МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА: ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

На правах рукописи

ХУСАИНОВА АЛЬВИНА НАИЛЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА:

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Уфа - 2012

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УН - РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией физиологической генетики ИБГ УН - РАН	Мустафина Ольга Евгеньевна
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор кафедры неврологии курса нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета	Бахтиярова Клара Закиевна
Официальные оппоненты: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УН - РАН	Карунас Александра Станиславовна
доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН	Карпухин Александр Васильевич
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится л29 мая 2012аг. в л12.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.113.01 при ИБГ УН - РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УН - РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УН - РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан л29 апреля 2012г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

С.М.Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз - хроническое аутоиммунное неврологическое заболевание, которое характеризуется воспалением, потерей миелина и последующими аксональными повреждениями в центральной нервной системе (ЦНС), что приводит к нарушениям многих функций организма [Kalman, 2002, Baranzini, 2010].

По распространенности среди неврологических заболеваний ЦНС рассеянный склероз (РС) занимает четвертое место после острых нарушений мозгового кровообращения, эпилепсии и паркинсонизма, а в молодом возрасте - второе место после эпилепсии. В настоящее время в мире насчитывается более 2 млн. больных РС, в том числе в России около 200 тысяч [Столяров, 2002; 2008]. В период с 1999 по 2006 гг. усредненный показатель распространенности РС в Республике Башкортостан составил 35.3 на 100а000 населения, что соответствует зоне среднего риска развития РС [Бахтиярова, 2007].

Рассеянный склероз является многофакторным полигенным заболеванием. В формировании генетической предрасположенности к нему участвуют гены белков, вовлеченных в процессы воспаления и развития аутоиммунных реакций. Области сцепления с РС обнаружены на большинстве хромосом (за исключением хромосом 21 и Y), но для разных этнических групп они не совпадают. Результаты мета-анализа подтвердили сцепление с РС области 6p21, в которой локализованы гены главного комплекса гистосовместимости (регионы DR, DP или DQ HLA класса II), и области 19q13 около гена APOE [Oksenberg, 2002; www.msgene.org]. У европеоидов от 20% до 60% больных РС являются носителями аллеля HLA-DRB1*1501 [Haines, 1998]. Для полиморфных локусов генов SH2D2A, FASL, FAS (CD95), PTPRC, IL10, IL1RA, CTLA4, OPN, IL2, IL7RA, IL4, PAI1, TCRB, IL2RA (CD25), UCP2, VDR, IFG, CIITA (MHC2TA), IL4R, RANTES (CCL5), CCL3, MBP, ICAM1, APOE ассоциации с РС подтверждены более чем в двух популяциях [www.msgene.org].

Согласно результатам полногеномных скринингов, проведенных участниками международного консорциума по генетике рассеянного склероза (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium - IMSGC), полиморфные локусы генов IL2RA, IL7R, IL12В, CD58, CLEC16A (KIAA0350), EVI5, TNFRSF1A, IRF8, CD6, TYK2, CD226, CYB27B1, KIF21B, TMEM39A также вносят вклад в формирование наследственной предрасположенности к РС. Ассоциации с РС полиморфных локусов этих генов подтверждены и в последующих УрепликативныхФ исследованиях [Teutsch, 2003; Fernald, 2005; Zhang, 2005; Gregory, 2007; Lundmark, 2007; Rubio, 2008; Baranzini, 2009; IMSGC 2007-2011].

Среди генов-кандидатов РС значительный интерес представляют гены цитокиновой сети. Цитокины регулируют дифференцировку и функционирование клеток, участвующих в воспалительных и иммунных процессах. Цитокины, продуцируемые активированными аутореактивными Т-клетками, моноцитами и микроглиальными клетками, обнаружены в очагах разрушения миелина. Более того, содержание провоспалительных и регуляторных цитокинов, включая IL-1, Il-6, IL-10, IL-12 и TNF-a, повышено у больных РС [Кулакова, 2004]. При этом обсуждается их роль в развитии различных типов течения заболевания, скорости прогрессирования и других клинико-патогенетических особенностей PC.

Рассмотренные выше сведения послужили основанием для постановки цели исследования.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить вклад полиморфных локусов некоторых генов цитокиновой сети в генетическую предрасположенность к рассеянному склерозу у русских и татар, проживающих в Республике Башкортостан.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести типирование больных рассеянным склерозом и здоровых индивидов по полиморфным локусам генов:

интерлейкина 1 бета (IL1B, rs16944, Ц511T>C),
рецептора интерлейкина 1 типа 1 (IL1R1, rs2287047, +3653T>C),
антагониста рецептора интерлейкина 1 (IL1RN, VNTR-полиморфизм),
каспазы-1 (CASP1, rs481736, -877С>Т),
интерлейкина 6 (IL6, rs1800796, -572G>C),
интерлейкина 10 (IL10, rs1800872, -627C>A),
интерлейкина 12 (IL12B, rs3212227, +1159A>C),
фактора некроза опухолей альфа (TNF, rs1800629, Ц308G>A),
имфотоксина альфа (LTA, rs909253, +252A>G),
рецептора первого типа фактора некроза опухолей альфа (TNFRSF1A, rs767455, +36 A>G).

2. Оценить частоты аллелей и генотипов по полиморфным локусам перечисленных генов в группах больных рассеянным склерозом и здоровых лиц.

3. Провести анализ ассоциаций с рассеянным склерозом полиморфных локусов перечисленных генов с учетом этнической, гендерной принадлежности, а также типов течения и тяжести заболевания.

4. Провести анализ межгенных взаимодействий аллельных вариантов исследуемых генов с учетом этнической и гендерной принадлежности больных рассеянным склерозом.

Научная новизна исследования. Впервые проведено исследование молекулярно-генетических основ рассеянного склероза с использованием полиморфных локусов генов IL1B, IL1RN, IL1R1, CASP1, IL6, IL10, IL12B, TNF, LTA, TNFRSF1A в этнически однородных группах (русские и татары) населения Республики Башкортостан. Обнаружены ассоциации с заболеванием полиморфных локусов генов IL1B (Ц511T>C), IL1R1(+3653T>C), IL6 (-572G>C), IL10 (-627C>A), IL12B (+1159A>C) у русских и полиморфных локусов генов CASP1 (-877С>Т), TNF (Ц308G>A), LTA (+252A>G), TNFRSF1A (+36A>G) у татар. Определены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокиновой сети, предрасполагающих к развитию РС, с учетом этнической и гендерной принадлежности.

Практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в общее представление о молекулярно-генетических основах предрасположенности к рассеянному склерозу. Данные диссертационной работы могут послужить базой для последующих исследований по генетике РС, для развития концепции о роли полиморфизма генов цитокиновой сети в этиопатогенезе заболевания. Результаты исследования могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска развития заболевания с учетом этнической принадлежности (у русских и татар). Результаты исследования могут быть рекомендованы для использования в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования врачей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; Ростов-на-Дону, 2010), международной конференции, посвященной 115-летию со дня рождения Н.И. Вавилова Вавиловские чтения (Москва, 2005), международной конференции Human genome meeting (Kyoto, 2005), международной конференции Генетика в России и мире (Москва, 2006), 9-й всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей Человек и его здоровье (2006), IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006), I и II Всероссийской школе-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика-наука XXI века (Уфа, 2007; 2011), Российском конгрессе с международным участием Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное (Санкт-Петербург, 2010), XVI и XVIII Всероссийской конференции УНейроиммунология. Рассеянный склерозФ (Санкт-Петербург, 2005; 2011), научно-практической конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии (Курск, 2011), Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2011), Европейских конгрессах - European Human Genetics Conference (Prague, 2005; Amsterdam, 2006; Gothenburg, 2010; Amsterdam, 2011).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликована 21 печатная работа, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение, выводы, библиографический список, приложения. Работа изложена на 237 страницах машинописного текста, содержит 65 таблиц и 32 рисунка. Библиографический список включает 364 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. Выборка больных сформирована из 430 индивидов (228 - русских, 202 - татар по этнической принадлежности), не родственных между собой, в возрасте от 14 до 56 лет (средний возраст составил 29.469.08), с достоверным диагнозом РС по критериям McDonald [McDonald., 2001], проходивших курс лечения в Республиканской клинической больнице г. Уфы. Средняя длительность заболевания вовлеченных в исследование пациентов составила 12.29.18 лет (от 1 до 35 лет), средний возраст манифестации заболевания - 28.948.92 (от 14 до 49 лет). Соотношение женщин и мужчин среди больных было 2 к 1 у русских, 1.7 к 1 у татар. Контрольную группу составили 738 индивида (из них 416 - русских, 322 - татар), не родственных между собой, без признаков РС и других неврологических заболеваний, в возрасте от 12 до 57 лет (средний возраст - 36.3410.11).

От всех обследуемых получено информированное добровольное согласие на проведение биомедицинских исследований. На каждого больного путем опроса и анализа истории болезни была заполнена анкета, включающая в возраст начала, тип течения заболевания. Принято выделять первично-прогрессирующее (ПП), вторично-прогрессирующее (ВП) и ремиттирующее (РМ) течение заболевания. Тяжесть состояния больных определяется по расширенной шкале степени инвалидизации (Expanded Disability Status Scale - EDSS) (Kurtzke J.F., 1983). Пограничное значение EDSS=6 соответствует уровню, при котором пациенты теряют способность к самостоятельному передвижению.

Методы исследования. ДНК выделяли из 10 мл периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Johns M, 1989]. Типирование аллельных вариантов генов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и рестрикционным анализом с последующим электрофорезом фрагментов ДНК в 7% полиакриламидном или 1-2% агарозном геле, окрашиванием гелей раствором этидия бромида (1%) и визуализацией с помощью видеогель-документирующей системы (лVilber Lourmat). Поиск условий проведения эксперимента, последовательностей олигонуклеотидных праймеров и рестриктаз для идентификации полиморфных локусов генов осуществляли с помощью электронных баз данных (www.snpper.chip.org, и пакета программ DNASTAR v.5.0.

Статистическую обработку полученных данных проводили, используя пакеты программ SPSS v.18.0, MDR v. 2.0 beta 6 (Multifactorial Dimensionality Reduction, ww.epistasis.org/mdr.html, и компьютерной программы RxC (ROW x Columns) по алгоритму, описанному Roff D.A. [Roff, 1989]. Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга использовали критерий 2 [Животовский, 1991]; достоверность различий в распределениях частот генотипов и аллелей в популяциях оценивали с помощью компьютерной программы Arlequin ver. 3.0. Попарное сравнение частот аллелей и генотипов в группе больных РС и контроля проводили с использованием точного двухстороннего теста Фишера. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OR - odds ratio).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов цитокиновой сети с рассеянным склерозом

Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов кластера интерлейкина 1 с рассеянным склерозом

Гены всех членов семейства IL-1 (IL1B, IL1RN, IL1R1) расположены в одном кластере на хромосоме 2 (2q13-q21). IL-1 - цитокин, играющий важную роль в развитии воспалительных реакций в ЦНС. При РС повышение продукции IL-1 является признаком активации патологического процесса, которая наблюдается в активных очагах демиелинизации в белом веществе головного и спинного мозга. [Moynagh, 2005]. Биологические эффекты IL-1 реализуются после связывания с IL-1RI [Ching, 2005, 2007]. На модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) было показано, что индукция и прогрессирование заболевания ослабляются у мышей, дефицитных по IL-1R1 [Qiming Li, 2011]. Полиморфный локус Ц511T>C гена IL1B ассоциирован с уровнем продукции IL-1. Вопрос о функциональной значимости полиморфного локуса VNTR гена IL1RN остается дискутабельным. У больных РС при сочетанном носительстве аллелей IL1RN*2 и IL1BЦ511*T отмечено более высокое содержание IL1RN в плазме крови [Arend, 2002].

Частоты генотипов и аллелей по полиморфному локусу -511Т>С (rs16944) гена IL1В в группах здоровых и больных индивидов представлены в таблице 1. Выявлены статистически значимые различия между группами по частотам генотипов L1B-511*T/*T (р=0.004) и IL1B-511*T/*C (р<0.001) у русских. Следовательно, предрасполагающим к развитию РС является генотип IL1B-511*T/*T (OR=1.84, CI: 1.22-2.77), а протективным - генотип IL1B-511*T/*C (OR=0.47, CI: 0.33-0.68). Анализ результатов с учетом гендерной принадлежности и типов течения заболевания показал, что выявленные ассоциации не зависят ни от полового диморфизма, ни от типов течения РС. При сравнении по частотам генотипов и аллелей групп больных РС (русских) с разной тяжестью заболевания (EDSS<6 и EDSS≥6) между ними выявлены достоверные отличия по частотам генотипа IL1B-511*T/*Т (р=0.005) и аллеля IL1B-511*T (р=0.001). По частотам генотипов группа больных с EDSS≥6 отличается от здоровых индивидов: в группе больных с EDSS≥6 понижена частота генотипа IL1B-511*T/*C (31.25% против 51.4%, р=0.009, OR=0.43, CI: 0.23-0.82) и повышена частота генотипа IL1B -511*T/*T (45.83% против 18.54%, р<0.001, OR=3.72, CI: 1.99-6.97). Генотип IL1B-511*T/*Т, по всей видимости, предрасполагает к более тяжелой степени инвалидизации.

Таким образом, полиморфный локус -511Т>С гена IL1В ассоциирован с РС у этнических русских. Не выявлено ассоциаций данного полиморфного локуса гена IL1B с РС у лиц татарской этнической принадлежности.

В литературе описано пять аллелей полиморфного локуса VNTR гена IL1RN с числом повторов от двух до шести. Нами идентифицировано 4 аллеля и 6 генотипов данного полиморфного локуса у русских и татар (табл. 1). Как следует из полученных данных, частоты генотипов и аллелей VNTR-полиморфизма гена IL1RN в контрольных группах и группах пациентов практически совпадают как у русских, так и у татар. Таким образом, ассоциаций с РС полиморфного локуса VNTR гена IL1RN не выявлено.

Результаты типирования по полиморфному локусу +3653Т>С (rs2287047) гена IL1R1 здоровых и больных РС представлены в таблице 1. По частотам генотипов группа русских пациентов с РС отличается от контрольной группы той же этнической принадлежности: в группе больных повышена частота генотипа IL1R1+3653*T/*Т (р=0.007) и понижена частота генотипа IL1R1+3653*С/*С (р=0.025). Предрасполагающим к развитию РС у русских является генотип IL1R1+3653*T/*T (OR=1.85, CI: 1.19-2.87), а протективным - IL1R1+3653*С/*C (OR=0.67, CI: 0.48-0.94).

Не обнаружено ассоциаций данного полиморфного локуса гена IL1R1 с РС у татар.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs481736 гена CASP1

с рассеянным склерозом

Каспаза-1 является IL-1-конвертирующим ферментом. Она участвует в процессинге провоспалительных цитокинов [Wang, 1996; Мартынова, 2003]. Вследствие дефицита каспазы-1 происходит угнетение синтеза провоспалительных цитокинов [Siegmund, 2001]. Роль полиморфных локусов гена CASP1 как генетических факторов риска развития нейродегенеративных заболеваний остается неясной.

В проведенном нами исследовании статистически значимых различий по распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs481736 (-877С>Т) гена CASP1 между контрольной группой и группой больных РС не выявлено (табл. 1).

Таблица 1

Результаты анализа ассоциаций полиморфных локусов генов цитокиновой сети с рассеянным склерозом у этнических русских и татар

Ген

(полиморфизм)

Русские (N=644)

Татары (N=524)

Генотип/

аллель

Частота (%)

Контроль

(N=416)

РС

(N=228)

Контроль

(N=322)

РС

(N=202)

IL1B

(-511T>C)

*C/*C

*T/*C

*T/*T

30.06

51.4

18.54

55.76

44.24

37.31

33.16

29.53

53.89

46.11

0.087

<0.001

0.004

0.551

0.47

1.84.

31.96

46.12

21.92

55.02

44.98

37.8

37.2

56.4

43.6

0.277

0.094

0.541

0.714

IL1R1

(+3653T>C)

*Т/*Т

*T/*C

*С/*С

*Т

*С

12.91

42.03

45.06

33.92

66.08

21.5

42.99

35.51

42.99

57.01

0.007

0.864

0.025

0.99

1.85

0.67

15.07

47.43

37.5

38.79

61.21

21.58

43.68

34.74

43.42

56.58

0.083

0.449

0.557

0.173

IL1RN (VNTR)

*1/*1

*1/*2

*1/*3

*2/*2

*2/*3

*1/*4

45.34

40.06

2.48

9.63

2.17

0.31

66.77

30.75

2.33

0.16

46.08

36.87

5.53

9.68

1.38

67.28

29.03

3.46

0.23

0.93

0.472

0.101

0.747

0.895

0.588

0.345

50.91

35.15

2.42

9.09

0.91

1.52

70.45

27.12

1.67

0.76

51.55

34.54

2.58

9.28

2.06

71.13

26.55

1.29

1.03

0.928

0.925

0.299

0.732

0.833

0.885

0.796

0.733

CASP1

(-877С>Т)

*C/*C

*T/*C

*T/*T

64.29

31.75

3.97

80.16

19.84

61.96

36.41

1.63

80.16

19.84

0.687

0.356

0.254

69.02

29.02

1.96

83.53

16.47

61.33

0.67

80.33

19.67

0.419

0.078

0.128

0.254

IL6

(-572G>C)

*G/*G

*G/*C

*C/*C

78.71

20.1

1.2

88.76

11.24

88.63

11.37

94.31

5.69

0.002

0.007

0.174

0.001

2.11

0.51

2.1

0.48

71.08

26.46

2.46

84.31

15.69

75.13

24.35

0.52

87.31

12.69

0.359

0.677

0.164

0.203

IL10

(-627C>A)

*С/*С

*С/*А

*А/*А

*С

*А

54.96

37.27

7.77

73.59

26.41

58.9

37.9

3.2

77.85

22.15

0.391

0.93

0.031

0.109

0.39

58.63

33.88

7.49

75.57

24.43

54.36

38.46

7.18

73.59

26.41

0.356

0.339

0.502

Продолжение таблицы 1

IL12B (+1159A>C)

*А/*А

*А/*С

*С/*С

*А

*С

66.42

28.4

5.19

80.62

19.38

61.95

32.2

5.85

78.05

21.95

0.282

0.349

0.709

0.292

57.74

38.06

4.19

76.77

23.23

56.04

40.66

3.3

76.37

23.63

0.777

0.568

0.809

0.938

TNF

(Ц308G>A)

*G/*G

*G/*А

*А/*А

*А

71.92

25.2

2.89

84.51

15.49

74.23

24.74

1.03

86.6

13.4

0.621

0.919

0.236

0.38

78.57

20.5

0.93

88.82

11.18

70.11

28.16

1.72

84.2

15.8

0.038

0.059

0.428

0.046

0.64

0.67

1.49

LTA

(+252A>G)

*А/*А

*А/*G

*G/*G

*А

53.33

39.75

6.91

73.21

26.79

51.8

39.19

9.01

71.4

28.6

0.738

0.932

0.35

0.508

54.46

34.32

11.22

71.62

28.38

46.15

42.05

11.79

67.18

32.82

0.081

0.088

0.886

0.138

TNFRSF1A (+36A>G)

*G/*G

*G/*А

*А/*А

*А

23.24

55.29

21.47

50.88

49.12

21.4

58.14

20.47

50.47

49.53

0.677

0.539

0.831

0.892

16.33

44.9

38.78

61.22

22.58

55.38

22.04

50.27

49.73

0.108

0.033

<0.001

1.52

0.45

1.6

0.63

Однако при анализе данных с учетом типа течения заболевания обнаружилось, что по распределению частот генотипов группа больных татар с вторично-прогрессирующим типом течения отличается от соответствующей контрольной группы (2=8.00, р=0.026): в этой группе больных наблюдается повышение частоты генотипа CASP1-877*С/*Т (48.28% против 29.02% в контрольной группе, р=0.008). и понижение частоты генотипа CASP1-877*С/*C (50% против 69.02% в контрольной группе, р=0.009). Генотип CASP1-877*С/*Т является маркером повышенного (OR=2.28, CI: 1.27-4.08), а генотип CASP1-877*С/*С - маркером пониженного риска РС (OR=0.45, CI: 0.25-0.8). При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей с учетом гендерной принадлежности и тяжести течения заболевания статистически значимых различий выявлено не было.

Таким образом, у татар полиморфный локус -877С>Т гена CASP1 ассоциирован с вторично-прогрессирующим типом течения заболевания.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs1800796 гена IL6

с рассеянным склерозом

Интерлейкин 6 (IL-6) - цитокин с плеойтропным характером действия [Colobran, 2007]. IL-6влияет на дифференцировку нейронов, усиливает продукцию фактора роста нервов и ремиелинизацию [Столяров, 2002]. Содержание IL-6 в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных РС и в клетках периваскулярных инфильтратов в ткани мозга повышено [Кулакова, 2004].

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1800796 (-572G>С) гена IL6 у здоровых и у больных РС представлены в таблице 1. Как показал анализ ассоциаций у русских предрасполагающим к развитию РС является генотип IL6-572*G/*G (р=0.002, OR=2.11, CI: 1.3-3.43) и аллель IL6-572*G (р=0.001, OR=2.1, CI: 1.32-3.34), а протективным генотип IL6-572*G/*С (р=0.007, OR=0.51, CI: 0.31-0.88) и аллель IL6-572*С (р=0.001, OR=0.48, CI: 0.3-0.76).

При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей с учетом гендерной принадлежности и тяжести течения заболевания статистически значимых различий выявлено не было.

У этнических татар ассоциаций полиморфного локуса -572G>С гена IL6 с РС не выявлено.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs1800872 гена IL10 с рассеянным склерозом

Интерлейкин 10 (IL-10) - цитокин с наиболее выраженным противовоспалительным действием. У больных РС уровень IL-10 и число секретирующих IL-10 мононуклеарных клеток в крови понижено по сравнению с таковыми у больных другими неврологическими заболеваниями и здоровых лиц [Ozenci, 1999; Petereit, 2003]. В то же время полагают, что повышение продукции IL-10 может быть одним из адаптационных механизмов, способствующих выходу из обострения и стабилизации течения заболевания [Гусев, 1997; Columbus, 2005]. Результаты анализа ассоциаций полиморфных локусов гена IL10 с уровнем его продукции, полученные разными авторами, неоднозначны. Согласно отдельным литературным данным, аллели IL10Ц627*С и IL10Ц1082*G ассоциированы с повышенным, а аллели IL10Ц627*A и IL10Ц1082*А - с пониженным содержанием

IL-10 в крови, с более низким уровнем экспрессии гена IL10 [Suarez, 2003].

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу rs1800872 (-627C>A) гена IL10 у здоровых и у больных РС индивидов представлено в таблице 1. В группе больных РС, русских по этнической принадлежности, в отличие от соответствующей контрольной группы, понижена частота генотипа IL10627*А/*А (р=0.031). Показатель отношения шансов по генотипу IL10627*А/*А составил 0.39 (CI: 0.17-0.91). При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей с учетом гендерной принадлежности, клинических вариантов и степени тяжести течения заболевания статистически значимых различий выявлено не было.

Не обнаружено статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей между группами больных РС и здоровых индивидов татарской этнической принадлежности.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs3212227 гена IL12В с

рассеянным склерозом

Интерлейкин 12 (IL-12) - один из наиболее важных регуляторов клеточного иммунного ответа. Некоторые авторы сообщают о связи повышенного содержания субъединицы р40 IL-12 в СМЖ с развитием воспаления и увеличением деградации миелина в ЦНС при РС [Fassbender, 1998; Van Veen, 2001]. IL-12 может также усугублять нейродегенерацию путем прямого активирующего действия на микроглию [Karp, 2000; Columbus, 2005]. Сведения о функциональном эффекте полиморфного локуса rs3212227 остаются противоречивыми.

Результаты типирования по полиморфному локусу rs3212227 (+1159А>С) гена IL12В у здоровых и больных РС лиц представлены в таблице 1. В группе русских женщин, больных РС с ремиттирующим типом течения, частота генотипа IL12B+1159*A/*A отличается (р=0.005) от таковой в контрольной группе; показатель отношения шансов по генотипу IL12B+1159*A/*A составил 0.47 (CI: 0.28-0.78). Таким образом, у русских женщин, носительниц генотипа IL12B+1159*А/*А понижен риск развития ремитирующего типа течения РС. При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей с учетом степени тяжести течения заболевания статистически значимых различий не выявлено.

У этнических татар ассоциаций данного полиморфного локуса гена IL12B с РС не выявлено.

Анализ ассоциаций полиморфных локусов rs1800629 гена TNF и rs909253 гена LTA с рассеянным склерозом

TNF-а (фактор некроза опухолей альфа) и LTA (лимфотоксин альфа) - ключевые воспалительные цитокины в патогенезе РС. Как было показано в исследованиях in vitro, эти цитокины индуцируют апоптоз олигодендроцитов. TNF-a вызывает демиелинизацию оптического нерва in vivo и вместе с LTA локализуется в активных бляшках (очагах демиелинизации) при РС. Уровень TNF-a в спинномозговой жидкости коррелирует с прогрессией заболевания. В мононуклеарных клетках, выделенных из СМЖ больных РС, повышен уровень мРНК этих цитокинов по сравнению с таковым у больных другими воспалительными неврологическими заболеваниями и здоровых лиц [Fernandes-Filho, 2002; Kamali-Sarvestani, 2007]. Сведения о влиянии различных аллельных вариантов генов TNF и LTA на уровень экспрессии TNF-а и LTA неоднозначны.

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1800629 (-308G>A) гена TNF у здоровых и больных РС индивидов представлены в таблице 1. Следует отметить, что у татар, больных РС, частота аллеля TNF-308*А повышена (р=0.046), а частоты аллеля TNF-308*G (р=0.046) и генотипа TNF-308*G/*G понижены (р=0.038). Таким образом, маркером повышенного риска РС у татар является аллель TNF-308*A (OR=1.49, CI: 1.02-2-17), а маркером пониженного риска - генотип TNF-308*G/*G (OR=0.64, CI:0.42-0.97) и аллель TNF-308*G (OR=0.67, CI:0.46-0.97). При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей с учетом гендерной принадлежности, типов течения и степени тяжести заболевания статистически значимых различий не выявлено.

У этнических русских не обнаружено ассоциаций полиморфного локуса Ц308 G>A гена TNF с рассеянным склерозом.

По распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса +252 A>G (rs909253) гена LTA группы больных РС и здоровых лиц не отличаются (табл. 1). Статистически значимые различия обнаруживаются в результате анализа данных с учетом половой принадлежности. Так, полиморфный локус +252G>A гена LTA ассоциирован с РС у женщин татарской этнической принадлежности: шансы развития заболевания повышены у носительниц генотипа LTA+252*A/*G (р=0.001, OR=2.63, CI:1.54-4.54) и понижены у носительниц генотипа LTA+252*A/*A (p<0.001, OR=0.37, CI:0.22-0.63). При сравнении по частотам генотипов и аллелей групп, дифференцированных с учетом клинических вариантов и степени тяжести течения заболевания, статистически значимых различий не выявлено.

Не обнаружено ассоциаций полиморфного локуса +252A>G гена LTA с рассеянным склерозом у русских.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs767455 гена TNFRSF1A с рассеянным склерозом

Ген рецептора первого типа к TNF-α (TNFRSF1A) локализован на хромосоме 12 (12p13.2). TNF-a, взаимодействуя с рецептором TNF-R1, может активировать и выживание, и пролиферацию, и апоптоз клеток. В опытах на модельных животных показано, что TNF-R1 вовлечен в процессы демиелинизации и воспаления [Probert, 2000; De Jager, 2009]. У мышей с нокаутом гена этого рецептора экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит не развивался [Suvannavejh, 2000]. С уровнем экспрессии гена TNFRSF1A у человека ассоциирован полиморфный локус +36A>G (rs767455) этого гена [Bridges, 2002; Mavri, 2007].

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса rs767455 (+36A>G) гена TNFRSF1A у больных РС и группы сравнения представлены в таблице 1. У больных РС татар по сравнению с группой контроля наблюдается снижение частот генотипа TNFRSF1A+36*A/*A (р<0.001, OR=0.45, CI: 0.29-0.69 ) и аллеля TNFRSF1A+36*A (р<0.001, OR=0.63, CI: 0.48-0.83), а также повышение частот генотипа TNFRSF1A+36*A/*G (р=0.033, OR=1.52, CI: 1.04-2.23) и аллеля TNFRSF1A+36*G (р<0.001, OR=1.6, CI: 1.22-2.1). Из этого следует, что у татар полиморфный локус +36A>G гена TNFRSF1A ассоциирован с РС. При этом данная ассоциация наблюдается вне связи с типами течения РС, тяжестью и гендерными особенностями.

У этнических русских не обнаружено ассоциаций полиморфного локуса +36A>G гена TNFRSF1A с рассеянным склерозом.

2. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к рассеянному склерозу

Нами проведен анализ взаимодействий аллельных вариантов генов IL1B (Ц511T>C), IL1R1 (+3653T>C), IL1RN, (VNTR), CASP1 (-877С>Т), IL6 (-572G>C), IL10 (-627C>A), IL12B (+1159A>С), TNF (Ц308G>A), LTA (+252A>G), TNFRSF1A (+36Т>С) в детерминации риска развития РС с помощью программы MDRаv.а2.0аbetaа6 (Multifactorial Dimensionality Reduction). Метод MDR позволил продемонстрировать сложный характер межгенных взаимодействий анализируемых полиморфных локусов генов-кандидатов РС. Для выбора моделей использовался алгоритм полного поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации аллельных вариантов в отношении риска развития заболевания, и алгоритм принудительного поиска (Forced search algorithm). Выборки были разделены с учетом этнической и гендерной принадлежности.

Рис. 1. Графическое отображение межгенных взаимодействий при рассеянном склерозе.

Примечание: на вершинах многогранника представлена информационная ценность каждого маркера в отдельности, на ребрах - информационная ценность взаимодействия пары маркеров.

Рис. 2. Графическое отображение межгенных взаимодействий генов кластера IL1и CASP1 при рассеянном склерозе.

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

У русских женщин выявлен значительный синергизм между аллельными вариантами генов IL6 и TNF, менее выраженный - между аллельными вариантами генов TNF и TNFRSF1A, у мужчин показано наличие синергизма между генами LTA и TNFRSF1A, IL12 и LTA (рис. 1). У этнических татар в группе больных мужского пола прослеживается эффект синергизма между аллельными вариантами генов IL12В и LTA, TNFRSF1A и TNF, IL10 и TNFRSF1A, а в группе больных женщин выявлен синергизм между аллельными вариантами генов LTA и TNF, IL10 и IL12В, IL6 и IL12В (рис. 1). Кроме того, был проведен отдельный анализ взаимодействия аллельных вариантв генов, входящих в генную сеть IL1 (IL1B, IL1RN, IL1R1, CASP1). У этнических татар обнаружен значительный синергизм взаимодействия между полиморфными локусами генов IL1B и CASP1 (рис. 2).

Таблица 2

Основные межгенные взаимодействия, определяющие развитие предрасположенности к рассеянному склерозу

Этнос	Пол	Оптимальная модель межгенного взаимодействия	ТВА1	CVC2	P value
Русские	женщины	IL6 - TNF	0.5894	10/10	0.0023
	женщины	IL1RN - CASP1 - IL1B - IL1R1	0.7486	10/10	<0.0001
	мужчины	IL1RN - CASP1 - IL1B - IL1R1	0.7708	10/10	<0.0001
Татары	женщины	IL12 - IL10 - LTA - TNFRSF1A	0.7770	9/10	<0.0001
	женщины	IL1RN - CASP1 - IL1B - IL1R1	0.7499	10/10	<0.0001
	мужчины	IL12 - LTA	0.6203	10/10	0.0022
	мужчины	IL1RN - CASP1 - IL1B - IL1R1	0.7454	10/10	<0.0001

Примечание. 1ТBA - testing balanced accuracy (cбалансированная точность), 2CVC - cross validation consistency (перекрестная проверка достоверности).

С помощью программы MDR, учитывая коэффициенты перекрестной проверки CV (cross-validation) и ошибки предсказания, построены оптимальные модели межгенных взаимодействий при сравнении групп больных РС и контроля (табл. 2). Оптимальная модель межгенных взаимодействий, отображающая предрасположенность к РС у мужчин и женщин в двух этнических группах, представлена комбинацией полиморфных локусов генов IL1RN, CASP1, IL1B и IL1R1. Кроме того, риск развития РС у русских женщин описывается моделью взаимодействия полиморфных локусов генов IL6 и TNF. Риск развития РС у женщин татарской этнической принадлежности описывается моделью взаимодействия полиморфных локусов генов IL12, IL10, LTА, TNFRSF1A. В то же время у мужчин татар в оптимальную модель ген-генного взаимодействия при РС входят полиморфные локусы двух генов - IL12 и LTA.

Таким образом, полученные результаты в целом показали, что в основе генетической детерминации рассеянного склероза может лежать сложный и многоуровневый характер взаимодействий между аллельными вариантами генов-кандидатов.

Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

Установлено, что полиморфные локусы генов IL1B (-511T>C), IL1R1 (+3653T>C), IL6 (-572G>C) и IL10 (-627C>A) ассоциированы с рассеянным склерозом у русских вне связи с типом, тяжестью течения заболевания и гендерными особенностями. Маркерами повышенного риска развития заболевания являются генотипы IL1B511*T/*T, IL1R1+3653*T/*T и IL6572*G/*G, а маркерами пониженного риска - генотипы IL1B511*T/*C, IL1R1+3653*С/*C, IL6572*G/*С и IL10627*А/*А.
Выявлено, что полиморфные локусы генов TNF (-308G>A), TNFRSF1A (+36A>G) ассоциированы с рассеянным склерозом у татар вне связи с типом, тяжестью течения заболевания и гендерными особенностями. Маркером повышенного риска развития заболевания является генотип TNFRSF1A+36*A/*G, а маркерами пониженного риска - генотипы TNFRSF1A+36*A/*A и TNF308*G/*G.
Выявлены ассоциации полиморфных локусов генов IL12B (+1159A>C) и LTA (+252А>G) с рассеянным склерозом у женщин. Установлено, что у русских женщин маркером пониженного риска заболевания является генотип IL12B+1159*A/*A; у женщин татарской этнической принадлежности шансы развития заболевания повышены у носительниц генотипа LTA+252*A/*G и понижены у носительниц генотипа LTA+252*A/*A.
Обнаружено, что полиморфный локус -877С>T гена CASP1 ассоциирован с вторично-прогрессирующим типом течения рассеянного склероза у татар; генотип CASP1-877*С/*Т является маркером повышенного, а генотип CASP1-877*С/*С - маркером пониженного риска заболевания.
Взаимодействия аллельных вариантов генов IL1RN (VNTR), CASP1(-877C>T), IL1B (-511T>C) и IL1R1(+3653T>C) вносят вклад в формирование риска развития рассеянного склероза вне связи с гендерными или этническими особенностями. В развитии рассеянного склероза у русских женщин играет роль взаимодействие аллельных вариантов генов IL6 (-572G>C) и TNF (-308G>A), у женщин татарской этнической принадлежности - аллельных вариантов генов IL12 (+1159A>C), IL10 (-627C>A), LTА (+252A>G), TNFRSF1A (+36A>G), у мужчин татарской этнической принадлежности - аллельных вариантов генов IL12 (+1159A>C) и LTА (+252A>G).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е., Заплахова О.В., Гумерова З.Б., Аглямова-Хусаинова А.Н., Магжанов Р.В. История изучения рассеянного склероза // История науки и техники. - 2005. - №3. - С. 99-102.
Мустафина О.Е., Бахтиярова К.З., Михайлова А.М., Туктарова И.А., Хусаинова А.Н., Насибуллин Т.Р., Магжанов Р.В. Анализ ассоциаций аллельных вариантов генов аполипопротеина Е и интерлейкина 1 бета с рассеянным склерозом в этнической группе татар // Генетика. - 2008. - Т.44.- №3. - С. 407-413.
Хусаинова А.Н., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Заплахова О.В., Кусярбаева А.Р., Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Роль аллельных вариантов генов цитокинов в формировании наследственной предрасположенности к рассеянному склерозу // Цитокины и воспаление. - 2011. - Т.4. - С.95-104.
Михайлова А.М., Аглямова-Хусаинова А.Н., Бахтиярова К.З, Магжанов Р.В., Хуснутдинова Э.К. Мустафина О.Е. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров гена интерлейкина 1 с рассеянным склерозом в популяции татар / Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2005. - Т.4. - №5. - С.231.
Михайлова А.М., Бахтиярова К.З, Аглямова-Хусаинова А.Н., Магжанов Р.В., Судомоина М.А., Фаворова О.О., Мустафина О.Е. Поиск ассоциаций полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов рассеянным склерозом / Материалы XIV всероссийской конференции Нейроиммунология // Нейроиммунология. - 2005. -Т.3.- №2. - С.145.
Михайлова А.М., Мустафина О.Е., Бахтиярова К.З, туктарова И.А., Аглямова-Хусаинова А.Н., Магжанов Р.В., Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров в кодонах 112 и 158 гена аполипопротеина Е с рассеянным склерозом / Материалы международной конференции, посвященной 115-летию со дня рождения Н.И. Вавилова // Вавиловские чтения. - 2005. - Выпуск 1. - С. 39-47.
Anna Mikhailova, Olga Mustafina, Klara Bahtyarova, Alvina Agljamova-Khusainova, Rim Magzhanov, Elza Khusnutdinova. Association of the interleukin-1 genetic polymorphism and multiple sclerosis risk in Bashkortostan // Human genome meeting. - Kyoto, 2005. - P. 129.
Mikhailova A.M., Mustafina O.E., Bahtyarova K.Z., Agljamova-Khusainova A.N., R. V. Magzhanov, E. K. Khusnutdinova. Interleukin-1b gene and receptor antagonist gene polymorphisms in patients with multiple sclerosis // European human genetics conference. - Prague, 2005. - P.256.
Михайлова А.М., Бахтиярова К.З., Хусаинова А.Н., Туктарова И.А., Ворончихина С.А., Волкова Л.И., Магжанов Р.В., Мустафина О.Е. Полиморфизм гена аполипопротеина Е и риск рассеянного склероза // Материалы Международной конференции Генетика в России и мире. - 2006. - С. 127.
Михайлова А.М., Хусаинова А.Н. Анализ ассоциаций полиморфизма гена аполипопротеина Е с рассеянным склерозом // Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей Человек и его здоровье. - 2006. - С. 217-218.
A.M. Mikhailova, O.E. Mustafina, K.Z. Bahtyarova, A.N. Agljamova-Khusainova, R. V. Magzhanov, E. K. Khusnutdinova. Association of the apolypoprotein E genetic polymorphism and multiple sclerosis risk in Bashkortostan // European Journal of Human Genetics. - 2006. - P.317.
Мустафина О.Е., Бахтиярова К.З., Хусаинова А.Н., Бикмеева А.М., Туктарова И.А., Магжанов Р.В. Молекулярно-генетическое иcследование рассеянного склероза // IX Всероссийский съезд неврологов : Сб. науч. трудов.- 2006.- С. 305.
Хусаинова А.Н., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Полиморфизм генов цитокинов у больных рассеянным склерозом // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика-наука XXI века. - 2007. - С.135
А.Н. Хусаинова, Т.Р. Насибуллин, И.А. Туктарова, О.В. Заплахова, К.З. Бахтиярова, О.Е. Мустафина. Полиморфизм генов цитокиновой сети и предрасположенность к рассеянному склерозу / Материалы российского конгресса с международным участием Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное // Научно-практический журнал Клинико-лабораторный консилиум. - 2010. - № 2-3 (33-34). - С.137.
Хусаинова А.Н., Туктарова И.А., Заплахова О.В., Насибуллин Т.Р., Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Молекулярно-генетическое иcследование рассеянного склероза в республике Башкортостан / Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2010. - С.189.
A.Khusainova, T.Nasibullin, I.Tuktarova, O.Zaplakhova, R. Magzhanov, K. Bahtyarova, O. Mustafina The polymorphism of cytokine genes in patients with multiple sclerosis // European Journal of Human Genetics. - 2010. - P.251.
Хусаинова А.Н., Насибуллин Т.Р. Туктарова И.А., Михайлова А.М., Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Молекулярно-генетическое исследование рассеянного склероза: анализ ассоциаций с полиморфными маркерами генов-кандидатов // Материалы XVIII российского национального конгресса Человек и лекарство. Ц2011. - С.357.
Хусаинова А.Н., Туктарова И.А., Заплахова О.В, Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Анализ ассоциаций полиморфных локусов генов цитокиновой сети с развитием рассеянного склероза. // Материалы II всероссийской научно-практической конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Ц2011. - С.113.
A.N.Khusainova, T.R.Nasibullin, I.A.Tuktarova, A.M.Mikhailova. O.V.Zaplakhova, R.V. Magzhanov, K.Z. Bahtijarova, O.Е. Mustafina. Cytokine genes polymorphism and susceptibility to multiple sclerosis in the republic of Bashkortostan // European Journal of Human Genetics. - 2011. - P.306.
Хусаинова А.Н., Заплахова О.В. Исследование молекулярно-генетических основ предрасположенности к рассеянному склерозу // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика-наука XXI века. Ц2011. - С.141.
Туктарова И.А., Насибуллин Т.Р., Хусаинова А.Н., Заплахова О.В., Бахтиярова К.З., Мустафина О.Е. Полиморфизм генов цитокиновой сети и риск развития рассеянного склероза / Материалы XVIII Всероссийской конференции Нейроиммунология. Рассеянный склероз // Нейроиммунология. - 2011. - Т.IX(3-4). - С. 158.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГЭБ

РС

ЦНС

ЭАЭ

EDSS

IL-1

IL1-RN

IL-1R1

LTA

TNF-R1

TNF-а

VNTR

гематоэнцефалический барьер

рассеянный склероз

центральная нервная система

экспериментальный аллергический энцефаломиелит

расширенная шкала степени инвалидности РС (Expanded Disability Status Scale)

интерлейкин-1 бета

антагонист рецептора интерлейкина-1

рецептор интерлейкина 1 типа 1

имфотоксин альфа или фактор некроза опухолей (TNF)

рецептор типа 1 к TNF-а или член 1А суперсемейства рецепторов к TNF (TNFRSF1A - tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A).

фактор некроза опухолей альфа

варьирующее число тандемных повторов (variable number tandem repeats)

95% доверительный интервал (confidence interval)

отношение шансов (odds ratio)

ХУСАИНОВА АЛЬВИНА НАИЛЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА: ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Подписано в печать 28.04.12 г. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 676.

Гарнитура TimesNewRoman. Отпечатано в типографии

ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ ИП ВЕРКО.

Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4,

т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog