Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА _____________________________________________________________________________ На правах рукописи
CИЛЕЦКИЙ Сергей Алексеевич
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ЦИТОХРОМ с ОКСИДАЗОЙ
03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич доктор биологических наук Андреев Игорь Михайлович доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.
Защита состоится У15Ф октября 2012 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ
Автореферат разослан У У 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Работа посвящена выяснению молекулярного механизма преобразования энергии, осуществляемого в мембранных ферментах электронтранспортных цепей митохондрий, бактерий и хлоропластов. В процессе дыхания энергия окислительно-восстановительных реакций трансформируется электрон-транспортной цепью митохондрий и многих бактерий в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране (H+). Возникающая таким образом протондвижущая сила служит в клетке источником энергии в реакциях биохимического синтеза, мембранного транспорта, механического движения бактериальных клеток и т.д. В концевом участке дыхательных цепей аэробных организмов образование протондвижущей силы обеспечивается в результате работы терминальных оксидаз, катализирующих восстановление кислорода цитохромом c или хинолом. Основная подгруппа этих ферментов, включающая цитохромоксидазу (ЦО) из митохондрий, образует суперсемейство структурно-родственных гем-медных оксидаз. Отличительной особенностью представителей суперсемейства является каталитический центр, который образован близко расположенными ионом железа гемовой группы а3 и ионом меди CuB (т.н. биядерный или бинуклеарный центр, BNC), и в котором непосредственно происходит восстановление молекулы кислорода с образованием двух молекул воды.
В ходе каталитического цикла, сопряженно с химической реакцией, ЦО образует H+ в результате двух процессов. Во-первых, электроны поступают в BNC ЦО от цитохрома с с внешней стороны мембраны (P-сторона), в то время как участвующие в восстановлении кислорода и образовании молекул воды протоны (т.н. УсубстратныеФ или УхимическиеФ протоны) переносятся в BNC из внутренней водной фазы (N-сторона). Вовторых, цитохромоксидаза является редокс-зависимым протонным насосом и дополнительно переносит с N-стороны на P-сторону мембраны в среднем четыре протона (т.н. УпомпируемыеФ протоны) на каждую восстановленную молекулу кислорода.
Таким образом, цитохромоксидаза представляет собой сложную и уникальную в своем роде молекулярную машину, осуществляющую сопряжение одноэлектронного окисления цитохрома с, 4-х электронного восстановления и протонирования молекулы кислорода с образованием воды и редокс-зависимого направленного трансмембранного переноса протонов. Сочетание этих процессов требует сложной организации и точной взаимной артикуляции перемещения зарядов (электронов и протонов) и превращения молекулы кислорода в ходе каталитического цикла. Отдельные одноэлектронные этапы восстановления кислорода в каталитическом цикле цитохромоксидазы сопряжены с набором частных реакций переноса электрона между редокс-центрами фермента и транслокации протонов в нем, происходящих в недоступном для быстрого смешивания временном диапазоне и потому практически неизученных с временным разрешением.
В последние годы для ряда цитохромоксидаз была получена трехмерная кристаллическая структура с атомным разрешением, что в сочетании с возможностями направленного мутагенеза и кинетических методов с необходимым временным разрешением предоставляет уникальную возможность для изучения механизма сопряжения энергии и внутрибелкового переноса протонов в данном ферментном комплексе. Выяснение молекулярного механизма редокс-сопряженного разделения зарядов в ЦО, динамики и траекторий внутрибелкового переноса протонов являются одними из наиболее важных и сложных задач биэнергетики, а также необходимой предпосылкой для установления общих закономерностей механизмов образования трансмембранного потенциала ферментами энерго-сопрягающих мембран.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выяснение молекулярного механизма сопряженного трансмембранного переноса зарядов (электронов и протонов) в цитохромоксидазе. Ставилась задача описать механику векторного переноса зарядов в цитохромоксидазе, разрешив во времени частные стадии электрогенного переноса электронов и протонов, составляющие суть отдельных одноэлектронных переходов в каталитическом цикле. Выяснить точную стехиометрию переноса помпируемых протонов в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла цитохромоксидаз.
Требовалось установить сопряженные электрон-транспортные стадии и конформационные изменения, контролирующие частные стадии транслокации протонов. Выявить внешние факторы, способные влиять на динамику проведения протонов в ЦО. Ставилась задача выяснить роль протон-проводящих путей в отдельных одноэлектронных переходах в каталитическом цикле ЦО. Локализовать траектории проведения протонов в цитохромоксидазе и выявить взаимную артикуляцию частных электрон и протонтранспортных реакций внутри отдельного одноэлектронного перехода фермента. Выяснить точную структуру каталитических интермедиатов ЦО, включая промежуточную локализацию протонов в кислород-редуктазном центре и в его окрестности. Выяснить структурно-функциональные особенности неканонических цитохромокосидаз, обусловливающие сниженную эффективность трансмембранной перекачки протонов.
Научная новизна работы. Впервые показано, что перенос на кислород 3 и 4 электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы митохондрий (переходы PF и FO, соответственно) сопряжен с суммарным электрогенным переносом равного количества зарядов через мембрану. Впервые показано, что фотоиндуцированный электрондонорными комплексами рутения переход PF цитохромоксидазы митохондрий включает две миллисекундные (УсредняяФ и УмедленнаяФ) компоненты генерации мембранного потенциала, отражающие электрогенный перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а биядерным центром фермента.
Впервые показано, что в фотоиндуцированных одноэлектронных переходах PF и FO цитохромоксидазы митохондрий, половина суммарной величины электрогенного перемещения протонов образуется в УсреднейФ электрогенной фазе синхронно с редоксреакцией переноса электрона от гема а в BNC (с 0.3 мс и 1 мс, соответственно).
Другая часть электрогенного переноса протонов в переходах PF и FO происходит в УмедленнойФ электрогенной фазе (с 1.8 мс и 4.5 мс, соответственно), засчет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в метастабильном состоянии фермента.
Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала прокариотической цитохромоксидазой aa3-типа из Rhodobacter sphaeroides. Показано сходство общей организации разрешенных стадий внутрибелкового электрогенного переноса зарядов представителями гем-медных терминальных оксидаз семейства А (митохондриальной цитохромоксидазой и цитохромоксидазой аа3 из R.sphaeroides).
Впервые показано, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидазы aa3-типа из R.sphaeroides происходит через протон-проводящие D и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы. Впервые показано, что протонный D-канал обслуживает перенос помпируемых протонов, а также перенос субстратных протонов в окислительной полуреакции каталитического цикла (стадии PF, FO), в то время как K-канал участвует в переносе субстратных протонов в восстановительной полуреакции (при переносе в BNC первых двух электронов в каталитическом цикле).
Впервые показано, что FO переход ЦО c мутацией N139D, характеризующейся ингибированием протон-помпирующей функции, сопряжен с суммарной транслокацией через мембрану одного элементарного заряда. Дополнительный вклад электрогенного переноса протонов в ЦО дикого типа из R. sphaeroides и ЦО митохондрий соответствует трансмембранному переносу не более одного (~0.9) помпируемого протон в каждом из переходов PF и FO окислительной фазы каталитического цикла.
Впервые показано, что в УсреднейФ электрогенной фазе в переходе FO происходит перенос помпируемого протона к внешней стороне мембраны, в то время как УмедленнаяФ электрогенная фаза связана с переносом субстратного протона из внутренней водной фазы к BNC. Впервые показано, что ионы цинка, ингибирующее стадии переноса протонов в ряде мембранных белков, тормозят УмедленнуюФ электрогенную фазу переноса протона при добавлении к протеолипосомам с ЦО с внешней стороны мембраны.
Предложена модель организации двухстадийного электрогенного переноса протонов в переходе FO каталитического цикла цитохромоксидаз семейства А. Первая стадия включает в себя перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы через консервативный остаток глутамата E286 в верхней части D-канала к промежуточному акцептору протона над биядерным центром. Вторая стадия включает в себя высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.
Впервые разрешены интермедиаты каталитического цикла представителя семейства B гем-медных терминальных оксидаз (цитохромоксидазы ba3 из Thermus thermophilus) в быстрой реакции с кислородом в режиме одного оборота. Выявлено отличие оксидаз семейств А и B в локализации внутреннего акцептора протона в кинетическом интермедиате, соответствующем состоянию F. В цитохромоксидазах семейства А перенос субстратного протона происходит непосредственно в биядерный центр (к связанному с CuB гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе ba3 акцептор протона локализован вне биядерного центра.
Впервые показано, что причиной сниженной усредненной эффективности протонного насоса ba3 ЦО из T. thermophilus является отсутствие сопряженного трансмембранного переноса протона в ряде одноэлектронных стадий каталитического цикла. В тоже время другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом 1 протона также, как в цитохромоксидазах семейства А.
Установлено, что при восстановлении низкоспинового гема b каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.
Практическая значимость исследования. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон-транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров.
Материалы работы используются в учебном процессе на факультет Биоинженерии и Биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике.
Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 9-ой, 12-ой, 14-ой, 15-ой и 16-й Европейских Биоэнергетических конференциях - EBEC (Лувен-лаНев, 1996; Аркашон, 2002; Москва, 2006; Дублин, 2008; Варшава, 2010), на 2-ом и 7-ом Европейском Биофизическом конгрессе (Орлеан, 1997; Генуя, 2009), на 26-м съезде Федерации Европейских биохимических обществ - FEBS (Ницца, 1999), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов - IUBMB (Бирмингем, 2000), Европейской конференции по спектоскопии биологических молекул ECSBM (Сегед, 2003), конференция УРоссийская биоэнергетика: от молекул к клеткеФ (Москва, 2005), на 8-й Европейской конференции по Биологической химии Eurobic 8 (Авиеро, Португалия, 2006), на V съезде Российского фотобиологического общества Международная конференция УПреобразование энергии света при фотосинтезеФ (Пущино, 2008), а также на ряде Гордоновских конференциях по биоэнергетике. Работа была также апробирована на теоретическом семинаре отделов биоэнергетики и молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ. Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых, премии Европейской академии для молодых ученых СНГ, премии им.
А.Д.Каулена за лучшую работу молодых ученых МГУ НИИФХБ, премии Биохимического общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 15 статей в рецензируемых журналах и 15 тезисов конференций.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 180 страниц, рисунков, 3 таблицы. В работе использовано около 290 литературных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Изоляция митохондриальной цитохромоксидазы. Цитохромоксидазу изолировали из митохондрий бычьей сердечной мышцы по методике [Fowler et al., 1962;
MacLennan & Tzagoloff, 1965].
Штаммы бактерий. Использовался штамм бактерий Rhodobacter sphaeroides (JS100), несущий делецию в гене cta D, кодирующем субьединицу I цитохромоксидазы.
Клетки данного штамма содержат плазмиду (pRK-415) с геном cta D, модифицированным добавлением последовательности из шести остатков гистидина [Mitchell and Gennis, 1995].
В результате С-конец субьединицы I цитохромоксидазы несет полигистиновую последовательность, что позволяет изолировать ЦО из мембран в одну стадию с помощью аффинной хроматографии (Ni-NTA агароза).
Выращивание клеток и получение мембран. Выращивание клеток штамма R.sphaeroides (JS100) проводилось аэробно, на модифицированной среде Систрем при 30C, как описано в [Hosler et al. 1992, Shaleigh et al. 1992]. В среде присутствовали антибиотики: стрептомицин (50 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл), канамицин (мкг/мл) или тетрациклин (1 мкг/мл). Собранные клетки ресуспендировали в 50 мМ Tрис (pH 8.0), и разрушали с помощью пресса Френча (в присутствии 50 мкг/мл ДНКазы 1).
Остатки клеток удаляли центрифугированием (30000 g, 30 минут).
Изоляция ЦО aa3Цтипа R.sphaeroides. Препарат мембран гомогенизировали в 1мМ KH2PO4 (pH 8.0) и инкубировали 30 минут (при 4С) в присутствии додецилмальтозида (1%) и PMSF (ингибитор протеаз) в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После центрифугирования (75000g, 35 минут, 4 С), к супернатанту добавляли 10 мМ имидазол и Ni-NTA сефароза (Quiagen). После инкубации (60 минут, С) смесь наносили на хроматогрфическую колонку и промывали 10-15 объемами буфера (50 мМ KH2PO4, pH=8.0, 10-15 мM имидазола, 0.1% мальтозида). Цитохромоксидазу элюировали (~ 0.1 мл/мин) буфером с ~120 мM имидазола. Избыток имидазола удаляли гельфильтрацией по [Fry et al., 1978]. Препарат очищенного белка концентрировали до концентрации 50-100 мкМ с помощью фильтров Amicon.
Определение активности ЦО aa3Цтипа R.sphaeroides. Активность ЦО из R.sphaeroides определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ KH2PO4 буфере (pH=6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25 С.
Цитохромоксидаза ba3 из T.thermophilus была очищена согласно [Soulimane T. et al., 2002]. Дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку cys-102 трис бипиридил-рутениевым комплексом был предоставлен Ф.Миллетом (Арканзасский университет, Файетвилль, Арканзас, США).
Встраивание цитохромоксидазы в протеолипосомы. Для встраивания цитохромоксидазы в протеолипосомы использовались два метода [Racker, 1972; Rigaud et al., 1995]. Суспензию азолектина (40-60мг/мл) в 2% растворе холата натрия в буфере (мМ Hepes либо KH2PO4, pH=7.5, 2мM MgSO4), озвученную в присутствии аргона в ледяной бане до просветления с помощью ультразвукового дезинтегратора (0.4А, 22 кГц), смешивали с ЦО до концентрации 4-6 мкМ [Racker, 1972] либо 6-9 мкМ [Rigaud et al., 1995]. Для удаления детергента cогласно [Racker, 1972], суспензию диализовали два раза по 3 часа против 200 объемов и, в течение ночи, против 500 объемов буфера без детергентов. После диализа липосомы осаждали центрифугированием (Ti-50, 480об/мин, 4C, 1 час). Ресуспендированный осадок протеолипосом использовали для приклеивания к плоской мембране. Для удаления детергента по методу [Rigaud et al., 1995], к суспензии протеолипосом вносили гранулы SM2 Bio-Bads (УBio-RadФ, 30 мг гранул сырого веса/мл) при постоянном перемешивании в течении 6 часов с интервалом 0.5-1 час, согласно [Verkhovskaya et al. 1997, Jasaitis et al. 1999]. Содержащую протеолипосомы жидкую фазу отделяли от гранул Bio-Beds, разделяли на порции и замораживали в жидком азоте.
Электрометрические измерения. Быструю кинетику образования разности потенциалов цитохромоксидазой на мембране протеолипосом регистрировали методом емкостной потенциометрии (УпрямойФ метод) с разрешением 100 нс [Drachev et al., 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах ЦО из митохондрий и бактерий [Zaslavsky, et al., 1993, Siletsky et al., 1996, Verkhovsky et al., 1997, Siletsky et al.,1999]. На отверстие диаметром 4 мм, разделяющее 2 отсека тефлоновой ячейки наносили коллодиевую пленку, смоченную в растворе фосфолипида в декане (99% лецитин, мг/мл; стеариламина, 1 мг/мл). В один из отсеков ячейки, заполненной буфером (10 мМ HEPES-KOH, рН 7.4), вносили протеолипосмы с ЦО и инкубировали 3-5 часов при перемешивании в присутствии 30 мМ MgSO4. Разность потенциалов между отсеками регистрировали при помощи светозащищенных Ag/AgCl электродов после замены буфера в отсеках на среду измерений (5 мМ Трис/ацетат, рН 8.1, 10 мМ анилин). Сигнал поступал в операционный усилитель (Burr-Brown) и затем через аналого-цифровой преобразователь фирмы (DATALAB, England или Datascope) в компьютер.
Для одноэлектронной инъекции в субмикросекундном временном диапазоне использовалось фотовосстановление цитохромоксидазы комплексом трис(2,2Тбипиридил)рутений(II)хлорид (Rubpy) [Nillson 1992]. Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (NdYAG; 532 нм, 15 нс, 40-100 мДж). В условиях низкой ионной силы, возбужденный Rubpy(II)* восстанавливает входной редокс-центр ЦО, CuA, в субмикросекундной временной шкале. Окисленный Rubpy(III) ревосстанавливался анилином. Для перевода фермента в соединение P, через липосомный отсек электрометрической ячейки в течение 1 минуты продували окись углерода [Nicholls and Chanady, 1981]. Для субмикросекундной инициации быстрой реакции окисления молекулярным кислородом восстановленной цитохромоксидазы в режиме одного оборота использовался метод Уфлоу-флэшФ [Gibson et al., 1963]. При анаэробной инкубации в присутствии окиси углерода цитохромоксидаза образует комплекс гема а32+-CO. Кислород вносится в систему с помощью быстрого смешивания, чтобы недопустить спонтанного вытеснения кислородом окиси углерода. Оксидазная реакция запускается фотолизом комплекса гем а32+-CO (NdYAG; 532 нм, 15 нс, 40 мДж), в результате чего молекула кислорода связывается с гемом а3 и восстанавливается электронами, присутствующими в ферменте в режиме одного оборота.
Разрешенные во времени спектрофотометрические измерения при одиночной длине волны. Быстрая кинетика спектральных изменений гемовых центров ЦО в ответ на инъекцию электрона с помощью Rubpy регистрировалась методом Уфлэш-фотолизаФ.
Световой поток от галогеновой лампы (70-100 вт) попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм. Пройдя через помещенный в микрокювету (33 мм либо 44 мм) образец, световой поток поступал через призменный монохроматор в ФЭУ. После аналого-цифрового преобразования (DATALAB, England; Datascope) сигнал заводился на компьютер.
Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (YAG Quantel, 4и Spectraphysics; 532 нм, 15 нс, 40-300 мДж). Возбуждающий свет подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света, перпендикулярно последнему. Для уменьшения ионной силы перед измерением c Rubpy препарат изолированной цитохромоксидазы переводили в деионизованный буфер с помощью гельфильтрации [Fry et al., 1978]. В некоторых случаях, вместо Rubpy, использовалось производное двухядерного рутениевого комплекса Ru2C [Siletsky et al. 2006], характеризующийся более высокой эффективностью фотовозбуждения.
Регистрация спектральных изменений ЦО c микросекундным временным разрешением. Для регистрации многостадийных кинетик переноса электронов в ЦО в ходе превращений каталитического центра использовался спектрофотометр на базе CCD (ПЗС) матрицы (DV420-UV-FK, Andor Technology, Северная Ирландия), позволяющий проводить регистрацию спектров с разрешением 1-16 мкс в течение нескольких миллисекунд после начала реакции. В случае измерения быстрой кинетики окисления ЦО кислородом в режиме одного оборота, предвосстановленный и уравновешенный с окисью углерода фермент смешивался с помощью приставки стоп-флоу (DX.17MV Applied Photophysics, Великобритания) в соотношении объемов 1:5 с буфером, насыщенном кислородом. Для инициации реакции в субмикросекундном временном диапазоне CO фотодиссоциировали из комплекса с гемом а3 коротким импульсом (YAG; 15 нс, 532 нм, ~100 мДж), спустя 5 мс после начала смешивания (чтобы предотвратить спонтанное вытеснение CO кислородом).
Обработка данных. Для обработки данных использовались программы Discrete [Provencher, 1976], Origin (OriginLab Corporation, США), GIM (Grafic Interactive Managment, НИИФХБ МГУ), MatLab (MathWorks Inc., США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd., Англия). Для разложения кинетических кривых генерации мембранного потенциала на индивидуальные экспоненты использовался алгоритм программ Discrete [Provencher, 1976] и Origin. В случае кинетической модели последовательных реакций, истинные амплитуды электрогенных стадий связаны с наблюдаемыми амплитудами алгебраическими выражениями [Medvedev et al., 2005; Siletsky et al., 2006]. Истинные значения амплитуд генерации потенциала V1 и V2 могут быть вычислены из измеряемых экспериментально амплитуд, V obs, и констант скоростей, k1,k2, с помощью системы уравнений:
kV1 = V1,obs + V2,obs k(k1 - k2 ) V2 = V2,obs (1) k РЕЗУЛЬТАТЫ КИНЕТИКА ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА, СОПРЯЖЕННАЯ С ОДНОЭЛЕКТРОННЫМИ ПЕРЕХОДАМИ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - разрешить отдельные стадии электрогенного переноса электронов и протонов в ходе одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы.
Цитохромоксидаза митохондрий содержит четыре редокс-центра. CuA располагается вблизи места взаимодействия ЦО с цитохромом с на внешней (P) стороне мембраны. Низкоспиновый гем а и биядерный каталитический центр, состоящий из высокоспинового железа гема a3 и иона меди (CuB), располагаются в гидрофобном ядре белка на сходном расстоянии от поверхности мембраны.
В каталитическом цикле цитохромоксидазы выделяют две части.
Восстановительная часть включает в себя перенос от цитохрома с в окисленный биядерный центр ЦО (состояние О) 1-го и 2-го электрона с образованием состояния R (схема 1). В окислительной фазе молекула кислорода связывается с восстановленным BNC и расщепляется, принимая одновременно 4 электрона от гема а3, CuB и входящего в состав активного каталитического центра ЦО остатка тирозина Y288, образующего ковалентную связь со связанным с CuB остатком гистидина. Возникшие 2 электронные вакансии заполняются в каталитическом центре ЦО переносом 3-го и 4-го электронов, переводя ЦО последовательно из состояния P в F и из F в окисленное состояние (O).
Схема O 1-й, 2-й e> R > А > P 3-й e> F 4-й e> O a33+ а32+ a32+-O2 a34+=O2-Tyr* a34+=O2- a33+-OH- На схеме изображены состояния гема а3, в комплексе с которым происходят редокс-превращения кислорода. Tyr* -радикал редокс-активного остатка тирозина Активируемый с помощью короткой лазерной вспышки (532 нм, ~10 нс) комплекс трис(бипиридил)рутения (Rubpy) может быть использован для фотоиндуцированного переноса электрона в белки в субмикросекундной временной шкале [Sutin et al., 1978;
Geren et al., 2009]. В случае природного субстрата цитохромоксидазной реакции, цитохрома с, ковалентно модифицированного Rubpy по периферическим остаткам на поверхности белка, в ответ на фотоактивацию наблюдается восстановление окисленного гема цитохрома с [Geren et al., 1991; Pan et al., 1990]. Электрогенная составляющая быстрой кинетики перераспределения электронной плотности от гема цитохрома с внутрь встроенной в протеолипосомы ЦО и сопряженного с редокс-реакцией переноса протонов может быть зарегистрирована с помощью УпрямогоФ электрометрического метода [Drachev et al., 1978; Drachev et al., 1979].
На рисунке 1 представлена кинетика генерации трансмембранной разности потенциалов встроенной в протеолипосомы окисленной ЦО при использовании в качестве фотовосстановителя цитохрома с из дрожжей, ковалентно модифицированного по остатку цистеина 102 трис-бипиридиловым комплексом рутения (Ru-102-Cyt c). В условиях низкой ионной силы (pH~8), Ru-102-Cyt c образует фермент-субстратный комплекс с ЦО, связываясь благодаря электростатическим взаимодействиям в специфическом сайте обращенной во внешнюю водную фазу поверхности ЦО. В присутствии избытка анилина, необходимого чтобы исключить обратный перенос электрона на окисленный Rubpy, в ответ на короткую лазерную вспышку (532нм, 10 нс, 40 мДж) ЦО генерирует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по знаку переносу отрицательного заряда внутрь протеолипосом (рис. 1А). Кривая нарастания регистрируемой разности потенциалов отражает кинетику образования на мембране протеолипосом [Drachev, et al.1978; Drachev et al., 1974].
Быстрая часть кинетики генерации мембранного потенциала (40-70 мкс) отражает перенос электрона в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, от CuA к гему а [Zaslavsky et al., 1995]. Происходящий значительно быстрее ( < 10 мкс, [Pan et al., 1993 ]) перенос электрона между цитохромом с и входным редокс-центром CuA, не сопровождается заметной электрогенной стадией (рис. 1A, вставка), в соответствии с периферическим расположением CuA вблизи поверхности ЦО. В медленной части кинетики доминирует электрогенная фаза, характеризующаяся субсекундным значением 0.3 с (рис. 1A), значительно более медленным, чем стадии каталитического цикла ЦО.
Эта компонента является результатом реакции второго порядка между ЦО и избытком восстановленного Ru-102-Cyt c, образовавшегося в растворе в ответ на лазерную вспышку [Zaslavsky et al., 1995].
Несвязанный с цитохромом с свободный Rubpy также способен восстанавливать ЦО в ответ на вспышку лазера (рис. 1Б, [Nilsson et al., 1992; Zaslavsky et al., 1993]).
Фотоэлектрический ответ с Rubpy и Ru-102-Cyt c сходны в начальной части (рис. 1Б; рис.
1A, вставка). В отличие от Ru-102-Cyt c, вызванная Rubpy cветоиндуцированная генерация завершается в течение нескольких десятков миллисекунд, вслед за чем мембрана разряжается благодаря пассивной утечки ионов.
3.5.A Б 4.2.4.3.2.0 0.3.0.1.2.0.2.1.0.1.0.0.5 1.0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 10 20 30 0.время, мс 0.0.0 2 4 6 8 10 200 400 600 800 100 2 4 6 8 10 200 400 600 800 10время, мс время, мс Рисунок 1. Кинетика генерации трансмембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО.
(A) в приcутствии восстановленного светом Ru-102-Cyt с. На вставке показана быстрая часть фотоэлектрического ответа. Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (pH=8.1), 10 мМ анилин, 5мкМ Ru102-cyt c. (Б) в присутствие Rubpy. Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (pH=8.1), 40 мкМ Rubpy, мМ анилин.
При использовании свободного Rubpy донирование электрона в ЦО происходит в одноэлектронном режиме, от образующего с ЦО электростатический комплекс предсвязанного Rubpy. Вследствие короткого времени жизни возбужденного состояния Rubpy (~0.6 мкс), дополнительного диффузионного переноса электронов из объемной водной фазы от несвязанных с ЦО возбужденных молекул Rubpy не происходит.
Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы (FO переход).
Фиксация ЦО в гомогенном состоянии требует специфической обработки и оказывается возможной не для всех промежуточных состояний восстановленности молекулы кислорода. Инкубация с милимолярными концентрациями H2O2 переводит ЦО в состояние F [Wriglethworth 1984], соответствующее промежуточной восстановленности кислорода в активном центре фермента 3-мя электронами. Инъекция электрона от Rubpy в ЦО в присутствии миллимолярных концентраций H2O2 приводит к быстрому транспорту электрона через гем а в биядерный центр фермента [Nilsson, 1992], что эквивалентно переносу на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле, и, в случае встроенной в протеолипосомы ЦО, сопровождается генерацией трансмембранной разности потенциалов (рис. 2А). В кинетике набора мембранного потенциала хорошо разрешаются три компоненты, характеристические времена которых составляют 40 мкс (УбыстраяФ), ф отопотенциал, м в ф отопотенциал, мв ф отопотенциал, м в мс (УсредняяФ) и 4 мс (УмедленнаяФ), а относительные вклады в суммарный фотоэлектрический ответ, соответсвенно: 20%, 20% и 60% (в согласии с [Zaslavsky et al., 1993]).
Для разрешенных электрогенных компонент характерно значительное различие в энергии активации, обусловленное природой транслоцируемых зарядов (электрона или протонов). Понижение температуры приводит к замедлению миллисекундных компонент генерации мембранного потенциала (УсреднейФ и УмедленнойФ), не сказываясь при этом заметно на скорости микросекундной фазы (рис. 2А). Константа скорости УбыстройФ фазы слабо зависит от температуры в исследованном диапазоне (Еа3.6 ккал/моль, рис. 2Б).
Низкое значение энергии активации (< 0.2 эВ или 4.8 ккал/моль) свидетельствует об отсутствии значительных структурных перестроек в белке, что свойственно несопряженным электрон-транспортным реакциям [Laidler et al., 1972; Farver et al., 2010].
5.A Б 2.быстрая 4.1.4.3.медленная 1.средняя 3.0.средняя 2.быстрая 2.0.медленная 1.0.00 0.05 0.10 0.15 10 20 30 3.3 3.4 3.время, мс 1000/T Рисунок 2. Миллисекундные компоненты генерации мембранного потенциала, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле ЦО из митохондрий, специфически замедляются при уменьшении температуры. (А): Кинетика генерации мембранного потенциала в переходе FO ЦО при двух значениях температуры (1 - при 24С, 2 - при 19С). Условия как на рисунке 1Б; в среде присутствует 4 мМ H2O2. (Б): Зависимость компонент генерации ЦО от температуры в координатах Аррениуса. Значения энергий активации для УбыстройФ, УсреднейФ и УмедленнойФ компонент составили, соответственно: ~3.ккал/моль, 19.4 ккал/моль и 16.6 ккал/моль.
Константы скоростей УсреднейФ и УмедленнойФ фаз генерации потенциала, напротив, в значительной степени растут при повышении температуры и характеризуются относительно высокими значениями энергии активации, соответственно, Еа 19.4 и 16.ккал/моль, (рис. 2Б, [Siletsky et al., 2000, 2011]). Сходные значения энергии активации log k фотопотенциал, мв характерны для протон-транслоцирующих стадий генерации мембранного потенциала в других белках-генераторах H+, включая реакционные центры и бактериородопсин [Mamedov et al., 2006]. Оба гемовых центра ЦО расположены на близком расстоянии от поверхности мембраны [Iwata et al., 1995; Yoshikawa et al., 1998], и перенос электрона между ними не вносит существенный вклад в генерацию мембранного потенциала.
Поэтому УсредняяФ и УмедленнаяФ фазы отражают электрогенную составляющую процессов транслокации протонов в FO переходе ЦО, сопряженных с переносом электрона от гема а в биядерный центр фермента.
Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го и 3-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы (фотовосстановление состояний O и P).
Чтобы перевести цитохромоксидазу исходно в состояние P, соответствующее уровню восстановленности молекулы кислорода 2-мя электронами, нами был подобран метод, основанный на обработке аэробного раствора окисленного фермента газообразным CO [Nicholls and Chanady, 1981]. Окись углерода служит в качестве 2-х электронного донора биядерного центра, и последующее взаимодействие полностью восстановленного a3/CuB центра с атмосферным кислородом приводит к образованию стабильного во времени компаунда P. Полученный после пропускания CO разностный спектр характеризуется в видимой области -пиком при 607 нм и -полосой при 566 нм c типичным для компаунда P соотношением амплитуд ~ 4:1 [Fabian et al., 1995; Rich et al., 1997]. Согласно величине молярной экстинкции при 607 нм (~ 6 мМ-1см-1), около 60% фермента образует соединение P, в то время как оставшаяся часть фермента (~40%) находится в окисленном состоянии (O).
Наблюдающаяся в результате инъекции электрона в исходное окисленное состояние (O) ЦО генерация мембранного потенциала (рис. 3, кривая 1), соответствует по знаку накоплению отрицательного заряда на протеолипосомальной мембране, обращенной во внутренний отсек. В кинетике доминирует фаза c ~45 мкс, отражающая электрогенный перенос электрона с CuA на гем а. Минорная миллисекундная часть кинетики генерации вызвана наличием в препарате окисленного фермента остаточной примеси P и F соединений (10-15%; [Siletsky et al. 1999]), в то время как инъекция электрона от Rubpy в гомогенное окисленное состояние О ЦО из митохондрий ограничивается восстановлением гема а и не сопровождается дальнейшим переносом электрона в BNC в миллисекундной временной шкале ([Nilsson, 1992]).
2.5 + C O 2.1.1.+ K C N 0.0.0. 0 0.1 2 0 4 в р е м я, м с Рисунок 3. Генерация мембранного потенциала, сопряженная с одноэлектронным фотовосстановлением встроенной в протеолипосомы ЦО. Условия: 5мМ Трис-ацетат буфер pH=8.1, 40мкM Rubpy, 10мM анилин. t = 19C. Экспериментальные кривые были зарегистрированы последовательно на одном препарате в следующем порядке: (1) после инкубации в течение 20 мин. в присутствии 200 мкМ феррицианида и 10 нМ каталазы, чтобы перевести ЦО в окисленное состояние (О) и убрать присутствующие в реакционной среде следовые количества H2O2, способствующие переходу фермента в состояния P и F.; (2) в течение 5 мин после пропускания в течение 1 мин. газообразного CO; (3), после добавления 0.5 мМ KCN.
В ответ на обработку CO и формирование состояния P ЦО, миллисекундная часть кинетики генерации мембранного потенциала резко возрастает (рис. 3, кривая 2), отражая сопряженные с реокислением гема а стадии электрогенного переноса протонов.
Добавление цианида, связывающегося с окисленным гемом а3 и блокирующего перенос электрона к нему от гема а, ингибирует фазы электрогенного переноса протонов (рис. 3, кривая 3). C учетом фракции ЦО в состояние О (~40%), относительная амплитуда УбыстройФ нечувствительной к цианиду электрогенной фазы (~45 мкс) для обоих одноэлектронных стадий FO и PF составляет ~20%. Взаимное соотношение скоростей и амплитуд двух чувствительных к цианиду электрогенных протонных фаз в переходе PF (~0.3 мс и ~1.5 мс) близко к таковому для УсреднейФ и УмедленнойФ фаз в переходе FO. Поскольку перенос электрона от гема а в BNC не вносит существенный вклад в генерацию мембранного потенциала, а чувствительные к цианиду стадии генерации потенциала обсуловлены электрогенной транслокацией протонов, то относительная амплитуда УбыстройФ электрогенной фазы переноса электрона от CuA на гем а может быть использована для оценки суммарной величины количества фотопотенциал, мв электрогенного переноса заряда в отдельных переходах. Очевидно, переходы FO и PF сопряжены с равным суммарным числом транслоцируемых через мембрану зарядов.
КИНЕТИКА ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА ЧЕРЕЗ ГЕМОВЫЕ ЦЕНТРЫ В ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДАХ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - установить стадии переноса электрона в ЦО, которые непосредственно сопряжены и контролируют отдельные электрогенные этапы перемещения протонов в одноэлектронных переходах фермента.
В случае исходного состояния F биядерного центра ЦО из митохондрий, разрешенная кинетика изменения экстинкции при 445 нм (максимум поглощения восстановленного гема а) содержит 3 компоненты. Микросекундная компонента нарастания поглощения А445 (40 мкс, неразрешаемый скачок поглощения на рисунке 4) соответствует восстановлению гема а УвходнойФ медью CuA. Последующее снижение абсорбции А445 отражает реокисление гема а биядерным центром и содержит две компоненты, характеристические времена которых совпадают со значениями УсреднейФ и УмедленнойФ электрогенных компонент (~1 мс и ~4 мс). Основной вклад (80-90%) в спад абсорбции А445, принадлежит компоненте с ~1 мс.
0,0444 нм 0,0438 нм 412 нм -0,0-0,00 5 10 15 время, мс Рисунок 4. Кинетика изменения оптического поглощения в полосе восстановленного гема а при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении ЦО из соединения F (445 нм), исчезновения оксоферрильного комплекса гема а3 (438 нм) и появления окисленного состояния гема а3 (412 нм) в FO переходе фермента. Условия: 20 мкМ ЦО, буфер 5 мМ Трис-ацетат (pH=8.1), 0.05% додецил-мальтозид, 80 мкМ Rubpy, 0.2 мМ феррицианида калия, 4 мМ H2O2. Для большей наглядности амплитуда кинетической кривой изменения А444 уменьшена в 2 раза.
Регистрация поглощения при 438 нм и 412 нм позволяет избирательно следить за превращением гема а3 в FO переходе. Данные длины волн близки, соответственно, к максимуму и минимуму поглощения в разностном спектре оксоферрильного комплекса гема а3 относительно окисленного гема а3; вклад редокс-изменений гема а при этом минимален. Из рисунка 4 можно видеть, что изменения поглощения ЦО в ответ на фотохимическую подачу электрона от Rubpy, отражающие, соответственно, реокисление гема а (445 нм), исчезновение состояния F (438 нм) и появление окисленного состояния O гема а3 (412 нм) происходят параллельно и характеризуются ~1-1.5 мс.
На рисунке 5А приведено сравнение кинетики увеличения поглощения при 412 нм, отражающей появление окисленного гема а3 в FO переходе и параллельной кинетики электрогенного движения протонов через мембрану. Разрешаемый оптически переход FO биядерного центра совпадает во времени со УсреднейФ фазой электрогенного протонного транспорта (~1 мс). В тоже время значительная часть электрогенного протонного транспорта происходит позднее, в УмедленнойФ электрогенной фазе (4 мс, рис. 6А) [Siletsky et al., 2006].
0.00Б F O A 0.0P F 0.00фотопотенциал 0.0фотопотенциал 0.000.001 A50.00A40.00.00-0.01.82.02.2 5 10 15 0 1 2 5 10 15 20 время, мс время, мс Рисунок 5. (А) Сравнение кинетики FO перехода, измеренной по увеличению поглощения при 412 нм, со скоростью электрогенного протонного транспорта, cопряженного с одноэлектронным фотовосстановлением компаунда F. Нарастание поглощения при 412 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа, отнормированы по амплитуде ~1 мс фазы электрогенного протонного транспорта. (Б) Сравнение кинетики PF перехода, измеренной по увеличению поглощения при 580 нм, со скоростью электрогенного протонного транспорта, сопряженного с одноэлектронным фотовосстановлением компаунда P. Нарастание поглощения при 580 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа отнормированы по амплитуде ~0.3 мс фазы электрогенного протонного транспорта. Как в (А) так и в (Б), электрогенная фаза переноса электрона CuAгем a (~45 мкс), вычтена из соответствующей электрометрической кривой.
поглощение погпощение Кинетика переноса электрона через гемовые центры ЦО из митохондрий в переходе PF регистрировалась в длинноволновой области спектра, где данные интермедиаты каталитического цикла ЦО имеют специфические и легко различимые полосы поглощения. Нарастание поглощения при 580 нм (рис. 6) отражает появление состояния F ЦО (максимум поглощения в видимой области ~583 нм) и характеризуется константой времени ~250 мкс.
Наблюдающийся скачок поглощения при 605 нм в начальном участке (рис. 6) вызван восстановлением гема а от CuA с ~40 мкс. В кинетику уменьшения поглощения A605 вносят вклад как реокисление гема а, так и исчезновение состояния P. Спектральные изменения при 605 нм и 580 нм, происходящие с ~230-250 мкс, отражают реокисление гема a и переход PF биядерного центра [Siletsky et al., 2006]). Как видно на рисунке 5Б, одновременно с переносом электрона в BNC ЦО образует разность электрических потенциалов в переходе PF засчет сопряженного электрогенного переноса протонов в УсреднейФ компоненте кинетики генерации (~0.3 мс). В тоже время, как и в случае FO перехода, значительная часть мембранного потенциала образуется в ходе электрогенного протонного транспорта, происходящего позднее, в УмедленнойФ электрогенной фазе c ~ 1.3-1.5 мс [Siletsky et al., 2006].
0,0605 нм 0,0580 нм 0,0-0,00,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,0время, с Рисунок 6. Кинетика изменения поглощения при 580 нм и 605 нм, вызванная одноэлектронным фотовосстановлением состояния P митохондриальной цитохромоксидазы в детергентном растворе. Реакционная среда содержала 10 мкМ ЦО, 30 мкМ Ru2C, 10 мМ анилин, 5 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, 0.1% додецил мальтозида. Данные свидетельствуют о том, что быстрая фаза снижения поглощения при 605 нм совпадает с образованием состояния F (увеличение поглощения при 580 нм).
Таким образом, перенос электрона от гема а в биядерный центр цитохромоксидазы из митохондрий характеризуется значением 0.3 мс (PF) и 1.2 мс (FO), соответственно, и сопряжен в обоих переходах с cинхронной генерацией мембранного потенциала в УсреднейФ электрогенной фазе. Электрогенный перенос протонов в УмедленнойФ электрогенной фазе (с 1.5 мс и 4.5 мс, соответственно), происходит за счет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в промежуточном метастабильном состоянии ЦО. Фазы электрогенного переноса протонов в переходах PF и FO характеризуются сходными параметрами как по относительному соотношению соответствующих скоростей и амплитуд, так и по связи с сопряженными стадиями переноса электрона в ЦО, что указывает на универсальный характер механизма транслокации протонов на отдельных одноэлектронных стадиях окислительной полуреакции каталитического цикла.
ВНУТРИБЕЛКОВЫЕ ПУТИ ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В ХОДЕ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - локализовать пути проведения протонов и выяснить их функциональную роль в каталитическом цикле цитохромоксидазы.
Электрогенная активность цитохромоксидазы аа3 типа из Rhodobacter sphaeroides.
Исследование бактериальных цитохромоксидаз, гомологичных митохондриальной ЦО, позволяет использовать возможности направленного мутагенеза по аминокислотным остаткам, предположительно участвующим в проведении протонов внутри белка. В качестве такого модельного объекта была выбрана ЦО аа3-типа из Rhodobacter sphaeroides, относящаяся к тому же подсемейству А1 семейства А гем-медных оксидаз и обладающая высокой степенью гомологии (50% для первой субъединицы) с ферментом из митохондрий [Shapleigh et al., 1992].
На рисунке 8 приведена кинетика генерации мембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО дикого типа из R.sphaeroides при одноэлектронном фотовосстановлении состояния F (переход FO). Разрешаемые кинетические компоненты бактериального фермента примерно в 2-3 раза быстрее соответствующих компонент кинетики митохондриальной ЦО, что согласуется с более высокой стационарной активностью бактериальной ЦО (750 с-1 против 250 с-1 при рН=8). Величина относительных вкладов в фотоэлектрический ответ чувствительных к цианиду аналогов УсреднейФ (0.35-0.6 мс) и УмедленнойФ (1.2-1.7 мс) электрогенных компонент и их соотношение (~1:3) близки к таковым в случае ЦО из митохондрий.
Рисунок 7. Кинетика генерации трансмембранной разности потенциала ЦО дикого типа из R.sphaeroides. Цианид калия ингибирует миллисекундные компоненты генерации . Условия:
буфер 5 мМ трис-ацетат (pH=8.1), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин, 1 мМ H2O2; где указано - добавлен 2 мМ KCN.
Относительная амплитуда собственно электрон-транспортной стадии восстановления гема а от CuA в цитохромоксидазе из R.sphaeroides (~10 мкс) имеет близкое значение к таковой в митохондриальной ЦО, в соответствии со сходством трехмерной структуры обоих ферментов, и составляет ~18-20% [Siletsky et al., 2010].
Роль входных протонных D и К каналов в каталитическом цикле ЦО.
В результате рентгено-структурного анализа кристаллов цитохромоксидазы из митохондрий сердечной мышцы быка и гомологичных бактериальных оксидаз, в мембранной гидрофобной части фермента были обнаружены структуры [Iwata et al., 1995;
Svensson-Ek et al., 2002], потенциально способные к проведению протонов на пути из матрикса к двухядерному железо-медному центру. Первичная гипотеза связывала два потенциальных протон-проводящих УканалаФ, названные по остаткам лизина и аспартата в начальной части, соответственно, К и D каналами [Konstantinov et al., 1997], с проведением протонов разных типов (субстратных и помпируемых) [Iwata et al., 1995;
Tsukihara et al., 1996].
Одиночные замены на непротонируемые аналоги ряда ключевых консервативных аминокислотных остатков в протон-проводящих путях в значительной степени либо полностью ингибируют цитохромоксидазную активность в стационарных условиях (табл.1).
ТАБЛИЦА 1. Каталитическая активность цитохромоксидазы дикого типа и мутантных форм из Rhodobacter sphaeroides.
Фермент Дикий тип T359A D132N K362M E286Q Число оборотов, с-1 (%) 1500 (100) 250 (17) 50 (3.3) <5 (<0.3) <5 (<0.3) На рисунке 8A представлена кинетика генерации мембранного потенциала ЦО дикого типа при фотохимическом одноэлектронном восстановлении соединения F с помощью Rubpy, в сравнении c ЦО, мутантной по остатку Е286. Можно видеть, что единичная замена расположенного в конце D-канала, вблизи двухядерного центра, остатка Е286 не влияет на быструю микросекундную часть кинетики генерации потенциала, связанную с переносом электрона с CuA на гем а. Одновременно, полностью ингибируются милисекундные фазы фотоэлектрического ответа, то есть внутрибелковый перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а и восстановлением гема а3.
Мутация D132N в начальной части D-канала также не влияет на микросекундную часть кинетики, в то время как в миллисекундной временной шкале амплитуда фотоэлектрического ответа мутантной ЦО значительно снижена (рис. 8B). Остаточная медленная часть кинетики генерации ингибируется цианидом и представляет собой электрогенное подтягивание протона в D-канале (выше остатка D132) в ответ на перенос электрона от гема а в двухядерный центр. Позднее, сходный эффект ингибирования электрогенного переноса протонов в результате перекрывания D-канала был обнаружен при замене на непротонируемые аналоги ряда консервативных остатков серина и аспарагина, расположенных в срединной части D-канала между остатками D132 и E2[Lee et al. 2010, Siletsky et al., 2004, 2010].
WT B A 2 WT D132N E286Q D132N+KCN 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 10 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 K362M D C 4 WT T359A 1 0 0.00 0.05 0.10 2 4 6 8 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 время, мс время, мс Рисунок 8. Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазами дикого типа (WT) и ЦО с сайт-специфическими мутациями в протон-проводящих каналах. Основные условия как на рисунке 7.
D-канал: (A). Кинетические кривые дикого типа (WT) и мутант E286Q нормированы по амплитуде микросекундной компоненты. В случае мутанта для поддержания гема а в окисленном состоянии добавлен 0.2 мМ феррицианид калия. (B) Кинетики фотоэлектрических ответов ЦО дикого типа и с мутацией D132N отнормированы по амплитуде в микросекундной временной шкале. Там, где указано - добавлен 1 мМ KCN.
K-канал: (C) Фотоэлектрический ответ ЦО с одиночной заменой T359A во входном протонном К-канале практически не отличается от ответа ЦО дикого типа. (D). Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией K362M в К-канале. Условия: 1.) без добавок; 2.) добавлено 100 мкМ феррицианида калия.; 3.) добавлено 1мМ перекиси; 4.) добавлен мМ KCN.
Одиночные замены аминокислотных остатков в К-канале также приводят к заметному (Т359A) либо полному (К362M) ингибированию активности фермента (табл.
1). Однако, как можно видеть на рисунке 8, мутации в К-канале не оказывали значительного влияния на кинетику генерации , сопряженную с одноэлектронным фотовосстановлением интермедиата F, и не ингибировали электрогенный перенос протонов в ЦО на этой стадии каталитического цикла.
фотопотенциал, мв 0.0.444 нм 605 нм 417 нм 0.08 1-E286Q 1 2-D132N 0.0.2 3-K362M 0.4-WT 0.0.0.560 580 600 620 640 6д л и н а в о л н ы, н м 0.0.1-E286Q 2-D132N 3-K362M 0.4-WT 0.400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 5Длина волны, нм Рисунок 9. Абсолютные спектры поглощения дикого типа и мутантных форм ЦО в аэробных стационарных условиях в присутствие аскорбата и TMPD в качестве доноров электронов в полосе Соре и в видимой области спектра (на вставке). Условия: кювета с постоянным перемешиванием и оптическим путем 1 см. Состав среды: 0.2Ц0.5 мМ фермента (ЦО дикого типа или мутантной формы), 50 мМ К-фосфат (pH 8.0) и 0.1% лаурил мальтозид.
Фотоэлектрический ответ цитохромоксидазы с заменой Т359А в присутствии 1 мМ H2O2 не отличается от кинетики ЦО дикого типа (рис. 8C). ЦО с мутацией К362M в присутствии Rubpy образует сильно заниженный по величине фотоэлектрический ответ (рис. 8D, кривая 1), что связано со значительной степенью восстановленности гема а в исходном состоянии. Добавление феррицианида окисляет гем а и разрешает его фотовосстановление от Rubpy через CuA (рис. 8D, кривая 2). Добавление перекиси водорода, переводящее фермент в оксоферрильное состояние F, приводит к появлению в практически неактивном K362M мутанте полностью развитой, чувствительной к цианиду миллисекундной части кинетики генерации потенциала (рис. 8D, кривая 3,4).
Стационарные оптические спектры всех описанных выше мутантных форм в присутствие избытка субстратов дыхания свидетельствуют о значительном повышении степени восстановленности гема а (вставка к рис. 9), в соответствии с ингибированием реакции реокисления гема а двухядерным центром вследствие мутации. Однако, в отличие от мутаций по D-каналу, в случае мутанта К362М два раздельных пика с максимумами 444 нм и 420 нм в полосе Соре свидетельствует об окисленном высокоспиновом состоянии гема а3 (состояние O) на фоне восстановленного гема а (рис.
9). То есть, ингибирование стационарной активности в УмертвомФ мутанте K362M в К канале вызвано замедлением переноса протонов в восстановительной части п о г л о щ е н и е поглощение каталитического цикла, в ходе восстановления биядерного центра с образованием состояния R, что является необходимым этапом для связывания O2.
Таким образом можно заключить, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла ЦО происходит через протон-проводящие D и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы, включая остатки D132, N139, E286 в D-канале и T351, T359 и K362 в К-канале [Siletsky et al., 1996;
Konstantinov et al., 1997; Siletsky et al., 2004]. Однако, протон-проводящие D и K каналы различаются не по типу переносимых протонов (субстратных или помпируемых), как предполагалось исходно, а задействованы на разных стадиях каталитического цикла.
АРТИКУЛЯЦИЯ ВНУТРИБЕЛКОВОГО ПЕРЕМЕЩЕНИЯ ПРОТОНОВ В ОДНОЭЛЕКТРОННОМ ПЕРЕХОДЕ FO ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - выяснить точную стехиометрию сопряженного трансмембранного переноса протонов в отдельном одноэлектронном переходе; выявить детали взаимной артикуляции проведения помпируемого и субстратного протонов в элементарном акте работы протонного насоса цитохромоксидазы.
Стехиометрия сопряженного электрогенного переноса протонов в одноэлектронном переходе F O цитохромоксидазы.
Точное число помпируемых протонов, сопряженных с отдельными одноэлектронными переходами ЦО, оставалось предметом дискуссий в течение длительного времени. Основываясь на анализе равновесных окислительновосстановительных титрований редокс-активных групп ЦО и переходов биядерного центра, Викстремом была предложена модель, в которой каждый из переходов PF и FO сопряжен с трансмембранным переносом двух помпируемых протонов [Wikstrom, 1989], в то время как перенос 2-х первых электронов в каталитическом цикле ЦО не сопряжен с перекачкой протонов через мембрану вовсе.
Количественная оценка числа переносимых зарядов в приведенных выше предстационарных измерениях генерации мембранного потенциала в одноэлектронных PF и FO переходах ЦО существенно зависит от степени электрогенности, приписываемой УбыстройФ стадии, отражающей перенос электрона от CuA к гему а и использующейся в качестве внутреннего нормировочного параметра. Так, согласно стационарным измерениям влияния мембранного потенциала на редокс-равновесие между цитохромом с и гемом а [Hinkle and Mitchell, 1970], исходно предполагалось, что амплитуда УбыстройФ электрогенной компоненты в ходе PF и FO переходов соовтетствует переносу электрона от CuA к гему a на 1/2 величины диэлектрического барьера мембраны. В этом случае суммарная амплитуда миллисекундных протонных фаз (80%) в FO или PF переходах может соответствовать трансмембранной транслокации 2 полных зарядов и включать в себя транслокацию из внутренней водной фазы в двухядерный центр субстратного протона на половину толщины мембраны и сопряженную электрогенную транслокацию двух помпируемых протонов: одного - через всю мембрану и еще одного - на половину ее толщины, то есть Уполутора помпируемых протоновФ на 1 одноэлектронный переход [Zaslavsky et al., 1993; Siletsky et al., 1999].
Чтобы достоверно оценить электрогенное расстояние между CuA и гемом а в предстационарных условиях и определить точное число зарядов, транслоцирумых в разрешенных во времени одноэлектронных переходах, нами была исследована генерация мембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией N139D в начальной части Dканала, полностью сохраняющей кислород-редуктазную активность и утрачивающей способность к трансмембранной перекачке протонов [Siletsky et al., 2004].
Как можно видеть на рисунке 10, реокисление гема а биядерным центром (снижение поглощения A444) в мутанте N139D и диком типе в переходе FO происходят с близкими скоростями. То есть мутация N139D не оказывает влияния на перенос электрона через гемовые центры ЦО. Фотоиндуцированная кинетика генерации мембранного потенциала непомпирующего мутанта N139D представлена на рисунке 11 и может быть использована в качестве калибровки суммарной транслокации помпируемых протонов в FO переходе протон-помпирующих оксидаз. Генерация мембранного потенциала в мутантной ЦО обусловлена электрогенными составляющими микросекундной компоненты переноса электрона с внешней стороны мембраны к гему а и чувствительной к цианиду миллисекундной (~0.6 мс) фазы переноса субстратного протона из внутренней водной фазы в BNC в ходе химического превращения интермедиата F в O. C учетом выхода соединения F в мутанте N139D (~70%), относительная амплитуда чувствительной к цианиду ~0.6 мс компоненты в фотоэлектрическом ответе составляет ~1.65 от амлитуды электрогенного переноса электрона между СuA и гемом а.
Поскольку гем а и биядерный центр располагаются на одинаковом расстоянии от поверхности мембраны, из полученного отношения следует, что электрогенное расстояние BNC и гема а от внешней поверхности мембраны составляет ~0.38 толщины мембранного диэлектрика, что близко к оценке геометрического расположения гема а в трехмерной структуре ЦО от внешней поверхности мембраны.
0,00,00,0N139D 0,0WT -0,00 5 10 15 20 время, мс Рисунок 10. Кинетика редокс-превращений гема а в переходе F O в очищенной ЦО дикого типа (WT) и мутантной N139D из R. sphaeroides. Условия: 20мкМ ЦО, 5 мМ Трис/ацетат буфер, 0.1% додецилмальтозид, 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин, 2 мМ H2O2. Две абсорбционные кривые отнормированы по амплитуде фотовосстановления гема а.
Сравнение амплитуды ~0.6 мс электрогенной фазы, отражающей перенос субстратного протона из внутренней водной фазы в BNC на расстояние ~0.62 толщины мембранного диэлектрика, с ответом митохондриальной ЦО и бактериальной ЦО дикого типа позволяет оценить дополнительный электрогенный вклад, возникающий в одноэлектронном переходе помпирующего фермента в результате транслокации помпируемого протона [Siletsky et al., 2004].
3,2,5 WT 2,N139D 1,1,E286Q 0,0,F->O переход -0,0,00 0,05 5 время, мс Рисунок 11. Электрогенные ответы, сопряженные с F переходом в ЦО из R. sphaeroides.
O Эксперименты с приклеенными к коллодиевой пленке липосомами ЦО проводились в буфере мМ Трис-ацетат, pH 8, в присутствии 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилина. Чтобы перевести фермент в оксоферрильное состояние добавляли 2 мM H2O2. В случае мутанта E286Q, был добавлен 0.2 мМ феррицианида калия, для того чтобы поддерживать гем а в окисленном состоянии.
A при 4нм фотопотенциал, мв Полагая, что амплитуда УбыстройФ фазы (~20% от полной величины ответа [Zaslavsky et al., 1993; Siletsky et al., 2010]) соответствует переносу электрона от CuA к гему а, находящемуся на том же расстоянии от поверхности мембраны, что и BNC, суммарная амплитуда УсреднейФ и УмедленнойФ электрогенных фаз соответствует транслокации ~1.52 заряда через всю толщину мембранного диэлектрика. Учитывая амплитуду переноса субстратного протона в биядерный центр (~0.62), дополнительный электрогенный вклад, наблюдающийся в помпирующем ферменте, соответствует трансмембранному переносу ~0.9 (то есть не более 1) помпируемого протона.
Последовательность проведения помпируемого и субстратного протонов в переходе F O цитохромоксидазы.
В отличие от УбыстройФ электрогенной фазы, для чувствительной к цианиду части фотоэлектрического ответа ЦО, отражающей стадии сопряженного переноса протонов, наблюдается заметный эффект изотопного замещения при проведении измерений в D2O (рис. 12). Как оказалось, различие в чувствительности к D2O/H2O изотопному замещению может служить независимым инструментом для разделения и идентификации УсреднейФ и УмедленнойФ фаз генерации потенциала в FO переходе.
A B A 0,H2O WT N139D H2O D2O 0,D2O 0,0 5 0 5 время, мс время, мс Рисунок 12. Действие замены D2O/H2O на кинетику электрогенные фаз в диком типе (A) и мутантной ЦО с заменой N139D (B). После регистрации фотоэлектрического ответа в H2O, заменялся буфер и ответ регистрировался в D2O.
При проведении измерения в D2O УсредняяФ протонная фаза в ЦО дикого типа замедлялась в 1.4-1.5 раза, в то время как характеристическое время УмедленнойФ электрогенной фазы увеличивалось в 3.5-4 раза (табл. 2, [Siletsky et al., 2004]). В фотоэлектрическом ответе мутанта N139D замедление чувствительной к цианиду ~0.6 мс электрогенной фазы в 3.5-4 раза практически идентично кинетическому изотопному фотопотенциал, мв эффекту, наблюдаемому для УмедленнойФ (~1.5 мс) электрогенной фазы в диком типе и в тоже время значительно больше, чем кинетический изотопный эффект на УсреднююФ (~0.5 мс) фазу (табл. 2). Это означает, что ~0.6 мс протонная фаза в N139D мутанте соответствует УмедленнойФ фазе электрогенной кинетики дикого типа, то есть электрогенное движение субстратного протона в ЦО дикого типа происходит в УмедленнойФ электрогенной фазе [Siletsky et al., 2004].
Таблица 2. Чувствительность перехода FO к изотопному замещению ионов водорода.
Протонная Дикий тип N139D электрогенная фаза H2O D2O H2O D2O мс мс УСредняяФ 0.53 0.0.62 2.УМедленнаяФ 1.46 4.Поскольку оксидаза c мутацией N139D не переносит протоны через мембрану, то отсутствующая в мутанте УсредняяФ электрогенная фаза отражает электрогенное перемещение помпируемого протона в ЦО дикого типа. Важно также, что электрогенное перемещение помпируемого протона в механизме сопряженного протонного транспорта цитохромоксидазы предшествует электрогенному перемещению субстратного протона.
Высвобождение протона на внешнюю сторону мембраны происходит в ФмедленнойФ электрогенной фазе. Ингибирование электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе ионами цинка.
В настоящее время принято считать, что выход помпируемого протона из ЦО на внешнюю сторону мембраны может осуществляться с помощью разветвленной сети гидрофильных остатков и молекул воды вблизи внешней поверхности ЦО [Mills et al., 2000; Sugitani et al., 2009]. Однако более точно локализовать траектории выхода протона на внешнюю сторону мембраны в трехмерной структуре ферменте пока не удалось, несмотря на применение методов направленного мутагенеза. В этой связи продуктивным оказалось использование нами ионов цинка, как поверхностного ингибитора протонного транспорта в ЦО [Kuznetsova et al., 2005].
Ионы цинка специфически ингибируют протонный транспорт в ряде мембранных белков [Skulachev et al., 1967; Lorusso et al., 1991; Paddock et al., 1999; Nicholls et al., 1988;
Berry et al., 2000; Kuznetsova et al., 2005]. В ходе исследования влияния Zn2+ на ЦО выяснилось, что в цитохромоксидазе имеются сайты связывания ЦО, располагающиеся как со стороны внутренней водной фазы, вблизи входа в D-канал, так и с внешней стороны мембраны. Взаимодействие Zn2+ с внутренней стороны мембраны отвечает за основные эффекты ионов цинка на солюбилизированный фермент [Kannt et al., 2001;
Aagaard et al., 2002; Martino et al., 2011]. В тоже время, в некоторых условиях показано действие ионов цинка на стационарную активность ЦО с внешней стороны цитохромоксидазных протеолипосом [Mills et al., 2002; Kuznetsova et al., 2005].
контроль Переход F в O + 100 мкМ Zn2+ 0,1 10 20 30 время, мс Рисунок 13. Ингибирование ионами Zn2+ электрогенной активности митохондриальной ЦО, сопряженное с переходом фермента из состояния F в состояние O. Перед опытом протеолипосомы в течение 30 мин инкубировались в среде измерения, содержащей 5 мМ Трис-ацетат, pH 8,0, мМ анилин, 40 мкМ Rubpy и 4 мМ Н2О2. После записи контрольной кривой 1 в кювету был добавлен 100 мкМ ZnCl2 и через 5 мин записана кривая 2. Кривые 1 и 2 нормированы по амплитуде быстрой электрогенной фазы.
Как можно видеть на рисунке 13, при измерении с временным разрешением фотоиндуцированной кинетики генерации мембранного потенциала ЦО в переходе FO в присутствии 100 мкМ Zn2+, добавленного с внешней стороны мембраны к протеолипосомам с ЦО, протонная составляющая генерации мембранного потенциала значительно замедляется. Существенно, что вызванное ионами цинка замедление обусловлено специфическим торможением УмедленнойФ электрогенной фазы, что свидетельствует о связи УмедленнойФ электрогенной фазы с высвобождением помпируемого протона и о лимитированиие вцелом электрогенного переноса протонов в УмедленнойФ электрогенной фазе стадией высвобождения помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны.
ОСОБЕННОСТИ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ ba3-ТИПА ИЗ T. THERMOPHILUS фотопотенциал, мВ Цель - выяснить структурно-функциональные особенности неканонической цитохромоксидазы ba3 типа из T.thermophilus, обусловливающие уменьшенную вдвое усредненную стехиометрию протонного насоса; выяснить структуру интермедиатов каталитического цикла и особенности взаимодействия каталитического центра с лигандами.
В отличие от классических цитохромоксидаз семейства А гем-медного суперсемейства, ЦО ba3 из T.thermophilus относится к эволюционно удаленному малоизученному семейству B и характеризуется вдвое меньшей усредненной стехиометрией помпирования протонов [Kannt et al., 1998], то есть переносит трансмембранно в среднем ~0.5 H+/e. Как соотносится усредненная дробная стехиометрия протонного насоса ЦО с транслокацией помпируемых протонов на отдельных одлноэлектронных стадиях каталитического цикла? Может ли изменение усредненной стехиометрии помпирования свидетельствовать о принципиальном отличии механизма помпирования и сопряжения в оксидазах семейства B? Электрогенные события, сопряженные с одноэлектронным фотовосстановлением ЦО ba3 -типа из T.thermophilus.
На рисунке 14 показана генерация встроенной в протеолипосомы окисленной (состояние О) цитохромоксидазы ba3 в ответ на вспышку лазера в присутствие Rubpy.
Фотовосстановление от комплекса Rubpy сопровождается быстрым нарастанием мебранного потенциала (соответствующего переносу положительно заряда изнутри липосом наружу), основной вклад в который вносят две компоненты с 1 ~10-20 мкс и 2~250 мкс и соотношением амплитуд 3:2, соответственно (рис. 14, кривая а).
В параллельной кинетике изменения оптического поглощения компоненты с аналогичными характеристическими временами отражают, соответственно, перенос электрона от CuA на гем b и последующее частичное (~30%) реокисление гема b биядерным центром [Siletsky et al., 2009]. Учитывая распределение электронной плотности от гема b в биядерный центр [Siletsky et al. 2009], электрогенность сопряженного переноса протона в фазе с 2~250 мкс соответствует транслокации одного субстратного протона из внутренней водной фазы к биядерному центру на расстояние около 2/3 толщины мембранного диэлектрика. Это означает, что в каталитическом цикле ЦО ba3 типа перенос первого электрона в BNC в окисленном состоянии O несопряжен с транслокацией помпируемого протона.
В отличие от канонических цитохромоксидаз, биядерный центр окисленной ЦО baпрактически не связывает внешние лиганды и, соответственно, не образует в присутствии H2O2 или при обработке смесью CO/O2 детектируемого количества интермедиатов P или/и F [Siletskiy et al., 1999]. Несмотря на это, при инъекции электрона от Rubpy в присутствии H2O2 наблюдается дополнительная электрогенная фаза (рис. 14, кривые b, c). Однако, в отличие от ЦО аа3 типа, скорость данной компоненты кинетики ba3 оксидазы прямо пропорциональна концентрации перекиси водорода в изученном диапазоне (0.5 - 80 мМ) с константой скорости второго порядка ~2 000 M-1с-1 [Siletskiy et al., 1999]. Это означает, что данная электрогенная компонента индуцирована инъекцией электрона в ЦО и лимитируется скоростью взаимодействия H2O2 с биядерным центром.
1,c, 40 мМ H2Ob, 4 мМ H2O0,a, без добавок 0,0,0,0 0,5 1,0 100 2время, мс Рисунок 14. Свето-индуцированная генерация мембранного потенциала цитохромом ba3.
Реакционная среда содержала буфер 5 мМ Трис-ацетат (pH 8), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин.
Фотоэлектрические кривые были зарегистированы на одном и том же образце без добавок (a) и после добавления H2O2 в указанных концентрациях (b и c).
Неактивный в окисленном состоянии биядерный центр ЦО ba3Цтипа приобретает, таким образом, способность связывать лиганды (переходит в активное состояние) в ответ на восстановление гема b [Siletskiy et al., 1999]. Подобные особенности были отмечено ранее в случае ряда других гемопротеидов, включая двухгемовые пероксидаз из P.denitrificans и cd1 нитрат редуктазы [Hu et al., 1997; Williams et al., 1997].
Интермедиаты каталитического цикла, разрешаемые при окислении кислородом восстановленной ЦО ba3 из T.thermophilus в режиме одного оборота Поскольку окисленная ЦО ba3 типа из T.thermophilus не связывает экзогенные лиганды и не образует состояний частичного восстановления кислорода в биядерном центре, для установления интермедиатов каталитического цикла ЦО ba3 нами был использован синхронный запуск каталитической реакции во всей популяции ЦО с помощью фотолиза комплекса полностью восстановленного фермента с CO в присутствии кислорода (т.н. метод Уфлоу-флэшФ, [Gibson et al., 1963]). Кинетика переноса электронов фотопотенциал, мв отслеживалась по спектральным изменениям редокс-центров, сопровождающим их редокс-превращения в ходе оксидазной реакции [Siletsky et al., 2007]. Параллельно регистрировалась быстрая кинетика электрогенного переноса электронов и протонов в ферменте с помощью УпрямогоФ электрометрического метода [Drachev et al., 1978;
Drachev et al., 1979].
В результате глобальной аппроксимации двумерного массива спектральнокинетических данных, собранных в ходе реакции окисления полностью восстановленной ba3 оксидазы кислородом с записью полного спектра образца с микросекундным разрешением, были выявлены 4 последовательные перехода в каталитическом цикле фермента с ~5.3 мкс, ~13 мкс, ~30 мкс и ~750 мкс. Разностные спектры разрешенных кинетических компонент представлены на рисунке 15. В спектре первой кинетической компоненты (рис. 15А), уменьшение поглощения при 615 нм и увеличение поглощения при 595 нм и 560 нм, близких и полосам комплекса восстановленного железа гема а3 с кислородом, отражает соответственно исчезновение несвязанной с лигандом восстановленной формы гема а3, и появление окси-комплекса или т.н. компаунда А (переход RA) [Hill et al., 1983].
В спектре второй кинетической фазы (~13 мкс, рис. 15B), уменьшение поглощения при 560 нм вместе с пиком при 612 нм указывает на одновременное окисление гема b и образование состояния P. На этой стадии, также как и в ЦО из митохондрий, молекула O2 расщепляется и принимает суммарно 4 электрона от гема а3, CuB и остатка тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина Y288 в ааоксидазах), образующего ковалентную связь с гистидиновым лигандом CuB (схема 1; рис.
19).
Спектр третьей кинетической компоненты (~30 мкс, рис. 15С) принципиально отличается от такового в случае ЦО из митохондрий. В оксидазах семейства A данная стадия реакции приводит к образованию из состояния P (максимум при 607 нм) состояния F биядерного центра (максимум при 580 нм), что сопровождается синхронным переносом электрона от СuA на низкоспиновый гем a и переносом протона к биядерному центру с внутренней (N) стороны мембраны. В ba3 оксидазе, в ходе данной кинетической фазы происходит полное ревосстановление низкоспинового гема b от CuA (увеличение поглощения при 560 нм), однако спектральные изменения полосы поглощения гема аотсутствуют (рис. 15С).
Кинетический спектр четвертой фазы цитохромоксидазы ba3 указывает на образование окисленного состояния O (увеличение поглощения в полосе с переносом заряда при 660 нм), а также исчезновение интермедиата гема а3 с пиком ~612 нм и перенос электрона в биядерный центр от гема b (уменьшение поглощения при 612 нм и 560 нм, соответственно) (рис. 15D). Таким образом, спектральные и кинетические параметры разрешаемых состояний A, P и O оксидазы ba3-типа схожи с таковыми в митохондриальной ЦО. Однако аналог интермедиата F BNC в кинетике ЦО ba3-типа не обнаруживает характерных спектральных признаков состояния F аа3 оксидаз.
Рисунок 15. Оптические спектры кинетических компонент в реакции полностью восстановленного цитохрома ba3 с молекулярным кислородом. (A) Первая компонента реакции, ~5 мкс. (B) Вторая компонента, ~13 мкс. (C) Третья компонента, ~30 мкс. (D) Четвертая компонента, ~740 мкс. Видимая область спектра (alpha) увеличена в 4-раза.
Cтадии генерации мембранного потенциала, сопряженные с окислением восстановленной ba3 оксидазы из T.thermophilus кислородом в режиме одного оборота В паралельной кинетике генерации мембранного потенциала в ходе одного каталитического оборота ba3 оксидазы также выделяются 4 компоненты (рис. 16).
Фотоэлектрический ответ начинается с микросекундной лаг-фазы (~5-6 мкс), отражающей электрометрически невидимые процессы высвобождения CO, связывания кислорода и образования состояния A. Вслед за лаг-фазой следуют три компоненты развития мембранного потенциала, соответствующие переносу положительного заряда через мембрану с N-стороны в направлении к P-стороне липосомальной мембраны (рис. 16).
Вторая фаза электрометрического ответа ( ~11 мкс) цитохрома ba3 соответствует константе скорости перехода AP в оптических измерениях и составляет ~ 6% от полной амплитуды ответа. Основная часть кинетики генерации потенциала (около 90%) образуется в третьей (~45 мкс, ~36%) и четвертой (~550 мкс, ~55%) электрометрических фазах, которые относятся, соответственно, к третьему и четвертому переходу в оптических измерениях.
Рисунок 16. Кинетика генерации мембранного потенциала (черная линия) в ходе реакции полностью восстановленной цитохромоксидазы ba3 с кислородом. Через экспериментальную кривую проведена теоретическая (серая линия). Параметры теоретической кривой: k1=190 мс-(амплитуда=0 мв), k2=90 мс-1 (0.69 мв), k3=21.9 мс-1 (4.33 мв), k4=1.84 мс-1 (6.55 мв), k5=0.56 мс-(0.35 мв). Условия: 100 мM HEPES (pH 8), 50 мM глюкоза, 50 мкг/мл каталаза, 120 мкг/мл глюкозоксидаза, 10% CO в смеси с аргоном. Реакция начиналась через 1.4 с после впрыска 1мкл насыщенного кислородом буфера.
Чтобы определить точное число зарядов, переносимых через мембрану на каждой вычленяемой в ходе измерения одного оборота фермента стадии, нами параллельно была исследована реакция обратного тока электронов в частично восстановленном ферменте.
Данная реакция представляет собой перенос электрона из BNC во входные редокс-центры после фотолиза окиси углерода в отсуствие кислорода. На рисунке 17 показана кинетика обратного переноса электрона в ba3 оксидазе, зарегистрированная с помощью оптической спектроскопии в полосе поглощения восстановленного гема a3 (445 нм, черная линия), и с помощью электрометрических измерений (серая линия). Кинетика изменения поглощения A445 начинается с неразрешаемого скачка, вызванного фотодиссоциацией CO от гема a3 и образованием несвязанного с лигандом восстановленного гема a3.
Последующее снижение поглощения с ~40 мкс отражает уход электрона с гема a3.
Учитывая соответствующие коэффициенты экстинкции при 445 нм для абсорбционных изменений, вызванных фотолизом CO и окислением гема a3 [Liao et al., 1996], величина фракции окисляющегося гема a3 составляет ~4.2%.
Образующийся параллельно трансмембранный потенциал (рис. 17, серая линия) отражает электрогенное перераспределение электронной плотности между гемом a3 в биядерном центре и CuA. Учитывая фракцию окисляющегося гема a3, амплитуду параллельной электрогенной транслокации заряда и геометрическое расстояние между биядерным центром и CuA, оказывается возможным оценить величину генерации мембранного потенциала в ЦО, соответствующую переносу одного заряда на всю толщину мембранного диэлектрика. Это позволило нам в конечном итоге рассчитать электрогенность отдельных разрешаемых кинетических фаз в реакции полностью восстановленной ЦО с кислородом в режиме одного оборота. Число зарядов, переносимых через мембрану, составило, соответственно, 0.15, 1.0, 1.68 заряда во второй, третьей и четвертой электрогенных компонентах [Siletsky et al., 2007].
Рисунок 17. Кинетика обратного переноса электрона в оксидазе ba3. Оптические изменения полосы поглощения восстановленного гема a3 (445 нм, черный цвет, ось справа) и паралельные электрометрические измерения (серый цвет, ось слева). Оптические измерения проводились на детергетном растворе фермента. Условия: 7 мкМ ba3 цитохромоксидаза, 0.1% додецил мальтозид, 0.1 M HEPES (pH 7.4), 1 атм CO, оптический путь 1 см. Условия электрометрических измерений как на рис. 16.
На рисунке 18 приведена схема интермедиатов и переходов между ними в каталитическом цикле цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, разрешаемых в кинетике окисления кислородом в режиме одного оборота. Сопряженная с образованием состояния P генерация мембранного потенциала в оксидазе ba3, эквивалентна по величине переносу заряда на ~15% толщины мембранного диэлектрика, что составляет около 4 и отражает электрогенное перемещение в биядерный центр протона, необходимого для разрыва кислород-кислородной связи. Донором протона служит, по-видимому, остаток тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина Y288 в аа3 оксидазах), образующий ковалентную связь со связанным с CuB остатком гистидина и располагающийся ниже CuB на соответствующем расстоянии от биядерного центра (рис. 18).
Соответствующая во времени переходу PF электрогенная стадия в оксидазе ba3, сопряжена с генерацией мембранного потенциала в результате транслокации в точности одного заряда через всю толщину мембранного диэлектрика и включает в себя перемещение электрона от CuA к гему b на 1/3 толщины мембранного диэлектрика и сопряженное перемещение протона из N-фазы к BNC на расстояние 0.6-0.7 толщины мембранного диэлектрика (рис. 18, [Siletsky et al. 2007]). Следовательно, в отличие от оксидаз семейства А, трансмембранной перекачки протона на данной стадии каталитического цикла ЦО ba3Цтипа не происходит.
Поскольку в быстрой кинетике окисления цитохромоксидазы ba3 в режиме одного оборота фермента не наблюдается образование состояния BNC с полосой поглощения ~580 нм, типичной для интермедиата F в оксидазах aa3 типа, это означает, что протон, переносящийся из N-фазы не достигает биядерного центра, а локализуется в конечном итоге в окрестности биядерного центра, не возмущая таким образом электронную структуру гема a3 и не влияя на его спектр [Siletsky et al., 2007]. Одним из наиболее вероятных акцепторов протона является консервативный остаток редокс-активного тирозина (Y237 в оксидазе ba3), который был депротонирован в ходе предшествующей стадии AP (рис. 18).
Рисунок 18. Схема интермедиатов каталитического цикла цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, разрешаемых в кинетике окисления кислородом в режиме одного оборота. Ромб и квадрат обозначают гемы b и a3 соответственно; круги - CuA и CuB. В начальном состоянии (R) все редокс-центры восстановлены (закрашены). Стадии переноса электрона и протонов обозначены пунктирными стрелками и указывают события, проиходящие на последующем этапе реакции.
Амплитуда электрогенного переноса зарядов в ЦО ba3-типа на стадии, соответствующей во времени FO переходу в ~1.7 раза выше, чем на предшествующей стадии и близка к таковому для FO перехода каталитического цикла в оксидазах семейства А [Jasaitis et al., 1999; Siletsky et al., 1999; Siletsky et al., 2007]. Суммарная транслокация зарядов в оксидазах обоих типов на стадии, соответствующей во времени переходу FO, включает в себя перенос двух протонов: субстратного (на величину ~0.от толщины мембраны) и помпируемого (с N-стороны на внешнюю сторону мембраны).
ОБСУЖДЕНИЕ Особенности общей организации сопряженного переноса протонов на отдельных стадиях каталитического цикла цитохромоксидазы Исходя из равновесных окислительно-восстановительных титрований редоксактивных групп ЦО считалось, что восстановительная часть каталитического цикла не сопряжена с трансмембранным переносом протонов (переходы OE и ER, рис. 19) и основная часть эндергонического процесса электрогенной перекачки протонов происходит в окислительной полуреакции (переходы PF и FO) [Babcock et al., 1992;
Wikstrom et al., 1989; Ferguson-Miller et al., 1996; Gennis, 1998; Vygodina et al., 1997].
Рисунок 19. Схема каталитического цикла цитохромоксидазы семейства А. Переходы от состояния R к OH образуют окислительную часть, в то время как переходы от OH к R - восстановительную часть каталитического цикла. Для окислительной фазы реакции приведена структура интермедиатов биядерного цикла, включая редокс-активный остаток тирозина.
Протоны, переносящиеся в ходе каталитического цикла через D- и K- протон-проводящие пути обозначены как HD+ и HK+, сооответственно. В случае отслеживания реакции с кислородом в исходно полностью восстановленной (4-мя электронами) ЦО обычное состояние P (PM на рисунке) не разрещается. При превращении интермедиата A радикал редокс-активного остатка тирозина ревосстанавливается вследствие переноса электрона от гема а с образованием состояния PR биядерного центра, обладающего сходным спектром поглощения с таковым для состояния PM.
В приведенных выше предстационарных измерениях, при инъекции электрона от Rubpy в находящуюся в обычном окисленном состоянии (O) цитохромоксидазу митохондрий, разрешенная во времени электрон-транспортная реакция ограничивается переносом электрона от СuA на гема а [Nilsson, 1992; Siletsky et al., 1999; Verkhovsky et al., 2001]. Биядерный центр не восстанавливается в миллисекундной временной шкале и чувствительные к цианиду электрогенные компоненты переноса протонов практически отсутствуют.
Данное явление можно было объяснить двояко. Либо модель, основанная на равновесных титрованиях ЦО верна и перенос всех помпируемых протонов сосредоточен в окислительной части каталитического цикла ЦО, либо используемое окисленное состояние ЦО функционально не активно и не участвует в каталитическом цикле.
Проведенное предстационарное исследование генерации мембранного потенциала мутантной оксидазой (N139D), полностью сохраняющей кислород-редуктазную активность и утрачивающей способность к трансмембранной перекачке протонов, позволило нам достоверно оценить электрогенность одноэлектронных переходов в окислительной фазе ЦО [Siletsky et al., 2004]. Учитывая перенос субстратного протона в BNC из внутренней водной фазы на расстояние (~0.62) толщины мембранного диэлектрика, дополнительный электрогенный вклад в одноэлектронном PF и FO переходе помпирующего фермента по сравнению с несопряженным мутантом, соответствует трансмембранному переносу ~ 0.9 (то есть всего одного) помпируемого протона.
Одновременно, в работах группы Верховского с временным разрешением было показано [Bloch et al., 2004; Belevich et al., 2007], что непосредственно после быстрого окисления восстановленной ЦО образуется коротко живущее окисленное состоянии OH., отличающееся по функциональным свойствам от обычного покоящегося окисленного состояния (O). Инъекция электрона с помощью Rubpy в метастабильное состояние OH.
cопровождается быстрым переносом электрона в биядерный центр и сопряженными стадиями электрогенной транслокации протонов [Bloch et al., 2004; Belevich et al., 2007;
Siletsky et al., 2009; Siletsky et al., 2011]. Характеристики электрогенных фаз, разрешенных в одноэлектронном переходе OHEH [Belevich et al., 2007], вцелом напоминают таковые для переходов в окислительной фазе и согласуются с трансмембранной перекачкой одного помпируемого протона, что дает основания полагать, что каждый из 4-х одноэлектронных переходов в ЦО, включая OHEH и наименее изученный, переход EHR, сопряжен с переносом одного помпируемого протона (рис. 20).
Общая организация механизма сопряженной перекачки протонов, по-видимому, имеет универсальные черты и в случае представителя эволюционно удаленного семейства B, цитохромоксидазы ba3 типа из T.thermophilus, несмотря на наблюдающуюся в стационарных измерениях дробную усредненную стехиометрию помпирования (0.5H+/e вместо 1H+/e). При использовании предстационарных измерений нами было установлено, что наблюдающаяся дробная cтехиометрия помпирования, является результатом того, что часть одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы ba3 не сопряжена с переносом помпируемых протонов и ограничивается электрогенной транслокацией субстратного протона, необходимого для протонирования интермедиатов восстановления кислорода.
В тоже время, разрешаемая электрогенная стадия цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, соответствующая во времени переходу FO ЦО из митохондрий, сопряжена с трансмембранным переносом в точности 1 помпируемого протона. Остается неизвестным происходит ли сопряженный перенос помпируемого протона на стадии переноса в BNC 2-го электрона (переход ER) в каталитическом цикле ЦО ba3 из T.thermophilus, а также в случае переноса 1-го электрона в окисленное состояние OH, образующееся непосредственно после окисления ЦО ba3Цтипа. Однако в совокупности с двукратным снижением усредненной стехиометрии помпирования в ЦО ba3-типа, имеющиеся результаты указывают на сопряженный трансмембранный перенос по одному помпируемого протону в двух из четырех одноэлектронных переходов каталитического цикла в этом ферменте.
Функциональная роль протон-проводящих каналов.
Электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидаз аа3-типа семейства А происходит через протон-проводящие структуры (D и К-каналы), содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы [Siletsky et al., 1996; Konstantinov et al., 1997; Siletsky et al., 2004; Siletsky et al., 2010]. При этом, участие протон-проводящих путей в проведении протонов разных типов на отдельных стадиях каталитического цикла организовано нетривиально (рис. 19).
Несмотря на то, что FO переход ЦО сопряжен с транслокацией протонов обоих типов, однако только мутации в D-канале (но не в К-канале) приводят к подавлению чувствительных к цианиду миллисекундных компонент генерации потенциала и, соответственно, электрогенного переноса протонов на стадии FO. В тоже время, спектральные характеристики гема а3 в мутантах по К-каналу (гем а3 остается в окисленном высокоспиновом состоянии в случае мутанта К362М) свидетельствуют о том, что торможение энзиматической активности в них обусловлено ингибированием восстановительной полуреакции каталитического цикла. Обнаружение несопряженной мутации N139D в D-канале, полностью утрачивающей способность к трансмембранной перекачке протонов, свидетельствует о том, что К-канал не участвует в проведении помпируемых протонов вовсе, в то время как D-канал обеспечивает перенос всех помпируемых протонов в каталитическом цикле: как в окислительной полуреакции, так и в восстановительной (рис. 19).
Роль К-канала ограничивается доставкой субстратных протонов в восстановительной полуреакции каталитического цикла. В подтверждение данной модели, в cтруктуре окисленной ЦО обнаружена УзащелкаУ в верхней части К-канала [Qin et al., 2009]. В кристаллах окисленной ЦО, в вершине К-канала, гидроксильная группа фарнезильного заместителя гема а3 и редокс-активный остаток тирозина связаны друг с другом водородной связью, отсутствующей в кристаллах восстановленной ЦО. Редокссопряженные конформационные изменения в структуре ЦО свидетельствуют таким образом о том, что верхняя часть К-канала закрыта в окислительной части и открывается в восстановительной части каталитического цикла ЦО, обеспечивая возможность переноса субстратных протонов в биядерный центр через него [Qin et al., 2009].
Последовательность элементарных событий, составляющих УсреднююФ и УмедленнуюФ протонные электрогенные стадии в одноэлектронном переходе ЦО Трансмембранная транслокация протона в отдельных одноэлектронных переходах окислительной фазы каталитического цикла ЦО (PF и FO) происходит засчет свободной энергии переноса электрона от гема а в биядерный центр фермента.
Исключительный редокс-центр в ферменте, редокс-превращения которого УпрямоФ сопряжены с транслокацией помпируемого протона выделить не удается. Сопряженный электрогенный транспорт в каждом из одноэлектронных переходов включает две кинетически разрешаемые стадии (УсреднююФ и УмедленнуюФ).
Разрешаемые в переходах PF и FO протонные электрогенные компоненты (УсредняяФ и УмедленнаяФ), характеризуются cоотношением наблюдаемых амплитуд ~1:3.
Использование модели двух последовательных кинетических стадий приводит к соотношению истинных амплитуд УсреднейФ и УмедленнойФ компонент, как ~1:1.(Материалы и методы, [Medvedev et al., 2005; Siletsky et al., 2006]). Относительная амплитуда УсреднейФ и УмедленнойФ электрогенных фаз для перехода FO в митохондриальном ферменте составляет в этом случае, ~1.9 и ~2.1 от величины УбыстройФ электрогенной фазы, что соответствует переносу двух протонов (субстратного и помпируемого) из внутренней водной фазы через большую часть мембранного диэлектрика в окрестность биядерного центра c минорным вкладом других сопряженных внутрибелковых перемещений заряда. Вероятным промежуточным донором протона, обеспечивающим проведение помпируемого и субстратного протонов является консервативный остаток E286 в верхней части D-канала, расположенный на расстоянии ~0.56 геометрической толщины мембраны от внутренней водной фазы (рис. 20, [Medvedev et al., 2005]). Электрогенное расстояние между остатком E286 и биядерным каталитическим центром составляет ~0.15 диэлектрической толщины мембраны ЦО [Siletsky et al., 2010].
В несопряженной ЦО с мутацией N139D происходит специфическое ингибирование УсреднейФ электрогенной фазы, в то время как ионы цинка, добавленные снаружи протеолиопосом тормозят УмедленнуюФ электрогенную фазу переноса протонов.
Следовательно, УсредняяФ электрогенная компонента ассоциирована с переносом помпируемого протона, в то время как УмедленнаяФ электрогенная фаза обусловлена электрогенным переносом субстратного протона в направлении биядерного центра [Siletsky et al., 2004], а также выходом помпируемого протона на внешнюю стороны мембраны. По-видимому, в УсреднейФ электрогенной фазе помпируемый протон в результате синхронного депротонирования и репротонирования E286 из внутренней водной фазы переносится к внешней поверхности мембраны и локализуется на некоем промежуточном акцепторе протона - т.н. протон-загрузочный сайт (PLS), располагающемся над биядерным центром, на пути выхода протона на P-сторону мембраны (рис. 20). Локализация PLS в точности неизвестна, однако наиболее вероятными кандидатами на роль PLS являются пропионатный заместитель A гема а3 и один из гистидиновых лигандов (H334) медного центра CuB.
Как показано на рисунке 20, набор частных стадий переноса зарядов, входящих в состав УсреднейФ электрогенной фазы, включает в себя: перенос электрона вдоль плоскости мембраны от гема a к гему a34+=O2- (стадия 3), электрогенный перенос H+ от остатка Е286 к первичному акцептору протона (PLS) и одно из последовательных электрогенных репротонирований остатка E286 из внутренней водной N-фазы через Dканал (стадии 2,4). Согласно данным рентгено-структурного анализа [Svensson-Ek et al., 2002], переносу протона от E286 к протон-акцептороному сайту (PLS), предположительно, предшествует стадия изомеризации E286 (рис. 20, стадия 1). УМедленнаяФ электрогенная протонная фаза включает в себя репротонирование остатка E286 (рис. 20, стадия 6), следующее за переносом от E286-COOH к кислород-восстанавливающему сайту протона, участвующего в химическом превращении кислорода. Кроме того, в УмедленнуюФ электрогенную фазу включено высвобождение протона из PLS на внешнюю сторону мембраны (рис. 20, стадия 7).
Отнесение стадии переноса субстратного протона от E286 в биядерный центр к УсреднейУ либо УмедленнойФ электрогенной фазе (рис. 20, стадия 5) остается до конца невыясненным. Завершение большей части процесса переноса электрона от гема а в BNC в переходах PF и FO митохондриальной ЦО синхронно со УсреднейФ фазой паралельной кинетики генерации мембранного потенциала может свидетельствовать об одновременном попадании электрона и субстратного протона в каталитический центр в ходе данной электрогенной фазы в основной части фермента. Наиболее вероятным донором субстратного протона в этом случае являются молекулы слабо связанной воды, расположенные между E286 и биядерным центром, либо непосредственно остаток E286 в D-канале.
Рисунок 20. На схеме приведены основные частные электрогенные стадии, разрешаемые при одноэлектронной фотоинъекции с помощью Rubpy в переходе FO (перенос 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы). Перед началом реакции гем а3 находятся в оксоферрильном состоянии (не показано). Узкие стрелки указывают направление переноса элетрона, в то время как широкие - стадии транслокации протонов. В ходе FO перехода оба протона (субстратный и помпируемый) переносятся через D-канал. Показаны ключевые аминокислотные остатки в D-канале (D132, N139, E286) и промежуточный протон-акцепторный сайт (PLS). В соответствии с данными рентгено-структурного анализа (Svensson-Ek et al. 2002) указаны две возможные конформации остатка E286 (E2861 и E2862). Предполагается, что изомеризация E286 предшествует переносу протона от E286 к протон-акцептороному сайту (PLS).
Целью дальнейшего изучения механизма сопряжения является выяснение того, каким образом происходит организованное и управляемое движение субстратного и помпируемого протонов между внутренним донором протонов (E286), промежуточным акцептором помпируемого протона (PLS) и каталитическим центром (BNC).
Теоретически, это может быть реализовано через изменения pK соответствующих промежуточных доноров и акцепторов протонов (E286, PLS и BNC) и/либо кинетических параметров переноса протонов между ними, возникающих вследствие сопряженных конформационных изменений в белке, формирования цепочек молекул воды между ними, электростатических эффектов при перемещении электрона через редокс-центры либо сочетания этих процессов.
В восстановительной полуреакции каталитического цикла ЦО кинетика генерации мембранного потенциала и переноса электрона через редокс-центры разрешена в группе Верховского в настоящее время только для OHEH перехода [Belevich et al, 2007], и характеризуется фазами электрогенного переноса протонов, напоминающими по скорости и амплитуде УсреднююФ и УмедленнуюФ протонные фазы в переходах исследованной нами окислительной полуреакции ЦО. В отличие от окислительной, в восстановительной полуреакции одновременно работают 2 протонных канала. Донором субстратного протона является К-канал, в то время как через остаток Е286 в D-канале переносится только помпируемый протон (рис. 18). Конечным акцептором электрона в OHEH переходе является CuB [Belevich et al., 2007; Siletsky et al., 2011].
Таким образом, механизм сопряжения и организации помпирования на отдельных стадиях каталитического цикла ЦО имеет как общие черты, так и некоторые отличия, вызванные различием в химии редокс-реакций в биядерном центре и участии протонных каналов в окислительной и восстановительной полуреакциях каталитического цикла.
Дальнейшая детализация структурных изменений ЦО в ходе каталитического цикла, точное установление промежуточной локализации протонов и кинетических параметров их перемещения является необходимой предпосылкой для глубокого понимания и формулирования более общих закономерностей механизма сопряженной транслокации протонов в цитохромоксидазе.
ВЫВОДЫ 1. Использование фотоактивируемых комплексов рутения в качестве донора электрона позволяет в предстационарном режиме исследовать отдельные стадии сопряженной транслокации электрона и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы с микросекундным временным разрешением, недоступном при использовании методов быстрого смешивания.
2. Общая организация стадий внутрибелкового электрогенного переноса зарядов в терминальных гем-медных оксидазах семейства А (митохондриальной цитохромоксидазе и цитохромоксидазе аа3 из R.sphaeroides) сходна. Восстановление цитохромом с входного редокс-центра, CuA, является неэлектрогенной реакцией. Перенос электрона от CuA к гему а (10-40 мкс) сопровождается генерацией мембранного потенциала, соответствующей транслокации отрицательного заряда с внешней стороны мембраны на ~1/3 толщины мембранного диэлектрика.
3. Перенос от гема а в биядерный кислород-редуктазный центр 3-го и 4-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидаз семейства А (переходы PF и FO, соответственно) сопряжен с трансмембранной транслокацией одного помпируемого протона и переносом из внутренней водной фазы к биядерному центру одного субстратного протона.
4. Сопряженный электрогенный перенос протонов в переходах PF и FO каталитического цикла цитохромоксидазы митохондрий включает две кинетически разрешаемые стадии. В первой стадии с 0.3 мс (PF) и 1 мс (FO), соответственно, происходит перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы к промежуточному акцептору протона, распологающемуся над биядерным центром. Вторая стадия (1.8 мс и 4.5 мс, соответственно) включает высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.
5. В каталитическом цикле цитохромоксидазы аа3 из R.sphaeroides, протонпроводящий D-канал служит для переноса всех помпируемых протонов, а также субстратных протонов на стадиях PF и FO переходов (перенос на кислород 3-го и 4го электронов, соответственно). Протон-проводящий K-канал необходим для переноса субстратных протонов из внутренней водной фазы в ходе восстановления биядерного центра первыми двумя электронами в каталитическом цикле.
6. Снижение вдвое эффективности протон-транслоцирующей функции цитохромоксидазы семейства B гем-медных оксидаз, ba3 из T.thermophilus, обусловлено отсутствием сопряженного трансмембранного переноса протона в части одноэлектронных стадий каталитического цикла, тогда как другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом ~1 протона.
7. Цитохромоксидаза семейства B гем-медных оксидаз, ba3 из T.thermophilus, отличается от оксидаз семейства А локализацией внутреннего акцептора протона в кинетическом интермедиате, соответствующем во времени состоянию F. В цитохромоксидазах семейства А перенос субстратного протона на этой каталитической стадии происходит в биядерный центр (к связанному с CuB гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе ba3 акцептор протона локализован вне биядерного центра.
8. При восстановлении низкоспинового гема b каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах.
1. Zaslavsky D.L., Smirnova I.A., Siletsky S.A., Kaulen A.D., Millett F. and Konstantinov A.A.
(1995) Rapid kinetics of membrane potential generation by cytochrome c oxidase with photoactive Ru(II)-tris-bipyridyl derivative of cytochrome c as electron donor. FEBS Lett. 359, 27-30.
2. Konstantinov A.A., Siletsky S. A., Mitchell D., Kaulen A. D., and R. B. Gennis (1997) The roles of the two proton input channels in cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides probed by the effects of site-directed mutations on time resolved electrogenic Intraprotein proton transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 9085-9090.
3. Siletsky S., Kaulen A. D., and Konstantinov A.A. (1999) Resolution of electrogenic steps coupled to conversion of cytochrome c oxidase from the Peroxy to the Ferryl-Oxo state.
Biochemistry 38, 4853-4861.
4. Siletskiy S.A., Soulimane T., Azarkina N., Vygodina T.V., Buse G., Kaulen A., and Konstantinov A. (1999) Time-resolved generation of membrane potential by ba3 cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus. FEBS Lett. 457, 98-102.
5. Azarkina N.A., Siletsky S.A., Borisov V.B., Wachenfeldt C., von Hederstedt L. and Konstantinov A.A. (1999) A cytochrome bb'-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168.
J.Biol.Chem. 274, 32810-32817.
6. Lee A., Kirichenko A., Vygodina T., Siletsky S.A., Das T.K., Rousseau D.L., Gennis R., Konstantinov A.A. (2002). Ca2+-binding site in Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase.
Biochemistry. 41, 8886-98.
7. Siletsky S.A., Pawate AS, Weiss K, Gennis RB, Konstantinov AA. (2004). Transmembrane charge separation during the ferryl-oxo -> oxidized transition in a nonpumping mutant of cytochrome c oxidase. J Biol Chem. 279, 52558-65.
8. Кузнецова С.С., Ацаркина Н.В., Выгодина Т.В., Силецкий С.А., Константинов А.А., (2005). Ионы цинка как ингибитор цитохром с оксидазы: две точки дейстивя на фермент.
Биохимия. 70, 160-170.
9. Siletsky S.A., Han D., Brand S., Morgan J.E., Fabian M., Geren L., Millett F., Durham B., Konstantinov A.A., Gennis R.B. (2006). Single-electron photoreduction of the P(M) intermediate of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta. 1757, 1122-32.
10. Mamedov M.D., Tyunyatkina A.A., Siletsky S.A., Semenov A.Y. (2006) Voltage changes involving photosystem II quinone-iron complex turnover. Eur Biophys J. 35, 647-54.
11. Siletsky S.A., Belevich I, Jasaitis A, Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane T., Verkhovsky M.I. (2007). Time-resolved single-turnover of ba3 oxidase from Thermus thermophilus. Biochim Biophys Acta. 1767, 1383-92.
12. Siletsky S.A., Belevich I., Wikstrom M., Soulimane T., and Verkhovsky M.I.. (2009) Timeresolved OH->EH transition of the aberrant ba3 oxidase from Thermus thermophilus. Biochim.
Biophys. Acta. 1787, 201-205.
13. Siletsky S.A., Zhu J., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (2010) Partial steps of charge translocation in the nonpumping N139L mutant of Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase with a blocked D-channel. Biochemistry 49, 3060-3073.
14. Siletsky S.A., Belevich I., Belevich N.P., Soulimane T., Verkhovsky M.I. (2011) Timeresolved single-turnover of caa3 oxidase from Thermus thermophilus. Fifth electron of the fully reduced enzyme converts O(H) into E(H) state. Biochim. Biophys. Acta 1807, 1162-1169.
15. Siletsky S.A., Konstantinov A.A. (2012) Cytochrome c oxidase: Charge translocation coupled to single-electron partial steps of the catalytic cycle. Biochim. Biophys. Acta. 1817, 476-88.
Тезисы конференций.
1. Siletsky S.A., Kaulen A.D., Mitchell D., Gennis R.B., Konstantinov, A.A. (1996) Resolution of two proton conduction pathways in cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 9, 90.
2. Mitchell D., Siletsky S.A., Kaulen A.D., Konstantinov A.A., Fetter D.A., Mills D.A., FergusonMiller S., Gennis R.B. (1996) The use of mutants to study the putative proton-conducting channels in the heme-copper oxidases. EBEC Short Reports (List of participant and late abstract), 3.
3. Siletsky S.A., Kaulen, A.D., Konstantinov, A.A. (1997) Electrogenic events associated with peroxy-to-ferryl-oxo state transition in cytochrome c oxidase. Eur. Biophys. J., 2nd European Biophysics Congress, 26, 98.
4. Siletsky S.A., Kaulen A.D., Konstantinov A.A., F-to-O transition of cytochrome c oxidase: pH and temperature effects on kinetics of charge translocation. Abstracts of the 18th Internatl.
Congress of Biochemistry and Molecular Biology, (2000), Birmingham, 457.
5. Siletsky S. Thomson F., Gennis R., Kaulen A.D., Konstantinov A. (2002) Time-resolved studies of intraprotein proton transfer in the D-channel mutants of Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 12, 114.
6. Khoroshyi P., Tenger K., Borovok N., Kotlyar A., Siletsky S., Zimanyi L. (2003) Electron transfer steps in cytochrome c and cytochrome oxidase. 10th European Conference on the spectroscopy of biological molecules, 153.
7. Kuznetsova S.S., Azarkina N.V., Vygodina T.V., Siletsky S.A., Konstantinov A.A. (2005) Cytochrome c oxidase inhibition by zink ions. УРоссийская биоэнергетика: от молекул к клеткеФ, Москва, МГУ, 48-49.
8. Siletsky S., Pawate A., Weiss K., Gennis R., Konstantinov A. (2005) Study of electrogenic proton transfer in cytocrhome c oxidase, УРоссийская биоэнергетика: от молекул к клеткеФ, Москва, МГУ, 60.
9. Siletsky, S.A., Weiss, K., Pawate, A.S., Gennis, R.B., Konstantinov, A.A. (2006) The intraprotein proton transfer in the D-channel mutants of Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 233.
10. Siletsky, S.A., Zaslavsky D., Simrnova I.A., Vygodina, T.V., Konstantinov A.A. (2006) Rapid kinetics of charge translocation by cytochrome c oxidase: transition between the feryl-oxo and ferric states. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 72.
11. Siletsky, S., Konstantinov, A.A. (2006) Electrogenic mechanism of cytochrome c oxidase. The 8th European Biological Chemistry Conference, EUROBIC 8, 2006, p.80.
12. Tyunyatkina, A.A., Siletsky, S.A., Semenov, A.Yu., Mamedov, M.D. (2006) Electrogenicity due to quinine-iron complex turnover. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 245.
13. I. Belevich, S.A. Siletsky, A. Jasaitis, A. Kronstantinov, M. Wikstrom, T. Soulimane, M.I.
Verkhovsky. (2008) Single-turnover of ba3 oxidase from Thermus thermophilus. Biochim. Biophys.
Acta, EBEC Short Reports, 1777, S73.
14. Siletsky S.A. Belevich I., Jasaitis A., Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane T., Verkhovsky M. (2008) Time-resolved study of ba3 cytochrome oxidase form Thermus thermophilus. V съезд Российского фотобиологического общества Международная конференция УПреобразование энергии света при фотосинтезеФ Пущино, 60.
15. I. Belevich, S.A. Siletsky, M. Wikstrom, T. Soulimane, M.I. Verkhovsky. (2009). Electron transfer during OH to EH transition of the aberrant ba3 oxidase from Thermus thermophilus. Eur.
Biophys. J. 38. S35, S212.