Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Андрианов Борис Витальевич
Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы
03.02.07 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2010
Работа выполнена в отделе генетики животных Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им Н.И. Вавилова РАН и в лаборатории генетики Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им Н.К. Кольцова РАН Научные консультанты: - доктор биологических наук В.Г. Митрофанов - доктор биологических наук Н.Г. Шуппе
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гордеев Михаил Иванович (МГОУ) доктор биологических наук, профессор Елена Алексеевна Ляпунова (ИБР РАН) доктор биологических наук, профессор Марлен Мкртычевич Асланян (МГУ) им. М.В. Ломоносова.
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии РАН
Защита состоится на заседании диссертационного совета Д002.238.01 созданного при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.
Сайт: E-mail: idbras@bk.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26, и на сайте Автореферат разослан_____________________2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова E-mail: ele0806@yandex.ru
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Автономные генетические элементы выделяют по признаку наличия собственной ДНК, репликация которой частично независима от репликации клеточного генома. Сравнительно небольшие размеры и высокий уровень изменчивости геномов автономных генетических элементов делают их чувствительным маркёром микроэволюционных процессов. Все эукариотические клетки содержат митохондрии и репликационно компетентные семейства транспозонов, а многие виды ещё и внутриклеточные бактерии. Изменчивость ядерного генома, вызываемая автономными генетическими элементами, связана с процессами рекомбинации, ретротранспозиции и горизонтального переноса ДНК. Эти события ведут к увеличению размеров и сложности эукариотических геномов.
Другой, не менее важной особенностью изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами, является её направленность. Как было впервые показано С.М. Гершензоном, наличие ДНК в цитоплазме является мутагенным фактором, вызывающим определённый спектр мутаций, обычно нестабильных и часто ревертирующих к норме. Мутации, вносимые транспозонами, так же носят направленный характер определяемый специфичностью ферментов интеграции. Так как разные виды имеют разные наборы функционально активных транспозонов, а мутации, вносимые ими, многократно и независимо повторяются, то вероятность фиксации этих мутаций в популяциях возрастает. Из этих фактов следует, что автономные генетические элементы имеют существенное значение в определении сценария эволюционного преобразования вида.
Изучение структурной и функциональной изменчивости, вносимой в геном ретротранспозонами, остается актуальной проблемой современной генетики.
Выделение функционально-активного семейства ретротранспозонов из генома любого вида организмов существенно расширяет возможности дальнейшего изучения генетики этого вида и его возможного биотехнологического применения. Задача эта, однако, не проста, так как большинство копий ретротранспозонов в геноме дефектны и либо вовсе не способны к перемещению, либо могут перемещаться только в присутствии ретротранспозона-помощника. В данной работе представлено выделение, клонирование и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов Tv1 из генома Drosophila.virilis. Применённый метод может быть использован для выделения и характеристики функционально-активных семейств ретротранспозонов из других видов животных.
В работе представлена молекулярно-генетическая характеристика экспрессии Tv1 и применение гипервариабельных последовательностей Tv1 в качестве селективно нейтральных маркёров для характеристики популяционной структуры природных популяций дрозофил группы virilis и в качестве маркёров сайтов инсерций митохондриальных псевдогенов.
Определена нуклеотидная последовательность митохондриального генома Drosophila.littoralis и на этой основе проведено изучение межвидовой, внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости митохондриального генома природных популяций дрозофил группы virilis. Группа virilis состоит из одиннадцати широко распространённых видов дрозофил, обитающих в Евразии и Северной Америке. Предполагаемое время дивергенции предковых форм D.virilis и D.melanogaster оценивается в 40 миллионов лет.
Начиная с классических исследований (Patterson & Stone, 1952), данная группа активно изучается как модельный объект микроэволюции и видообразования. Изучение дрозофил группы virilis в России имеет давнюю историю. Первые исследования систематики и экологии D.lummei и D.littoralis проведены Н.Н. Соколовым. (Соколов, 1948). Интерес к исследованию популяционно-генетических и микроэволюционных процессов в группе virilis сохраняется и в настоящее время. Одно из перспективных направлений в этой области - связь микроэволюционных процессов с активностью ретротранспозонов. Дрозофилы группы virilis - удобный модельный объект для сравнительного исследования популяционной структуры природных и синантропных видов.
В настоящее время все больше видов вовлекается во взаимодействие с человеком, возникают синантропные расы, изменяется генетическая структура популяций. Изучение закономерностей в ответе на эти изменения со стороны наиболее лабильной части генома, представленной ретротранспозонами и другими автономными генетическими элементами, представляет несомненный интерес.
Цель работы. Изучить структуру и популяционную динамику изменчивости, связанную с полуавтономными генетическими элементами дрозофил.
Задачи исследования 1. Разработать метод выделения функционально-активных семейств ретротранспозонов и выделить функционально-активные семейства ретротранспозонов D.virilis.
2. Определить нуклеотидную последовательность митохондриального генома одного из видов группы virilis (D.littoralis).
3. Охарактеризовать межвидовую изменчивость митохондриальной ДНК у дрозофил группы virilis по трем признакам: Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) тотальной мтДНК, изменчивость фрагмента гена 16S рРНК, изменчивость фрагмента гена cox1.
4. Изучить особенности внутривидового полиморфизма мтДНК в группе virilis у четырех видов дрозофил: D.littoralis, D.americana, D.virilis, и D.montana.
5. Исследовать внутрипопуляционную структуру и динамику митохондриальной изменчивости в локальной, чётко ограниченной, природной популяции D.littoralis (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении нескольких лет. Для этого провести анализ сопряженности митохондриальных гаплотипов с полиморфным ядерным ДНК-маркером для выявления расовой структуры популяции.
6. Получить новую пересеваемую клеточную линию дрозофилы, инфицированную внутриклеточными бактериями Wolbachia для изучения горизонтального переноса ДНК между клеткой дрозофилы и бактерией.
Научная новизна работы Разработан метод выделения функционально-активных ретротранспозонов и этим методом впервые выделено и охарактеризовано функциональноактивное семейство ретротранспозонов D.virilis - Tv1.
Предложен простой метод электронно-микроскопической идентификации вирусоподобных частиц ретротранспозонов.
Впервые показана трансактивация синтеза вирусоподобных частиц Tv1 в клеточной культуре.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома D.littoralis.
Впервые проведен многолетний анализ динамики митохондриальных маркеров в локальной природной популяции D.littoralis. Обнаружено устойчивое соотношение мт-гаплотипов. Анализ сопряженности несцепленных ядерных и митохондриальных маркеров в выборке из природной популяции D.littoralis позволил выявить скрытую расовую структуру, способствующую поддержанию генетической гетерогенности и стабильности популяционного генофонда.
На основе анализа изменчивости митохондриальной ДНК в группе virilis получен ряд новых данных, позволивших уточнить филогенетическую структуру группы virilis. В частности, показано единство митохондриального генофонда двух подвидов D.americana; а также получено подтверждение разделения вида D.littoralis на два подвида: D.littoralis littoralis и D.littoralis imeretensis.
Теоретическая и практическая значимость работы Разработанный метод выделения функционально-активных ретротранспозонов может быть применён для оценки геномной стабильности клеточных культур животных по наличию/отсутствию и количеству вирусоподобных частиц эндогенных ретротранспозонов.
Описание и анализ полного митохондриального генома D.littoralis даёт новые данные для изучения эволюции митохондриального генома дрозофилы.
Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике популяций, разрабатываемые на дрозофиле как модельном объекте, и закладывают основы для дальнейшего изучения динамики митохондриальных генофондов насекомых. Полученные результаты важны для исследований в области охраны и мониторинга популяций редких и исчезающих видов, а также рационального использования эксплуатируемых популяций. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН и РАСХН, таких как Институт общей генетики РАН, Институт молекулярной биологии РАН, Институт биологии развития РАН, Институт биологии гена РАН, Институт комплексного освоения природных ресурсов РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийский научноисследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства РАСХН.
Положения выносимые на защиту 1. Клетки дрозофил содержат вирусоподобные частицы одного или нескольких семейств эндогенных ретровирусов и/или ретротранспозонов.
Клонирование нуклеиновых кислот из клеточной фракции вирусоподобных частиц позволяет клонировать функционально-активные семейства ретротранспозонов данного вида.
2. Суперинфекция вирусоподобными частицами клеток пересеваемой культуры может приводить к временной индукции синтеза вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки.
3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома D.littoralis и выявлены области, изменчивость которых специфична для группы virilis.
4. В условиях клеточной пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием новых митохондриальных псевдогенов.
5. Структура митохондриальной изменчивости природных и синантропных видов насекомых существенно различается. Локальные популяции синантропных видов мономорфны, тогда как у видов, образующих природные популяции, митохондриальная изменчивость образована совокупностью нескольких митохондриальных гаплотипов, находящихся в равновесии.
6. Анализ сопряжённости несцепленных митохондриальных и ядерных ДНК маркёров в локальных, частично изолированных популяциях позволяет выявить криптические расы, обитающие симпатрически.
7. В пересеваемых клеточных линиях дрозофилы возможна персистенция внутриклеточных бактерий Wolbachia pipientis.
Апробация результатов диссертации Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
Х International Conference Molecular PhylogeneticsФ (MolPhy-2) Moscow, May 18-21, 2010;
Х 51th Annual Drosophila Research Conference. Washington, DC.April 7-11.
2010;
Х IV съезда ВОГиС. Москва 21-22 июня. 2009;
Х Международная научно-практическая конференция Х Актуальные проблемы биоэкологи. 21-24 октября 2008;
Х XX International Congress of Genetics Berlin, Germany, 2008;
Х 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 2007;
Х 47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, Texas, 2006;
Х 19th European Drosophila Research Conference, Eger, Hungary, 2005;
Х 46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, 2005;
Х III съезда ВОГиС, 2004;
Х 45th Annual Drosophila Research Conference, Washington, USA, 2004.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 статей в российских и международных рецензируемых журналах, Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 515 ссылок.
Работа проиллюстрирована 14 таблицами и 67 рисунками.
Результаты и обсуждение 1. Выделение и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов D.virilis - Tv1.
1.1. Выделение и клонирование Tv1. Метод выделения функционально активных ретротранспозонов основывался на универсальности цикла автономной репликации ретротранспозонов относящихся к суперсемействам gypsy и copia. Цикл ретротранспозиции данных ретротранспозонов включает стадию вирусоподобной частицы (ВПЧ), в которой компартментализована активность обратной транскриптазы и геномная РНК ретротранспозона. В составе ВПЧ обнаруживают как РНК-геномы ретротранспозонов, так и различные промежуточные продукты их обратной транскрипции, включающие полиаденилированные РНК-ДНК гибридные формы и конечный продукт обратной транскрипции - линейную двухцепочечную ДНК.
Полиаденилированные РНК-ДНК гибридные формы особенно удобны для клонирования, так как с помощью афинной хроматографии их можно отделить от примесей фрагментов хромосомной ДНК. Из культивируемых клеток D.virilis была получена клонотека полиаденилированных нуклеиновых кислот ВПЧ. Чтобы найти среди них последовательности ретротранспозонов, использовали хорошо известное свойство ретротранспозонов активно транскрибироваться в культуре клеток. Для этого был получен меченый зонд кДНК, синтезированный на основе препарата тотальной поли(А) РНК из клеток D.virilis. Клон pf7Dv14, связывавший максимальное количество зонда, отобрали как возможный ретротранспозон.
Другая клонотека была получена на основе клонирования двухцепочечной ДНК ВПЧ клеток D.virilis. Используя в качестве зонда клонированный фрагмент pf7Dv14, из второй клонотеки отобрали гомологичный клон pf7V-59, содержащий фрагмент размером 7 т.п.н. Секвенирование этого фрагмента и анализ полученной последовательности позволили определить его как новое семейство ретротранспозонов.
На (рис. 1) представлена схема структурной организации ретротранспозона Tv1. На концах Tv1 выявляются идентичные ДКП. Тело элемента содержит три протяженные открытые рамки считывания. Поиск последовательностей, гомологичных Tv1, в GenBank, выявил наибольшее сходство Tv1с компактной группой ретротранспозонов gypsy-группы, Рис. 1. Генетическая карта ретротранспозона Tv1. ORF - открытая рамка считывания.
Белковые домены: Pr -протеаза, RT - обратная транскриптаза, RNaseH - рибонуклеаза Н, Int - интеграза (GenBank ID: AF056940) Транскрипция Tv1 в клетках линии 79f7Dv3g. Nothern блот-гибридизация 5 мкг поли(А) РНК клеток 79f7Dv3g, фракционированной в денатурирующем агарозном геле с (32P) меченым зондом Tv1.
Дорожки: 2 - поли(А) РНК; 1 - тот же материал, что и на дорожке 2, обработанный РНКазой А в растворе с низкой ионной силой.
Амплификация Tv1 в клеточной культуре. Саузерн-блот-гибридизация тотальной HpaII расщепленной ДНК с (32P) меченым ScaI фрагментом Tv1 (3236-6654). Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки: 1 - клетки 79f7Dv3g, 2 - линия мух Pu40, 3 - линия мух Dv9.
Стрелками отмечены внутренние фрагменты Tv1. Треугольники отмечают концевые фрагменты Tv1, возникающие при гидролизе линейных внехромосомных форм Tv1.
Внехромосомные кольцевые формы Tv1 Саузерн-блот-гибридизация внехромосомной кольцевой ДНК из культуры клеток 79f7Dv3g с (32P) меченой ДНК плазмиды pf7V-59. На каждой дорожке материал из 108 клеток, расщепленный 1 - HindIII, 2 - XhoI, 3 - SalI, 4 - без рестрикции. Миграция фрагментов маркера молекулярной массы HindIII отмечена на полях. Размеры фрагментов в т.п.н.
относящихся, согласно последней классификации, к эррантивирусам насекомых. Выявляемая гомология позволяет заключить, что три открытые рамки считывания Tv1 соответствуют генам gag, pol и env. Анализ гена pol позволил выявить консервативные домены протеазы, обратной транскриптазы, РНКазы Н и интегразы ретротранспозонов gypsy-группы. Последовательность Tv1 прилежащая к 5' ДКП, гомологична 3' концевой области тРНКSer и, следовательно, может функционировать, как сайт связывания праймера для синтеза минус цепи ретротранспозона ((-) PBS). Последовательность Tvприлежащая к 3' ДКП, является полипуриновым трактом и, следовательно, может функционировать как (+)PBS.
1.2. Распространение Tv1 у дрозофил группы virilis. Все изученные линии D.virilis содержат Tv1, причем в сходной копийности (рис. 2).
Рис. 2. Распределение Tv1 в линиях D.virilis различного географического происхождения.
Саузерн-блот-гибридизация геномной ДНК мух, расщепленной XhoI, с зондом внутреннего ScaI фрагмента Tv1 (3236-6654).
1 - D.melanogaster (Oregon R); 2 - Dv160; 3 - Dv1; 4 - Dv59; 5 - Dv101; 6 - Dv10; 7 - Dv13; 8 - Dv117; 9 - Dv40; 10 - Dv118; 11 - Dv25; 12 - Dv42.
Миграция фрагментов маркера молекулярной массы HindIII отмечена на полях.
Для линии Dv9 методом дотгибридизации число копий Tvопределено как 25-50 на гаплоидный геном. Значительная часть этих копий может иметь ту же структуру, что и отсеквенированная копия Tv1. Данный вывод следует из наличия яркой полосы 4.4 т.п.н., ожидаемой при XhoI расщеплении Tv1 из плазмиды pf7V-59. Эта полоса хорошо выражена у всех проанализированных линий, что свидетельствует о гомогенности структуры Tv1 в геноме D.virilis.
Рис. 3. Межвидовое распределение Tv1.
Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК разных видов мух из группы virilis, расщепленной XhoI, с зондом внутреннего ScaI фрагмента Tv(3236-6654). Взяты следующие линии мух:
1 - D.melanogaster (Oregon R) 2 - D.virilis (Uman);
3 - D.virilis (Magarach); 4 - D.lummei 211; 5 - D.lummei 234; 6 - D.littoralis; 7 - D.virilis (160); 8 - D.flavomontana; 9 - D.americana; 10 - D.borealis; - D.kanekoi; 12 - D.ezoana; 13 - D.lacicola; 14 - D.novomexicana; 15 - D.montana.
Межвидовое сравнение структуры и копийности Tv1 в группе видовблизнецов D.virilis (рис. 3) выявило отсутствие похожих по рестриктной карте элементов и резкие различия в копийности. В жестких условиях гибридизации в геноме D.melanogaster никаких гомологичных Tv1 последовательностей не выявляется. Значительные отличия в копийности и структуре Tvсвидетельствуют о том, что дивергенция видов группы virilis сопровождалась транспозициями Tv1.
1.3. Хромосомная локализация Tv1. На (рис. 4) показан результат локализации Tv1 на хромосомах D.virilis. Гибридизация выявляется, в основном, в прицентромерном гетерохроматине всех шести хромосом и в нескольких эухроматиновых сайтах. Такой тип локализации свойственен транспозонам, давно внедрившимся в геном данного организма.
Рис. 4. In situ гибридизация политенных хромосом клеток слюнных желез мух линии Dv9 c (3H) меченым ScaI фрагментом Tv1 (3236-6654). Стрелкой отмечена интенсивная гибридизация в области хромоцентра.
Хромосомная локализация копий Tv1 в линиях: Dv9, Dv160 и Ds11(w). Кружками отмечены вновь возникшие сайты локализации Tv1 в гибридной, мутантной линии.
Экспериментально наблюдаемые перемещения Tv1 удалось обнаружить при дестабилизации генома D.virilis в системе гибридного дисгенеза, при скрещивании линий Dv9 и Dv160 (Evgen'ev et al., 1997). Сравнение хромосомной локализации Tv1 в геноме родительских линий и в сублинии Ds11(w), отобранной из потомства от дисгенного скрещивания по спонтанной мутации white, приведено на (рис. 4). Наблюдается полиморфизм между родительскими линиями, кроме того, в гибридной линии возникло три новых сайта, указывающих на транспозиции Tv1 в системе гибридного дисгенеза.
Хромосомные локусы 29C, 39F, 49F и 60C содержат Tv1 во всех трех проанализированных линиях.
1.4. Идентификация сайтов интеграции Tv1. Сравнительно недавно стал доступен для анализа полный геном D.virilis (линия Dv 149) Поиск in silico с зондом в виде длинного концевого повтора Tv1 выявил 211 последовательностей. Характерно наличие двух основных размерных классов. Первый имеет длину около 6,5 т.п.н.
образован полноразмерными элементами с двумя ДКП. Второй, длиной 413 н.п.
образован одиночными ДКП (несколько аномально длинных копий Tvобразованы рекомбинантными копиями, составленными из фрагментов двух элементов). Оба класса элементов фланкированы микросателлитными последователностями (ТА)n. Наличие таких фланкирующих последовательностей может быть обьяснено специфичностью интегразы элемента. Для выяснения длины узнаваемой интегразой последовательности и длины вносимой интегразой дупликации проведено сравнение фланкирующих последовательностей всех полноразмерных копий Tv1, выявленных в полном геноме D.virilis. Из данных представленных на (рис. 5), видно 100% совпадение первых четырёх нуклеотидов, которые, следовательно, дуплицируются интегразой элемента при встраивании новой копии Tv1 в хромосому.
Рис. 5. Анализ сайтов интеграции 92 полноразмерных Tv1 из отсеквенированного генома.
Строчными буквами показана консенсусная последовательность сайта интеграции.
Заглавными буквам показана последовательности концов Tv1. На гистограммах сверху консенсуса показан процент консенсусного основания в данном положении.
Последовательность первых восьми нуклеотидов консервативна в 95-98% случаев. Можно предположить, что эта последовательность необходима для узнавания интегразой Tv1 сайта будущей инсерции. Вне этих пределов строгость соответствия консенсусу скачкообразно снижается, следовательно, значение этих последовательностей для эффективного узнавания интегразой Tv1 маловероятно. Таким образом, минимально необходимый для узнавания Tv1 интегразой сайт состоит из 12 нуклеотидов - (ТА)6.
1.5. Идентификация ВПЧ Tv1. Вирусоподобные частицы D.virilis выделяли из клеток эмбриональной пересеваемой культуры. Нуклеиновые кислоты, выделенные из ВПЧ культуральной среды, ядер и цитоплазмы, фракционировали в нативном агарозном геле и после переноса по Саузерну на нейлоновую мембрану гибридизовали с (32P) меченой ДНК плазмиды pf7V-59, содержащей полноразмерную копию Tv1. Результат гибридизации, представленный на (рис. 6) дорожки 1-3, свидетельствует о наличии Tv1 ДНК размером 7 т.п.н. в составе цитоплазматических и внеклеточных ВПЧ. В ядре ВПЧ Tv1 отсутствуют, что подтверждает электронно-микроскопический анализ клеточных срезов. Обработка нативных частиц ДНКазой 1 не приводит к деградации ДНК Tv1, что свидетельствует об упаковке Tv1 ДНК внутри частиц и исключает вероятность адсорбции свободной внехромосомной ДНК Tv1 на частицы.
Непосредственная идентификация частиц Tv1 на электронных микрофотографиях частиц из фракций сахарозного градиента затруднена, поскольку в культуре клеток D.virilis 79f7Dv3g присутствует персистирующий реовирус, сходный с реовирусом, идентифицированным в клетках линии 67j25D (D.melanogaster) (Алаторцев и др., 1980). Геном реовируса представлен восемью фрагментами двухцепочечной РНК. Частицы реовируса обнаруживаются как в клетке, так и в культуральной среде. ВПЧ ретротранспозонов коседиментируют с частицами реовирусов, давая совпадение пиков в сахарозном градиенте.
Рис. 6. Саузерн-блот-гибридизация нуклеиновых кислот ВПЧ из культуры клеток 79f7Dv3g с (32P) меченой ДНК плазмиды pf7V-59.
Дорожки 1-3 - нуклеиновые кислоты ВПЧ из 108 клеток 79f7Dv3g:
1 - внеклеточные ВПЧ, 2 - ядерные ВПЧ, 3 - цитоплазматические ВПЧ. Дорожки 4,5 - нуклеиновые кислоты ВПЧ из 10 мл культуральной среды: 4 - ВПЧ обработаны ДНКазой 1, затем депротеинизированы, и нуклеиновые кислоты нанесены на гель; - ВПЧ обработаны РНКазой А, затем депротеинизированы, и нуклеиновые кислоты нанесены на гель. (К препаратам 4 и 5 перед обработкой нуклеазами добавили по 10 нг линеаризованной по Sal1 плазмиды pUC19 размером 2.7 т.п.н. в качестве контроля активности нуклеазы).
Для очистки частиц ретротранспозона Tv1 от реовирусов препарат внеклеточных ВПЧ фракционировали электрофорезом в агарозном геле. Для идентификации частиц Tv1 использовали различие в чувствительности реовирусов и ретровирусоподобных частиц к органическим растворителям.
Частицы реовирусов устойчивы к воздействию органических растворителей, так как не содержат липидов, а ретровирусы разрушаются даже в присутствии следовых количеств органических растворителей.
На (рис. 7А) представлен результат фракционирования внеклеточных ВПЧ клеточной линии 79fDv3g в нативном агарозном геле. Выявляются три окрашенные полосы, отмеченные на (рис. 7А) тонкими стрелками, которые соответствуют трем формам реовирусных частиц. Локализацию частиц Tvопределяли по гибридизации с (32P) меченой ДНК плазмиды pf7V-59 (рис. 7В).
В выбранных условиях электрофореза частицы Tv1 входят в гель на глубину 1-мм. Как и ожидалось, обработка ВПЧ хлороформом приводит к освобождению ДНК из частиц Tv1 (рис. 7В), но не разрушает частиц реовирусов.
Рис. 7. Фракционирование внеклеточных ВПЧ линии клеток 79f7Dv3g в агарозном геле.
А - гель, окрашенный бромидом этидия. На дорожку нанесены ВПЧ из 20 мл среды: 1 - предварительно обработанные хлороформом; 2 - без обработки. Тонкими стрелками отмечена область локализации реовирусных частиц, толстой стрелкой - Tv1-частиц.
В - Саузерн-блот-перенос ДНК из геля, сфотографированного в секции а, с последующей гибридизацией с (32P) меченой ДНК плазмиды pf7V-59. 1 - ВПЧ, предварительно обработанные хлороформом; 2 - необработанные ВПЧ.
Частицы из соответствующих зон геля, определенных в предварительных экспериментах, переносили на сетки для электронной микроскопии.
Электронно-микроскопические фотографии частиц из области геля, соответствующей Tv1, показаны на (рис. 8А). Частицы имеют сферическую форму, диаметр частицы 757 нм. В центре частицы располагается капсид диаметром 465 нм, толщина оболочки составляет 15 нм. Частицы, выделенные из области геля, соответствующей реовирусам, показаны на (рис. 8В).
Реовирусы имеют внешний диаметр 596 нм, диаметр сердцевины 395 нм, толщину оболочки 10 нм. Частицы реовирусов из клеток D.virilis морфологически сходны с реовирусами из клеток D.melanogaster.
Рис. 8. Внеклеточные ВПЧ культуры клеток 79fDv3g, фракционированные в нейтральном агарозном геле.
А - Tv1-частицы; В - реовирусы.
Фотографии получены на электронном микроскопе "Jem200CX". Увеличение 300 000х.
Идентификация внеклеточных ВПЧ ретротранспозона Tv1 с типичной для ретровирусов морфологией частиц свидетельствует в пользу предположения о инфекционности таких ВПЧ. Вместе с тем, частицы Tv1 отличаются от частиц ретровирусов, так как содержат преимущественно двухцепочечную ДНК, а не РНК, как в случае ретровирусов.
1.6. Трансактивация синтеза ВПЧ Tv1. Так как внехромосомная ДНК-форма Tv1 находится в цитоплазме только в составе частиц, то по количеству этой ДНК можно судить о количестве ВПЧ Tv1. Такой подход позволяет упростить процедуры биохимического анализа и облегчает количественные сравнения.
Препарат ВПЧ, полученный для количественного анализа, содержит еще и митохондрии, что позволяет оценивать количество собранной цитоплазмы по интенсивности флуоресценции полосы митохондриальной ДНК. Полученную ДНК цитоплазмы расщепляли PstI. Данная рестриктаза вносит единственный разрыв в митохондриальную ДНК D.virilis, в результате чего она выглядит на электрофорезе в виде единственной полосы размером около 16 т.п.н., что делает ее удобным количественным маркером. PstI не расщепляет последовательность Tv1. Видимая после гибридизации с радиоактивным зондом Tv1 полоса 7.0 т.п.н. соответствует полноразмерной линейной форме Tv1 из ВПЧ. На (рис. 9), дорожки 1-3, проведено сравнение копийности ВПЧ Tv1 в линиях мух D.virilis. Количество частиц Tv1 в линии Dv160 в несколько раз превосходит их количество в линии Dv9. Гибридные мухи содержат равное с линией Dv9 количество частиц. Межлинейные различия в копийности частиц стабильны и являются свойством линии. На (рис. 9), дорожки 5-7, представлен результат инфекции культивируемых клеток D.virilis частицами, выделенными из взрослых мух. ВПЧ из 0.5 г мух добавляли к 10 мл растущей культуры в объеме 0.5 мл. Через двое суток клетки переносили в свежую среду, и давали расти в обычном режиме, пассируя в соотношении один к трем, раз в неделю.
Процедура инфекции не приводит к видимым признакам шока. Морфология клеток и скорость роста культуры оставались без видимых изменений.
Сравнение копийности частиц Tv1 в цитоплазме культивируемых клеток, напротив, обнаруживает многократное увеличение числа частиц через две недели после инфекции. К пятой неделе роста количество частиц заметно снижается и приближается к уровню контроля. Следует отметить, что наблюдаемая индукция не связана с внесением частиц мух, так как количество частиц в мухах много меньше их количества в клеточной культуре, кроме того, среду с частицами мух удаляли в ходе культивирования клеток и в ходе выделения цитоплазмы. Поэтому наблюдаемая индукция частиц Tv1, несомненно, связана с их образованием в клетках пересеваемой культуры.
Для выяснения вопроса, существуют ли качественные отличия между частицами, выделенными из разных линий мух по способности индуцировать синтез ВПЧ Tv1 в культивируемых клетках, очищенные препараты ВПЧ линий мух: Dv9, Dv160, дисгенных мух F1 и из клеточной культуры, нормализованные по суммарному белку, вносили в растущие клеточные культуры D.virilis.
Только ВПЧ из мух линии Dv160 и дисгенных мух F1 проявили свойство индуцировать образование ВПЧ Tv1в клеточной культуре.
Рис. 9. Межлинейные различия в копийности ВПЧ Tv1 и трансактивация синтеза ВПЧ Tv1 в клетках пересеваемой культуры D.virilis.
А. Фракционирование препаратов цитоплазматической ДНК, расщепленной PstI, в агарозном геле. Гель, окрашен бромидом этидия.
Дорожки 1-3 - линии мух. - Dv9; 2 - Dv160; 3 - Fдисгенные гибриды.
Дорожки 5-7 - пассажи культуры клеток D.virilis 79f7Dv3g (CVi).
инфицированные ВПЧ Dv160. 5 - CVi - второй пассаж после инфекции; 6 - CVi - пятый пассаж после инфекции; 7 - контрольные CVi. Дорожка 4 - маркер молекулярной массы ДНК / HindIII.
Б. Саузерн-блот гибридизация геля, сфотографированного в секции А, с зондом (32P)меченого внутреннего XhoI-фрагмента Tv1.
Миграция фрагментов маркера молекулярной массы HindIII отмечена на полях, размеры фрагментов в т.п.н.
2. Сравнительный анализ митохондриальной изменивости у дрозофил группы virilis.
2.1. Определение нуклеотидной последовательности митохондриального генома D.littoralis. Состав генов и геномная организация.
Митохондриальный геном D.littoralis представляет собой замкнутую кольцевую молекулу длиной 16017 п. н. Он содержит набор из 37 генов, которые обычно присутствуют в митохондриальном геноме животных: 22 гена тРНК, 13 генов, кодирующих белки, и 2 гена рРНК. Кроме того, в геноме есть один большой некодирующий участок, соответствующий контролирующему, или A+T богатому району, расположенному между генами малой субъединицы рРНК и тРНКIle (рис. 10). Порядок генов идентичен таковому у Drosophila yakuba и у других видов дрозофил (Clary & Wolstenholme, 1985).
Между генами есть несколько коротких некодирующих участков. Наибольший из них длиной 45 пн расположен между генами atp6 и cox3. Все гены, кодирующие белки, кроме cox1, имеют правильный инициаторный кодон: либо ATR метионин, либо ATY изолейцин. Семь генов начинаются с ATR: cox2, atp6, cox3, nad4, nad4l, cytb, nad1. Пять генов начинаются с ATY: nad2, atp8, nad3, nad5, nad6.
Недавно, на основн результатов сиквенирования митохондриальных мРНК появились экспериментальные данные ставящие под сомнение ранее принятые представления о начале инициации трансляции генов nad1 и nad5.
Рис. 10. Генетическая карта митохондриального генома D.littoralis (GenBank ID:FJ447340).
Гены, кодирующие белки и рРНК, обозначены стандартными сокращениями. Гены тРНК обозначены в соответствии с однобуквенным кодом. В скобках даны антикодоны. Гены, расположенные на N-нити, подчеркнуты.
мРНК этих генов оказалась длиннее с 5Т конца чем ожидалось. мРНК гена nad1 включает три дополнительных кодона (UUG UUU UAU), соответсвенно трансляция может инициироваться с неканонического кодона UUG для лейцина, мРНК гена nad5 содержит пять дополнительных кодонов (GUG AAA TUT UUA UCU) соответсвенно трансляция может инициироваться с неканонического кодона GUG для валина (Montooth et al. 2009).
Вместе с тем, полученные данные не исключают возможности инициации трансляции этих генов с канонических старт кодонов. У некоторых видов насекомых ген cox1не имеет канонического старт кодона. Открытая рамка считывания гена cox1 у D.littoralis так же начинается с кодона TCG. Шесть генов, nad2, cox1, atp8, atp6, cox3 и nad3, имеют канонические кодоны терминации TAA или TAG. У остальных семи генов кодоны терминации неполные: Т или ТА, и их функциональность, вероятно, восстанавливается постранскрипционно за счет полиаденилирования.
Все 22 гена тРНК, типичные для мтДНК насекомых, идентифицировали по их первичной последовательности, вторичной структуре и антикодону.
Антикодоны тРНК D.littoralis идентичны антикодонам соответствующих тРНК D.yakuba. Все тРНК имеют типичную структуру клеверного листа за исключением тРНКSer(AGN). Данная тРНК имеет простую DHU петлю без стебля. Необычная структура не влияет на функциональность молекулы, т.к.
кодон AGN, узнаваемый данной тРНК, широко используется в митохондриальном геноме D.littoralis для кодирования аминокислот.
Единственный протяжённый некодирующий белки район митохондриального генма дрозофил локализован между геном малой субьединицы рРНК и геном тРНКIle и идентифицирован как контролирующий район (КР), содержащий ориджины репликации и промоторы для обеих нитей митохондриального генма. Контролирующий район D.littoralis имеет длину 1023 п.н. и относится к типу коротких. Короткие КР описаны как у видов дрозофил относяшихся к подроду Drosophila, так и у видов дрозофил подрода Sophophora. Сравнение контролирующих районов D.littoralis и D.virilis показывает наличие консервативных доменов и характерные различия в скорости эволюции между разными областями контролирующего района. В составе КР выявлены две протяжённые полиТ последовательости, необходимые для иницияции репликации мт-ДНК. Одна, вблизи гена тРНКIle, другая, на противоположной цепи ДНК в центральной области КР. В центральной части КР, между поли Т блоками идентифицирована высоко консервативная последовательность длиной 275 п.н. известная как HCSE. Если при сравнении изменчивости КР в паре видов D.littoralis и D.virilis величина (р) дистанции равна 0.150.01 для целых КР, то величина (р) дистанции при сравнении только HCSE в три раза меньше: р=0.050.01 и не превышает изменчивости нуклеотидных последовательностей белок-кодирующих генов этих же видов. В области контрольного района примыкающей к гену 12SрРНК выявлена последовательность из четырёх G, или G остров, предположительно являющийся частью сигнальной последовательности для терминации синтеза N нити мтДНК.
Нуклеотидная изменчивость митохондриальных генов, кодирующих белки, позволяет оценить мутационное давление и давление отбора для индивидуальных генов. Нуклеотидная изменчивость каждого из генов, измерялась как отношение частоты синонимичных (Ks) и несинонимичных (Kn) замен на синонимичный сайт и на несинонимичный сайт соответственно, при сравнении последовательностей D.littoralis и D.virilis (GenBank ID:
BK006340). Соотношение Kn/Ks во всех 13 генах гораздо меньше единицы, что указывает на сильное действие стабилизирующего отбора. Гены nad6, nad3 и nad4L более изменчивы, чем остальные. Наиболее консервативный ген D.littoralis - cox1.
Межгенные спейсерные последовательности - самая изменчивая часть митохондриального генома. Их полиморфизм наблюдается не только между близкородственными видами, но и между расами и внутривидовыми формами.
Самый протяженный спейсер, разделяющий atp6 и cox3, имеет длину 45 пн.
Нуклеотидная последовательность этого спейсера и прилежащих фрагментов генов atp6 и cox3 была определена у девяти видов дрозофил группы virilis. Все проанализированные варианты спейсера могут принимать форму шпильки (рис. 11). Наименьшую длину имеет шпилька D.kanekoi, что позволяет идентифицировать минимальный, или основной элемент шпильки. У остальных видов дрозофил шпильки более длинные за счет добавления нескольких (TA) динуклеотидов, иногда с несколькими точковыми различиями. Шпильки разной длины на стыке atp6 и cox3 характерны только для группы virilis; у других насекомых и дрозофил эти гены расположены встык, без спейсера. Это наблюдение подсказало возможное использование микросателитов (TA)n в митохондриальных геномах дрозофил группы virilis для обнаружения и характеристики митохондриальных псевдогенов.
Рис. 11. Возможная шпилечная структура спейсерной последовательности atp6/coxD.littoralis и изменчивость длины шпильки у девяти видов дрозофил группы virilis. Основной элемент шпильки выделен затемнением. Стоп и старт-кодоны фланкирующих генов показаны жирным шрифтом. Пары нуклеотидов Уотсона-Крика обозначены УЦФ, а GЦT пары обозначены У+Ф.
2.2. Митохондриальная ДНК в ядре. Выявление микросателлитных последовательностей (TA)n в митохондриальных геномах дрозофил группы virilis позволило предположить возможность инсерции ретротранспозона Tv1 в последовательность митохондриальной ДНК или митохондриального псевдогена. Инсерция Tv1 в последовательность (TA)n митохондриального псевдогена пометит его и позволит идентифицировать в геноме с помощью простой методики ПЦР. Для проверки этой гипотезы были разработаны две пары праймеров для ожидаемой последовательности митохондриального псевдогена, содержащего гены atp6/cox3 с инсерциями Tv1 в прямой и обратной ориентациях. In silico ПЦР с использованием этих праймеров и генома D.virilis (UCSC веб-сервер //genome.ucsc.edu/index.html) дал отрицательный результат. Результаты экспериментальной проверки представлены на (рис. 12).
Положительные результаты получены только на ДНК самцов D.virilis.
Клонирование полученных ПЦР-фрагментов и секвенирование отдельных клонов подтвердило их химерную Tv1-митохондриальную природу. Этот результат позволяет картировать митохондриальный псевдоген atp6/cox3 на Y - хромосоме D.virilis. Позитивный сигнал, идентичный таковому у самцов D.virilis, был получен с использованием матрицы геномной ДНК клеточной культуры 79f7Dv3g D.virilis. Отрицательный результат данного ПЦР-теста на ДНК самок D.virilis не исключает возможности существования митохондриального псевдогена atp6/cox3 в их геноме, но не маркированых инсерциями Tv1.
Рис. 12A. - ПЦР-идентификация митохондриального псевдогена atp6 D.virilis, ассоциированного с ретротранспозоном Tv1.
Рис. 12B. - ПЦР-идентификация митохондриального псевдогена cox3 D.virilis, ассоциированного с ретротранспозоном Tv1.
Каждая дорожка показывает результат ПЦР-анализа одной мухи. Черточка указывает локализацию ожидаемого ПЦР-фрагмента. Линии 1, 2 Цсамцы D.littoralis; 3, 4 Цсамки D.littoralis; 5, 6 - самцы D.virilis; 7, 8 - самки D.virilis.
Для точного картирования сайтов интеграции Tv1, последовательности Tvбыли удалены из сиквенсов химерных ПЦР-фрагментов и проведено выравнивание полученных митохондриальных последовательностей с последовательностями митохондриального генома D.virilis. Во всех трех проанализированных случаях Tv1 интегрировался в районе спейсера atp6/cox3, в микросателлитный район сразу после октануклеотида 5Т ATATATAT 3Т Обнаружение пседогенов atp6/cox3 в геноме D.virilis поднимает вопрос о времени их появления и частоте этого процесса. Для ответа на этот вопрос был проведен филогенетический анализ фрагментов генов atp6 и cox3 у дрозофил группы virilis, включая последовательности митохондриальных псевдогенов (рис. 13). Хотя филограммы были построены только на основе сравнительно короткого митохондриального фрагмента, они хорошо согласуются с известной филогенией дрозофил группы virilis (Trockmorton, 1982). Все последовательности псевдогенов кластеризуются с предковыми митохондриальными последовательностями D.virilis, что указывает на их недавнее происхождение. Случай с геном atp6 особенно информативен.
Митохондриальный псевдоген из клеточной культуры более сходен с митохондриальным геном мух, чем митохондриальный псевдоген из той же линии мух. Следовательно, образование митохондриальных псевдогенов - частый процесс, идущий и в настоящее время, по крайней мере в геноме клеточной линии. Этот факт может быть связан с повышенной активностью ретротранспозонов в изучаемой клеточной линии в которой наблюдается 10кратная амплификация Tv1.
Рис. 13. Эволюционные взаимоотношения дрозофил группы virilis, основанные на митохондриальных последовательностях. Дерево минимальной эволюции построено в MEGA4.
A. Филогенетический анализ фрагмента митохондриального гена и митохондриального псевдогена (NUMT) atp6. Использован фрагмент длиной 261 пн, соответствующий позициям 4478-4738 полной последовательности генома D.virilis (GeneBank- BK006340) B. Филогенетический анализ фрагмента митохондриального гена и митохондриального псевдогена (NUMT) cox3. Использован фрагмент длиной 301 пн, соответствующий позициям 4791-5091 полной последовательности генома D.virilis (GeneBank - BK006340) 3. Изучение митохондриальной изменчивости в природных популяциях дрозофил группы virilis. В данном исследовании впервые изучена митохондриальная изменчивость всех видов группы virilis. Изучена она была по трем признакам. HinfI-ПДРФ полиморфизм позволяет с низким разрешением охарактеризовать весь митохондриальный геном. Для увеличения разрешающей способности метода были проанализированы фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и cox1. Филогения группы, построенная по результатам анализа межвидовой митохондриальной изменчивости, соответствует общепринятой классификации Трокмортона (Throckmorton, 1982).
Далее был проведен анализ внутривидовой митохондриальной изменчивости для четырех видов группы: D.virilis, D.montana, D.americana и D.littoralis.
Анализ обнаружил характерные отличия синатропного вида D.virilis от остальных трех видов, образующих природные популяции. Вид D.virilis мономорфен на всем ареале, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью митохондриальных гаплотипов.
Для объяснения наблюдаемых отличий была предложена гипотеза, согласно которой высокая изменчивость видов, образующих природные популяции, объясняется наличием скрытой внутрипопуляционной структуры, образованной несколькими симпатрическими расами. Для проверки этой гипотезы была подробно проанализирована внутрипопуляционная изменчивость у D.americana и D.littoralis.Проведённый анализ позволил выявить расовую структуру локальных популяций D.littoralis,что подтверждает нашу гипотезу.
3.1. ПДРФ-анализ изменчивости мтДНК в группе virilis. Исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) мтДНК одиннадцати видов дрозофил группы virilis проводилось с использованием мелкощепящей рестриктазы HinfI, которая разрезает мтДНК дрозофилы на 9 - 14 фрагментов. На (рис. 14) приведен результат фракционирования HinfI рестрикционных фрагментов митохондриальной ДНК одиннадцати видов дрозофил группы virilis. Каждый вид обладает уникальным набором полос, отличающим его от любого другого по одному или нескольким признакам.
Суммирование размеров фрагментов для каждого вида дает минимальную оценку размеров митохондриального генома. Эта величина оказалась различной у разных видов и колебалась от 15.5 до 17.5 т.п.н., что близко к ожидаемой величине 16 т.п.н. Исключением оказалась D.borealis, у которой размер ДНК митохондрий оказался существенно выше, чем у остальных - 19.т.п.н.
Рис. 14. Межвидовой HinfI-ПДРФ митохондриальной ДНК в группе virilis. Сокращения видовых названий:
D.virilis - Vi; D.amеricana americana - Aa; D.americana texana - At;
D.novamexicana - No; D.lummei - Lu;
клеточная культура D.virilis - CVi;
D.kanekoi - Ka; D.ezoana - Ez;
D.littoralis - Lt; D.borealis - Bo;
D.flavomontana - Fl; D.montana - Mo;
D.lacicola - Lc. Маркер молекулярной массы - двойное расщепление ДНК фага ЕсоRI и HindIII. Длины фрагментов (сверху вниз): 21,226;
5,148; 4,973; 4,268; 3,530; 2,027; 1,904;
1,584; 1,375; 0,947; 0,831; 0,564 т.п.н.
Рассчитаный по числу общих фрагментов индекс генетического сходства между видами (F) (доля общих фрагментов) показывает, что виды филады virilis значительно ближе друг к другу, чем виды филады montana.
Усредненные значения F для внутри- и межфиладных сравнений приведены в (табл. 1). Максимальные значения F соответствуют американской ветви филады virilis (D.a.americana, D.a.texana, D.novamexicana) и составляют в среднем 0,753. Минимальные значения F соответствуют D. kanekoi - 0,121.
Данный вид одинаково удален от обеих филад.
3.2. Изменчивость 3Т- концевого фрагмента гена 16S рРНК в группе virilis.
Нами было проведено секвенирование 3Т-концевого фрагмента гена 16S рРНК длиной 478 нуклеотидов у одиннадцати видов дрозофил группы virilis.
Изучаемый фрагмент соответствует позициям NN 12902-13380 мт-генома D.yakuba (GenBank ID: NC_001322). Значения генетических дистанций (Р) при попарных сравнениях в группе приведены в (табл. 1). Среднее значение (Р) в группе 0,009. Максимальные значения P отмечено у D.kanekoi - 0,087, что указывает на наибольшую дивергенцию этого вида от общего предка. Для определения характера нуклеотидной изменчивости гена 16S рРНК, проведено сопоставление изменчивых сайтов с предполагаемой вторичной структурой 16S рРНК. Для этого, с использованием известных скелетов вторичных структур рРНК большой субчастицы рибосомы других организмов была построена вторичная структура фрагмента 16S рРНК дрозофил группы D.
virilis и выделены функционально значимые структурные элементы.
Нуклеотидных замещений оказалось больше в стеблевых структурах, в то время как открытые петельные области, участвующие в формировании третичной и четвертичной структуры, оказались более консервативными.
Выявлены филогенетически информативные замещения. Замещения 221 Т-A и 366 G-A объединяют кластер D.a.americana, D.a.texana и D.novamexicana;
замещение 140 A-G, объединяет D.montana, D.flavomontana и D.lacicola.
Несмотря на низкую вариабельность изучаемой последовательности, наблюдаются обратные и конвергентные мутации (гомоплазия). Так замещение 140 A-G, характерное для филады montana, должно было произойти независимо у предка D.montana, D.lacicola и D. flavomontana и у филогенетически удаленного от них вида D. ezoana.
3.3. Изменчивость фрагмента гена cox1 в группе virilis. Исследованный фрагмент гена cox1 длиной 630 п.о. находится в первой трети гена и соответствует позициям 57 - 687 гена cox1 D.virilis (GenBank ID: BK006340).
Всего обнаружено 154 полиморфных сайта, из которых 95 являются филогенетически информативными.
Мутации представлены в основном транзициями. Средняя величина генетических расстояний (P) в группе по данному признаку составляет 0,088.
Наименьшее значение - между D.americana и D.novanexicana - 0,003, наибольшее - у D.flavomontana - 0,118. Значения гентических дистанций представлены в (табл. 1). Филогения группы virilis, построенная по данным фрагмента гена cox1, представлена на (рис. 15).
Рис. 15. Филогения группы virilis, построенная по данным изменчивости гена субъединицы 1 цитохром с оксидазы (cox1). Дендрограмма посторена по методу ближайшего соседа (NeighborJoining) с bootstrap-поддержкой - 1000 псевдореплик. В качестве внешней группы используется D.melanogaster (GenBank ID: AF200828).
Несмотря на то, что значения генетических расстояний (Р) в группе по гену cox1 значительно выше, чем по гену 16S рРНК, вероятность повторных замещений, занижающих истинную степень дивергенции, невысока. Об этом свидетельствует значение соотношения транзиций и трансверсий (Ts/Tv), которое внутри группы virilis не опускается ниже единицы (табл. 1). При сравнении D.virilis с представителем другого подрода - D.melanogaster количество трансверсий резко возрастает. Соотношение Ts/Tv - 0,76.
Таблица 1. Характеристика изменчивости мтДНК в группе virilis.
16S рРНК (F) cox(P) (P) Ts/Tv Группа virilis 0,24 0,009 0,088 1,Филада virilis 0,48 0,005 0,038 1,7Филада montana 0,17 0,01 0,089 2,5Филада virilis/montana 0,14 0,009 0,102 1,1Грп. virilis/D.melanogaster - - 0,126 0,(F) - средняя доля общих рестрикционных фрагментов HinfI для набора линий; (P) - средние значения попарных генетических дистанций; Ts/Tv - соотношение транзиций и трансверсий.
Внутривидовая изменчивость мтДНК в дрозофил группы virilis.
Изучен полиморфизм мтДНК у четырех видов дрозофи группы virilis:
D.littoralis, D.americana, D.virilis, D.montana.
3.4. Митохондриальная изменчивость D.littoralis. Данный вид, образует природные популяции в умеренном и субтропическом поясах Евразии от Финляндии до Ирана. Ареал фрагментирован. Всего было проанализировано 255 изосамочных линий D.littoralis из семи географических точек в разных частях ареала. При помощи метода HinfI-ПДРФ в популяциях D.littoralis был выявлен полиморфизм мтДНК. Всего было обнаружено 14 мт-гаплотипов (Рис. 16). Популяция из Ростовской области (РО) (пос. Рыбинский) представлена наибольшей выборкой - 206 линий. Ее генетическая структура складывается из двух мажорных мт-гаплотипов (H1 и H2), имеющих примерно равную численность и 11 минорных, представленных единичными находками.
Генетические структуры популяций Ростовской и Московской (МО) областей сходны. В грузинской популяции одним из доминирующих гаплотипов является Н7. Гаплотип H1 широко распространен и встречается по всему ареалу D.littoralis. Сайты, мутации в которых приводят к взаимным превращениям трех мажорных гаплотипов (Н1, Н2 и Н7), находятся в точках с низким уровнем давления отбора: сайт 15.298 (H1 <-> H2) находится в гипервариабельной области некодирующего АТ-района; сайт 8.582 (H1 <-> H7) - в третьем положении одного из кодонов высокополиморфного гена ND4.
Рис. 16. HinfI-ПДРФ мтДНК D.littoralis и рестрикционная карта митохондриального генома D.littoralis с локализацией специфичных для индивидуальных мт-гаплотипов сайтов HinfI.
Короткие радиальные штрихи обозначают консервативные сайты HinfI; средние - полиморфные сайты HinfI; длинные - сайты HinfI, мутации в которых приводят к взаимным превращениям трех мажорных гаплотипов (Н1, Н2 и Н7).
Следовательно, возможно многократное возникновение этих гаплотипов в истории вида. Из карты рестрикции следует, что полиморфизм распределен неравномерно по длине молекулы. Выделяется две полиморфные области, соответствующие регуляторному АТ-району и блоку полиморфных генов ND - ND6. Для углублённого анализа внутривидовой дифференциации митохондриального генома D.littoralis была охарактеризована нуклеотидная изменчивость фрагмента гена cox1 D.littoralis. Секвенирование и сравнение изменчивости гена cox1 в выборке линий D.littoralis из различных частей ареала выявляет 41 полиморфный сайт. Филогенетический анализ исследованного фрагмента гена cox1 D.littoralis, позволяет выделить южную популяцию, образованную линиями из Закавказья, Ирана и некоторыми линиями из пос. Дивноморское (Краснодарский край). Данный кластер преимущественно состоит из гаплотипа H7. Северная популяция образована линиями из Ростовской и Московской областей, Финляндии, Хакасии и некоторыми линиями из пос. Дивноморское. Численная характеристика нуклеотидной изменчивости гена cox1 D.littoralis представлена в (табл. 2).
Величины генетических дистанций (D) внутри локальных популяций северной группы равны или превышают величину D между локальными популяциями северной группы. Величина (D) между северной и южной популяциями намного выше внутрипопуляционных значений (D), что говорит о дифференциации вида на северную и южную популяции и об отсутствии дифференциации внутри северной группы популяций.
3.5. Парсимониальный нетворк (SNP) мт-гаплотипов D.littoralis.
Парсимониальная сеть митохондриальных гаплотипов, построенная по данным изменчивости фрагмента гена cox1 и HinfI-ПДРФ тотальной мтДНК D.littoralis приведена на (рис. 17).
Рис. 17. Парсимониальная сеть митохондриальных гаплотипов, построенная по данным изменчивости фрагмента гена cox1 и ПДРФ тотальной мтДНК D.littoralis. O - линии мтгаплогруппы Н7, - линии мт-гаплогруппы Н1, - линии мт-гаплогруппы Н2.
Буквы в начале названий линий обозначают место сбора, цифры - год сбора и номер линии.
В конце названия указан митохондриальный HinfI-гаплотип. РО - пос. Рыбинский (Ростовская обл.); МО - пос. Куликово (Московская обл.); DVN - пос. Дивноморское (Краснодарский кр.); лабораторные линии из коллекции лаборатории генетики ИБР РАН даны под номерами: 340, 327, 357 - Грузия, 1971; 360 - Хакасия, 2003; 1013 - Швеция, 1970;
1001.3 - Иран; 1091.0 - Канада Из полученной схемы следует, что предковым является гаплотип H7. Наиболее распространенные в северных популяциях гаплотипы, Н1 и Н2, возникали в истории вида неоднократно. Интересен тот факт, что часть линий из популяции Дивноморского (DVN) попала в кластер южной популяции, другая часть в кластер северной. Это может быть объяснено тем, что между территориями северной и южной популяций пролегает Кавказский хребет, который служит преградой, препятствующей потоку генов между этими популяциями. Однако по побережью возможна миграция, благодаря чему на Черноморском побережье Краснодарского края возникла зона вторичного контакта северной и южной популяций.
3.8. Митохондриальная изменчивость D.americana. По признаку наличия или отсутствия слияния Х-хромосомы с четвёртой хромосомой, вид подразделяется на два подвида. У D.americana americana хромосомы слиты, тогда как у D.americana texana этого слияния нет.
Изменчивость мтДНК D.americana была проанализирована для обеих хромосомных форм D.americana в выборках из природных популяций при помощи HinfI-ПДРФ. В работе использовались 45 изосамочных линий из географических точек. Всего было выявлено 10 митохондриальных HinfI гаплотипов, из которых два - Ha1 и Ha8 встречались у обоих подвидов D.americana. Для выявления возможной дифференциации митохондриального генофонда обеих подвидов D.americana был проанализирован полиморфизм гена cox1 у 23 линий D.americana обеих хромосомных форм с известными HinfI-ПДРФ мт-гаплотипами. Характеристика нуклеотидной изменчивости гена cox1 D.americana приведена в (табл. 2). Было обнаружено полиморфных сайта. Аминокислотных замен не обнаружено. Значения генетических дистанций (D) не выявляют дифференциации популяций D.americana ни по географическому, ни по хромосомному признакам.
Величины (D) внутри каждой хромосомной расы не отличаются от величины (D) между ними. Полученные результаты указывают на единство митохондриального генома вида.
В сравнении с D.littoralis изменчивость мтДНК D.americana имеет некоторые особенности. Различается богатство генетических вариантов и их относительное распределение - выравненность. Значения индекса генетического разнообразия (Н), отражающего эти два параметра для D.littoralis и D.americana составляют 1,71 и 2,65 соответственно. Различия статистически достоверны. Причиной такого различия может быть индивидуальная филогеографическая история видов, в частности Убутылочное горлышкоФ в истории D.littoralis и последующая демографическая экспансия на Северо-Европейской части ареала.
Таблица 2. Характеристика изменчивости мтДНК D.littoralis и D.americana.
(P) Ts/Tv (D) (F) (H) cox1 cox1 coxD.littoralis 0,706 0,013 6,7 - 1,D.litt Сев. - - - 0,007 - D.litt Южн. - - - 0,010 - D.litt Сев./Южн. - - - 0,260 - D.americana 0,62 0,009 3,2 2,D.americana F - - - 0,010 - D.americana U - - - 0,008 - D.americana F/U - - - 0,009 - (F) - средняя доля общих рестрикционных фрагментов HinfI для набора линий; (P) - средние значения попарных генетических дистанций; Ts/Tv - cоотношение транзиций и трансверсий; (D) - внутри- и межпопуляционные генетические дистанции; (H) - генетическое разнообразие (индекс Шеннона). cox1 - фрагмент последовательности гена cox1. D.americana F - хромосомная форма со слиянием 4й и X хромосом (F-fused);
D.americana U - хромосомная форма без слияния 4й и X хромосом (U-unfused 3.7. Митохондриальная изменчивость D.virilis. Единственный синантропный вид группы, D.virilis образует плотные популяции, развиваясь в массе на различных антропогенных субстратах, претерпевая резкие колебания численности. HinfI-ПДРФ мт-ДНК D.virilis из разных географических районов (Рис. 18) обнаруживает крайне низкий уровень внутривидовой изменчивости.
Единственное обнаруженное отличие найдено у мух, собранных на Сейшельских островах. ДНК митохондрий в этой линии содержит один дополнительный HinfI сайт. Возможное объяснение столь низкого полиморфизма этого вида на огромном ареале, состоит в том, что мухи заселили его недавно, распространившись из одной популяции.
3.8. Митохондриальная изменчивость D.montana. Вид широко распространён в северном полушарии и дифференцирован, как минимум, на две популяции, северо-американскую - (D.m.standard) и европейскую (D.m.ovivororum), У D.montana. Выявляется три HinfI-ПДРФ мт-гаплотипа.
Гаплотипы Hm1 и Hm2 характерны для популяций Европы и Восточной Сибири. Hm3 был обнаружен у линий из Северной Америки. Данный мтгаплотип практически совпадает с гаплотипом D.lacicola, обитающего с ним симпатрически, но имеющего ряд экологических отличий. Изменчивость гена cox1 между D.montana и D.lacicola соответствует внутривидовому уровню, характерному для других видов группы virilis (P = 0,019). Полученные данные вместе с данными по скрещиваемости видов D.montana и D.lacicola позволяют предполагать возможность интрогрессивной гибридизации между этими двумя видами на территории Северной Америки.
Рис. 18. HinfI-ПДРФ митохондриальной ДНК D.virilis различного географического происхождения. Обозначения к дорожкам соответствуют номерам линий.
Внутрипопуляционная изменчивость.
3.9. Динамика внутрипопуляционного полиморфизма D.littoralis. ПДРФанализ сборов D.littoralis, проведенных в природной популяции (пос.
Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении десяти лет, выявил стабильное соотношение частот мажорных митохондриальных гаплотипов на фоне ежегодных колебаний численности мух. Минорные гаплотипы представлены единичными находками.
Судя по количеству пойманных самок, численность D.littoralis значительно колеблется в разные годы (Рис. 19). Если бы митохондриальные гаплотипы были эволюционно нейтральными, то резкие колебания численности популяции неизбежно привели бы к изменению частот гаплотипов и даже к полной потере некоторых из них. Так как в популяциях D.littoralis вместо ожидаемой изменчивости имеет место постоянное соотношение частот основных гаплотипов, что позволяет сделать вывод, что либо гаплотипы имеют самостоятельное приспособительное значение, либо маркируют географические расы, образующие зону смешения на исследуемой территории, либо, что более вероятно, служат маркерами нескольких экологических рас, занимающих одну территорию.
Рис. 19. Популяционная динамика митохондриальных гаплотипов природной популяции D.littoralis (пос. Рыбинский, Ростовская обл.
(РО)). Столбцы показывают численность выборок и соотношение мт-гаплотипов на протяжении десяти лет.
Наличие частично репродуктивно изолированных в природе рас можно проверить, определив сопряженность изменчивости митохондриальных и полиморфных ядерных маркеров. Длительное частично изолированное существование должно привести к формированию достоверных отличий по высокоизменчивым ядерным маркерам и, независимо от них, к фиксации различных митохондриальных гаплотипов в пределах расы. Положительная корреляция между определенным митохондриальным гаплотипом и ядерным маркером может послужить доказательством реальности существования рас. В качестве высокополиморфного ядреного маркера использовали аллельные формы длинных концевых повторов (ДКП) ретротранспозона Tv1. На (рис. 20) показан полиморфизм изосамочных линий D.littoralis по аллельным формам ретротранспозона.
Рис. 20. Полиморфизм длин ПЦР-фрагментов ДКП ретротранспозона Tv1.
Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.
Дорожки 2-15 - анализ индивидуальных самок.
Полиморфизм заключается в наличии одной или двух форм ДКП. Клонирование и секвенирование длинной и короткой форм ДКП показало, что полиморфизм вызван делецией внутреннего прямого повтора размером 48 п.о. Вероятно, делеция произошла в результате гомологичной рекомбинации. Интересно, что повтор специфичен для D.littoralis. Та же последовательность в ДКП D.virilis существует в единственной копии. Сопряжение признаков митохондриального гаплотипа и аллельных форм Tv1 показано в (табл. 3). Сравнение наблюдаемых значений таблицы с ожидаемыми в случае независимости митохондриального гаплотипа от числа аллельных форм ДКП Tv1 позволяет отвергнуть гипотезу о независимости этих признаков. Значение критерия 2 = 13,45>{3,84; 6,64; 10,83} при одной степени свободы позволяет отклонить гипотезу о независимости признаков на уровне значимости 0,001.
Следовательно, экологические расы, маркированные митохондриальным гаплотипом, действительно существуют в популяциях D.littoralis.
Таблица 3. Сопряжение признаков митохондриального гаплотипа и аллельных форм Tv1 в выборке изосамочных линий D.littoralis.
1 форма ДКП Tv1 2 формы ДКП Tv1 Мт-гаплотип Н1 15 30 Мт-гаплотип Н2 25 8 40 38 Цифры соответствуют количеству изосамочных линий.
4.1. Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе. Wolbachia pipientis - облигатно-внутриклеточная бактерия, инфицирующая ряд видов членистоногих и филярий. На уровне организма инфекция Wolbachia может вызывать партеногенез, феминизацию генетических самцов, беcсамцовость, цитоплазматическую несовместимость или проходить бессимптомно.
Дополнительный интерес исследованиям придает недавнее открытие возможности переноса ДНК бактерии в геном насекомого-хозяина. На клеточном уровне эффекты, вызываемые Wolbachia, менее изучены.
В данной работе получена новая пересеваемая клеточная линия Drosophila melanogaster - Dm2008Wb1 из эмбрионов инфицированных Wolbachia в природе.
Распространенные клеточные культуры дрозофилы S2, S3, Kc, 67j25D не содержат Wolbachia, что может быть вызвано как случайностью, так и гибелью бактерии в процессе жесткой процедуры стерилизации эмбрионов, использованной при получении этих линий.
Для решения этого вопроса, новая клеточная линия D.melanjgaster была получена с применением более мягкой методики обработки эмбрионов.
Самок линии Черноморка инфицированных Wolbachia в природе скрещивали с самцами линии F32 и из эмбрионов F1 получали клеточную линию. Наличие Wolbachia. Определяли методом ПЦР с праймерами, специфичными к гену wsp. Полученная культура была названа Dm2008Wb1. Морфология клеток культуры имела некоторые особенности (Рис. 21А). Клетки округлые, мелкие, с диаметром около 10 мкм, что вдвое меньше типичного диаметра клеток пересеваемых культур дрозофилы. Они образуют плотные, медленно растущие колонии, крепко прикреплённые к поверхности пластика. В культуре стабильно присутствует Wolbachia.
Полученную культуру использовали как источник для выделения Wolbachia. Метод основан на механическом разрушении клеток стеклянными шарами с последующим отделением Wolbachia от неразрушенных клеток путем фильтрации. Полученные препараты бактерий использовали для заражения клеток S2, не содержащих Wolbachia. Результат представлен на (рис. 21В). Появление специфичной для Wolbachia ПЦР-полосы происходило только в случае обработки клеток S2 живыми бактериями. Внесение термоинактивированных бактерий не вызывало инфекции. Этот результат свидетельствует о наличии живых бактерий в культуре Dm2008Wb1.
Нуклеотидная последовательность специфичных для Wolbachia ПЦР фрагментов из мух и обеих клеточных линий D.melanogaster оказалась идентичной и на 99% совпала с известной последовательностью гена белка внешней оболочки бактерии (wsp) Wolbachia pipientis strain wMel зарегистрированной в GenBank AF338346. Доказательство существования в культуре живых бактерий получено при обработке клеток тетрациклином. На (рис. 21В) видно постепенное исчезновение специфичной для Wolbachia ПЦРполосы в течение 3-х последовательных пассажей при росте на среде с антибиотиком.
Рис. 21.А. монослой клеток Dm2008Wb1. В. ПЦР идентификации бактерий Wolbachia.
Дорожки 1 и 9 - маркёры молекулярной массы. Стрелка отмечает положение диагностической полосы, указывающей на наличие Wolbachia.
Дорожки 2, 3, 4 - последовательные пассажи клеток линии Dm2008Wb1, растущие на среде с добавлением тетрациклина 10 мкг/мл. Дорожка 4 - первый пассаж; 3 - второй пассаж; 2 - третий пассаж. Дорожка 5 - линия мух Черноморка. Дорожка 6 - линия клеток Dm2008Wb1. Дорожка 7 - клетки линии Schneider2. Дорожка 8 - клетки линии Schneiderинфицированные бактериями Wolbachia, выделенными из клеток Dm2008Wb1.
Удобство манипулирования с клеточными культурами и возможность их криогенного хранения делает клеточные культуры надежным банком определенных штаммов Wolbachia, гарантирующим неизменность их свойств в постоянных условиях культуры. Возможность выделить Wolbachia в большом количестве позволяет разрабатывать методы её трансформации плазмидными векторами. Клеточные культуры могут быть полезны и для изучения экспрессионного отклика генома клеток насекомых на инфекцию, что может составить основу для изучения тонких молекулярно-генетических взаимодействий Wolbachia и клеток хозяина.
Выводы:
1. Разработан метод выделения и клонирования функционально активных ретротранспозонов из ВПЧ клеток пересеваемых культур. Данным методом клонировано новое семейство ретротранспозонов D.virilis, названное Tv1, определена его нуклеотидная последовательность. Анализ структуры и экспрессии Tv1 подтвердил его функциональную активность.
Идентифицированы ВПЧ Tv1 и проведено их электронно-микроскопическое описание. Основной формой Tv1 в составе частиц является двуцепочечная ДНК.
2. Перемещения Tv1 обнаружены в клеточной культуре и в геноме мух после дисгенного скрещивания. В отличие от традиционной схемы гибридного дисгенеза, копийность Tv1 в обеих родительских линиях почти одинакова, но в индукторной линии резко повышено количество ВПЧ Tv1. Амплификация Tvв пересеваемой клеточной культуре складывается из увеличения числа хромосомных копий и персистенции внехромосомных линейных и кольцевых форм.
3. Выявлена трансактивация синтеза ВПЧ Tv1 в растущей клеточной культуре D.virilis после инфекции препаратом ВПЧ из мух индукторной линии D.virilis.
4. Определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома D.littoralis и проведен её анализ. В Y хроомосоме D.virilis идентифицированы митохондриальные псевдогены, содержащие инсерции ретротранспозона Tv1. Обнаружен процесс возникновения новых копий митохондриальных псевдогенов в клетках пересеваемой культуры.
5. Сравнительный анализ изменчивости мтДНК в группе virilis выявил существенные различия в популяционной структуре видов, образующих природные популяции (D.littoralis, D.americana, D.montana), и синантропного вида D.virilis. Синантропный вид D.virilis мономорфен, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью нескольких мт-гаплотипов в локальных популяциях.
6. Наблюдения за популяционной динамикой митохондриального полиморфизма в локальной популяции D.littoralis в течение 10 лет выявили равновесные колебания частот двух мажорных мт-гаплотипов на фоне резких колебаний общей численности.
7. Выявлена сопряженность несцепленных ДНК маркёров: аллельных форм ДКП Tv1 и митохондриальных гаплотипов в локальной популяции D.littoralis.
Проведённый анализ позволил выявить подразделенность популяции на две, генетически маркированные расы, обитающие симпатрически.
8. Получена новая пересеваемая клеточная культура Dm2008Wb1 из эмбрионов D.melanogaster, инфицированных в природе Wolbachia pipientis.
Наличие бактерии в клетках в свободной форме подтверждено возможностью излечения культуры от Wolbachia обработкой тетрациклином, а также успешной передачей Wolbachia в другую клеточную линию D.melanogaster - S2, в которой Wolbachia ранее отсутствовала.
Список работ опубликованных по теме диссертации 1. Andrianov B.V., Goryacheva I. I., Mugue N.S., Sorokina S. Yu., Gorelova T.V., Mitrofanov V.G. Comparative analysis of the mitochondrial genomes in Drosophila virilis species group (Diptera: Drosophilidae) // Trends in Evolutionary Biology 2010. V. 2, No 1: e4.
2. Андрианов Б.В., Горячева И.И., Александров И. Д., Горелова Т.В.
Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе // Генетика. 2010. Т.46. №1. С.. 14Ц17.
3. Андрианов Б.В., Сорокина С.Ю., Мюге Н.С., Резник Н.Л., Митрофанов В.Г. Популяционная динамика митохондриального полиморфизма в природной популяции Drosophila littoralis // Генетика. 2008. Т.44. №2. С.195-201.
4. Пантелеев Д.Ю., Горячева И.И., Андрианов Б.В., Резник Н.Л., Лазебный О.Е., Куликов А.М. Эндосимбиотическая бактерия Wolbachia повышает неспецифическую устойчивость к энтомопатогенам и изменяет поведение Drosophila melanogastrer // Генетика. 2007. Т43. №9. С.1277-1280.
5. Пантелеев Д.Ю., Какпаков В.Т., Горелова Т.В., Андрианов Б.В.
Изменчивость клеточных линий насекомых и их идентификация // Цитология.
2006. Т.48. №8. с.653-660.
6. Сорокина С.Ю., Мюге Н.С., Андрианов Б.В., Митрофанов В.Г.
Изменчивость 3Т-концевого фрагмента гена 16S рРНК в группе близкородственных видов дрозофил virilis // Генетика. 2005. Т.41. № 8.
С.1049-1054.
7. Андрианов Б.В., Резник Н.Л., Горелова Т.В., Золотова Л.И.
Ретротранспозон Tv1 образует инфекционные вирусоподоблные частицы в некоторых линиях мух Drosophila virilis //Докл. Акад. наук. 2005. Т.400. № 5.
С.697-700.
8. Андрианов Б.В. Индуцированная ретротранспозиция // Успехи современной биологии. 2005. Т.125. № 1. С.78-90.
9. Андрианов Б.В., Резник Н.Л., Ларина О.Н. Перспективы изучения индуцированной генетической нестабильности в условиях космического полета // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2005. т.39. № 3. с.3-9.
10. Б.В.Андрианов, С.Ю.Сорокина, Т.В.Горелова, В.Г.Митрофанов.
Полиморфизм митохондриальной ДНК природных популяций дрозофил группы virilis // Генетика. 2003. Т.39. № 6. С.762-768.
11. В.Г.Митрофанов, С.Ю.Сорокина, Б.В.Андрианов. Изменчивость митохондриального генома в эволюции Drosophila // Генетика. 2002. Т.38. № 8.
С.1063-1077.
12. Andrianov B.V., Zakharyev V.M., Reznik N.L., Gorelova T.V., Evgen'ev M.V.
Gypsy group retrotransposon Tv1 from Drosophila virilis // GENE 1999. V.239.
P.193-199.
13. Золотова Л.И., Андрианов Б.В., Горелова Т.В., Клицунова Н.В., Резник Н.Л., Шуппе Н.Г. Полиморфизм вирусоподобных частиц ретротранспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей // Генетика. 1996. Т.32. №.11. С.1528-1535.
14. Андрианов Б.В., Золотова Л.И., Горелова Т.В., Клицунова Н.В., Шуппе Н.Г. Идентификация и ультраструктурная характеристика вирусоподобных частиц ретротранспозона Tv1 в клетках D.virilis // Доклады Академии наук.
1994. Т.339. №.1. С.127-129.
15. Андрианов Б.В., Шуппе Н.Г., Tv1 - новое семейство ретротранспозонов Drosophila virilis // Генетика. 1994. Т.30. № 4. С.437-446.