не только кроветворные, но и стромальные клетки костного мозга.
Через 3 суток после свинцовой интоксикации цыплят в большинстве кроветворных и стромальных клеток костного мозга, преимущественно в цитоплазме, обнаруживались уже выраженные деструктивные изменения. Органеллы полностью разрушались или вакуолизировались, и в цитоплазме вместо них часто встречались разного размера гетерогенные липидные включения. В это время нами определена компенсаторная активация эритропоэза в виде увеличения в поле зрения количества ретикулоцитов и базофильно-зернистых эритроцитов.
После трех суток свинцовой интоксикации цыплят при изучении препаратов костного мозга вне зависимости от того, к какому ряду относятся клетки, обращали на себя внимание одинаковые изменения структуры ядра.
Во-первых, выявлялись признаки, свидетельствующие о снижении транскрипции генов рибосомных РНК: ядерный хроматин плотно конденсировался по периферии кариолеммы или в кариоплазме, а ядрышки бледнели. Во-вторых, у многих клеток ядерный хроматин формировал довольно широкие плотные участки и создавалась видимость подготовки клетки к апоптозу (рис. 3). В отдельных участках определялись клетки с пикнотичным плотным темным ядром (рис. 4).
Рисунок 3 - Уплотнение хроматина по кариолемме и в кариоплазме клеток в костном мозге цыпленка через 3 суток после введения в организм азотнокислого свинца.
Электронограмма. Увел.Х10000.
Рисунок 4 - Кариопикноз в клетке костного мозга цыпленка через 3 суток после введения в организм азотнокислого свинца. Справа клетка с гетерохроматином в ядре и клетка с липидными включениями в цитоплазме.
Электронограмма. Увел.Х10000. Условные обозначения: 1 - пикноз ядра; 2 - гетерохро2 матин в ядре; 3 - липидные включения.
Нами установлено, что через сутки после попадания в организм свинца общая численность клеток в 1 мм3 красного костного мозга у цыплят оставалась на уровне контроля и составляла 2,800,080 млн., а начиная с пятых суток этот показатель постепенно начинает снижаться на 10,0 - 32,06 % (р<0.01).
Концентрация клеток миэлоидной группы на вторые и пятые сутки эксперимента превышала контрольные значения на 36,28 и 50,65 % соответственно (р<0.01).
Изменения со стороны клеток эритроидной группы носили следующий характер: на протяжении первых двух недель происходило постепенное снижение как абсолютной, так и относительной их численности и на 15-е сутки составляло 1,04 млн.
в 1 мм3, что соответствовало 67,65 % от контрольных значений (р<0.001). При изучении клеток лимфоидной группы нами было отмечено, что на всем протяжении эксперимента их численность была ниже, чем у животных, не подвергавшихся воздействию химических веществ. Так, уже через сутки после попадания солей свинца с кормом в организм мы выявили стойкое снижение численности клеток данной группы на 21,67 % (р<0.01) - 40,66 % (р<0.001) от фоновых значений. На последующих этапах эксперимента мы отмечали наступление процессов восстановления, и к 60-м суткам данный показатель был на уровне 85,15 % (р<0.01) от контрольных значений. Изменения численности клеток моноцитарной группы носили следующий характер: на вторые и пятые сутки их численность была ниже контрольных показателей на 26,43 и 27,12 % соответственно (р<0.01), в недельном возрасте их количество приближалось к фоновым значениям, а в последующем вновь происходило снижение, и к 60-м суткам составляло 0,140 млн. в 1 мм3 (70,20 %, р<0.01).
Колебания численности мегакариоцитарных клеток носили волнообразный характер: минимальные значения на вторые (50,0 %, р<0.01) и 45-е (47,92 %, р<0.01) сутки и максимальные - на 15-е (101,79 %) и 60-е (85,23 %, р<0.05).
Анализируя изменения со стороны периферической крови мы установили, что снижение численности эритроцитов начиналось с недельного возраста и было на уровне 80,0 %, (р<0.001) от контрольных значений, в дальнейшем отмечалось повышение их содержания в кровяном русле с достижением максимума на 45-е сутки (3,80,05 *1012/л, р<0.001). Сходные результаты были получены Н.В. Садовниковым, Е.А. Фесенко, Н.А. Кольберг (2010) при хронической затравке цыплят уксуснокислым свинцом. Со стороны гемоглобина отмечались несколько иные изменения: в первые семь дней исследования нами установлено стойкое его снижение до 55,10,56 г/л (р<0.001), через неделю данный показатель достигал своего максимума (р<0.001), а на протяжении остального периода находился на уровне контрольных значений. По нашему мнению, это связано со степенью насыщения эритроцитов гемоглобином.
Изучая изменения со стороны лейкоцитов, мы установили, что через сутки отмечалось резкое увеличение данного показателя в 2,0 раза (р<0.001) по сравнению с интактными животными, к пятым суткам происходит такое же резкое падение их количества в 2,6 раза (р<0.001), на таком уровне содержание лейкоцитов сохраняется до конца первого месяца, а в последние два срока (в 45 и 60 суток) повышается до исходных значений (р<0.001). В лейкоцитарной формуле нами выявлен яркий сдвиг ядра влево.
Таким образом, результаты исследования показали, что воздействие азотнокислого свинца на клетки костного мозга начинает проявляться даже при небольшом превышении МДУ уже через одни сутки интоксикации. В кроветворных и стромальных клетках костного мозга выявляются большей частью признаки дистрофических изменений, которые усиливаются по мере возрастания срока после воздействия азотнокислого свинца. В цитоплазме большинства клеток формируются гетерогенные липидные включения; по нашему мнению, они являются липидными продуктами деструкции клеточных мембран. При свинцовой интоксикации цыплят в костном мозге изменяется и структура клеточных ядер, выявляющиеся морфологические признаки свидетельствуют о снижении транскрибции генов рибосомных РНК и о подготовке многих клеток к процессу апоптоза. Соли свинца угнетают работу эритроидного и грануляционного ростков кроветворения.
3.3 Состояние гемопоэза птицы при воздействии различных доз хлорида цинка. Через 1 сутки после цинковой интоксикации цыплят даже в дозе 40 мг/кг в клетках костного мозга выявлялись признаки выраженных структурных изменений.
Стромальные ретикулярные клетки костного мозга подвергались дистрофическим изменениям. В цитоплазме определялись единичные набухшие митохондрии с разрушающимися кристами и мелко вакуолизированным митохондриальным матриксом, везикулы и пузырьки. В ядрах хроматин частично разрушался, хотя форма ядер не изменялась, оставаясь округлой или несколько удлиненной.
В макрофагах костного мозга цитоплазма была неоднородной, с большим количеством различной электроноплотности крупных и мелких округлых включений, многочисленных пузырьков. Большинство органелл в цитоплазме макрофагов не просматривалось. Перинуклеарные пространства в клетках были расширены. Гетерохроматин в ядрах макрофагов подвергался деградации, в кариоплазме он определялся в виде округлых и расплывчатых темных островков. У большинства макрофагов отростки цитоплазмы как таковые отсутствовали. Клетки принимали округлую форму, что свидетельствовало о снижении их функциональной активности. Цитоплазма перегружалась остаточными тельцами. Иногда в эритробластических островках среди эритробластов выявлялись макрофаги с опустошенной светлой цитоплазмой, содержащей единичные обрывки разрушившихся органелл.
В эритробластах и эритрокариоцитах подвергались деструкции рибосомы и полирибосомы, единичные митохондрии, часто гомогенизировалась цитоплазма.
Клетки были или вытянутой формы, или имели разнообразные очертания вместо округлой формы в норме. Во многих ядрах эритробластических клеток определялся в большом количестве гетерохроматин, который сильно уплотнялся по внутренней стороне кариолеммы. В отдельных эритрокариоцитах ядра уменьшались в размерах, уплотнялись и подвергались кариопикнозу. В костном мозге наблюдалось увеличение количества базофильных эритрокариоцитов, безъядерных ретикулоцитов и уменьшение гемоглобинизированных форм эритроцитов.
В промоноцитах частично сохранялись органеллы в цитоплазме, но в ядре хроматин несколько гомогенизировался, изменялась форма ядра, появлялись небольшие выпячивания кариолеммы в цитоплазму. В некоторых клетках моноцитоидного ряда разрушались органеллы в цитоплазме, вследствие этого она вакуолизировалась, или определялся выраженный отек перинуклеарного пространства, а часть органелл при этом сохранялась.
имфоциты почти при полной сохранности ядра имели широкую цитоплазму с выраженными дистрофическими изменениями в виде разрушения внутриклеточных органелл, просветления и расширения ее участков.
Через 3 суток после цинковой интоксикации цыплят в дозе 40 мг/кг деструктивные процессы в клетках костного мозга усиливались. Дистрофическим изменениям подвергались как кроветворные клетки, так и стромальные клетки костного мозга. Наиболее выраженные морфологические изменения клеток заключались в полной деструкции органелл, в формировании вместо них гетерогенных липидных включений, в выраженной вакуолизации цитоплазмы, в сильном расширении перинуклеарного пространства.
Эти изменения больше касались зрелых форм кроветворных клеток. Фигуры митоза не определялись. Встречались промоноциты с относительно нормальной ультраструктурой. В их цитоплазме определялись короткие каналы ГЭР, округлые темные митохондрии, много рибосом и полирибосом, различных пузырьков и везикул, выявлялись маленькие округлые лизосомы, был хорошо выражен пластинчатый комплекс Гольджи. Нужно отметить, что в большинстве клеток патологические изменения касались ядерного материала. Даже в клетках с сохранившейся структурой цитоплазмы часто исчезал гетерохроматин, менялось строение ядрышек, они принимали причудливые формы и иногда как бы растворялись в кариоплазме (рис. 5).
Рисунок 5 - Изменение структуры ядерного материала в клетках костного мозга цыпленка через 3 суток после цинковой интоксикации в дозе 40 мг/кг. Электронограмма. Увел.Х10000.
Изучая влияние хлорида цинка на клетки костного мозга беспородных мышей в аналогичных дозах, Т.М. Владимцева с соавт. (2002) выявили признаки развития апоптоза. Нами такие признаки у кур не установлены.
При повышении концентрации цинка через 1 сутки выявлялись дистрофические изменения клеток костного мозга: примерно такие же, как и в группе цыплят при интоксикации в дозе 40 мг/кг через сутки.
Через 3 суток после интоксикации в дозе 60 мг/кг массы деструктивные изменения кроветворных и стромальных клеток костного мозга усиливались. Органеллы часто полностью разрушались или вакуолизировались, и в цитоплазме вместо них определялись гетерогенные включения или вакуоли. Сходные данные получены на млекопитающих в дозе 40 мг/кг Т.М. Владимцевой (2003). В эритробластических клетках подвергались деструкции рибосомы и полирибосомы, митохондрии, гомогенизировалась цитоплазма, в ядрах разрушался хроматин, ядра часто деформировались. В поле зрения увеличивалось количество ретикулоцитов.
После трехсуточной цинковой интоксикации в большинстве клеток костного мозга вне зависимости от того, к какому ряду относятся, отмечались разного рода изменения структуры ядра: иногда это проявлялось в конденсации хроматина в ядре; иногда, наоборот, в разрушении хроматина и просветлении ядра, отделении нитчатого компонента ядрышка, разрушении ядрышек. В клетках нередко определялся кариопикноз - сморщивание ядра (рис. 6).
К пятым суткам у животных первой опытной группы было максимальное содержание общего количества клеток красного костного мозга на 46,36 % выше фоновых значений (р<0.001); в дальнейшем происходило снижение данного показателя до 45-ти суток на 56,67 % (р<0.001), а к концу исследования отмечалось повышение его до контрольных значений. Во второй опытной группе общее содержание клеток достигало максимума на седьмые сутки, что на 5,26 % превосходит показатель у интактной птицы; к концу 45-х суток мы выявили резкое их снижение в 2,0 раза (р<0.001), а к концу второго месяца данный показатель находится на уровне 59,65 % от контроля (р<0.01).
Рисунок 6 - Кариопикноз в клетке костного мозга цыпленка через 3 суток после цинковой интоксикации в дозе 60 мг/кг.
Электронограмма. Увел.Х10000.
Если говорить об изменении клеточного состава различных ростков кроветворения, то картина выглядит следующим образом: в первой опытной группе через сутки после воздействия концентрация всех клеток в костно-мозговом пунктате находилось на уровне фоновых значений, во второй - резкое снижение численности клеток лимфоидной (в 14,2 раза, р<0.001) и ретикуло-эндотелиальной (в 9,3 раза, р<0.001) групп; повышение отмечалолсь только у клеток грануляционной группы (на 21,25 %, р<0.01), все остальные клетки находились на уровне ниже контрольных значений на 15,93 - 55,40 % (р<0.05).
В дальнейшем происходят следующие изменения в численности клеток различных групп: концентрация клеток грануляционной группы в обеих опытных группах изменяется таким же образом, что и общая численность клеток; содержание эритроидных клеток в первой группе изменяется волнообразно с максимальным пиком на седьмые сутки (на 56,62 % выше фоновых значений, р<0.001) и минимальным - на 45-е (28,54 %, р<0.01); во второй группе на протяжении всего эксперимента - ниже значений у интактных животных и к 60-м суткам составляет 1,1690,00млн. в 1 мм3, что на 43,48 % ниже контрольных показателей (р<0.001).
Абсолютное содержание клеток лимфоидной группы как в первой, так и во второй опытной группах было ниже значений, чем у интактной птицы на протяжении всего исследования, а к его концу в первой группе составляло 59,21 %, а во второй - 31,40 % от контрольных животных (р<0.001).
В первую неделю жизни цыплят численность клеток моноцитарной группы повышалась в первой группе до 0,1510,0018 млн./мм3, а во второй до 0,1210,00млн./мм3 (р<0.001), к 15-м суткам отмечалось их резкое снижение до 0,0470,0005 и 0,0450,0007 млн./мм3 соответственно (р<0.001), а к 60-м суткам происходило восстановление их количества, однако данные величины не достигали исходных значений.
Через сутки после воздействия на организм хлорида цинка у животных как первой, так и второй опытных групп основные показатели периферической крови остаются на уровне фоновых значений. В последующую неделю мы выявили возрастание содержания эритроцитов и гемоглобина в обеих группах и лейкоцитов - во второй (р<0.001); до 15-ти суток увеличивается число тромбоцитов и превосходит контрольные значения на 19,11 % (р<0.01). К концу исследования концентрация эритроцитов находится ниже значений у интактной птицы в первой опытной группе на 14,29 % (р<0.05), на 28,57 % - во второй (р<0.01); содержание гемоглобина приближается к исходным значениям; тромбоцитов - в первой опытной группе на уровне контроля, во второй опытной - на 26,65 % ниже (р<0.01); лейкоцитов ниже на 17,41 % в первой опытной группе (р<0.01) и на 34,30 % - во второй (р<0.001).
Со стороны лейкоцитарной формулы при увеличении дозы мы выявили следующие изменения: отмечено достоверное снижение концентрации эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов и увеличение - палочкоядерных и сегментоядерных псевдоэозинофилов.
Таким образом, результаты исследования показали, цинковое отравление цыплят даже в течение 1 - 3 суток ведет к повреждению клеток костного мозга. В цитоплазме кроветворных и стромальных клетках костного мозга выявляются большей частью признаки деструктивных процессов, которые усиливаются по мере возрастания срока и дозы воздействия. При этом в костном мозге часто изменяется структура клеточных ядер. Выявляющиеся морфологические признаки свидетельствуют о снижении транскрипции генов рибосомных РНК клеток костного мозга. В костном мозге увеличивается число базофильных эритрокариоцитов и уменьшается количество гемоглобинизированных форм эритроцитов. Цинк большей частью вызывает нарушения морфо-функциональных структур в эритробластах и зрелых клетках других линий клеток костного мозга. При увеличении дозы хлорида цинка нами установлены более глубокие изменения в красном костном мозге и периферической крови у птицы. Хлорид цинка оказывает влияние на клетки моноцитарной и мегакариоцитарной групп.
3.4 Особенности костномозгового кроветворения, периферической крови и элементного статуса красного костного мозга цыплят при введении в организм нанопорошка меди. Проводя анализ миелограммы птицы при различных способах введения в организм наночастиц меди и разной дозировки, мы установили, что к концу эксперимента общая численность клеток красного костного мозга во всех группах была ниже контрольных значений: в III группе - на 12,54 % (р<0.05), в IV - на 26,32 % (р<0.001), в V - на 14,75 % (р<0.05), исключение составляют животные II группы у которых данный показатель был выше на 45,51 % (р<0.001) (табл 6).
Таблица 6 - Миэлограмма цыплят-бройлеров при введении в организм наночастиц меди, (ХSх), млн./1 ммКлетки Группы I (контроль) II III IV V Общая численность клеток 2.860.23 3.900.34*** 2.360.19* 2.060.12*** 2.310.15* Гранулоцитарной группы 0.710.04 1.030.06*** 0.680.02* 0.620.03** 0.690.04** Эритроидной группы 1.650.09 2.500.11*** 1.350.06* 1.110.05** 1.220.04** Лимфоидной группы 0.100.01 0.070.01** 0.100.02 0.060.01** 0.150.02*** Моноцитарной группы 0.100.01 0.120.01** 0.100.01 0.080.00* 0.100.01** Мегакариоцитарной группы 10-3 10.80.3,4 47.040.6,5*** 11.70.2,9* 19.00.2,3* 11.50.1,4* Гистиоцитарные 10-3 18.020.1,6 31.40.3,8*** 17.00.3,4 18.00.3,6 11.50.2,Плазматические 10-3 26.90.8,4 5.90.4,7** 21.00.4,2 4.00.3,1** 6.90.2,8** Ретикуло-эндотелиальные 10-3 21.520.4,9 31,40.4,1*** 23.50.3,7 24.00.4,3 25.30.4,8*** В стадиях митоза 10-3 45.70.3,8 58.80.6,3*** 51.00.7,3 48.00.6,4 78.20.8,1*** Примечание: * р<0.05; ** р<0.01; ***- р<0.001 по t-критерию при сравнении с контролем.
При рассмотрении отдельных ростков кроветворения мы выявили, что аналогичная тенденция наблюдается у клеток грануляционной и эритроидной групп. Так, в III группе на 4,57 и 18,14 % (р<0.05); в IV - на 12,71 и 32,95 % (р<0.01); в V - на 3,49 и 26,24 % (р<0.01), а во II - на 44,13 и 51,56 % (р<0.001) выше, чем в контрольной группе.
Численность лимфоидных клеток во II и IV группах была ниже контрольных значений на 16,29 и 37,88 % (р<0.01), в V - выше на 45,11 % (р<0.001), а в III находилась на уровне с животными, не подвергавшимися воздействию наночастиц меди.
Во II группе отмечено повышение содержания моноцитарных клеток на 23,% (р<0.01), а в IV группе - снижение на 16,94 % (р<0.05).
Численность клеток магакариоцитарного ростка кроветворения во всех группах была выше, чем в контрольной в 4,37 раза (р<0.001); на 8,74 %; 11,52 % (р<0.05) и на 6,88 % соответственно.
Абсолютное содержание клеток на различных стадиях митоза в опытных группах было выше фоновых значений. Так, во II группе - на 28,58 % (р<0.001); в III - на 11,52 %; в IV - на 4, 96 %; в V-й - на 71,01 % (р<0.001) соответственно.
Со стороны периферической крови отмечены следующие изменения: содержание гемоглобина, за исключением животных III группы (на 3,2 % ниже) к концу эксперимента было достоверно выше контрольных значений на 18,63% - вo II группе (р<0.01); на 28,6 % - в IV (р<0.001); на 15,8 % - в V (р<0.01). Концентрация эритроцитов во всех группах была выше фоновых значений на 24,6 % (р<0.001); 3,4 %;
26,2 % (р<0.001) и 14,8 % (р<0.01); лейкоцитов - на уровне контрольных значений.
Скорость оседания эритроцитов во всех группах увеличивалась в 2,4; 4,0; 2,0 и 1,раза (р<0.001).
Численность палочкоядерных псевдоэозинофилов в V группе было в 2 раза меньше (р<0.001), в остальных группах их концентрация сохранялась на том же уровне, сегментоядерных псевдоэозинофилов было выше на 22,78 % (р<0.001); 8,%; 25,61 % (р<0.001) и 19, 74 % (р<0.01) соответственно.
Содержание же лимфоцитов и моноцитов было ниже, чем в контрольной группе: во II группе на 33,33 % и 44,2 % (р<0.001), в III - на 6,8 % и в 2,17 раза (р<0.001), в IV - на 41,8 % и в 2,40 раза (р<0.001), в V - на 13,9 % (р<0.05) и в 3,раза (р<0.001).
Исходя из изложенного выше, мы делаем вывод, что различные дозировки и способы введения наночастиц меди неоднозначно влияют на костномозговое кроветворение птицы. При использовании дозы меди 1,7 мг/кг корма, что соответствует 50 % суточной потребности организма, активизируется кроветворная функция красного костного мозга, в частности гарнулоцито-, мегакариоцито- и эритропоэз. Исследования Е.А. Сизовой (2010), доказали стимулирующее действие наночастиц меди в той же дозировке на клетки печени цыплят.
3.5 Состояние костномозгового кроветворения и периферической крови цыплят при воздействии физических факторов (облучение гамма-лучами). В костном мозге цыплят морфологические изменения были выявлены уже вскоре после действия радиации даже при относительно небольших дозах облучения. Причем при облучении в дозе 0,5 Гр изменения были несколько неоднозначными, наряду с морфологическими признаками деструктивного характера в отдельных клетках выявлялись и признаки, свидетельствующие о стимуляции процессов белкового синтеза. Особенно это было выражено в костном мозге птиц, облученных при дозе 0,5 Гр через 3 и 6 часов. В этих группах морфологическая картина костного мозга была примерно одинаковой. В цитоплазме клеток с мелкоячеистой структурой определялись пучки микрофиламентов, множество канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума и большое количество рибосом и полирибосом, свидетельствующих об интенсивном внутриклеточном синтезе белка. При облучении цыплят в дозе 0,5 Гр не выявлено существенных изменений со стороны параметров, характеризующих эритроцитарный росток кроветворения.
У молодых бластных клеточных форм обнаруживались изменения как в ядре, так и в цитоплазме. Менялась форма ядрышек, иногда они уплотнялись, а иногда присутствовали в виде причудливых извитых фигур; увеличивалась площадь поверхности ядра; расширялось перинуклеарное пространство. В цитоплазме появлялись отдельные включения, разрушались митохондрии с деструкцией крист и последующей вакуолизацией. Нужно отметить, что рибосомы и полирибосомы продолжали выявляться в цитоплазме бластных клеток в значительном количестве. В промиелоцитах изменению подвергались митохондрии. В них разрушались кристы и наружные мембраны, митохондрии как бы расплавлялись, и вместо них появлялись вакуоли.
Через сутки деструктивные процессы в клетках нарастали. В большей части исследуемого костного мозга обнаруживались такие патологические изменения, как отек клеток в виде сильного расширения перинуклеарного пространства и вакуолизации цитоплазмы, опустошения цитоплазмы, разрушения хроматина в ядре (рис. 7).
В исследованном участке костного мозга фигур митоза клеток не обнаруживалось.
Рисунок 7 - Расширение перинуклеарного пространства (1), вакуолизация цитоплазмы (2), разрушение хроматина в ядрах (3) клеток костного мозга цыпленка через 24 часа после облучения в дозе 0,5 Гр. Электронограмма. Увел.Х72При повышении дозы облучения птиц до 1,0 Гр через 3 часа деструктивные процессы клеток костного мозга были более выраженными, чем в предыдущей опытной группе. Здесь поражались и более зрелые кроветворные клетки, в том числе и клетки эритроидного ряда. В ретикулярных стромальных клетках цитоплазма была светлой, в ней определялись единичные митохондрии, редкие короткие каналы ГЭР, небольшое количество рибосом и полирибосом, отдельные светлые вакуоли.
Ядра просветлялись и иногда содержали несколько удлиненные слабо выраженные фигуры ядрышек.
В молодых клетках эритроидного ряда кариоплазма становилась более светлой, редкие митохондрии в цитоплазме разрушались, но продолжали выявляться рибосомы и полисомы. Перинуклеарные пространства в данных клетках часто были расширены. В цитоплазме ретикулярных клеток, вокруг которых они формировали эритробластические островки, обнаруживалось большое количество крупных фагосом. В бластных клетках менялась форма ядра и ядрышек, последние принимали форму извитых удлиненных фигур.
Через 6 часов после облучения цыплят в дозе 1,0 Гр морфологическая картина оставалась примерно такой же, а через 24 часа она уже менялась, почти все клетки костного мозга подвергались серьезным разрушениям. В стромальных ретикулярных клетках вакуолизировалась цитоплазма, подвергались дезорганизации клеточные органеллы и внутриядерные элементы.
В эритробластах просветлялись кариоплазма и цитоплазма, так как рибосомы и другие органеллы подвергались деструкции, одновременно расширялись перинуклеарные пространства клеток (рис. 8). В гранулоцитах разрушались базофильные гранулы. Клетки миелоидного ряда плохо дифференцировались, так как органеллы в цитоплазме исчезали, кариоплазма просветлялась, в ней иногда выявлялись расплывчатые очертания ядрышка. Морфологические признаки интенсивного деления кроветворных клеток в костном мозге не обнаруживались.
Рисунок 8 - Просветление кариоплазмы (1) и цитоплазмы (2), расширение перинуклеарного пространства (3) эритробластов в костном мозге цыпленка через 24 часа после облучения в дозе 1,0 Гр. Электронограмма. Увел.Х10000.
В группе птиц, облученных в дозе 6,0 Гр, через 1 час и через 3 часа морфологические изменения клеток костного мозга в степени выраженности широко варьировали, но местами были выражены гораздо меньше, чем в предыдущей опытной группе при облучении в дозе 1,0 Гр через 24 часа. В некоторых гемопоэтических клетках наблюдались как признаки повреждения, так и компенсации, направленные на восстановление интрацеллюлярных элементов и поддержание целостности всей клетки. В таких клетках повреждения были не столь значительны. Так наиболее распространенными признаками являлись: набухание митохондрий и частичная дезорганизация в них крист, расширение перинуклеарного пространства. Реакции компенсации характеризовались повышением активности клеточного ядра, усилением внутриядерного синтеза белка, увеличением площади поверхности ядерных мембран и плазмалеммы клеток.
Молодые клетки-предшественники (бластные клетки) костного мозга цыплят в данной опытной группе были представлены как крупными клетками, от 20 до мкм в диаметре, так и меньшего размера, от 8-10 до 15-20 мкм. Несмотря на сохранность большинства внутриклеточных органелл, внутри ядра часто выявлялись изменения в виде исчезновения периферического гетерохроматина и ослабления плотности и распыления ядрышек, а в цитоплазме таких клеток уже выявлялись признаки уменьшения количества рибосом и полирибосом. То есть налицо были все признаки снижения белкового синтеза.
У многих бластных клеток в разной степени выраженности расширялись перинуклеарные пространства, начиная от слабой степени до сильной. У отдельных клеток при полном просветлении кариоплазмы сильно вакуолизировалась цитоплазма. Определялись также признаки апоптоза бластных клеток в виде специфических плотных фигур (рис. 9). Ю.Е. Квачева, П.А. Власов (1997) доказали, что ранний некробиоз миелокариоцитов крыс при их облучении в дозе 9,0 Гр (ЛД 100/30) осуществляется путем апоптоза.
Рисунок 9 - Признаки апоптоза бластной клетки в виде специфических плотных фигур в костном мозге цыпленка через 3 часа после облучения в дозе 6,0 Гр. Электронограмма.
Увел.Х14000.
Что касается клеток моноцитоидного ряда костного мозга цыплят при облучении в дозе 6,0 Гр через 1 и 3 часа, то в промоноцитах внутриклеточные деструктивные процессы были разной степени выраженности: от слабо проявляющихся до средней степени и очень выраженные в виде полного просветления ядра и цитоплазмы из-за разрушения хроматина в ядре и органелл в цитоплазме. В клетках исчезали кристы в митохондриях, вакуолизировались каналы ГЭР и цистерны пластинчатого комплекса Гольджи, значительно уменьшалось количество рибосом и полисом в цитоплазме. Гетерохроматин в ядрах этих клеток сохранялся частично.
Отдельные промиелоциты сохраняли свою структуру.
Из клеток лимфопоэза изредка встречались сохранившиеся лимфобласты в виде крупных мононуклеарных клеток, до 25 мкм в диаметре, имеющие большое округлое или овальное ядро с многочисленными зернами гетерохроматина по периферии и 1-3 выраженных ядрышка. Цитоплазма содержала несколько сферических митохондрий, слабо развитый КГ, несколько коротких цистерн ГЭР и большое количество РНК в виде скоплений свободных рибосом и полирибосом. Лимфоциты часто почти при полной сохранности ядра имели цитоплазму с выраженными дистрофическими изменениями в виде деструкции внутриклеточных органелл, просветления и расширения цитоплазмы. Встречались также лимфоциты с признаками апоптоза в виде выраженной конденсации хроматина и фрагментации ядра, сильного уплотнения цитоплазмы (рис. 10). Одновременно в таких клетках обнаруживались и признаки деструкции митохондрий, цистерн ГЭР, других органелл. Рядом присутствовали плазматические клетки с развитыми каналами ГЭР и тучные клетки с типичными гранулами в цитоплазме. Изредка встречались макрофаги с признаками ослабления функциональной активности в виде накопления в цитоплазме крупных непереваривающихся остаточных телец.
Сохранившиеся эритробластические островки состояли из эритробластов с расширенными перинуклеарными пространствами и разрушенными внутриклеточными органеллами. Изредка выявлялся проэритробласт с большими вакуолями в цитоплазме, вероятно, возникшими на месте разрушенных митохондрий и цистерн ГЭР. В светлой его кариоплазме хорошо просматривалось просветленное ядрышко в виде мозаичной фигуры. В отдельно лежащих от ретикулярных клеток полихроматофильных эритробластах частично разрушался ядерный гетерохроматин, расширялось перинуклеарное пространство, вакуолизировались редкие митохондрии и каналы ГЭР (рис. 11).
Рисунок 10 - Признаки апоптоза лимфоцита в костном мозге цыпленка через 3 часа после облучения в дозе 6,0 Гр. Электронограмма. Увел.Х10000.
Рисунок 11 - Разрушение ядерного гетерохроматина, расширение перинуклеарного пространства, вакуолизация митохондрий и каналов ГЭР в полихроматофильном эритробласте костного мозга цыпленка через часа после облучения в дозе 6,0 Гр. Электронограмма. Увел.Х7200.
Эритробластические островки как таковые разрушались, лишь иногда около вакуолизированных и разрушенных клеток встречались отдельные уцелевшие полихроматофильные или базофильные эритробласты с расширенными перинуклеарными пространствами. Иногда выявлялись молодые бластные клетки костного мозга с признаками отека, выражающимися в виде расширения перинуклеарного пространства, вакуолизации митохондрий, со значительным уменьшением количества рибосом и полирибосом в цитоплазме.
Через 24 часа после воздействия радиации на цыплят в дозе 6,0 Гр деструктивные процессы в костном мозге настолько возрастали, что большинство рядом лежащих клеток переставали отличаться друг от друга.
Нами было установлено, что через сутки после облучения цыплят -лучами в дозе 0,5 Гр отмечалось увеличение общего числа клеток костного мозга на 34,3 % по сравнению с контролем. В дальнейшем происходило увеличение данного показателя до конца первого месяца жизни, и на 30-е сутки составляло 3,900,037 млн. / мм3, что на 45,7 % выше контрольных значений (р<0.05). При характеристике ростков костномозгового кроветворения мы выяснили, что на протяжении первого месяца жизни отмечается достоверное увеличение численности клеток миэлоидной группы.
Рассматривая закономерности изменения клеток эритроидной группы мы установили, что через сутки их численность превышала контрольные значения на 31,% (р<0.001) и составляла 2,17 млн. / мм3; к пятому дню эта разница была 22,2 % (р<0.01), на 45-е и 60-е сутки их количество составляет соответственно 143,5 и 122,% от фоновых показателей (р<0.01). Процентное содержание клеток лимфоидного ряда у облученных цыплят через сутки было всего лишь на уровне 15,8 % от контрольных; к пяти суткам их численность возрастала и максимально приближалась к показателям необлученной птицы. В последующем отмечалось снижение количества данных клеток до одного месяца (0,07 млн. / мм3, р<0.01; 44,6 % от контроля), после чего на 45-е и 60-е сутки происходит повышение содержания клеток лимфоидной группы в костномозговом пунктате 57,1 % (р<0.05) и в 2,0 раза, соответственно.
Через сутки после облучения у цыплят отмечалась, на 7,9 % ниже контроля концентрация моноцитарных клеток, но уже на пятые сутки данный показатель вырос на 34,5 %; до 15-го дня никаких изменений нами не наблюдалось, а с 45-го происходит возрастание их численности, хотя превышение фоновых значений не было. Во все возрастные периоды исследования абсолютная численность клеток мегакариоцитарной группы у опытных животных была значительно выше контрольных показателей и лишь к концу второго месяца приблизилась к таковым. Аналогичные изменения наблюдались и при изучении концентрации гистиоцитарных и ретикулоэндотелиальных клеток.
Что же касается клеток на различных стадиях митоза, то на вторые и пятые сутки жизни цыплят отмечалось превышение этого показателя по сравнению с интактной птицей в 2,0 раза (р<0.001); на седьмые сутки - на 67,3 %, а на 15-е и 30-е сутки происходило его снижение на 16,0 и 14,6 %; далее происходит рост численности данных клеток на 77,3 % (р<0.001), и к концу эксперимента - вновь снижение до контрольного уровня.
Со стороны периферической крови у облученных в суточном возрасте лучами в дозе 0,5 Гр цыплят отмечалось в течение первых 15-ти дней несколько пониженное, по сравнению с контролем, содержание эритроцитов и гемоглобина. К 30-му дню имеющаяся разница сглаживалась, а в возрасте 60-ти суток общее количество эритроцитов у облученных цыплят было выше, чем у необлученных (р<0.01).
Изучая изменение численности лейкоцитов в крови птицы мы установили, что через сутки после облучения отмечается резкое увеличение данного показателя в 2,раза (р<0.001) по сравнению с необлученными цыплятами. К концу пятого дня произошло такое же резкое падение их количества до контрольных значений (р<0.001).
До 15-го дня мы отмечали рост концентрации лейкоцитов на 27,8 % (р<0.01), что составляло 52,3 % (р<0.001) от контрольной величины. В дальнейшем, мы наблюдали постепенное возрастание этого показателя, который достигал уровня контроля к 45-м суткам.
Нами были установлены следующие изменения в составе лейкоцитарной формулы: со стороны псевдоэозинофилов отмечен небольшой сдвиг ядра влево. Это подтверждается увеличением численности более молодых (юных) клеток: от 33,3 % через сутки после облучения (р<0.001) до 7,0 раз - на 45-е сутки (р<0.001) - и снижением количества более зрелых (сегментоядерных) - через сутки - на 44,4 % (р<0.001), через неделю - на 30,5 % (р<0.001), через месяц - на 41,5 % (р<0.001), по сравнению с контролем, восстанавливаясь к концу эксперимента.
После облучения суточных цыплят -лучами в дозе 1,0 Гр отмечались следующие изменения: регистрировалось стойкое снижение общего числа клеток красного костного мозга. Так, через сутки их численность снизилась на 10,7 %; на пятые сутки - на 21,4 %; к седьмым суткам - на 25,5 %; к 15-м - на 32,1 %, и минимальное значение данного показателя отмечалось к концу первого месяца жизни и составляло 55,3 % от контрольных значений (р<0.001).
При рассмотрении отдельных ростков кроветворения мы выявили следующие изменения: через сутки после облучения численность клеток миэлоидной группы была на 21,2 % выше контрольных значений (р<0.001), после чего, вплоть до конца первого месяца жизни процент клеток данной группы снижался и через 30 суток составил 59,4 % от контрольных значений (р<0.001), причем отмечался явный сдвиг ядра влево, т.е. в сторону незрелых бластных форм (р<0.001).
На протяжении всего эксперимента численность клеток эритроидной группы находилась ниже контрольных показателей. Содержание клеток лимфоидной группы через сутки у облученных цыплят в дозе 1,0 Гр было на уровне 6,99 % от фоновых значений; к пяти суткам этот показатель возрастает в 7,5 раза (р<0.001), на протяжении следующих 10-ти суток продолжается повышение уровня клеток данной группы и к 15-ти суткам составляет 58,5 % от контроля. В дальнейшем, регистрируется резкое снижение их численности в 1,5 раза (р<0.001). На вторые сутки после облучения концентрация клеток моноцитарной группы составляла 65,64 % от контрольных показателей; к пятым суткам она была на уровне таковых у необлученной птицы, а в дальнейшем начинала снижаться и к месячному возрасту составляла 38,27 % от исходной величины (р<0.001). По нашему мнению, это связано с трудностью дифференцировки клеток из-за исчезновения органелл в цитоплазме и просветлении кариоплазмы. После этого нами был отмечен незначительный рост количества моноцитов, к концу эксперимента их численность составляла 51,86 % от показателя у интактных животных.
Иная картина наблюдалась при изучении клеток мегакариоцитарной группы:
сразу после облучения нами установлено, что их численность резко снижается (44,61 % от контроля); на пятые сутки происходит резкое увеличение концентрации клеток в 1,96 раза (р<0.001), после чего происходит их постепенное снижение и к концу второго месяца исследования данный показатель составляет 40,84 % от контрольных значений (р<0.001). Аналогичная картина нами отмечена при изучении гистиоцитарных клеток и к 60-му дню численность составляла 65,34 % от значений у интактных животных (р<0.001).
Мы установили, что при облучении цыплят в дозе 1,0 Гр численность клеток в стадиях митоза была ниже контрольных значений практически на протяжении всего исследования. Этот факт подтверждается результатами электронной микроскопии, не выявившей морфологические признаки интенсивного деления кроветворных клеток в костном мозге.
При характеристике показателей периферической крови мы установили, что снижение концентрации эритроцитов у облученных в суточном возрасте цыплят дозой 1,0 Гр происходило уже на пятые сутки и составляет 83,3 % от фоновых значений (р<0.01), после чего, начиная с недельного возраста, их численность начинает возрастать сохраняя такую тенденция до конца исследования.
В тесной взаимосвязи с численностью эритроцитов находится и концентрация гемоглобина, изменения которой носят идентичный характер.
Численность лейкоцитов у птицы до месячного возраста находится ниже контрольных значений на 21,9 - 61,6 % (р<0.001), а на 45-е сутки приходит к значению исходных показателей.
При анализе изменений со стороны лейкоцитарной формулы нами выявлено резкое снижение концентрации сегментоядерных псевдоэозинофилов на 20,0 - 45,% (р<0.001). Численность лимфоцитов в кровяном русле наоборот повышалось на 15,3 - 21,9 % (р<0.01). По нашему мнению, данный факт говорит о срабатывании защитных механизмов. Процентное содержание моноцитов колебалось в тех же пределах, что и у здоровых животных.
При характеристике костно-мозгового кроветворения мы определили, что после облучения цыплят в дозе 6,0 Гр отмечалось стойкое снижение общего количества клеток, так через сутки в 1 мм3 пунктата содержалось всего 74,35 % клеток от контрольных показателей (2,00х106 против 2,40х106) (р<0.01); на пятые сутки количество клеток составляло 63,67 %; на седьмые - 60,90 %; на 15-е - 57,14 %; через месяц - 48,45 %; на 45-е сутки - 44,00 %; на 60-е - 39,77 % (р<0.001).
Характеризуя различные ростки кроветворения мы выявили, что численность клеток миэлоидной группы на протяжении всего эксперимента неуклонно снижалась и к концу второго месяца составляла 49,69 % от фоновых значений (р<0.001).
Что же касается клеток эритроидной группы, то уже на вторые сутки после воздействия -излучения их численность составляла 60,08 % от контроля (р<0.001), в последующем данный показатель снижался к 30-м суток (33,04 % от такового у необлученной птицы) (р<0.001). В 45 и 60 суток численность клеток постепенно начинала возрастать и к концу эксперимента составляет 40,07 % от контрольных показателей (р<0.001).
Содержание клеток лимфоидной группы сразу после облучения резко снижалось и на вторые сутки составляло только 2,91 % от контрольных значений (р<0.001). После этого численность данных клеток постепенно начинает возрастать, достигая своего максимума к 15-м суткам - 0,032 млн. / 1 мм3 (29,84 % от фоновых значений, р<0.001). После этого происходило вновь снижение данного показателя до 20,93 % к концу второго месяца.
После облучения в дозе 6,0 Гр в группе опытных животных к пятым суткам происходило резкое увеличение численности клеток моноциатрного ряда до 0,12млн. / 1 мм3, что на 37,67 % выше, чем у животных в контрольной группе (р<0.01).
После чего нами установлено плавное снижение данного показателя до конца эксперимента, когда он составил 0,049 млн. / 1 мм3, что соответствует 24,55 % от фоновых показателей (р<0.001).
По нашему мнению, это происходит из-за нарастающих дистрофических изменений в клетках данной группы.
Аналогичная картина в начале эксперимента нами отмечалась и при исследовании клеток магакариоцитарной группы (р<0.001). Далее, до месячного возраста, происходит резкое снижение их численности до 0,0039 млн. / 1 мм3 костномозгового пунктата, что в 5,54 раза меньше контрольных значений (р<0.001). В последние два срока исследования (на 45-е и 60-е сутки) отмечено возрастание этой величины на 0,0027 млн. и 0,0032 млн. / 1 мм3 соответственно (р<0.01).
Количество клеток гистиоцитарного ряда на протяжении всего исследования снижалось с минимальными значениями на 45-е и 60-е сутки (р<0.001).
На всем протяжении исследования численность клеток в стадиях митоза была ниже уровня необлученных животных с минимальным содержанием на вторые и 60е сутки (25,80 и 35,35 % от исходных значений) (р<0.001).
Изучая изменения со стороны периферической крови, мы установили, что колебания численности эритроцитов и гемоглобина носили аналогичый характер, что и у животных контрольной группы, но их значения были на 10 - 15 % ниже (р<0.001).
Более глубокие изменения нами выявлены со стороны лейкоцитов: так, уже через сутки после облучения их количество составляло всего лишь 64,63 % от таковых у интактной птицы (р<0.001); на пятые - 56,30 % (р<0.001); на 15-е сутки - 42,81 % (р<0.001), после чего их концентрация в кровяном русле начинала постепенно восстанавливаться, достигая к концу второго месяца уровня контроля.
Если говорить о лейкоформуле, то яркие изменения были нами отмечены в численности лимфоцитов. Через сутки после облучения их содержание было в 3,раза ниже фоновых значений (р<0.001); на пятые сутки - в 1,4 раза (р<0.05). На седьмые и последующие сутки эксперимента нами отмечено превышение относительно контроля данного показателя на 21,64 % (р<0.01); на 63,27 % - в 15 суток (р<0.001); на 60,29 % - в 30 суток (р<0.001), и на последних двух этапах (в 45 и суток) численность лимфоцитов приближалась к фоновым значениям. Сходные результаты о состояние кроветворения при острой лучевой болезни получены Г.Д.
Байсоголов (2000), изучая людей, подвергшихся однократному облучению в дозах 30 - 600 Р.
На начальном этапе исследования нами выявлено увеличение количества псевдоэозинофилов на вторые и пятые сутки в 2,00 раза (р<0.001), после чего их содержание в периферической крови начинает снижаться, достигая своего минимума к 60-му дню (72,59 % от контрольных значений, р<0.01).
Для решения задачи классификации особей по воздействию экологическинеблагоприятных факторов окружающей среды (физические факторы) на костномозговое кроветворение животных, по нашему мнению, наилучшим образом подойдет дискриминантный анализ.
В результате мы получаем следующие функции, с помощью которых представляется возможным отнесение новых объектов к одной из четырех групп.
GROUP1 = 55,60 X1 - 117,88 X7 + 56,98 X9 + 49,59 X10 - 2366,GROUP2= 81,37 X1 - 97,31 X7 + 52,91 X9 + 45,99 X10 - 2131,GROUP3= 90,67 X1 - 111,99 X7 + 54,67 X9 + 49,57 X10 - 2429,GROUP4= 40,28 X1 - 107,95 X7 + 52,92 X9 + 49,36 X10 - 2216,61, где X7 - псевдоэозинофилы юные, % X1 - эритроциты (1012/л) X9 - псевдоэозинофилы сегментоядерные, % X10 - лимфоциты, % GROUP1 - контрольная группа. Животные без облучения.
GROUP2 - II группа характеризуется облучением птицы -лучами в дозе 0,Гр, источник Со-60.
GROUP3 - III группа характеризуется облучением птицы -лучами в дозе 1,Гр, источник Со-60.
GROUP4 - IV группа характеризуется облучением птицы -лучами в дозе 6,Гр, источник Со-60.
Таким образом, ультраструктурные изменения клеток стромы костного мозга и кроветворных клеток выявляются вскоре после действия радиации уже при наименьшей дозе облучения (0,5 Гр). При облучении в дозе 0,5 Гр через 3 и 6 часов наряду с признаками дистрофического характера в клетках определяются признаки компенсаторно-приспособительного характера в виде увеличения ядрышек, количества рибосом и полирибосом, цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, свидетельствующие о стимуляции белоксинтетических процессов. Наиболее чувствительными к облучению являются клетки стволового пула, число их резко снижается уже после облучения цыплят в дозе 0,5 Гр и 1,0 Гр. Фигуры митоза встречаются редко, то есть обнаруживается приостановка клеточного деления (блок митозов). Интенсивность усиления деструктивных процессов клеток костного мозга после облучения в дозах до 6,0 Гр зависит не сколько от увеличения дозы радиации, а сколько от времени, прошедшего после облучения. Процессы деструкции нарастают прямо пропорционально количеству часов, прошедших после облучения. Вероятнее всего, что это происходит под влиянием накопления продуктов перекисного окисления, образующихся после облучения, в результате чего начальный радиационный эффект со временем усиливается.
ВЫВОДЫ 1. Выявлено влияние уровня нутриентной обеспеченности по химическим элементам на костномозговое кроветворение. Дефицит химических элементов приводит к снижению общей численности клеток красного костного мозга в период интенсивного роста организма с последующей компенсацией их количества к 40 - 50суточному возрасту. Избыток химических элементов угнетает костномозговое кроветворение, что проявляется в уменьшении клеточного состава в течение всего периода исследования.
2. Впервые выявлена корреляционная зависимость между содержанием элементов в теле, красном костном мозге и миэлограммой кур. На численность клеток грануляционной и эритроидной групп с обратной связью оказывает влияние уровень Pb; на клетки моноцитарной группы - Zn; Cu - на клетки в стадиях митоза и мегакариоцитарной группы. Прямую зависимость имеют содержание Zn и клетки мегакариоцитарной группы.
3. Увеличение содержания Pb в рационе цыплят-бройлеров до 1,5 МДУ (4,мг/кг корма) сопровождается разрушением органелл в цитоплазме клеток красного костного мозга, расширением перинуклеарного пространства, деструкцией гетерохроматина, развитием пикноза ядра и индуцированием апоптоза. При этом численность клеток достоверно снижалась до 45-х суток на 21,67 - 52,08 %. Свинец угнетает работу эритроидного ростка кроветворения, что подтверждается снижением количества эритроцитов в кровяном русле в первую неделю на 20,0 % с последующим восстановлением к 45-м суткам, в лейкоцитарной формуле происходит яркий сдвиг ядра влево (р<0,001).
4. Хлорид цинка в дозах 40 мг/кг и 60 мг/кг при остром воздействии вызывает в красном костном мозге рост числа зрелых клеток с признаками деструктивных процессов в ядре и цитоплазме. С повышением дозы появляются клетки с признаками апоптоза. Уменьшается концентрация клеток моноцитарной в 2,9 - 3,1 раза и увеличивается - мегакариоцитарной групп в 3,4 - 4, 0 раза (р<0,001). К концу исследования концентрация эритроцитов в периферической крови находится ниже контрольных значений на 14,29 % (р<0,05) и 28,57 % (р<0,01); лейкоцитов ниже на 17,41 % (р<0,01) и 34,30 % (р<0,001).
5. Наибольший стимулирующий эффект на костномозговое кроветворение оказывает доза нанопорошка меди в количестве 1,7 мг/кг корма, вызывая рост количества клеток гранулоцитарной группы на 45,1 - 66,1 %, мегакариоцитарной в 2,5 - 4,4 раза и эритроидной - в 1,5 - 2,3 раза (р<0.001). Периферическая кровь реагирует увеличением численности эритроцитов на 24,6 % (р<0.001), содержания лимфоцитов и моноцитов на 33,3 % и 44,2 % соответственно.
6. При облучении в дозе 0,5 Гр наряду с дистрофическими изменениями в клетках определяются признаки компенсаторно-приспособительного характера в виде увеличения ядрышек, количества рибосом и полирибосом, цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, свидетельствующие о стимуляции белоксинтетических процессов. Наиболее чувствительными к облучению являются клетки стволового пула, число их резко снижается уже после облучения цыплят в дозе 0,5 Гр и 1,0 Гр. Фигуры митоза встречаются редко, то есть обнаруживается приостановка клеточного деления (блок митозов). При облучении в дозе 6,0 Гр процессы деструкции нарастают прямо пропорционально количеству времени, прошедшему после облучения это происходит под влиянием накопления продуктов перекисного окисления, образующихся после облучения, в результате чего начальный радиационный эффект со временем усиливается. Количество клеток красного костного мозга при облучении в дозе 0,5 Гр превышало контрольные значения на 15,8 - 57,1 % (р<0.01) при облучении в дозе 1,0 Гр происходило стойкое снижение их численности на 10,7 - 44,7 %; при дозе 6,0 Гр - на 25,65 - 60,3 % (р<0.001). Концентрация эритроцитов в периферической крови составляет 83,3 - 85,2 % от контрольных значений при облучении в дозах 1,0 и 6,0 Гр; лейкоцитов - 59,1 - 79,1 % и 42,8 - 64,% (р<0.001); в лейкоцитарной формуле изменения касались доли лимфоцитов и псевдоэозинофилов.
7. На основе дискриминантного анализа получены функции, позволяющие определить степень воздействия физических факторов (гамма-облучение) на организм птицы. В качестве переменных функции предлагаем использовать показатели концентрации эритроцитов в кровяном русле и доли лимфоцитов, юных и сегментоядерных псевдоэозинофилов в общем количестве лейкоцитов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Результаты исследования могут быть использованы:
- в лабораториях НИИ, занимающихся выяснением индивидуальных особенностей гемопоэза кур в норме при действии различных факторов;
- при классификации животных, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды;
- для экспресс-диагностики степени физического воздействия на организм рекомендуем в качестве переменных функций использовать концентрации эритроцитов в кровяном русле и доли лимфоцитов, юных и сегментоядерных псевдоэозинофилов в общем количестве лейкоцитов;
- при написании соответствующих разделов учебников и справочных руководств по диагностике болезней и терапии птицы, морфологии, гематологии, токсикологии, патоморфологии и радиобиологии;
- в образовательном процессе для чтения лекций и проведения практических занятий на биологических, ветеринарных и зооинженерных факультетах высших учебных заведений. Основные положения диссертационной работы изложены: в методических указаниях Миграция радионуклидов по биологической цепочке: почва - растение - животное; в Словаре радиобиологических терминов (допущен МСХ РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по биологическим и ветеринарным специальностям, Оренбург, 2004); в рекомендациях Стимуляция гемопоэза птицы нанопорошками меди (рассмотрены и одобрены Ученым советом ВНИИВСГЭ и секцией Ветеринарная санитария, гигиена и экология Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии протокол № 2/3 от л13 апреля 2011 г.).
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах перечня ВАК России 1. Вишняков, А.И. Изменения в системе крови кур под действием радиации в дозе 12 Гр [Текст] / А.И. Вишняков // Морфологические ведомости. - 2004. - № 1Ц2.
- С. 21.
2. Вишняков, А.И. Влияние -лучей на костномозговое кроветворение птицы [Текст] / А.И. Вишняков // Морфология. - 2004. - № 4. - С. 30.
3. Вишняков, А.И. Влияние различных уровней кормления на элементный статус красного костного мозга [Текст] / А.И. Вишняков // Вестник ОГУ. - № /февраль 2009. - С. 184Ц186.
4. Вишняков, А.И. Изменение морфологического состава крови цыплятбройлеров при разных уровнях кормления [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Вестник ОГУ. - № 2 /февраль 2009. - С. 186Ц187.
5. Вишняков, А.И. Экологические аспекты гемопоэза птиц [Текст] / А.И.
Вишняков // Вестник ОГУ. - № 6 /июнь 2009. - С. 106Ц107.
6. Вишняков, А.И. Морфологические изменения картины крови птицы при минимальном содержании в рационе минеральных веществ и обменной энергии [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2009. - Ч. 2, № 1. - С. 19Ц21.
7. Вишняков, А.И. Особенность костномозгового кроветворения птицы при воздействии экологически-неблагоприятных факторов антропогенного происхождения [Текст] / А.И. Вишняков, С.В. Лебедев, А.А. Торшков // Вестник ОГУ. - Ч. 1, № 10 /октябрь 2009. - С. 49Ц51.
8. Вишняков, А.И. Последствия антропогенного влияния на состав крови цыплят-бройлеров [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2009. - № 4. - С. 166Ц167.
9. Вишняков, А. И. Электронно-микроскопические особенности костномозгового кроветворения птиц [Текст] / А.И. Вишняков // Вестник ОГУ. - № 12 /декабрь 2009. - С. 81Ц84.
10. Вишняков, А.И. Ультраструктура клеток костного мозга цыплят при воздействии гамма-облучения [Текст] / А.И. Вишняков // Морфология. - 2010. - Т. 137, № 4. - С. 48Ц49.
11. Вишняков, А. И. Морфология клеток красного костного мозга и периферической крови цыплят при введении в организм наночастиц меди [Текст] / А. И.
Вишняков, А. С. Ушаков // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - №2. - С. 3Ц7.
12. Вишняков, А.И. Ультраструктура клеток костного мозга цыплят после цинковой интоксикации [Электронный ресурс] / А.И. Вишняков. - Краснодар : Куб ГАУ, 2011. - № 69 (5). - Шифр Информрегистра: 0421100012/0180. - Режим доступа:
13. Вишняков, А.И. Особенности элементного статуса красного костного мозга цыплят-бройлеров при введении в организм нанопорошка меди [Текст] / А.И.
Вишняков // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины. - 2011. - № 207. - С. 105Ц110.
14. Вишняков, А.И. Ультраструктура клеток красного костного мозга цыплят при воздействии свинца [Электронный ресурс] / А.И. Вишняков // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 3. - Режим доступа: www.scienceeducation.ru/97-4701. - Дата обращения: 20.09.2011.
15. Сизенцов, А.Н. Экологические аспекты аккумуляции свинца и цинка пробиотическими препаратами на основе бактерий рода Bacillus [Текст] / А.Н. Сизенцов, А.И. Вишняков, А.Е. Новикова // Вестник ОГУ. - № 4 / апрель 2011. - С. 7Ц9.
Статьи в других изданиях 16. Вишняков, А.И. Изменения в красном костном мозге птиц при облучении [Текст] / А.И. Вишняков // Достижения ветеринарной медицины XXI веку : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Барнаул : Изд-во Алтайского ГАУ, 2002. - Ч. I. - С. 115Ц117.
17. Вишняков, А.И. Динамика показателей периферической крови кур при действии разных доз -облучения [Текст] / А.И. Вишняков, В.В. Дегтярев // Достижения ветеринарной медицины XXI веку : материалы Междунар. науч.-практ. конф.
- Барнаул : Изд-во Алтайского ГАУ, 2002. - Ч. I. - С. 134Ц136.
18. Вишняков, А.И. Изменения в периферической крови кур под действием неблагоприятных факторов [Текст] / А.И. Вишняков // Проблемы регионального управления рисками на объектах агропромышленного комплекса : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Оренбург : Изд-во ОГАУ, 2002. - С. 195Ц199.
19. Вишняков, А.И. Влияние тимогена на некоторые показатели периферической крови птицы, подверженной гамма-облучению [Текст] / В.В. Дегтярев, Р.Ш.
Тайгузин, А.И. Вишняков // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля с/х продукции : материалы Междунар. науч.-практ.
конф. / Московский госуниверситет прикладной биотехнологии. - М., 2002. - С.
193Ц195.
20. Вишняков, А.И. Влияние гамма-облучения в дозе 0,5 Гр на состояние костномозгового кроветворения у птицы [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях : материалы Всероссийской науч.-практ. конф. - Пенза : Изд-во ПГСХА, 2003. - С. 12Ц15.
21. Вишняков, А.И. Нарушение системы крови птицы при острой лучевой болезни [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные аспекты экологической, сравнительновидовой, возрастной и экспериментальной морфологии : материалы Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию профессора В. Я. Суетина. - Улан-Удэ : Изд-во ФГОУ ВПО БГСХА им. В. Р. Филиппова, 2004. - С. 239Ц241.
22. Вишняков, А.И. Нарушение в периферической крови птицы под действием гамма-облучения в дозе 0,5 Гр [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные вопросы ветеринарной медицины : материалы Сибирской междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск : Изд-во АГРО-СИБИРЬ, 2004. - Ч. 2. - С. 236Ц237.
23. Вишняков, А.И. Гематологические показатели крови цыплят, облученных гамма-лучами в дозе 6,0 Гр [Текст] / А.И. Вишняков, В.В. Дегтярев // Актуальные вопросы ветеринарной медицины : материалы Сибирской междунар. науч.-практ.
конф. - Новосибирск : Изд-во АГРО-СИБИРЬ, 2004. - Ч. 2. - С. 217Ц219.
24. Вишняков, А.И. Действие ионизирующего излучения на костномозговое кроветворение и периферическую кровь кур [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные проблемы АПК в XXI веке : материалы Междунар. межвузовской науч.-практ. конф.
профессорско-преподавательского состава. - Самара : Изд-во ФГОУ ВПО СГСХА, 2004. - С. 108Ц115.
25. Вишняков, А.И. Воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды на организм животных [Текст] / А.И. Вишняков // Млекопитающие как компонент аридных экосистем : ресурсы, фауна, экология, медицинское значение и охрана : материалы Междунар. совещания. - М., 2004. - С. 34Ц35.
26. Вишняков, А.И. Источники поступления тяжелых металлов в организм животных [Текст] / А.И. Вишняков // Агропромышленный комплекс : состояние и перспективы развития : сб. трудов Межрегиональной науч.-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. А. К. Ермолаева. - Великие Луки, 2005. - С.
96Ц98.
27. Вишняков, А.И. Изменения в костномозговом кроветворении птицы при введении в рацион солей свинца [Текст] / А. И. Вишняков // Современное развитие АПК : региональный опыт, проблемы, перспективы : материалы Всероссийской науч.-практ. конф. - Ульяновск, 2005. - Ч. V. - С. 327Ц329.
28. Вишняков, А.И. Загрязнение окружающей среды свинцом и цинком [Текст] / А.И. Вишняков // Естествознание и гуманизм : сб. науч. работ. - Томск, 2005. - Т. 2, № 1. - С. 91Ц92.
29. Вишняков, А.И. Источники попадания свинца в организм человека и животных [Текст] / А.И. Вишняков // Технологические проблемы пр-ва продукции животноводства и растениеводства : материалы Междунар. науч.-практ. конф., посвященной 75-летию УГАВМ. - Троицк, 2005. - С. 27Ц29.
30. Вишняков, А.И. Влияние избыточного содержания обменной энергии и минеральных веществ в рационе цыплят-бройлеров на морфологический состав крови [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных : материалы Междунар. науч.практ. конф., посвященной 80-летию кафедры анатомии и гистологии с-х животных, 110-летию со дня рождения проф. Н. И. Акаевского и 15-летию кинологического центра. - 21 мая 2009 г. - Троицк : УГАВМ, 2009. - С. 40Ц43.
31. Вишняков, А.И. Зависимость морфологического состава крови цыплятбройлеров от содержания в рационе микроэлементов и обменной энергии [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решении : материалы Междунар. науч.практ. конф. - 26Ц28 мая 2009 г. - Ульяновск, 2009. - Т. III : Актуальные вопросы ветеринарной медицины, биологии и экологии. - С. 15Ц17.
32. Вишняков, А.И. Влияние недостатка минеральных веществ в рационе на некоторые биохимические показатели крови цыплят-бройлеров [Текст] / А.И. Вишняков, А.А. Торшков // Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - 14Ц15 октября 2009 г. - Оренбург:
ИПК ГОУ ОГУ. - С. 316Ц319.
33. Вишняков, А.И. Влияние нехватки минеральных веществ в рационах цыплят-бройлеров на биохимический состав крови [Текст] / А.И. Вишняков // Аграрная наука и образование на современном этапе развития : опыт, проблемы и пути их решения : материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - 8Ц10 июня 2010 г. - Ульяновск, 2010. - С. 16Ц18.
34. Вишняков, А.И. Особенности периферического кроветворения цыплят при общем гамма-облучении [Текст] / А.И. Вишняков, Е.А. Уварова // Аграрная наука и образование на современном этапе развития : опыт, проблемы и пути их решения :
материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - 8Ц10 июня 2010 г. - Ульяновск, 2010.
- С. 19Ц23.
35. Vishnjakov, A.I. Elemental status of marrow in broilers at different feeding rate [Теxt] / A.I. Vishnjakov // 4th International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology. - June 9-12, 2010. - St. Petersburg, Russia. - Р. 52.
36. Вишняков, А.И. Особенности костномозгового кроветворения птицы через сутки после интоксикации солями свинца [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные проблемы охраны природы, окружающей природной среды и рационального природопользования : материалы I Междунар. науч.-практ. конф. - Чебоксары, 2010. - С.
132Ц134.
37. Вишняков, А.И. Влияние высокодисперсных порошков металлов на морфологическое состояние внутренних органов млекопитающих [Текст] / А.И. Вишняков // Экология. Риск. Безопасность : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - 20 - 21 октября 2010. - Курган, 2010. - Т. 2. - С. 28.
38. Vishnjakov, A.I. Ecological aspects of influence of ionizing radiation on bonebrain haemopoiesis animals [Теxt] / A.I. Vishnjakov // Хабаршысы КАЗУ. - Алматы, 2010. - № 4. - С. 20Ц23.
39. Вишняков, А.И. Структурно-функциональная реорганизация клеток красного костного мозга животных при воздействии ионизирующего излучения [Текст] / А.И. Вишняков // Казанская наука : сб. науч. ст. - Казань, 2010. - Вып. 1, № 8. - С.
28Ц33.
40. Вишняков, А.И. Морфофункциональные изменения клеток красного костного мозга животных при воздействии солей свинца [Текст] / А.И. Вишняков // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2010. - № 12. - С. 23Ц26.
Рекомендации 41. Вишняков, А.И. Стимуляция гемопоэза птицы наночастицами меди [Текст]: рекомендации / А.И. Вишняков, Е. А. Сизова. - Оренбург: Изд-во Штрих, 2011. - 19 с.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству