Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ДЖЕТЫБАЕВ ИЛЬЯС ЕРКИНОВИЧ
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПУТЕЙ И МЕХАНИЗМОВ КАРИОТИПИЧЕСКОЙ ЭВОЛЮЦИИ САРАНЧОВЫХ ПОДСЕМЕЙСТВА GOMPHOCERINAE (ORTHOPTERA, ACRIDIDAE)
03.02.07 - Генетика 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2012
Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Федерального бюджетного государственного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск.
Научные руководители: Рубцов Николай Борисович, доктор биологических наук, профессор.
Бугров Александр Геннадьевич, доктор биологических наук, доцент,
Официальные оппоненты: Жданова Наталья Сергеевна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник.
Федеральное бюджетное государственное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН Гусаченко Анна Михайловна кандидат биологических наук, доцент кафедры цитологии и генетики НГУ.
Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования УНовосибирский национальный исследовательский государственный университетФ, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования УНациональный исследовательский Томский государственный университетФ, г. Томск
Защита диссертации состоится л___ ____________ 20___ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан л___ _____________ 20___ г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Саранчовые широко распространены в Голарктике и представляют одну из наиболее богатых по видовому разнообразию таксономических групп в отряде прямокрылых насекомых (Uvarov, 1966; Otte, 1981). Сочетание высокой стабильности кариотипов с интенсивными процессами дивергенции видов делает саранчовых уникальной модельной группой для изучения молекулярных механизмов эволюционных процессов. Базовый тип хромосомного набора у представителей этого семейства представлен 23 акроцентрическими хромосомами у самца и акроцентрическими хромосомами у самки при хромосомном определении пола Х0/ХХ (2n=22+Х0/22+ХХ). Этот вариант хромосомного набора характерен для большинства видов семейства Acrididae, однако в подсемействе Gomphocerinae описано большое количество видов, в кариотип которых включает 3 пары крупных метацентрических хромосом. Остальные хромосомы, в том числе Х-хромосома, - акроцентрики разной длины (2n=16+X0/16+XX) (Cabrero, Camacho, 1986; Бугров и др., 1991). Предполагается, что такой тип хромосомного набора является производным от исходного 23-хромосомного предкового кариотипа в результате трех центрических слияний (Robertson, 1916; White, 1973). Об этом может свидетельствовать наличие в подсемействе видов с 23 хромосомами (Santos et al., 1983; Cabrero, Camacho, 1986;
Бугров и др., 1991), а также видов с промежуточным числом хромосом - Chorthippus hammarstroemi (2n=20+Х0/ХХ) и Eremippus sobolevi (2n=18+Х0/ХХ) (Бугров и др., 1993). Считается, что эволюция кариотипов саранчовых проходила с уменьшением числа хромосом за счет робертсоновских слияний (White, 1973; Hewitt, 1979), поэтому можно предположить, что подсемейство Gomphocerinae является кариотипически наиболее продвинутым таксоном в семействе Acrididae.
Несмотря на богатую историю сравнительных кариологических исследований саранчовых, возможности линейной дифференциации хромосом саранчовых практически отсуствовали. Длительное время цитогенетики были ограничены методами рутинного и C-дифференциального окрашивания хромосом, что затрудняло выяснение путей и механизмов кариотипической эволюции саранчовых. До сих пор стоит вопрос, является ли наблюдаемая стабильность кариотипов следствием малого количества изменений в геноме группы, либо она является результатом ограниченных возможностей использованных методов.
Другой отличительной особенностью саранчовых является то, что они обладают самыми большими по размеру геномами среди насекомых. Размер геномов саранчовых варьирует от 6000 до 20000 миллионов пар нуклеотидов (Bensasson et al., 2001).
Большинство работ по изучению организации геномов эукариот было выполнено на видах с геномами небольших или средних размеров. Хромосомная организация крупных геномов остается слабо изученной. Основная часть генома эукариот представлена повторенными последовательностями ДНК. Состав и распределение повторенных последовательностей в геномах саранчовых остаются практически неизученными. Одним из типов повторенных последовательностей являются кластерированные повторы, которые образуют С-позитивные блоки и играют значительную роль в структурно-функциональной организации генома. Как было показано ранее, эти блоки проявляют высокую внутри- и межвидовую изменчивость по размеру и локализации, однако у саранчовых данных по молекулярному составу этих блоков и темпам их изменчивости крайне мало.
Методы молекулярной цитогенетики позволяют решать вопросы, связанные с эволюционной трансформацией хромосомных наборов. Эти методы успешно применяются в исследованиях ряда таксонов позвоночных (Ferguson-Smith, Trifonov, 2007), растений (Schubert et al., 2001) и насекомых (Panzera et al., 2010). Они были частично адаптированы и использованы также для исследований хромосом саранчовых (Lopez-Leon et al., 1995, 1999; Lopez-Fernandes et al., 2004; Cabrero et al., 1997; Cabrero et al., 2003а,b; Bugrov et al., 2003, 2004, 2007). Однако их применение ограничивалось лишь небольшим набором видов и последовательностей ДНК. Большинство видов подсемейства Gomphocerinae остались за рамками этих исследований. Анализ локализации молекулярно-цитогенетических маркеров в хромосомах саранчовых подсемейства Gomphocerinae позволило по-новому взглянуть на вопросы кариотипической эволюции не только в пределах этого таксона, но и всего семейства настоящих саранчовых (Acrididae) в целом. Изучение молекулярной композиции Спозитивных блоков у саранчовых подсемейства Gomphocerinae представляет собой значительный вклад в понимание организации и эволюции геномов саранчовых и позволило лучше понять общие принципы организации больших по размеру геномов эукариот.
Цель настоящего исследования: описать распределение повторенных последовательностей ДНК в хромосомах видов подсемейства Gomphocerinae и оценить их возможную роль в кариотипической эволюции саранчовых.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Дать детальное описание кариотипов видов подсемейства Gomphocerinae, используя С-дифференциальное окрашивание митотических хромосом из эмбриональных клеток изучаемых видов.
2. Провести сравнительный анализ локализации кластеров повторенных последовательностей гомологичных рибосомальной и теломерной ДНК в хромосомах ряда видов подсемейства Gomphocerinae.
3. Провести оценку уровня гомологии ДНК С-позитивных районов близких видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae.
Научная новизна. Впервые описаны особенности локализации С-позитивных блоков в митотических хромосомах 15 видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae.
Впервые определена локализация кластеров рибосомных и теломерных повторов в митотических хромосомах 13 ранее не изученных видов саранчовых.
Впервые было показано наличие субблоков, различающихся обогащенностью различными повторенными последовательностями ДНК, в прицентромерных Спозитивных блоках хромосом S. scalaris и A. sibiricus.
Практическая ценность. Полученные данные являются весомым вкладом в изучение кариотипического разнообразия видов саранчовых и дают новую информацию об организации их геномов. Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе.
Полученные ДНК-библиотеки будут служить основой для дальнейшего изучения повторенных последовательностей, локализующихся в прицентромерных районах разных видов, что позволит лучше понять механизмы эволюционных процессов.
Положения, выносимые на защиту.
Крупные прицентромерные С-позитивные блоки хромосом саранчовых могут состоят из субблоков, отличающихся по молекулярному составу. Различия в размере и комбинации таких субблоков обуславливают хромосомо-специфичную организацию прицентромерных районов хромосом близких видов саранчовых Наличие интерстициальных теломерных сайтов не характерно для саранчовых подсемейства Gomphocerinae Апробация. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:
Международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2005, 2007; XII съезд Русского энтомологического общества, Краснодар, 2007; Отчетная конференция, посвященная памяти академика Ю.П.
Алтухова, Москва, 2008; 17th International Chromosome Conference 2009. Boone, 2009;
Международная конференция KARYO V, Новосибирск, 2010; 18th International Chromosome Conference 2011, Manchester, 2011.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов.
ичный вклад автора. Вся работа была выполнена автором самостоятельно либо при его непосредственном участии. Помощь в проведении FISH и приготовлении микродиссекционных ДНК зондов оказывали Карамышева Т.В. и Рубцов Н.Б.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список использованной литературы (168 источников). Работа изложена на 122 страницах, содержит 8 рисунков и 3 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Самцы и самки 15 видов саранчовых были отловлены в полевые сезоны 2006-20на территории Российской Федерации и Республики Казахстан.
Приготовление препаратов, проведение С-дифференциальной окраски хромосом и флуоресцентной гибридизации in situ. Препараты хромосом были приготовлены по методике, описанной в статье Бугрова с соавторами (Bugrov et al., 2003). С-дифференциальную окраску проводили в соответствии с классическим протоколом Самнера (Sumner, 1972). Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) проводилась по стандартной методике, (Rubtsov et al., 2000, 2002). В качестве зонда для выявления кластеров рибосомных генов были использованы фрагмент гена 18s рДНК человека, клонированный в плазмиде pHr13 (Malygin, 1992), и фрагменты гена 18s rDNA саранчовых, амплифицированные в ПЦР со специфичными праймерами (табл. 1).
Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных для амплификации фрагментов рибосомных генов.
Название Последовательность Размер продукта 18S-1f 5'-ATGGTTCCTTAGATCGTACCC-3' 741 п.н.
18S-1r 5'-TTGTCAAAGTAAACGTGC-3' 18S-2f 5'-GCATGGAATAATGGAATAGGAC-3' 667 п.н.
18S-2r 5'-AGAACATCTAAGGGCATCAC-3' 18S-3f 5'-TGATAGCTCTTTCTTGATTCGG-3' 506 п.н.
18S-3r 5'-AGTTTGGTCATCTTTCCGGT-3' 28S-2f 5'-TGGAGCAATTTCACGACCCGTC-3' 600 п.н 28S-2r 5'-GCGTTTGGTTCATCCCACAG-3' 28S-3f 5'-TGAACCAAACGCCGAGTTAAGG-3' 650 п.н 28S-3r 5'-ATTCCAGGGAACTCGAACGCTC-3' 28S-4f 5'-TTCTGCATGAGCGTTCGAGTTC-3' 700 п.н.
28S-4r 5'-TGGGCAGAAATCACATTGCGTC-3' В качестве зонда, для выявления теломерных повторов использовался продукт нематричной ПЦР с праймерами 5-TAACCTAACCTAACCTAACC-3 и 5TTAGGTTAGGTTAGGTTAGG-3,(Ijdo et al., 1991; Sahara et al., 1999).
Получение микродиссекционных ДНК-проб. Приготовление микродиссекционных ДНК-проб проводилось по стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Амплификация библиотек проводилась в ПЦР с частично вырожденным праймером 6MW (Telenius et al., 1992) в два этапа. На первом этапе проводили 8 низкотемпературных циклов с ферментом Sequenase Version 2.0.
После чего проводили 33 высокотемпературных цикла с AmpliTaq Stoffel Fragment ДНК полимеразой (Rubtsov et al., 2000).
Мечение проводили введением в ДНК дигоксигенина,или биотина в дополнительных циклах ПЦР. Детекция ДНК-проб осуществлялась с помощью овечьих антител к дигоксигенину, конъюгированных с родамином, и авидина, конъюгированного с FITC. Общая окраска ДНК осуществлялась красителем DAPI.
Микроскопический анализ. Результаты С-дифференциальной окраски анализировались на микроскопе Axioplan 2 Plus (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой AxioCam HRcr (Carl Zeiss, Германия) и программой AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Результаты FISH визуализировали с помощью люминесцентного микроскопа Axioplan 2 Plus (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой (CV M300, JAI) и пакетом обработки изображений ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика кариотипов и особенности локализации С-позитивных блоков. У исследованных видов было обнаружено 4 типа хромосомных наборов:
2n=14+neo-Xneo-Y/neo-XneoX, 2n=16+X0/XX, 2n=20+X0/XX и 2n=22+X0/XX. У 23-хромосомных видов кариотип состоял из акроцентрических хромосом: 2 пары крупных хромосом (L1, L2), 6 пар хромосом среднего размерного класса (M3-M8) 3 пары мелких хромосом (S9-S11) и Х-хромосомы - самой крупной из хромосом среднего размерного класса. Остальные хромосомные наборы представляли собой результат одной, трех или четырех центрических слияний. Использование митотических хромосом из эмбрионов саранчовых позволило выявить более тонкую организацию гетерохроматиновых блоков. Для видов Omocestus viridulus, Mesasippus kozhevnikovi, Stauroderus scalaris, Chorthippus jacobsoni, Chorthippus intermedius, Chorthippus hammarshtroemi, Chorthippus albomarginatus были выявлены интеркалярные блоки, которые ранее не были описаны при анализе мейотических хромосом (Santos et al., 1983; Gosalvez et al., 1997; Cabrero, Camacho, 1986; Бугров и др., 1991).
Результаты С-дифференциальной окраски представлены в таблице 2.
Выявленные С-позитивные районы относились к трем типам. Первый тип - прицентромерный гетерохроматин. Они присутствует у всех видов, но их размеры варьируются от очень небольшого, как у Podismopsis altaica, до большого, например, очень крупные блоки, составляющие почти треть хромосомы у S. scalais (Рис. 1 а, б).
Крупные гетерохроматиновые блоки могут содержать в себе небольшие участки Снегативного материала. Это было показано для Aeropus sibiricus (Рис. 1 в) и M.
kozhevnikovi, Однако не все крупные С-позитивные блоки содержат С-негативный материал. Примером таких блоков являются крупные С-позитивные районы S.scalaris (Рис. 1 б).
Второй тип - интеркалярные С-позитивные районы. Они наблюдались как в двуплечих, так и в акроцентрических хромосомах. Как видно из таблицы 2, в двуплечих хромосомах они чаще всего локализовались в проксимальной части хромосом L2 и L3.
В акроцентрических хромосомах интерстициальные С-позитивные блоки обычно располагались в середине хромосомы либо в ее проксимальной части. В большинстве случаев в одной хромосоме наблюдался один интеркалярный С-позитивный блок, и только у Chorthippus karatavicus и Ch. hammarstroemi было больше одного блока (Рис. г, д). У A. sibiricus и M. kozevnikovi в хромосомах на ранней стадии конденсации прицентромерные блоки состоят из набора мелких блоков, отделенных узкими Снегативными участками (Рис. 1 в), что может быть объяснено тем, что в зависимости от степени конденсации хромосом интеркалярные гетерохроматиновые блоки могут сливаться с прицентромерными в один более крупный прицентромерный, что лучше видно на митотических хромосомах.
Третий тип - теломерный гетерохроматин был обнаружен только у 5 видов. В хромосомах видов с кариотипом 2n=16+X0/XX блоки локализовались Рисунок 1. С-дифференциальная окраска метафазных хромосом саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Цифрами указаны номера хромосом. а - P. altaica,. б - S. scalaris, стрелкой указан полиморфный С-позитивный блок. в - прометафазные хромосомы A. sibiricus, стрелки указывают на Снегативные блоки внутри прицентромерных С-позитивных блоков. г - Ch. karatavicus, большие черные стрелки указывают на полиморфный С-позитивный блок, большие серые стрелки указывают на теломерные С-позитивные блоки на субметацентрической хромосоме, стрелки указывают на интеркалярные С-позитивные блоки. д - Ch. hammarstroemmi, стрелками указаны интеркалярные Спозитивные блоки. e ЦM. kozhevnikovi, стрелкой указаны хромосомы с полиморфным теломерным Спозитивным блоком. ё - S. eurasius, стрелокой указаны половые хромосомы. ж - Ch. albomarginatus cтрелки указывают на интеркалярные С-позитивные блоки, большие стрелки указывают на теломерные С-позитивные блоки. з - A. fusca.
преимущественно в акроцентрических хромосомах. Только у Ch. karatavicus теломерные С-позитивные блоки были обнаружены в коротком плече двуплечей хромосомы L3 (Рис. 1 г). Часто теломерные C-позитивные блоки в коротких хромосомах являлись полиморфными (Табл. 1).
Таким образом, на материале митотических хромосом из эмбрионов саранчовых удалось не только выявить те же гетерохроматиновые блоки, которые выявляются на мейотических хромосомах, но и получить дополнительную информацию о мелких и располагающихся рядом друг с другом С-позитивных блоках.
Таблица 2. Локализация С-позитивных районов, кластеров теломерных повторов и рибосомной ДНК в хромосомах саранчовых подсемейства Gomphocerinae.
C-позитивные блоки Трибы FISH Виды NF 2n SD Cen Int Tel Telomeric DNA 18s rDNA Gomphocerini Aeropus sibiricus 23 17 Х0 1-8, X - - All ter; int 6 Cen 1-8, X Arcypterini Arcyptera fusca 23 23 Х0 1-11, X 3, 5, 11* 2, 5-10 All ter Int 3, Gomphocerini Chorthippus albomarginatus 23 17 Х0 1-8, X 1q*, 2p, 3p**, 5 5, 8 All ter Int 2р, 3p* Gomphocerini Chorthippus apricarius 23 17 Х0 1-8, X 2p, 3p** - All ter Int 2р, 3p* Gomphocerini Chorthippus biguttulus 23 17 X0 1-8, X 2p, 3p, 4, 5 7,8 All ter Int 2р, 3p*; cenX Gomphocerini Chorthippus hammarstroemi 23 21 Х0 1-10, X 1p, 5, X 9 All ter Int 1p, Gomphocerini Chorthippus intermedius 23 17 X0 1-8,X 2p, 3p, 4 - All ter Int 2р, 3p*; cenX Gomphocerini Chorthippus jacobsoni 23 17 Х0 1-8, X 2p, 3p* - All ter; cen (1, 2, 3) Int 2р,3p Gomphocerini Chorthippus karatavicus 23 17 Х0 1-8, X 4, 5, 6, X 3p, 4-8, 7* All ter Cen 2р, tel 3p Gomphocerini Gomphocerippus rufus 23 17 X0 1-8, X 2,3**,5 7,8 All ter Int 2; cen 2, 3, X, 4, Gomphocerini Mesasippus kozhevnikovi 23 23 Х0 1-11, X 5, 6 11 All ter Int 5, Stenobothrini Omocestus viridulus 23 17 Х0 1-8, X 3p, 1q - All ter Int 3q Chrysochroantini Podismopsis altaica 23 17 Х0 1-8, X 5 - All ter Int 2р, 3q, Gomphocerini Stauroderus scalaris 23 17 Х0 1-8, X 1q* - All ter Cen 1-8, X, int 3p** Stenobothrini Stenobothrus eurasius 23 16 ХY 1-7, X, Y 3p - - All ter Cen X NF - число хромосомных плеч, 2n - число хромосом, S.D. - система определения пола, Cen - прицентромерный, Int-интеркалярный, Tel - теломерный, Ter - терминальный; 1-11 - номера хромосом, р - короткое плечо хромосомы, q - длинное плечо хромосомы, * - обнаружено не у всех особей, ** - размеры различаются между особями,- - не обнаружено.
окализация рибосомной ДНК. Результаты локализации кластеров рибосомной ДНК (рДНК) представлены в таблице 2. Сравнительный анализ распределения районов локализации рДНК у саранчовых показал, что в трибе Gomphocerini было выявлено 2 типа локализации рДНК: первый тип - проксимальный интеркалярный гетерохроматин субметацентрических хромосом L2, L3 у 17хромосомных видов и реже прицентромерный гетерохроматин Х-хромосомы (Рис. 2 г);
второй тип локализации - прицентромерный гетерохроматин всех хромосом (Рис. 2 а, в). В трибе Gomphocerini большое число видов имеют кариотип 2n=16+X0/XX, однако также имеются виды с кариотипами 2n=22+X0/XX, 2n=20+X0/XX и 2n=18+X0/XX. Среди изученных видов у Ch. hammarstroemmi (Рис. 2 е) и M.
kozhevnikovi (Рис. 2 д) хромосомные наборы состояли из 21 и 23 хромосом, соответственно, и у них было выявлено по два сайта локализации рДНК. У 23хромосомного M. kozhevnikovi кластеры рДНК локализованы в интеркалярных гетерохроматиновых блоках акроцентрических хромосом среднего размера. У 21хромосомного Ch. hammarstroemi один кластер рДНК был локализован в проксимальном С-позитивном блоке акроцентрической хромосомы среднего размера, а второй в проксимальном интеркалярном С-позитивном блоке короткого плеча субметацентрической хромосомы. У 17-хромосомных видов рДНК локализуется в коротких плечах двуплечих хромосом.
Таким образом, в трибе Gomphocerini рибосомные кластеры, вероятно, маркируют гомеологичные хромосомы, которые участвовали в робертсоновских слияниях, сформировавших 17-хромосомный кариотип. У Ch. intermedius (Рис. 2 ё) и Ch. karatavicus места локализации кластеров рДНК находились в гомеологичных плечах метацентрических хромосом, но у Ch. intermedius кластеры рДНК помимо интеркалярного С-позитивного блока в хромосоме L2 локализовались и в прицентромерных С-позитивных районах хромосом L2 и L3. У Ch. karatavicus один из кластеров рДНК присутствовал в прицентромерном C-позитивном блоке хромосомы L2, а второй - в теломерном С-позитивном блоке хромосомы L3. Возможно, у данных видов произошла парацентрическая инверсия, которая переместила кластер рДНК в новое место.
Второй тип локализации рДНК, который наблюдался у A. sibiricus (Рис. 2 а) и S.
scalaris (Рис. 2 в), вероятно, является производным от первого, о чем может свидетельствовать наличие рДНК в некоторых прицентромерных районах хромосом Gomphocerippus rufus (Рис. 2 б). Можно предположить, что кариотип G. rufus, представляет собой переходный между кариотипами видов с первым типом распределения и вторым типом распределения рДНК. Скорей всего, существует больше видов со вторым типом распределения рДНК.
Несмотря на большое число выявленных мест локализации рДНК, активных ЯОР у этих видов было обнаружено от 1 до 3. Лопез-Леон с соавторами (Lopez-Leon et al.,1999) отмечают, что в геноме S. scalaris присутствует огромное количество Рисунок 2 Флуоресцентная гибридизация in situ 18S рДНК-пробы (зеленый) и теломерной ДНК-пробы (красный) с метафазными хромосомами (синий) саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Буквами и цирами обозначены размерный класс и номера хромосом. а - Aeropus sibiricus, б - Gomphocerippus rufus, в - Stauroderus scalaris, г - Chorthippus jacobsoni, д - Mezasippus kozhevnikovi, е - Chorthippus hammarshtroemi, ё - Chorthippus intermedius, ж - Aeropus sibiricus. Стрелками указана локализация теломерный повторов в хромосоме M6, з - Chorthippus jacobsoni. Стрелками указано положение рибосомной ДНК в хромосоме L2, головками стрелок указано положение центромеры.
неактивных рибосомных генов. Испанские исследователи в цитированной выше работе предполагают, что выявленные кластеры рибосомных повторов в хромосомах S. scalaris являются молчащими копиями генов. Однако с уверенностью говорить о том, что это целые гены нельзя. Можно предположить, что обилие рДНК объясняется присутствием нефункционирующих фрагментов рибосомных генов.
окализация рДНК часто сильно отличается у разных видов, что свидетельствует о высокой мобильности указанных кластеров в ходе кариотипической эволюции. Одним из перемещающих механизмов могут являться хромосомные структурные перестройки, такие как инверсии, транслокации, слияния и разделения хромосом. В данном случае кластеры рДНК представляют собой хорошие молекулярные маркеры, позволяющие выявить пути преобразования кариотипов в ходе эволюционного процесса. Однако в некоторых случаях кластеры рДНК изменяют свою локализацию без видимых структурных изменений кариотипов. Есть несколько точек зрения на подобную мобильность кластеров рДНК. Одна из них - активность мобильных элементов, которые при транспозиции переносят либо копии рибосомных генов, либо фрагменты этих генов в новое место. Согласно другой гипотезе копии рибосомных генов сами обладают потенциалом к транспозициям (Schubert, 1984;
Schubert, Wobus, 1985). При любом варианте транспозиции рДНК не может быть использована в качестве адекватного маркера хромосомных перестроек, поэтому для сравнительных цитогенетических исследований необходимо использовать дополнительные молекулярные маркеры.
окализация теломерных повторов. ITS могут служить хорошими молекулярными маркерами реорганизации хромосом, так как часто они находятся в горячих точках хромосомных перестроек. У изученных видов основным местом локализации теломерных повторов являлись концы хромосом (Табл. 2, Рис. 2). Уровень полиморфизма по количеству теломерных повторов в терминальных районах хромосом внутри вида очень высок и не позволяет оценить характерные для отдельных плеч размеры кластеров этих повторов.
ITS ранее были описаны у 11 видов саранчовых, из которых 7 принадлежало подсемейству Gomphocerinae (Lopez-Fernandez et al., 2004). В настоящей работе были изучены два вида - A. fusca и S. scalaris, для которых в цитированной работе были обнаружены ITS. Локализация теломерных повторов у остальных видов ранее не изучалась. Несмотря на то, что у A. fusca и S. scalaris испанскими исследователями были обнаружены ITS, нам не удалось их обнаружить в хромосомах особей наших популяций. У всех исследованных в данной работе видов кластеры теломерных повторов были выявлены на концах всех хромосом. Различия в результатах между данной работой и работой испанских коллег могут быть вызваны несколькими причинами. Во-первых, ITS, описанные ранее, могут являться специфичными для испанских популяций. Во-вторых, может существовать гетерогенность по размеру ITS.
Количество теломерных повторов в ITS хромосомах изученных популяций могло быть недостаточным для выявления этих последовательностей с помощью FISH. В-третьих, распластанные препараты митотических хромосом отличаются от давленых препаратов мейотических хромосом. При раздавливании материал семенников образует относительно толстый слой, и хромосомы часто лежат в окружении постороннего материала, который может являться источником неспецифического сигнала при FISH.
Из всех изученных видов ITS были выявлены только у двух видов. У A. sibiricus выявленный кластер локализовался в середине M6 хромосомы (Рис. 2 ж). Кластер присутствовал у части исследованных образцов. У гетерозиготных особей гибридизационный сигнал на конце длинного плеча хромосомы, несущей интерстициальный кластер, был слабее, чем на гомологе, не несущем этот кластер.
Данный ITS, скорее всего, является результатом парацентрической инверсии в Мхромосоме A. sibiricus, которая перенесла часть кластера теломерных повторов в середину хромосомы. Другим видом, у которого были обнаружены ITS, является эндемик гор северного Тянь-Шаня Ch. jacobsoni (Рис. 2 г). Эти теломерные повторы присутствуют во всем С-позитивном материале прицентромерных блоков двуплечих хромосом, однако удельная интенсивность флуоресцентного сигнала в этих блоках ниже, чем в терминальных районах. Можно предположить, что слияние предковых хромосом произошло с сохранением ITS, затем в ходе эволюции молекулярной композиции прицентромерных С-позитивных блоков двуплечих аутосом произошло перемешивание теломерных повторов с другими типами повторенных последовательностей. У других видов с 17 хромосомами теломерных повторов в прицентромерном районе двуплечих хромосом обнаружено не было. С одной стороны, слияния хромосом в указанных видах могли идти с потерей теломерных повторов, с другой стороны, теломерные повторы могли быть элиминированы в процессе эволюции.
У вида Ch. jacobsini была обнаружена перестроенная хромосома L2 в гетерозиготном состоянии. Из 41 исследованного эмбриона данная перестройка была обнаружена только у одного. Перестроенная хромосома является субметацентрической, в то время как исходная хромосома - метацентрическая. Общая длина перестроенной хромосомы меньше длины исходной хромосомы примерно на 7% (Рис. 2 з). Кластер рДНК находится в ее длинном плече, тогда как в не перестроенном гомологе - он локализован в коротком.
Таким образом, использованные в данной работе молекулярные маркеры позволили установить гомеологичные хромосомы, участвовавшие в робертсоновских слияниях, которые сформировали 17-хромосомный кариотип. Благодаря использованию этих маркеров, удалось получить свидетельства происходящих в кариотипах саранчовых хромосомных перестроек и предположить, что парацентрические инверсии являются не редким событием в кариотипической эволюции саранчовых. Однако для подтверждения этой гипотезы необходимо привлечь дополнительные маркеры, такие как, эволюционно консервативные гены гистоновых белков, 5S рРНК или анонимные клонированные последовательности.
Распределение повторенных последовательностей из прицентромерных Спозитивных районов хромосом саранчовых. Состав ДНК прицентромерных Спозитивных районов у саранчовых сильно различается даже между таксономически близкими видами. Приготовленная из прицентромерного района аутосомы Ch.
apricarius микродиссекционная ДНК-библиотека (CAP-cen ДНК-библиотека) гибридизовалась с прицентромерными районами всех хромосом этого вида (Рис. 3 а).
Однако при гибридизации in situ пробы с хромосомами близких видов - Ch.
albomarginatus, Ch. karatavicus и S. scalaris флуоресцентный сигнал выявлялся в Рисунок 3. Флуоресцентная гибридизация CAP-cen ДНК-пробы c хромосомами близких видов: а - Ch. apricarius; б - S. scalaris; в - Сh. albomarginatus; г - Сh. karatavicus.
эухроматине, в то время как С-позитивные районы, в том числе и непосредственно прицентромерные районы, оставались не мечеными (Рис. 3 б-г). При кроссгибридизации С-негативный материал давал гораздо более сильный сигнал, чем Спозитивный, из-за обилия диспергированных повторов в эухроматиновых районах, которые, по-видимому, более эволюционно консервативны, чем повторенные последовательности С-позитивных блоков. Не исключено, что в С-позитивных районах имеются гомологичные последовательности, но количество этих последовательностей недостаточно, чтобы быть обнаруженными с помощью FISH.
Особенной оказалась организация очень крупных С-позитивных блоков. При гибридизации ДНК-библиотеки, полученной из Х-хромосомы A. sibiricus, (ASI-X ДНКбиблиотека) с хромосомами A. sibiricus флуоресцентный сигнал наблюдался в периферических частях прицентромерных С-позитивных районов всех акроцентрических хромосом и в дистальной части прицентромерного блока короткого Рисунок 4. Гибридизация микродиссекционных ДНК-библиотек из прицентромерных районов Ххромосом. а - A. sibiricus, зеленый - ASI-X ДНК-библиотека, красный - теломерная ДНК-проба. б ЦA.
sibiricus, зеленый - 18s рДНК-проба, красный - ASI-X ДНК-проба. в - S. scalaris, зеленый - 18s рДНКпроба, красный - SSC-X ДНК-проба.
плеча субметацентрической хромосомы L3 (Рис. 4 а). Гибридизационный сигнал наблюдался и в интерстициальных районах X, M4 и в коротком плече хромосом L2.Слабый сигнал наблюдался и в терминальных районах длинного плеча хромосом L1, M4, M6 и Х. Фоновый флуоресцентный сигнал наблюдался во всех эухроматиновых районах. Несмотря на то, что в хромосомах L1 и L2 имеются крупные прицентромерные С-позитивые блоки, гомологии с ASI-X ДНК-пробой обнаружено не было. При совместной гибридизации 18S рДНК-пробы и ASI-X ДНК-пробы с хромосомами A. sibiricus часть прицентромерного блока, не дававшая гибридизационного сигнала с ASI-X ДНК-пробой гибридизовалась с 18S рДНК-пробой (Рис. 4 б).
Микродиссекционная ДНК-библиотека SSC-X, полученная из прицентромерного С-позитивного блока S. scalaris, давала гибридизационный сигнал по всей длине всех хромосом, но в районах прицентромерного гетерохроматина сигнал был значительно сильнее. При совместной гибридизации SSC-X ДНК-пробы и 18s рДНК-пробы было показано, что большая часть сигнала от микродиссекционной ДНК-пробы колокализуется с рибосомной ДНК в центральной части гетерохроматиновых блоков всех хромосом (Рис. 4 в). Однако сигнал от микродиссекционной пробы наблюдался и в периферических частях гетерохроматиновых блоков, не несущих рибосомные повторы.
Были обнаружены части С-позитивных блоков, в которых не были выявлены последовательности гомологичные последовательностям из использованных ДНКбиблиотек. Наличие интенсивных сигналов в терминальном районе короткого плеча хромосомы L2, в дистальных терминальных районах хромосом M5 и M6 и в дистальной части хромосомы M6 свидетельствует о присутствии в эухроматине крупных кластеров повторенных последовательностей, гомологичных последовательностям из SSC-X ДНК-библиотеки. Кроме кластеров повторенных последовательностей в эухроматиновой части хромосом присутствовали диспергированные повторенные последовательности.
Крупные гетерохроматиновые блоки не являются гомогенными по молекулярному составу. Например, у A. sibiricus прицентромерный гетерохроматин состоит из трех зон: зоны рДНК, зоны повторенных последовательностей гетерохроматина и промежуточной зоны, где происходит взаимное проникновение этих двух типов повторов. Как было показано на хромосомах других видов, в прицентромерных районах новые повторы при амплификации смещают старые на периферию гетерохроматинового блока (Heinkoff, 2002). Возможно, встроившиеся в прицентромерный район повторы рДНК в результате активной амплификации сместили на периферию блока повторы, населявшие эти районы до инсерции повторов рДНК. Отсутствие в хромосомах L1, L2 повторов, гомологичных повторам из микродиссекционной ДНК-пробы говорит о том, что в метацентрических и акроцентрических хромосомах эволюция прицентромерных повторов идет по-разному.
Вероятно, в результате слияния прицентромерный гетерохроматин эволюционировал независимо от прицентромерного гетерохроматина акроцентрических хромосом.
Амплификация рДНК и различных повторенных последовательностей в С-позитивном районе двуплечих хромосом сопровождалась элиминацией повторенных последовательностей, гомологичных последовательностям из акроцентрических хромосом, что привело к вытеснению этих повторов. Другим механизмом дивергенции состава прицентромерных блоков могла быть амплификация новых повторенных последовательностей в акроцентрических хромосомах. Выявленный в прицентромерном районе хромосомы L3 район, содержащий повторенные последовательности, характерные для акроцентрических хромосом, свидетельствует о том, что слияние предковых хромосом, давших хромосому L3, произошло позднее.
Стоит отметить, что некоторые типы повторов, присутствующие в прицентромерном Спозитивном блоке, также кластеризуются в С-негативных районах хромосом. К сожалению, пока не ясно, что представляют собой эти повторы. Это могут быть как мобильные элементы, так и сателлитные повторы. Дальнейшее секвенирование ДНК,микродиссекционной ДНК библиотеки -,позволит выяснить природу этих повторов.
Молекулярный состав прицентромерных С-позитивных блоков сильно различается у близких видов. Более того, молекулярный состав С-позитивных районов разных хромосом в кариотипе одного вида может также сильно различаться, что свидетельствует о быстрой эволюции прицентромерного гетерохроматина. Не исключено, что такая дивергенция гетерохроматиновых районов могла стать причиной репродуктивной изоляции видов на раннем этапе видообразования.
ВЫВОДЫ 1. На высоком уровне разрешения описано распределение С-позитивных блоков в митотических хромосомах из нейробластов эмбрионов. Выявлена внутренняя ранее не известная организация С-позитивных районов в кариотипе ряда видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Показано, что прицентромерные С-позитивные блоки A.
sibiricus и M. kozhevnikovi состоят из более мелких С-позитивных блоков, разделенных узкими участками С-негативного хроматина. Впервые были выявлены и описаны короткие эухроматиновые плечи Х-хромосом у P. poppiusi и Ch. hammarshtroemi.
2. У всех исследованных видов кластеры теломерных пентамеров (ТТАGG)n локализуются в терминальных районах хромосом. Наличие ITS не характерно для изученных видов. ITS, обнаруженный в акроцентрической M6 хромосоме A. sibiricus, вероятно, является результатом парацентрической инверсии.
3. Выявлены два типа распределения кластеров рДНК в хромосомах саранчовых трибы Gomphocerini. Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов.
4. Даже у близких видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae прицентромерные С-позитивные блоки сильно различаются по молекулярному составу, что свидетельствует о высокой скорости эволюции ДНК этих районов. Показано, что прицентромерные гетерохроматиновые блоки, гомогенные при С-дифференциальном окрашивании, могут состоять из нескольких субблоков, обогащенных различными повторенными последовательностями ДНК.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Джетыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Кросс-гибридизация повторенных последовательностей ДНК прицентромерного гетерохроматина Chorthippus apricarius (L.) с хромосомами саранчовых трибы Gomphocerini. // Евразиатский энтомологический журнал, 2010, Т. 9, №3 стр. 433-42. Дзюбенко В.В., Бугров А.Г., Джетыбаев И.Е., Рубцов Н.Б. Добавочные хромосомы как маркёры формирования популяционной структуры плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans Charpantier, 1825 (Orthoptera, Acrididae) //Евразиатский энтомологический журнал, 2010, Т. 9, №3 стр. 437-43. Jetybayev I.E., Bugrov A.G., Karamysheva T.V., Camacho J.P.M., Rubtsov N.B.
Chromosomal localization of ribosomal and telomeric DNA provides new insights on the evolution of Gomphocerinae grasshoppers // Cytogenetic and genome research, 20(DOI:10.1159/000341571) 4. Джетыбаев И.Е. Цитогенетические особенности популяции бурого конька Chorthippus apricarius (L.) (Orthoptera, Acrididae) из Южного Казахстана // Материалы Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс": Биология. - Новосибирск, Новосибирский госуниверситет, 2005. - С. 19.
5. Бугров А.Г., Джетыбаев И.Е., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б. Молекулярная композиция С-позитивных районов хромосом саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae) // Проблемы и перспективы общей энтомологии. Тезисы докладов XII съезда Русского энтомологического общества.
Краснодар, 9-15 сентября 2007 года. - Краснодар, 2007 - С. 42-43.
6. Бугров А.Г., Карамышева Т.В., Джетыбаев И.Е., Дзюбенко В.В., Рубцов Н. Б.
Происхождение, эволюция и распространение в популяциях саранчовых повторенных и дуплицированных последовательностей ДНК // Программа фундаментальных исследований РАН №11 Биоразнообразие и динамика генофондов. Материалы отчётной конференции, посвященной памяти академика Ю.П. Алтухова. - Москва, 2008. - С. 100-101.
7. Jetybayev I., Bugrov A., Karamysheva T., Rubtsov N., Comparative analysis of localization of rDNA clusters an telomeric repeats (TTAGG)n in C-positive and Cnegative chromosome regions of Gomphocerinae grasshoppers (Acrididae; Orthoptera) // Chromosome research (2009) 17:533-577. Materials of 17th International Chromosome Conference 208. Джетыбаев И.Е., Карамышева Т.В., Дзюбенко В.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б.
Возможности и ограничения молекулярно-цитогенетических методов в исследовании хромосом саранчовых // Тезисы международной конференции KARYO V, Новосибирск, 209. Джетыбаев И. Е., Лосева Е.М., Морозкин Е.С., Лактионов П.П., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Гибридизация in situ и LA-PCR - новый метод получениея микродиссекционных ДНК-проб хромосом саранчовых //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2010. Джетыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярные маркеры в сравнительной цитогенетике саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Acridida, Orthoptera) //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2011. Jetybayev I.E., Bugrov A.G., Belavin P.A., Tatkov S.I., Shvalov A.N. Rubtsov N.B.
Comparison of molecular composition of pericentric heterochromatin of two grasshopper species from Gomphocerini tribe (Acrididae; Orthoptera) // Materials of 18th International Chromosome Conference 2011, Manchester UK.