Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
1 На правах рукописи
ДЖЕМИЛЕВА Лиля Усеиновна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ
03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
МОСКВА - 2011
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Асанов Алий Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится л_____________________2011 г. в _________часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов по адресу 117198, г.
Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов по адресу 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.
Автореферат разослан л__________________2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент Гигани Ольга Борисовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы: Изучение молекулярно-генетической природы наследственных заболеваний является основой для понимания их патогенеза, разработки методов ДНК-диагностики, профилактики и лечения. К настоящему времени идентифицировано более 17000 генов наследственных заболеваний из существующих, примерно, 25000 генов человека [OMIM]1.
Дефекты органов слуха занимают существенное место среди наследственной патологии. По статистическим данным ВОЗ на сегодняшний день в мире насчитывается порядка 300 млн человек, страдающих нарушением слуха различной этиологии (III-IV степени тугоухости). В Российской Федерации (РФ) эта цифра превышает 13 млн. человек, из которых более 1 млн. - это дети в возрасте до 18 лет. Общепопуляционная частота врожденной тугоухости и глухоты составляет 1 на 650-1000 новорожденных детей [Chaleshtori et. al., 2007]. По прогнозам ВОЗ к 2020 году более 30% всей популяции земного шара будут иметь нарушения слуха [Загорянская и др., 2003]. Данный прогноз указывает на отсутствие в перспективе снижения числа инвалидов по слуху в абсолютном и долевом выражении, как в РФ, так и в других странах, свидетельствуя о масштабе медицинской проблемы и ее социальной значимости [Дайхес и др., 2003]. В вопросах этиологии и патогенеза заболевания остается много неясных аспектов, но считается, что примерно половина всех случаев врожденной глухоты имеет наследственное происхождение. Как следствие, правильное консультирование семей таких пациентов практически невозможно без применения ДНК-диагностики.
Большинство случаев генетически детерминированной потери слуха наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Однако выраженная клиническая и генетическая гетерогенность заболевания, а также большая ассортативность браков между глухими и слабослышащими зачастую не позволяет точно выяснить механизм наследования дефекта звуковосприятия, а также приводит к повышению случаев болезни среди потомков пробанда.
Известно более 60 ядерных и митохондриальных генов, мутации в которых являются причиной тугоухости и глухоты у человека [Van Camp et al., 2009]. Наиболее частая форма наследственной глухоты - несиндромальная сенсоневральная тугоухость/глухота (НСНТ). Среди всех идентифицированных генов, вовлеченных в функционирование системы звуковосприятия, наиболее значимыми являются гены белков-коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6) и 31 (GJB3), вклад которых в развитие несиндромальных и некоторых синдромальных форм, по данным различных авторов, достигает 80% [Petersen et. al., 2006].
Кроме генов белковЦконнексинов, непосредственно участвующих в процессе звуковосприятия, рядом исследователей [Prezant et. al., 1993; Estivill et. al., 1998] показано, что некоторые мутации генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) митохондриальной ДНК могут являться причиной гиперчувствительности Online Mendelian Inheritance in Man к ототоксическим лекарственным препаратам и вызывать потерю слуха.
Поскольку применение антибиотиков из группы аминогликозидов широко распространено, изучение частот мутаций в генах 12SrRNA и tRNASer(UCN) является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях с отягощенным наследственным анамнезом, а также разработки схем дородовой диагностики повреждений генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) у плода. Благодаря работам многочисленных исследователей, работающих в области популяционной генетики, удалось установить, что каждая популяция имеет свою характерную генетическую структуру и генофонд. Поэтому и распространенность многих моногенных заболеваний, обусловленных мутациями в соответствующих генах, а также спектр и частота мутаций в этих генах, как правило, имеют неоднородный популяционный характер. Это определяет необходимость изучения молекулярно-генетических основ наследственных заболеваний в конкретных популяциях и регионах, что позволяет разрабатывать оптимальные для этих регионов алгоритмы их ДНК-диагностики.
Необходимость профилактики врожденных случаев потери слуха обусловлена значительными материальными затратами на выплаты по инвалидности, мероприятия по реабилитации, курсы специального обучения, слуховые аппараты и кохлеарные импланты. Однако, несмотря на острую социальную значимость проблемы, до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий, при этом, одновременно, отсутствует повсеместный мониторинг синдромальных и несиндромальных форм тугоухости и глухоты среди детского населения. Не разработаны четкие диагностические алгоритмы обследования пациентов с наследственными дефектами звуковосприятия, нет полных данных по спектру и частоте мутаций генов GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A у пациентов из различных этнических групп, проживающих на территории РФ и Республики Башкортостан (РБ). Нет полноценных данных о частоте гетерозиготного носительства мажорных мутаций гена GJB2 среди населения РФ.
В настоящее время допускается значительная гиподиагностика наследственных заболеваний, связанных с потерей слуха. Это связано с недостаточной информированностью оториноларингологов и сурдологов, отсутствием развитой программы генетического скрининга врожденной потери слуха и универсальных алгоритмов ДНК-диагностики наследственных форм потери слуха, оптимальных для различных этнических групп, проживающих на территории РФ.
Таким образом, диагностика и профилактика наследственных форм потери слуха является актуальной медицинской и социальной задачей.
Большинство подходов, применяемых для решения данной задачи, базируется на результатах биомедицинских исследований генома человека.
Все вышеперечисленное и предопределило актуальность данного исследования.
Цель и задачи исследования Целью исследования является изучение молекулярно-генетических основ и популяционных механизмов распространения наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты и разработка оптимальных подходов ДНК-диагностики в различных регионах РФ.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести сегрегационный анализ семей пациентов с наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ.
2. Изучить распространенность и популяционно-генетические факторы распространения наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ.
3. Определить характерные для РБ спектры и частоты мутаций в генах GJB2, GJВ6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A.
4. Провести сравнительный анализ частот гетерозиготного носительства трех мажорных мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC в гене GJB2 в евразийских популяциях.
5. Выявить популяционно-генетические механизмы накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты на основании гаплотипического анализа в локусе DFNB1 (13q 21.1) и оценить время, за которое произошла экспансия хромосом, несущих мутацию с.35delG в гене GJB2 в популяциях Волго-Уральского региона.
6. Разработать оптимальный для РБ алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты.
7. Создать национальный автоматизированный генетический регистр наследственных форм потери слуха в РБ.
8. Провести исследование биоэтических проблем, связанных с применением ДНК-тестирования наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты у пациентов с наследственной формой потери слуха из РБ.
9. Разработать биоэтические правила взаимодействия с тугоухими и глухими пациентами с учетом их психологических и социальных особенностей.
Научная новизна. Впервые получены данные по распространенности наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ, которая составляет 5,7 на 100000 (1:17543) населения, что сопоставимо с современными показателями в мире. Установлено неравномерное территориальное распространение заболевания с очагами накопления в центральных и юго-восточных районах республики.
Впервые изучена частота гетерозиготного носительства трех мажорных мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC в гене GJB2 в 17 популяциях Евразии и показана гетерогенность по частоте гетерозиготного носительства мутаций с.35delG и с.235delC между славянскими, финно-угорскими, тюркскими, адыгоабхазскими, дагестанскими и нахскими этносами.
Впервые проведенный анализ мутаций генов GJB2, GJВ6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4 и SLC26A5 у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ позволил идентифицировать 57% всех мутантных хромосом и установить, спектр мутаций, приводящих к нарушению процесса звуковосприятия у пациентов из РБ.
Впервые установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей и генотипов микросателлитных маркеров D13S141, D13S175 и D13S143 гена GJB2 на нормальных хромосомах и хромосомах с мутацией с.35delG у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ. Впервые выявлен мажорный гаплотип по локусам D13S141-D13S175-D13S143 125-105-130, достоверно чаще встречающийся на хромосомах с мутацией с.35delG в гене GJB2. Доля полностью информативных семей при анализе генов GJB2, GJВ6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4 и SLC26A5 по всем изученным мутациям составила 59%, что позволило разработать подходы ДНК-диагностики несиндромальной наследственной глухоты в РБ.
Впервые рассмотрен механизм накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты, вызванной мутацией с.35delG в гене GJB2 в РБ на основании проведенного гаплотипического анализа и оценен возраст мутации с.35delG в гене GJB2 в популяциях ВолгоУральского региона.
Впервые проведен анализ биоэтических вопросов при использовании ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ с учетом социальных и психологических особенностей тугоухих и глухих индивидов. Выявлены неразработанные в практике лечебно-профилактической помощи этические вопросы:
недирективность медико-генетического консультирования, информированное согласие пациентов на проведение ДНК-диагностики, ДНК-тестирование детей, конфиденциальность генетической информации.
Разработаны новые подходы, качественно отличающиеся от традиционных, в области профилактики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты для совершенствования медикогенетической помощи пациентам с наследственной формой нарушения слуха в РБ. Решена важная для практического здравоохранения проблема:
полученные в данной работе результаты используются для планирования исследований в области медицинской генетики, особенно для скрининга наследственных дефектов звуковосприятия у населения как РБ, так и населения РФ.
Практическая значимость работы. В рамках работ по государственному контракту № 02.442.11.7508 (Федеральная целевая научнотехническая программа Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы) созданы уникальные патентно-чистые тест-системы экспресс-ДНК-диагностики НСНТ на основе определения 19 наиболее частых мутаций в генах GJB2 и 12SrRNA (мтДНК).
На основании комплексного клинико-генетического и молекулярного обследования пациентов с НСНТ в практическое здравоохранение внедрены разработанный в ходе настоящего исследования, алгоритм ДНК-диагностики для профилактики рождения детей с наследственной формой потери слуха и научно обоснованная схема организации медицинской помощи семьям с высоким риском рождения детей с указанным заболеванием. Создан национальный автоматизированный генетический регистр наследственных форм потери слуха на базе Сурдологического центра ГУЗ Республиканской детской клинической больницы и Центра патологии речи, нейрореабилитации и реабилитации слуха ГУЗ Республиканской детской клинической больницы (г. Уфа).
Материалы диссертации используются в работе медико-генетической консультации при ГУЗ: Республиканский перинатальный центр РБ, а также включены в учебный процесс для студентов, в программу обучения ординаторов, интернов, врачей на кафедрах детских болезней, педиатрии, курса пропедевтики детских болезней лечебного и педиатрического факультетов ГОУ высшего профессионального образования Башкирский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Данные исследования имеют большое практическое значение и для здравоохранения как РБ, так и РФ, поскольку они позволят планировать объем медицинской помощи населению, а также существенно снизить распространенность наследственных форм потери слуха.
Положения, выносимые на защиту.
1. Преобладание среди наследственных форм НСНТ у пациентов из РБ аутосомно-рецессивной формы заболевания (89%).
2. Неравномерное территориальное распространение НСНТ в РБ с очагами накопления в центральных и юго-восточных районах республики.
Распространенность наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в Республике Башкортостан составляет 5,7 на 1000(1:17543) населения, что сопоставимо с таковой в европейских популяциях.
3. Спектр мутаций генов GJB2 (с.35delG (34%), c.35dupG (0,5%), c.167delT (2%), c.235delC (0,74%), q.-3179G>A (1,23%), c.358_360delGAG (0,5%), c.302A>G (0,25%), c.290_291insA (0,25%), c.299_300delAT (1%), c.333_334delAA (0,5%), c.312_325del14 (0,5%), c.314_327del14 (3%), c.101T>C (1%), c.109G>A (0,5%), c.139G>T (0,25%), c.380G>A (0,25%), c.224G>A (0,5%), c.95G>A (0,25%), c.551G>C (0,5%), c.250G>C (0,25%), c.79G>A+c.341A>G (0,25%)), 12SrRNA (m.961insC(n) (0,25%) и m.961delTinsC(n) (0,74%)), tRNASer(UCN) (m.7444G>A (0, 25%)), SLC26A5 (q.-532A>G) (0,25%) и SLC26A4 (q.919-2A>G) (0,25%) у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из Башкортостана.
4. Неоднородность 17 евразийских популяций по частоте гетерозиготного носительства мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC гена GJB2.
5. Эффект основателя - основной популяционный механизм накопления несиндромальной наследственной глухоты в популяциях Волго-Уральского региона. Время экспансии гаплотипа основателя с мутацией с. 35delG в популяциях Волго-Уральского региона составляет ~ 10000 лет.
6. Республиканский генетический регистр наследственных форм потери слуха в Республике Башкортостан, созданный в ходе исследования, позволяет решать задачи накопления эпидемиологической информации о нозологической структуре несиндромальной наследственной потери слуха, диспансеризации семей высокого риска, пре- и постнатальной диагностики и профилактики наследственных форм тугоухости/глухоты у детей, а также проводить генетический мониторинг населения.
7. Разработанный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты, позволяет 8. Недостаточная информированность тугоухих и глухих индивидов о современных методах дородовой ДНК-диагностики по данным проведенного социологического опроса.
9. Биоэтические правила взаимодействия с тугоухими и глухими пациентами, позволяющие повысить уровень медико-генетического консультирования пациентов с наследственными формами потери слуха.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликована 60 работ, из которых 19 статей в журналах, рекомендованных для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук, 2 статьи в зарубежной печати, 2 главы в иностранных монографиях, 38 публикаций - в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций, 2 патента РФ на изобретения. Результаты исследования были представлены на международных и российских конференциях: Биоразнообразие и динамика экосистем северной Евразии (Новосибирск, 2001), IV Международном симпозиуме Современные проблемы физиологии и патологии слуха (Суздаль, 2001), Юбилейной научной конференции Молодые ученые ВолгоУральского региона на рубеже веков (Уфа, 2001), Inherited disorders and their genes in different European populations, exploring human genetic variability - a Euroconference (San Feliu de Guixols, Spain, 2001), Human Genome Meeting (Shanghai, China, 2002), European Human Genetics Conference (Strasbourg, France, 2002), V Съезде Российского общества медицинских генетиков (2005), Eropean Society of Human Genetics conference (Prague, the Czech Republic 2005), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино. 2006), 7th Balkan Meeting of Human Genetics (Skopje, Macedonia, 2006), European Society of Human Genetics, Amsterdam (Amsterdam, The Netherlands, 2006), European Association for Vision and Eye Research Congress (Portugal, 2006), Школе молодых ученых им. Вавилова Актуальные проблемы современной генетики (Москва, 2006), International Society of Ocular Cell Biology (Cambridge, United Kingdom, 2006), XIIth International Symposium on Retinal Degeneration, (San Carlos de Bariloche, Argentina 2006), Научно-практической конференции Человек и его здоровье (СанктПетербург, 2006), International Congress of Human Genetics (Brisbane, Australia 2006), Asia ARVO (Singapore, 2007), European Society of Human Genetics conference (Nice, France 2007), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов (Москва, 2007), II Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 50летию высшего медицинского образования Республики Саха (Якутия) Экология и здоровье человека на Севере (Якутск, 2007), Newborn Hearing Screening (Cernobbio, Italy, 2008), ESF Research Conference on Rare Diseases (Sant Feliu de Guixols, Spain, 2008), European Society of Human Genetics conference (Wien, Austria 2009), European Society of Human Genetics conference (Gothenburg, Sweden 2010), IV Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Human Genome Meeting (Dubai, UAE, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 435 страницах машинописного текста. Данные проиллюстрированы таблицами (28), рисунками (78) и приложениями (2). Библиографический указатель включает 657 источников литературы, из них 80 работ отечественных авторов.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в проведении совместных исследований и обсуждении результатов работы своему научному консультанту, д.б.н., проф.
Хуснутдиновой Э.К. (ИБГ УН - РАН), директору ИБГ УН - РАН, д.б.н., проф. Вахитову В.А. и заместителю директора ИБГ УН - РАН, д.б.н., проф., Чемерису А.В., а также главному сурдологу РБ Хабибуллину Р.М. (РДКБ, Уфа), д.б.н., проф., Хидиятовой И.М. (ИБГ УН - РАН), д.б.н., доц., Баймиеву Ал. Х. (ИБГ УН - РАН), д.б.н., Федоровой С.А. (Якутский центр медицинских проблем, Якутск), д.м.н., Журавскому С.Н. (Военномедицинская академия им. Кирова, Санкт-Петербург), к.б.н., Посух О.Л.
(Институт цитологии и генетики, Новосибирск), к.б.н., Барашкову Н.А.
(Якутский центр медицинских проблем, Якутск), сотрудникам ИБГ УН - РАН, к.б.н., доц., Баймиеву Ан.Х., к.б.н., Хусаиновой Р.И., к.б.н., Ахметовой В.Л., и всем коллегам лаборатории молекулярной генетики ИБГ УН - РАН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для оценки распространенности НСНТ на территории РБ, без дифференциации на типы, использовались материалы комплексного сплошного медико- и популяционно-генетического исследования населения семи районов РБ, проведенного в период с 2005 по 2008 гг. совместно с Медико-генетическим научным центром РАМН (г. Москва), сведения о всех известных больных с врожденной потерей слуха, проживающими на территории РБ, полученные из базы данных Республиканского сурдологического центра, где состоит на учете большинство семей с наследственной потерей слуха, протоколы осмотров в специализированных школах глухих и слабослышащих из РБ, документы МСЭК по освидетельствованию глухих и слабослышащих за 2000 - 2009 г.г.
Полученные сведения дополнительно уточнялись на момент исследования путем целенаправленного запроса в центральные городские и районные больницы, специализированные школы и коррекционные детские сады, а также в процессе экспедиционных выездов 2000 - 2009 гг., проводимых нами совместно с сотрудниками Республиканского сурдологического центра с целью дополнительного клинического осмотра больных и членов их семей, и забора крови для ДНК-анализа. Для клинико-эпидемиологического исследования были собраны данные о каждом пациенте, проживавшем или проживающем на территории РБ за исследуемый период времени с 1 января 2000 по 1 января 2010 года. Данные о каждом пациенте, собранные из всех возможных источников, заносились в специально разработанную нами формализованную карту (ФК), на основании которой создана автоматизированная база данных Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота. Для каждого из обследованных больных составлялась родословная по общепринятым правилам с использованием стандартной символики. Критерием включения в исследование был диагноз Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота (G11 по МКБ-10), установленный на основании клинических, лабораторно-инструментальных и молекулярно-генетических методов исследований в соответствии с современными диагностическими критериями, предлагаемыми Институтом глухоты и коммуникативных расстройств (г. Омаха, США) и рекомендованных в 2003 г. Европейской рабочей группой по наследственным нарушениям слуха GENDEAF [Stephens et al., 2001; Mazzoli et al., 2003].
В ходе исследования уточнялись данные об этнической принадлежности больных путем опроса и выяснения национальной принадлежности родителей до третьего поколения. Особое внимание уделялось установлению места рождения пробандов, их родителей и прародителей; выявлению кровнородственных браков в семьях обследованных пациентов. Согласно первичному анализу данных и, исходя из диагностических критериев НСНТ, из общего числа случаев изолированной тугоухости/глухоты, были выделены несиндромальные сенсоневральные нарушения слуха с отягощенным по нарушенному звуковосприятию семейным анамнезом. Таким образом, в исследование вошли 246 семей пациентов с НСНТ из РБ. По степени потери слуха у пробандов семьи распределились следующим образом: I степень тугоухости была зарегистрирована в 4 семьях, II степень тугоухости - в 17 семьях, III степень тугоухости - в 31 семье, IV степень тугоухости - в 62 семьях, и глухота - в 132 семьях. Этнический состав обследованных молекулярно-генетическими методами семей был следующим: русские - семей, татары - 58 семей, башкиры - 37 семей, мари - 5 семей, украинцы - 3 семьи, армяне - 3 семьи, метисы - 42 семьи. Для анализа частоты и спектра мутаций в генах митохондриальной ДНК проанализированы неродственные индивиды из 999 семей (520 здоровых доноров и 479 пациентов с нарушением слуховой функции) из различных регионов РФ (табл. 1). Популяционная выборка состоит из 2078 образцов ДНК, полученных от здоровых неродственных индивидов. Этнический состав изученной выборки: русские (N=92), белоруссы (N=97), украинцы (N=90), абхазы (N=80), аварцы (N=60), черкесы (N=80), ингуши (N=80), казахи (N=240), уйгуры (N=116), узбеки (N=60), башкиры (N=400), татары (N=96), чуваши (N=100), удмурты (N=80), комипермяки (N=80), мордва (N=80) и якуты (N=247).
Для настоящего исследования все образцы ДНК были анонимизированы. Забор крови производили после медицинского осмотра у взрослых жителей, принадлежащих к разным семьям, что позволяет рассматривать выборки случайными для популяций. Данная научноисследовательская работа была одобрена локальным этическим комитетом по биомедицинской этике при ИБГ УН - РАН. Образцы крови были взяты с информированного письменного согласия пациентов и их родителей.
Таблица 1. Численность и этническая принадлежность пациентов и групп контроля для анализа частоты и спектра мутаций в генах митохондриальной ДНК Регионы Республика Республика Санкт- Республика Саха Этническая Башкортостан Петербург Алтай (Якутия) принадлежность Пациенты ОСТ СНТ Русские 98 50 71 46 100 10 0 10* - Татары 45 50 - - - - - - - Башкиры 30 48 - - - - - - - Якуты - - - - - 48 120 - - Алтайцы - - - - - - - 64* 1Казахи - - - - - - - 12* - Метисы 22 - - - - - - - - Другие 9 2 - 5 - 7 - 2 - национальности Всего 204 150 71 51 100 65 120 88 1* - включены также индивиды смешанной этнической принадлежности, по материнской линии относящиеся к русским, алтайцам, казахам, соответственно. ОСТ - группа больных с острой сенсоневральной тугоухостью; СНТ - группа больных с несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой.
Собранный в РБ клинический материал был проанализирован с помощью сегрегационного анализа, цель которого заключалась в проверке соответствия распределения больных и здоровых в выявленных ядерных семьях согласно определенному типу наследования - аутосомно- ты ты ты роль роль роль роль Конт Конт Конт Конт Пациен Пациен Пациен доминантному или аутосомно-рецессивному. Для получения доли спорадических случаев проводился сегрегационный анализ методом максимального правдоподобия с учетом вероятности регистрации в соответствии с алгоритмом комплексного сегрегационного анализа, разработанного Мортоном [Lalouel et al., 1983] Молекулярно-генетические исследования проведены с использованием стандартных методов: выделения ДНК; полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР); полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ), полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), гибридизации на чипах (HHL) фирмы Asper Biothech; конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) и ресеквенирования.
Для оценки времени экспансии мутации с.35delG на территории ВолгоУральского региона проанализирована степень неравновесия по сцеплению по формуле [Bengtsson, Thomson, 1981]: = (PD- PN) /(1-PN), где PD и PN - частоты аллеля на хромосомах, несущих мутацию и на нормальных хромосомах, соответственно, с доверительным интервалом [Diaz et al., 2000].
Для определения возраста мутации использовался подход генетических часов [Labuda et al, 1997], оценивающий количество поколений g с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени [Risch et al., 1995].
Статистический анализ полученных данных проведен с использованием стандартных для популяционно-генетических и медицинских исследований методов и соответствующего программного обеспечения (Statistica 5.5, GenePop 3.3, Genetic Data Analysis 1.0). Для подбора олигонуклеотидных праймеров использовалась программа Primer Select 5.05 из пакета DNASTAR (1993-2002). Построение карт территориальной распространенности частот гетерозиготного носительства мутаций c.35delG и c.235delC в гене GJB2 осуществлялось с помощью пакета SURFER 9.0. Карта территориальной распространенности НСНТ в РБ построена с помощью пакета программ ArcView GIS v. 3.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СЕГРЕГАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ НСНТ В РБ Сегрегационный анализ.
Для сегрегационного анализа была сформирована выборка из 2семей с 424 больными с наследственной этиологией НСНТ (рецессивный тип наследования предположительно определен в 220 семьях (385 больных), а доминантный в 26 семьях (39 больных). Мы не обнаружили ни одной семьи с Х-сцепленным типом наследования НСНТ. Во всех семьях с аутосомнорецессивным и аутосомно-доминантным типом наследования раздельно проводился сегрегационный анализ, цель которого заключалась в проверке соответствия распределения больных и здоровых в ядерных семьях соответственно типу наследования - доминантному или рецессивному. Для этого весь материал был разделен на две группы в зависимости от фенотипа родителей.
Первую группу составили семьи, в которых тестировалась гипотеза рецессивного наследования. После анализа медицинских карт из материала были исключены 27 семей, которые имели одного (пораженного) ребенка и число сибсов менее 2, а также 78 семей, в которых наблюдались ассортативные браки (глухой + глухой, были больны все сибсы и глухой + глухой, были больны все сибсы и генеалогический анализ родословных не прояснил предположительный тип наследования), следовательно, оказались неинформативными для проведения сегрегационного анализа. Таким образом, в сегрегационный анализ вошли 172 больных из 115 семей. Максимальное число детей в ядерных семьях составило 7, а число пораженных сибсов - 4.
Наибольшее число семей - с двумя сибсами (56%). Распределение семей по числу детей несколько отличается от среднепопуляционного по РБ (1,44-1,50).
Это указывает на то, что появление больного ребенка в семье, возможно, компенсаторно увеличивает данный показатель. Основная часть семей - (59,1%) в группе с предположительно рецессивной патологией с одним больным ребенком, 42 семьи (36,5%) с двумя пораженными, 4 семьи (3,5%) с тремя-, 1 семья (0,9%) с четырьмя - пораженными. Согласно литературным данным спорадически выявляемые несиндромальные сенсоневральные нарушения слуха, приблизительно в 98% случаев, обусловлены гомозиготностью либо компаунд-гетерозиготным состоянием по аутосомнорецессивным мутациям и менее чем в 5% случаев представляют собой новые доминантные либо сцепленные с полом мутации [Гинтер Е.К., 2002]. Таким образом, мы рассматривали данную группу как группу с аутосомнорецессивным типом наследования заболевания. Расчет вероятности регистрации и оценка сегрегационной частоты в семьях с предположительно рецессивной патологией проводились методом максимального правдоподобия с учетом вероятности регистрации, а также в соответствии с алгоритмом комплексного сегрегационного анализа, разработанного Мортоном [Morton, 1959; Cavalli-Sforza et al., 1971; Lalouel et al., 1983].
Вероятность регистрации (), оцененная методом Фишера, составила 0,62 (54/88), что говорит о ее множественном характере и возможности использования для расчета сегрегационной частоты. Сегрегационная частота методом максимального правдоподобия с учетом вероятности регистрации, составила 0,36 (53,86 / 147,86), а при помощи компьютерной программы в соответствии с алгоритмом комплексного сегрегационного анализа Мортона - 0,370,03, (доля спорадических случаев х = 0,120,04). Полученные результаты, с учетом ошибок, можно считать допустимыми при аутосомнорецессивном типе наследования (ожидаемая сегрегационная частота 0,25).
Сегрегационный анализ множественно пораженных сибсов показал полное соответствие рецессивному типу наследования в семьях с двумя и более пораженными: ожидаемое число больных (R0) - 173, а наблюдаемое (Rn) - 172.
Таким образом, результаты сегрегационного анализа для семей с предположительно аутосомно-рецессивным типом наследования НСНТ, в целом, не противоречат гипотезе о том, что для большинства семей характерно аутосомно-рецессивное наследование заболевания.
Во второй группе семей, где один из родителей болен (тип брака здоровый + больной) либо больны оба родителя (тип брака глухой + глухой, но среди сибсов есть здоровые), тестировали гипотезу об аутосомнодоминантном типе наследования НСНТ. В данном случае выбор метода сегрегационного анализа был пробандовый метод, т.е. регистрация велась через пораженных детей. Всего таких семей оказалось 26 (39 больных и здоровых сибса). Вероятность регистрации составила 0,7. Значение сегрегационной частоты составило p0=0,4, а при использовании комплексного сегрегационного анализа 0,47 0,068 (ожидаемая сегрегационная частота при аутосомно-доминантном типе наследования 0,5). Таким образом, проведенный сегрегационный анализ для группы семей с предположительно рецессивной и доминантной патологией показал соответствие ожидаемому типу наследования (0,25 и 0,5 соответственно) и позволил перейти к расчету распространенности НСНТ в РБ.
Распространенность НСНТ на территории РБ Распространенность наследственной несиндромальной тугоухости в РБ варьирует от 15 до 30,11 на 105 населения и это одно из наиболее частых наследственных заболеваний среди населения некоторых районов РБ [Зинченко и др., 2009]. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что НСНТ на территории РБ распространена неравномерно. Ее распределение по районам РБ представлено на рис. 1.
Распространенность НСНТ в РБ, в целом, составляет 5,7 на 1(1:17543) жителей. Заболевание зарегистрировано в 35 из административных районов Республики. Анализ данных свидетельствует о широком разбросе значений распространенности НСНТ - от 0,39 до 39,67 на 100000 населения. В 19 районах Республики: Альшеевском, Бакалинском, Белокатайском, Бижбулякском,Благоварском, Дуванском, Дюртюлинском, Ермекеевском, Зилаирском, Калтасинском, Куюргазинском, Мечетлинском, Миякинском, Нуримановском, Стерлибашевском, Татышлинском, Федоровском, Чекмагушевском, Шаранском нет зарегистрированных случаев заболевания. Минимальные показатели распространенности заболевания выявлены в Илишевском, Белебеевском, Белорецком, Мелеузовском, Гафурийском, Ишимбайском, Краснокамском районах и составляют менее на 105 населения. Наивысший показатель 39,67 на 105 зарегистрирован в Архангельском районе, на втором месте находится Салаватский район, на третьем - Балтачевский (38,57 и 32,39 на 100000 населения, соответственно).
При выяснении причин повышенной распространенности заболевания в отдельных районах (более 15 на 105) установлено, что высокие значения данного показателя могут быть связаны с территориальной дислокацией коррекционных школ.
Янаульский Татышлинский Аскинский Краснокамский Балтачевский Мечетлинский А Калтасинский Дуванский Белокатайский Бураевский Караидельский Дюртюлинский Мишкинский Илишевский Кигинский Бирский Салаватский Нуримановский Бакалинский Благовещенский Чекмагушевский Кушнаренковский Шаранский Иглинский Благоварский Уфимский Буздякский Туймазинский Чишминский Архангельский Учалинский Кармаскалинский Давлекановский Белебеевский Ермекеевский Аургазинский Альшеевский Гафурийский Б Белорецкий Бижбулякский Миякинский Стерлитамакский Ишимбайский Стерлибашевский Абзелиловский Бурзянский Федоровский Мелеузовский РаспростраБаймакский ненность Кугарчинский Куюргазинский НСНТ на 1Зилаирский населения Хайбуллинский Зианчуринский N W E S Рис. 1. А. Распространенность НСНТ на территории РБ. Б. Коррекционные школы для глухих и тугоухих на территории РБ Этот факт может быть объяснен особенностью уклада жизни глухих и тугоухих индивидов. На рис. 1Б обозначены места расположения школ для глухих и тугоухих индивидов, в которых учатся дети с нарушениями звуковосприятия.
При сопоставлении карты распространенности НСНТ на территории РБ и карты коррекционных школ для тугоухих/глухих наблюдается соответствие высоких показателей распространенности НСНТ и территориального расположения той или иной коррекционной школы.
Эти выводы подтверждаются рядом европейских исследований распространенности наследственных форм потери слуха [Nance et al., 2004, Tekin et al., 2007]. Введение жестового языка в Европе и создание школ для глухих и тугоухих более 300 лет назад способствовало прорыву социальной изоляции из-за коммуникативного дефекта, и, тем самым, способствовало увеличению шансов глухих и тугоухих индивидов вступать в брак, что, в свою очередь, привело к увеличению количества ассортативных браков и повышению рождаемости у этой группы населения [Tekin et al., 2007].
АНАЛИЗ СПЕКТРА И ЧАСТОТЫ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ КОННЕКСИНОВ 26 (GJB2), 30 (GJB6) И 31 (GJB3), ПЕНДРИНА (SLC26A4), ПРЕСТИНА (SLC26A5), НЕКОНВЕНЦИАЛЬНОГО МИОЗИНА (MYO7A) У БОЛЬНЫХ НСНТ ИЗ РБ Анализ мутации с.35delG в гене GJB2 у больных НСНТ из РБ Мутация c.35delG (p.Gly12Valfsx1) гена GJB2 является наиболее частой для популяций Западной Европы, где ее частота составляет 20% среди всех наследственных изолированных нарушений слуха, а каждый 33-й житель является гетерозиготным носителем [Gasparini et al., 2000; Mahdieh et al., 2009].
На первом этапе исследований был проведен скрининг мутации с.35delG в гене коннексина 26 (GJB2) у 390 больных из 204 неродственных семей из РБ. У 66 пациентов (58 неродственных) данная делеция была выявлена в гомозиготном состоянии. У 67 (56 неродственных) пациентов мутация 35delG идентифицировалась в гетерозиготном состоянии и у пациентов (39 неродственных) - в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями в гене GJB2. Таким образом, в 153 неродственных семьях была обнаружена мутация с.35delG, что составляет 75% всех обследованных семей с НСНТ.
Учитывая соотношение числа семей, у пробандов которых мутация с.35delG была выявлена в гомоЦ, гетеро- и компаунд-гетерозиготном состоянии, мы провели оценку частоты делеции у пациентов, которая составила 34% в исследованной выборке больных. Полученный результат согласуется с литературными данными о высокой распространенности данной мутации в различных этнических группах. В основном, эта мутация регистрируется с высокой частотой среди больных наследственной глухотой в Европе, Сев. Америке и Евразии [Mustapha et al., 2001; Lucotte et al., 2007; Man et al., 2007].
Частота мутации с.35delG на хромосомах пациентов русской этнической принадлежности составила 43%, среди татар с НСНТ - 27%, башкир с НСНТ - 13% (2=10,644; р<0,05; df=2). Таким образом, наблюдаются статистически достоверные отличия между группами пациентов башкир, русских и татар по частоте встречаемости мутации с.35delG в гене GJB2. В группе метисов частота с.35delG составила 34%. Малочисленность представителей других этнических групп в выборке больных не позволила провести для них статистический анализ и рассчитать частоту с.35delG в гене GJB2. Полученные результаты подтверждают данные о преобладании данной делеции у пациентов из Европы и ее более низкой распространенности у больных НСНТ из Азии [Kokotas et al., 2008; Cama et al., 2009; Dai et al., 2009].
У 66 пациентов из 54 неродственных семей, на обеих хромосомах которых была выявлена мутация с.35delG, причину снижения слуха можно считать установленной. Данные пациенты полностью информативны для ДНК-диагностики. В этих семьях возможна как дифференциальная диагностика для установления наследственной этиологии заболевания, так и проспективное медико-генетическое консультирование, включающее возможность проведения дородовой молекулярно-генетической диагностики.
Учитывая высокую частоту ассортативных браков между глухими индивидами (45% у пациентов из РБ) достаточно легко объяснить относительное преобладание гомозигот по мутации с.35delG в гене GJB2 (28%) среди пациентов с НСНТ из РБ.
Мутация с.35delG выявлена у 67 пациентов из 56 неродственных семей в гетерозиготном состоянии и у 45 пациентов из 39 неродственных семей в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями. Такое количество гетерозиготных носителей делеции с.35delG и наличие у них потери слуха может указывать на сегрегацию различных по происхождению мутантных аллелей, что, вероятно, также является следствием ассортативности браков между индивидами с нарушением слуха из РБ.
Степень тугоухости пациентов с генотипом с.35delG/с.35delG составила:
10%-III степень, 79% - IVстепень, и глухота - 11%, что подтверждает многие исследования о почти полной потери слуха у носителей данной мутации в гомозиготном состоянии [Morton et al., 1991; Cryns et. al., 2004; Snoeckx et al., 2005; Kokotas et al., 2010]. Полученные высокие значения частоты мутации с.35delG среди больных наследственной несиндромальной глухотой в РБ показывают важность изучения распространенности этой делеции среди больных и подтверждают ее первоочередность при диагностическом поиске причин потери слуха в семьях высокого риска по наследственной глухоте в регионе.
Поиск мутаций в гене GJB2 у больных с НСНТ из РБ На втором этапе исследований с помощью глубокого ресеквенирования образцов и гибридизации на чипах фирмы Asper Biothech был проведен анализ всей кодирующей области гена GJB2 в выборке больных из РБ. Молекулярногенетический анализ позволил идентифицировать 20 мутаций c c.35dupG (p.Val13fsx), c.167delT (p.Leu56Argfsx26), c.235delC (p.Leu79Cysfsx3), q.3179G>A, c.358_360delGAG (p.Glu120delfx1), c.302A>G (p.Glu101Gly), c.290_291insA (p.Tyr97X), c.299_300delAT (p.His100Argfsx14), c.333_334delAA (p.Lys112Argfsx1), c.310_325del14 (p.Arg104fsx), c.314_327del14 (p.Lys105fsx), c.101T>C (p.Met34Thr), c.109G>A (p.Val37Ile), c.139G>T (p.Glu47X), c.380G>A (p.Arg127His), c.224G>A (p.Arg75Gln), c.95G>A (p.Arg32His), c.551G>C (p.
Arg184Pro), c.250G>C (p.Val84Leu), c.79G>A+c.341A>G (p.Val27Ile+p.Glu114Gly) и 4 полиморфных варианта c.79G>A+240G>A, c.79G>A, c.457G>A, и c.404C>T в гене GJB2.
Мутация c.35dupG была идентифицирована с помощью ресеквенирования в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с.35delG у двух пробандов с НСНТ (IV степень тугоухости) в двух семьях (татарской и русской этнической принадлежности). При данной мутации в 30-35 положении происходит вставка гуанина, что так же, как и в случае делеции с.35delG, приводит к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стопкодона. Мутацию c.35dupG относят к редко встречающимся рецессивным мутациям в гене GJB2 [Estivill et al., 1998; Cryns et al., 2004; Primignani et al., 2009]. Частота c.35dupG в выборке больных НСНТ из РБ составила 0,5%.
Мутация с.167delT в гене GJB2 впервые была идентифицирована в 1998 г. у больных наследственной формой потери слуха в нескольких семьях евреев Ашкенази [Morell et al., 1998]. Далее, различными исследовательскими группами были показаны достаточно высокие частоты этой мутации и в других популяциях Европы, Средиземноморья, Ближнего Востока, Сев.
Америки и Евразии [Bors et al., 2004; Chaleshtori et al., 2005; Padma et al., 2009].
Мутация с.167delT в гене GJB2 была идентифицирована у пробандов из восьми семей с НСНТ из РБ. В четырех семьях (двух метисных татарин/русский, одной русской и одной татарской) с.167delT выявлена в гетерозиготном состоянии, в трех семьях (двух русских и одной татарской) данная делеция была выявлена в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с.35delG. И в одной татарской семье (Б) у пробанда с глухотой мутация с.167delT в гене GJB2 выявлена в сочетании с мутацией q.919-2A>G, расположенной в 7 интроне в сайте сплайсинга 8 экзона в гене SLC26A4.
Подобное сочетание мутаций q.-3179G>A и с.35delG в гене GJB2 и q.2-2A>G в гене SLC26A4 обнаружено в двух эстонских семьях с нарушением слуха [Teek et al., 2009]. Частота мутации с.167delT в выборке больных из РБ составляет 2%.
Рядом авторов была показана этническая специфичность накопления мутаций в гене GJB2 в некоторых монголоидных популяциях Восточной Азии.
Среди больных несиндромальной глухотой японцев, китайцев, корейцев, наиболее распространенной мутацией в гене GJB2 оказалась делеция цитозина в 235 положении - с.235delC [Fuse et al., 1999; Park et al., 2000; Abe et al., 2000;
Abe et al., 2010]. Частота данной делеции среди больных наследственной несиндромальной глухотой японцев, китайцев, корейцев, монголов, алтайцев, составляет от 34% до 76% среди всех мутантных аллелей этого гена [Park et al., 2000; Ohtsuka et al., 2003; Posukh et al., 2005]. Данная мутация в выборке пациентов с НСНТ из РБ обнаружена в трех неродственных семьях (двух татарских и одной башкирской) в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутациями с.35delG и c.314_327del14. У всех пробандов из трех семей диагностирована тяжелая степень потери слуха (IV).
Трансверсия q.-3179G>A впервые была описана двумя независимыми исследовательскими группами в 1999 году, как патологическая мутация, вызывающая нарушение консервативного участка донорного сайта сплайсинга некодирующего экзона 1 гена GJB2 [Denoyelle et al., 1999; Green et al., 1999].
Мутация q.-3179G>A была выявлена в пяти семьях с НСНТ из РБ. По этнической принадлежности семьи распределились следующим образом - две русских и три татарских. У пробандов двух русских и двух татарских семей с диагнозом НСНТ мутация q.-3179G>A была обнаружена в компаундгетерозиготном состоянии с делецией с.35delG, а у пятого пробанда данная мутация идентифицировалась в гетерозиготном состоянии. Таким образом, частота q.-3179G>A в выборке больных из РБ составляет 1,23%.
Мутация c.358_360delGAG, приводящая к преждевременному образованию стоп-кодона во 2 экзоне гена GJB2 и вызывающая делецию глутамина в 120 положении коннексина 26, была впервые описана в 1999 году [Denoyelle et al., 1999]. Данная мутация обнаружена нами в двух семьях с НСНТ у пробандов татарской этнической принадлежности. У одного пациента c.358_360delGAG сочеталась с мутацией с.35delG, а у другого находилась в гетерозиготном состоянии. Оба пробанда имели IV степень потери слуха, и в обоих случаях были больны их сибсы. Частота мутации c.358_360delGAG в общей выборке больных из РБ составила 0,5%.
Мутация c.250G>C впервые была описана в 1998 году, как замена валина на лейцин, что приводит к изменению конформации второго трансмембранного домена в коннексине 26 [Kelley et al., 1998]. Валин в положении является консервативной аминокислотой и общей для всех белков коннексинов. В группе пациентов из РБ c.250G>C была выявлена в компаундгетерозиготном состоянии с другой редкой мутацией c.302A>G в семье пациента с НСНТ III степени тяжести русской этнической принадлежности.
Мутация c.302A>G в гене GJB2 описана только у одного больного с деформацией костного лабиринта внутреннего уха из США в сочетании с с.35delG [Jun et al., 2000].
Инсерция c.290_291insA в гене GJB2 была описана как патологическая мутация, вызывающая преждевременное образование стоп кодона во втором экзоне гена GJB2 [Mustafa et al., 2001]. Мутация c.290_291insA впервые идентифицирована в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией c.95G>A в семье христиан - маронитов у пациента с глухотой [Mustafa et al., 2001].
Инсерция c.290_291insA обнаружена в компаунд-гетерозиготном состоянии с с.35delG у пациентки из семьи с НСНТ (IV степени) русской этнической принадлежности. Родители пациентки имеют нормальный слух, сибсы и муж слабослышащие (II-III степень).
Делеция c.299_300delAT впервые была описана японской исследовательской группой в 2000 году, как патологическая мутация, вызывающая сдвиг рамки считывания и терминацию белкового синтеза в 1положении белковой молекулы коннексина 26 [Abe et al., 2000]. Делеция c.299_300delAT в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с.35delG в гене GJB2 была обнаружена в четырех семьях с НСНТ из РБ. Этнический состав семей был следующим: украинская семья, русская и татарская семьи и одна метисная семья (русские и татары). Пробанды во всех этих семьях были глухими. Слышащие родители были только у пробанда из семьи русских, в остальных семьях у родителей наблюдалась глухота.
Делеция c.333_334delAA была впервые описана в 1998 г. [Kelley et. al., 1998] как мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания и вызывающая преждевременную терминацию белкового синтеза. В основном, эта мутация регистрируется с относительно небольшими частотами среди больных наследственной глухотой из Европы [Feldman et al., 2004; Propst et. al., 2006] и не обнаружена в азиатских популяциях [Snoeckx et al., 2005; Han et al., 2008;
Yuan et al., 2009b]. Мутация c.333_334delAA была обнаружена нами у пробандов с нарушением слуха из двух неродственных семей татарской этнической принадлежности из РБ в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с.35delG. В этих семьях родители пробандов и их сибсы были клинически здоровы, т.е. имели нормальный слух. Частота мутации c.333_334delAA в гене GJB2 на хромосомах больных НСНТ из РБ составила 0,5%.
Делеции c.310_325del14 и c.314_327del14 были выявлены, в основном, у больных НСНТ из Европы и Ближнего Востока [Kenna et al., 2001; Putcha et al. 2007]. Мутация c.310_325del14 обнаружена с частотой 0,5% только на хромосомах пациентов татарской этнической принадлежности из РБ в компаунд-гетерозиготном состоянии с делецией с.35delG. В обеих семьях родители пробандов имели нормальный слух, а сибсы были клинически здоровы.
Частота мутации c.314_327del14 у пациентов с НСНТ из РБ составила %, причем данная мутация была выявлена в гомозиготном состоянии у двух пробандов татарской этнической принадлежности. В остальных семьях, у пробандов (5 русских, 1 татарина и 1 метиса татарин/русский), мутация c.314_327del14 была идентифицирована в компаунд-гетерозиготном состоянии с делецией с.35delG и у 1 пробанда, татарина по этнической принадлежности, данная мутация находилась в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией c.235delC. Таким образом, мутация c.314_327del14 в гене GJB2 является второй по частоте встречаемости мутацией у больных НСНТ из РБ.
Впервые трансверсия в 101 положении гена GJB2 была описана в 19как доминантная мутация, вызывающая потерю слуха [Kelsell et al., 1997].
Далее, в 1998 году, c.101T>C была обнаружена в гетерозиготном состоянии в выборке 192 индивидов с нормальным слухом [Kelley et al., 1998]. Однако несколькими исследователями при изучении экспрессии коннексина 26 с заменой метионина на триптофан в 34 положении был подтвержден доминантно негативный эффект мутации c.101T>C in vitro [D'Andrea et al.
2002; Bicego et. al., 2006; Pollak et al. 2007; Palmada et al., 2006; Teek et al., 2010]. Мутация c.101T>C была выявлена нами в трех семьях с НСНТ из РБ. У всех трех пациентов наблюдалась III степень тугоухости. У одного индивида из выборки больных, башкира по этнической принадлежности, замена c.101T>C была идентифицирована в гомозиготном состоянии, у второго пациента, метиса (русский/татарин) - в компаунд-гетерозиготном состоянии с полиморфным вариантом с.79A>G в гене GJB2 и у третьего пациента, русского по этнической принадлежности, в сочетании с мутацией q.-53-2A>G в гене SLC26A5. Таким образом, частота мутации c.101T>C составила 1% на хромосомах пациентов из РБ. Трансверсия q.-53-2A>G в гене SLC26Aвстречается, в основном, в популяциях Европы и частота гетерозиготного носительства данной мутации у европейцев, в целом, составляет около 4% [Tang et al., 2005].
Мутация с.109G>A была идентифицирована в гетерозиготном состоянии у двух пациентов с НСНТ, русского по этнической принадлежности и метиса (татарин/русский) из РБ. Оба пациента имели тугоухость II-III степени. Впервые данная мутация была описана Kelley с соавт. в 1998 году как нейтральный полиморфизм. Тем не менее, на сегодняшний день вариант нуклеотидной последовательности с.109G>A относят к рецессивным патологическим мутациям гена GJB2, во многом благодаря генотипфенотипическим корреляционным исследованиям [Cryns et. al., 2004; Oguchi et al., 2005; Huculak et al., 2006]. Частота данной мутации в изученной общей выборке больных составила 0,5%.
Мутация c.139G>T в гомозиготном состоянии была впервые идентифицирована в 1997 году французской исследовательской группой у пробанда из семьи с НСНТ, живущей на юге Туниса [Denoyelle et al., 1997].
Мутация c.139G>T была обнаружена в гетерозиготном состоянии у двух членов семьи с НСНТ, матери и дочери, русских по этнической принадлежности из РБ, что составило 0,25% для общей выборки больных НСНТ и 0,51% для выборки больных НСНТ русской этнической принадлежности.
У пробанда с тугоухостью III степени из семьи с НСНТ, русского по этнической принадлежности, была идентифицирована замена гуанина на аденин в 380 положении (с.380G>A), которая ведет к замене аминокислоты аргинин на гистидин в 127 положении (p.Arg127His). Данная мутация была выявлена в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией c.35delG. Частота мутации в общей выборке больных НСНТ из РБ составила 0,25%. Впервые мутация c.380G>А была описана как нейтральный полиморфизм у пациента с нарушением слуха, испанца по этнической принадлежности [Estivill et al., 1998]. Однако в последующих исследованиях была показана патогенетическая значимость данной замены [Marlin et al., 2001; DТAndrea et al., 2002; Wang et al., 2003].
Впервые мутация c.224G>A (p.Arg75Gly) была описана в турецкой семье с аутосомно-доминантной формой потери слуха и ладонно-подошвенным гиперкератозом [Uyguner et al., 2002]. У двух пробандов с тугоухостью IV степени из семей с НСНТ, русских по этнической принадлежности, была идентифицирована замена гуанина на аденин в 224 положении (c.224G>A), что составило в общей выборке неродственных больных НСНТ 0,5%, а выборке больных НСНТ русской этнической принадлежности - 1%. Данная мутация была выявлена в гетерозиготном состоянии у обоих индивидов.
У пробанда с тугоухостью IV степени из семьи с НСНТ, метиса (татарин/белорус), была идентифицирована замена гуанина на аденин в положении (c.95G>A), которая ведет к замене аминокислоты аргинин на гистидин в 32 положении (p.Arg32His). Данная мутация была выявлена в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией c.35delG. Частота c.95G>A на хромосомах пациентов из РБ составила 0,25%. Мутация р.Arg32His изменяет аминокислотную последовательность первого трансмембранного домена белка Сх26 и, как показали Joseph с соавт. (2009), приводит к нарушению процесса олигомеризации коннексинов и препятствует процессу сборки коннексона.
Мутация c.551G>C, приводящая к замене аргинина на пролин в 1положении, была обнаружена в компаунд-гетерозиготном состоянии с делецией c.35delG у двух индивидов с потерей слуха, метисов (русский/татарин и татарин/башкир) по этнической принадлежности из РБ (0,5%). Причем в обеих семьях у пробандов были слышащие родители и глухие сибсы. Аргинин в 184 положении в коннексине 26 расположен в эволюционно консервативном участке второго экстрацеллюлярного домена белковой молекулы у разных биологических видов [Yuan et al., 2009b; Yum et al., 2010].
На хромосомах больных несиндромальной глухотой из РБ в гене GJBбыли выявлены 4 варианта нуклеотидной последовательности - р.Val27Ile (c.79G>A), р.Glu114Gly (c.341G>A), p.Val153Ile (c.457G>A) и p.Thr135Thr (c.404C>T), описанные в литературе как нейтральные полиморфизмы. На сегодняшний день, патогенетическая значимость данных нуклеотидных замен рядом авторов трактуется неоднозначно и носит дискуссионный характер [Yuan et al., 2009; Yum et al., 2010].
Так, частота полиморфного варианта c.79G>A составила 5,15% на хромосомах пациентов с НСНТ из РБ. Данный полиморфный вариант был выявлен преимущественно на хромосомах индивидов, башкир и татар по этнической принадлежности, с частотой 15% и 6,67%, соответственно. В популяционном отношении частота этого полиморфизма неоднородна и имеет расово-этнические отличия. Мировой максимум встречаемости 79G>A - 62% всех обследованных хромосом индивидов с нарушением слуха, зарегистрирован в Корее и Японии [Park et. al., 2000; Abe et. al., 2000; Lee et al., 2007], в Европе и Африке частота данного полиморфного варианта незначительна (около 0,1% и менее) [Roux et. al., 2004; Rodriguez-Paris et al., 2009].
Полиморфный вариант c.341G>A, наиболее часто встречается у пациентов из азиатских популяций и практически не выявляется у больных из Европы [Rodriguez-Paris et al., 2009]. Функциональная значимость замены c.341G>A подтверждается тем, что данный полиморфный вариант был обнаружен в гомозиготном состоянии на хромосомах глухих индивидов из Кореи [Park et. al., 2000] и в сочетании с мутацией GJB6-D13S1830 у пациента с нарушением слуха из США [Rodriguez-Paris et al., 2009]. На официальном сайте The Connexin Deafness Homepage полиморфные варианты c.79G>A и р.Glu114Gly (c.341G>A), образующие группу сцепления и находящиеся в цис-положении на одной хромосоме, описаны как рецессивная мутация у японских и корейских пациентов [Abe et al., 2000; Pandya et al., 2001], причем у корейцев с НСНТ данная группа сцепления выявляется на 97,2% всех обследованных хромосом [Lee et al., 2007]. Полиморфный вариант c.341G>A был идентифицирован в гетерозиготном состоянии только у одного пациента с НСНТ из РБ, башкира по этнической принадлежности, в сочетании с заменой c.79G>A. Таким образом, учитывая достаточно высокую частоту c.79G>A (5,15%) и низкую частоту c.341G>A (0,25%), можно сделать вывод о том, что в изученной выборке больных из РБ вклад полиморфных вариантов c.79G>A и c.341G>A, образующих группу сцепления, незначителен (менее 1%). Вариант нуклеотидной последовательности c.457G>A в гене GJB2 был выявлен в гетерозиготном состоянии у двух пациентов с IV степенью тугоухости из РБ, русского и татарина по этнической принадлежности (0,5%).
На сегодняшний день, полиморфный вариант c.457G>A некоторые исследователи относят к рецессивным патологическим мутациям гена GJB[Dinh et al., 2009; Fischer et al., 2009; Shan et al., 2010]. Полиморфный вариант c.404C>T был идентифицирован в гетерозиготном состоянии у пациента, русского по этнической принадлежности из РБ, имеющего врожденную тугоухость IV степени. Полиморфный вариант c.404C>T, в результате которого аминокислота триптофан в 135 положении сохраняется, и строение белка остается неизменным, был обнаружен нами впервые.
Поиск мутаций в генах коннексина 30 (GJB6) и коннексина 31 (GJB3) у больных НСНТ из РБ Проведен скрининг на наличие наиболее часто встречающихся протяженных делеций (GJB6-D13S1830) 309kb и (GJB6-D13S1854) 232kb в гене коннексина 30 (GJB6), у больных НСНТ из РБ. Также у пациентов НСНТ с отсутствием протяженных делеций в гене GJB6 проведен SSCP-анализ всего кодирующего региона, который не выявил каких либо изменений подвижности ДНК в образцах пациентов.
Результаты скрининга показали, что две делеции (GJB6-D13S1830) и (GJB6-D13S1854), захватывающие большую часть гена GJB6 и промоторную область гена GJB2, выявленные ранее в некоторых популяциях в ассоциации (или без) с мутациями в гене GJB2 [Feldmann et al., 2009; Liu et al., 2009; Wilch et al., 2010], не были зарегистрированы ни у одного пациента из РБ.
Мы провели прямое ресеквенирование кодирующего региона гена коннексина 31, который, по данным литературы, также принимает участие в образовании гетерологичных коннексонов, наряду с коннексинами 26 и [Van Camp et al., 2000; Friedman et al., 2003; Zhao et al., 2006]. У пяти пациентов с НСНТ русской этнической принадлежности из РБ был выявлен полиморфный вариант р.Asn119Asn (c. 357C>T) в гетерозиготном состоянии.
Частота данного полиморфного варианта составила 1,23% для общей выборки больных НСНТ из РБ, и 2,5% для выборки больных НСНТ русской этнической принадлежности Поиск мутаций в гене неконвенциального миозина (MYO7A) у больных НСНТ из РБ Для анализа гена MYO7A мы применили следующую стратегию:
исследовались участки гена, где по литературным данным было выявлено наибольшее количество мутаций, вызывающих наследственные формы тугоухости/глухоты, обусловленные нарушением функционирования волосковых клеток внутреннего уха [Ahmed et al., 2003; Kallman et al., 2008;
Street et al., 2008].
В экзоне 3 нами было зафиксировано одинаковое изменение подвижности у 5 неродственных пациентов с НСНТ русской этнической принадлежности из РБ. Последующее ресеквенирование 3 экзона гена MYO7A показало ранее описанный в литературе вариант нуклеотидной последовательности с.47T>C (p.Leu16Ser), идентифицированный в гетерозиготном состоянии, приводящий к замене лейцина на серин в положении (p.Leu16Ser) белковой молекулы [Pennings R.J., 2005]. Для установления патогенетической значимости полиморфного варианта с.47T>C нами были проведены исследования по оценке частоты данной замены в популяциях русских, татар и башкир, показавшие наличие с.47T>C у слышащих индивидов, практически, с той же частотой, что и у больных. Таким образом, полиморфный вариант с.47T>C у пациентов с НСНТ из РБ, вероятно, можно рассматривать как нейтральную замену, не влияющую на процесс звуковосприятия. В пользу данного предположения свидетельствует и тот факт, что среди популяционной выборки русских был обнаружен индивид, имеющий полиморфный вариант с.47T>C в гомозиготном состоянии. Частота данного полиморфного варианта среди пациентов с НСНТ из РБ составила 1,2% в общей выборке, и 2,5% - среди русских.
Спектр и частота идентифицированных мутаций в генах GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A у пациентов с НСНТ из РБ В результате проведенного молекулярно-генетического анализа генов GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A идентифицировано мутации. Спектр и частота обнаруженных мутаций у пациентов с НСНТ из РБ имеют выраженную этническую неоднородность (рис. 2). Таким образом, наиболее частой мутацией, идентифицированной с частотой 42,8% на хромосомах носителей русской этнической принадлежности, была делеция с.35delG в гене GJB2. С частотой более 1 % встречались мутации c.314_327del14 (2,5%), c.167delT (1,5%), q.-3179G>A (1,02%) и c.224G>A (1,02%). Частота остальных мутаций не превышала 0,5%.
русские татары башкиры метисы другие 0% 20% 40% 60% 80% 100% c.35delG q.-3179G>A c.35dupG c.167delT c.235delC c.358_360delGAG c.302A>G c.290_291insA c.299_300delAT c.333_334delAA c.310_325del14 c.314_327delc.109G>A c.139G>T c.380G>A c.224G>A c.95G>A c.551C>G c.250G>C c.79G>A+341A>G c.101T>C c.79G>A c.457G>A c.404C>T MYO7A с.47T>C GJB3 c. 357C>T SLC26A5 q.-53-2A>G SLC26A4 q.919-2A>G мутации в других генах Рис. 2. Спектр и частота мутаций генов GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26Aи MYO7A в этнически подразделенных выборках больных НСНТ из РБ На хромосомах пациентов НСНТ, татар по этнической принадлежности, были идентифицированы следующие мутации: с.35delG (27,8%), c.314_327del14 (6,67%), c.167delT (3,33%), q.-3179G>A (3,33%), c.235delC (2,22%), c.358_360delGAG (2,22%), c.333_334delAA (2,22%), c.310_325del14(2,22%), c.35dupG (1,11%), и два полиморфных варианта c.79G>A (6,67%) и c.457G>A (1,1%) в гене GJB2 и мутация q.919-2A>G (1,1%) в гене SLC26A4. Среди больных, башкир по этнической принадлежности, были найдены мутации с.35delG (13,3%), c.235delC (1,67%) и р.Val27Ile (c.79G>A)+р.Glu114Gly (c.341G>A) (1,67%) и c.101T>C (3,33%). Наиболее частым полиморфным вариантом, встречающимся у башкир, оказался р.Val27Ile (c.79G>A), частота которого на хромосомах больных с потерей слуха составила 15%. Небольшой вклад мутаций гена GJB2 в развитие несиндромальной глухоты у башкир (35%), возможно, связан с наличием мутаций в других генах, участвующих в процессе звуковосприятия. На хромосомах пациентов НСНТ, метисов, были идентифицированы следующие мутации: с.35delG (34%), c.167delT (4,55%), c.551G>C (4,55%), c.299_300delAT (2,27%), c.314_327del14 (2,27%), c.109G>A (2,27%), c.95G>A (2,27%), c.101T>C (2,27%) и полиморфный вариант c.79G>A (4,55%). Мутации с.35delG (39%), c.299_300delAT (5,56%) и полиморфный вариант c.79G>A (11,1%) были выявлены в группе пациентов НСНТ, украинцев, армян, и мари. Таким образом, все мутации и полиморфные варианты, обнаруженные в генах GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A у пациентов из РБ, характерны, в основном, как для больных НСНТ из европейских, так и из азиатских популяций. Наиболее распространенной мутацией, идентифицированной на 34% хромосом пациентов с НСНТ из РБ оказалась мутация с.35delG, что соответствует литературным данным о высокой частоте встречаемости данной делеции среди населения Европы и Ближнего Востока [Mahdieh et al., 2009].
Доля хромосом с мутациями c.314_327del14 и c.299_300delAT составила 3,94%. Мутация c.314_327del14 является второй по распространенности мутацией в гене GJB2 среди больных РБ (в основном, среди больных татарской этнической принадлежности). Также с частотой более 1% у пациентов с НСНТ из РБ были выявлены мутации c.167delT и c.235delC.
Достаточно высокая частота мутации с.35delG у пациентов с нарушением слуха, русских и татар по этнической принадлежности, из РБ предполагает возможность проведения прямой ДНКЦдиагностики, а также проведения скрининга среди широких групп населения.
АНАЛИЗ СПЕКТРА И ЧАСТОТЫ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ 12S rRNA И tRNASer(UCN) мтДНК У БОЛЬНЫХ НСНТ ИЗ РБ И ДРУГИХ РЕГИОНОВ РФ Мутации мтДНК, влияющие на слуховую функцию, в основном, обнаружены в генах, кодирующих компоненты белоксинтезирующего аппарата митохондрий - рРНК и тРНК. Известны мутации в гене tRNASer(UCN) (m.7445A>G, m.7472insC, m.7510T>C, m.7511T>С), вызывающие несиндромальную сенсоневральную тугоухость (НСНТ), и в гене 12S rRNA (m.1555A>G, m.1494C>Т, вариации вблизи нуклеотидной позиции 961), приводящие к НСНТ, в том числе после приема антибиотиков из группы аминогликозидов. Участие этих мутаций мтДНК в потере слуха подтверждено многочисленными исследованиями [Yao et al., 2006; Chen et al., 2007,2008;
Berrettini et al., 2008].
Ген 12S rRNA Нарушение слуховой функции у носителей мутации m.1555A>G характеризуется различным возрастом начала заболевания, варьирующей степенью потери слуха и прогрессией. В выборках пациентов мутация m.1555A>G была обнаружена у двух членов семьи К. (пробанд и ее мать) смешанного этнического происхождения из Якутии, а также у двух членов (пробанд - сын и его мать) русской семьи из Санкт-Петербурга. Наличие мутации m.1555A>G верифицировано прямым секвенированием. В популяционных выборках мутация m.1555A>G была обнаружена у одного индивида из группы вилюйских якутов, частота m.1555A>G в популяционной выборке якутов (N=120) составила 0,83%. В других обследованных популяционных выборках мутация m.1555A>G не выявлена.
У трех неродственных русских пациентов из Санкт-Петербурга обнаружена инсерция m.961insC. У двух из них, имеющих мутацию m.961insC, ОСТ IV степени возникла в раннем детстве после пневмонии на фоне антибиотикотерапии. Третий пациент с m.961insC имеет клинический диагноз НСНТ III-IV степени. Мутация m.961insC(n) была выявлена у пациента татарской этнической принадлежности из РБ с диагнозом НСНТ IV степени.
Мутация m.961delTinsC(n) идентифицирована у трех больных (3 русских) из РБ с диагнозом НСНТ III степени. Замена m.961T>G была выявлена у трех несвязанных родством русских пациентов, у одного из них (из СанктПетербурга) диагностирована ОСТ неясной этиологии, у двух других (Республика Алтай) - НСНТ неясной этиологии, возникшей в раннем возрасте.
Замена m.961T>A обнаружена у одного русского больного (Санкт-Петербург) с врожденной НСНТ, причем данное изменение мтДНК было выявлено нами впервые. Мутация m.1095T>С (ген 12S rRNA) была выявлена нами у двух индивидов, алтайцев - пациента с НСНТ IV степени и у здорового индивида из алтайской популяционной выборки. Мутация m.1005T>С, обнаруженная нами у одного индивида из популяционной выборки алтайцев, ранее была выявлена в китайской семье с потерей слуха, обусловленной применением аминогликозидов. Мутация m.827A>G обнаружена у индивида, русской этнической принадлежности, из выборки пациентов с ОСТ из СанктПетербурга имеющего мутацию c.35delG гена GJB2 в гомозиготном состоянии.
Ген tRNASer(UCN) Мутации m.7444G>A и m.7445A>C были обнаружены у двух несвязанных родством русских пациентов с ОСТ и НСНТ IV степени из СанктПетербурга и РБ, соответственно, и у трех сибсов из одной казахской семьи (с прогрессирующей НСНТ III степени, возникшей во взрослом состоянии).
Впервые нуклеотидная замена m.7444G>A, в сочетании с мутацией m.1555A>G (ген 12S rRNA), с частотой 1,33% была обнаружена при исследовании глухих пациентов из Монголии [Pandya et al., 1999]. Механизм патогенного влияния m.7444G>A, и m.7445A>C может быть схож с последствиями известной мутации m.7445A>G, ассоциированной с потерей слуха [Pandya et al., 1999; Jin et al., 2007], которая нарушает нормальный процессинг предшественника тРНК Ser(UCN) и мРНК гена ND6, совместно транскрибируемых с легкой цепи.
АЛГОРИТМ ДНК-ДИАГНОСТИКИ НСНТ В РБ В изученной выборке больных наследственной глухотой из РБ наиболее распространенной мутацией в гене GJB2 оказалась мутация с.35delG (34%), остальные мутации генов GJB2, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A5 и SLC26A4, в общей сложности, составили 24 % (рис. 3). Доля мутаций в генах митохондриальной ДНК составила 2,4%. В целом, мутации в гене GJB2 были выявлены у 116 из 204 неродственных пациентов НСНТ из РБ (56,8%), что хорошо согласуется с литературными данными, так, как уже было отмечено выше, в европейских популяциях вклад мутаций гена GJB2 составляет от до 60% и преобладающей у пациентов из Европы является делеция с.35delG [Bevilacqua et al., 2010; Chora et al., 2010].
c.35delG; 34% X; 41% c.35dupG; 0,5% c.314_327del14; 3% c.167delT; 2% tRNASER(UCN) m.7444G>A; 0,25% c.235delC; 0,74% Мутации и 12SrRNA m.961insC(n);
c.358_360delGAG; 0,5% полиморфные 0,25% c.79G>A*;
12SrRNA m.961delTinsC(n);
c.302A>G; 0,25% варианты 5,39% 0,74% в генах GJB3, c.290_291insA; 0,25% MYO7A с.47T>C*; 1,23% 12SrRNA, c.299_300delAT; 1% tRNASer(UCN) c.101T>C; 1% SLC26A4q.919-2A>G; 0,25% c.333_334delAA; 0,5% c.380G>A;
SLC26A5, SLC26A5q.-53-2A>G; 0,25% 0,25% SLC26A4 и c.79G>A+341A>G;
c.224G>A; 0,5% c.310_325del14; 0,5% GJB3 c. 357C>T*; 1,23% 0,25% MYO7A q.-3179G>A ; 1,c.95G>A; 0,25% c.404C>T*; 0,25% c.250G>C;0,25% c.109G>A; 0,5% c.551C>G;0,5% c.457G>A*; 0,5% c.139G>T; 0,25% Рис. 3. Спектр и доля мутантных хромосом генов GJB2, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A5, SLC26A4 и MYO7A у больных НСНТ из РБ. Рамкой выделены мутации в гене GJB2, встречающиеся с частотой 1% и более.
Выделены и отмечены звездочкой полиморфные варианты.
Доля идентифицированных мутантных хромосом у больных НСНТ из РБ составила 58%, а доля семей, в которых причина потери слуха полностью установлена - 59 % (рис. 3). Следует отметить, что в этих семьях возможно проведение молекулярно-генетической диагностики, а члены этих семей полностью информативны для проспективного медико-генетического консультирования.
На основании полученных результатов исследований о спектре и частоте мутаций в генах GJB2, GJB3, 12SrRNA, SLC26A5, SLC26A4, и tRNASer(UCN) нами был предложен алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ (рис. 4). Данная схема действий при ДНКЦдиагностике не является строгой и может варьировать в зависимости от конкретного клинического случая. Согласно этому алгоритму, обследование следует начинать с прямой диагностики на наличие мутации c.35delG гена GJB2. В случае полной информативности семьи ДНК-диагностика ограничивается прямым методом. В случае частичной информативности или абсолютной неинформативности, проводится молекулярно-генетический анализ для выявления 21 мутации в генах GJB2 и GJB6, наиболее часто встречающихся у пациентов НСНТ из РБ:
c.35dupG, c.167delT, c.235delC, c.358_360delGAG, c.302A>G, c.290_291insA, c.299_300delAT, c.333_334delAA, c.310_325del14, c.314_327del14, c.101T>C, c.109G>A, c.139G>T, c.380G>A, c.224G>A, c.95G>A, c.551G>C, c.250G>C, c.79G>A+c.341A>G, GJB6-D13S1830 и GJB6-D13S1854. Если эти мутации не выявляются, то проводится ресеквенирование экзона 2 GJB2 и экзона 3 GJB6. При неинформативности исследования генов GJB2 и GJB6, проводится глубокое ресеквенирование генов мтДНК 12SrRNA и tRNASer(UCN), а также генов SLC26A4 и SLC26A5.
АНАЛИЗ ГЕТЕРОЗИГОТНОГО НОСИТЕЛЬСТВА МУТАЦИЙ с.35delG, с.235delC И с.167delT В ГЕНЕ GJB2 В ПОПУЛЯЦИЯХ ЕВРАЗИИ Распространенность наиболее важных делеций гена GJB2, особенно мутации c. 35delG, хорошо изучена в ряде популяций мира [Gasparini et al., 2000; Kokotas et al., 2008; Mahdieh et al., 2009; Kokotas et al., 2010], однако до недавнего времени такие данные, касающиеся популяций, проживающих на территории Российской Федерации, были ограничены [Anichkina et al. 2001;
Хидиятова и др., 2002; Posukh et al., 2005, Шокарев и др., 2005; Зинченко и др., 2007; 2008]. Новые данные, полученные в нашей работе, позволяют, до некоторой степени, закрыть существующие пробелы в информации о распространенности мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC гена GJB2 на территориях Волго-Уральского региона, Средней Азии, Северного Кавказа и Якутии.
Рис. 4. Алгоритм ДНК-диагностики НСНТ в РБ.
Мутация c.35delG Нами была изучена частота гетерозиготного носительства с.35delG среди различных популяций коренного населения Волго-Уральского региона (башкиры, татары, чуваши, мордва, удмурты, коми-пермяки), а также в выборке русских. В тюркоязычных популяциях Волго-Уральского региона мутация с.35delG обнаружена с частотами 1%, 0,3%, и 0%, у татар, башкир и чувашей, соответственно. Среди финно-угорских популяций ВолгоУральского региона мутация с.35delG была выявлена с экстремально высокой частотой 6,2% у мордвы, с частотой 3,7% у удмуртов и отсутствует у комипермяков. Ранее, высокая частота с.35delG (4,4%) была обнаружена у эстонцев, что явилось очевидным исключением для популяций Северной Европы с низкими частотами с.35delG [Gasparini et al., 2000]. Данные о частоте мутации с.35delG в популяциях Волго-Уральского региона, полученных нами, и в других исследованиях [Anichkina et al., 2001;
Хидиятова с соавт., 2002; Шокарев с соавт., 2005; Зинченко с соавт., 2007;
Хуснутдинова с соавт., 2005], свидетельствуют о вариабельности частоты гетерозиготного носительства с.35delG среди коренных популяций ВолгоУральского региона.
Частота гетерозиготного носительства с.35delG, выявленная нами у русских - 2,2%, сопоставима с данными, полученными в других исследованиях русского населения в центральных регионах России [Anichkina et al., 2001; Шокарев с соавт., 2005; Зинченко с соавт., 2007].
В исследованных тюркоязычных популяциях Центральной Азии (казахи, уйгуры, узбеки) мутация c.35delG с низкой частотой обнаружена у казахов (0,8%) и уйгуров (0,9%) и не выявлена у узбеков. В тюркоязычных популяциях Сибири (якуты, алтайцы) мутация c.35delG с относительно низкой частотой (0,4%) была выявлена нами в популяции якутов, но не обнаружена в популяции алтайцев [Posukh et al., 2005].
В исследованных популяциях Северного Кавказа (абхазы, аварцы, черкесы, ингуши) мутация с.35delG выявлена только у абхазов (3,8%) и черкесов (1,3%).
Пространственное распределение частот мутации с. 35delG на территории Евразии, построенное на основании данных, полученных в этом исследовании и доступных на 2010 г. литературных данных, представлено на рис. 5. Полученные данные о распространенности мутации 35delG среди различных популяций, располагающихся на обширных территориях Евразии, позволят, до некоторой степени, уточнить или, возможно, пересмотреть современные представления о центре происхождения, возрасте, и механизмах распространенности мутации с.35delG. Таким образом, полученные нами данные подтверждают градиент снижения частоты гетерозиготного носительства мутации с.35delG с запада на восток: высокая частота с.35delG в популяциях Восточной Европы (белорусы, украинцы), промежуточные частоты с.35delG - в популяциях Волго-Уральского региона и Средней Азии, и минимальная частота с.35delG у якутов в Восточной Сибири.
Рис. 5. Пространственное распределение частот мутации c.35delG гена GJBв популяциях Евразии Наблюдаемый градиент снижения частоты с.35delG, в общем, соответствует данным сравнительного анализа линий мтДНК в финно- и тюркоязычных популяциях Северной Евразии, где было отмечено снижение содержания европеоидного компонента в генофонде этих популяций в направлении с запада на восток от Восточной Европы до Сибири [Хуснутдинова и др., 2006; Khusnutdinova E. et al., 2009].
Мутация c.167delT Ранее было показано, что частота гетерозиготного носительства с.167delT в популяционных выборках евреев Ашкенази составляет, в среднем, 4,03%, достигая в некоторых выборках 7,5%, и что на хромосомах пациентов, несущих с.167delT, выявляется общий предковый гаплотип, что может указывать на эффект основателя в происхождении этой мутации [Morell et al., 1998; Sobe et al., 1999; Lerer et al., 2000]. Распространенность c.167delT в Евразии ограничена, в основном, территорией Ближнего Востока, хотя эта мутация спорадически выявляется и в других регионах [Mahasneh et al., 2006; Niceta et al., 2007; Padma et al., 2009].
В исследованных нами популяциях мутация c.167delT была обнаружена в коренных этносах Волго-Уральского региона: у чувашей (1%) и коми-пермяков (2,5%). Эти данные могут свидетельствовать как о распространении хромосом с мутацией с.167delT, имеющих ближневосточное происхождение, в популяции чувашей и коми-пермяков, так и о независимом возникновении этой мутации, поскольку у народов, соседствующих с чувашами и коми, мутация с.167delT не обнаружена.
Мутация c.235delС При анализе гена GJB2 в ряде азиатских стран, выяснилось, что мутация c.235delC является мажорной в Японии, Китае, Корее и Монголии, и ее частота составляет 1,6% - 20,3% на хромосомах в выборках глухих пациентов, а частота гетерозиготного носительства c.235delC варьирует от 0,8% до 1,3% [Han et al., 2008; Dai et al., 2009], но мутация c.235delC практически отсутствует в популяциях Южной и Юго-Восточной Азии [Ramchander et al., 2005, Wattanasirichaigoon et al., 2004; Snoeckx et al., 2005] и лишь спорадически обнаруживается в других регионах Евразии, имеющих сложный этнический состав населения [Snoeckx et al., 2005].
На территории бывшего Советского Союза мутация c.235delC выявлена с частотой 3,5% у тюркоязычных алтайцев (Южная Сибирь) [Posukh et. al., 2005], с частотой 1,3% у мордвы (Волго-Уральский регион), с частотой 1,7% у аварцев, локальной группы на Кавказе со сложным этногенезом, и, с относительно низкой частотой 0,4% в популяционной выборке казахов.
Интересно заметить, что мутация c.235delC не была выявлена у тюркоязычных якутов (Восточная Сибирь), хотя, основываясь на данных археологов, этнографов и лингвистов, а также учитывая данные по изучению мтДНК и Y-хромосомы предполагается, что якуты мигрировали на север от их первоначального поселения в районе озера Байкал под давлением экспансии монголов между тринадцатым и пятнадцатым веками нашей эры [Pakendorf et al., 2006].
Пространственное распределение частоты мутации c.235delC на территории Евразии показывает градиент снижения частоты c.235delC с востока на запад на территории Евразии и демонстрирует, что АлтаеСаянский регион мог являться потенциальным регионом происхождения этой мутации (рис. 6).
Рис. 6. Пространственное распределение частот мутации c.235delС гена GJBв популяциях Евразии.
Полученные нами результаты вносят весомый вклад в уточнение распространенности мажорных рецессивных мутаций с.35delG, с.235delC и с.167delT гена GJB2 в популяциях Евразии и могут быть дополнительным свидетельством предполагаемой роли эффекта основателя в происхождении и распространенности этих мутаций в популяциях мира.
РЕКОНСТРУКЦИЯ ГАПЛОТИПА ОСНОВАТЕЛЯ С МУТАЦИЕЙ с.35delG В ГЕНЕ GJB2, ЯВЛЯЮЩЕЙСЯ ОСНОВНОЙ ПРИЧИНОЙ НСНТ В РБ В отношении распространенности некоторых мутаций гена GJBпоказана расовая и/или этническая специфичность, обусловленная в ряде случаев эффектом основателя, а также, возможно, географической и социальной изоляцией некоторых популяций [Abidi et al., 2008; Kokotas et al., 2010]. Наиболее распространенная в Европе мутация c.35delG (средняя частота гетерозиготного носительства в Старом Свете 1/51 (1,9%) [Gasparini et al., 2000], вероятно, имела также одну хромосому основателя. Впервые данная мутация возникла, по разным оценкам, от 10 000 до 14 000 лет назад, на территории Ближнего Востока или Средиземноморья (возможно, на территории современной Греции) [Najmabadi et al., 2002; Kokotas et al., 2008;
Kokotas et al., 2010]. Впоследствие, с неолитической популяцией Homo sapiens, она была занесена в Европу [Van Laer et al., 2001]. У населения РБ, преимущественно русских, татар и башкир была идентифицирована основная молекулярно-генетическая причина наследственной несиндромальной формы тугоухости и глухоты, обусловленная мутацией c.35delG. Высокая частота данной мутации (34%) при НСНТ у пациентов из РБ может свидетельствовать о ее локальном накоплении на территории ВолгоУральского региона. Из всех исследованных популяций Волго-Уральского региона с высокой частотой гетерозиготного носительства мутация c.35delG была идентифицирована у мордвы (1/16), удмуртов (1/27), русских (1/46), реже у татар (1/96) и (1/400) у башкир. Единственной популяцией из ВолгоУральского региона, в которой не было зарегистрировано ни одного носителя c.35delG, были коми-пермяки. Территория Южного Урала, где располагается Республика Башкортостан, как и всего Волго-Уральского региона, находясь на границе Европы и Азии, на протяжении исторически длительного времени была ареной постоянного генетического взаимодействия многих этнических слоев. В формировании народов края известна роль угров Западной Сибири, финнов севера Восточной Европы, индо-иранцев Ближнего Востока, тюрков Южной Сибири и Алтая, а позднее кочевых татаро-монгольских племен и славянских народов Центральной и Западной Европы [Кузеев, 1985]. На сегодняшний день РБ имеет многонациональный состав населения с общей численностью 4104336 человек.
Материалом для гаплотипического анализа и оценки времени экспансии c.35delG гена GJB2 послужили образцы ДНК 56 пациентов с НСНТ из РБ, у которых мутация была идентифицирована в гомозиготном состоянии (русских, 10 татар, 1 башкир, 4 украинца, 2 армянина, 7 метисов). В контрольную группу включены 179 здоровых индивидов из трех этногеографических групп русских, татар и башкир (86 русских, башкирских и 62 татарских семьи), у которых данная мутация не выявлена.
Для оценки возраста мутации c.35delG в гене GJB2 были использованы три высокополиморфных СА-маркера: D13S175, D13S141 и D13S143 [Van Laer et al., 2001; Rotchrok et al., 2003; Abidi et al., 2008; Kokotas et al., 2008; Kokotas et al., 2010], расположенных в области размером около 2Мб вокруг локуса DFNB1, содержащего ген GJB2 (рис. 7).
Центромера Теломера 1,5 Mб 38,5 Кб 84 Кб GJB(19659605-19665114 п.н.) D13S141 D13S175 D13S1(19622459-19622584 п.н.) (19746380-19746734 п.н.) (21172085-21172213 п.н.) 1,535 См (Marshfield) 5,94 См (Marshfield) 6,03 См (Marshfield) Рис. 7. Локализация микросателлитных маркеров D13S141, D13S175 и D13S143, фланкирующих ген GJB2 на хромосоме 13. Расстояния между геном GJB2 и маркерами обозначены стрелками При анализе распределения частот аллелей трех микросателлитных локусов D13S141, D13S175 и D13S143 на нормальных хромосомах и хромосомах с мутацией с.35delG было установлено выраженное неравновесие по сцеплению между определенными аллелями данных маркеров и мутацией с.35delG в гене GJB2 (табл. 2). Степень ассоциаций аллелей исследованных внегенных микросателлитных локусов наглядно отражает стандартный коэффициент аллельной ассоциации (St) [Krawczak et al., 1998]. Наибольшая степень сцепления с мутацией с.35delG характерна для аллеля 125 маркера D13S141 (St=-0,438) и аллеля 105 (St=-0,386) маркера D13S175.
Учитывая данные, полученные нами при исследовании полиморфизма ДНК-локусов D13S141, D13S175 и D13S143, неравновесное сцепление их определенных аллелей (табл. 2) с мутацией с.35delG в кодирующем регионе GJB2, мы предположили, что должен существовать предковый гаплотип или гаплотип основателя. Для членов каждой из 56 семей с наследственной глухотой и 179 здоровых доноров по трем полиморфным локусам были реконструированы гаплотипы.
Точная идентификация гаплотипа D13S141-D13S175-D13S143 была возможна для 112 мутантных хромосом с с.35delG и 358 нормальных хромосом.
Таблица Распределение частот аллелей микросателлитных локусов D13S141, D13S175, и D13S143 в группах пациентов с НСНТ из РБ и контроле.
Хромосомы с мутацией Нормальные хромосомы Аллель c.35delG (N=112) (N=358) 2 р (п.н.) Кол-во Частота Кол-во Частота хромосом аллеля хромосом аллеля D13S1113 0 0 10 0,0270,008 0,3131 0,123 26 0,2320,03 211 0,5890,026 43,458 0,0125 84 0,7500,04 112 0,3120,024 67,058 0,000 0,6361127 2 0,0170,002 25 0,0690,013 4,2629 0,0D13S1101 3 0,0260,01 21 0,0580,01 1,793 0,3103 8 0,0710,02 88 0,2450,02 15,875 0,0105 91 0,8120,03 157 0,4380,02 47,866 0,000 0,6660107 1 0,0080,007 30 0,0830,01 7,763 0,0109 6 0,0530,02 38 0,1060,01 2,783 0,1111 0 0 7 0,0190,007 2,222 0,1113 3 0,0260,01 17 0,0470,01 0,897 0,0D13S1126 1 0,0080,007 0 0 3,192 0,128 1 0,0080,007 5 0,0130,006 0,169 0,130 90 0,800,04 283 0,790,02 0,088 0,81 0,0623132 6 0,050,02 26 0,070,01 0,490 0,134 12 0,110,01 37 0,100,01 0,012 0,136 2 0,0170,02 3 0,0080,004 0,727 0,138 0 0 4 0,0110,005 3,278 0,Распределение гаплотипов на нормальных хромосомах характеризуется высокой степенью дисперсии, частота самого распространенного гаплотипа 123-105-130 не превышает 17,8%, что подтверждается большим значением гаплотипического разнообразия (h=0,9434). Также частыми гаплотипами на хромосомах здоровых доноров являются 123-103-130 (7,82%), 125-103-1(5,58%), 123-109-130 (4,46%), 123-107-130 (4,46%), 123-101-130 (3,35%), 123103-134 (2,23%) и 123-113-130 (2,23%). Кроме того, еще шесть гаплотипов (125-103-136, 125-105-128, 113-105-132, 123-105-128, 125-109-126 и 123-109136), не обнаруженных на нормальных хромосомах, встречались относительно часто на хромосомах с мутацией с.35delG, на долю каждого приходилось приблизительно по 1%. Из 59 гаплотипов, обнаруженных на нормальных хромосомах, 34 варианта гаплотипов не обнаружены на хромосомах с мутацией с.35delG. При анализе распределения частот гаплотипов на 112 хромосомах с мутацией c.35delG обнаружено различных гаплотипов. Обращает на себя внимание низкое значение гаплотипического разнообразия (h=0,6453) и достаточно высокая частота одного гаплотипа 125-105-130, встречающегося с частотой 59% (рис. 8).
Обнаружены достоверные различия частот гаплотипа 125-105-130 при сравнении хромосом с мутацией с.35delG и хромосом здоровых доноров (2=64,866, р<0,001).
На основе проведенного анализа неравновесия по сцеплению аллелей полиморфных маркеров D13S175, D13S143 и D13S141 с заболеванием нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация с.
35delG - это, вероятнее всего, гаплотип 125-105-130 (рис. 8). Таким образом, реконструкция 112 гаплотипов, вероятнее всего, указывает на единство происхождения большинства исследованных мутантных хромосом, что подтверждает наше предположение о распространении мутации с. 35delG на территории Волго-Уральского региона в результате эффекта основателя.
0,0,0,50 c.35delG/c.35delG контроль 0,0,0,0,0,Рис. 8. Распределение частот гаплотипов D13D141-D13S175-D13S143 на нормальных хромосомах и хромосомах с мутацией с.35delG у пациентов с НСНТ из РБ. По оси ординат указаны частоты гаплотипов, по оси абсцисс - названия гаплотипов.
При определении аллельного состава гаплотипа основателя мы руководствовались следующим: поскольку в момент появления в популяции мутации с. 35delG формируется полное неравновесие по сцеплению этой мутации с аллелями 125, 105, и 130 маркеров D13S141, D13S175 и D13S1составляющими гаплотип основателя, и данное неравновесие вследствие рекомбинационных событий в области размером около 2Мб вокруг локуса DFNB1, содержащего ген GJB2, размывается с течением времени, в настоящее время аллели из гаплотипа основателя должны характеризоваться максимальной неравновесностью сцепления с локусом заболевания по сравнению с другими аллелями тех же маркеров.
Наибольшие значения параметра неравновесия по сцеплению были получены для аллелей 105 и 125 маркеров D13S175 и D13S141, расположенных проксимально, наименьшее - для аллелей маркера D13S143, расположенного дистально по отношению к гену GJB2 (табл. 2). Слабое сцепление аллелей маркера D13S143, расположенного дистально от гена GJB2, может свидетельствовать о достаточно большом периоде времени, которое прошло с момента появления мутации и о сильном размытии гаплотипа основателя. Исходя из значений параметра 2 и параметра неравновесия по сцеплению, гаплотип основателя представляется состоящим из аллелей 125-105-130. Этот гаплотип был выявлен на 59% всех хромосом, несущих мутацию с.35delG. Среди хромосом без этой мутации данный гаплотип был идентифицирован только на 19% хромосом.
Для расчета значения числа поколений, прошедших после начала распространения мутации с.35delG в популяциях Волго-Уральского региона, были выбрани 2 STR-маркера - D13S175 и D13S141. Критерием отбора данного маркера являлись относительно высокие показатели значения параметров 2 и меры неравновесия по сцеплению , а также учитывались статистически значимые отличия в распределении частот аллелей этих маркеров между хромосомами с мутацией с. 35delG и хромосомами без данной мутации на 95% уровне значимости (p<0,05). D13S143 не был включен в число маркеров, по которым производился расчет числа поколений, т.к. он продемонстрировал минимальное значение параметра неравновесия по сцеплению (табл. 2).
Значение числа поколений, прошедших после начала дивергенции гаплотипа основателя с мутацией с. 35delG в популяциях Волго-Уральского региона, находится в интервале ~ от 132,71 до 470,5 поколений назад (в среднем, 301 поколение). Продолжительность одного поколения по аналогии с другими работами, считали равной 25 годам [Рафиков и др., 1981]. Таким образом, время, за которое произошла экспансия хромосом, несущих мутацию с. 35delG, в популяциях Волго-Уральского региона, находится в интервале ~ от 3320 до 11762 лет, со средними значениями ~ 7540137,5лет.
Датировка времени начала распространения гаплотипа основателя по мутации с. 35delG в популяциях Волго-Уральского региона находится в интервале ~ от 3300 до 11800 лет. Однако подобная оценка расчета числа поколений, на основании физического расстояния часто дает либо завышенный, либо заниженный возраст мутации, поскольку учитывается не наблюдаемое значение мутационных событий, а приблизительное.
Поэтому при данном подходе предпочитают ориентироваться не на средние значения, а выбирают наиболее удаленный, но еще сцепленный с локусом заболевания маркер, так называемая граница стабильного гаплотипа [Slatkin et al., 2000]. В данном случае это маркер D13S175. Если предположить, что значения числа поколений, рассчитанное по данному маркеру, являются более корректными, то наиболее вероятное время экспансии гаплотипа основателя с мутацией с. 35delG в популяциях Волго-Уральского региона составляет ~ 11800 лет. Учитывая, что средний год рождения индивидов с с.35delG в гомозиготном состоянии - 1986, период начала экспансии мутации начался ~10000 лет до н.э. период неолита эпохи голоцена. Такая датировка начала экспансии с.35delG подтверждается многочисленными работами современных исследователей, где приблизительный возраст мутации с.35delG оценивается в 10000-14000 лет [Van Laer et al., 2001; Rothrock et al., 2003; Najmabadi et al., 2002; Kokotas et al., 2008; Kokotas et al., 2010].
РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЗИРОВАННОГО РЕГИСТРА ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ, СИСТЕМАТИЗАЦИИ, ОБСЛЕДОВАНИЯ И УЧЕТА БОЛЬНЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ НАРУШЕНИЯ СЛУХА На первом этапе работы была составлена формализованная карта (ФК) обследования пациентов с НСНТ, которая послужила основой для последующей разработки автоматизированного генетического регистра Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота.
ФК состоит из пяти частей: паспортной, генеалогической, анамнестической, клинической и лабораторно-инструментальной, каждая из которых делится на разделы и подразделы. ФК заполняется врачамисурдологом, офтальмологом, кардиологом, нефрологом и врачом-генетиком на основе информации, полученной непосредственно от пациента, его родственников и данных медицинской документации. Карта очень проста и удобна в использовании. При работе с ней осуществляется заполнение существующих полей или выбор одного или нескольких из предложенных вариантов ответа.
На основе ФК нами разработан и внедрен автоматизированный регистр Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота на базе Республиканского сурдологического центра Республиканской детской клинической больницы.
Основными функциями регистра являются:
1) формирование базы данных, электронное ведение документации о больных с наследственными заболеваниями органа зрения;
2) оценка динамики состояния каждого больного и группы обследуемой в целом;
3) формирование выборки больных по ряду критериев;
4) оптимизация диспансерного наблюдения;
5) формирование отчетной документации (консультативных заключений, эпикризов, результатов эпидемиологического анализа);
6) статистический анализ данных для клинических, эпидемиологических и научных целей;
7) создание статистических таблиц, графиков, отчетов;
8) эпидемиологический мониторинг наследственных форм потери слуха в РБ.
Программа предназначена для работы врача-сурдолога и врачагенетика в условиях поликлинической службы, стационаров, медицинской кафедры учебно-образовательного учреждения и для научных исследований.
БИОЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ НАРУШЕНИЯ СЛУХА Психологические и социальные аспекты рассматриваемой проблемы Большинство специалистов различного профиля, работающие с глухими и тугоухими пациентами, подчеркивают важность социального контекста, в котором возникают этические проблемы.
Социально неадекватный слух, т.е. потерю слуха, не позволяющую общаться без вспомогательных средств (слуховых аппаратов), имеют, приблизительно, 25% - 30% пациентов [Загорянская и др., 2003]. Это группа детей, в которой развитие речи, как коммуникативной функции, затруднено.
Значительная потеря слуха создает дополнительные сложности в развитии и обучении ребенка, его интеграции в общество.
Официальная статистика в Российской Федерации оперирует результатами всеобщих переписей населения, проводимых по отработанной стандартизированной методике. Однако большинство цифр в семейной статистике носят достаточно обобщенный характер и семьи, входящие в этот массив, достаточно разнообразны. Отдельная статистика по семьям, имеющим детей с нарушением слуха, есть только в некоторых регионах РФ [Маркова и др., 2008 Зинченко и др., 2007, 2008, 2009]. Для конкретных исследовательских и практических целей в Сурдологическом центре при Республиканской детской клинической больнице г. Уфы мы применяем несколько вариантов типологических групп семей.
Семья, имеющая ребенка с сенсорным дефектом, может жить либо в городе, либо в сельской местности. В РБ в сельской местности проживает около 35% семей из числа всех семей, имеющих детей с нарушением слуха.
Распределение семей по величине очень показательно. Средняя величина российской семьи - 3,23 человека, причем эта цифра является стабилизировавшимся результатом долговременной тенденции ее сокращения. Среднее число детей в семье, имеющей их, 1,63 [Тимошенко, 2006]. В РБ средняя величина семьи, имеющей детей с нарушением слуха, составляет 3,0 человека, среднее число детей в семье - 2,0.
Основная масса семей в РБ, в которых есть глухие или слабослышащие дети, относится к типу расширенной семьи, с многопоколенной структурой.
Основную массу (75,4%) составляют двухдетные и однодетные семьи, и все меньше таких, где детей в семье более 3, не говоря уже о более крупных.
Многодетные семьи со слабослышащими и глухими детьми, особенно живущими в сельской местности, почти обязательно имеют материальные проблемы, жилищные трудности (около 82%). Одна из самых главных трудностей таких семей связана с проблемами образования и воспитания ребёнка с нарушением слуха (около 99% случаев).
Определёнными особенностями в исследуемой группе выделяются семьи с детьми от разных браков (10%), чаще всего, одной матери и разных отцов. Среднее количество детей в них выше, чем в семьях одного брака, жилищные, материальные условия, как правило, хуже.
Материнская неполная семья со слабослышащим или глухим ребёнком (5,3%) - результат привычного стереотипа при разводе или в случае рождения ребёнка у матери, не состоящей в браке.
Наконец, определённая категория семей является результатом антисоциальной жизни родителей, прежде всего, матери (0,45%).
У большинства семей, имеющих слабослышащего или глухого ребёнка, возникают проблемы, связанные не только с сегодняшним благополучием семьи, но и с необходимостью приобретения ребёнком профессии, которая могла бы стать источником средств к существованию в будущем. Появление в семье слабослышащего или глухого ребёнка является тяжёлым испытанием для родителей. Это оказывает влияние не только на их эмоциональное состояние, но и на родительские установки и поведение [Обухова, 2007]. В неблагополучных семьях ситуация осложняется нежеланием родителей утратить защитный статус инвалида, дабы не лишиться льгот и выплат, что способствует формированию своеобразного отношения к недугу ребёнка.
Вид и тяжесть детской патологии, безусловно, влияют на характер и качество этого отношения [Обухова, 2007].
Уровень сельских жителей в РБ, как и в целом, по России, в материальном плане остается весьма низким. Дороговизна проездных расходов до г. Уфы является значительным препятствием для потенциальных пациентов медико-генетической консультации. Лечебно-профилактические учреждения на местах не имеют законных оснований воспользоваться статьей расходов на оплату проезда до г. Уфы женщин из отягощенных семей для пренатальной ДНК-диагностики на ранних сроках беременности, не предусмотрены такие статьи расходов и в системе обязательного медицинского страхования. Решением данной проблемы, на наш взгляд, является создание специализированных врачебных бригад, имеющих в своем составе врачей-генетиков, сурдологов, офтальмологов, педиатров, неврологов и психологов, которые могли бы выезжать в отдаленные районы Республики для выявления и последующей диспансеризации семей высокого риска по наследственной тугоухости/глухоте. Также основной задачей таких коллективов врачей различного профиля являлось бы более активное выявление носителей мутаций и помощь в выборе решения пациентами о возможности проведения дородовой ДНК-диагностики, а также осуществление качественной психологической поддержки семьи.
Этические особенности медико-генетического консультирования семей с наследственными формами потери слуха Одной из самых важных проблем, на наш взгляд, является проведение дородовой ДНК-диагностики у лиц с наследственными формами потери слуха без адекватного медико-генетического консультирования с соблюдением всех этических норм и правил, и последующее директивное отношение к пациенту, выражающееся в настоятельных рекомендациях прервать уже имеющуюся беременность.
Преодоление сложившихся в силу объективных причин заблуждений в отношении наследственных форм тугоухости/глухоты предполагает решение проблем, связанных с организацией распространения современных знаний и биоэтических принципов среди врачей, работающих с данным контингентом пациентов и населением. Прежде всего, необходима интеграция врачей - генетиков с медицинскими работниками других специальностей (акушеровгинекологов женских консультаций, сурдологов, неврологов, педиатров) для осуществления мероприятий по профилактике появления новых случаев наследственных форм нарушения слуха. Данные мероприятия должны включать: просветительскую деятельность среди медицинских работников о возможностях ДНК-диагностики и дородовой диагностики наследственных нарушений слуха, скрининг гетерозиготных носителей среди новорожденных и работа с семьями высокого риска по наследственной глухоте в центрах планирования семьи, женских консультациях, детских поликлиниках и сурдологических центрах. Также необходимым, на наш взгляд, является оказание психологической поддержки консультирующимся при обнаружении у них носительства патологического варианта гена.
Таким образом, медико-генетическое консультирование пациентов с наследственными нарушениями слуха в РБ должно основываться на существующих принципах биоэтики (Всеобщая декларация о биоэтике и правах человека, Париж, 24 июня 2005 г.).
1. Взаимоотношения врача и пациента основываются на взаимном доверии и являются недирективными. В целом, работая с пациентами в медикогенетической консультации и Сурдологическом центре при Республиканской детской клинической больнице г. Уфы, мы стараемся придерживаться принципа недирективности и доверительных взаимоотношений с пациентами.
2. Каждый индивидуум, проходящий ДНК-тестирование, либо желающий его пройти, имеет право на получение исчерпывающей информации о его заболевании, сущности ДНК-диагностики и возможных результатах.
Данный принцип реализуется нами в полной мере, поскольку при консультативном приеме у врача Сурдологического центра при Республиканской детской клинической больнице г. Уфы увеличено время на каждого пациента до 2 часов с возможностью повторных приемов по желанию пациента.
3. Решение о прохождении ДНК-тестирования должно быть добровольным. Данный принцип также соблюдается нами в полном объеме - пациенты из отягощенных семей приходят на консультирование и добровольно изъявляют желание пройти ДНКдиагностику наследственных форм тугоухости/глухоты.
4. Необходимым условием проведения медико-генетического консультирования является информированное согласие, которое означает, что пациент полностью ознакомлен с предоставленной ему информацией, адекватно ее понимает и принимает решение об обследовании самостоятельно, без какого-либо давления извне.
Информированное согласие на проведение ДНК-диагностики оформляется в письменной форме в двух экземплярах, один из которых хранится у врача-генетика Сурдологического центра при Республиканской детской клинической больнице г. Уфы, а второй остается у пациента.
5. ДНК-тестирование для лиц из отягощенных семей из РБ проводится бесплатно.
6. На обдумывание решения о прохождении ДНК-диагностики пациенту выделяется время. Мы всегда извещаем пациентов, что у них есть время на обдумывание при принятии решения о генетическом тестировании.
7. Информация о результатах тестирования строго конфиденциальна и сообщается лично пациенту и его лечащему врачу. Пациент также самостоятельно решает о сообщении результатов ДНК-диагностики родственникам.
8. ДНК-тестирование у несовершеннолетних детей проводится только с письменного согласия их родителей.
Анализ анкетирования семей пациентов с НСНТ по биоэтическим вопросам Мы провели анкетирование пациентов НСНТ и членов их семей на предмет осведомленности по наследственным формам тугоухости/глухоты и для предоставления возможности им выразить свое отношение к медикогенетическому консультированию и пренатальной ДНК-диагностике. Анкета была разработана в Лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН совместно с Учреждением Российской академии медицинских наук Якутским научным центром комплексных медицинских проблем Сибирского отделения РАМН, Сурдологическим центром при Республиканской детской клинической больнице г. Уфы и Межобластным медико-генетическим центром при Республиканской клинической больнице им. Г.Г. Куватова.
По результатам анкетирования пациентов с НСНТ из РБ были сделаны следующие важные выводы:
1. Большинство опрошенных пациентов (83%) не знают о современных методах диагностики наследственных заболеваний, что в целом свидетельствует о низком уровне информированности населения в рамках данной проблемы;
2. Высокий процент из числа опрошенных (56%) считают, что их семьям необходима медико-генетическая консультация;
3. Более половины пациентов (60%) выразили желание пройти ДНКтестирование, для выяснения причин нарушения слуха у их ребенка.
4. Большинство тугоухих и глухих респондентов (80%) отказались бы от прерывания беременности в случае, если бы было известно, что у плода имеются нарушения слуха.
ВЫВОДЫ 1. По данным сегрегационного анализа у пациентов с наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из Республики Башкортостан выявлено преобладание аутосомно-рецессивной формы заболевания (89%). Аутосомно-доминантная форма составляет 11%.
2. По данным эпидемиологического исследования распространенность наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в Республике Башкортостан составляет 5,7 на 100000 (1:17543) населения, что сопоставимо с современными показателями в мире. Установлено неравномерное территориальное распространение заболевания с очагами накопления в центральных и юго-восточных районах Республики.
3. В изученной выборке больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из Республики Башкортостан наиболее распространенной мутацией в гене GJB2 является мутация с.35delG (34%), остальные мутации генов GJB2 (c.35dupG, c.167delT, c.235delC, q.3179G>A, c.358_360delGAG, c.302A>G, c.290_291insA, c.299_300delAT, c.333_334delAA, c.310_325del14, c.314_327del14, c.101T>C, c.109G>A, c.139G>T, c.380G>A, c.224G>A, c.95G>A, c.551G>C, c.250G>C, c.79G>A+c.341A>G), 12SrRNA (m.961insC(n) и m.961delTinsC(n)), 12SrRNA и tRNASer(UCN) (m.7444G>A), SLC26A5 (q.-53-2A>G) и SLC26A4 (q.919-2A>G) составляют 24%. Доля идентифицированных мутантных хромосом у больных НСНТ из РБ составила 57%, а доля семей, в которых причина потери слуха полностью установлена - 59 %.
4. Выявлена существенная неоднородность по частоте гетерозиготного носительства мажорных мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC гена GJB2 между славянскими, финно-угорскими, тюркскими, адыго-абхазскими, дагестанскими и нахскими группами этносов. Определены частоты гетерозиготного носительства мажорных мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC гена GJB2 в популяциях Волго-Уральского региона, составляющие, в среднем 1,29%, 0,3% и 0,1%, соответственно.
5. Популяционным механизмом накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в популяциях ВолгоУральского региона является эффект основателя. Наиболее вероятное время экспансии гаплотипа основателя с мутацией с. 35delG в гене GJB2 в популяциях Волго-Уральского региона составляет 10000 лет.
6. Разработан, обоснован и внедрен в работу медико-генетических консультаций оптимальный для этнически подразделенного населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты.
7. Создан Республиканский генетический регистр наследственных форм потери слуха, позволяющий решать задачи накопления эпидемиологической информации о нозологической структуре, диспансеризации семей с наследственными заболеваниями слуха, пре- и постнатальной диагностики и профилактики заболевания, а также проводить генетический мониторинг населения.
8. Разработаны биоэтические правила взаимодействия с тугоухими и глухими пациентами, позволяющие повысить уровень медико-генетического консультирования пациентов с наследственными формами потери слуха.
9. Выявлена недостаточная информированность тугоухих и глухих индивидов (83%) о современных методах дородовой и проспективной ДНКдиагностики по данным проведенного социологического опроса пациентов с наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из Республики Башкортостан.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Полученные в ходе исследования данные о распространенности наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоте в Республике Башкортостан, довести до сведения сотрудников медикогенетической консультации региона, использовать при обучении студентов старших курсов ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, последипломной подготовки врачей на кафедрах педиатрии, терапии, семейной медицины, неврологии и оториноларингологии.
2. Врачам-педиатрам, акушерам-гинекологам, терапевтам, эндокринологам, невропатологам, офтальмологам, оториноларингологам, рекомендуется направлять пациентов с клиническими проявлениями наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоте в Медико-генетическую консультацию при Республиканском перинатальном центре или в Республиканский сурдологический центр Республиканской детской клинической больницы.
3. Учитывая достаточно высокую распространенность наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в Республике Башкортостан и высокую частоту гетерозиготного носительства мутации с. 35delG в гене GJB2 среди индивидов с нормальным слухом, всем пациентам с сенсоневральными формами нарушения слуха в Республике Башкортостан рекомендуется ДНК-диагностика для уточнения диагноза и прогноза потомства.
4. В целях совершенствования медико-генетической помощи больным с наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой в Республике Башкортостан разработать и внести на утверждение Министерством здравоохранения РБ Республиканскую целевую программу профилактики врожденных и наследственных форм нарушения слуха на 2011Ц2015 гг.
5. Вести широкую просветительскую работу среди педиатров, терапевтов, невропатологов, офтальмологов, эндокринологов, оториноларингологов и акушеров-гинекологов с целью активного выявления и формирования ориентированного потока для оказания медико-генетической помощи.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ СТАТЬИ 1. Dzhemileva L.U. Carrier frequency of GJB2 gene mutations c.35delG, c.235delC and c.167delT among the populations of Eurasia / L.U. Dzhemileva, N.A. Barashkov, O.L.
Posukh, R.I. Khusainova, V.L. Akhmetova, I.A. Kutuev, I.R. Gilyazova, V.N. Tadinova, S.A. Fedorova, I.M. Khidiyatova, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova // Journal of Human Genetics. - 2010.-V.8. - Р. 35Ц40.
2. Барашков Н.А. Реконструкция гаплотипа основателя с мутацией q.-31(IVS1+1G>A) гена GJB2, приводящей к аутосомно-рецессивной глухоте 1 А типа, в популяции якутов / Н.А.Барашков, С.А. Федорова, Л.У. Джемилева, Н.А.
Соловьева, Л.В. Григорьева, Ф.А. Платонов, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2010. - №11. - С. 11Ц18.
3. Барашков Н.А. Мутация сайта сплайсинга q.-3179 (IVS1+1G>A) гена GJB2 - основная причина наследственной несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты у якутов / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова Н.А.
Соловьева, Л.В. Григорьева, Ф.А. Платонов, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2010. - №7. - С. 22Ц32.
4. Джемилева Л.У. Хуснутдинова Анализ гетерозиготного носительства мутаций 35delG 167delT и 235delC, в гене GJB2 в популяциях Евразии / Л.У. Джемилева, Н.А. Барашков, О.Л. Посух, Р.И. Хусаинова, В.Л. Ахметова, Кутуев И.А., В.Н.
Тадинова, С.А. Федорова, И.М. Хидиятова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2009. - № 8. - С. 20Ц28.
5. Джемилева Л.У. Анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой наследственной этиологии из различных регионов России / Л.У. Джемилева, О.Л. Посух, А.М.
Тазетдинов, Н.А. Барашков, С.Г. Журавский, С.Н. Пониделко, Т.Г. Маркова, В.Н.
Тадинова, С.А. Федорова, Н.Р. Максимова, Э.К. Хуснутдинова // Генетика. - 2009.
- № 7. - С. 982Ц991.
6. Барашков Н.А. Наследственная несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота в Якутии: молекулярно-генетические аспекты и опыт кохлеарной имплантации / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Ф.М. Терютин, Э.Е. Федотова, А.М. Тазетдинов, С.К. Кононова, А.Л. Сухомясова, Е.Е. Гуринова, С.П. Алексеева, А.Н. Ноговицына, А.Р. Максимова, Э.К. Хуснутдинова // Якутский медицинский журнал. - 2009 - №2. - С. 49Ц52.
7. Терютин Ф.М. Кохлеарная имплантация у ребенка с врожденной сенсоневральной глухотой, обусловленной мутацией 35delG в гене GJB(коннексин 26) / Ф.М. Терютин, Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, О.Л. Посух, Э.Е.
Федотова, Е.Е. Гуринова, С.А. Федорова, Г.А. Таварткиладзе, Э.К. Хуснутдинова // Вестник оториноларингологии. - № 2. - 2009. - С. 17Ц19.
8. Тазетдинов А.М. Молекулярная генетика синдрома Ушера / А.М. Тазетдинов, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Генетика. - 2008. - №6. - С. 1Ц9.
9. Барашков Н.А. Мутации гена коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью в республике Саха (Якутия) / Н.А.
Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Н.Р. Максимова, Э.К. Хуснутдинова // Вестник оториноларингологии. - 2008. - №5. - С. 23Ц28.
10. Посух О.Л. Митохондриальные мутации в этиологии наследственной глухоты / О.Л. Посух, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика - 2008. - №1 - С. 12Ц20.
11. Хидиятова И.М. Популяционные особенности ДНК-диагностики наследственных заболеваний / И.М. Хидиятова, А.С. Карунас, Р.И. Хусаинова, В.Л. Ахметова, Л.У.
Джемилева, Р.Р. Валиев, Э.К. Хуснутдинова // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - 2008. - № 12. - С. 17Ц25.
12. Зинченко Р.А., Морозова А.А., Галкина В.А., Хидиятова И.М., Хлебникова О.В., Кононов А.Б., Федотов В.П., Хусаинова Р.И., Ахметова В.Л., Джемилева Л.У., Щагина О.А., Хуснутдинова Э.К., Гинтер Е.К. Медико-генетическое изучение населения Республики Башкортостан. Сообщение II. Разнообразие наследственной патологии в трех районах Республики // Медицинская генетика - 2007. - №7. - С.
18Ц25.
13. Зинченко С.П. Генетико-эпидемиологическое исследование наследственных (изолированных и синдромальных) нарушений слуха в Республике Чувашии / С.П.
Зинченко, А.Г. Кириллов, А.В. Абрукова, Т.В. Сорокина, Е.И. Шаронова, И.М.
Хидиятова, Л.У. Джемилева, Р.А. Шокарев, Е.А. Близнец, Р.А. Зинченко, Е.К.
Гинтер // Медицинская генетика. - 2007. - №5. - С. 19Ц29.
14. Джемилева Л.У. Молекулярные основы дегенеративных процессов в сетчатке при тапеторетинальной абиотрофии сетчатки / Л.У. Джемилева, Э.Р. Гринберг, А.М. Тазетдинов, И.С. Зайдуллин М.М., Бикбов, В.В. Мусина, Э.К. Хуснутдинова // Молекулярная биология. - 2007. - №6. - С. 7Ц14.
15. Гринберг Э.Р. Новая мутация R252P гена RHO у больных пигментным ретинитом из Башкортостана / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Молекулярная биология. Ц2007. - №3. - С. 33Ц35.
16. Барашков Н.А. Вклад мутаций 35delG, 167delT и 235delC гена коннексина (GJB2) в возникновение наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости в Республике Саха / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Н.Р. Максимова, А.Л. Сухомясова, Е.Е. Гуринова, С.К. Кононова, Ф.М. Терютин, Е.Э. Федотова, А.Н. Ноговицына, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2007. - № 9. - С. 26Ц31.
17. Джемилева Л.У. Гены белков-коннексинов, принимающие участие в процессе звуковосприятия / Л.У. Джемилева, Э.Р. Гринберг, Р.М. Хабибуллин, Э.К.
Хуснутдинова // Вестник оториноларингологии. - 2006. - № 4. - С. 15Ц20.
18. Барашков Н.А. Идентификация мутации 35delG в гене GJB2 у детей с нейросенсорной тугоухостью в Республике Саха (Якутия) / Н.А. Барашков, Л.У.
Джемилева, С.К. Кононова, Н.Р. Максимова, Э.Е. Федотова, А.Л. Сухомясова, В.М. Николаев, С.А. Федорова, Э.К. Хуснутдинова, А.Н. Ноговицына // Наука и образование. - 2006. - № 2 (42). - С. 129Ц133.
19. Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетический анализ несиндромальной аутосомно-рецессивной тугоухости и глухоты у больных и в популяциях ВолгоУральского региона / Э.К. Хуснутдинова, Л.У. Джемилева // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчиникова. - 2005.
- № 1. - С. 24Ц31.
20. Dzhemileva L.U. Novel mutations and haplotype analysis of genomic polymorphisms of GJB2 and GJB3 genes associated with profound and moderately severe hearing loss in patients from Bashkortostan / L.U. Dzhemileva, I.M. Khidiyatova, R.M. Khabibullin, Е.
К. Khusnutdinova // Balkan Journal of Medical Genetic. - 2003. - V. 6. - Р. 41Ц46.
21. Хидиятова И.М. Анализ частоты мутации 35delG в гене коннексина 26(GJB2) у больных с несиндромальной аутосомно-рецессивной глухотой из Башкортостана и в популяциях народов Волго-Уральского региона / И.М. Хидиятова, Л.У.
Джемилева, Р.М. Хабибуллин, Э.К. Хуснутдинова // Молекулярная биология. - 2002. - №3. - С. 438Ц441.
ПАТЕНТЫ 22. Джемилева Л.У., Э.К. Хуснутдинова, И.М. Хидиятова, Р.М. Хабибуллин, А.М.
Тазетдинов. Способ выявления мутаций в гене GJB2, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты. Патент РФ № 2317547. Зарегистр. 20.02.2008. Б.И.№5 (2008).
23. Джемилева Л.У., А.М. Тазетдинов, И.М. Хидиятова, Э.К. Хуснутдинова. Способ определения мутаций гена MTRNR1 при острой нейросенсорной тугоухости, на фоне применения антибиотиков из группы аминогликозидов. Патент РФ № 2335541. Зарегистр. 10.10.2008. Б.И.№28 (2008).
ГЛАВЫ В ИНОСТРАННЫХ МОНОГРАФИЯХ 24. Dzhemileva L.U. Molecular Screening of Deafness in Populations and Patients with Nonsyndromic Congenital Deafness from the Volga-Ural Region of Russia / L.U.
Dzhemileva, I.M. Khidiyatova, E.K. Khusnutdinova // Deafness, Hearing Loss and the Auditory System. Ed. by Derick Fiedler and Rowland Krause. Nova Science Publishers.
New-York. - 2010. - P. 80Ц25. Dzhemileva L.U. Mutational Analysis of RHO and RDS Genes in Patients with Retinitis Pigmentosa from Volga-Ural Region of Russia / L.U. Dzhemileva, I.S.
Zaidullin, E.R. Greenberg, E.K. Khusnutdinova // Retinitis Pigmentosa: Causes, Diagnosis and Treatment. Ed. by Michal Baert and Cdric Peeters. Nova Science Publishers. - New-York. - 2010. - Chapther 5. - P. 103Ц114.
ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЬИ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ 26. Barashkov N. A. Molecular, audiological and population features of autosomal recessive deafness 1A (DFNB1A) in Yakut population isolate from Eastern Siberia / N. A.
Barashkov, L. U. Dzhemileva, S. A. Fedorova, F. M. Teryutin, O. L. Posukh, E. E.
Fedotova, S. L. Lobov, E. K. Khusnutdinova // Human Genome Meeting. - 2011. - Dubai, UAE. - P. 218.
27. Dzhemileva L.U. Spectrums and frequences of GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A mutations among patients with nonsyndromic hearing loss from Bashkortostan (Russia) / L.U. Dzhemileva, S.L. Lobov, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2011. - Amsterdam, the Netherlands. - P. 312.
28. Barashkov N. A. Homozygosity for IVS1+1G>A GJB2 (connexin-26)splice site mutation in 73 unrelated patients with nonsyndromic hearing loss from East Siberia / N. A.
Barashkov, L. U. Dzhemileva, S. A. Fedorova, F. M. Terutin, E. E. Fedotova, E. K.
Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2010. - Gothenburg, Sweden. - P. 310.
29. Барашков Н.А. Мутация сайта сплайсинга q.-3179 (IVS1+1G>A) гена GJB2 - основная причина наследственной несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты у якутов / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Ф.М.
Терютин, Э.Е. Федотова, Э.К. Хуснутдинова // Материалы IV съезда Российского общества медицинских генетиков. - 2010.ЦРостов-на-Дону. - С. 357.
30. Barashkov N.A. The spectrum of GJB2 (connexin-26) mutations in patients with nonsyndromic hearing loss: high prevalence of the allelic variant V37I (109G>A) in Asian populations of Sakha (Yakutia) / N.A. Barashkov, L.U. Dzhemileva, S.A.
Fedorova, F.M. Terutin, E.E. Fedotova, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2009. - Wien, Austria. - P. 276.
31. Tazetdinov A. M. Mutational analysis of the 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes in patients with nonsyndromic hearing loss from Volga-Ural region (Russia) / A.M.
Tazetdinov, L.U. Dzhemileva, S.N. Ponidelko, E.K. Khusnutdinova // Newborn Hearing Screening. - 2008. Ц - Italy, Cernobbio. - P. 59.
32. Dzhemileva L.U. Molecular analysis of the 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes (mtDNA) in patients with nonsyndromic hearing loss from different Russia regions / L.U. Dzhemileva, O.L. Posukh, N.A. Barashkov, A.M. Tazetdinov, E.K. Khusnutdinova // ESF Research Conference on Rare Diseases. - 2008. - Sant Feliu de Guixols, Spain. - P. 114.
33. Барашков Н.А. Распространенность мутации V37I (109G>A) гена GJB2 (коннексин 26) в популяциях якутов и русских Республики Саха (Якутия) / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Э.К. Хуснутдинова // X Всероссийский популяционный семинар Современное состояние и пути развития популяционной биологии. - 2008. - Ижевск. - С. 23.
34. Dzhemileva L. U. Mutational analysis of the mitochondrial 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes in patients with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss from Volga-Ural region andSiberia (Russia) / L. U. Dzhemileva, O. L.
Posukh, N. A. Barashkov, A. M. Tazetdinov, S. A. Fedorova, N. R. Maximova, E. E.
Fedotova, V. N. Tadinova, E. K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2007. - Nice, France. - P. 213.
35. Grinberg E. R. Analysis of RHO and RDS genes mutations in Patients with RP / E. R.
Grinberg, L. U. Dzhemileva, E. K. Khusnutdinova // Asia ARVO - 2007. - Singapore. - P. 147.
36. Dzhemileva L. U. Mutational analysis of the mitochondrial 12S rRNA and tRNASer(UCN) genes in patients with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss from Volga-Ural region and Siberia (Russia) / L. U. Dzhemileva, O.L.Posukh, N.A.Barashkov, A.M. Tazetdinov, S.A. Fedorova, N.R. Maximova, E.F.
Fedotova, V.N. Tadinova, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2007. - Nice, France - Р. 213-214.
37. Барашков Н.А. Анализ мутации A1555G в генe 12S rRNA митохондриальной ДНК у больных с несиндромальной нейросенсорной глухотой из Республики Саха (Якутия) / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, Н.Р. Максимова, Ф.М. Терютин, А.Л.
Сухомясова А.М. Тазетдинов // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - 2007. - Москва. - С.
31.
38. Гринберг Э.Р. Изучение распространенности тапеторетинальной абиотрофии и мутации, выявленные в генах RHO и RPE65 у больных из Республики Башкортостан / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Материалы школы семинара по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика- наука XXI века -2007. - Пущино. - С. 34-36.
39. Джемилева Л.У. Спектр мутаций в 12SrRNA и tRNASer(UCN) генах мтДНК у больных наследственными формами несиндромальной потери слуха, проживающих в различных регионах России / Л.У. Джемилева, А.М. Тазетдинов, О.Л. Посух, Н.А. Барашков, Э.К. Хуснутдинова // Материалы школы семинара по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика- наука XXI века.
- 2007. - Пущино. - С. 122-123.
40. Тазетдинов А.М. Анализ генов MTRNR1 (12SrRNA) и MTTS1 (tRNASer(UCN)) у больных с острой нейросенсорной тугоухостью / А.М. Тазетдинов, Л.У.
Джемилева, О.Л. Посух, Н.А. Барашков, Э.К. Хуснутдинова // Материалы докладов 11-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА. - 2007. - С. 18.
41. Барашков Н.А. Вклад мажорных мутаций гена коннексина 26 (GJB2) в возникновении наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости в популяции якутов / Н.А. Барашков, Л.У. Джемилева, С.А. Федорова, Ф.М.
Терютин, Н.Р. Максимова, А.Л. Сухомясова, Э.Е. Федотова, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 50-летию высшего медицинского образования Республики Саха (Якутия) - 2007. - Якутск. - С. 12-15.
42. Tazetdinov A.M. Molecular analysis of MTRNR1 and MTTS1 genes in patients with suddenly deafness from Russia / A.M. Tazetdinov, L.U. Dzhemileva, S.N. Ponidelko, E.K. Khusnutdinova // 7th Balkan Meeting of Human Genetics. - 2006. - Skopje. - Р.
96.
43. Dzhemileva L.U. Molecular screening of deafness in populations and patients with nonsyndromic congenital deafness in Volga-Ural region / L.U. Dzhemileva, A.M.
Tazetdinov, A.H. Baimiev, R.M. Khabibulin, E.K. Khusnutdinova // 7th Balkan Meeting of Human Genetics. - 2006. - Skopje. - Р. 41.
44. Grinberg E. R. Mutation analysis of RHO gene in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan / E. R. Grinberg, L. U. Dzhemileva, E. K.
Khusnutdinova // European Society of human Genetics. - 2006. - Amsterdam, the Netherlands. - P. 236.
45. Grinberg E. R. Mutation Analysis of RHO gene and novel mutation Arg252Pro (755G>C) in Patients with Nonsyndromic Retinitis Pigmentosa from Bashkortostan / E. R.
Grinberg, L. U. Dzhemileva, E. K. Khusnutdinova // 7th Balkan Meeting of Human Genetics. - 2006. - Skopje. - P. 40.
46. Grinberg E. R. Mutation analysis of RHO gene and novel mutation Arg252Pro in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan / E. R. Grinberg, L. U.
Dzhemileva, E. K. Khusnutdinova // European association for Vision and Eye Research Congress. - 2006. - Vilamoura, Portugal. - Р. 45.
47. Гринберг Э.Р. Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии сетчатки / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Тезисы докладов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. - 2006. - Пущино. - C.
35.
48. Джемилева Л.У. Идентификация мутации 312-32del 14 гене GJB2 (коннексина 26) у больных наследственной несиндромальной глухотой из Башкортостана/ Л.У.
Джемилева, А.Х. Баймиев, Р.М. Хабибуллин, Э.К. Хуснутдинова // V съезд Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика (часть I). - 2005. - №5. - С. 149. Гринберг Э.Р. Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии сетчатки в Башкортостане / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Международная Конференция Генетика в России и мире, посвященной 40летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН - 2006. - Москва. - С.
55.
50. Гринберг Э.Р. Молекулярно-генетический анализ гена RPE65 у больных с пигментным ретинитом из Башкортостана / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К.
Хуснутдинова // V съезд Российского общества медицинских генетиков.
Медицинская генетика (часть I). - 2005. - №5. - С. 175.
51. Гринберг Э.Р. Изучение гена RPE65 у больных с пигментным ретинитом / Э.Р.
Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Всероссийская научнопрактическая конференция Актуальные вопросы офтальмогенетики. - 2005. - Москва. - С. 45.
52. Grinberg E.R. Novel 1308delT mutation of the RPE65 gene in patients with nonsyndromic retinitis pigmentosa from Bashkortostan / E. R. Grinberg, L. U.
Dzhemileva, E. K. Khusnutdinova // European Journal of Human Genetics. - 2005. - Prague. - P. 237.
53. Dzhemileva L. U. The novel 312-326del14 mutation of the connexin 26 gene is the second common cause of non-syndromic sensorineural hearing loss in patients with deafness from Bashkortostan / L. U. Dzhemileva, I. M. Khidiyatova, E. K.
Khusnutdinova // European Journal of Human Genetics. - 2005. - Prague. - P. 236.
54. Гринберг Э.Р. Скрининг мутаций в гене RPE65 у больных с пигментным ретинитом из Башкортостана / Э.Р. Гринберг, Л.У. Джемилева, Э.К. Хуснутдинова // Международная научно-практическая конференция Биологические науки в XXI веке. Проблемы и тенденции развития - 2005. - Бирск. - С. 7-11.
55. Джемилева Л.У. Анализ частоты мутации 35delG гена коннексина 26 (Сх26, GJB2) у больных с несиндромальной аутосомно-рецессивной глухотой из Башкортостана / Л.У. Джемилева, И.М. Хидиятова, Р.М. Хабибуллин, Э.К. Хуснутдинова // IV Международный симпозиум Современные проблемы физиологии и патологии слуха. - 2001. -Суздаль.- С. 63.
56. Джемилева Л.У. Анализ частоты мутации 35delG гена коннексина 26, детерминирующей развитие несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты, в популяциях народов Волго-Уральского региона / Л.У. Джемилева, И.М.
Хидиятова, Э.К. Хуснутдинова // Международный конгресс Биоразнообразие и динамика экосистем в Северной Евразии, BDENEТ2001. - 2001. - Новосибирск.- С. 157. Джемилева Л.У. Изучение частоты мутации 35delG гена коннексина 26, вызывающей развитие несиндромальной наследственной глухоты в популяциях Волго-Уральского региона / Л.У. Джемилева, И.М. Хидиятова, Э.К. Хуснутдинова // Юбилейная научная конференция молодых ученых Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков. - 2001.- Уфа. - С. 47.
58. Dzhemileva L. U. Analysis of connexin 26 gene mutations in families with inherited deafness from Bashkortostan / L. U. Dzhemileva, I. M. Khidiyatova, E. K.
Khusnutdinova // Inherited Disorders and their Genes in Different European Populations. -2001. - San Feliu de Guixols, Spain. ЦP. 31.
59. Dzhemileva L. U. Analysis of connexin 26 gene (GJB2) mutations in families from Bashkortostan with inherited non-syndromic hearing loss / L. U. Dzhemileva, I. M.
Khidiyatova, E. K. Khusnutdinova // Human Genome Meeting. Ц2002. - Shanghai. - P.
151.
60. Dzhemileva L. U. Spectrum of connexin 26 gene (GJB2) mutations in families from Bashkortostan with inherited non-syndromic deafness / L. U. Dzhemileva, I. M.
Khidiyatova, E. K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2002. - Strasbourg, France. ЦP. 289.
Джемилева Лиля Усеиновна (Россия) Молекулярно-генетический анализ наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости Получены данные по распространенности наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ, которая составляет 5,7 на 100000 (1:17543) населения. Изучена частота гетерозиготного носительства мутаций с.35delG, с.167delT и с.235delC в гене GJB2 в 17 популяциях Евразии. Проведен анализ спектра и частоты мутаций в генах GJB2, GJВ6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4 и SLC26A5 у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ. Установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей и генотипов микросателлитных маркеров D13S141, D13S175 и D13S143 гена GJB2 на нормальных хромосомах и хромосомах с мутацией с.35delG у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ. Рассмотрен механизм накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты, вызванной мутацией с.35delG в гене GJB2 в РБ на основании проведенного гаплотипического анализа и оценен возраст мутации с.35delG в гене GJB2 в популяциях Волго-Уральского региона.
Разработаны новые подходы в области профилактики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты для совершенствования медико-генетической помощи пациентам с наследственной формой нарушения слуха в РБ.
Dzhemileva Lilya Useinovna (Russia) Molecular analysis of hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss The data on the prevalence of hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss in the Republic of Bashkortostan was received. It was 5.7 per 1000(1:17543) of the population. The heterozygous carrier frequency of c.35delG, c.167delT and c.235delC mutations of the GJB2 gene in 17 populations of Eurasia was revealed. The analysis of the spectrum and frequency of mutations in genes GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer(UCN), SLC26A4 and SLC26A5 in patients with non-syndromic sensorineural hearing loss from Bashkortostan Republic was performed. The differences in distribution of polymorphic alleles and genotypes of microsatellite markers D13S141, D13S175 and D13S143 of the GJB2 gene in normal chromosomes and chromosomes with c.35delG mutation in patients with hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss from Bashkortostan were obtained. The mechanism of accumulation of non-syndromic sensorineural hearing loss caused by c.35delG mutation in Bashkortostan Republic is analyzed on the basis of haplotype analysis. The age of c.35delG mutation in the GJB2 gene in populations of the Volga-Ural region was defined. New approaches are developed to prevent hereditary sensorineural hearing loss and to improve medical and genetic consulting for patients with the inherited form of hearing impairment in Bashkortostan Republic.