Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Микрюкова Тамара Петровна
Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России
03.01.03 - молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Кольцово-2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Научный Терновой Владимир Александрович, кандидат руководитель: биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор, заведующий лабораторией молекулярной эпидемиологии ООИ Официальные Кочнева Галина Вадимовна - доктор оппоненты: биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор, заведующая лабораторией вирусных гепатитов Беклемишев Анатолий Борисович - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ Институт биохимии СО РАМН, заведующий лабораторией генной инженерии Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится л14 декабря 2012 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор по адресу: р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, 630599; тел: (383) 336-74-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГН - ВБ Вектор Автореферат разослан л9 ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Трошкова Галина Павловна
Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, возбудители которых циркулируют в природе, остаются сложной проблемой, несмотря на все усилия по борьбе с ними. Нарастающая в последние десятилетия тенденция сосредоточения очагов природных инфекций на территориях, освоенных или осваиваемых человеком, заставляет искать закономерности их формирования и устойчивого функционирования.
Устойчивость паразитарной системы трансмиссивных заболеваний обеспечивается сложными взаимодействиями гетерогенных структур - популяций основных компонентов очага: возбудителей, переносчиков и прокормителей. Несмотря на большое количество исследований в этой области, представления о структурных компонентах природных очагов недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований, касающихся функционирования и контроля эпидемической напряжённости природных очагов и очагов, подвергшихся антропогенной трансформации.
Наиболее патогенными для человека из природно-очаговых трансмиссивных инфекций переносимых клещами являются флавивирусы. Для России наибольшую медицинскую значимость имеет вирус клещевого энцефалита (Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V., 1999), который был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке как этиологический агент клещевого энцефалита (Павловский, 1940). ВКЭ принадлежит к группе вирусов одноимённого комплекса и вызывает у людей заболевание центральной нервной системы с уровнем смертности 1Ц2 % для европейского и сибирского генотипа и 30 % - для дальневосточного генотипа (Gritsun T.S. et al., 2003). Передача ВКЭ осуществляется членистоногими переносчиками - клещами семейства Ixodidae.
В настоящее время заболеваемость КЭ она остаётся стабильно высокой и составляет 2,4Ц2,6 чел. на 100 тыс. населения (3200Ц3700 случаев в год), но в некоторых регионах Урала, Сибири и Дальнего Востока она в несколько раз превышает среднюю по РФ и достигает 30Ц35 чел. на 100 тыс. населения.
Ежегодно в РФ до 350 тысяч человек подвергаются нападению клещей, а значит, и риску заболевания клещевыми инфекциями, список которых ежегодно увеличивается. Для одних, вновь выявленных инфекций, роль в инфекционной патологии человека установлена, а для других вопрос патогенности остаётся открытым.
В настоящее время существует несколько видов риккетсий, патогенность которых для человека не подтверждена. Требуются дополнительные исследования этой группы клещевых инфекций для уточнения спектра циркулирующих в России видов и уточнения их патогенности для человека.
Наиболее актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций являются уточнение их ареалов, генотипов возбудителей этих инфекций, а также видового состава и границ распространения переносчиков.
Известно, что членистоногие переносчики могут влиять на свойства ВКЭ (Вотяков, 2002), в силу чего знание их генетических характеристик может быть полезным при изучении механизмов адаптации возбудителей к различным видам хозяев и формирования их патогенетических свойств. При этом информация о генетических характеристиках иксодовых клещей, распространённых в России, практически полностью отсутствует.
Всё также остаётся актуальной проблема вакцинопрофилактики: доля привитых, подвергшихся нападению клеща, не превышает 10 % даже для районов, неблагополучных по КЭ. Если ранее вакцинопрофилактика проводилась только для людей профессионально связанных с лесом, то сейчас к группе риска можно отнести всё население эндемичных по КВЭ районов.
Поэтому необходим генетический контроль производственных штаммов, используемых для вакцинации населения. Исходя из выше изложенного, нами было решено подойти к решению обозначенных проблем комплексно. Отсюда вытекает несколько поставленных целей для моего диссертационного исследования.
Цели исследования:
Х оценить уровень заражённости клещей вида Ixodes persulcatus и определить спектр инфекций в иксодовых клещах, собранных в пограничных районах ареала - на территории Республики Коми в 20году;
Х определить генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита и риккетсий, циркулирующих в выбранных для исследования природных очагах;
Х провести молекулярно-генетическую видовую идентификацию иксодовых клещей, участвующих в трансмиссии инфекций, в природных очагах Западной Сибири;
Х дать генетическую характеристику производственного штамма 2вируса клещевого энцефалита из коллекции ГН - ВБ Вектор.
В связи с поставленными целями предстояло решить ряд задач.
Задачи исследования:
Х создать коллекцию ДНК и РНК, выделенных из индивидуальных иксодовых клещей, собранных в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России;
Х выявить РНК ВКЭ и ДНК бактерий в коллекционных образцах с помощью ПЦР;
Х определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов, выявленных в образцах коллекции, вариантов ВКЭ и риккетсий и провести их молекулярно-генетический анализ;
Х охарактеризовать межвидовую и внутривидовую вариабельность иксодовых клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011Ц2012 гг., участвующих в трансмиссии клещевых инфекций, по нуклеотидным последовательностям митохондриальных геномов;
Х провести определение полной нуклеотидной последовательности генома референс-штамма 205 ВКЭ из коллекции ГН - ВБ Вектор и его сравнительный анализ.
Научно-практическая значимость Х Впервые проведено комплексное исследование природного очага клещевых инфекций в Республике Коми. В клещах I. persulcatus обнаружен генетический материал возбудителей восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированности клещей для разных инфекций колебался от 11,3 % до 1,2 % в зависимости от вида возбудителя. Уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %.
Х Впервые проведена оценка генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита, РНК которого выявлена в иксодовых клещах, собранных в центральных и южных районах Республики Коми.
Х Впервые показано, что в иксодовых клещах Республики Коми циркулирует сибирский и дальневосточный генотип ВКЭ, причём доминирует дальневосточный, доля которого достигает 81,2 % от числа клещей, генотипированных по ВКЭ. Во всех исследованных образцах иксодовых клещей европейский генотип ВКЭ обнаружен не был.
Х Анализ нуклеотидной последовательности 5'-НТО геномной РНК ВКЭ, выделенной из индивидуальных клещей, показал высокий уровень вариабельности некоторых участков Y-структуры 5'-НТО. Вариабельность элементов В2, С1, CS B наблюдалась в более чем 50 % образцов. Анализ конформации района 5'-НТО геномной РНК ВКЭ показал, что наблюдаются существенные изменения вторичной структуры этого района РНК. Полученные данные подтверждают гипотезу, что вариабельность и конформация 5'-НТО геномной РНК ВКЭ имеют принципиальное значение для адаптации вируса к активной репликации в клетках различных видов.
Х Установлено, что ДНК Rickettsia spp. встречается в клещах, грызунах и птицах, обитающих в г. Томске и его пригородах, Республике Коми и Республике Молдова. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена в 12,7Ц5,9 % образцов. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и ompA, кодирующих цитратсинтазу и белок А наружной мембраны, позволил установить, что на территории Республики Коми циркулируют два вида риккетсий - R. raoultii и R. tarasevichiae, на территории Томска - R. raoultii, R. tarasevichiae, R. slovaca. С помощью филогенетического анализа показано, что восемь томских изолятов кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. H820 (JF714220), которая является кандидатной для выделения в новый вид риккетсий.
Х Проведён анализ генома штамма 205 ВКЭ, используемого в настоящее время для производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита из двух вирусных коллекций, прошедших разную пассажную историю. Анализ показал их высокую гомологию и высокий уровень консерватизма штамма 205.
Полученные данные по генетическим характеристикам производственного штамма 205 ВКЭ могут быть использованы для стандартизации производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита.
Х Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генов субъединицы 1 цитохромоксидазы (COI) и 16S рРНК митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011Ц2012 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей исследованных митохондриальных генов иксодовых клещей показал, что уровень межвидовых отличий клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus, варьировал от 8 до 12 %, а уровень внутривидовой изменчивости - от 0,58 % до 1,93 %. Полученные данные могут быть использованы для проведения генетических исследований биоразнообразия различных видов клещей, обитающих в Евразии.
Положения, выносимые на защиту Х В Республике Коми в клещах I. persulcatus обнаружены генетические маркёры восьми инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.
Х Установлено, что на территории Республики Коми циркулируют ВКЭ дальневосточного и сибирского генотипа.
Х Доказано, что элементы С1, В2, CS B Y-структуры 5-НТО геномной РНК ВКЭ природных образцов высоковариабельны, при этом вторичная структура 5-НТО природных вариантов существенно отличается от вторичной структуры 5-НТО лабораторных штаммов.
Х Генетические маркёры Rickettsia spp. выявлены в пробах клещей, грызунов и птиц, обитающих в биотопах г. Томска и его пригородах и в клещах Республики Коми.
Х С помощью секвенирования показано, что полные нуклеотидные последовательности геномной РНК штамма 205 ВКЭ из коллекции ГН - ВБ Вектор и производственного штамма 205 из коллекции НПО Вирион, опубликованной в 1991 г., имеют высокий уровень гомологии.
Х Установлено, что уровень межвидовых и внутривидовых отличий по нуклеотидным последовательностям генов COI и 16S рРНК митохондриального генома клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus подтверждает правильность таксономического разделения двух рассматриваемых видов и позволяет использовать фрагменты последовательностей этих генов в качестве генетического маркёра для видовой идентификации иксодовых клещей.
Вклад автора:
Расчёт и тестирование олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для генотипирования иксодовых клещей; создание коллекции образцов ДНК/РНК, выделенных из иксодовых клещей; проведение ПЦР; определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) и их анализ, выполнены лично автором.
Выявление РНК/ДНК-маркёров трансмиссивных инфекций в образцах коллекции, расчёт олигонуклеотидных праймеров для определения полной нуклеотидной последовательности штамма 205 вируса клещевого энцефалита выполнено совместно с канд. биол. наук Чаусовым Е.В. и Карташовым М.Ю.
Структура диссертации Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы Материалы и методы, главы Результаты и обсуждение, выводов, списка литературы и приложения.
Библиография включает 150 работ: 54 - отечественных авторов, 96 - зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 13 таблиц.
Материалы и методы исследования Иксодовые клещи. Республика Коми. В исследование взяты 1137 клещей I. persulcatus, собранных в южных и центральных районах Республики Коми в 2010 г. Отлов клещей проведён сотрудниками ФГУП Дезинфекция, г. Сыктывкар Роспотребнадзора. Томск. В исследование взяты 1723 клеща I. persulcatus и I. pavlovskyi, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска в 2010Ц2011 гг. Отлов клещей проводили сотрудники кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета.
Республика Молдова. В исследование взяты клещи I. ricinus - 78, Dermacentor spp. - 77, Haemaphisalis spp. - 34, собранные в 2011 г. Отлов клещей проведён сотрудниками Национального Центра Общественного Здоровья Республики Молдова.
Штаммы и изоляты ВКЭ. Лабораторные изоляты ВКЭ Tms-Ix6, Tms-M-83, Tms-M-202, Tms-PT-14, Tms-PT-12 получены из природных образцов, собранных в г. Томске, пассированием на культуре клеток СПЭВ и штамм ВКЭ № 205(2), полученный из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (г. Москва) в 1989 г., предоставлены к. б. н. Е.В. Протопоповой. Штамм ВКЭ № 205(1) получен из НИИ ВС НПО Вирион (г. Томск) в 1989 г.
Используется для производства инактивированной вакцины.
Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью Taq-ДНКполимеразы (Медиген, Россия); температурный профиль реакции для разных пар праймеров определяли индивидуально.
Определение нуклеотидных последовательностей (НП) проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах, а для последовательностей I. pavlovskyi - не менее четырёх раз.
Анализ последовательностей. При проведении филогенетического анализа для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов.
Множественное сравнение последовательностей осуществляли с использованием пакета программного обеспечения LaserGene 8.
Филогенетический анализ проводили с помощью программ MEGA5, также использовались программа BLAST ( для расчёта вторичной структуры 5'-НТО в режиме on-line использовали программу
Результаты исследований и их обсуждение Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита в клещах I. persulcatus в Северо-Восточном регионе Европейской части России. Для уточнения спектра инфекций, циркулирующих в Республике Коми нуклеотидный материал, выделенный из клещей, анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Нами были обнаружены маркёры 8 клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ), лихорадки Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickеttsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.
(рис. 1).
Рис. 1а. Инфицированность клещей по Рис. 1б. Суммарная (общая) возбудителям (%), собранных в Республике Коми инфицированность клещей, собранных 2010 г. в Республике Коми в 2010 г.
Инфицированность клещей возбудителями инфекций распределялась в ряду в сторону уменьшения: боррелии (11,3 %) < риккетсии (8,4 %) < ВКЭ (4,6 %) < ВЗН (2,9 %) < бартонеллы (2,1 %) < бабезии (1,8 %) < анаплазмы (1,5 %) < эрлихии (1,2 %).
Нуклеотидный материал ПЦР-положительных индивидуальных клещей с выявлением ВКЭ был использован для определения нуклеотидной последовательности фрагмента 5-нетраслируемой области (5-НТО) вирусного генома. Данный подход позволил избежать культивирования ВКЭ в лабораторных условиях с рисками адаптации вирусного изолята к лабораторным системам культивирования и возможному изменению вирусного генома. С помощью филогенетического анализа (рис. 2) установлено, что из образцов 13 образцов (81,25 %) принадлежали к дальневосточному генотипу.
Они распадаются на несколько кластеров, близких к высокопатогенным штаммам 205, Приморье-91 и Глубинное/2004. 3 образца (18,75 %) отнесены к сибирскому генотипу и попадали в один кластер со штаммом Заусаев (использован как прототип), способным вызывать развитие хронического клещевого вирусного энцефалита. Из этого следует, что на территории Республики Коми возможно обнаружение у пациентов хронической формы течения этого заболевания. Образцов, содержащих европейский генотип ВКЭ, обнаружить не удалось. Т.о., разнообразие генетических вариантов ВКЭ в таёжном клеще даёт основание утверждать, что ВКЭ длительный период времени эволюционировал в исследованных биотопах Республики Коми и на её территории сформировались стойкие природные очаги с доминированием дальневосточного генотипа вируса.
НП 5'-НТО, определённые прямым секвенированием из природных образцов, сравнивали с 5'-НТО последовательностей из 5 лабораторных изолятов ВКЭ, выделенных из органов птиц (Tms-14Pt, Tms-12Pt), млекопитающих (Tms-83m, Tms-202m) и клещей (Tms-Ix6), собранных в г. Томске в 2006Ц2008 гг. и прошедших 5 пассажей на культуре клеток СПЭВ.
Анализ последовательностей 5-НТО в клещах I. persulcatus, отловленных в Республике Коми показал, что этот район генома высоко вариабелен. Уровень вариабельности для элементов С1, В2, CS B Y-структуры 5'-НТО превышал 50 %. Однако при этом некоторые элементы 5-НТО (A2, CS A, AUG) были полностью консервативны.
Для уточнения влияния наблюдаемых нуклеотидных замен на вторичную структуру 5-НТО генома ВКЭ исследованных вариантов, что включены в рис. 2, было проведено компьютерное моделирование вторичной структуры РНК. Полученные результаты показывают, что среди изолятов ВКЭ наблюдаются существенные изменения пространственной структуры этого района вирусного генома (рис. 3).
2. Молекулярно-генетический анализ полного генома вируса клещевого энцефалита дальневосточного генотипа референс-штамма 205.
Для получения новых данных, касающихся возможной изменчивости референс-штамма 205 дальневосточного генотипа, связанной с хранением и/или периодическим культивированием в лабораторных условиях, мы решили провести полноразмерное секвенирование штамма 205 из коллекции ГН - ВБ Вектор. Сравнить полученную НП генома с известными штаммами ВКЭ и штаммом 205 (DQ989336) из коллекции НПО Вирион (г. Томск), который секвенирован нами в 1991 году. Длина полного генома штамма 205 ВКЭ составила 10495 н.о.
Уровни гомологии, количество нуклеотидных замен и мутаций в выведенной аминокислотной последовательности штамма 205 в сравнении с прототипными штаммами флавивирусов колеблется от 90 до 99 % для полной НП и от 93 до 100 % для аминокислотной. Вторичная структура РНК 5-НТО - важного элемента для репликации вируса (Filamatori et al., 2006), у штамма 205 имеет обычный вид для дальневосточного генотипа ВКЭ. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей показывает, что штамм 205 находится внутри ветви дальневосточного генотипа.
Последовательность депонирована gb JX498939.
Komi Komi Komi Komi Komi Komi Komi76 Komi Komi Komi Komi Komi 205(DQ989336) Tms-Ix Tms-PT- Tms-PT- Tms-M-2Дальневосточный Glubinnoe/2004(DQ862460) Tms-M-генотип Komi Primorye-91(JQ825150) Primirye-89(FJ906622) Primorye-6 Sofjin-HO(AB062064) Primorye-18(GQ228395)d Primorye-253(EU816451)d Primorye-332(AY169390)d Primorye-212(EU816450)d Primorye-270(EU816452)d Primorye-90(FJ997899)d Primorye-86(EU816455)d Dalnegorsk(FJ402886) Primorye-94(EU816454) Primorye-22 Primorye-11 Pimorye92(HQ201303) Primorye-69(EU816453) Primorye-5 Oshima5-10(AB062063) Kavalerovo(FJ402885) MDJ-02(JF316707) 98 MDJ-03(JF316708) Европейский генотип Bogoluvovska (AY193805) Neudoerfl(U27495) 263(U27491) HM535678 HM5356 SALEM(FJ572210) Hypr(U39292) Louping ill(Y07863) Сибирский генотип EK-328(DQ486861) Aina (JN003206) Vasilchenko(AF069066) 653 (HM859894) Kolarovo-2008(FJ968751) Zausaev(AF527415) Komi Komi- Komi 178-79(EF469661) 98 886-84(EF469662) LangatTP21(EU790644) POW-Spassk9(EU7705Alkhurma1176(AF331718) 0.Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе НП (240 н.о.) 5-НТО РНК ВКЭ методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимуры. НП, полученные в данном исследовании обозначены знаками - для изолятовУKomiФ и - для изолятовУTomskФ Komi 10-04 Komi 10-Komi 10-14 Tms PtРис. 3. Вторичные структуры 5'-НТО ВКЭ различных генотипов: Komi 10-04 - сибирский генотип; Komi 10-03, Komi 10-14, Tms-Pt14 - дальневосточный генотип.
Изолят Tms-Pt14, прошедший 5 пассажей на культуре клеток, имеет вторичную структуру, характерную для дальневосточного генотипа ВКЭ, у остальных образцов наблюдаются существенные отличия от прототипных штаммов 3. Исследование встречаемости ДНК-маркёров рода Rickettsia в иксодовых клещах и их прокормителях из различных эпидемически активных природных очагов. Для определения частоты встречаемости генетических маркёров риккетсий с помощью ПЦР исследованы образцы иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска, Республике Коми и Республике Молдова. Также использовали материал из органов мелких млекопитающих и птиц, отловленных в Томской области (табл. 1).
Для генетического типирования риккетсий использовали фрагменты двух генов - gltA и ompA длиной 260 и 466 н.о., кодирующих соответственно цитратсинтазу и белок А наружной мембраны. Определены НП gltA для образцов (19 образцов - из Томска, 15 - из Респ. Коми и 8 - из Респ. Молдова).
Таблица Выявление ДНК риккетсий в исследуемых образцах методом ПЦР Кол-во Rickettsia spp.
Место сбора образцов абс. (отн. %) Томская область (клещи) 1723 102 (5,9 %) Томская область (млек.) 289 28 (9,7 %) Томская область (птицы) 84 23 (27,4 %) Республика Коми (клещи) 1137 95 (8,4 %) Республика Молдова (клещи) 189 24 (12,7 %) Филогенетический анализ по gltA-гену (рис. 4) позволил установить, что доминирующим видом риккетсий на территории Томской области была R. tarasevichiae, патогенность которой для человека не установлена. В образцах из Республики Коми также была обнаружена R. tarasevichiae, в образцах - ДНК R. raoultii, относящаяся к новым риккетсиозным патогенам. На филогенетическом дереве, построенном по НП гена gltA 14 образцов из Томска и 6 образцов из Респ. Коми, кластеризовались в одну ветвь с R. tarasevichiae и образовывали 3 субкластера. 3 изолята, выделенные на территории Респ.
Молдова, группировались в одну ветвь вместе с R. japonica, R. slovaca, R. conorii. Изолятов, выделенных в других регионах, в данной ветви нет. Ветвь, образованная образцами из группы R. raoultii, включала 5 НП из Респ.
Молдова, 9 - из Респ. Коми и 5 - из Томска.
НП гена ompA, кодирующего белок А наружной мембраны, были определены для 18 образцов, из них 9 образцов были из Томска, 4 - из Респ.
Коми и 5 - из Респ. Молдова (рис. 5).
Komi-10-11 Tomsk-10-131B Komi-10-1 Moldova-11-2 Tomsk-10-29M Tomsk-10-01M Tomsk-10-34B Tomsk-10-28M Komi-10-9 Komi-10-9 Komi-10-7 Komi-10-9 Komi-10-6 Komi-10-9 Komi-11-0 Moldova-11- R.andeanae (GU169050) R.aeschlimannii(DQ235776) R. raoultii (DQ365803) R.raoultii (DQ365804) Moldova-11-0 Moldova-11- Moldova-11- Moldova-11- R.slovaca 13-B (CP002428) Moldova-11-2 R. sibirica (HM050296) R. parkeri strain ApPR (JN126320) R.japonica YM (AP011533) R.africae (JL043505) R.conorii(HM050292) Moldova-11- Komi-10-0 Tomsk-11-2 Komi-10-9Рис. 4. Филогенетическое дерево, Komi-10-9 Komi-10-8построенное по ДНК-фрагменту Tomsk-10- Tomsk-11-27m (260 н.о.) гена gltA риккетсий Tomsk-11-2 Tomsk-11-2методом объединения ближайших Komi-10-8 R.tarasevichiae (DQ168981) соседей с использованием Tomsk-10- Tomsk-10-2-параметрической модели Tomsk-10-8 Tomsk-10-16 Кимуры. НП ДНК риккетсий, Tomsk-10-8секвенированные нами, Tomsk-10- Tomsk-10-обозначены как УKomiФ Tomsk-10- Tomsk-10-0УMoldovaФ, УTomskФ Komi-10-8 R.helvetica(U59723) в соответствии с местами сбора.
R.asiatica (AB297808) 1 R.canadensis (AB 297809) Прототипные последовательности R.tarasevichiae L40 (EU919263) Rickettsia sp H820(JF 714219) в оригинальной транскрипции 0.GenBank Moldova-11-06 (JX978435) Moldova-11-09 (JX978436) Komi-10-6 Komi-10-1179 (JX978439) Komi-10-4 R. raoultii isolate T6 (JQ798907) R. raoultii (JN 39848) Komi-10-733 (JX978438) Moldova-11-10 (JX978437) Rickettsia sp. JL-02(AY093696) R. conorii (JN944636) R. sibirica (U43807) R. parkeri strain Toledo (EU715288) R. africae (U83436) Tomsk-11-25 (JX972176) Moldova-11-271 (JX978433) R. slovaca 13-B (CP002428) 99 R. slovaca st.WB10 (HM161797) R.slovaca isolate T8 (JQ798909) Moldova-11-08 (JX978434) R. amblyommii (EF194096) 60 R. amblyommii is.75A(JQ690638) R.tamurae (DQ103259) Rickettsia sp.PoTiR634(HM149288) Rickettsia sp(JF714220) Tomsk-11-292 (JX946729) Tomsk-11-242 (JX946728) Tomsk-11-262 (JX946730) Tomsk-11-243 (JX972172) Tomsk-11-52m (JX972171) Tomsk-11-248 (JX972174) Tomsk-11-27m (JX972173) 69 Tomsk-11-232 (JX972175) R. monacensis (FJ919650) 0.Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное по ДНК-фрагменту гена ompA (466 н.о.), кодирующим белок А наружной мембраны риккетсий, методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимуры. НП ДНК риккетсий, секвенированные нами, обозначены как УKomiФ, УMoldovaФ, УTomskФ.
Последовательности депонированы gb JX946728, JX946729, JX946730, JX972171, JX972172, JX972173, JX972174, JX972175, JX972176, JX97843, JX978434, JX978435, JX978436, JX978437, JX978438, JX9784Томские образцы 11-292, 11-232, 11-262, 11-243, 11-27m, 11-52mp и 11-248, выделенные из органов птиц и клещей I. persulcatus и кластеризовавшиеся по гену gltA с R. tarasevichiae, по гену ompA оказались в одной ветви с последовательностью Rickettsia sp. H820 (JF714220), которая в 2011 г. была обнаружена в клещах на Северо-Востоке Китая. Один томский образец, полученный из клеща I. persulcatus, генотипирован как R. slovaca - вид, встречающийся в Европе и являющийся классическим риккетсиозным патогеном, вызывающим тяжёлое заболевание у людей. Исследование иксодовых клещей I. ricinus и Dermacentor spp., отловленных на территории Респ. Молдовы, выявило наличие в организме переносчиков двух видов риккетсий - R. slovaca и R. raoultii.
4. Нуклеотидная последовательность генов 16S рРНК и субъединицы цитохромоксидазы (CO) митохондриального генома иксодовых клещей Ixodes pavlovskyi и Ixodes persulcatus. В последнее десятилетие отмечается изменение видового состава иксодовых клещей, обитающих в городских биотопах г. Томска с увеличением доли, а на некоторых территориях полного доминирования клеща I. pavlovskyi и вытеснением I. persulcatus. Для доказательства этого был использован молекулярный метод, которые позволил провести идентификацию этих видов. Нами были определены НП митохондриальных генов клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus отловленных в Западной Сибири в 2011Ц2012 гг., а именно генов cox1, кодирующего субъединицу 1 цитохром-c-оксидазы (COI), и гена rrnL, кодирующего 16S рРНК. Выбор этих генов был во многом определён наличием информации по этим районам генома для других видов иксодовых клещей.
Последовательности депонированы в GenBank под номерами JX288763 и JX288764. Полноразмерный ген COI содержит 1539 н.о. для обоих видов клещей. Уровень межвидовых отличий НП митохондриального гена COI между двумя видами клещей составляет около 10 %. Уровень межвидовых отличий по аминокислотной последовательности составил всего 4 аминокислоты, 3 из них кластеризуются в одном районе - в позициях 157, 161 и 176 (табл. 3). Без сомнения, именно этот район может быть рекомендован для разработки тестсистемы для быстрого типирования этих видов клещей. Уровень внутривидовых отличий для двух известных полных нуклеотидных последовательностей генов COI составил 0,58 % для клещей I. pavlovskyi и 1,17 % для I. persulcatus.
Таблица Аминокислотные замены в гене, кодирующем CO Позиция а.о. в белке 157 161 176 4I. persulcatus (AB073725) I I S A I. persulcatus 1632 (JQ625687) I I S A I. persulcatus-T (JX288764) I I S A I. pavlovskyi (AB231669) M M L S I. pavlovskyi -Ipv1(JQ823025) M M L S I. pavlovskyi- Ipv2(JQ823024) M M L S I. pavlovskyi-T (JX288763) M M L S Последовательности, полученные нами, выделены жирным шрифтом.
Для филогенетического анализа нами был выбран фрагмент гена COI (640 н. о.), используемый для ДНК-штрихкодирования сельскохозяйственных животных. Его результаты представлены на рис. 6. Филогенетический анализ показал, что последовательности клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus формируют отдельные филогенетические ветви, обособленные от других видов иксодовых клещей. Полученные данные свидетельствуют о достаточно давнем разделении видов иксодид и о правомерности использования данного фрагмента митохондриального генома для определения видового состава иксодовых клещей.
НП гена 16S рРНК митохондриального генома была определена для клещей: I. pavlovskyi - Томск, 2011 г. (JX392858), I. persulcatus - Томск, 2011 г.
(JX392859) и I. pavlovskyi - Новосибирск, 2012 г. (JX392860). Полноразмерный ген 16S рРНК содержит 1206 н.о. для обоих видов клещей, что соответствует размеру этого гена для многих видов иксодовых клещей. Уровень гомологии по гену rrnL с известными последовательностями, депонированными в GenBank, составляет: для клещей I. pavlovskyi / I. persulcatus - 90Ц93 %; для I. pavlovskyi / I. ricinus - 82Ц84 %; для I. pavlovskyi / I. scapularis - 89Ц90 %.
Результаты филогенетического анализа по гену 16S рРНК (рис. 7) аналогичны результатам, полученным при филогенетическом анализе последовательности гена COI (см. рис. 6). Естественная внутривидовая изменчивость по гену 16S рРНК составляла соответственно 1,44 % и 1,93 % для клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus.
Полученные результаты согласуются с данными об уровне внутривидовой изменчивости гена COI, полученные при исследованиях клещей, обитающих в других районах земного шара.
Рис. 6. Филогенетическое дерево, построенное по НП фрагмента гена COI мтДНК (640 н.о.) иксодовых клещей.
НП, определённые в данном исследовании, обозначены как Рис. 7. Филогенетическое дерево, построенное по НП фрагмента гена 16S рРНК мтДНК (437 н.о.) иксодовых клещей. НП, определённые в данном исследовании, обозначены знаком Выводы 1. В клещах I. persulcatus, собранных в биотопах Республики Коми, обнаружен генетический материал восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ) и Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.
Уровень инфицированности клещей колебался от 11,3 % до 1,2 % в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %. Анализ 5'-НТО геномной РНК ВКЭ из иксодовых клещей, собранных на территории Республики Коми в 2010 г. показал, что 81,3 % образцов относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, а 18,7 % - к сибирскому генотипу. Варианты европейского генотипа не обнаружены.
2. Анализ 5-НТО геномой РНК ВКЭ из иксодовых клещей показал существенные изменения конформации Y-структуры и высокую вариабельность этого района. Вариабельность элементов С1, В2, CS B наблюдалась в более чем 50 % образцов, при этом A2 и ATG-элементы 5-НТО оставались полностью консервативными.
3. Rickettsia spp. была обнаружена в пробах клещей, собранных в г. Томске - в 5,9 %, Республике Коми - в 8,4 % и Республике Молдова - в 12,7 % образцов. Генетический материал риккетсий был выявлен в 9,7 % образцов, полученных из органов грызунов и в 27,4 % образцов - из различных видов птиц, обитающих в г. Томске и его пригородах.
4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и ompA риккетсий позволил выявить циркуляцию R. raoultii и R. tarasevichiae на территории Республики Коми и г. Томске. Восемь томских изолятов Rickettsia кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. H8(JF714220), выявленной в 2011 г. в Северном Китае и рассматриваемую как кандидата для выделения в новый вид риккетсий.
5. Определена нуклеотидная последовательность генов COI и 16S рРНК митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011Ц2012 гг. Уровень гомологии между этими видами клещей составил для гена 16S рРНК - 92 %, для гена CO - 90 %.
Уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составил 0,58 % для клещей I. pavlovskyi и 1,17 % для I. persulcatus, по гену 16S рРНК - 1,44 % и 1,93 % соответственно. Филогенетический анализ генов COI и 16S рРНК показал, что последовательности мтДНК клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геногруппы и могут быть использованы в качестве генетических маркёров для видовой идентификации клещей рода Ixodes.
6. Генетический анализ полной нуклеотидной последовательности штамма 205 ВКЭ из коллекции ГН - ВБ Вектор (GenBank JX498939) показал, что уровень гомологии нуклеотидной последовательности с прототипными последовательностями дальневосточного генотипа составил 90Ц95 % и для аминокислотных последовательностей - 94Ц98 %. Уровень гомологии со штаммом 205 (GenBank DQ989336) из коллекции НПО Вирион - 100 %, за исключением 3'-НТО, которая оказалась на 30 нуклеотидов длиннее, чем у штамма 205 из коллекции ГН - ВБ Вектор.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Л.И. Глушкова, И.В. Корабельников, Ю.И. Егорова, В.А. Терновой, Е.В. Протопопова, Т.П. Микрюкова, Ю.В. Кононова, С.Н. Коновалова, Н.Л. Тупота, М.Ю. Карташов, Е.В. Чаусов, В.Б. Локтев // Возбудители инфекционных заболеваний в таёжном клеще на территории Республики Коми // Дезинфекционное дело. - 2012. - № 1. - С. 52Ц56.
2. Л.И. Глушкова, И.В. Корабельников, В.А. Терновой, Е.В. Протопопова, Т.П. Микрюкова, Ю.В. Кононова, С.Н. Коновалова, Н.Л. Тупота, М.Ю. Карташов, Е.В. Чаусов, В.Б. Локтев, Ю.И. Егорова // Выявление возбудителей заболеваний в Ixodes persulcatus на территории Республики Коми // Сибирский мед. журнал. - 2012. - № 4. - С. 88Ц91.
3. П.Ф. Сафронов, С.В. Нетёсов, Т.П. Микрюкова, Блинов В.М., Е.Г Осипова, Н.Н. Киселева, Л.С. Сандахчиев. Нуклеотидная последовательность генов и полная аминокислотная последовательность вируса клещевого энцефалита, штамм 205 // Молекул. ген. микробиол. вирусол. - 1991. - № 4. - С. 23Ц29.
Тезисы 1. Семенцова А.О., Терновой В.А., Шиков А.Н., Чаусов Е.В., Микрюкова Т.П., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. - Дифференциальная диагностика флавивирусных инфекций методом ПЦР в реальном времени // 2-ая Международная конференция Астана Биотех 2011. Астана, Казахстан. 2011 г. С. 71.
2. Микрюкова Т.П., Карташов М.Ю., Протопопова Е.В., Тупота Н.Л., Кононова Ю.В., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. - Циркуляция патогенов, передающихся клещами на территории Западной Сибири в 2009Ц2011 гг. // 2-ая Международная конференция Астана Биотех 2011. Астана, Казахстан. 2011 г. С. 158.
3. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Терновой В.А., Микрюкова Т.П., Протопопова Е.В., Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. - Возбудители инфекционных заболеваний в таёжном клеще на территории Республики Коми // IV Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 2012 г. С. 100.
4. Микрюкова Т.П., Карташов М.Ю., Протопопова Е.В., Коновалова Ю.В., Тупота Н.Л., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Гори А.Ф., Москвитина Н.С., Локтев В.Б. - Генетические варианты риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки из различных эпидемически активных очагов // IV Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 2012 г.
С. 249.
5. Микрюкова Т.П., Шиков А.Н., Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Кононова Ю.В., Семенцова А.О., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Романенко В.Н., Москвитина Н.С., Локтев В.Б. - Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и CR-района митохондриальной ДНК иксодовых клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus.
Международная конференция Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами. ИркутскЦЛиствянка. 2012 г. С. 35.
6. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Микрюкова Т.П., Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б., Егорова Ю.И. - Выявление возбудителей заболеваний в Ixodes persulcatus на территории Республики Коми //Международная конференция Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами. Иркутск - Листвянка. 2012 г. С. 15.
7. Кононова Ю.В., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Микрюкова Т.П., Локтев В.Б. и др. - Инфицированность клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi вирусами клещевого энцефалита и Западного Нила в биотопах г. Томска и его пригородах в период 2006Ц2010 гг. Международная конференция Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами.
ИркутскЦЛиствянка. 2012 г. С. 31.
Настоящая работа выполнена за счёт финансирования по грантам НШ-65387.2010.4, НШ-2996.2011.4, гранта РФФИ 12-04-00563-а, ФЦП № 63-Д/2 по Госконтракту № 01201175188, № 70-Д/1 по Госконтракту № 01201175183 и № 41-Д/по Госконтракту № 01201270193.