Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи
НАСЫХОВА Юлия Алмазовна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗВИТИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА:
БОЛЕЗНИ КРОНА И ЯЗВЕННОГО КОЛИТА Специальность: 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научноисследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Иващенко Татьяна Эдуардовна, ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Горбунова Виктория Николаевна, профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович, заведующий лабораторией эпигенетики ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздравсоцразвития России
Защита состоится л__ __________ 2012 г. в____часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:
199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербург, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького СанктПетербургского государственного университета
Автореферат разослан л ______________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.232.доктор биологических наук Мамон Людмила Андреевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), к которым относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), является одной из наиболее актуальных задач современной гастроэнтерологии. Несмотря на относительно невысокую частоту ВЗК, неуклонный рост заболеваемости БК и ЯК, смещение начала заболевания в более ранний возраст, появление тяжелых форм, учащение внекишечных проявлений делают ВЗК серьезнейшей проблемой среди патологий желудочно-кишечного тракта (Адлер, 2001; Барановский и др., 2009).
Воспалительные заболевания кишечника являются социально значимой проблемой медицины, что обусловлено большими затратами на лечение, потерей трудоспособности в молодом и зрелом возрасте, частой инвалидизацией и сложностью социальной реабилитации больных (Халиф, Лоранская, 2004).
Несмотря на многолетнюю историю изучения ВЗК, этиология заболеваний остается по-прежнему неизвестной, а патогенез исследован недостаточно. В настоящее время признана точка зрения, согласно которой, в возникновении ВЗК участвуют многие внешние и внутренние факторы. На сегодняшний день накоплены данные о роли генетических факторов в развитии заболеваний, их влиянии на особенности клинической картины, и установлено более 40 генов, полиморфизм которых ассоциирован с развитием ВЗК. Прежде всего, это гены, задействованные в регуляции таких процессов как дифференцирование Th17-лимфоцитов, аутофагия, поддержание целостности эпителиального барьера и иммунный ответ (Zhang et al., 2008; Thompson, Lees, 2011; van Limbergen et al., 2007; Cooney, Jewell, 2009).
Несомненную важность имеют работы, направленные на комплексную оценку вклада генетических нарушений в развитие ВЗК. Такие исследования позволят расширить представления о механизмах возникновения и прогрессирования данных тяжелых патологий желудочно-кишечного тракта. Изучение генетических маркеров развития ВЗК в будущем позволит выявлять индивидуумов с высоким риском возникновения БК и ЯК, а в дальнейшем может послужить основой для разработки профилактических мероприятий и оптимизации лечения патологий желудочнокишечного тракта.
Цель и задачи исследования. Изучить роль аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера и иммунного ответа в развитии болезни Крона и язвенного колита.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:
1. Определить частоты генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (NOD2/CARD15); дифференцировки Th17-лимфоцитов (IL-23R, STAT3, JAK2, IL-12B); аутофагии (ATG16L1, IRGM); иммунного ответа (TNF; TNFSF15, PTPN2, PTPN22, IL-10, IL-18RAP, MST1, IL-4, IL-4R);
эпителиального барьера (IBD5), а также NKX2-3 и BTNL2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле.
2. Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также NKX2-3 и BTNL2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле.
3. Исследовать ассоциацию полиморфных вариантов генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также NKX2-3 и BTNL2 c клиническими параметрами у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом.
4. Провести поиск и идентификацию новых полиморфных вариантов в вариабельной области экзона 4, а также в экзоне 11 гена NOD2/CARD15 у пациентов с БК.
5. Определить комплексный вклад и прогностическое значение полиморфных аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также NKX2-3 и BTNL2 в развитии ВЗК.
Научная новизна работы. В рамках данного исследования впервые изучено распределение частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (NOD2/CARD15 (2104*C/T, 2722*G/C, Leu3020fsinsC));
дифференцировки Th17-лимфоцитов (IL-23R (798+2778*C/T, 1142*G/A), STAT3 (-113666*T/C), JAK2 (1358*C/A), IL-12B (rs10045431*C/A)); аутофагии (ATG16L(841*A/G), IRGM (rs13361189*T/C)); иммунного ответа (TNF (-238*G/A, -308*G/A);
TNFSF15 (rs4263839*G/A), PTPN2 (rs2542151*G/T), PTPN22 (1858*C/T), IL-(rs3024505*C/T), IL-18RAP (rs917997*G/A), MST1 (1965*G/T), IL-4 (-590*C/T), IL-4R (1727*A/G)); эпителиального барьера (IBD5 (rs2522057*G/C)), а также NKX2-(rs10883365*A/G) и BTNL2 (1050*C/T) у пациентов с БК, у пациентов с ЯК и популяционной выборке Северо-Западного региона РФ. Впервые был проведен анализ ассоциации полиморфизма генов с клиническими параметрами воспалительных заболеваний кишечника (форма течения БК, степень тяжести ЯК).
Впервые получены результаты, свидетельствующие об ассоциации полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15 (Leu3020fsinsC), JAK2 (1358*C/A), TNFa (-308*G/A), IL-4R (1727*A/G) с развитием БК, а также полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15 (2104*C/T), IL-12B (rs10045431*C/A), JAK2 (1358*C/A), IRGM (rs13361189*T/C) с развитием ЯК. Впервые обнаружены достоверные различия частот генотипов и аллелей для вариантов генов NOD2/CARD15 (2722*G/C, Leu3020fsinsC), IL-10 (rs3024505*C/T), IL-4R (1727*A/G) в группах с осложненными (стриктурирующая, пенетрирующая) и воспалительной формами течения БК.
Впервые у пациентов с БК в Северо-западном регионе России идентифицированы новых полиморфных варианта в экзоне 4 гена NOD2/CARD15. Разработана система детекции данных вариантов гена NOD2/CARD15. Впервые получены результаты, свидетельствующие о роли взаимодействия генов JAK2 (1358*C/A), IL4R (1727*A/G), TNF (-308*G/A) в развитии БК. Впервые разработаны логические регрессионные модели - модель прогнозирования риска развития БК и модель риска развития осложненных форм БК.
Основные положения, выносимые на защиту:
Полиморфные аллели генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии и иммунного ответа вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе России.
Маркерами повышенного риска развития БК являются аллели 3020*insC (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2), -308*A (TNF), 1727*G (IL-4R).
Полиморфные аллели rs10045431*A (IL-12B), 2104*С (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2) и генотип rs13361189*CC (IRGM) являются маркерами повышенного риска развития язвенного колита.
Взаимодействие аллелей генов JAK2, IL-4R, TNF вносит вклад в формирование генетической предрасположенности к развитию болезни Крона.
Критериями прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона являются следующие факторы: курение, женский пол, аллели генов 1727*G (IL4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*C (NOD2/CARD15).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2008), на Европейских конгрессах по генетике человека (Nice, 2007; Barcelona, 2008; Vienna, 2009;
Gothenburg, 2010), на VI Съезде российских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 1страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 214 источников, из них 2зарубежных. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками, содержит приложения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В исследование были включены 250 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (138 с заболеванием Крона и 112 с язвенным колитом), которые наблюдались на базе кафедры гастроэнтерологии и диетологии ГОУ ДПО СПбМАПО (зав. отделения - д.м.н. проф. Барановский А.Ю.) с 2004 до 2010 гг.
Контрольная группа сформирована из 140 неродственных индивидуумов, не имеющих признаков ВЗК на момент сбора материала и проживающих в СевероЗападном регионе России.
Экстракция геномной ДНК из клеток лимфоцитов периферической крови.
Выделение ДНК проводилось из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989).
Анализ полиморфизма генов. Исследование полиморфизма генов NOD2/CARD15, IL-4, IL-4R, TNF проводилось методом ПЦР-ПДРФ. Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, подбирали с использованием программы Oligo v.6.31 (Molecular Biology Insights Inc., США). Для анализа полиморфизма 15 генов (JAK2, IL-23R, STAT3, IL-12B, PTPN2, PTPN22, IL-10, IL-18RAP, MST1, TNFSF15, IBD5, ATG16L1, IRGM, BTNL2, NKX2-3) были использованы Taqman-пробы (Applied Biosystems).
Генотипирование было проведено в лаборатории генетики Медицинского центра Университета г. Гронинген (Нидерланды) (зав. лаборатории - prof. Wijmenga C.).
Поиск и идентификация новых полиморфных вариантов. Поиск новых полиморфных вариантов в экзоне 11 и в вариабельной области экзона 4 гена NOD2/CARD15 проводили с помощью метода конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP). Нуклеотидные последовательности фрагментов с измененной конформационной подвижностью были определены методом прямого секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl.
Статистическая обработка данных. При сравнении результатов анализа генетического полиморфизма в группах использовали критерий Фишера или критерий 2 с поправкой Бонферонни при множественных сравнениях (Животовский, 1991). Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали критерий 2 (Р) по алгоритму, описанному D. Roff и P. Bentzen (1989).
Анализ межгенных взаимодействий проводился биоинформатическим методом Multifactor Dimensionality Reduction (MDR). Оценку комплексного влияния клинических и генетических показателей на риск развития патологий и клинические особенности течения заболеваний проводили с помощью логистического регрессионного анализа (методом максимального правдоподобия). Обработка данных проводилась с использованием программ Microsoft Excel (Microsoft Corporation, США), STATISTICA v.6.0 (Statsoft Inc., США) и GraphPad Instat v.3.05 (GraphPad Software Inc., США), Eviews 3.1 (Quantitative Micro Software, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма гена NOD2/CARDГен NOD2/CARD15 кодирует внутриклеточный рецептор, который способен распознавать специфические компоненты бактериальной клеточной стенки L-Ala, DGlx (мурамилдипептиды, MDP) и регулировать развитие воспалительной реакции посредством активирования ядерного фактора NF-kB (Kovalenko et al., 2003).
Проведенный сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма гена NOD2/CARD15 в Северо-Западном регионе РФ установил ассоциацию варианта Leu3020finsC гена NOD2/CARD15 с развитием болезни Крона (Рисунок 1).
Гомозиготный генотип 3020*insC/insC определен у 3,6% пациентов с БК и не встречался у пациентов с ЯК и в популяционном контроле. Частота аллеля 3020*insC была в 2,5 раза выше среди пациентов с БК по сравнению с популяционной группой (9,1% и 3,6%, p=0,009). Согласно показателю соотношения шансов Odds ratio аллель 3020*insC гена NOD2/CARD15 повышает риск развития болезни Крона почти в 2,раз (OR=2,69, 95%CI: 1,26-5,71) по сравнению с индивидуумами с генотипом 3020*wt/wt. Полиморфизм Leu3020finsC представляет собой инсерцию цитозина в 3020 положении нуклеотидной последовательности гена NOD2/CARD15. Данный генетический вариант приводит к сдвигу рамки считывания и образованию белка, укороченного на 33 аминокислотных остатка. Известно, что белковый продукт гена с аллелем 3020*insC характеризуется снижением функции распознавания молекул MDP, что в конечном итоге может привести к развитию патологического воспалительного процесса (Hisamutsu et al., 2003; Maeda et al., 2005).
96,4 99,5 96,96,100 1* 90,96,80 60 40 * 20 10,9 9,7,1 7,* 0 * 0,5 * 3,6 3,6 0 0 3,0 wt/wt wt/insC insC/insC wt insC 2104*CC 2104*CT 2104*TT 2104*C 2104*T БК Контроль ЯК Контроль Рис. 1. Частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов Leu3020finsC и 2104*C/T гена NOD2/CARD15 в группах пациентов и в популяционном контроле; * - p<0,Результаты исследования полиморфизма 2104*C/T гена NOD2/CARD15 показали достоверно низкую частоту редкого аллеля 2104*Т среди пациентов с ЯК (0,5%, p=0,028) и в объединенной группе пациентов с ВЗК (1,2%, p=0,037) по сравнению с популяционным контролем (3,6%) (Рисунок 1), что указывает на протективную роль аллеля 2104*Т в развитии ЯК в Северо-Западном регионе РФ. Функциональное значение полиморфного варианта 2104*C/T не установлено, но исходя из расположения однонуклеотидной замены в LRR области, которая обладает ключевым значением в распознавании молекул MDP, можно предположить, что данный аллельный вариант приводит к изменению рецепторных свойств белка NOD2/CARD15.
Для полиморфизма 2722*G/C гена NOD2/CARD15 достоверных различий между исследованными группами обнаружено не было (p>0,05).
В ряде популяций была установлена ассоциация данных трех полиморфных вариантов с различным клиническим течением БК: возрастом манифестации болезни у взрослых, пенетрирующим и стриктурирующим течением, локализацией воспалительного процесса (илеальная форма БК) (Harton et al., 2003; Kobayashi et al., 2005; Wehkamp et al., 2004; Ogura et al., 2001).
100% 80% 2 SNP 60% 1 SNP 40% 20% "дикий тип" 0% воспалительное осложненное Рис. 2. Частоты носительства аллелей 2722*C и 3020*insC гена NOD2/CARD15 при различном клиническом течении БК Проведенный анализ полиморфизма гена NOD2/CARD15 среди пациентов с различными формами БК (простой (воспалительная) и осложненными (пенетрирующей, стриктурирующей)) выявил ассоциацию полиморфизма 2722*G/C и Leu3020finsC гена с развитием осложнённых форм заболевания (Рисунок 2).
Показано достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа 2722*GC полиморфизма 2722*G/C гена NOD2/CARD15 у пациентов при осложненных формах заболевания в сравнении с воспалительной формой БК (p=0,0495; OR=5,81;
95%CI:1,11-30,47). Генотип 3020*wt/wt полиморфизма Leu3020finsC достоверно чаще встречался у больных с воспалительной формой (92,2%) в сравнении с группой больных с осложненными формами течения БК (73,7%, p=0,019; OR=4,21;
95%CI:1,32-13,50). Частота редкого аллеля 3020*insC была достоверно выше в группе пациентов с осложненными формами БК, по сравнению с группой пациентов с воспалительной формой заболевания. Процент пациентов, имеющих один из двух полиморфных аллелей гена NOD2/CARD15 (2722*G/C и Leu3020finsC), среди группы с воспалительной формой БК (11%) ниже в 3 раза по сравнению с таковым у пациентов с осложненными формами БК (30,8%, р=0,018). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что редкие аллели 2722*C и 3020*insC гена NOD2/CARD15 являются маркерами повышенного риска развития осложненных форм болезни Крона.
2.Поиск и идентификация новых полиморфных вариантов в гене NOD2/CARDу пациентов с болезнью Крона Значение белка NOD2/CARD15 в реакциях иммунного ответа на компоненты бактериальной клеточной стенки, позволяет предположить, что в развитии болезни Крона помимо трех частых генетических вариантов (2104*C/T, 2722*G/C, Leu3020fsinsC) важную роль могут играть редкие мутации гена, которые оказывают значительное функциональное влияние на формирование предрасположенности к ВЗК. В связи с этим нами был предпринят поиск новых полиморфных вариантов в вариабельной области экзона 4 и в экзоне 11 гена, значимых для развития заболевания Крона в нашей популяции. При исследовании экзона 11 гена NOD2/CARD15 новых полиморфных вариантов гена обнаружено не было. SSCPанализ вариабельной области экзона 4 позволил выявить 3 типа измененной подвижности фрагментов в геле. Нуклеотидные последовательности фрагментов были определены методом секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl.
Секвенирование отобранных образцов с измененной подвижностью I типа позволило идентифицировать полиморфный вариант 2462+10*A/C (rs72796353), расположенный в 3Т-нетранслируемой области (IVS4+10A>C) экзона 4 гена NOD2/CARD15 (Рисунок 3). Локализация в донорном сайте интрона 4 гена NOD2/CARD15 позволяет предположить возможную роль данной однонуклеотидной замены в реализации процессов сплайсинга гена. Определение нуклеотидной последовательности отобранных образцов с измененной подвижностью II типа позволило идентифицировать полиморфный вариант 2174*C/G (rs5743278), который приводит к замене аланина на глицин в 725 положении (Ala725Gly) аминокислотной последовательности белка NOD2/CARD15 (Рисунок 3). Секвенирование отобранных образцов с измененной подвижность III типа позволило идентифицировать полиморфизм 2264*C/T (rs61747625), который приводит к замене валина на аланин в 755 положении (Ala755Val) аминокислотной последовательности белка NOD2/CARD15 (Рисунок 3).
2462+10*A/C (rs72796353) 2174*C/G (rs5743278) 2264*C/T (rs61747625) Рис. 3. Результаты секвенирования образцов с измененной подвижностью в геле.
Наличие идентифицированных нуклеотидных замен в гене NOD2/CARD15 было подтверждено с помощью разработанного метода ПЦР-ПДРФ анализа. Проведенный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма 2462+10*A/C, 2174*C/G, 2264*C/T гена NOD2/CARD15 в исследуемых выборках не выявил достоверных различий между группой пациентов с БК и популяционной выборкой (p>0,05).
3.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов дифференцировки Th17-лимфоцитов (IL-23R, STAT3, JAK2, IL-12B) Th17-лимфоциты имеют ключевое значение в развитии хронических и аутоиммунных воспалительных заболеваний, а гены, ответственные за дифференцировку Th17-лимфоциты (IL-23R, STAT3, JAK2, IL-12B), являются перспективными генами-кандидатами развития ВЗК.
IL23R 1142*A * IL-12B IL23R 798+2778*T rs10045431*A * JAK2 1358*A STAT3 -1-13666*C Контроль БК ЯК Рис. 4. Частоты аллелей генов дифференцировки Th17-лимфоцитов (JAK2, STAT3, IL-23, IL12B) в группах пациентов с ЯК, с БК и в популяционной выборке; * - p<0,Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма 1358*A/C гена JAK2 выявил достоверное повышение частоты аллеля 1358*C в объединенной группе пациентов с ВЗК (42,1%, p=0,01), в группе пациентов с БК (42,6%, p=0,02) и в группе пациентов с ЯК (41,6%, p=0,0485) по сравнению с популяционной выборкой (32,2%). Частота гомозиготного генотипа 1358*AA была достоверно ниже в объединенной группе пациентов с ВЗК (33,8%, p=0,01) и в группе пациентов с БК (31,3%, p=0,01) по сравнению с популяционным контролем (47,4%) (Рисунок 4).
Полученные нами данные хорошо согласуются с результатами, полученными в исследованиях для других популяциях. В работе Prager et al. были представлены данные об ассоциации повышенной проницаемости кишечника с 1358*A/C полиморфизмом гена JAK2 и высказано предположение, что редкий аллель 1358*C гена JAK2 способствует разворачиванию воспалительной реакции, что в свою очередь определяет увеличение проницаемости стенки кишечника (Prager et al., 2011).
Проведенный анализ частот аллелей полиморфного варианта rs10045431*C/A гена IL-12B выявил ассоциацию редкого аллеля A с развитием язвенного колита (р=0,019) (Рисунок 3). Ген IL-12B кодирует субъединицу p40, которая входит в состав гетеродимерных цитокинов IL-12 и IL-23. Было установлено, что мутации гена IL-12B приводят к нарушению иммунных реакций, опосредованных цитокинами IL-12 и IL-23, что в свою очередь обуславливает повышенную восприимчивость к Mycobacteria и Salmonella и может явиться причиной развития воспалительных заболеваний кишечника.
4.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов аутофагии (ATG16L1, IRGM) Аутофагия играет важную роль в ряде процессов (регуляция NF-kB-сигнального пути, защита от патоген-индуцированной клеточной смерти, функционирование клеток Паннета и др.), которые потенциально вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника. Исходя из этого, гены аутофагии представляют интерес при исследовании наследственной предрасположенности к болезни Крона и язвенному колиту.
Анализ полиморфного локуса rs13361189*T/C гена IRGM выявил достоверное повышение частоты редкого генотипа CC (4,3%) в группе пациентов с ЯК по сравнению с контрольной группой (0%, p=0,028) и пациентами с БК (0%, p=0,045).
Ген IRGM кодирует белок - иммунитет-связанную гуанозин-трифосфатазу M, осуществляющую регуляцию процесса аутофагии внутриклеточных патогенов. В настоящее время установлено, что однонуклеотидная замена rs13361189*T/C оказывает влияние на уровень экспрессии IRGM (McCarrol et al., 2008), что вероятно определяет значение полиморфизма rs13361189*T/C в развитии ВЗК (Parkes et al., 2007; Meggyesi et al., 2010).
92,190,96,14,2 9,20 10,* 7,4,TT TC CC T C ЯК Контроль Рис. 5. Частоты генотипов и аллелей полиморфизма rs13361189*T/C гена IRGM в группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле; * - p<0,Сравнительный анализ распределений частот генотипов и аллелей по гену ATG16L1 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).
5.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма локуса IBDАнализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма rs2522057G/C локуса IBD5 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).
6.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов иммунного ответа (TNF, TNFSF15, PTPN2, PTPN22, MST1, IL-10, IL-18RAP, IL-4, IL-4R) Многочисленные данные указывают на ведущую роль патологического иммунного ответа в природе болезни Крона и язвенного колита. Воспалительные процессы могут служить причиной возникновения изъявлений, изменения межклеточных соединений и снижения продукции слизи, что в свою очередь позволяет антигенам свободно проникать в собственную пластинку. В связи с этим гены иммунного ответа представляют большой интерес для изучения генетической предрасположенности к ВЗК.
IL-4 -590*T * * TNF -308*A IL-4R 1727*G IL-18RAP TNF -238*A rs917997*A БК Контроль TNFSFIL-10 rs3024505*T rs4263839*A PTPN2 rs2542151*T MST1 1965*T PTPN22 1858*T Рис. 6. Частоты полиморфных аллелей генов иммунного ответа (TNF, TNFSF15, PTPN2, PTPN22, MST1, IL-10, IL-18RAP, IL-4, IL-4R) в группе пациентов с БК и в популяционном контроле Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфизма гена TNF (238*G/A, -308*G/A) в Северо-Западном регионе РФ выявил достоверные различия для -308*G/A полиморфного варианта в объединенной группе пациентов с ВЗК и в группе пациентов с БК по сравнению с популяционной выборкой. Согласно полученным данным, редкий аллель -308*А гена TNF достоверно чаще встречался в объединенной группе пациентов с ВЗК (11,2%, p=0,008) и в группе пациентов с БК (12,3%, p=0,004) по сравнению с популяционным контролем (5,4%), и согласно коэффициенту соотношения шансов повышает риск развития БК почти в 2,5 раза (OR=2,48; 95% CI:1,32-4,67), а также повышает общий риск развития ВЗК в 2 раза (OR=2,22; 95% CI:1,23-4,01). Сравнительный анализ частот генотипов полиморфизма -308*G/A по гену TNF показал, что частота генотип -308*GG достоверно ниже в общей группа пациентов с ВЗК (79,3%,p=0,007) и в группе пациентов с БК (76,8%, p=0,004) по сравнению с популяционной выборкой (90%), что указывает на протективный эффект данного генотипа в отношении развития БК и развития ВЗК, в целом. Известно, что нуклеотидные замены гуанина на аденин в -238 и -3положениях промоторной области гена TNFA способны влиять на продукцию белка (Bouma et al., 1996). Полиморфизм -308*G/A значительно повышает транскрипционную активность гена, увеличивает скорость образования мРНК.
Показано, что у носителей генотипа -308*A/A cинтез белка происходит в 3 раза активнее, чем у лиц с генотипом -308* G/G. (Louis E. et al., 1996; Bouma G. et al., 1998).
Проведенный нами сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма 1727*A/G гена IL-4R показал, что редкий аллель 1727*G и гомозиготный генотип 1727*GG достоверно реже встречались в контрольной выборке (13,9% и 2,1%) по сравнению с общей группой пациентов с ВЗК (21,1%, p=0,02; 8,3%, p=0,01) и группой пациентов с БК (23,9%, p=0,003; 10,9%, p=0,003).Таким образом, редкий аллель 1727*G является аллелем риска развития БК и ВЗК в целом. Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, аллель 1727*G гена IL-4R повышает в 1,65 раз общий риск развития воспалительных заболеваний кишечника (OR=1,65, 95% CI:1,10-2,47) и почти в 2 раза повышает риск развития болезни Крона (OR=1,94, 95% CI:1,25-3,01). Известно, что редким аллелем 1727*G гена IL-4R кодирует белок-рецептор интерлейкина 4, обладающий пониженным сродством к внутриклеточной тирозинфосфатазе SHP-1, включающей сигнал терминации транскрипции гена IL-4. Следовательно, индивиды с 1727*G-аллелем теряют возможность к супрессии синтеза IL-4 (Zheng et al., 2003). Можно предположить, что снижение контроля cупрессии синтеза провоспалительного цитокина IL-предрасполагает к развитию хронического воспалительного процесса. В проведенном исследовании установлено, что аллель 1727*G гена IL-4R достоверно чаще встречался в группе с осложненным течением (стриктурирующая и пенетрирующая формы) БК, чем в группе с воспалительным течением БК (p<0,0001).
Вероятно, что носительство аллеля 1727*G гена IL-4R предрасполагает к более агрессивному течению заболевания и является прогностическим фактором развития осложненных форм БК.
Изучение полиморфизма rs3024505*C/T гена IL-10 в группах пациентов с воспалительной и осложненными формами течения БК позволил выявить ряд закономерностей. Показано, что генотип CT достоверно чаще встречается среди больных с воспалительной формой БК (42,6%) по сравнению с объединенной группой пациентов с осложненными формами БК (14,3%; р=0,01), что указывает на протективную роль данного полиморфизма в формировании осложнённых форм болезни Крона.
Анализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма генов TNFSF15, PTPN2, PTPN22, MST1, IL-18RAP, IL-4 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).
7. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов дополнительных генов-кандидатов ВЗК (NKX2-3, BTNL2) Анализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма генов NKX2-3, BTNL2 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).
8. Комплексный анализ роли генетических и средовых факторов в развитии ВЗК В основе наследственной предрасположенности, как известно, лежит специфическая комбинация аллелей нескольких генов, которые оказывают влияние на развитие заболевания или же на модификацию клинических проявлений болезни.
Установление взаимосвязей между полиморфными генами и фенотипическими проявлениями ВЗК является важнейшим условием для выделения ключевых звеньев патогенеза, затрагивающих определенные физиологические функции, посредством которых формируется клиническая картина заболевания. В настоящее время одними из наиболее эффективных и популярных методов анализа межгенных взаимодействий являются биоинформатический метод Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), целью которого является моделирования межгенных взаимодействий (Moore, 2004;
Motsinger et al, 2006: Moore et al, 2006) и логистический регрессионный анализ.
а) Исследование межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к воспалительным заболеваниям кишечника методом MDR.
Для оценки межгенных взаимодействий с помощью метода MDR был использован алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации полиморфных локусов, выбранных для анализа межгенных взаимодействий, в отношении риска развития воспалительных заболеваний кишечника. В результате анализа взаимодействий исследованных генов в формировании предрасположенности к БК была установлена четырехлокусная модель JAK2(1358*C/A) x NOD2/CARD15 (2722*G/C) x IL-4R(1727*A/G) x TNF (308*G/A), которая характеризовалась 90% воспроизводимостью и точностью предсказания 56,4 %. Согласно параметрам данной модели наиболее тесное взаимодействие установлено для генов JAK2(1358*C/A) и IL-4R(1727*A/G), меньшее по силе взаимодействие наблюдается с геном TNF (-308*G/A). Влияние генов на развитие БК определяется дублирующими эффектами. В модель также входит ген NOD2/CARD15 (2722*G/C) с независимым от представленных генов влиянием на развитие патологии. Анализ комбинаций всех возможных вариантов сочетаний аллелей для данной 4-х локусной модели позволил установить 17 генотипов повышенного риска и 10 генотипов пониженного риска развития БК.
В результате анализа межгенных взаимодействий в развитии ЯК была определена двухлокусная модель, включающая полиморфизм -308*G/A гена TNF и полиморфизм rs917997*G/A гена IL-18RAP. Модель обладала воспроизводимостью 100% и точностью предсказания 61,4%. Согласно полученной модели, гены TNF (308*G/A) и IL-18RAP (rs917997), которые вносят наибольший комплексный вклад в формирование предрасположенности к ЯК, входят в состав двух независимых и слабовзаимодействующих между собой кластеров генов. В рамках данной модели было выявлено 5 генотипов повышенного риска и 2 генотипа пониженного риска развития ЯК.
б) Прогнозирование риска возникновения ВЗК на основе исследования полиморфизма генов-кандидатов и средовых факторов риска заболевания Для оценки комплексного вклада генетических и средовых факторов в патогенез заболеваний, а также для определения прогностической значимости данных факторов нами использован метод логистического регрессионного анализа. Используя метод пошагового включения предикторов и расчета отношения правдоподобия оценены сочетания аллелей генов-кандидатов ВЗК, а также средовых факторов и, таким образом, были выбраны две наиболее эффективные регрессионные модели: модель, предсказывающей риск развития БК, и модель, прогнозирующая развитие осложненных форм течения БК. Для язвенного колита статистически значимых регрессионных моделей разработать не удалось.
В состав модели прогноза развития БК вошли 6 предикторов: NOD2/CARD(2104*C/T, 2722*G/C, Leu3020fsinsC), JAK2 (1358*C/A), TNF (-308*G/A) и IL4R (1727*A/G). Согласно полученным данным наибольшую прогностическую ценность несет полиморфизм гена NOD2/CARD15 (2104*C/T), наименьшее значение в прогнозе БК в данной модели имеет полиморфизм JAK2 (1358*C/A).
На основании показателей данной регрессионной модели получена математическая формула для оценки вероятности развития (p) заболевания Крона:
где А Ч полиморфизм 2104*C/T гена NOD2/CARD15 (2104*CC - 0, 2104*CT - 1, 2104*TT - 2);
B Ч полиморфизм 1727*A/G гена IL-4R (1727*AA - 0, 1727*AG - 1, 1727*GG - 2);
C Ч полиморфизм 1358*C/A гена JAK2 (1358*AA - 0, 1358*CA - 1, 1358*CC - 2);
D Ч полиморфизм -308*G/A гена TNF (-308*GG - 0, -308*GA - 1, -308*AA - 2);
E Ч полиморфизм 2722*G/C гена NOD2/CARD15 (2722*GG - 0, 2722*GC - 1, 2722*CC - 2);
F Ч полиморфизм 3020* wt / insC гена NOD2/CARD15 (3020* wt / wt - 0, 3020* wt / insC - 1, 3020* insC/ insC - 2);
е Ч математическая константа (численное значение: е = 2,7).
В полученную математическую формулу подставляются закодированные данные анализа полиморфизма генов-кандидатов для получения вероятности развития заболевания. Нами были условно выделены следующие группы риска развития заболевания: группа низкого риска (вероятность (p) <0,6); группа среднего риска (0,6< вероятность (p) <0,7); группа высокого риска (вероятность (p) >0,7). При анализе полиморфизма генов в группах больных и популяционного контроля, проведенном с помощью математической формулы расчета риска развития болезни Крона, 73% индивидуумов без признаков патологий ЖКТ правильно отнесены в группу низкого риска БК, 59% больных правильно отнесены в группу высокого риска развития БК.
Далее проведен анализ значения некоторых клинико-анамнестических показателей (пол, курение, возраст, возраст манифестации заболевания) и данных исследования генетического полиморфизма пациентов с БК на прогноз развития осложненных форм заболевания (стриктурирующей и пенетрирующей). Была выбрана модель, включающая 5 предикторов: пол, курение и полиморфизм генов IL4R (1727*A/G), NOD2/CARD15 (2722*G/C, Leu3020fsinsC). Согласно полученным результатам можно выделить следующие факторы прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона: курение, женский пол, носительство редких аллелей генов 1727*G (IL-4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*C (NOD2/CARD15).
На основании показателей данной регрессионной модели получена математическая формула для оценки вероятности развития (p) осложненных форм заболевания Крона (пенетрирующей и стриктурирующей):
где А Ч пол (мужской - 1, женский -2);
B Ч полиморфизм 1727*A/G гена IL-4R (1727*AA - 0, 1727*AG - 1, 1727*GG - 2);
C Ч курение (курящий -1; некурящий - 0);
D Ч полиморфизм 3020* wt / insC гена NOD2/CARD15 (3020* wt / wt - 0, 3020* wt / insC - 1, 3020* insC/ insC - 2);
E Ч полиморфизм 2722*G/C гена NOD2/CARD15 (2722*GG - 0, 2722*GC - 1, 2722*CC - 2);
е Ч математическая константа (численное значение: е = 2,7).
В полученную математическую формулу подставляются закодированные данные анализа полиморфизма генов-кандидатов и данные анамнестического исследования для расчета вероятности развития осложненных форм заболевания. Нами были условно выделены следующие группы риска развития осложненных форм заболевания: группа низкого риска развития осложненных форм БК (вероятность (p) <0,6); группа среднего риска развития осложненных форм БК (0,6 < вероятность (p) <0,7); группа высокого риска развития осложненной формы БК (вероятность (p) >0,7).
С помощью второй математической модели 82% пациентов с пенетрирующим и стриктурирующим характером течения БК были правильно отнесены к группе высокого риска развития осложненных форм и в 76% случаев пациенты с воспалительным течением БК были правильно включены в группу низкого риска развития осложненных форм.
Таким образом, применение методов многофакторного анализа с целью установления роли генетических и клинических показателей в прогнозировании формирования осложнённых форм БК еще раз подтвердило значение полиморфизма генов IL-4R и NOD2/CARD15, независимая ассоциация которых с развитием осложненных форм заболевания была ранее показана (Hugot et al., 2001; Zheng et al., 2003). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у женщин болезнь Крона протекает более агрессивно, чем у мужчин, а женский пол может являться фактором риска развития более тяжелых форм у пациентов с БК. Согласно эпидемиологическим исследованиям среди пациентов с БК преобладают женщины (Ekbom, 1991, Адлер, 2001), однако причины данного факта не установлены. Вполне вероятно, что половые различия в заболеваемости БК, а также в развитии осложненных форм заболевания обусловлены гормональными особенностями женского организма. Курение как фактор, способствующий более агрессивному течению БК, был ранее установлен в ряде исследований (Sutherland et al., 1990; Cosnes et al., 1996; Cottone, 1994). Одним из возможных механизмов влияния курения на течение БК является супрессорное воздействие никотина на функцию макрофагов (Hugot et al., 1999). С учетом этих сведений можно считать, что курение является фактором, способствующим более активному течению воспалительного процесса при БК и дальнейшему прогрессированию заболевания.
ВЫВОДЫ 1. Полиморфные аллели генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, аутофагии и иммунного ответа вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе России.
2. Полиморфизм генов NOD2/CARD15, JAK2, TNF, IL-4R независимо ассоциирован с развитием болезни Крона. Маркерами повышенного риска развития БК являются аллели 3020*insC (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2), -308*A (TNF), 1727*G (IL-4R).
3. Полиморфизм генов NOD2/CARD15, JAK2, IL-12B, IRGM независимо ассоциирован с развитием язвенного колита. Аллели генов rs10045431*A (IL-12B), 2104*С (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2), а также генотип rs13361189*CC (IRGM) являются маркерами повышенного риска развития язвенного колита.
4. Взаимодействие аллелей генов JAK2, IL-4R, TNF вносит вклад в формирование генетической предрасположенности к развитию болезни Крона.
5. Критериями прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона являются следующие факторы: курение, женский пол, аллели генов 1727*G (IL4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*C (NOD2/CARD15).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ в журналах, рекомендованных ВАК 1. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Барановский А.Ю., Баранов В.С.
Генетические факторы предрасположенности к болезни Крона // Медицинская генетика. 2007. Т.6. №5. С. 35-38.
2. Насыхова Ю.А., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Иващенко Т.Э., Барановский А.Ю., Баранов В.С. Анализ полиморфизма генов NOD2/CARD15 и TNF у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями желудочнокишечного тракта // Молекулярная медицина. 2010. №3. С. 32-37.
3. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., Харитонов А.Г., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э. Полиморфизм гена TNF-a у пациентов с язвенным колитом // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. 2011. Т.3, №3. С.41-45.
в других журналах, включая тезисы 4. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Барановский А.Ю., Баранов В.С.
Полиморфизм цитокиновых генов как маркер риска развития БК // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике. 2011. №16. С.135-141.
5. Семенов Н.В., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Барановский А.Ю., Баранов В.С.
Роль полиморфизмов гена TNFA в предрасположенности к болезни Крона // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 9-го международного славянобалтийского научного форума Санкт-Петербург - Гастро-2007. 2007. № 1-2.
С.99.
6. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Баранов В.С.
Исследование полиморфизма гена NOD2/CARD15 при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите // Вестник РГМУ. 2008. №2. С.316.
7. Харитонов А.Г., Кондрашина Э.А., Иващенко Т.Э., Насыхова Ю.А.
Полиморфные варианты гена TNF- у пациентов с язвенным колитом // СанктПетербург - Гастро-2009. 2009. №2-3. C.83.
8. Nasykhova Y., Ivaschenko T., Semenov N., Baranov V. CrohnТs disease and polymorphisms of the NOD2/CARD15 and TNFA genes // European journal of Human genetics. 2007. Vol.15, suppl. 1. P. 29. Nasykhova Y.A., Zhernakova A.P., Festen E.A., Ivaschenko T.E., Semenov N.V., Kharitonov A.G., Baranovskii A.Y., Weersma R.K., Wijmenga C., Baranov V.S..
Association study of 16 susceptibility loci with CrohnТs disease in Russian population // European journal of Human genetics. 2010. Vol.18, suppl. 1. P. 254.
10. Ivashchenko T., Nasyhova J., Ostankova J., Semenov N., Baranov V.. Polymorphism of TNFA gene promoter region and chronic inflammatory disorders // European Journal of Human Genetics. 2008. Vol. 16, suppl. 2. P. 355.
11. Nasykhova Y.A., Semenov N.V, Ivaschenko T.E, Barovskii A.Y., Baranov V.S. Study of association between polymorphism of 5 genes and CrohnТs disease in Russian population // European Journal of Human Genetics. 2009. Vol. 17, suppl. 2. P. 265.
12. Nasykhova Y. A., Semenov, N. V., Kharitonov A.G., Ivashchenko T.E. Novel differentiating genetic markers for CD and UC // European Journal of Human Genetics.
2008. Vol. 16, suppl. 2. P. 319.
13. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Жернакова А.П., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Барановский А.Ю., Баранов В.С. Роль полиморфизма генов системы JAK-STAT в развитии воспалительных заболеваний кишечника // Медицинская генетика.
Материалы VI съезда российских медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. 2010.
С. 125.
14. Kharitonov A.G., Kondrashina E.A., Baranovsky A.Y., Nasykhova Y.A., Baranov V.S.
Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in Russian patients with ulcerative colitis. Journal of CrohnТs and colitis. 2009. Vol..3. P.115. Семенов Н.В., Барановский А.Ю., Щукина О.Б., Кондрашина Э.А., Корниенко Е.А., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Баранов В.С. Новые генетические маркеры болезни Крона и язвенного колита // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2010. - №2-3. - С.82-83.