МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ; СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭТИХ ИНФЕКЦИЙ 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

На правах рукописи

БОРИСОВА

ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ;

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭТИХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мазурова Изабелла Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Меньшиков Дмитрий Дмитриевич

доктор медицинских наук Грубер Ирина Мироновна

доктор медицинских наук, профессор Далин Михаил Викторович

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится л_____ ___________________ 2009 г. в ____ час. на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Государственном учреждении науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан л______ _________________ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций (Герасимова А.Г. и др., 2004; Лыткина И.Н. и др., 2004; Максимова Н.М. и др., 2002, 2003, 2008; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006; Петрова М.С. и др., 2000; Селезнева Т.С. и др., 2002, 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2001, 2005).

Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидпроцессов этих инфекций.

Однако, в настоящее время в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) отмечается относительная стабилизация заболеваемости коклюшем (показатель заболеваемости на 100000 населения (ПЗ) 2006 г. - 13,28; 2007 г. - 12,87), регистрируется заболеваемость среди привитых детей, наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста) и тяжесть клинического течения коклюша (регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста) (Лыткина И.Н. и др., 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2005). Аналогичные тенденции развития эпидпроцесса коклюшной инфекции отмечаются в России (Герасимова А.Г. и др., 2004; Селезнева Т.С. и др., 2002). При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ - 0,48 - 0,35 в 2005 - 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета (Максимова Н.М. и др., 2002, 2003; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006). Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит, существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность иррадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики (Мазурова И.К., 1993, 2002, 2006, 2008).

Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость возбудителей, лежащая в основе их адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощный селективный фактор отбора (Борисова И.Э. и др., 2008; Селезнева Т.С., 2002; Семенов Б.Ф. и др., 2002, 2003; Cassiday P. et all, 2000; de Melker H.E. et all, 2000; Gandon S. et all, 2003, 2007; Packard E.R. et all, 2004; Preston A. et all, 2005).

Поэтому, в сложившихся условиях необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменениям фенотипа и появлению новых клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.

Цель исследования: выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности B. pertussis и С. diphtheriae, циркулирующих на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и разработка принципиально новых подходов к совершенствованию лабораторной диагностики и средств вакцинопрофилактики коклюша и дифтерии.

Задачи исследования

Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxА гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 - 2007 гг.
Изучить генетическую структуру штаммов B. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов B. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов патогенности.
Разработать ускоренный метод мониторинга, основанный на технологии ПЦР-ПДРФ, для выявления распространенных в настоящее время штаммов B. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина.
Разработать и провести клинико-микробиологические испытания ускоренного молекулярно-генетического метода лабораторной диагностики коклюша (LAMP-вариант), позволяющего идентифицировать возбудителя коклюша в клиническом материале без предварительного выделения чистой культуры B. pertussis.
Изучить структуру гена дифтерийного токсина (tox) и провести наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в его структуре.
Определить нуклеотидную последовательность (amy ген), являющуюся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность С. diphtheriae, и выявить мишени - нуклеотидные последовательности ДНК, ответственные за принадлежность возбудителя дифтерии к биовару gravis или mitis, и на этой основе разработать новый метод дифференциальной диагностики биоваров.
Систематизировать коллекцию штаммов B. pertussis, выделенных за период 1948 - 1994 гг., и пополнить коллекцию штаммов B. pertussis и С. diphtheriae штаммами современного периода эпидпроцессов.

Научная новизна

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показано, что происходит вытеснение штаммов, содержащих вакцинные аллели, штаммами с невакцинными аллелями генов, кодирующих S1 субъединицу коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков.

Получены новые данные об особенностях структуры пяти основных генов патогенности штаммов B. pertussis. Установлено, что в настоящее время штаммы B. pertussis с новым невакцинным ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина распространились и полностью вытеснили штаммы B. pertussis с вакцинными ptxА4 и ptxА2 аллелями; новые невакцинные prn2 и prn3 аллели гена пертактина встречаются у 76,0% и 21,9% штаммов, соответственно. В тоже время формирование и распространение штаммов с невакцинными fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) не выявлено. Обнаружено, что современная популяция штаммов B. pertussis, характеризующаяся новыми невакцинными аллелями основных генов патогенности, обладает высокой патогенностью и высокой лейкоцитозстимулирующей активностью, что влияет на тяжесть клинического течения коклюша.

Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин, фимбриальные белки, штаммов B. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакцинопрофилактики при коклюше.

Показано, что сохраняется циркуляция штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаев) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Выявлено, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют делецию этого фрагмента генома.

Сформированы новые подходы в системе мониторинга коклюшной инфекции и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии, основанные на современных амплификационных технологиях, использующих выбранные мишени (нуклеотидные последовательности ДНК).

Впервые разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) и получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Впервые разработан молекулярно-генетический способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae по принадлежности к биовару; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13(044745).

Теоретическая значимость

Новые знания о генетической структуре возбудителей коклюшной и дифтерийной инфекций, об измененных нуклеотидных последовательностях и мутациях в генетических детерминантах факторов патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae являются обоснованием для создания новых вакцинных препаратов, в первую очередь, при коклюшной инфекции, на основе современных штаммов B. pertussis. Установленные факты имеют значение для формирования новых подходов в системе мониторинга и ускоренной лабораторной диагностики возбудителей коклюша и дифтерии, основанных на выборе генетических мишеней и на современных амплификационных технологиях. Данные о генетической гетерогенности штаммов свидетельствуют о резерве изменчивости, лежащем в основе механизмов формирования адаптаций микроорганизмов к меняющимся условиям существования и сохранению B. pertussis и C. diphtheriae как биологических видов.

Практическая значимость

Пополнена уникальная коллекция штаммов B. pertussis и С. diphtheriaе, позволяющая проводить многоплановые исследования возбудителей коклюша и дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики при этих инфекциях.

Подобраны штаммы B. pertussis, вызывающие заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса, с новой генетической структурой основных факторов патогенности, как кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов.

Новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ позволяет определять штаммы с измененной структурой ptxА гена коклюшного токсина для наблюдения за циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции популяцией B. pertussis.

Прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант выявляет возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного без выделения чистой культуры в течение 9 - 10 часов. Клинические испытания метода показали его высокую специфичность (100%), высокую чувствительность (103 м.кл.) и высокую диагностическую эффективность (84,9% 4,9% (р < 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% 5,7% (р < 0,001). Использование LAMP-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания, начиная с ранних сроков, а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях.

Способ дифференциальной диагностики C. diphtheriae позволяет определять принадлежность к биовару по более специфичному, по сравнению с биохимической идентификацией, признаку - нуклеотидной последовательности в amy гене, что является одним из этапов в создании новых мультиплексных тест-систем для выявления возбудителя дифтерии при обследовании больных с подозрением на дифтерию и для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий на курсах сертификации и повышения квалификации для врачей Цбактериологов Актуальные вопросы медицинской микробиологии, проводимых на базе ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2000 г.; 2004 г.; 2005 г.; 2006 г.); семинара Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ г. Москвы на базе ФГУЗ ЦГиЭ (г. Москва) (2008 г.); семинара по лабораторной диагностике дифтерии для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Центрального федерального Округа Российской Федерации, проводимого в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (2002 г.) и были использованы при составлении следующих пособий, рекомендаций и информационного письма (совместно с сотрудниками лаборатории):

Пособие для врачей Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 - 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией).
Методические рекомендации Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции.
Пособие для врачей Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина.
Пособие для врачей Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae.

Патенты на изобретения (в соавторстве):

Патент на изобретение Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis № 2299908 от 27 мая 2007 г.
Способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae; положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13(044745).
Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша; положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Штаммы B. pertussis - кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов переданы в ГУ НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова РАМН.

Разработанные методы ускоренной лабораторной диагностики коклюша и дифтерии внедрены в практическую работу отделений № 2 и № 20 ИКБ № 1 (г. Москва).

Основные положения, выносимые на защиту:

Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis выявил особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и изменения в распространении штаммов, несущих вакцинные и невакцинные аллели генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки.
У штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции, произошли изменения структуры генов, кодирующих основные факторы патогенности коклюшного микроба - коклюшного токсина (ptxА ген), пертактина (prn ген) и фимбриальных белков (fim2 и fim3 гены), и отмечается усиление их вирулентных свойств. Структура основных генов патогенности штаммов B. pertussis, используемых в нашей стране для производства АКДС-вакцины, не соответствует структуре этих генов современных штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.
Мутационные изменения происходят в структурном tox гене дифтерийного токсина C. diphtheriae - циркулируют штаммы с незначительными единичными мутациями, не приводящими к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина. Распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой этого гена (в положении 1252), приводящей к замене аминокислот, не произошло. Определена последовательность нуклеотидов, являющаяся генетической детерминантой дополнительного фактора патогенности C. diphtheriae, не связанного с токсином, - amy геном, ответственным за амилазную активность.
Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae, позволили подобрать специфические мишени (нуклеотидные последовательности ДНК) и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы - мониторинга штаммов B. pertussis и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии для ускоренного выявления возбудителей этих болезней непосредственно в клиническом материале.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 6 от 23 октября 2008 г. Основные результаты исследований представлены и доложены на 4-х Российских и 15-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002; 2007); Российских научно-практических конференциях Инфекционные болезни на рубеже XXI века (Москва, 2000), Вакцинология Ц 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней (Москва, 2006); на международных конференциях Идеи Пастера в борьбе с инфекциями (Санкт-Петербург, 1998; 2003; 2008); на Международных совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET Ц Халхидики, 1998; Брюссель, 2000; Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Вольягмени, 2006; Ларнака, 2008).

Основное содержание работы отражено в 40 научных публикациях.

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Эпидемиология, микробиология, Федеральной целевой программы Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 - 2011 годы), подпрограммы Вакцинопрофилактика, Международных проектов IncoCopernicus, INTAS, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по Дифтерии.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименований работ, в том числе отечественных - 167 и зарубежных - 306 авторов. Общий объем диссертации составляет 292 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы бактерий. Изучено 187 штаммов B. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции (34 штамма - 1958 - 1969 гг., 57 штаммов - 1970 - 1989 гг. из коллекции ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора и 96 штаммов, выделенных от больных коклюшем в г. Москве в 1990 - 2007 гг. и полученные из бактериологических лабораторий филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Роспотребнадзора в г. Москве); 147 штаммов C. diphtheriae, выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей на территории России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции (1985 - 2006 гг.) (из них 100 токсигенных штаммов, 47 нетоксигенных штаммов, 76 штаммов биовара gravis и 71 штамм биовара mitis).

Коллекционные штаммы: три штамма B. pertussis, используемые для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины (№ 475 (серотип 1.2.3), № 305 (серотип 1.2.0) и № 267 (серотип 1.0.3) и C. diphtheriae Park Williams 8 (PW 8) - для анатоксина (из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича); референс штамм ВОЗ B. pertussis 18323 (из коллекции ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН). В качестве контролей использовали 20 штаммов B. parapertussis, 8 штаммов B. bronchiseptica, 2 штамма S. aureus, 10 штаммов C. ulcerans, 8 штаммов C. pseudodiphtheriticum из коллекции ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Штаммы микроорганизмов изучены с помощью микробиологических (334 штамма), иммунохимических (187 штаммов) и молекулярно-генетических (секвенирование (267 штаммов), ПЦР-технологии (268 штаммов) методов исследования.

Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica проводили согласно Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше (1984) путем изучения их морфологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Изучение штаммов С. diphtheriae, С. ulcerans, C. glutamicum, C. pseudodiphtheriticum осуществляли по Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции (Мазурова И.К. с соавт., 1998) с определением токсигенных свойств в реакции преципитации в геле (тест Элека); цистиназной, уреазной, сахаролитической и нитратредуктазной активностей.

Для генотипирования штаммов B. pertussis пользовались стандартным протоколом, принятым на международном совещании ведущих специалистов в области молекулярно-биологических исследований представителей рода Bordetella в мае 1999 г. в Парижском институте Пастера (Mooi F., 2000). В основу проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) по выявлению генов: S1 субъединицы коклюшного токсина (ptxА), пертактина (prn), фимбриальных белков (fim2 и fim3), фактора колонизации трахеи (tcfA) взяты условия (Mooi F., 1998). Учитывая высокую стоимость реагентов и трудности их приобретения, проведены эксперименты по адаптации реагентов для ПЦР, предлагаемых российскими фирмами. Праймеры синтезировали в научно-производственной фирме Литех (г. Москва), реагенты для ПЦР приобретали в фирме УFermentasФ (Литва).

Секвенирование фрагментов ptxА, prn, fim2, fim3, tcfA генов штаммов B. pertussis выполнено с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе (Perkin-Elmer Applied Biosystems). При секвенировании фрагментов ptxА гена использовали AF-AR праймеры; 1 области prn гена использовали праймеры AF и AR, 2 области - BF и BR, на область 152 - 707 - PF и PRN707R; фрагментов fim2 - Fim2F - Fim2R праймеры, фрагментов fim3 генов - Fim3F - Fim3R праймеры и фрагментов tcfA гена - TcfAF - TcfAR праймеры. Нуклеотидные последовательности генов штаммов B. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Секвенирование фрагментов tox гена C. diphtheriae проводили по (Nakao H., Mazurova I.K. et all, 1997) c использованием праймеров Diph 1F, Diph 3F, Diph 5F, Diph 6F. Секвенирование выполнено, как отмечено выше. В качестве сравнения использовали данные по структуре гена tox референс штаммов и токсигенных коринефагов из базы GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez ).

Вирулентные свойства штаммов B. pertussis (в опытах in vivo на мышах при интрацеребральном заражении и учете количества павших животных с расчетом LD50) и ейкоцитозстимулирующую активность (ЛСА) культур (подсчет количества лейкоцитов в 1 мм3 периферической крови опытных и контрольных животных) определяли согласно (Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий, 1987).

Статистическая обработка результатов. Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (Гланц С., 1999).

Программное обеспечение. Поиск и выравнивание нуклеотидных последовательностей в международных базах данных проводили с использованием BLAST WWW-сервера в NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; http://www.sanger.ac.uk; http://www.pasteur.fr/mycb. Использовали программы BlastN и Blast2. Подбор олигонуклеотидных праймеров и температур их плавления осуществляли с помощью программы УPrimer3.0Ф (http://www-genome.wi.mit.edu).

Изучение вирулентных и иммунобиологических свойств штаммов B. pertussis выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатории иммуномодуляторов ГУ Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН - руководителем лаборатории к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой и А.С. Шинкаревым. Изучение особенностей структуры tox гена штаммов С. diphtheriae выполнено совместно с сотрудниками лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора - руководителем лаборатории д.м.н., профессором И.К. Мазуровой, ведущим научным сотрудником, д.б.н. С.Ю. Комбаровой и к.м.н., доцентом В.Г. Мельниковым. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта проводили совместно с сотрудниками клинического отдела ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора на базе ИКБ № 1 (г. Москва) - к.м.н. М.С. Петровой и к.м.н. О.П. Поповой, с врачами-бактериологами филиала ФГУЗ ЦГиЭ в Северо-Западном административном округе (СЗАО) (г. Москва) В.Г. Скачковой и В.С. Савинковой и с младшим научным сотрудником ФРЛДДИ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора Н.Т. Гадуа. Исследования по применению мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных проведены совместно с руководителем лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) к.б.н. Н.В. Воложанцевым и сотрудником этой лаборатории В.А. Банновым. Из вышеуказанной лаборатории получены праймеры и протоколы для проведения мультиплексной амплификации. Апробирование метода выявления возбудителя дифтерии проведено на базе ИКБ № 1 (г. Москва) совместно с ведущим научным сотрудником ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора к.м.н. М.П. Корженковой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура основных генов патогенности B. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции

Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis позволил оценить особенности распространения и свойства штаммов возбудителя коклюша, циркулировавших в прошлые годы, и сопоставить с данными о биологических и молекулярно-генетических свойствах штаммов, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Изучена вариабельность биологических свойств 187 штаммов B. pertussis разных этапов эпидпроцесса, характеризующихся различным уровнем заболеваемости, охвата прививками, динамикой тяжести клинического течения коклюша и удельного веса штаммов различных серотипов (рис. 1):

Рисунок 1. Заболеваемость коклюшем и охват профилактическими прививками в г. Москве (1958 - 2007 гг.).

Примечание: - - - данных об охвате прививками в эти годы собрать не удалось

I период - допрививочный и первые десять лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1958 - 1969 гг.), II - период стабилизации заболеваемости в 70-е годы и роста заболеваемости в 80-е годы при резком уменьшении охвата профилактическими прививками (1970 - 1989 гг.) и III - период относительной стабилизации заболеваемости на фоне роста охвата прививками, который к настоящему времени достиг 95,0% (1990 - 2007 гг.).

В патогенезе заболевания коклюшем главная роль принадлежит коклюшному токсину - его энзиматически активной S1 субъединице, кодируемой ptxА геном. Вместе с тем, немаловажную роль в развитии инфекции играют другие факторы патогенности, такие как пертактин, кодируемый prn геном, фимбриальные белки, кодируемые fim2 и fim3 генами, и фактор колонизации трахеи, кодируемый tcfA геном, которые обеспечивают адгезию на поверхности чувствительных клеток эпителия и участвуют в запуске инфекционного процесса. Эти факторы патогенности B. pertussis, определяющие патогенез заболевания коклюшем, имеют важное значение при конструировании перспективных вакцинных препаратов - бесклеточных коклюшных вакцин.

Изучена динамика распространения 187 штаммов B. pertussis, выделенных в разные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, и показано, что штаммы с новыми невакцинными (ptxA1, prn2/prn3, fim2-2 и fim3В) аллелями четырех генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки, постепенно вытесняют штаммы со старыми вакцинными (ptxA2/ptxA4, prn1, fim2-1 и fim3А) аллелями этих генов (рис. 2).

Для штаммов B. pertussis, циркулировавших в допрививочный период и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (I период наблюдения), характерными были вакцинные аллели четырех основных генов патогенности: ptxА2/ptxА4 аллели гена коклюшного токсина (в 47,0% и 53,0% случаев, соответственно), prn1 аллель гена пертактина (в 100% случаев), fim2-1 и fim3А аллели фимбриальных генов (в 89,5% и 100% случаев, соответственно).

С начала 70-х годов в популяции штаммов коклюшного микроба появились штаммы (16,7% штаммов) с новым невакцинным ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина. Начиная с 80-х годов штаммы B. pertussis, имеющие невакцинный ptxА1 аллель гена, стали доминирующими в популяции штаммов B. pertussis и в последующие годы полностью вытеснили штаммы с вакцинными ptxА4 и ptxА2 аллелями этого гена.

Распространение штаммов, несущих новые невакцинные аллели гена пертактина и фимбриальных генов происходило более медленно. Во II периоде наблюдения (1970 - 80-е годы), продолжали циркулировать штаммы вакцинных аллелей: prn1 аллеля (в 89,5% случаев), fim2-1 и fim3А аллелей фимбриальных генов (в 53,3% и 53,3% случаях, соответственно), кроме того, регистрировали штаммы с невакцинными аллелями этих генов патогенности: prn3/prn2 аллелями (в 25,1% и 11,0% случаев, соответственно), fim2-2 и fim3В аллелями (в 46,7% и 46,7% случаев, соответственно). Начиная с 90-х годов и до настоящего времени, в циркулирующей популяции штаммов B. pertussis, доминируют штаммы невакцинных аллелей этих четырех генов - ptxА1, prn2, fim2-2, fim3В и ptxА1, prn3, fim2-2 и fim3В.

Таким образом, вся циркулирующая популяция современных штаммов B. pertussis (в 100% случаев) имеет невакцинный ptxA1 аллель гена коклюшного токсина; доминируют штаммы, содержащие невакцинные prn2 и prn3 аллели гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); отмечается тенденция к увеличению доли штаммов с невакцинными fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов (в 53,3% и 83,4% случаев, соответственно).

Невакцинный ptxА1 аллель характерен для структуры гена коклюшного токсина (КТ) современных штаммов B. pertussis, он отличается от других аллелей немолчащей мутацией в положении 684, приводящей к замене аминокислоты метионина на изолейцин (M228I) в молекуле белка КТ. Все три вакцинных штамма B. pertussis имели вакцинные (№ 475 - ptxА4, № 267 и № 305 Ц ptxА2) аллели гена КТ.

Наиболее существенные изменения произошли в структуре гена пертактина. Вакцинные штаммы характеризовались наличием вакцинного prn1 аллеля гена пертактина. Невакцинные аллели prn2 и prn3 отличались от вакцинного аллеля немолчащими мутациями в положениях 832 - 834, приводящими к замене аминокислоты аланина на фенилаланин (А278F), и мутацией в положении 836 с заменой аминокислоты валин на глицин (V279G), а также наличием у prn2 аллеля дополнительного фрагмента в 15 п.н., которые кодируют новые аминокислоты в белковой молекуле пертактина, что существенно отличает её от молекулы белка пертактина вакцинных штаммов.

Значительно меньшие изменения обнаружены в fim2 и fim3 генах, кодирующих фимбриальные белки. Структура fim2 и fim3 генов циркулирующих штаммов B. pertussis соответствовала одному из двух аллелей fim2 гена и одному из трех аллелей fim3 гена. Вакцинные штаммы характеризовались наличием вакцинных (fim2-2 и fim3А) аллелей фимбриальных генов. У невакцинного fim2-2 аллеля обнаружена молчащая мутация в положении 521, не приводящая к изменению на аминокислотном уровне. Вместе с тем, в невакцинном fim3В аллеле выявлена немолчащая мутация в положении 260, сопровождающаяся заменой аланина на глутаминовую кислоту (А87Е), что является контрастной заменой и оказывает влияние на функциональное состояние белка.

Следовательно, генетическая структура современных штаммов B. рertussis с новыми невакцинными аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов, входящих в АКДС-вакцину, что является весомым основанием для выбора и использования новых штаммов при конструировании АКДС-вакцины (табл. 1).

Все изученные штаммы B. pertussis, независимо от периода эпидемического процесса коклюшной инфекции, также как и три производственных вакцинных штамма, были однородны и имели одинаковую структуру tcfA гена - вакцинный tcfA2 аллель. Другими словами, изменений в tcfA гене, кодирующем фактор колонизации трахеи, оказывающим существенное влияние на процесс адгезии и колонизации возбудителя коклюша в респираторном эпителии дыхательных путей, не обнаружено.

Таблица 1. Сопоставление структуры генов коклюшного токсина (ptxA), пертактина (prn) и фимбриальных (fim2 и fim3) у современных штаммов B. pertussis (2002 - 2007 гг.) и штаммов B. pertussis, входящих в АКДС-вакцину.

Штаммы B. pertussis

ptxA ген

рrn ген

fim2 ген

fim3 ген

от больных коклюшем (70 шт.)

ptxA1 (100%)

prn1 (2,4%)

prn2 (75,8%)

prn3 (21,8%)

fim2-1 (33,3%)

fim2-2 (66,7%)

fim3A (12,5%)

fim3B (87,5%)

Вакцинные штаммы

№ 267 1.0.3

№ 305 1.2.0

№ 475 1.2.3

ptxA2

ptxA4

рrn1

fim2-1

fim3A

Вирулентные свойства штаммов B. pertussis, выделенных на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, изучены в пробе in vivo на мышах. Патогенные свойства штаммов B. pertussis оценивали по вирулентности и лейкоцитозстимулирующей активности.

Анализ данных литературы по изучению вирулентных и токсических свойств штаммов B. рertussis прошлых лет и собственных исследований современных штаммов позволил получить полное представление о свойствах возбудителя коклюша в процессе его циркуляции в различные периоды эпидпроцесса (рис. 3).

Показано, что в 60-е годы прошлого столетия в популяции возбудителя коклюша преобладали высокопатогенные штаммы. Начиная с 70-х годов, в течение 10 лет, стали регистрировать единичные штаммы с новыми невакцинными аллелями генов основных факторов патогенности возбудителя коклюша. При этом высокопатогенных штаммов не выявляли.

В 80-е годы, т.е. в период снижения охвата профилактическими прививками и закрепления в популяции штаммов B. рertussis с невакцинными аллелями, среди циркулирующих штаммов появились высокопатогенные штаммы B. рertussis, удельный вес которых составил 6,0% - 8,0%, а к началу 90-х годов, когда штаммы с невакцинными аллелями заняли доминирующее положение, удельный вес высокопатогенных штаммов вырос до 11,1%. В настоящее время, когда охват профилактическими прививками достиг 95,0%, циркулируют штаммы B. рertussis с новыми невакцинными аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности, и в 72,7% случаев - с высокой степенью патогенности.

Рисунок 3. Патогенные свойства штаммов B. рertussis, выделенных в 1967 - 2005 гг.

Штаммы B. pertussis с мутационными изменениями в гене коклюшного токсина, гене пертактина и фимбриальном гене, обнаружены еще в начале 70-х годов (рис. 2), т.е. через 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной в период стабилизации заболеваемости и высокого охвата прививками. Однако широкое распространение этих новых аллелей происходило в 80 - 90-е годы, когда процент охвата прививками не превышал 32,0% - 33,4%. В это время распространились штаммы B. pertussis с новыми невакцинными аллелями генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков. Появившиеся мутационные изменения в геноме возбудителя коклюша оказались луспешными для циркулирующей популяции и в последующих поколениях получили преимущественное распространение. Можно полагать, что период отсутствия или снижения охвата прививками явился стрессовым фактором, позволившим закрепиться новым мутационным изменениям в циркулирующей популяции и запустить распространение высокопатогенных штаммов B. pertussis с новыми невакцинными аллелями генов, т.е. имеющих новую генетическую структуру основных факторов патогенности.

Нами подобраны три штамма B. рertussis - кандидата для вакцинных препаратов: № 186Ц01 (серотипа 1.0.3) с ptxA1, prn2, fim2-2 и fim3В аллелями, № 178Ц03 (серотипа 1.2.0) с ptxA1, prn3, fim2-2 и fim3В аллелями и № 19Ц05 (серотипа 1.0.3) с ptxA1, prn2, fim2-2, fim3А аллелями генов. Предварительные исследования иммунобиологических свойств этих штаммов показали возможности использования их в качестве кандидатов для конструирования вакцинных препаратов.

Особенности структуры tox гена, кодирующего синтез дифтерийного токсина

С. diphtheriae

При постановке задач по изучению дифтерийной инфекции были учтены результаты совместных исследований, проводимых ранее в Федеральной референс лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (руководитель - д.м.н., профессор И.К. Мазурова) по изучению фено- и генотипических свойств С. diphtheriae, выявлению особенностей формирования структуры популяции и раскрытию механизмов эпидемического распространения возбудителя дифтерии.

Полная нуклеотидная последовательность tox гена секвенирована у 45 штаммов С. diphtheriae (табл. 2). У 18 штаммов С. diphtheriae (в 40,0% случаев) последовательность нуклеотидов структурного tox гена соответствовала последовательности нуклеотидов этого гена производственного вакцинного штамма С. diphtheriae PW 8. В тоже время у 27 штаммов (в 60,0% случаев) в последовательности нуклеотидов обнаружены точечные мутации в 7 положениях. При этом, мутации в 6 положениях не приводили к замене аминокислот и только в позиции 1252 мутация сопровождалась изменением аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Мутационные изменения у штаммов C. diphtheriae встречались в различных сочетаниях (табл. 4). У большинства штаммов C. diphtheriae (в 66,7% случаях) замены нуклеотидов были только в одном из трех положений, у 11,1% штаммов - в двух и у 22,2% штаммов - в трех положениях. Частота встречаемости выявленных мутаций в tox гене штаммов С. diphtheriae была различная (табл. 3).

Таблица 2. Замены нуклеотидов в tox гене у штаммов С. diphtheriae по сравнению со структурой tox гена штамма С. diphtheriae PW 8.

Штаммы С. diphtheriae	Количество штаммов	Положение нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена ДТ
		Промотор-ная обл.	Фрагмент А	Фрагмент В				3Тнекодирую-щая область
		-58	415	1083	1233	1252	1590	1704
PW 8 (производственный)	1	с	t	g	g	g	g	t
от больных и бактерионосителей без изменений нуклеотидных последовательностей	18	c	t	g	g	g	g	t
от больных и бактерионосителей с изменениями нуклеотидных последовательностей	27	t	c	a	a	c!	a	c

Примечание: ! - мутация, приводящая к замене аминокислоты

Во фрагменте А tox гена только у одного штамма С. diphtheriae обнаружили замену нуклеотида, не приводящую к замене аминокислоты в белке дифтерийного токсина, что подтверждает консервативность А фрагмента tox гена. У большинства штаммов С. diphtheriae (в 75,0% случаях) мутационные изменения зарегистрированы в В фрагменте структурного tox гена, из них у 44,4% штаммов мутации выявлены в положении 1233. Обнаруженные мутации также не приводили к изменениям на аминокислотном уровне, за исключением замены нуклеотида в положении 1252, выявленной у двух штаммов биовара mitis, которая повлекла за собой изменение состава аминокислот - глицина на аргинин в положении 393 (G393R), что может оказывать влияние на конформацию и, следовательно, функциональные свойства белка дифтерийного токсина.

Таблица 3. Сочетания мутационных изменений в tox гене ДТ.

Штаммы С. diphtheriae	Количество шта-ов	Положение нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена ДТ
		Промотор-ная область	Фрагмент А	Фрагмент В				3Т некодирую-щая область
		-58	415	1083	1233	1252	1590	1704
PW 8 (производственный)	1	c	t	g	g	g	g	t
выделенные от больных и бактерионосителей	1	*	*	*	*	*	*	c
	1	*	*	*	*	*	a	c
	16	*	*	*	a	*	*	*
	3	*	*	a	*	*	a	c
	1	*	c	*	*	*	*	*
	2	*	*	*	a	*	*	c
	2	*	*	*	a	c!	*	c
	1	t	*	a	*	*	*	с
Частота распространения мутаций (%)		2,2	2,2	8,8	44,4	4,4	8,8	29,2

Примечание: ! - мутация, приводящая к замене аминокислоты; * - наличие аналогичного нуклеотида

Нами проведен мониторинг штаммов C. diphtheriae для обнаружения выявленной мутации в положении 1252. Секвенирован фрагмент tox гена размером 760 п.н. (положение нуклеотидов 991 - 1751) у 35 штаммов C. diphtheriae биовара mitis, выделенных в различных регионах России. В результате проведенного исследования оказалось, что у всех 35 штаммов C. diphtheriae биовара mitis мутация в положении 1252 не выявлена.

Таким образом, обнаружено, что у большинства штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаях) имеются единичные мутации в структурном tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, и только у 2 штаммов C. diphtheriae (в 2,5% случаях) выявлена мутация (замена нуклеотида в положении 1252), которая приводит к контрастной замене аминокислот, что может оказывать влияние на функциональное состояние белка дифтерийного токсина. Появление даже единичных штаммов со значительными мутационными изменениями в tox гене дифтерийного токсина у циркулирующих штаммов свидетельствует о подвижности генетической структуры C. diphtheriae, что может привести к снижению эффективности анатоксина, полученного из токсина C. diphtheriae PW8. С другой стороны, накопление штаммов с множественными мутационными изменениями, не приводящими к аминокислотным изменениям, также может влиять на формирование генетической вариабельности вида и, вероятно, создает резерв изменчивости возбудителя дифтерии в меняющихся условиях существования.

Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов C. diphtheriae

Другим фактором патогенности C. diphtheriae, не связанным с токсическим компонентом, является способность возбудителя синтезировать фермент амилазу, который утилизирует углеводы, и тем самым создает дополнительный источник энергии для ускорения процессов генерации, роста на питательных средах и колонизации на слизистых оболочках человека.

Анализ структуры генома возбудителя дифтерии позволил нам выявить в островке патогенности, включающем локусы DIP0334 - DIP0357, нуклеотидную последовательность - amy ген, кодирующий синтез амилазы, отвечающей за расщепление углеводов. Было сконструировано 10 пар праймеров, фланкирующих 10 взаимоперекрывающихся участков amy гена (рис. 4).

После амплификации (рис. 5) выбранных областей специфические светящиеся фрагменты выявили только в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и не обнаружили в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Был проведен мониторинг 87 штаммов C. diphtheriae биоваров gravis и mitis, выделенных от больных и бактерионосителей в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции, на наличие фрагментов amy гена. Показано, что все образцы ДНК из 31 штаммов C. diphtheriae биовара gravis содержали специфический фрагмент ДНК, в то время как в 56 образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis, данный фрагмент гена не регистрировали.

Рисунок 4. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты amy гена.

Рисунок 5. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием специфических праймеров Amy3F - Amy3R к последовательности фрагмента amy гена.

Примечание: дорожки 1, 18 - маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6, 8, 12, 13, 14 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis; 15, 16, 17 - отрицательные контроли.

Следующим этапом исследования явилось установление размера делеции. Анализ последовательности нуклеотидов в геноме штамма C. diphtheriae показал, что перед аmy геном расположен ген DIP0354. После проведения амплификации со специфическими праймерами и электрофореза регистрировали ПЦР - продукты во всех образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis, и отсутствие таких фрагментов при исследовании образцов, содержащих ДНК штаммов C .diphtheriae биовара mitis.

Для установления начала делеции провели анализ последовательности нуклеотидов генома C. diphtheriae и сконструировали две пары праймеров (рис.6): первая пара праймеров фланкировала область DIP0353 - DIP0354 размером 285 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353 и фрагмент гена DIP0354; другая пара - фланкировала область DIP03532F - DIP03532R размером 225 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353.

После амплификации и электрофореза с парой праймеров DIP03531F - DIP03541R выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие данных ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7А). После амплификации со второй парой праймеров (DIP0353 2F - DIP0353 2R) получили ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7Б).

Рисунок 6. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты генов DIP0354, DIP0357 (amy ген) и DIP0358 C. diphtheriae.

Рисунок 7. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03531F - DIP03541R к последовательности фрагмента локуса DIP0353 - DIP0354 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03532F - DIP03532R к последовательности фрагмента гена DIP0353 (Б) C. diphtheriae.

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis

Для определения конца делеции также сконструировали две пары праймеров (рис. 6): первая пара фланкировала область DIP0357 - DIP0358 размером 307 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0357 (аmy ген) и фрагмент гена DIP0358, кодирующего синтез ацил-CoA-синтазы. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8А) выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Другая пара праймеров фланкировала фрагмент гена DIP0358 размером в 210 п.н. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8Б) получили ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis.

Рисунок 8. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP0357F ЦDIP0358R к последовательности фрагмента локуса DIP0357 - DIP0358 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03582F - DIP0358yR к последовательности фрагмента гена DIP0358 (Б) C. diphtheriae.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара mitis отсутствуют локусы DIP0354 - DIP0357 (amy ген) и, следовательно, эти штаммы не обладают амилазной активностью.

Способностью штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу и использовать дополнительные источники энергии (углеводы) можно объяснить различия и во времени генерации (in vitro) штаммов биоваров gravis и mitis. У штаммов биовара gravis оно составляет 60 минут, в то время как у штаммов биовара mitis - 180 минут. Быстрорастущие штаммы, формирующие колонии большего размера на питательной среде и на слизистых человека, имеют возможность более быстрого захвата железа из инфицированных тканей, что приводит к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина. При изучении уровня токсинообразования (УТ) штаммов C. diphtheriae двух биоваров нами показано, что у штаммов биовара gravis УТ в два раза превышал УТ штаммов биовара mitis (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю. и др., 2004; Мазурова И.К., 1993; Мазурова И.К. и др., 1999). Поэтому, взаимосвязь между тяжестью клинического течения дифтерии и выделением возбудителя биовара gravis можно объяснить высоким уровнем продукции дифтерийного токсина и быстрой колонизацией слизистой ротоглотки штаммами этого биовара. Так, совместные многолетние клинико-микробиологические исследования, проводимые сотрудниками лаборатории ФРЛДДИ совместно с Т.В. Платоновой показали, что в 90-е годы, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией, формировалась генетически однородная высокотоксигенная популяция C. diphtheriae. При этом от больных выделяли штаммы биовара gravis и наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии у непривитых детей, по сравнению с 80-ми годами ХХ века, когда у больных выделяли штаммы C. diphtheriae биовара mitis. Такое наблюдение подкрепляется и данными литературы, показавшими более тяжелую клиническую картину дифтерии при выделении штаммов C. diphtheriae биовара gravis (Нисевич Н.И., 1947; Хрущева В.А., 1964; Корженкова М.П., 2002, 2006).

Способность штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу создает преимущества перед штаммами биовара mitis в скорости роста и, что, наряду с другими особенностями структуры биовара gravis, определяет более широкое и длительное распространение этого биовара. Показано, что период распространения штаммов C. diphtheriae биовара mitis (в 80-ые годы прошлого столетия) составил 7 - 8 лет, в то время как штаммы биовара gravis доминировали и циркулировали многие десятилетия - в 40 - 70-е годы и в течение последних 18 лет (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю., 2004, 2007; Мазурова И.К., 1993, 1997, 1999).

Таким образом, исследование показало, что только штаммы C. diphtheriae биовара gravis несут генетическую детерминанту - amy ген, определяющую дополнительный фактор патогенности - фермент амилазу, дающий микроорганизму лучшие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки и, вследствие этого, более широко и длительно циркулировать среди населения, в то время как штаммы C. diphtheriae биовара mitis, в том числе и производственный вакцинный штамм C. diphtheriae PW8, имеют делецию фрагмента генома, включающего гены DIP0354 - DIP0357.

Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша

Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности, их мутационных изменениях, особенностях циркулирующих штаммов B. pertussis позволили подобрать специфические мишени и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы наблюдения и диагностики за возбудителями коклюша и дифтерии.

Современный мониторинг и лабораторная диагностика инфекционных заболеваний, базирующиеся на молекулярно-генетических методах исследования, выявляют специфические генетические мишени и с большей достоверностью, по сравнению с фенотипической диагностикой, идентифицируют возбудителей инфекций, а также значительно сокращают сроки исследования.

Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе

Нами разработан новый молекулярно-генетический метод мониторинга штаммов B. pertussis, основанный на изучении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ). Метод базируется на выявлении специфических генетических мишеней, дифференцирующих штаммы с новыми особенностями структуры ptxА гена, кодирующего основной фактор патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин. Метод позволяет после проведения рестрикции амплифицированного определенного фрагмента ДНК специфической рестриктазой и последующего электрофореза, получить характерный рестрикционный профиль, являющийся генетическим маркером, тесно связанным с генотипом микроорганизма. Учитывая выявленные особенности структуры различных аллелей ptxА гена (рис. 9), выбран фрагмент ДНК этого гена и подобраны две рестриктазы (EheI и BfuI), с помощью которых получен специфический рестрикционный профиль ДНК (рис. 10).

Наличие мутации в положении 684 ptxA1 аллеля (рис. 9), создающей сайт рестрикции для фермента-рестриктазы EheI, определило выбор специфической мишени для дифференциации штаммов B. pertussis, имеющих новый невакцинный ptxА1 аллель гена от штаммов, несущих старые вакцинные аллели (рис. 10А). Наличие мутации в положении 586, создающей сайт рестрикции для рестриктазы BfuI, определило выбор другой специфической мишени, с помощью которой можно дифференцировать штаммы B. pertussis с уникальным ptxА5 аллелем гена от штаммов с другими аллелями (рис. 10Б).

* 196 204 586 684 696

ptxA2 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATA GGC

ptxA4 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG GTG GGC

ptxA5 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT С CC AAC GC T -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATG GGC

ptxA1 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATA GCG CCG GTG ATA GGC

Рисунок 9. Сайты рестрикции для ферментов-рестриктаз EheI и BfuI.

Примечание: показаны четыре аллели ptxА гена; положения нуклеотидов относительно стартового кодона AJ245366.

Рисунок 10. Профили рестрикции штаммов B. pertussis, полученные после обработки ампликонов рестриктазой EheI ( А) и BfuI (Б).

Примечание

А: Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 2, 3 - рестрикционный профиль тип 1 (EheI); 4, 5, 6, 7 - рестрикционный профиль тип 2 (EheI)

Б: Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 4 - рестрикционный профиль тип I (BfuI); 2, 3, 5 - рестрикционный профиль тип II (BfuI)

Для подтверждения возможностей использования нового метода для мониторинга штаммов возбудителя коклюша, изучен 121 штамм B. pertussis и показана полная корреляция между результатами рестрикционного анализа и секвенирования.

Разработанный нами новый метод типирования штаммов B. pertussis может явиться инструментом в системе мониторинга коклюшной инфекции, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией штаммов B. pertussis, выявлять штаммы с измененной структурой ptxА гена и следить за их распространением. На новый молекулярно-генетический способ типирования штаммов B. pertussis, имеющих различную структуру гена коклюшного токсина, получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Прямой ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции

абораторная диагностика коклюша в России до сих пор основана на микробиологических методах исследования, которые являются недостаточно чувствительными и эффективными. Серологические методы диагностики используются для ретроспективного анализа, так как эффективны только на 4-ой неделе заболевания. Все используемые в настоящее время амплификационные технологии не обладают высокой специфичностью, чувствительностью и дают ложноположительные результаты из-за большой гомологии геномов представителей рода Bordetella.

Нами впервые разработан прямой, ускоренный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант, основанный на современной изотермальной амплификационной технологии. Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP-технологии. Использование этой технологии представляло серьезные затруднения вследствие отсутствия реагентов, используемых в LAMP, трудности их приобретения, а также их высокой стоимости. Поэтому были проведены предварительные эксперименты по оптимизации параметров амплификации - подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Разработанный протокол исследования изучен на большой панели микроорганизмов (рис. 11). Обнаружено, что для всех образцов, содержащих ДНК штаммов B. pertussis, характерными были светящиеся специфические Ladder-подобные профили. Во всех остальных образцах, содержащих ДНК штаммов других микроорганизмов, регистрировали отрицательный результат.

Данный метод с разработанным нами составом реакционной смеси был воспроизводим, что подтверждено серией повторяющихся экспериментов. Во всех сериях опытов отмечали постоянство профилей LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis.

Вместе с тем, такой вариант применим только при изучении чистой культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки прямого метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала (с тампонов от больных коклюшем).

Рисунок 11. Профили LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, С. glutamicum, C. ulcerans, C. pseudodiphtheriticum, C. diphtheriae и S. aureus

Примечание: дорожки 1, 2, 5, 10, 12 - ДНК штаммов B. pertussis (50 штаммов); 3, 4 - ДНК штаммов B. parapertussis (20 штаммов); 6, 7 - ДНК штаммов B. bronchiseptica (8 штаммов); 8 ЦДНК штамма С. glutamicum (2 штамма); 11 - ДНК штамма C. ulcerans (10 штаммов); 14 - ДНК штамма C. pseudodiphtheriticum (8 штаммов); 15, 16 - ДНК штаммов C. diphtheriae (20 штаммов); 9, 13 - ДНК штаммов S. aureus (2 штамма)

Чувствительность амплификационных технологий высока только при работе с чистыми культурами микроорганизмов и автоматически не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияет методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации, а также низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца. Разработка прямого молекулярно-генетического метода включала несколько этапов экспериментальных исследований: предварительную обработку клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обработка), подготовку клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения).

В результате большого числа предварительных экспериментов показано, что прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант обладает высокой специфичностью в 100% случаев, высокой чувствительностью - выявляет 103 м.кл. возбудителя и позволяет идентифицировать возбудителя заболевания в течение 9 Ц10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения чистой культуры.

Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта

Применение LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных коклюшем. Обследовано 86 больных, из них 53 больных с клиническим диагнозом коклюш разной степени тяжести (у 9,4% больных коклюш протекал в легкой форме, у 66,0% - в среднетяжелой форме и у 24,6% - в тяжелой форме), обследованных на различные сроки от начала заболевания (7,5% больных обследованы на 1ой неделе заболевания; 30,2% - на 2ой; 41,5% - на 3ьей; 15,1% - на 4ой и 5,7% - на 5ой неделях заболевания) и 33 больных с другими заболеваниями верхних дыхательных путей. Основную группу больных коклюшем (67,9%) составили дети в возрасте до 1 года, обследованных на 2ой - 3ьей неделях заболевания.

Клинический материал от 86 больных коклюшем и из контрольной группы изучали одновременно в разработанном молекулярно-генетическом методе - LAMP-варианте и в классическом бактериологическом методе. Проведенные клинические испытания прямого метода LAMP-варианта, показали его высокую специфичность и высокую диагностическую эффективность, по сравнению с бактериологическим методом (рис. 12). Из 53 больных с диагнозом коклюш, у 35 больных (в 66,0% случаях) клинический диагноз подтвержден только в LAMP-варианте; у 10 больных (в 18,9% случаях) диагноз подтвержден в LAMP-варианте и в бактериологическом методе; у 2 больных (в 3,8% случаях) диагноз подтвержден только в бактериологическом методе и у 6 больных (в 11,3% случаях) клинический диагноз не был подтвержден ни в одном из используемых методов. При сопоставлении эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода показано, что из 53 больных коклюшем, у 45 больных клинический диагноз коклюш был подтвержден в LAMP-варианте, т.е. процент совпадений клинического диагноза и результатов разработанного метода составил 84,9% 4,9% (р < 0,001). В то время как бактериологическое подтверждение клинического диагноза коклюш было лишь в 12 случаях, что составило 22,7% 5,7% (р < 0,001).

Рисунок 12. Диагностическая эффективность LAMP-варианта при сравнении с бактериологическим методом при обследовании 53 больных с клиническим диагнозом коклюш.

Рисунок 13. Сравнение эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода в зависимости от формы заболевания коклюшем.

Высокая диагностическая эффективность LAMP-варианта показана при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания (рис. 13) - не только при среднетяжелых (в 91,4% случаев) и тяжелых формах (в 61,5% случаев), но и при легких формах заболевания (в 100% случаев). В тоже время бактериологическим методом возбудитель коклюша выявлен в небольшом проценте случаев только при среднетяжелых (в 22,8% случаях) и тяжелых формах заболевания (в 30,7% случаях).

Высокая эффективность LAMP-варианта показана также при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания (рис. 14) - от 72,7% на 3ьей неделе, 87,5% на 4ой неделе заболевания до 100% на 1ой, 2ой и 5ой неделях заболевания. Бактериологическим методом удалось выявить возбудителя коклюша лишь в небольшом проценте случаев и то, только на 3ьей и на 4ой неделях заболевания.

С целью определения специфичности разработанного метода взята контрольная группа больных - 33 человека с диагнозами ОРВИ, лакунарная ангина, респираторный микоплазмоз и др. Исследование клинических образцов, полученных от этих больных, в разработанном LAMP-варианте показало, что у всех 33 больных, т.е. в 100% случаев, были отрицательные результаты, также как и при бактериологическом обследовании.

Рисунок 14. Сравнение эффективности разработанного метода ускоренной диагностики коклюша и бактериологического метода в зависимости от сроков обследования больных коклюшем.

Таким образом, использование LAMP-варианта расширило возможности эффективного обследования больных, как с различной тяжестью клинического течения болезни, так и в различные сроки от начала заболевания (с ранних сроков и вплоть до 31 дня болезни, т.е. даже в период обратного развития заболевания), а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях. Разработанный метод применим для быстрого подтверждения или опровержения клинического диагноза коклюш, в то время как бактериологический метод обладает низкой диагностической эффективностью (10,0%) и длительностью выдачи ответа (5 - 7 дней).

Приведем несколько примеров эффективного использования нового прямого ускоренного молекулярно-генетического метода - LAMP-варианта при обследовании больных с подозрением на коклюш.

Ребенок А. (11 мес.) госпитализирован в ИКБ № 1 с предварительным диагнозом коклюш из Дома ребенка № 2 СЗАО г. Москвы. При обследовании группы контактных лиц (10 детей и 10 взрослых) бактериологическим методом и разработанным ускоренным методом - LAMP-вариантом в течение суток был выявлен ребенок Г. (11 мес.) с положительным результатом в LAMP-варианте, что позволило быстро удалить его из очага коклюша и госпитализировать также в инфекционное отделение с диагнозом коклюш. Однако, бактериологическое подтверждение этого случая было получено только через 6 дней. Следовательно, применение LAMP-варианта позволило провести быстрое обследование очага коклюшной инфекции, выявить заболевшего ребенка и своевременно изолировать его от остальных детей грудничкового возраста, тем самым предотвратив распространение инфекции.

Ребенок М. (4 мес.) с серьезной патологией сердечно-сосудистой системы переведен из специализированного стационара в ИКБ №1 с подозрением на коклюш при отрицательных результатах бактериологического обследования. Применение разработанного LAMP-варианта позволило быстро подтвердить диагноз коклюш.

Ребенок Г. (4 мес.) из асоциальной семьи госпитализирован в ИКБ № 1 с диагнозом респираторный микоплазмоз, острый бронхиолит, ателектаз сегмента левого легкого. Симптомы заболевания коклюшем у него были замаскированы выраженным микоплазмозом. Разработанный LAMP-вариант позволил подтвердить диагноз коклюш, в то время как бактериологическое обследование дало отрицательные результаты. Впоследствии, серологическое обследование показало убедительное нарастание динамики титров антител в РА с 1:20 до 1:320, т.е. в четыре раза, на четвертой неделе от начала заболевания, что ретроспективно также подтвердило диагноз коклюш у ребенка.

Апробация LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, проведена на 447 клинических образцах от лиц, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Среди них, 81 (18,1%) образец был положительным в LAMP-варианте, в то время как в бактериологическом методе положительными были только 19 образцов. Из 81 положительного LAMP-образца, бактериологически подтвержденными оказались только 23,4% образцов. Таким образом, выявлена высокая эффективность применения LAMP-варианта для диагностики больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которая в 4,3 раза превышала результативность бактериологического обследования, а также в 5 - 7 раз сокращала срок выдачи окончательного ответа.

На новый метод LAMP-вариант получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (052390).

Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в amy гене в качестве мишени для определения принадлежности C. diphtheriae к биовару с помощью ПЦР

Система бактериологической диагностики дифтерии, разработанная в России несколькими поколениями исследователей и практических микробиологов и используемая в настоящее время, направлена на то, чтобы в максимально короткий срок (4 - 5 дней) с помощью минимального набора тестов выявить в исследуемом материале (в мазках из ротоглотки и носа, или других мест локализации) возбудителя дифтерии - токсигенные С. diphtheriae.

Определение принадлежности штаммов С. diphtheriae к биовару проводится классическим бактериологическим методом - биохимической реакцией разложения крахмала на среде Грисса. Однако результаты проведения биохимической идентификации С. diphtheriae зависят от большого числа факторов, таких как качество питательных сред и реагентов, условий их приготовления, определения рН среды, а также квалификации персонала и др. Поэтому, выявление генетической детерминанты амилазной активности (фрагмента amy гена) в геноме возбудителя дифтерии с помощью ПЦР является более точным и достоверным методом определения принадлежности к биовару, по сравнению с биохимической идентификацией.

На основании выявленных особенностей структуры генетической детерминанты, определяющей амилазную активность, нами разработан новый основанный на ПЦР способ, позволяющий дифференцировать штаммы C. diphtheriae по принадлежности к биоварам.

На консервативную область аmy гена сконструированы праймеры, фланкирующие фрагмент гена, после амплификации с которыми положительными считались образцы, содержащие специфический светящийся фрагмент и данные штаммы регистрировались как C. diphtheriae биовар gravis (рис. 15).

Рисунок 15. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров AmyF1 - AmyR1 к последовательности фрагмента amy гена C. diphtheriae.

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6, 8, 12, 13 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis

Специфичность, чувствительность и воспроизводимость метода подтверждена при изучении 99 штаммов C. diphtheriae (48 штаммов биовара gravis и 51 штамм биовара mitis), выделенных от больных и бактерионосителей в 80 - 90-е годы прошлого столетия, а также на современном этапе эпидпроцесса дифтерийной инфекции. Сравнительные исследования фенотипических свойств штаммов C. diphtheriae в классическом бактериологическом методе и ПЦР показали 100% корреляцию результатов. Вместе с тем, разработанный способ позволял дифференцировать штаммы C. diphtheriae биовара gravis от штаммов биовара mitis в более короткие сроки (на 1 сутки меньше). Данный метод явился одним из этапов разработки метода ускоренной лабораторной диагностики дифтерии. На разработку способа дифференцирования штаммов C. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13 (044745).

Для оценки возможностей использования разработанных мишеней в amy гене в качестве диагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии предпринята попытка применения мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты amy гена, ответственного за амилазную активность, и tox гена, кодирующего токсинообразование.

Рис. 16. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DTF - DTR и AmyF1 - AmyR1 к последовательностям фрагментов tox и amy генов C. diphtheriae.

Примечание: дорожки 1, 8 - маркер молекулярных весов; 2, 5 - ДНК токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3 - ДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 4 ЦДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 6 - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 7 - отрицательный контроль

Метод апробирован на 147 штаммах C. diphtheriae, как токсигенных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух биоваров - gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов). У токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis регистрировали специфический профиль, состоящий из двух фрагментов ДНК с молекулярной массой 634 п.н. и 289 п.н., у токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара mitis - фрагмент с молекулярной массой 634 п.н. При отсутствии этих фрагментов в исследуемом образце ДНК, продукты амплификации не регистрировали (рис. 16).

Апробирование метода подтвердило специфичность мишеней в amy гене для определения биовара gravis и показало возможности использования мультиплексной ПЦР-технологии для диагностических целей.

Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и amy генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией. Обследовано 9 больных в возрасте от 28 лет до 60 лет, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва). Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПЦР.

Рис. 17. Профили ПЦР-ампликонов образцов клинического материала, полученного от больного (С., 44 года) с подозрением на дифтерию.

Примечание: дорожки 1, 8 - маркер молекулярных весов; 2 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С, 44 года (нос); 3 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С., 44 года (зев); 5 - положительный контроль - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 6 - положительный контроль - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 4, 7 - отрицательные контроли

На рис. 17 представлены результаты обследования больного (С., 44 лет) с подозрением на дифтерию в мультиплексной ПЦР. Положительной считалась проба, имеющая характерный вид профиля, состоящего из двух специфических светящихся фрагментов определенной молекулярной массы. В образцах, содержащих ДНК из клинического образца из носа и ротоглотки больного, регистрировали положительные результаты, что свидетельствовало о наличие в материале от больного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis и подтверждало клинический диагноз дифтерия ротоглотки и носа.

С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз дифтерия удалось подтвердить у трех больных: у больного (С., 44 лет) с диагнозом комбинированная дифтерия ротоглотки и носа; у больной (И., 54 лет) с клиническим диагнозом комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа; у больной (Е., 60 лет) с клиническим диагнозом токсическая дифтерия ротоглотки II - III степени в комбинации с дифтерией гортани. Для первых двух больных получено бактериологическое подтверждение на 4 сутки, бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты. У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы лакунарная ангина и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты. Проведенное исследование показало возможности использования мишеней в amy гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.

В Ы В О Д Ы

Мониторинг штаммов B. pertussis выявил особенности распространения и различия в генетической структуре штаммов, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показал, что в допрививочный период (1948 - 1959 гг.) и первые десять лет (1960 - 1969 гг.) проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулировали штаммы B. pertussis с вакцинными аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности; в начале 70-х годов в популяции штаммов B. pertussis появились штаммы с новыми невакцинными аллелями генов, которые с начала 80-х годов заняли доминирующее положение в популяции.
Выявлены особенности генетической структуры штаммов B. pertussis, выделенных на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции. В настоящее время циркулируют штаммы B. pertussis с новым невакцинным ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина (в 100% случаев), новыми невакцинными prn2 и prn3 аллелями гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); распространение штаммов с невакцинными fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в популяции современных штаммов в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, не обнаружено.
Современные штаммы B. pertussis, несущие новые невакцинные аллели, и вакцинные штаммы B. pertussis, используемые для производства АКДС-вакцины и несущие старые вакцинные аллели генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков, имеют существенные различия генетической структуры. У современных штаммов B. pertussis произошли существенные изменения в структуре ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, и в фимбриальном fim3 гене, кодирующем Fim3 белок.
Штаммы B. pertussis, характеризующиеся новыми невакцинными аллелями генов патогенности, обладают высокой степенью вирулентности (в 72,7% случаев) и высоким уровнем лейкоцитозстимулирующей активности (в 100% случаев), что является неблагоприятным прогностическим признаком тяжести течения инфекционного процесса коклюшной инфекции.
Разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ, позволяющий выявлять штаммы с новым ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина, для наблюдения за популяцией B. pertussis, циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции.
Показаны высокая специфичность (100%), высокая чувствительность (103 м.кл.), высокая диагностическая эффективность (84,9% 4,9% (р < 0,001) нового впервые разработанного прямого ускоренного метода (LAMP-вариант), позволяющего выявлять возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного в течение 9 - 10 часов. Данный метод позволяет обследовать больных как в ранние (с 3 дня), так и в поздние (в течение месяца) сроки заболевания, а также больных с различными формами клинического течения заболевания.
Подтверждено сохранение в циркуляции штаммов C. diphtheriae (в 66,7% случаях) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, не приводящими к изменению первичной структуры белка дифтерийного токсина, что влияет на формирование генетической вариабельности вида. Мониторинг штаммов C. diphtheriae показал, что распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой гена дифтерийного токсина (в положении 1252 tox гена), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина, не произошло.
Получены новые знания о том, что в геноме C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (локус DIP0357 - amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность - дополнительный фактор патогенности C. diphtheriae биовара gravis, и впервые определена нуклеотидная мишень в amy гене, выявляемая в ПЦР новыми сконструированными специфическими праймерами, для дифференциации штаммов C. diphtheriae двух биоваров, что имеет значение для создания диагностических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю. Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 - 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией) // Пособие для врачей - Москва. - 1999. - 26 Стр.
Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова Н.Н., Мазурова И.К. Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского УПроблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)Ф. - 2000. - С. 42 - 47.
Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Соков Б.Н., Смердов Г.Н., Ушакова Н.С., Степанова Н.И., Бугаев Е.А., Мазурова И.К. Усовершенствование методики постановки полимеразной цепной реакции для выявления гена дифтерийного токсина // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского УПроблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)Ф. - 2000. - С. 47 - 52.
Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Герасимова С.В., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского УПроблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)Ф. - 2000. - С. 52 - 55.
Платонова Т.В., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г. Биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпидпроцесса // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского УПроблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)Ф. - 2000. - С. 52 - 59.
Мазурова И.К., Платонова Т.В., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова Н.Н. Молекулярно-биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в периоды различной интенсивности эпидемического процесса // Материалы научно-практической конференции Инфекционные болезни на рубеже XXI века, 24 - 26 мая, Москва. - 2000. - С. 75.
Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Платонова Т.В., Андрусенко Е.Э. Антибиотикорезистентность штаммов Corynebacterium diphtheriae - новая проблема инфекционной патологии // Материалы международной конференции Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века, Москва. - том 2. Ц2000. - С. 27 - 28.
Melnikov V.G., Zoysa A.De, Mazurova I.K., Kombarova S.J., Borisova O.J., Engler K.H., Efstratiou А. Molecular screening for the СidentificationТ of non-toxigenic tox bearing strains of Corynebacterium diphtheriae from the Russian Federation // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21 - 24 June, Brussels, Belgium. - 2000. - P. 60 - 61.
Mazurova I.K., Platonova T.V., Kombarova S.J., Melnikov V.G., Borisova O.J. Diphtheria in Russia: clinical and epidemiological features // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21 - 24 June, Brussels, Belgium. - 2000. - P. 33 - 34.
Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Бугаев Е.В. Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции // Методические рекомендации. - Москва. Ц2001. - 12 Стр.
Kombarova S., Kim C., Melnikov V., Reeves M., Borisova O., Mazurova I., Popovic T. Rapid identification of Corynebacterium diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation // Journal Infectious Diseases. - Vol. 7. - no. 1. - 2001. - Р. 133 - 136.
Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова Н.Н., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou А. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии // ЖМЭИ. - 2001. Ц № 3. - С. 3 - 8.
Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина // Пособие для врачей. - Москва. - 2002. - 12 Стр.
Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Нарвская О.В., Костюкова Н.Н., Платонова Т.В., Волковой К.И., Прохоров В.А., Салова Н.Я., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П., Кривопалова Н.С. Молекулярная эпидемиология дифтерии в России // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26 - 28 марта, Москва. - 2002. - том 1. - С. 68 - 69.
Бугаев Е., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Шипулин Г.А., Малинина С.В., Корочкина М.Ю., Мазурова И.К.. Полимеразная цепная реакция в диагностике дифтерийной инфекции // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26 - 28 марта, Москва. - 2002. - том 3. - С. 236 - 237.
Mazurova I.К., Melnikov V., Kombarova S.J., Borisova O., Bugaev E.A. Laboratory diagnosis of diphtheria as part of diphtheria surveillance in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - Р. 53.
Borisova O., Melnikov V., Kombarova S.J., Mazurova I.К. Antibiotic-resistant Corynebacterium diphtheriae strains circulating in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - Р. 79.
Kombarova S., Melnikov V., Borisova O., Platonova T.V., Mazurova I.K. Genotype characteristics of Corynebacterium diphtheriae strains in a period of low diphtheria incidence in Russia: 1997 to 2001 // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - Р. 68 - 69.
Melnikov V., Kombarova S., Borisova O., Mazurova I.K. Etiological value of non-toxigenic tox-bearing (NTTB) Corynebacterium diphtheriae strains // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - Р. 80.
Мазурова И.К., Борисова О.И., Петрова М.С., Мельников В.Г. Фено - и генотипического характеристика штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве // Материалы международной конгресса Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы. - 2003. - С. 30.
Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Веревкин В.В., Волковой К.И., Мазурова И.К. Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина // ЖМЭИ. - 2004. - № 1. - С. 3 - 7.
Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae // Пособие для врачей. - Москва. - 2004. - 34 Стр.
Borisova O.J., Кombarova S.J., Berens T.T., Vaizovaj А., Мazurova I.K. Phenotypic and genotypic characteristics of toxigenic C. diphtheriae isolated in the Central Federal District of Russia during 2002-2004 // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16 - 18 june, Denmark, Copenhagen. Ц2004. - Р. 45.
Кombarova S.J.,, Zotina R.K., Borisova O.J, Narvskaya O.V., Limeshenko E., Мazurova I.K. Circulation of toxigenic and non-toxigenic С. diphtheriae in period of decreasing morbidity of diphtheria in Russia // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16 - 18 june, Denmark, Copenhagen. - 2004. - Р. 43
Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Захарова Н.С., Алешкин В.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Журнал молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - № 4. - С. 21 - 25.
Kombarova S.Yu., Borisova O.Yu., Melnikov V.G., Mazurova I.K Monitoring the genes responsible for Сorynebacterium diphtheriae toxin production // Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15 - 17 November 2006, Voliagmeni, Greece. Ц2006. - P. 65.
Borisova O.Yu., Kombarova S.Yu., Volozhantsev N.V., Mazurova I.K. Investigation of the amylase gene structure of Сorynebacterium diphtheriae // Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15 - 17 November 2006, Voliagmeni, Greece Ц2006. - P. 66.
Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Грачева Н.М., Герасимова А.Г., Алешкин В.А., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Шинкарев А.С., Семенов Б.Ф. Особенности генетической структуры производственных штаммов для АКДС-вакцины и циркулирующих в настоящее время штаммов возбудителей коклюша и дифтерии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней, 21 - 22 ноября, Москва. - 2006. - С. 60 - 61.
Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Мельникова А.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе // ЖМЭИ. - 2005. - № 5. - С. 35 - 40.
Borisova O., Kombarova S.J., Zakharova N.S., Marjolein van Gent, Aleshkin V.A., Mazurova I.K., Mooi F. Antigenic divergence between Bordetella pertussis clinical isolates from Moscow, Russia and vaccine strains // J. Clinical and vaccine immunology. - 2007. ЦVol. 14. - № 3. - Р. 234 - 238.
Шинкарев А.С, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков А.В., Брицина М.В., Бажанова И.Г. Современные штаммы Bordetella pertussis: молекулярная и иммунобиологическая характеристика // ЖМЭИ. - 2007. - № 4. - С. 20 - 25.
Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Герасимова А.Г., Пяева А.П., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Полиморфизм генов, кодирующих основные факторы патогенности штаммов Bordetella pertussis // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - том 1. - С. 50 - 51.
Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Гадуа Н.Т., Губина Н.И., Лосева Л.В., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Особенности структуры генов, ответственных за токсинообразование Сorynebacterium diphtheriae // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - том 1. - С. 69 - 70.
Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Алешкин В.А. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг дифтерийной инфекции // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - том 1. - С. 78 - 79.
Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948 - 2005 гг.) // Журнал молекулярной медицины. - 2008. - № 1. - С. 40 - 45.
Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Bordetella pertussis, обладающих различными ptx генами // ЖМЭИ. - 2008. - № 5 - С. 80 - 83.
Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Шинкарев А.С., Захарова Н.С., Пяева А.П., Лыткина И.Н., Требунских И.П., Салова Н.Я., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Материалы четвертой международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, 2 - 4 июня 2008 г., Санкт - Петербург. - 2008. - С. 7.

Изобретения

Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Алешкин В.А., Мазурова И.К. Патент на изобретение Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.
Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Заявка на изобретение Способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae № 2007140879/13(044745) от 07.11.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г.
Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А. Заявка на изобретение Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша № 2007147797/13 (52390) от 25.12.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog