Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

КАРУНАС АЛЕКСАНДРА СТАНИСЛАВОВНА 

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Уфа Ц 2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор		Мустафина Ольга Евгеньевна Учреждение Российской академии  наук Институт биохимии и генетики УН - РАН
доктор биологичеких наук, профессор		Карпухин Александр Васильевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН
доктор медицинских наук, профессор		Петрин Александр Николаевич Московский государственный медико-стоматологический  университет МЗ РФ
Ведущая организация:		Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

 

Защита диссертации состоится л___ марта  2012 г. в л___ часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и генетики УН - РАН по адресу: 450054, Уфа,  просп. Октября, 71. ИБГ УН - РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (г.Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом - на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УН - РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html,

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан  л ___ _______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.М.  Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аллергические заболевания (АЗ) являются одними из наиболее распространенных хронических заболеваний, в основе которых лежит повышенная чувствительность организма к воздействию некоторых факторов внешней среды, которые принимаются им за потенциально опасные. По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными АЗ (World Allergy Organisation, Бронхиальная астма, аллергический ринит и атопический дерматит (атопическая триада) - три распространенных, взаимосвязанных между собой аллергических заболевания, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу.

Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором играют роль многие клетки и клеточные элементы (GINA, 2010). БА относится к числу наиболее распространенных, тяжелых и инвалидизирующих хронических заболеваний, значительно изменяющих образ и качество жизни больных. В мире насчитывается около 300 млн. больных БА, распространенность данной патологии в разных странах варьирует от 1 до 18% (GINA, 2010). Согласно данным Российского респираторного общества, в России распространенность БА среди детей составляет от 5,6 до 12,1%, среди взрослых - 5,6-7,3%, а общее количество больных БА в России приближается к 7 млн. (Глобальная стратегия по лечению и профилактике бронхиальной астмы. Пересмотр 2006 г.; ФЦП РФ Бронхиальная астма на 2011-2015 годы). Аллергический ринит (АР) - заболевание, характеризующееся IgE-опосредованным воспалением, развивающимся в результате попадания аллергенов на слизистую оболочку носа. В мире АР страдают 10-30% взрослых и до 40% детей (Pawankar et al., 2011), в России распространенность АР в различных регионах колеблется от 18 до 38% ( Симптомы, развивающиеся при AР, не являются угрожающими для жизни, однако они создают значительный дискомфорт, резко снижают работоспособность и качество жизни человека. Поздняя диагностика  АР и несвоевременное назначение патогенетической терапии могут привести к появлению осложнений и развитию БА. Атопический дерматит (АД) - хроническое воспалительное заболевание кожи, которое чаще всего является первым проявлением аллергии у ребенка, может продолжаться в зрелом возрасте и приводит к физической и эмоциональной дезадаптации пациента. Почти у половины детей на фоне АД в последующем формируется бронхиальная астма или аллергический ринит. Распространенность АД у детей составляет 15-30%, у взрослого населения - 2-10% (Pawankar et al., 2011).

Аллергические заболевания имеют сложную многофакторную природу и развиваются при взаимодействии факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Во всем мире ведется активный поиск генов, отвечающих за формирование предрасположенности к АЗ, что связано как с несомненной актуальностью изучения факторов риска развития АЗ, так и с появлением новых возможностей генетических исследований. К настоящему времени выполнены анализы ассоциации БА и других АЗ с полиморфными вариантами сотен генов. Проведено более 20 полногеномных анализов сцепления БА, атопии, АР и АД. Выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АЗ, идентифицированы позиционно-клонированные гены для БА (ADAM33, DPP10, MS4A2 (FCERIB), GPR154 (GPRA), PHF11, HLA-G, CYFIP2) и АД (COL29A1) (Van Eerdewegh et al., 2002; Allen et al., 2003; Zhang et al., 2003; Laitinen et al., 2004; Nicolae et al., 2005; Soderhall et al., 2007).

Одним из наиболее перспективных современных методов изучения сложных признаков является метод полногеномного анализа ассоциаций (Genome-wide Association Studies, GWAS), в котором проводят генотипирование и тестирование ассоциации с заболеванием сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) (Manolio et al., 2010). При первом GWAS БА обнаружена ассоциация ОНП, локализованных в области 17q12-q21 (гены ORMDL3 и GSDMB), с детской астмой в Германии и Англии (Moffat et al., 2007). За последние годы GWAS БА проведены в различных популяциях мира, обнаружены новые гены, ассоциированные с развитием БА у индивидов европейского происхождения - DENND1B, PDE4D, RAD50, IL1RL1/IL18R1, HLA-DQ, IL33, IL6R, SMAD3 и IL2RB; африканского происхождения - ADRA1B, PRNP и DPP10; мексиканцев - TLE4, корейцев - CTNNA3  ( gov/GWAStudies/). Опубликованы результаты двух GWAS для АД, выявивших ассоциацию с ОНП области 11q13.5 у индивидов европейского происхождения  (Esparza-Gordillo et al., 2009), и ОНП, локализованными в областях 5q22.1, 20q13.33 и 1q21.3 (FLG), у китайцев (Sun et al., 2011).

В целом, генетические исследования показали, что в этиопатогенезе АЗ принимает участие множество функционально взаимосвязанных генов. Идентифицировано более 150 генов-кандидатов АЗ, однако только около 40 из них ассоциированы с АЗ более чем в пяти независимых исследованиях (Dvila et al., 2009; Holloway et al., 2010; Meng et al., 2010; Michel et al., 2010; Boguniewicz et al., 2011; March, 2011). Среди них гены цитокинов (IL4, IL4RА, IL12B, IL13, TNFA, CCL5), главного комплекса гистосовместимости (HLA-DRB1), 2-адренорецепторов (ADRB2), ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTP1 и GSTT1); гены, белковые продукты которых участвуют в распознавании консервативных структур микроорганизмов (CD14, TLR2, TLR4, CD14, CARD15), в регуляции барьерной функции эпителия (FLG, SPINK5), позиционно-клонированные гены (ADAM33, DPP10, GPR154), гены ORMDL3 и GSDMB, обнаруженные при GWAS.

В России несколькими группами исследователей проводилось изучение полиморфных вариантов генов цитокинов и генов системы биотрансформации у больных АЗ (Иващенко и др., 2000-2002; Ляхович и др., 2002; Макарова и др., 2002, 2011; Фрейдин и др., 2002, 2003, 2007, 2010; Казначеев, 2005; Келембет и др., 2008; Полоников и др., 2006; 2009; Тюменцева, 2011). Проведен GWAS АЗ у русских жителей Западной Сибири: выявлены новые гены-кандидаты детской БА, АЗ, АР и атопической сенсибилизации (YWHAB, PPP1R12B, KCNE4, BAT1, MAGI2, ACPL2) (Фрейдин и др., 2011).

Несмотря на многочисленность генетических исследований АЗ, полученные результаты противоречивы, плохо воспроизводятся в последующих работах и характеризуются наличием выраженных межэтнических различий. Широкая вариабельность клинических проявлений АЗ свидетельствует о необходимости изучения как общих генетических факторов риска развития АЗ, так и специфических факторов, предрасполагающих к определенным клинико-патогенетическим вариантам течения АЗ. В связи с этим актуальной является идентификация этноспецифических факторов риска развития АЗ - БА, АР, АД и их сочетанного проявления, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболеваний и разрабатывать профилактические мероприятия с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.

На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Комплексный анализ генетической предрасположенности к развитию трех распространенных аллергических заболеваний - бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита.

Задачи исследования

1. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов-кандидатов аллергических заболеваний - цитокинов (IL4, IL4RA, IL10, IL13, CCL11, TNFA), дизинтегрина и металлопротеазы 33 (ADAM33), ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
2. Провести анализ частоты встречаемости мутаций гена профилаггрина (FLG) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
3. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов и мутаций генов с предрасположенностью к различным клинико-патогенетическим вариантам течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
4. Провести полногеномный анализ ассоциации 610000 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием бронхиальной астмы с учетом этнической принадлежности индивидов и тяжести течения заболевания.
5. Провести исследование ассоциированных с бронхиальной астмой по данным полногеномного анализа полиморфных локусов на расширенных выборках больных бронхиальной астмой, аллергическим ринитом и атопическим дерматитом.
6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию различных клинико-патогенетических вариантов течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
7. Идентифицировать маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита и сочетанных форм аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Научная новизна

Впервые молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности проведено с использованием двух основных подходов, применяемых в настоящее время для поиска генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям - исследования генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциаций. Проведен анализ ассоциации полиморфных вариантов 6 генов цитокинов (IL4, IL13, IL4RA, IL10, TNFA, CCL11), 7 генов системы ферментов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2) и гена ADAM33 с развитием БА, АР, АД и сочетанных форм аллергопатологии у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Выявлены маркеры риска развития различных клинико-патогенетических вариантов аллергических заболеваний. Установлена роль мутаций гена профилаггрина в развитии атопического дерматита и других АЗ на фоне АД.

Впервые проведен полногеномный анализ ассоциации 610а000 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием БА у индивидов русской, татарской и башкирской этической принадлежности. Идентифицированы полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21 и ассоциированные с развитием БА с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7). Обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами, локализованными в областях 9р13 и 7р12.3. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития бронхиальной астмы у русских, татар и башкир.

Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена профилаггрина, гена ADAM33 и гена гасдермина В, предрасполагающих к развитию различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Научно-практическая значимость работы

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к аллергическим заболеваниям - бронхиальной астме, атопическому дерматиту и аллергическому риниту. На основании результатов данной работы разработан Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Патент на изобретение № 2324937. Приоретет изобретения 27.11.2006. Зарегистрирован 20 мая 2008 г. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития АЗ и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Развитие аллергических заболеваний у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов IL4 и ADAM33, у татар - c полиморфными вариантами генов NAT2, IL13 и TNFA, у башкир -  с полиморфными вариантами генов CCL11 и ADAM33. Маркерами повышенного риска тяжелого течения бронхиальной астмы у русских являются генотип А/А полиморфного локуса rs44707 гена ADAM33, у татар - генотип T/T rs1799929 гена NAT2, у башкир  - генотип A/A rs1800629 гена TNFA.
2. Развитие атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита с сопутствующим атопическим дерматитом в объединенной выборке больных и во всех этнических группах ассоциировано с носительством мутации c.2282del4 в гене профилаггрина FLG. Полиморфный локус rs1800629 гена TNFA ассоциирован с развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления в объединенной выборке больных.
3. Полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21, ассоциированы с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7) с бронхиальной астмой и тяжестью ее течения. Наиболее высокий уровень ассоциации БА установлен с полиморфным локусом rs7216389 в гене гасдермина В GSDMB (p=1,01x10-7). Полиморфные локусы, локализованные в областях 9р13 в гене бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1 и 7р12.3 в гене IGFBP3, кодирующем белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста, ассоциированы с развитием и тяжестью течения бронхиальной астмы.
4. Этноспецифическими маркерами риска развития бронхиальной астмы, идентифицированными при полногеномном анализе ассоциации у русских,  являются полиморфные варианты гена муцина 19 MUC19 (12q12); у татар - полиморфные локусы, расположенные в области 15q26.3, у башкир - полиморфные варианты гена субъединицы AMPA - ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (5q33).
5. Полиморфные локусы гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) ассоциированы с развитием собственно бронхиальной астмы и БА с сопутствующими аллергическим ринитом и атопическим дерматитом.  Исследованные ДНК-локусы гена GSDMB не ассоциированы с развитием атопического дерматита и аллергического ринита, не сопровождаемых развитием бронхиальной астмы.
6. Межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов GSDMB и IL4 детерминирует развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом в объединенной выборке больных. Специфические комбинации полиморфных вариантов исследованных генов ассоциированы с развитием различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. 

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на российских и международных конференциях: XVII Всемирном конгрессе по астме (Санкт-Петербург, 2003), V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; Ростов-на-Дону, 2010), 14-м, 16-м и 21-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2004; Санкт-Петербург, 2006; Уфа, 2011), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2011), I и II школах-семинарах Биомика - наука XXI века (Уфа, 2007; 2011), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии (Курск, 2011), Санкт-Петербургском научном форуме Наука и общество. Физиология и медицина XXI века (Санкт-Петербург, 2011), конференциях Европейского общества генетики человека (Мюнхен, 2004; Прага, 2005; Ницца, 2007; Барселона, 2008; Вена, 2009; Гетебург, 2010; Амстердам, 2011), 7-ом Балканском конгрессе по генетике человека (Скопье, 2006), конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Гетебург, 2007; Барселона, 2008; Варшава, 2009; Стамбул, 2011), конгрессах Европейского респираторного общества (Мюнхен, 2006; Стокгольм, 2007; Берлин, 2008; Вена, 2009; Барселона, 2010; Амстердам, 2011), Международном  конгрессе по геному человека (Дубай, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 работ, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, из них 5 из международной базы цитирования, две главы в монографиях и один патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 458 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 73 таблицами. Список литературы включает 725 источников.

Конкурсная поддержка исследования

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Европейской Комиссии в рамках проекта GABRIEL (контракт № LSHB-CT-2006-018996) и Минобрнауки России (госконтракт № 02.434.11.7115 от 18.08.2006, госконтракт №П601 от 18.05.2010).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал для исследования

Основная группа исследования включала 1000 неродственных индивидов (620 мужского пола, 380 женского пола) с различными аллергическими заболеваниями (БА, АР и АД) в возрасте от 1 года до 67 лет (средний возраст 20,45 лет). Обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета, пульмонологического и аллергологического отделений городской клинической больницы № 21 г. Уфы, аллергологического отделения Республиканской клинической детской больницы г.Уфы. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и инструментальных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний. В зависимости от наличия того или иного АЗ выборка больных была разделена на следующие группы: 1) общая выборка (ОВ) больных БА, в которую входили все пациенты с установленным диагнозом Бронхиальная астма; 2) ОВ больных АР - все пациенты с диагнозом Аллергический ринит; 3) ОВ больных АД - все пациенты с диагнозом Атопический дерматит. Выборка больных была также подразделена на группы в зависимости от наличия и сочетания различных АЗ: 1) больные с сочетанными клиническими проявлениями БА, АР и АД; 2) больные БА и АД (без проявлений АР); больные БА и АР (без АД); больные АР и АД (без БА); больные с клиническими проявлениями только БА (без АР и АД); больные  АР (без БА и АД); больные АД (без БА и АР). Сведения о численности и этнической принадлежности больных, входящих в различные клинико-патогенетические группы, представлены в табл. 1. В качестве контроля исследована группа, состоящая из 589 практически здоровых лиц (338 мужского пола, 251 женского пола) от 2 до 66 лет (средний возраст 24,01 года), не имеющих проявлений аллергических заболеваний (на момент осмотра и в анамнезе) и отягощенной наследственности по атопическим заболеваниям (212 русских, 152 татар, 124 башкир, 101 индивид метисного происхождения). Все участники исследования или их родители (у индивидов детского возраста) дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.

Таблица 1

Численность и этническая принадлежность пациентов,

входящих в различные клинико-патогенетические группы

№ группы	Группы больных	Объед. выборка	Русские	Татары	Башкиры	Метисы
1	Больные БА	186	71	38	30	47
2	Больные АР	95	37	9	2	47
3	Больные АД	166	56	42	8	60
4	Больные БА, АР и АД	164	60	32	10	62
5	Больные БА и АД	40	9	12	1	18
6	Больные БА и АР	248	85	57	31	75
7	Больные АР и АД	101	46	21	4	30
8	Общая выборка больных АЗ	1000	364	211	86	339
9	Общая выборка больных  БА (группы 1+4+5+6)	638	225	139	72	202
10	Общая выборка больных АР (группы 2+4+6+7)	608	228	119	47	214
11	Общая выборка больных АД (группы 3+4+5+7)	471	171	107	23	170

Методы исследования

ДНК выделяли из 5-8 мл периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew et al., 1984). Анализ полиморфных вариантов генов IL4, IL13, IL4RA, IL10, TNFA, CCL11, ADAM33, GSDMB и мутаций гена FLG (с.2282del4, p.Arg501Ter) осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле.

Генотипирование полиморфного локуса c.236-1199С>T (rs7216389) гена GSDMB проводили с использованием TaqManо SNP Genotyping Assays C__29062108_10 и TaqManо Genotyping Master Mix (УApplied BiosystemsФ) согласно протоколу фирмы-производителя. Исследование полиморфных локусов генов системы биотрансформации ксенобиотиков - CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTT1, GSTM1 и NAT2 выполняли при помощи биочипа, разработанного в лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии  им. В.А. Энгельгардта РАН (Глотов и др., 2005). Перечень исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов представлен в табл. 2.

Полногеномное генотипирование 610000 однонуклеотидных полиморфизмов у больных БА и в контрольной группе индивидов проводили на Illumina Platform c использованием Illumina Human610 quad array (лIllumina) в Национальном центре генотипирования в г. Эври (Франция) в рамках гранта Шестой рамочной программы Eвросоюза GABRIEL.

Таблица 2

Исследованные полиморфные локусы генов

Ген	№ rs	Изменение на уровне ДНК	Изменение на уровне белка	Ранее принятые обозначения
IL4	rs2243250	-590C>T (g.4782C>T)	-	-589 C>T
IL13	rs20541	c.431G>A	p.Arg144Gln	2044G>A (Arg130Gln)
IL4RA	rs1805010	c.223A>G	р.Ile75Val	Ile50Val
IL10	rs1800872	-627C>A (g.4433C>A)	-	-
TNFA	rs1800629	-308G>A (g.8156G>A)	-	-
CCL11	rs17809012	-384A>G (g.4758A>G)	-	-
ADAM33	rs2787095	c.255-191G>C	-	D-1, 6716G>C
	rs2485700	c.601-62A>G	-	G-1,7667A>G
	rs44707	c.2162+427C>A	-	ST+4, 11434C>A
	rs2280091	c.2213A>G	p.Met738Thr	T1,12433A>G
CYP1A1	rs1799814	c.1382C>A	p.Thr461Asn	4887C>A, 2452C>A
	rs1048943	c.1384A>G	p.Ile462Val	4889A>G, 2454A>G
	rs4646903	g.1759T>C	-	6235T>C, 3798T>C
CYP2D6	rs3892097	c.353-1G>A	-	1934G>A, 1846G>A
CYP2C9	rs1799853	c.430C>T	p.Arg144Cys	-
	rs1057910	c.1075A>C	p.Ile359Leu	-
CYP2C19	rs4244285	c.681G>A	-	-
NAT2	rs1799929	c.481C>T	-	-
	rs1799930	c.590G>A	p.Arg197Gln	-
	rs1799931	c.857G>A	p.Gly286Glu	-

Статистическая обработка

Математическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), Statistica v.6.0. (StatSoft), PLINK 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/ index.shtml).

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий χ2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982). Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview 4.2 (Barrett, 2005). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011).

Анализ ассоциации 610000 ОНП выполняли с помощью пакета программ PLINK 1.06. Провели строгий контроль качества образцов ДНК и прогенотипированных маркеров. Из анализируемой выборки исключили дуплицированные образцы ДНК, а также образцы ДНК, в которых не прошло генотипирование более чем 5% маркеров и образцы ДНК, у которых выявлено несоответствие между обозначенным и установленным при генотипировании полом. Из дальнейшего анализа также исключили ОНП, по которым не прошло генотипирование более чем у 5% индивидов, ОНП с частотой редкого аллеля менее 0,01 и ОНП со статистически значимым отклонением (p<0,001) от равновесия Харди-Вайнберга. Полногеномный уровень значимости p<4,79x10-7, при котором ожидаемая доля ложноположительных результатов не превышает 5% (5% false discovery rate), определили с использованием функции q value в среде программирования R (www.r-project.org) (Benjamini, Hochberg, 1995; Storey, Tibshirani, 2003). Для учета популяционной гетерогенности исследуемых выборок больных и контроля провели Eigenstrat-анализ, позволяющий сделать поправку на наличие популяционной стратификации в полногеномном масштабе (Price et al., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных аллергическими заболеваниями и индивидов контрольной группы

Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов

с развитием аллергических заболеваний

Среди значительного количества генов-кандидатов АЗ особое место занимают гены цитокинов, участвующих в модулировании иммунного ответа практически на всех стадиях аллергического воспаления. Нами проведено изучение полиморфных вариантов генов интерлейкина 4, 10, 13, -цепи рецептора интерлейкина 4, фактора некроза опухолей и эотаксина у больных АЗ и индивидов контрольной группы. Выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса гена IL4 (rs2243250, Ц590C>T) между контрольными группами русских и башкир, русских и татар, а также полиморфного локуса гена IL10 (rs1800872, -627С>A) между русскими и башкирами, в связи с чем анализ ассоциации данных полиморфных локусов проводился только с учетом этнической принадлежности индивидов.

При исследовании объединенной выборки больных АЗ и контроля установлено, что аллель А полиморфного локуса rs1800629 (-308G>A) гена  TNFA является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (р=0,036; OR=1,34 (CI95% 1,02-1,77)); бронхиальной астмы (p=0,02; OR=1,41 (CI95% 1,05-1,89)), АР (p=0,021; OR=1,41 (CI95% 1,05-1,9)); БА, сочетанной с АР (p=0,014; OR=1,55 (CI95% 1,08-2,2)) и БА с АД (p=0,045; OR=1,88 (CI95% 1,01-3,51)). Маркером повышенного риска развития БА с сопутствующим АР также является аллель A полиморфного локуса rs20541 (p.Arg144Gln) гена IL13 (p=0,037; OR=1,3 (CI955 1,02-1,66)).

При анализе ассоциации полиморфных локусов генов цитокинов с учетом этнической принадлежности индивидов установлено, что у русских развитие АЗ ассоциировано с полиморфным локусом  rs2243250 (Ц590C>T) гена IL4. Генотип Т/Т является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,029; OR=4,17 (CI95% 1,26-13,81)), БА (p=0,0088; OR=4,97 (CI95% 1,47-16,81)), АР (p=0,011; OR=4,82 (CI95% 1,42-16,3)) и их сочетанного проявления (р=0,0086; OR=5,78 (CI95% 1,56-21,04)).

У индивидов татарской этнической принадлежности выявлена ассоциация аллеля rs20541*A гена IL13 с развитием АР (p=0,022; OR=1,66 (CI95% 1,07-2,55)) и сочетанного проявления БА и АР (p=0,039; OR=1,72 CI95% 1,03-2,89)). Аллель A полиморфного локуса rs1800629 (-308G>A) гена TNFA является маркером повышенного риска развития АД (p=0,039; OR=1,93 (CI95% 1,03-3,64))  и сопутствующих БА, АР и АД (p=0,003; OR=3,16 (CI95% 1,44-6,94)).

У индивидов башкирской этнической принадлежности обнаружена ассоциация аллеля  G полиморфного локуса rs1800629 (-384A>G) гена  CCL11 с развитием АЗ в целом (р=0,046; OR=1,7 (CI95% 1,01-2,86)), БА (р=0,053; OR=1,71 (CI95% 0,99-2,93)), АР (р=0,019; OR=2,01 (CI95% 1,12-3,61)) и их сочетанного проявления (р=0,026; OR=2,1 (CI95% 1,09-4,06)). Маркерами повышенного риска тяжелого течения БА у башкир являются аллель A  и генотип A/А полиморфного локуса rs1800629 (-308G>A) гена  TNFA (p=0,038; OR=2,62 (CI95% 1,03-6,63) и p=0,041; OR=4,82 (CI95% 0,96-24,31), соответственно.

В целом, проведенный нами анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с развитием АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности показал значимость исследованных генов в развитии БА, АР, АД и сочетанных форм аллергопатологии, а также наличие межэтнических различий обнаруженных ассоциаций.

Анализ ассоциации мутаций в гене FLG  с развитием

аллергических заболеваний

Мутации в гене профилаггрина, приводящие к прекращению выработки филаггрина, являются одним из основных факторов риска развития АД и других АЗ в различных популяциях. Следствием мутаций  является нарушение барьерной функции кожи, что облегчает проникновение аллергенов через эпидермис, инициирует развитие местной и системной аллергической реакции (Palmer et al., 2006; Smith et al., 2006; Elias et al., 2008; Akiyama et al., 2010; Bnnelykke et al., 2010; Mildner et al., 2010; Poniska et al., 2011; Zhang et al., 2008, 2011; Kezic et al., 2011). Нами проведено исследование двух распространенных в европейских популяциях мутаций гена FLG - с.2282del4 (c.2282delAGCT) и p.Arg501Ter (p.R501X), у больных АЗ и в контрольной группе. Мутация с.2282del4 в гене FLG в объединенной выборке больных АЗ выявлена у 7,85% больных в гетерозиготном состоянии и 0,41% больных - в гомозиготном. В контрольной группе 3,86% индивидов являлись гетерозиготными носителями этой мутации (рис. 1). Аллельная частота делеции с.2282del4 в ОВ больных АЗ составила 4,34%, в контроле - 1,93% (p=0,0033; OR=2,31 (CI95%1,3-4,09)). У больных с сочетанными проявлениями трех АЗ мутация с.2282del4  встречалась с частотой 5,0% (р=0,0069; OR=2,68 (CI95% 1,27-5,62)). С более высокой частотой мутация с.2282del4 определялась у больных с АД: в ОВ больных АД - 6,36% (p=1,4x10-5; OR=3,45 (1,91-6,24)), у больных с проявлениями только АД - с максимальной частотой 8,79% (р=1,72х10-7; OR=4,9 (CI95% 2,55-9,4)). В ОВ больных БА отмечалась тенденция повышения частоты встречаемости делеции по сравнению с контролем (3,22% vs 1,93%) (р=0,092), у больных с сопутствующими БА и АД частота мутации была выше - 6,25% (р=0,042; OR=3,39 (CI95% 1,19-9,67)).

Рис. 1. Частота мутации c.2282del4 в гене FLG в объединенной выборке  больных АЗ и в контрольной группе.

В ОВ больных АР частота мутации с.2282del4 составляла 3,71% (р=0,028; OR=1,96 (CI95% 1,06-3,6)), у больных с сочетанными АР и АД - 4,46%. У больных БА и АР без сопутствующего АД частота мутации статистически значимо не отличалась от контроля.

Среди исследованных этнических групп с наибольшей частотой мутация с.2282del4 определялась у татар - у 10,94% пациентов, больных АЗ (9,45% гетерозигот, 1,49% гомозигот). У русских и башкир она обнаружена в гетерозиготном состоянии у 8,61% и 7,14% пациентов с АЗ, соответственно. У татар аллельная частота мутации в ОВ больных АЗ составила 6,22%, в контроле - 1,65% (р=0,029; OR=3,96 (CI95% 1,18-13,28)). Статистически значимое повышение частоты этой мутации выявлено у больных с проявлениями всех трех АЗ (8,33%, р=0,036; OR=5,42 (CI95% 1,26-23,42), в ОВ больных АД (10,48%, р=0,00078; OR=6,98 (CI95% 2,05-23,73)), у больных с проявлениями только АД (14,29%, р=3,3х10-5; OR=9,94 (CI95% 2,73-36,28)). У русских статистически значимое повышение частоты делеции обнаружено в общей выборке больных АД (5,69% по сравнению с 1,65% в контроле  (р=0,0026; OR=3,59 (CI95% 1,21-10,69)) и подгруппе больных с проявлениями только АД (9,82%, р=0,0011; OR=6,48 (CI95% 2,02-20,83)). В контрольной группе башкир данная мутация встречалась с частотой 1,96%, у больных АЗ частота мутации была выше и составляла в ОВ больных АЗ - 3,57%, ОВ больных БА - 3,57%, ОВ больных АР - 4,44%, ОВ больных АД - 7,14%.

При исследовании мутации р.R501X установлено, что у больных из РБ она встречается с низкой аллельной частотой, составляющей в объединенной группе больных АЗ 0,98%; у русских, больных АЗ, - 0,64%; у татар, больных АЗ, - 0,8%; у башкир мутация не обнаружена.  В контроле в объединенной группе аллельная частота мутации  составила 0,37%, у русских - 0,61%, у татар и башкир мутация не обнаружена. В целом, в объединенной выборке больных АЗ мутации в гене FLG обнаружены у 96 больных. Четверо больных оказались гомозиготами по делеции c.2282del4 и один больной - гомозиготой по мутации p.R501X. У 76 больных в гетерозиготном состоянии выявлена мутация c.2282del4, у 15 больных - мутация p.R501X. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о значимости  мутаций в гене FLG в развитии АД и других АЗ на фоне АД у русских, татар и башкир.

Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена ADAM33

с развитием аллергических заболеваний

Ген АDАМ33 является первым геном предрасположенности БА, детектированным с помощью позиционного клонирования (20р13) (Van Eerdewegh et al., 2002). ADAM33 принадлежит к семейству Zn-зависимых металлопротеиназ, экспрессируется преимущественно в гладкой мускулатуре и фибробластах легких, вовлечен в развитие субэпителиального фиброза, гипертрофии гладких мышц, гиперреактивности бронхов и воспаления (Cakebread et al., 2004; Holgate et al., 2004; Zhang et al., 2009; Awasthi et al., 2010). Нами проведено исследование четырех полиморфных локусов гена ADAM33 (rs2787095, rs2485700, rs44707, rs2280091) у больных АЗ и в контрольной группе.        При анализе ОНП полиморфного варианта rs44707 (c.2162+427C>A), локализованного в 11 интроне гена ADAM33, обнаружена ассоциация данного локуса с развитием АЗ у русских. Генотип A/A является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,0033; OR=1,98 (CI95% 1,25-3,12)), и, в частности, БА (р=0,0011; OR=2,2 (CI95% 1,36-3,57)), АР (р=0,0198; OR=1,77 (CI95% 1,09-2,86)), сочетанного проявления БА и АР (р=0,023; OR=1,97 (CI95% 1,09-3,54)). Выявлена ассоциация данного генотипа с тяжелым течением БА (p=0,0008, OR=3,35 (CI95% 1,62-6,93)).

Анализ полиморфного локуса rs2280091 (c.2213A>G, p.Met738Thr), расположенного в 20 экзоне гена ADAM33, показал, что у индивидов башкирской этнической принадлежности аллель G является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,048, OR=2,41 (CI95% 0,99-5,87)), БА (p=0,038, OR=2,52 (CI95% 1,03-6,19)), АР (р=0,0044; OR=2,63 (CI95% 1,0-6,95)) и сочетанных проявлений БА и АР (р=0,041; OR=2,83 (CI95% 1,01-7,89)).

Проведен анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ исследованных полиморфных вариантов гена ADAM33 в выборках больных АЗ и контрольной группе. У русских обнаружены статистически значимые отличия в распределении частот гаплотипов гена ADAM33  между больными АЗ и контрольной группой. Установлено, что гаплотип ACAC (rs2280091-rs44707-rs2485700-rs2787095) у русских является маркером пониженного риска развития  аллергических заболеваний в целом (p=0,0041), БА (р=0,0017), АР (р=0,0314), сопутствующих БА и АР (р=0,0207).

Результаты проведенного нами анализа ассоциации свидетельствуют о роли полиморфных вариантов гена ADAM33 в формировании предрасположенности к АЗ заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у русских и башкир.

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков с аллергическими заболеваниями

Развитие АЗ тесно связано с воздействием на организм человека различных неблагоприятных факторов окружающей среды. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) участвуют в метаболизме множества токсичных веществ окружающей среды, лекарственных препаратов, медиаторов аллергического воспаления лейкотриенов и простагландинов (Carroll, 2005). С помощью биочипа-ИМБ нами было проведено исследование полиморфных локусов генов ФБК: CYP1A1 (rs1799814, rs1048943, rs4646903), CYP2D6 (rs3892097), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), NAT2 (rs1799929, rs1799930, rs1799931), CYP2C9 (rs1799853, rs1057910) и CYP2C19 (rs4244285) у больных АЗ русской и татарской этнической принадлежности и в соответствующих контрольных группах. В результате проведенного исследования полиморфного локуса rs3892097 (c.353-1G>A) гена CYP2D6, установлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русских и татар. Выявлена тенденция повышения частоты аллеля А, определяющего фенотип медленного лекарственного метаболизма, у татар, больных АР (р=0,099) и больных с сочетанными проявлениями БА и АР (р=0,091).

       Анализ полиморфного локуса rs1799929 (c.481C>T) гена NAT2 показал наличие статистически значимых различий в распределении частот аллелей между контрольными выборками русских и татар. Анализ ассоциации показал, что у русских аллель С является маркером повышенного риска развития АД (p=0,032; OR=1,57 (CI95% 1,04-2,38)) и сочетанных проявлений трех АЗ (р=0,015; OR=1,94 (CI95%1,14-3,33)). Полученные ассоциации согласуются с исследованиями Макаровой С.И., в которых было показано, что аллель NAT2*481T является протективным, а отсутствие этого аллеля связано с развитием астмы у детей русской этнической принадлежности (Makarova et al., 2000; Макарова, 2011). У индивидов татарской этнической принадлежности, напротив, генотип T/T данного локуса является маркером повышенного риска развития  АЗ в целом (p=0,036; OR=2,54 (CI95% 1,04-6,19)), БА (p=0,029; OR=2,69 (CI95% 1,08-6,69)) и ее тяжелого течения (p=0,0019; OR=5,26 (CI95% 1,71-16,17)). Обнаруженные ассоциации БА у татар согласуются с результатами исследований, проведенных в Польше, Турции и Индии (Zielinska et al., 1997; Gawronska-Szklars et al., 2001; Nacak et al., 2002; Batra et al., 2006; Tamer et al., 2006; Pawlik et al., 2009). Распространенность различных аллелей полиморфного варианта rs1799929 (c.481C>T) гена NAT2 широко варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением (Sabbagh et al., 2011). Индивидуальные и этнические различия в скорости ацетилирования оказывают влияние на терапевтический эффект и наличие побочных действий некоторых лекарств и, вероятно, различные аллельные варианты гена NAT2 могут модулировать риск развития АЗ у лиц разной этнической принадлежности.

Таким образом, анализ 12 полиморфных локусов 7 генов системы биотрансформации у больных АЗ и здоровых индивидов из РБ выявил статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русской и татарской этнической принадлежности по полиморфным локусам генов CYP2D6 (rs3892097) и NAT2 (rs1799929). Установлена ассоциация полиморфного варианта гена NAT2 (rs1799929) с развитием АЗ у русских и татар.

В целом, анализ полиморфных вариантов и мутаций генов-кандидатов  позволил выявить ряд маркеров повышенного риска развития АЗ в целом, БА, АД, АР и их сочетанных форм у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности (табл. 3), показал наличие межэтнических различий выявленных маркеров риска, а также сходство маркеров риска, предрасполагающих к развитию БА, АР и их сочетанного проявления.

Таблица 3

Маркеры повышенного риска развития АЗ, БА, АР, АД

у индивидов различной этнической принадлежности

	Русские	Татары	Башкиры	Объедин. выборка
БА	IL4 rs2243250*Т/Т p=0,0088; OR=4,97 ADAM33 rs44707*А/А р=0,0011; OR=2,2	NAT2 rs1799929*T/T p=0,029; OR=2,69	CCL11 rs17809012*G р=0,053; OR=1,71 ADAM33 rs2280091*G p=0,038;  OR=2,52	TNFA rs1800629*A p=0,02; OR=1,41
АР	IL4 rs2243250*Т/Т p=0,011; OR=4,82 ADAM33 rs44707*А/А р=0,0198; OR=1,77	IL13 rs20541*A (144Gln) p=0,022;OR=1,66	CCL11 rs17809012*G р=0,019; OR=2,01 FLG с.2282*del4 р=0,028;  OR=1,96 ADAM33 rs2280091*G р=0,0044; OR=2,63	TNFA rs1800629*A p=0,021;OR=1,41
АД	FLG с.2282*del4 р=0,0026; OR=3,59 NAT2 rs1799929*С p=0,032; OR=1,57	TNFA rs1800629*A p=0,039; OR=1,93 FLG с.2282*del4 р=0,0008;OR=6,98 NAT2 rs1799929*T p=0,032; OR=1,57		FLG с.2282*del4 p=1,4x10-5; OR=3,45
АЗ	IL4 rs2243250*Т/Т p=0,029; OR=4,17 ADAM33 rs44707*А/А p=0,0033; OR=1,98	FLG с.2282*del4 р=0,029; OR=3,96 NAT2 rs1799929*T/T p=0,036;  OR=2,54	CCL11 rs17809012*G р=0,046; OR=1,7 ADAM33 rs2280091*G p=0,048; OR=2,41	TNFA rs1800629*A р=0,036;OR=1,34 FLG с.2282*del4 p=0,003; OR=2,3
БА, АР и АД	NAT2 rs1799929*С/С p=0,015; OR=1,94	TNFA rs1800629*A p=0,003;OR=3,16 FLG с.2282*del4 р=0,036; OR=5,42		FLG с.2282*del4 р=0,0069; OR=2,68
БА и АР	IL4 rs2243250*Т/Т (р=0,0086; OR=5,78) ADAM33 rs44707*А/А (р=0,023; OR=1,97)	IL13 rs20541*A (144Gln) p=0,039; OR=1,72	CCL11 rs17809012*G р=0,026; OR=2,1 ADAM33 rs2280091*G р=0,041; OR=2,83	IL13 rs20541*A p=0,037; OR=1,3 TNFA rs1800629*A p=0,014;OR=1,55

2. Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы.

Полногеномное генотипирование 610000 однонуклеотидных полиморфных локусов выполнено у больных БА и индивидов контрольной группы русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. После проведения контроля качества генотипирования и корректировки генетической стратификации 550915 ОНП, прогенотипированных у 330 больных БА (141 русский, 120 татар, 69 башкир) и 348 индивидов контрольной группы (145 русских, 111 татар, 92 башкира) были отобраны для анализа ассоциации с БА.

Установлена статистически значимая ассоциация ОНП, локализованных на длинном плече хромосомы 17 в области 17q12-q21, с развитием БА (рис. 2). Пять ОНП были ассоциированы с БА с полногеномным уровнем значимости p<4,79х10-7 (rs9303277, rs8067378, rs2290400, rs7216389, rs4795405) и локализованы в интервале, охватывающем приблизительно 112 т.п.н. В этой области хромосомы 17 локализованы гены GSDMB и ORMDL3. Ген GSDMB кодирует один из белков семейства гасдерминдомен-содержащих протеинов - гасдермин B, экспрессируется в эпителиальных клетках, лимфоцитах, желудке, кишечнике, печени, легких и других тканях. Роль гасдермина В в развитии БА ясна не до конца, однако известно, что он принимает участие в терминальной дифференцировке эпителиальных клеток (Carl-McGrath et al., 2008). Ген ORMDL3 (orosomucoid 1 like 3) кодирует трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума ORMDL3, который входит в семейство оросомукоид-подобных белков и синтезируется во многих тканях, включая клетки печени и лимфоциты крови. ORMDL3 вовлечен в гомеостаз Ca(2+), способствует усилению отклика неструктурированных белков, инициируя развитие воспаления (Cantero-Recasens, 2010). Кроме того, белки ORM регулируют синтез сфинголипидов, участвующих в развитии аллергического воспаления и ремоделирования при БА (Ammit et al., 2001; Masini et al., 2008; Ryan et al., 2008; Breslow et al., 2010).

Ассоциация БА с данной областью была впервые выявлена у детей из Германии и Великобритании (Moffatt et al., 2007).  К настоящему времени проведен целый ряд работ, в которых установлена ассоциация ОНП области 17q12-q21, с БА в различных европейских и азиатских популяциях (Bouzigon et al., 2008; Hirota et al., 2008; Madore et al., 2008; Sleiman et al., 2008; Tavendale et al., 2008;  Bisgaard et al., 2009; Leung et al., 2009; Wu et al., 2009; Halapi et al., 2010; Moffat et al., 2010; Ferreira et al., 2010; Binia et al., 2011; Hrdlickova et al., 2011; Kavalar et al., 2011; Yu et al., 2011). У русских жителей Западной Сибири при полногеномном анализе не обнаружено ассоциации ОНП из области 17q12-q21 с развитием БА (Фрейдин и др., 2011).

В исследованной нами выборке с наиболее высоким уровнем значимости с развитием БА был ассоциирован ОНП rs7216389 (c.236-1199С>T), расположенный в первом интроне гена GSDMB (p=1,01x10-7). Частота встречаемости аллеля rs7216389*T у больных БА из РБ была выше (59,55%), чем в контрольной группе - 45,04% (p=1,01x10-7; OR=1,8 (CI95% 1,45-2,23)).

Рис.2. Графическое изображение результатов полногеномного анализа ассоциации 550 915 ОНП с бронхиальной астмой (Manhattan plot). На оси X указана хромосомная локализация ОНП, на оси Y - значения отрицательного десятичного логарифма уровня значимости P-value. Горизонтальная черта соответствует принятому в данной работе пороговому уровню значимости, при котором доля ожидаемых ложноположительных результатов равна 5%.

Гомозиготный генотип rs7216389*T/Т в группе пациентов определялся в 37,27% случаев, в контроле - в 21,87% (p=1,2x10-5, OR=2,12 (CI95% 1,51-2,98)).

Ассоциация БА с ОНП области 17q12-q21 наблюдалась с различной степенью выраженности и при анализе ассоциации, проведенном в отдельных этнических группах Ц  у русских (p=2,15x10-5 для rs7216389 при сравнении частот аллелей у больных БА и в контрольной группе), татар (p=0,049 для rs7216389) и башкир (p=0,0043 для rs7216389). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в подгруппах с детской астмой (возраст манифестации <18 лет) и БА с поздней манифестацией заболевания (>18 лет) показал наличие выраженных различий в распределении частот аллелей ОНП данной области между больными и контролем в обеих подгруппах. Наиболее высокий уровень ассоциации БА и в той, и в другой подгруппах установлен для ОНП rs7216389 (р=1,97х10-6 и р=1,8х10-4, соответственно). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в группах больных с различной тяжестью течения БА выявил тенденцию увеличения частоты аллелей и генотипов повышенного риска по данным локусам от легкой до тяжелой степени течения БА.

       Анализ неравновесия по сцеплению ОНП области 17q12-21, показал, что 8 ОНП (rs9303277, rs12150079, rs11557467, rs2872507, rs8067378, rs2305480, rs2290400, rs7216389), ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости, находятся в тесном неравновесии по сцеплению (D`>0,99) и входят в один гаплотипический блок, охватывающий примерно 93 т.п.н. (блок 1 на рис. 3). При анализе гаплотипов обнаружено, что маркером повышенного риска развития БА является наиболее распространенный гаплотип CGGGAGTT (р=2,77х10-7, OR=1,76 (CI95% 1,42-2,18)). Этот гаплотип по генотипированным локусам оказался идентичным гаплотипу, ассоциированному с повышенным уровнем экспрессии генов GSDMB и ORMDL3 в клеточных линиях  лимфобластов индивидов европейского происхождения (CEU, HapMap) (Verlaan et al., 2009).        Таким образом, при полногеномном исследовании установлена статистически значимая ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-21, и составленных по ним гаплотипов с развитием  бронхиальной астмы у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Рис. 3. Структура неравновесия по сцеплению между ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (Haploview 4.2). В верхней части рисунка показана локализация ОНП в генах IKZF3, ZPBP2, GSDMB (GSDML), ORMDL3. Черными линиями очерчены гаплотипические блоки. В ячейках указаны значения коэффициента неравновесия по сцеплению D`(в ячейках без указанных значений D`=1). Различные оттенки серого цвета отображают силу неравновесия по сцеплению между ОНП.

Репликация результатов анализа ассоциации БА

с полиморфными вариантами гена GSDMB

       Для подтверждения ассоциации полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-q21, с развитием БА в РБ, нами проведен анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389), в независимой выборке больных БА (202 чел.) и в контрольной группе русской, татарской и башкирской этнической принадлежности (220 чел.). Частоты аллелей и генотипов ОНП rs7216389 в новой выборке больных БА и контроля оказались сходными с таковыми в первоначально исследованных группах. Аллель rs7216389*Т встречался с более высокой частотой у больных БА - 57,43% по сравнению с 47,95% в контроле (р=0,0059; OR=1,46 (CI95% 1,12-1,92)) Исследование ОНП rs2290400 также выявило наличие ассоциации данного локуса c БА (р=0,0047, ORT=1,48 (CI95% 1,13-1,94)). Анализ ассоциации гаплотипов по трем полиморфным вариантам гена гасдермина В с БА показал, что гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) является маркером повышенного риска развития БА (р=0,0028). Анализ ассоциации трех ОНП гена GSDMB, проведенный с учетом возраста  манифестации заболевания, выявил различия в распределении частот аллелей всех трех локусов между больными детской БА и контрольной группой: rs2305480 (p=0,0451; ORT=1,37 (1,01-1,88)), rs2290400 (p=0,0021; ORT=1,62 (CI95% 1,19-2,21)), rs7216389 (р=0,0029; ORT=1,59 (1,17-2,18)). Гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) у больных детской БА встречался на 59,5% хромосом, в контроле - на 46,3% (р=0,0007). У больных с поздней манифестацией заболевания частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов гена GSDMB статистически значимо не отличались от частот аллелей и генотипов данных локусов в контрольных группах (p>0,05). Учитывая, что в независимой выборке больных БА и индивидов контрольной группы не подтверждена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием БА в возрасте >18 лет, можно сделать вывод о том, что ОНП области 17q12-q21, имеют более важное значение в развитии БА в детском возрасте. По данным литературы, в большинстве предыдущих исследований была показана ассоциация ОНП области 17q12-21 только с БА, дебютировавшей в детском возрасте (Moffatt et al., 2007, 2010; Bouzigon et al., 2008; Hirota et al., 2008; Tavendale et al., 2008; Bisgaard et al., 2009; Leung et al., 2009; Wu et al., 2009;  Halapi et al., 2010; Smit et al., 2010; Binia et al., 2011; Yu et al., 2011).

Анализ ассоциации  полиморфных локусов гена GSDMB с аллергическими заболеваниями

Анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) также проведен на расширенной выборке больных (906 человек) с различными клиническими проявлениями и сочетаниями АЗ (рис. 4).

Рис. 4.  Результаты анализа ассоциации полиморфного варианта rs7216389 гена GSDMB с развитием аллергических заболеваний. На оси Х указана частота встречаемости аллеля rs7216389*Т.

В объединенной группе больных установлена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием АЗ в целом: rs2305480 (р=0,00047; OR=1,37 (CI95% 1,15-1,64)), rs2290400 (p=5x10-5; OR=1,44 (CI95% 1,21-1,72)), rs7216389 (p=3,2x10-5; OR=1,45 (CI95% 1,22-1,73)). Кроме того, обнаружена ассоциация данных локусов с развитием БА в качестве единственного проявления аллергопатологии и БА в сочетании с другими аллергическими заболеваниями - с АР или с АР и АД. Ассоциация данных локусов с собственно БА и БА с сопутствующими АР и/или АД наблюдается у русских и башкир. У татар обнаружена ассоциация ОНП rs2305480, rs2290400, rs7216389 гена GSDMB с развитием сопутствующих БА и АР. Проведенный анализ гаплотипов трех полиморфных локусов гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) подтвердил результаты ассоциаций отдельных полиморфных вариантов гена с различными клиническими проявлениями и сочетаниями аллергических заболеваний. Не выявлено ассоциации данных полиморфных локусов и составленных по ним гаплотипов с развитием АР и АД без клинических проявлений БА, что свидетельствует о значении данных локусов в развитии именно БА и о возможности использования их в качестве прогностических маркеров риска развития БА у больных АД и АР.

Ассоциация бронхиальной астмы с полиморфными локусами, локализованными в областях 9p13 и 7p12.3

В проведенном нами полногеномном анализе ассоциации было выявлено еще несколько полиморфных локусов, кроме локализованных в области 17q12-q21, ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости порядка 10-6.

Один из них, rs12342831 (c.649-4268T>C), локализован в области 9p13 во втором интроне гена бета1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1. Установлено, что аллель rs12342831*Т, определенный с частотой 77,36% у больных и 66,03% в контрольной группе, является маркером повышенного риска развития БА (р=4,2х10-6; OR=1,76 (CI95% 1,38-2,24). Генотип  rs12342831*Т/Т у больных БА встречается с частотой 58,05%, у индивидов контрольной группы - 41,98% (p=3,1x10-5; OR=1,91 (CI95% 1,41-2,59)). Наиболее выраженные различия в распределении частот аллелей и генотипов ОНП rs12342831 наблюдаются между больными тяжелой формой БА и контрольной группой. ОНП rs12342831 расположен в гаплотипическом блоке, охватывающем 36 т.п.н. В состав данного блока также входят еще 7 генотипированных ОНП, локализованных в интронах гена B4GALT1 и ассоциированных с БА с уровнями значимости от 0,05 до 3,6х10-4. Ген B4GALT1 является одним из семи генов бета1,4-галактозилтрансферазы и кодирует две изоформы белка, различающиеся по длине цитоплазматического домена (www.ncbi.nlm.nih.gov). Обе изоформы beta-1,4-GalT-I экспрессируются в моноцитарных дендритных клетках и CD4(+) T лимфоцитах человека и являются одними из ключевых молекул клеточной адгезии, участвующими во взаимодействии дендритных клеток с Т-лимфоцитами (Han et al., 2009; Cheng et al., 2010). Экспрессия длинной формы beta-1,4-GalT-I повышается под действием IL12 и IL4 в присутствии IL2, что свидетельствует о том, что данная форма белка может активно участвовать в дифференциации и функционировании Th1/Th2 клеток (Han et al., 2009).

При полногеномном анализе установлена также выраженная ассоциация БА с ОНП rs1496499 (g.45979023T>G), локализованным в области 7p12.3 (p=4,77x10-6). Аллель rs1496499*Т, обнаруженный на 55,78% хромосом больных и 43,29% хромосом здоровых индивидов, оказался маркером повышенного риска развития БА (p=4,77x10-6; OR=1,65 (CI95% 1,33-2,05)). Генотип rs1496499*Т/Т встречался у больных БА с частотой 30,09%, в контрольной группе - 20,12% (р=0,0028; OR=1,71 (CI95% 1,2-2,43)). Несколько ОНП, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению с rs1496499, также показали выраженную ассоциацию с БА: rs2965072 (р=4,98х10-6), rs1534151 (р=2,18х10-5), rs2949833 (р=6,88х10-5), rs1534150 (р=6,13х10-5). Анализ ассоциации ОНП области 7p12.3 с учетом тяжести течения БА выявил наиболее выраженные различия между индивидами с тяжелым течением заболевания и контрольной группой. Ближайшим геном, расположенным на расстоянии около 18 т.п.н. от ОНП rs1496499, является ген IGFBP3, который кодирует белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II. ОНП rs3110697 (c.769-485T>C), расположенный в 3-ем интроне гена IGFBP3 и находящийся в тесном неравновесии по сцеплению с ОНП rs1496499, также показал наличие ассоциации с БА (р=0,0058). В ряде работ было выявлено, что инсулино-подобные факторы роста активируются при воспалении дыхательных путей и индуцируют пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных клеток, стимулируя выработку коллагена, ангиогенез и гиперплазию гладкомышечных клеток - основных процессов, происходящих при ремоделировании легких (Pascual, Peters, 2005; Veraldi et al., 2009; Kaplan et al., 2011) .

       Таким образом, впервые обнаружена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в областях 9p13 и 7р12.3, с развитием и тяжестью течения БА, что свидетельствует о вероятной роли в развитии данного заболевания расположенных в данных хромосомных областях генов (B4GALT1 и IGFBP3),  в развитии бронхиальной астмы.

Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности

С целью выявления этноспецифических генетических факторов риска развития бронхиальной астмы проведен полногеномный анализ ассоциации в отдельных этнических группах - русских, татар и башкир.

У русских наиболее выраженные различия между больными БА и контрольной группой выявлены по полиморфным локусам гена муцина 19 (MUC19), локализованного в области 12q12. Ген  MUC19 является одним из 24 генов, кодирующих у человека муцины, высокомолекулярные гликопротеины, являющиеся главной составной частью слизистого геля, покрывающего большинство эпителиальных поверхностей и служащего селективным барьером между клеточной мембраной и внешним окружением. MUC19 относится к подсемейству гель-формирующих муцинов, экспрессируется в основном в клетках подслизистых желез трахеи и слюнных желез (Desseyn et al., 2000; Chen et al., 2004). При некоторых заболеваниях MUC19 начинает экспрессироваться в эпителии - при аллергическом рините, хроническом среднем отите с эффузией (Kerschner, 2007; Ji, Guo, 2009; Zhu et al., 2010). Уровень продукции MUC19 регулируется цитокинами TNF-alpha, IL1b, IL6 и IL8, задействованными в аллергическом воспалении при БА (Kerschner et al., 2009).

В исследуемой нами выборке больных и контроля русской этнической принадлежности наиболее высокий уровень ассоциации БА обнаружен с ОНП rs2933346 (c.4048+292T>G), расположенным в 52 интроне гена MUC19. Частота аллеля rs2933346*G у больных БА была выше (85,25%), чем в контроле (68,53%) (р=2,59x10-6; OR=2,65 (CI95% 1,75-4,02)). Частота генотипа rs2933346*G/G у больных составляла 71,22%, в контрольной группе - 48,25% (p=8,5x10-5; OR=2,65 (CI95% 1,62-4,34)). Семь ОНП гена MUC19 (rs1492313 (p.Arg1524Lys), rs2588401 (p.Ala1734Thr), rs2588402 (p.Ala1770Thr), rs2638863 (p.Pro1785Thr), rs2638864 (p.Thr1878Ile), rs1352940 (c.16916-41G>A), rs2933373 (c.17123-477G>A)), пять из которых локализованы в центральном, 56-ом, экзоне гена и приводят к заменам аминокислот, были ассоциированы с БА с одинаковым уровнем значимости (р=4,96x10-6). Анализ неравновесия по сцеплению показал, что все они находятся в тесном неравновесии по сцеплению и входят в один гаплотипический блок размером около 29 т.п.н. Анализ гаплотипов 12 ОНП, входящих в данный блок, показал, что гаплотип GAAAATTAAGTA (rs2933346 - rs1492313 - rs2588401 - rs2588402 - rs2638863 - rs2638864 - rs2638880 - rs2920833 - rs1352940 - rs17597637 - rs719228 - rs2933373) является маркером повышенного риска развития БА у русских: его частота у больных составляла 68,8%, в контроле - 50,0% (р=4,96х10-6).

Таким образом, проведенный полногеномный анализ ассоциации показал наличие выраженной ассоциации БА у русских с ОНП, локализованными в гене муцина 19 (12q12). Ранее, по данным литературы, ассоциация БА и каких-либо других АЗ с данной областью и геном MUC19 не была выявлена ни в одной популяции. MUC19 является относительно недавно клонированным и просеквенированным геном среди всех муцинов (Chen et al., 2004; Zhu et al., 2010), и результаты исследований по изучению его экспрессии, полиморфных вариантов весьма ограниченны. Однако, его структурное сходство с другими гель-продуцирующими муцинами, экспрессирующимся в респираторном тракте, и повышенная экспрессия этого гена у больных АР дают возможность предположить, что MUC19 играет важную роль в развитии БА.

Полногеномный анализ ассоциации БА, выполненный у индивидов татарской этнической принадлежности, показал наличие наиболее статистически значимой ассоциации с ОНП rs12719740 (g.99072905G>A), расположенным в области 15q26.3 (p=4,65х10-7). В данном участке хромосомы локализовано два гена: FAM169B и IGF1R. Ген FAM169B принадлежит к семейству генов FAM169, кодирующих белки с неисследованной функцией. Ген рецептора инсулиноподобного фактора роста IGF1R экспрессируется практически во всех тканях. Рецептор IGF1R взаимодействует с высокой аффинностью с инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1) и инсулиноподобным фактором роста 2 (IGF2), с меньшей аффинностью - с инсулином (Le Roith et al, 1995). Как уже было сказано выше, инсулиноподобные факторы роста играют важную роль в процессах пролиферации, дифференциации, апоптоза клеток и ремоделирования дыхательных путей при хронических заболеваниях легких (Kaplan et al., 2011). При проведенном нами анализе распределения частот аллелей и генотипов ОНП  rs12719740  установлено, что аллель rs12719740*G у больных БА встречается с более высокой частотой (90,34%), чем в контрольной группе (72,35%) (p=7,93x10-7; OR=3,57 (CI95% 2,12-6,03)). Частота гомозиготного генотипа rs12719740*G/G у больных БА составила 81,51%, в контрольной группе - 52,29% (р=2,5x10-6; OR=4,02 (CI95% 2,22-7,3)). Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, показал, что  ОНП rs12719740 находится в одном гаплотипическом блоке, размером около 20 т.п.н., с 10 другими полиморфными локусами. У больных БА была выше частота встречаемости гаплотипа GACACGGCATC  (rs8034376 - rs12914549 - rs4257189 - rs6598516 - rs12164914 - rs12719740 - rs8043332 - rs11247355 - rs933813 -        rs933812 - rs4641724) (17,0% vs 9,2%) (2=6,08; p=0,014). Таким образом, в результате проведенного исследования установлена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, с развитием БА у татар. Учитывая, что ассоциированные локусы находятся в непосредственной близости к гену рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), можно предположить, что данные ОНП играют роль в ремоделировании легких при бронхиальной астме.

У индивидов башкирской этнической принадлежности была обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в области 5q33. В хромосомной области 5q31-33 находится кластер генов цитокинов (IL4, 5, 9, 13, GM-CSF), участвующих в реакциях аллергического воспаления и ассоциированных с развитием АЗ по данным многочисленных исследований. Полиморфные локусы, ассоциированные с БА в настоящей работе, локализованы в гене GRIA1, кодирующем субъединицу AMPA - ионотропного рецептора глутамата. Субъединицы AMPA рецептора экспрессируются тканеспецифично, главным образом, в тканях переднего мозга и гиппокампа. В настоящее время в литературе активно обсуждается иммуномодуляторная роль глутаматных рецепторов: глутаматные рецепторы обнаружены на поверхности Т-лимфоцитов; установлено, что дендритные клетки секретируют глутамат, необходимый при взаимодействии Т-лимфоцитов и дендритных клеток (Pacheco et al., 2006). При полногеномном анализе обнаружена ассоциация ОНП в гене GRIA1 с аллергической реакцией на аспарагиназу у больных острой лимфобластной лейкемией (Chen et al., 2010).

       Уровень значимости ассоциации ОНП с БА, выявленный в данном исследовании, достаточно широко варьировал при рассмотрении отдельных полиморфных вариантов гена GRIA1 (от р=0,0145 до р=4,25x10-7). С наиболее высоким уровнем значимости был ассоциирован ОНП rs9324750 (c.220+42404A>C), расположенный во втором интроне гена GRIA1. У больных БА частота аллеля rs9324750*А (36,96%) была значительно выше, чем в контрольной группе (12,78%) (p=4,25x10-7; OR=4,001 (CI95% 2,29-6,99)). Анализ неравновесия по сцеплению показал, что ОНП rs9324750 находится в тесном неравновесии по сцеплению с 7 ОНП, также локализованными во 2 интроне гена и входящими вместе с ним в один гаплотипический блок размером около 10 т.п.н. Гаплотип GTGCGGAT (rs495703 - rs480726 - rs726877 - rs726876 - rs1463747 -        rs17114771 - rs9324750 - rs10041179) у больных БА встречался значительно чаще (в 24,6% случаев), чем в контрольной группе индивидов (9,4% случаев) (р=3,0x10-4). Таким образом, полногеномный анализ ассоциации БА у башкир выявил ассоциацию с ОНП в гене GRIA1, локализованном в области 5q33 и кодирующем субъединицу AMPA - ионотропного рецептора глутамата, предположительно играющего роль в инициации и регуляции T-клеточного иммунитета.

В целом, проведенное полногеномное исследование однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных БА и индивидов контрольной группы показало наличие ассоциации БА с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7) с ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (гены GSDMB и ORMDL3) и, по данным литературы, ассоциированными с развитием БА в популяциях различного этнического происхождения (табл. 4). Впервые обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в областях 9р13 (в гене B4GALT1) и 7р12.3 (в гене IGFBP3). Идентифицированы этноспецифические маркеры риска развития БА. У русских установлена значительная ассоциация БА с полиморфными вариантами гена муцина 19 (12q12). У татар с наиболее высоким уровнем значимости с БА были ассоциированы ОНП, расположенные в области 15q26.3, в которой локализован ген рецептора инсулиноподобного роста 1. У башкир  выявлена значимая  ассоциация с полиморфными вариантами гена GRIA1, локализованного в области 5q33 и кодирующего субъединицу AMPA - ионотропного рецептора глутамата.

Таблица 4

Маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы по результатам анализа генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциации

Русские	Татары	Башкиры	Общая  выборка
IL4 rs2243250*Т/Т ADAM33 rs44707*А/А GSDMB rs7216389*T/T B4GALT1 rs12342831*T/T IGFBP3 rs1496499*T/T MUC19 rs2933346*G/G	NAT2 rs1799929*T/T GSDMB rs7216389*T/T IGFBP3 rs1496499*T/T rs12719740*G/G (15q26.3, IGFR1)	CCL11 rs17809012*G ADAM33 rs2280091*G GSDMB rs7216389*T/T B4GALT1 rs12342831*T/T IGFBP3 rs1496499*T/T GRIA1 rs9324750*A	TNFA rs1800629*A GSDMB rs7216389*T/T B4GALT1 rs12342831*T/T IGFBP3 rs1496499*T/T

3. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к бронхиальной астме

Анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формирования наследственной предрасположенности, поскольку в основе возникновения многофакторной патологии лежат сложные взаимодействия генетических и средовых факторов, которые необходимо учитывать при прогнозировании риска развития заболевания и разработки профилактических мероприятий. В настоящей работе для моделирования межгенных взаимодействий были использованы программы MDR (Ritchie et al., 2001) и ее модифицированная версия - GMDR  (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011). В этих программах с помощью многократного перекрестного пересчета первичных данных были выбраны оптимальные модели межгенного взаимодействия, позволяющие с наиболее высокой точностью предсказать человеку наличие предрасположенности к определенному аллергическому заболеванию.

Проведена оценка роли межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов цитокинов (IL4, IL4RA, IL13, IL10, TNFA и CCL11, гена ADAM33 (rs44707) и гена GSDMB (rs7216389) в детерминации риска развития аллергических заболеваний. При анализе объединенной выборки больных АЗ и контроля оптимальной моделью межгенного взаимодействия, предрасполагающей к развитию АЗ, оказалась комбинация из ДНК-локусов двух генов - интерлейкина 4 и гасдермина В (IL4 - GSDMB) (рис. 5). Основные характеристики моделей приведены в таблице 5.  Эта же модель межгенного взаимодействия была предрасполагающей к развитию БА. Оптимальная модель ген-генного взаимодействия, ассоциированная с развитием АР, включала полиморфные локусы пяти генов  (IL4 - IL13 - CCL11- ADAM33 - GSDMB). В оптимальную модель ген-генного взаимодействия при АД, входили полиморфные локусы трех генов - IL4, IL10 и GSDMB. Анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию сочетанных форм аллергопатологии, выявил трехлокусную модель (IL4 - IL13 - GSDMB), ассоциированную с развитием сочетанных БА и АР.

Исследование ген-генных взаимодействий у индивидов различной этнической принадлежности показало, что у русских оптимальной моделью, предрасполагающей к развитию АЗ в целом является трехлокусная модель IL4 - IL4RA - GSDMB.

Рис. 5. Модель межгенных взаимодействий, предрасполагающая к развитию аллергических заболеваний (MDR).

Таблица 5

Ключевые межгенные взаимодействия,

определяющие предрасположенность к развитию АЗ

Группы	Оптимальная модель межгенного взаимодействия	Точность модели	CV Сonsistency	P value
Объединенная группа больных АЗ и контроля
АЗ	IL4- GSDMB	0,5892	9/10	0,0107
БА	IL4 - GSDMB	0,6206	8/10	0,0010
АР	IL4 - IL13 - CCL11 - ADAM33 - GSDMB	0,7397	7/10	0,0547
АД	IL4 - IL10 - GSDMB	0,6110	10/10	0,0107
БА и АР	IL4 - IL13 - GSDMB	0,6704	10/10	0,0010
Больные АЗ и контрольная группа русской этнической принадлежности
АЗ	IL4 - IL4RA - GSDMB	0,6745	10/10	0,0010
БА	IL4 - GSDMB	0,664	10/10	0,0010
БА, АР и АД	IL10 - GSDMB	0,6871	8/10	0,0107
Больные АЗ и контрольная группа татарской этнической принадлежности
БА	IL4 - IL4RA - IL13 - CCL11 - GSDMB	0,8867	10/10	0,0547
АР	IL4 - IL13 - CCL11 - GSDMB	0,8201	9/10	0,0547
АД	IL4 - IL13 - IL10 - CCL11 - GSDMB	0,9035	8/10	0,0107
Больные АЗ и контрольная группа башкирской этнической принадлежности
АЗ	IL4 - IL13 - CCL11	0,8004	10/10	0,0107
БА	IL4 - IL4RA - IL10 - CCL11	0,901	7/10	0,0010
АР	IL4 - IL13 - CCL11	0,8231	9/10	0,0107

Примечание: CV Сonsistency - cross-validation consistency (перекрестная проверка достоверности)

Для БА у русских выявлена двухлокусная модель, аналогичная обнаруженной при анализе в объединенной выборке больных и контроля  (IL4 - GSDMB). К развитию сочетанной аллергопатологии у русских предрасполагает взаимодействие полиморфных локусов генов интерлейкина 10 и гасдермина В (IL10 - GSDMB).

       При анализе межгенных взаимодействий у индивидов татарской этнической принадлежности была выявлена модель межгенного взаимодействия полиморфных локусов пяти генов (IL4 - IL4RA - IL13 - CCL11 - GSDMB), предрасполагающая к развитию БА. С аллергическим ринитом у татар была ассоциирована четырехлокусная модель, в которую входили те же полиморфные локусы, что и при БА, за исключением IL4RA (IL4 - IL13 - CCL11 - GSDMB). При атопическом дерматите статистически значимая пятилокусная модель включала полиморфные локусы генов IL4,  IL13, IL10, CCL11 и GSDMB.

У башкир была выявлена статистически значимая трехлокусная модель межгенных взаимодействий, предрасполагающая к развитию аллергических заболеваний в целом и аллергическому риниту, в частности (IL4 - IL13 - CCL11), а также  четырехлокусная модель, ассоциированная с развитием бронхиальной астмы (IL4 - IL4RA - IL10 - CCL11). 

Проведенный анализ межгенных взаимодействий дал возможность установить ДНК-локусы исследованных генов, взаимодействующие при формировании наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям в целом и к различным клинико-патогенетическим вариантам их течения. Несмотря на то, что в структуре и характере взаимосвязей между локусами, предрасполагающих к развитию разных АЗ в различных этнических группах, наблюдаются существенные отличия, полученные результаты анализа межгенных взаимодействий свидетельствуют, что ключевая роль в формировании предрасположенности к АЗ принадлежит полиморфным локусам генов интерлейкина 4, интерлейкина 13 и гасдермина В, входящих в состав большинства статистически значимых моделей.

Таким образом, в результате исследования полиморфных вариантов ряда генов-кандидатов АЗ и полногеномного анализа ассоциации БА выявлены маркеры риска, предрасполагающие к развитию различных клинико-патогенетических вариантов развития АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Установлено, что в развитии БА во всех исследованных этических группах ведущую роль играют полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21. По результатам проведенных до настоящего времени работ, ассоциация БА именно с этой областью многократно подтверждена в популяциях различного этнического происхождения, что однозначно свидетельствует о роли локализованных в ней генов (GSDMB и ORMDL3) в развитии этого многофакторного заболевания. Впервые выявлена значительная ассоциация БА и ее тяжелого течения с полиморфными локусами, локализованными в областях 9р13 и 7р12.3. Идентифицированы этноспецифические маркеры риска развития БА и других АЗ по результатам анализа генов-кандидатов и GWAS. Во всех этнических группах установлено сходство маркеров риска развития АЗ верхних и нижних дыхательных путей - аллергического ринита, бронхиальной астмы  и их сочетанного проявления. Показана ключевая роль мутаций в гене профилаггрина в развитии  атопического дерматита и других аллергических заболеваний, развивающихся на фоне АД. Анализ межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов позволил выявить ключевые ген-генные взаимодействия, предрасполагающие к развитию различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены генетические маркеры, предрасполагающие к развитию аллергических заболеваний во всех исследованных этнических группах, и этноспецифические маркеры риска развития АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Выявлены полиморфные варианты генов, обусловливающие развитие определенных клинико-патогенетических вариантов течения аллергических заболеваний.
2. Установлена ассоциация полиморфных вариантов генов IL4 (rs2243250) и ADAM33 (rs44707) c развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления у индивидов русской этнической принадлежности.
3. Выявлено, что у индивидов татарской этнической принадлежности развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом ассоциировано с полиморфным вариантом гена NAT2 (rs1799929), развитие аллергического ринита и бронхиальной астмы, сочетанной с аллергическим ринитом - с полиморфным вариантом гена IL13 (rs20541), развитие атопического дерматита - с полиморфными вариантами генов TNFA (rs1800629) и NAT2 (rs1799929).
4. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов CCL11 (rs17809012) и ADAM33 (rs2280091) c развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления у индивидов башкирской этнической принадлежности.
5. Установлено, что развитие атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита с сопутствующим атопическим дерматитом в объединенной выборке больных и во всех этнических группах ассоциировано с носительством мутации c.2282del4 в гене профилаггрина FLG. Полиморфный локус rs1800629 гена TNFA ассоциирован с развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления в объединенной выборке больных.
6. Выявлено, что маркерами повышенного риска тяжелого течения бронхиальной астмы у русских является генотип А/А полиморфного локуса rs44707 гена ADAM33, у татар - генотип  T/T rs1799929 гена NAT2, у башкир - генотип A/A rs1800629 гена TNFA.
7. Установлена статистически значимая при полногеномном исследовании ассоциация пяти полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-q21, с развитием БА (p<4,79x10-7). Наиболее высокий уровень ассоциации БА обнаружен с полиморфным локусом rs7216389, расположенным в первом интроне гена гасдермина В GSDMB (p=1,01x10-7). С наибольшей частотой аллели и генотипы повышенного риска данных локусов встречались у больных с тяжелой формой заболевания.
8. Обнаружена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в областях 9р13 в гене бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT и 7р12.3 в гене IGFBP3, кодирующем белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста, с развитием и тяжестью течения бронхиальной астмы.
9. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития бронхиальной астмы по результатам полногеномного анализа ассоциации. У русских установлена ассоциация БА с полиморфными локусами гена муцина 19 MUC19, локализованного в области 12q12; у татар - с полиморфными локусами, расположенными в области 15q26.3, у башкир - с полиморфными вариантами гена субъединицы AMPA - ионотропного рецептора глутамата GRIA1, локализованного в области 5q33.
10. Обнаружена ассоциация трех полиморфных локусов гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) с развитием собственно бронхиальной астмы и БА с сопутствующими аллергическим ринитом и атопическим дерматитом при исследовании на расширенной выборке больных аллергическими заболеваниями. Установлено, что исследованные ДНК-локусы гена GSDMB не ассоциированы с развитием атопического дерматита и аллергического ринита, не сопровождаемых развитием БА, что свидетельствует об их роли в развитии именно бронхиальной астмы.
11. Выявлено межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов GSDMB и IL4, детерминирующее развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом в объединенной выборке больных. Установлены комбинации полиморфных вариантов генов, предрасполагающие к развитию аллергического ринита (IL4 - IL13 - CCL11 - ADAM33 - GSDMB) и атопического дерматита (IL4 - IL10 - GSDMB). Идентифицированы модели межгенного взаимодействия, ассоциированные с развитием различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи в рецензируемых научных журналах

1. Эткина И.А., Карунас А.С., Вялкова А.А., Гурьева Л.В., Хуснутдинова Э.К. Генетические аспекты бронхиальной астмы // Здравоохранение Башкортостана. 1999. № 6. С.69-80.
2. Карунас А.С., Измайлова А.Р., Загидуллин Ш.З., Хуснутдинова Э.К. Исследование молекулярно-генетических основ предрасположенности к бронхиальной астме в Башкортостане // Медицинская генетика. 2004. № 6. С.284-290.
3. Kutuev I., Khusainova R., Karunas A., Yunusbayev B., Fedorova S., Lebedev Yu., Hunsmann G., Khusnutdinova E. From east to west: patterns of genetic diversity of populations living in four Eurasian regions // Human Heredity. 2006.  V.61(1). P.1-9.
4. Хузина А.Х., Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетические аспекты аллергического ринита // Медицинская генетика. 2007. №6. С.9-16.
5. Карунас А.С., Измайлова А.Р., Хуснутдинова Э.К., Загидуллин Ш.З. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан // Цитокины и воспаление. 2007. Т.6. № 4. C.22-28.
6. Рамазанова Н.Н., Эткина Э.И., Хузина А.Х., Карунас А.С., Гурьева Л.Л., Орлова Н.А., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфизма генов IL4 (-590 С>Т) и IL4R (Ile50Val) с бронхиальной астмой в республике Башкортостан // Казанский медицинский журнал.  2007.  Т.8. №6. С.574-576.
7. Хузина А.Х., Карунас А.С., Бикташева А.Р., Юлдашева А.А., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Исследование ассоциаций полиморфных вариантов ряда генов цитокинов с аллергическим ринитом в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. 2008. №7. С. 27-35.
8. Юнусбаева М. М., Карунас А.С., Гарифуллин З.Р., Хуснутдинова Э.К. Исследование полиморфных локусов ряда генов цитокинов (TNFA,IL1B, IL1RA) и генов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1,GSTM1) у больных инфильтративным туберкулезом легких // Пульмонология. 2008.  №3. С.59-63.
9. Федорова Ю.Ю., Гра О.А., Карунас А.С., Хузина А.Х., Рамазанова Н.Н., Юлдашева А.А., Бикташева А.Р., Эткина Э.И., Наседкина Т.В., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с атопическими заболеваниями у русских детей из Республики Башкортостан // Молекулярная биология. 2009. №6. С.1032Ц1039.
10. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Гра О.А., Рамазанова Н.Н.. Гурьева Л.Л., Эткина Э.И., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с бронхиальной астмой у татар // Якутский медицинский журнал. 2009. №2. С.93-95.
11. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Измайлова А.Р., Исламгулов Д.В., Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, CYP1A1) с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан //Аграрная Россия. 2009. № 5. С.132-133.
12. Moffatt M.F., Gut I.G., Demenais F., Strachan D.P., Bouzigon E., Heath S., von Mutius E., Farrall M., Lathrop M., Cookson W.O.; GABRIEL Consortium (Collaborators (164): Е Khusnutdinova E.K., Karunas A.S., Fedorova Y.Y.Е). A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma // New England Journal of Medicine. 2010 V.363(13). P.1211-1221.
13. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетические аспекты бронхиальной астмы // Молекулярная медицина. 2010. № 1. С.8-17.
14. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Нургалиева А.Х., Гра О.А., Гималова Г.Ф., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Бикташева А.Р., Эткина Э.И., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Роль полиморфных вариантов генов системы биотрансформации в развитии аллергических заболеваний у татар // Медицинская генетика. 2010. №6. С. 28-35.
15. Карунас А.С., Юнусбаев Б.Б., Федорова Ю.Ю., Гималова Г.Ф., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Мухтарова Л.А., Загидуллин Ш.З., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы в Волго-Уральском регионе России // Молекулярная биология. 2011. Т.45. №6. С. 992-1003.
16. Хидиятова И.М., Ахметова В.Л., Хусаинова Р.И., Карунас А.С., Джемилева Л.У., Скачкова И.А., Надыршина Д.Д., Рахимкулова А.А., Марданова А.К., Мурзабаева С.Ш., Магжанов Р.В., Хуснутдинова Э.К. Популяционное исследование структурных особенностей генов моногенных заболеваний в Республике Башкортостан //Медицинская генетика. 2011. Т.10. №6. С. 13-22.
17. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Гималова Г.Ф., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Мухтарова Л.А., Мурзина Р.Р., Гатиятуллин Р.Ф., Загидуллин Ш.З., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена дизинтегрина и металлопротеазы 33 (ADAM33) с развитием бронхиальной астмы в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. 2011. Т.10. №11. С. 22-29.

Главы в монографиях

18. Хуснутдинова Э.К., Карунас А.С. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с бронхиальной астмой // В кн. Молекулярный полиморфизм человека. Под редакцией С.Д.Варфоломеева. М.: РУДН, 2007. Т. II. С.540-582.
19. Khusnutdinova E.K., Karunas A.S., Fedorova U.U., Gilyazova I.R. Association of candidate genes polymorphism with asthma in Bashkortostan Republic of Russia // Molecular Polymorphism of Man: Structural and Functional Individual Multiformity of Biomacromolecules. Ed. by Sergei D. Varfolomyev and Gennady E. Zaikov. Nova Science: 2011. P. 101-129.

Патент

20. Карунас А.С., Шалухина А.Р., Загидуллин Ш.З., Исламгулов Д.В., Хуснутдинова Э.К. Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Заявка № 2006141964. Приоретет изобретения 27.11.2006. Зарегистрирован 20 мая 2008 г.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференций (38)

21. Karunas A., Izmaylova A., Zagidullin S., Khusnutdinova E. The analysis of the IL4 and IL9 polymorphisms in asthma patients and healthy donors from Volgo-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2004. Munich. Germany.  P.295.
22. Карунас А.С., Измайлова А.Р., Загидуллин Ш.З., Хуснутдинова Э.К. Исследование генов цитокинов и 2-адренергического рецептора у больных бронхиальной астмой из Башкортостана // Материалы V cъезда Российского общества медицинских генетиков. Уфа. С.199.
23. Karunas A., Izmaylova A., Khuzina A., Zagidullin S., Khusnutdinova E.. Molecular-genetic study of asthma in Volgo-Ural region of Russia // 16th Annual Congress of European Respiratory Society. 2006. Munich.  P.524.
24. Khuzina A., Karunas A., Biktasheva A., Yuldasheva A., Etkina E., Khusnutdinova E. Association analysis of the IL4 and IL4 genes with allergic rhinitis in Volga-Ural region of Russia // XXVI Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. 2007. Gothenburg. P.228.
25. Khuzina A., Karunas A., Biktasheva A., Yuldasheva A., Etkina E., Khusnutdinova E. The analysis of Eotaxin (CCL11) gene single nucleotide polymorphisms in allergic rhinitis patients and healthy donors from Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2007. Nice. P.234.
26. Khuzina A., Karunas A., Biktasheva A., Yuldasheva A., Etkina E., Khusnutdinova E.. The study of genetic susceptibility to allergic rhinitis in Volga-Ural region of Russia // 17-th Annual Сongress of European Respiratory Society. 2007. Stockholm. P.536.
27. Fedorova Y., Karunas A., Ramazanova N., Etkina E., Khusnutdinova E.. Association analysis of interleukin gene polymorphisms with childhood asthma in Volga-Ural region of Russia // 18-th Annual Сongress of European Respiratory Society. 2008. Berlin. P.362.
28. Khuzina A., Karunas A., Biktasheva A., Yuldasheva A., Etkina E., Khusnutdinova E.. Association between the N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphisms and allergic rhinitis in Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. Barcelona. 2008. P.290.
29. Fedorova Y.Y., Karunas A.S., Gra O.A., Goldenkova-Pavlova I.V., Khusnutdinova E.K. Biochip analysis of the role of xenobiotic-metabolizing gene polymorphisms in the pathogenesis of bronchial asthma in Volga-Ural region of Russia // XXVIII Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. 2009. Warsaw. P.187.
30. Karunas A.S., Gimalova G.F., Fedorova Y.Y., Gumennaya E.R., Levashova S.V., Ramazanova N.N., Biktasheva A.R., Murzina R.R., Etkina E.I., Khusnutdinova E.K. Association analysis of two common filaggrin mutations (2282del4 and R501X) and atopic diseases in Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2010. Gothenburg.  P. 234.
31. Fedorova Y., Karunas A., Gimalova G., Skachkova I., Khusnutdinova E.. Study of gene-gene interactions for bronchial asthma in Russians from Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2010. Gothenburg. P.218.
32. Гималова Г.Ф., Карунас А.С., Федорова Ю.Ю., Юнусбаева М.М., Гуменная Э.Р., Мурзина Р.Р., Левашова С.В., Рамазанова Н.Н., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Исследование мутации 2282del4 в гене филаггрина у больных аллергическими заболеваниями из республики Башкортостан // VI съезд Российского общества медицинских генетиков. 2010. Ростов-на-Дону. C.44-45.
33. Карунас А.С., Федорова Ю.Ю., Юнусбаев Б.Б., Нургалиева А.Х., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Шалухина А.Р., Загидуллин Ш.З., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ генов предрасположенности к развитию бронхиальной астмы в республике Башкортостан //VI съезд Российского общества медицинских генетиков. 2010. Ростов-на-Дону. C. 81.
34. Gimalova G., Karunas A., Fedorova Y., Gumennaya E., Imangulova M., Biktasheva A., Levashova S., Etkina E., Khusnutdinova E. Analysis of filaggrin loss-of-function mutations in atopic dermatitis patients and populations of the Volga-Ural region of Russia // 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Istanbul. 2011.P.57.
35. Fedorova Y., Karunas A., Gimalova G., Guryeva L., Ramazanova N., Levashova S., Muhtarova L., Murzina R., Etkina E., Zagidullin Sh., Khusnutdinova E. Association of ADAM33 gene polymorphisms with asthma in Volga-Ural region of Russia //Annual Congress of European Respiratory Society. 2011. Amsterdam. P.55-56.
36. Gimalova G.F., Karunas A.S., Fedorova Y.Y., Gumennaya E.R., Levashova S.V., Biktasheva A.R., Etkina E.I., Khusnutdinova E.K. Association analysis of cytokine gene polymorphisms and atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2011. Amsterdam. P.273.
37. Karunas A.S., Yunusbayev B.B., Fedorova Y.Y., Ramazanova N.N., Zagidullin S.Z., E Etkina. I., Khusnutdinova E.K.. The association between 17q12-21 SNPs and asthma in the Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. 2011. Amsterdam. P.271-272.
38. Khusnutdinova E.K., Karunas A.S., Yunusbayev B.B., Fedorova Y.Y., Shaluhina A.R., Ramazanova N.N., Zagidullin S.Z., Etkina E.I. Genome-wide association study of asthma in the Volga-Ural region of Russia //Human Genome Meeting. 2011. Dubai. P.52.
39. Карунас А.С., Федорова Ю.Ю., Хузина А.Х., Гималова Г.Ф., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Левашева С.В., Бикташева А.Р., Гуменная Э.Р., Мурзина Р.Р., Гатиятуллин Р.Ф., Загидуллин Ш.З., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Исследование генетической предрасположенности к аллергическим заболеваниям в Республике Башкортостан // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Курск: КГМУ. 2011. С.59-60.
40. Гималова Г.Ф., Карунас А.С., Федорова Ю.Ю., Гуменная Э.Р., Имангулова М.М., Бикташева А.Р., Левашева С.В., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций в гене филаггрина у пациентов с атопическим дерматитом и в этнических группах Республики Башкортостан // Наука и общество. Физиология и медицина XXI века: тезисы секционных и стендовых докладов Санкт-Петербургского научного форума. - СПб. 2011. С.107-108.
41. Карунас А.С., Юнусбаев Б.Б., Федорова Ю.Ю., Гималова Г.Ф., Рамазанова Н.Н., Гурьева Л.Л., Левашова С.В., Бикташева А.Р., Мухтарова Л.А., Загидуллин Ш.З., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Идентификация генов предрасположенности к развитию бронхиальной астмы в Волго-Уральском регионе России: результаты полногеномного анализа ассоциации //Материалы XXI Национального конгресса по болезням органов дыхания. 2011. Уфа. С. 74-75.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АЗ АД АР БА ОВ ОНП ПДРФ ПЦР ПЦР-РВ т.п.н. ФБК ADAM33 CCL11 CYP1A1 CYP2C9,C19 CYP2D6 GST GSDMB GINA GMDR GWAS FLG IgE IL IL4RA NAT2 OR TNFA 95%CI

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Аллергические заболевания Атопический дерматит Аллергический ринит Бронхиальная астма Общая выборка Однонуклеотидный(е) полиморфизм(ы) Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция в реальном времени тысяча пар нуклеотидов Ферменты биотрансформации ксенобиотиков Дизинтегрин и металлопротеаза 33 Эотаксин 1 Цитохром Р450 класса 1А Цитохром Р450 класса 2C Цитохром Р450 класса 2D Глутатион-S-трансфераза Гасдермин В Global Strategy for Asthma Management and Prevention Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction Genome-wide Association Studies профилаггрин Иммуноглобулин E Интерлейкин -цепь рецептора интерлейкина 4 Ариламин-N-ацетилтрансфераза 2 Соотношение шансов Фактор некроза опухолей- Доверительный интервал

  Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии