Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА ____________________________________________________________________ На правах рукописи
БОРИСОВ Виталий Борисович
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ ТИПА bd
03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2008
Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич
Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.
Защита состоится У17Ф ноября 2008 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан У____Ф ____________ 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Работа посвящена актуальной проблеме биохимии - изучению механизмов преобразования энергии у бактерий на молекулярном уровне.
Запасание энергии в дыхательной цепи аэробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса H+ или Na+ из цитоплазмы в периплазматическое пространство.
Создаваемая при этом на цитоплазматической мембране протон- или натрий-движущая сила используется клеткой для энергообеспечения основных типов работы: химической, осмотической, механической. В дыхательной цепи электроны по градиенту редокспотенциала последовательно передаются от НАДН на О2 с помощью нескольких ферментных комплексов. Терминальная оксидаза является концевым ферментным комплексом дыхательной цепи. Обнаружено два класса терминальных оксидаз: гем/Cu-содержащие ферменты и цитохромы bd. Про гем-медные оксидазы известно уже довольно много. В частности, с помощью рентгеноструктурного анализа удалось увидеть трехмерную структуру гем-медных оксидаз из сердца быка и ряда бактерий. Цитохром bd не имеет гомологии с геммедными оксидазами, не содержит меди, но способен генерировать мембранный потенциал.
По сравнению с гем-медными оксидазами, цитохром bd остается малоизученным ферментом.
Не известно, как устроен его активный кислородоредуктазный центр, является ли он биядерным; какие интермедиаты образуются в ходе его каталитического цикла; каков механизм образования мембранного потенциала, какие из частных каталитических стадий сопряжены с генерацией потенциала. Цитохром bd является ключевым энергопреобразующим дыхательным ферментом как у микроорганизмов, безвредных для человека и животных, так и у бактерий, вызывающих различные заболевания, среди которых дизентерия, пневмония, сальмонеллез, периодонтит, бруцеллез, брюшной тиф, туберкулез.
Замечена положительная корреляция между вирулентностью бактериальных патогенов, ответственных за эти болезни и уровнем экспрессии цитохрома bd. Именно поэтому изучение цитохромов bd представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и полезно с медицинской точки зрения. Полученные знания могут помочь созданию антибактериальных медицинских препаратов, используя в качестве мишени терминальные оксидазы bd-типа.
Цель и задачи исследования. Целью этой работы было изучение молекулярного механизма функционирования терминальных оксидаз типа bd. Особое внимание было уделено исследованию цитохромов bd из Escherichia coli и Azotobacter vinelandii. Требовалось понять, является ли наличие биядерного редокс-центра у терминальных оксидаз необходимым условием для восстановления кислорода до воды и если это так, то для какой из стадий каталитического превращения интермедиатов. Альтернативой могла бы быть необходимость наличия второго редокс-центра для переноса протонов через мембрану.
Таким образом, установление роли высокоспинового гема b595 у цитохрома bd представляет особый интерес. Ставилась задача выявить и охарактеризовать основные интермедиаты каталитического цикла фермента; понять, каким образом цитохром bd генерирует потенциал в отсутствие механизма трансмембранной перекачки помповых протонов; определить устройство и механизм функционирования его активного кислородоредуктазного центра.
Изучение механизма образования цитохромом bd мебранного потенциала помогает понять, как именно бактерии, включая патогенные штаммы, запасают энергию при недостатке кислорода и других неблагоприятных условиях. Кроме того, выявление общих черт и различий в механизме восстановления кислорода до воды у цитохрома bd и основных протон-транслоцирующих терминальных оксидаз помогает установить принципиальные компоненты протон-переносящей машины, присущей гем-медным концевым дыхательным ферментам.
Научная новизна работы. Впервые разработан удобный метод окисления цитохрома bd, что позволило провести систематическое исследование взаимодействия с лигандами не только восстановленного, но и окисленного фермента.
Обнаружено, что в окисленном ферменте, Н2О2 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Kd) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом b595. Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=O2-). Показано, что как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d. Кажущаяся Kd гема d с СО составляет 70-80 нМ.
Существенно новым результатом работы является то, что связывание СО с гемом b595 не превышает 6% даже при низких температурах. Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (~10 ) гемов b5и d, проявляющих антикооперативность в связывании лигандов.
Впервые идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема b595.
Удалось определить сродство цитохромов bd из E. coli и A. vinelandii к кислороду, а также измерить скорости связывания О2 с одноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd. В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2. Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер.
Предполагается, что MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать О2 может только в одном из них.
Впервые зарегистрирована быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента. Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема d (Fe3+ЦOЦOЦ(H)). Показано, что связывание восстановленного цитохрома bd с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии - переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными. Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом.
Измерены константы скорости спонтанной диссоциации O2, NО и СO от цитохрома bd в разных редокс-состояниях фермента. NO и СО диссоциируют из цитохрома bd гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз. Диссоциация этих лигандов из MV формы цитохрома bd замедлена в сравнении с R ферментом. Предполагается, что редокссостояние гема b595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из активного центра цитохрома bd.
На основании сравнительной характеристики мутантной формы фермента Е445А и цитохрома bd дикого типа предлагается модель внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd.
Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о свойствах и механизме функционирования терминального участка дыхательной цепи организмов и могут найти применение в исследованиях гемопротеинов дыхательной или фотосинтетической редокс-цепей.
Разработанный метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленное состояние может быть использован для окисления других гидрофобных редокс-ферментов, не взаимодействующих с традиционными акцепторами электронов типа феррицианида или персульфата. На основе цитохрома bd можно разработать биосенсоры О2, СО и NO.
Информация о структуре и функционировании активного центра цитохрома bd открывает возможности для использования оксидазы этого типа в качестве мишени при антибактериальной терапии.
Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинженерии и биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике.
Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 23-м, 26-м, 27-м, 29-м, 30-м и 32-м съездах Федерации европейских биохимических обществ - FEBS (Базель, 1995; Ницца, 1999; Лиссабон, 2001; Варшава, 2004; Будапешт, 2005; Вена, 2007), 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й и 14-й Европейских биоэнергетических конференциях - EBEC (Лёвен-ля-Нёв, 1996; Гётеборг, 1998; Сассекс, 2000; Аркашон, 2002; Пиза, 2004;
Москва, 2006), 2-м Европейском биофизическом конгрессе - EBSA (Орлеан, 1997), конференции Митохондрии, клетки и активные формы кислорода (Пущино, 2000), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов - IUBMB (Бирмингем, 2000), конференции Федерации европейских микробиологических обществ - FEMS Физиология, регуляция и биохимия электронного транспорта в катаболизме микробов (о.Терсхеллинг, 2001), 18-м Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Киото, 2002), 2-й Международной конференции Ферменты в окружающей среде: активность, экология и приложения (Прага, 2003), конференции Российская биоэнергетика: от молекул к клетке (Москва, 2005), 2-й Всемирной конференции по стрессу (Будапешт, 2007). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.
Белозерского МГУ.
Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых (1999), премии Биохимического Общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России (2000), премии им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИФХБ МГУ (2000), премии Академии наук высшей школы России (2000), премии в конкурсе молодых ученых МГУ (2001), премии Европейской академии для молодых ученых СНГ (2002) и премии им. И.И. Шувалова МГУ (2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 статьи в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 232 страницы, 84 рисунка и таблицы. Список литературы включает 291 источник.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проводили как на бактериальных субклеточных пузырьках, так и на изолированном ферменте, - солюбилизированном в детергенте либо встроенном в искусственную фосфолипидную мембрану (липосомы).
Штаммы бактерий. Использовали оксидазы bd-типа, полученные из Escherichia coli и Azotobacter vinelandii. Штамм GO105/pTK1 E.coli любезно предоставлен проф. Р.Геннисом (Иллинойский университет в Урбане-Шампейн, США); штамм MK8 A.vinelandii - дар проф.
Р.Пула (университет г. Шеффилда, Англия). Эти штаммы удобны тем, что за счет введения плазмиды с геном цитохрома bd обеспечивается суперпродукция изучаемого фермента.
Вдобавок, в штамме GO105/pTK1 E.coli проведена делеция в гене цитохрома bo3 (вторая терминальная оксидаза у E.coli), что дает возможность получения препарата цитохрома bd без примеси другой оксидазы. Кроме того, исследования проводили на мутантных ферментах из E.coli - Е445А и L65C. В мутантном ферменте L65C шесть эндогенных остатков цистеина заменены на серин либо аланин (субъединица I: C128A, C396S, C479A;
субъединица II: C214S, C301S и C358S); также в субъединицу I введен один добавочный цистеин (L65C). В мутантной оксидазе L65C отсутствует гем d, но сохраняются гемы b558 и b595.
Выращивание клеток. Клетки E.coli выращивали аэробно в ферментере (с контролируемой подачей О2), либо в колбах на качалке (с 200 об/мин) при температуре С. Среда выращивания состояла из 80 мM фосфата натрия, 2,5 мM цитрата натрия, 19 мM сульфата аммония, 1%-ного триптона, 0,5%-ного дрожжевого экстракта, 0,5%-ных казаминовых кислот, 0,01%-ного L-триптофана, 2%-ного глицерина, 0,8 мM MgSO4, 0,18 мM FeSO4Х7H2O, 0,1 мM CuSO4Х5H2O, 0,005%-ного канамицина, 0,01%-ного ампициллина, pH 7,2.
Клетки A.vinelandii выращивали аэробно в ферментере (с контролируемой подачей О2), либо в качалочных колбах на качалке (с 250-300 об/мин) при температуре 30 С. Состав среды выращивания: 6 мМ фосфат калия, 1,27 мМ сульфат натрия, 15 мМ ацетат аммония, 2%-ная сахароза, 3,3 мкМ CaCl2, 8,5 мкМ MgCl2, 0,33 мкМ FeSO4, 0,097 мМ Na2MoO4, 0,002%-ный рифампицин, 0,0001%-ный канамицин, pH 7,6.
За ростом клеток следили по увеличению мутности при 600 нм. Процесс культивирования обычно занимал 22-24 ч. На поздней логарифмической стадии клетки осаждали (5500 g, 10 мин, 4 С) и дважды промывали в среде, содержащей 172 мM NaCl, мМ фосфат натрия и AЭБСФ (на кончике шпателя), pH 7,5 (E.coli), либо 50 мM NaCl, 10 мМ фосфат калия, 1 мМ MgSO4 и AЭБСФ (на кончике шпателя), pH 7,5 (A.vinelandii).
Получение мембран. После промывки клетки E.coli суспендировали в среде, содержащей 20 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO4, 20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, рН 8,3. Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли AЭБСФ (на кончике шпателя), а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл). Суспензию дважды пропускали через пресс Френча (French Pressure Cell Press J5-598AE, American Instrument Company, division of travenol laboratories, Inc.) порциями по 35 мл. Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (14500 g, 15 мин, С). Из полученного супернатанта ультрацентрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, 4 С), которые затем гомогенизировали в среде требуемого состава.
После промывки клетки A.vinelandii суспендировали в среде, содержащей 20 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO4, 20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, рН 7,5.
Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли AЭБСФ (на кончике шпателя), либо спиртовой раствор фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 0,3 мМ, а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл). Суспензию пропускали один раз через пресс Френча порциями по 35 мл. Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (17600 g, 7 мин, 4 С). Из полученного супернатанта ультрацентрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, С).
Выделение фермента. Цитохром bd из E.coli выделяли и очищали по методу, описанному ранее Миллером и Геннисом [Miller and Gennis, 1986], с некоторыми модификациями. Размороженные мембраны E.coli гомогенизировали в среде для уравновешивания хроматографической колонки без детергента (50 мМ фосфат калия, 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, AЭБСФ, pH 6,5). К гомогенату добавляли монолаурат сахарозы до конечной концентрации 1,8% и инкубировали при перемешивании в бане со льдом в течение 2 ч. Суспензию центрифугировали (160000 g, 60 мин, 4 С), осадок отбрасывали, а супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-сефарозой Fast Flow, уравновешанную 50 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим также 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, и 0,1%-ный монолаурат сахарозы, pH 6,5. Колонку промывали 100 мл этого буфера при скорости тока 100-120 мл/ч и температуре 4 C (скорость тока задавали с помощью перистальтического насоса фирмы Pharmacia, Швеция), затем проводили элюцию градиентом KCl (25-350 мМ) при скорости тока 90-100 мл/ч. Собирали фракции объемом 7 мл (коллектор 2070 Ultrorac II фирмы LKB), регистрируя поглощение при 405 нм (спектрофотометр UA-5 с проточной ячейкой фирмы ISCO). Для дальнейшей работы отбирали фракции с соотношением оптических плотностей A412/A280 0,7. Эти фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией с помощью ячейки фирмы Amicon и фильтра типа YM-30.
Полученный раствор диализовали при 4 С против 50 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА и 0,05%-ный N-лаурилсаркозинат натрия, pH 7,0, с двукратной сменой буфера через каждые 5 ч. Иногда диализ заменяли гель-фильтрацией на колонке PD10 с Сефадекс G-25 (фирмы Pharmacia, Швеция).
Цитохром bd из A.vinelandii выделяли и очищали по методу, описанному ранее Джунеманн и Ригглсвортом [Junemann and Wrigglesworth, 1995], с незначительными модификациями. Мембраны гомогенизировали в 20 мМ трис/HCl буфере, содержащем мМ ЭДТА, 0,5 М KCl и AЭБСФ, pH 8,0; при этом концентрация белка составляла 10 мг/мл.
Гомогенат инкубировали 1 ч. при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (168000 g, 2 ч, 4 С). Супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 100 мМ калийфосфатном буфере, pH 7,2 (концентрация белка - 10 мг/мл). К суспензии добавляли 10%-ный раствор холата натрия (до конечной концентрации 2%) и оставляли на ночь при перемешивании. На следующий день полученную смесь центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 С). Супернатант отбрасывали, а осадок, дважды промывали в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), чтобы избавиться от следов холата натрия (режим центрифугирования был тем же - 45000 g, 15 мин, 4 С). Затем осадок суспендировали в том же фосфатном буфере (концентрация белка - 10-15 мг/мл) и добавляли n-додецил--D-мальтозид до конечной концентрации 1,5%. Суспензию инкубировали 1 ч. при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 С). Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли 4 М раствор сульфата аммония до 55%-ного насыщения при перемешивании в течение 2-3 минут. Суспензию инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 С). Осадок красного цвета отбрасывали, а к супернатанту желто-зеленого цвета добавляли сульфат аммнония (в сухом виде, предварительно измельченный) до 80%-ного насыщения при перемешивании в течение 2-минут. Полученную смесь инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 С). Плавающий осадок цитохрома bd осторожно извлекали и растворяли 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 0,02% nдодецил--D-мальтозид. Для удаления сульфата аммония применяли гель-фильтрацию на колонке PD10 с Сефадекс G-25.
Определение степени чистоты препарата. Степень чистоты препарата изолированного цитохрома bd определяли по содержанию гема d в пересчете на мг белка.
Это соотношение, как правило, составляло 6-7 нмолей гема d/мг белка.
Определение концентрации цитохрома bd. Концентрацию цитохромов bd дикого типа из E.coli и A.vinelandii определяли по разностным спектрам поглощения (восстановленные дитионитом минус локисленные на воздухе), используя значения миллимолярных коэффициентов экстинкции 628-607 = 10,8 мМ-1см-1 [Borisov et al., 1999] и 628-605 = 9,5 мМ-1см-1 [Belevich et al., 2007b] для ферментов из E.coli и A.vinelandii, соответственно. Концентрацию мутантного цитохрома bd Е445А из E.coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение 628-670 = 25 мМ-1см-1 [Belevich et al., 2005b]. Концентрацию мутантного цитохрома bd L65C из E.coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение 531 = 9 мМ-1см-1 для -полосы гема b558, измеренное относительно опорной линии, соединяющей точки при 505 и 544 нм [Arutyunyan et al., 2008].
Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли по методам Лоури [Lowry et al., 1951] и Брэдфорд [Bradford, 1976] используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
Определение концентрации СО, NO и О2. Концентрацию СО и NO определяли, принимая растворимость этих газов в воде при 20 С и атмосферном давлении равной 1 мМ и 2 мМ, соответственно [Anderson and Antonini, 1968; Brunori et al., 1974; Brunori et al., 1997].
Концентрацию О2 в воздухе, уравновешанной с воздухом воде и насыщенной кислородом воде при 21 С принимали равной 8,6 мМ, 278 мкМ и 1,32 мМ, соответственно [Montgomery et al., 1964].
Встраивание цитохрома bd в липосомы. Цитохром bd встраивали в липосомы двумя методами. На начальном этапе исследований использовали диализный метод Рэкера [Racker, 1972] с некоторыми модификациями. На более поздних этапах исследования стали применять более простой и эффективный метод Риго (Bio-Вeads) [Rigaud et al., 1995], который успешно зарекомендовал себя в опытах на хинолоксидазе типа bo3 [Verkhovskaya et al., 1997].
Метод Рэкера. Всю процедуру встраивания проводили в бане со льдом. Азолектин (40 мг/мл) диспергировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 2%-ный холат натрия и 2 мМ MgSO4, рН 7,5. После этого суспензию продували аргоном в течение 10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления. Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 2-4 раза по 20-30 с на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при токе 0,4 А и частоте 22 кГц до полного ее просветления. Озвучивание проводили в ледяной бане с NaCl (температура -15) для предотвращения перегрева. После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd, так, чтобы соотношение белка и липида составляло 1:40 и диспергировали под током аргона. Для удаления холата смесь подвергнутых ультразвуковой обработке липидов и фермента диализовали против 300-5объемов того же буфера, в котором проводили озвучивание, но не содержащем холата, с двукратной сменой буфера.
Метод Риго. Азолектин (8 мг/мл) диспергировали в 200 мМ Hepes-KOH буфере, содержащем 55 мМ n-октил--D-глюкозид, рН 7,4. После этого суспензию продували аргоном в течение 5-10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления. Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 3 раза по 20-30 с (с 1 мин перерывами) на ультразвуковом дезинтеграторе до полного ее просветления. Озвучивание проводили в ледяной бане для предотвращения перегрева. Все дальнейшие процедуры встраивания проводили при комнатной температуре. После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd до конечной концентрации 0,2 - 0,8 мкМ и перемешивали в течение 15 мин. После этого к суспензии добавляли предактивированные гранулы SM2 Bio-Beads фирмы УBio-RadФ (80 мг гранул сырого веса/мл), инкубировали мин при перемещивании и затем вносили вторую порцию 80 мг/мл Bio-Beads. Вслед за новым 30 мин перемешиванием добавляли третью порцию 160 мг/мл Bio-Beads. Такое же количество гранул Bio-Beads вносили еще через 1 час перемешивания. После этого смесь инкубировали при перемешивании еще 2 часа для полного удаления детергента. Жидкую фазу, содержащую протеолипосомы, осторожно изымали пипеткой с тонкой насадкой, не пропускающей гранулы Bio-Beads.
Амперометрия. Определение дыхательной активности. Потребление Oпрепаратами цитохрома bd определяли амперометрически при помощи закрытого электрода типа Кларка на полярографе LP 7e фирмы УLaboratorni pristrojeФ (Чехословакия). На платиновый электрод подавали напряжение 0,6 В; ток регистрировали на связанном с полярографом самописце УServographФ Rec 80Ф фирмы УRadiometerФ (Дания). Раствор в измерительной ячейке, рабочий объем которой составлял 1,1 мл, термостатировали при 25 С и интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Среда измерения активности субклеточных пузырьков содержала 50 мМ трицин, 50 мМ K2SO4, 10 мМ MgSO4, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0. Активность выделенного цитохрома bd определяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0), включающем также 40 мкМ ЭДТА и детергент: 0,05%-ный Nлаурилсаркозинат натрия (для фермента из E.coli), либо 0,02%-ный n-додецил--D-мальтозид (для фермента из A.vinelandii). В качестве субстратов использовали 250 мкМ убихинол-1 с мМ дитиотреитолом либо 4-5 мМ аскорбат с 0,1-0,5 мМ ТМФД. Реакцию начинали добавлением убихинола-1 или ТМФД. Во всех случаях отдельно регистрировали скорость самоокисления субстратов, которую учитывали при расчете удельной активности.
Амперометрические измерения в присутствии NO и О2. Метод амперометрии применяли также для изучения взаимодействия цитохрома bd с NO как без кислорода, так и в присутствии разных его концентраций в среде измерения. Для этого использовали специальные О2- и NO- электроды (ISO2 и ISO-NO MarkII, World Precision Instruments, Сарасота, США) встроенные в одну и ту же полярографическую ячейку и соединенные с компьютером, что позволяло одновременно следить за изменением концентрации О2 и NO в пробе [Borisov et al., 2004].
Электрометрия. Быструю кинетику образования разности потенциалов бактериальным ферментом на мембране протеолипосом регистрировали прямым электрометрическим методом с разрешением 100 нс [Drachev et al., 1979; Drachev et al., 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах с цитохромоксидазой [Jasaitis et al., 1999; Verkhovsky et al., 1997]. На отверстие (d=4 мм), разделяющее два отсека тефлоновой ячейки для электрометрических измерений, наносили пленку, смоченную в декановом растворе фосфолипида. Ячейку заполняли 100 мМ бис-трис-пропан/HCl буфером, рН=7,0. В один из отсеков ячейки вносили липосомы с оксидазой, добавляли в оба отсека мМ CaCl2 и инкубировали 1,5-2 часа при постоянном перемешивании. В этих условиях липосомы со встроенным ферментом сорбировались на поверхности мембраны, разделяющей два отсека ячейки. После инкубации липосомы, не связавшиеся с мембраной, удаляли путем замены объема ячейки с помощью перистальтического насоса, и оба отсека заполняли конечной буферной средой для измерений (100 мМ MOPS/KOH, рН = 7,0).
Электрометрическую ячейку помещали в газонепроницаемый футляр, уравновешивали с атмосферой аргона и для достижения полного анаэробиоза добавляли 50 мМ глюкозу, мкг/мл каталазу, 130 мкг/мл глюкозоксидазу. Затем пробу инкубировали в атмосфере СО. В опытах по взаимодействию восстановленого цитохрома bd с кислородом в ячейку добавляли также 10 мкМ ТМФД. Требуемое количество кислорода впрыскивали в виде насыщенного О2 буферного раствора, используя управляемый компьютером насос со шприцем (SP200i, World Precision Instruments, Англия) и присоединенную к шприцу длинную иглу (22S RN, Hamilton). Струя от иглы была направлена на измеряющую мембрану, что создавало высокую локальную концентрацию кислорода во время реакции. Разность потенциалов в отсеках регистрировали при помощи защищенных от света хлор-серебряных электродов (World Precision Instruments, Англия). Изучаемые реакции запускали лазерной вспышкой (YAG лазер Quantel Brilliant, мощность вспышки 180 мДж), вызывающей фотодиссоциацию СО из фермента.
Методы спектроскопии. Регистрация изменений поглощения. Поглощение регистрировали на соединенных с компьютером двухлучевых/двухволновых спектрофотометрах Aminco-SLM DW-2000, Cary 300 UV-Vis, Shimadzu UV-vis 1601, Jasco V550, Unisoku Instruments (Киото, Япония), HR2000+ (Ocean Optics Inc., США). Использовали кюветы различных типов с длиной оптического пути 0,1-1 см. Регистрацию быстрой кинетики взаимодействия цитохрома bd с лигандами методом быстрого смешивания первоначально осуществляли с использованием приставки к Aminco DW-2 Aminco-Morrow J4-9602 Stopped flow. Впоследствии стали использовать спектрофотометр с диодной матрицей (DX.17MV, Applied Photophysics, Leatherhead, Великобритания), позволяющей записывать с миллисекундным временным разрешением спектры поглощения фермента целиком (350-800 нм), а не по отдельным точкам, как в случае приставки Aminco-Morrow. В опытах по взаимодействию фермента с кислородом применили установку по быстрому смешиванию с матрицей DV420-UV-FK (Andor Technology, Белфаст, Северная Ирландия), что позволило записывать спектры поглощения целиком с интервалом 1 мкс (детальное описание установки можно найти в работе [Belevich et al., 2007a]). Для исследования быстрых изменений поглощения света фоточувствительными комплексами частично или полностью восстановленного цитохрома bd с лигандами проводили эксперименты по фотолизу лазерным светом с использованием следующих подходов: (1) Для изучения вызываемых светом спектральных изменений и их рекомбинации в микро/миллисекундной временной шкале была задействована неодимовая лазерная установка YAG (Quantel 481, вторая гармоника, длина волны 532 нм, длительность импульса 15 нс, мощность вспышки 40-120 мДж) [Azarkina et al., 1999]. Мониторный свет от галогеновой лампы мощностью Вт попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора фирмы Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм. Пройдя через образец, свет поступал через призменный монохроматор на фотоумножитель. Отцифровка сигнала с фотоумножителя происходила с помощью аналого-цифрового преобразователя DL-1080 (Datalab, Англия).
Далее сигнал поступал в компьютер. Для увеличения отношения сигнал/шум проводили накопление 50-250 кривых с интервалом 5 с. Возбуждающий свет с помощью отражающего зеркала подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света перпендикулярно последнему. (2) Для исследования сверхбыстрых процессов (фемто/пикосекунды) применяли фемто/пико-секундную лазерную абсорбционную спектроскопию [Martin and Vos, 1994], которая позволяла записывать непрерывные спектры поглощения как в полосе Соре, так и в видимой области. Длина волны возбуждения находилась в области 590 нм, 620 нм либо 655 нм, что давало возможность следить за поведением отдельных гемовых центров в фемто-пикосекундном временном интервале [Vos et al., 2000]. (3) Наносекундная лазерная спектроскопия отличается очень высоким оптическим разрешением (0,00001 OD). Сочетание вышеупомянутых подходов позволило наблюдать за динамикой поведения редокс-центров цитохрома bd во всем значимом для поставленных целей и задач временном диапазоне - от нескольких фемтосекунд до нескольких часов.
Низкотемпературная абсорбционная спектроскопия. Изучение взаимодействия восстановленного цитохрома bd с СО при низких температурах (в основном от -70 до -1С) проводили как описано в работах [Borisov et al., 2001; Chance et al., 1975; Kalnenieks et al., 1998; Poole et al., 1994]. Типичный эксперимент выглядит следующим образом. Выделенный фермент, содержащий 30%-ный этиленгликоль, восстанавливали в кювете с оптическим путем 2 мм (общий объем - 1 мл) в течение 15 мин небольшим количеством сухого дитионита натрия, либо 10 мМ аскорбатом/50 мкМ ТМФД в течение 25 мин, и затем образец продували СО в течение 2 мин при комнатной температуре. После этого кювету с образцом в условиях полной темноты переносили в термос, содержащий смесь сухого льда с этанолом при -78 С и быстро замораживали. Фотолиз СО проводили с помощью освещения образца сфокусированным лучом от 150-Вт вольфрамовой лампы в течение 3 мин, после чего регистрировали во времени разностные спектры поглощения (против записанной прежде и хранящейся в памяти базовой линии). Параллельно готовили и замораживали образец восстановленного фермента без СО, чтобы иметь базовую линию для слежения за изменениями поглощения при связывании СО с ферментом и для сравнения с соответствующими спектральными изменениями, индуцированными фотодиссоциацией СО от цитохрома bd.
Спектроэлектрохимическое редокс титрование цитохрома bd проводили с помощью оптически прозрачной тонкослойной электродной ячейки (OTTLE). В ходе как окислительного, так и восстановительного титрования устанавливали потенциалы с шагом 20 мВ в диапазоне от -100 до +450 мВ (относительно стандартного водородного электрода) с использованием потенциостата PAR263A (Princeton Applied Research). На каждом шаге потенциала определяли начало установления равновесия на рабочем электроде. Двухслойная сеточка из золота (Buckbee-Mears Europe GmbH, Германия) служила в качестве рабочего электрода. В качестве измеряющего электрода использовали платиновую проволоку, погруженную в раствор 3 M KCl; хлор-серебряный электрод являлся электродом сравнения.
В качестве редокс-медиаторов использовали гексааминорутений (Eс = +50 мВ), пентааминопиридинрутений (Eс = +250 мВ) и ферроценилэтанол (Eс = +430 мВ); все - в концентрации 200 мкМ.
Измерение МКД и КД. Регистрацию спектров МКД проводили при комнатной температуре в кюветах с оптическим путем 10 мм на соединенном с компьютером дихрографе, сконструированном А.М.Арутюняном (Москва). Спектр МКД получали, вычитая из спектра, записанного в прямом поле, таковой в обратном поле (Н 0,7 Т).
Спектры КД записывали с помощью соединенного с компьютером дихрографа Mark V (Jobin Yvon, Франция).
Спектроскопия ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре ESP-300 фирмы Bruker. Частота модуляции 100 кГц. Температуру образца контролировали с помощью криостата с жидким гелием ESR 900 и температурного контроллера ITC4 (Oxford Instruments). Данные ЭПР корректировали, вычитая контрольную пробу (сигнал ЭПР трубки с буфером). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 2 мВт, СВ частота 9,4ГГц, амплитуда модуляции 1,2 мТл, температура 12 K.
Обработка данных. Обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием программ GIM (Scientific Graphic Interactive Management System, разработана А.Л. Драчевым в НИИФХБ МГУ), Discrete [Provencher, 1976], MatLab (MathWorks Inc., США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd., Англия), Origin 7.(OriginLab Corporation, США). Спектры КД и МКД анализировали с использованием программ RDA и WTEST, разработанных И. Хоменковым и А.М. Арутюняном (Москва).
Определение кажущейся константы диссоциации комплекса гема d с кислородом (Kd(O2)) в одноэлектронной форме цитохрома bd. Выделенный цитохром bd в аэробных условиях находится преимущественно в форме оксикомплекса, где гем d восстановлен и связан с О2. Чтобы определить Kd(O2), вначале получали одноэлектронную форму фермента без связанного кислорода. Для этого образец помещали в газонепроницаемую кювету флуоресцентного типа (кювета прямоугольной формы; общий объем - 11,8 - 14,6 мл; объем, занимаемый образцом - 0,35 - 0,5 мл; внутренние размеры - 4 x 10 мм), приспособленную для соединения с газовой/вакуумной линией. С помощью последней образец переводили в атмосферу аргона [Belevich et al., 2005a]. Об удалении кислорода с гема d судили по смещению полосы поглощения гема d - от 645 нм до 629 нм. Затем проводили титрование анаэробного одноэлектронного фермента возрастающими добавками воздуха. Воздух добавляли в виде газа или уравновешанной с воздухом воды. Концентрацию О2 в воздухе и уравновешанной с воздухом воде при 21 С принимали равной 8,6 мМ и 278 мкМ, соответственно [Montgomery et al., 1964]. Обычно эксперимент ставили следующим образом:
Порцию воздуха вносили против тока аргона с помощью газонепроницаемого микрошприца с длинной иглой непосредственно на дно кюветы (в жидкую фазу). Затем кювету перемешивали путем качания до тех пор, пока не устанавливалось равновесие между жидкой и газовой фазами. За наступлением равновесия следили по степени интенсивности полосы поглощения при 648 нм, то есть кислород распределялся между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения, примерно равным 31. Поскольку концентрация О2 и объем газовой фазы кюветы были намного выше таковых жидкой фазы, газовая фаза над образцом служила в качестве кислородного буфера, поддерживая концентрацию кислорода в жидкой фазе.
Значение Kd(O2) определяли в соответствии с уравнением:
[O2] 2+ [d - O2] =, (Kd +[O2]) где: [d2+-O2] - фракция оксикомплекса гема d; [O2] - концентрация свободного (несвязанного) кислорода в растворе образца.
Определение кажущейся константы диссоциации (Kd) комплекса гема d с СО.
Кажущуюся Kd комплекса гема d с СО определяли по формуле:
K1 [Mb - CO]([d]o -[d - CO]) K2 =, [d - CO]([Mb]o -[Mb - CO]) где: K1 - кажущаяся константа диссоциации для комплекса миоглобина с СО, K2 - кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с СО, [d]о - общая концентрация цитохрома d, [Mb]о - общая концентрация миоглобина, которую определяли из 579-594 = 6,4 мМ-1см-1 для разностного спектра (карбоксимиоглобин (Fe2+-СО) минус деоксимиоглобин (Fe2+)), 435-4= 121 мМ-1см-1 для абсолютного спектра востановленного миоглобина (деоксимиоглобина), а также из 502-600 = 10,2 мМ-1см-1 для абсолютного спектра окисленного миоглобина (Fe3+), значения для Mb взяты из работы Вуда [Wood, 1984], [Mb-CO] - концентрация комплекса миоглобина с СО, которую определяли как [Mb]о(А579-594 x мкМ СО)/(А579-594 1 мМ СО), А брали из разностного спектра (СО+восстановленный минус восстановленный), [d-CO] - концентрация комплекса гема d с СО, которую определяли как [d]о(А643-623 x мкМ СО)/(А6431 мМ СО ), А рассчитывали из разностного спектра (СО+восстановленный минус 6восстановленный), [CO]о - концентрация добавленной окиси углерода.
Обработка кривых титрования CO спектральных изменений цитохрома bd.
Кривые титрования СО спектральных изменений восстановленного дитионитом цитохрома bd обрабатывали в программе GIM по формуле:
A = 0,5 (Kd +[d]o + [CO]o - (Kd +[d]o +[CO]o)2 - 4 [d]o [CO]o ), где: А - А644-624, разность поглощения восстановленного дитионитом цитохрома bd в присутствии и отсутствие СО, - коэффициент экстинкции комплекса гема d с СО (644-624), Kd - кажущаяся константа диссоциации комплекса гема d с СО, [d]о - общая концентрация цитохрома d, [CO]о - концентрация добавленной окиси углерода. При обработке кривых титрования и Kd задавали в качестве параметров.
Определение кажущейся константы диссоциации (Kd) комплекса гема d с Н2O2.
Кажущуюся константу диссоциации комплекса гема d с Н2O2 рассчитывали в программе GIM по формуле:
[d ]о [H2O2 ]о A =, Kd + [H2O2 ]о где: А - А680, которую измеряли относительно опорной линии, соединяющей точки разностного спектра цитохрома d (обработанный Н2O2 минус окисленный BQCl4); - коэффициент экстинкции для комплекса гема d с Н2O2 (680); Kd - кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с Н2O2; [d]о - общая концентрация цитохрома d; [Н2O2]о - концентрация добавленной перекиси водорода.
РЕЗУЛЬТАТЫ ОКИСЛЕНИЕ ГЕМА d Цель - найти способ быстрого и эффективного окисления цитохрома bd.
Изолированный цитохром bd обнаруживает интенсивную полосу поглощения с максимумом при 648 нм, которая характеризует оксикомплекс восстановленного гема d (d2+O2) (рис. 1, спектр 1). Какие-либо признаки восстановления гемов b558 и b595 отсутствуют.
Таким образом, выделенный фермент находится большей частью в оксигенированном состоянии b5583+ b5953+ d2+ -O2. Окислители феррицианид калия и персульфат аммония не изменяют исходный спектр цитохрома bd (рис. 1, спектры 2 и 3). Данный факт указывает на неспособность этих веществ разрушить оксикомплекс гема d, несмотря на то, что они являются весьма эффективными акцепторами электронов. Ввиду того, что субстратом оксидазы bd-типа служит липофильный хинол, можно ожидать, что активный центр фермента находится в гидрофобном окружении и потому плохо взаимодействует с заряженными донорами и акцепторами электронов вроде феррицианида или персульфата.
Мы предположили, что гидрофобные окислители соответственно могли бы более эффективно окислять гем d.
Рис. 1. Действие различных окислителей на оксикомплекс цитохрома bd E.coli.
Приведены абсолютные спектры: 1 - без добавок, 2 - 30 мин с 0,2 мМ K3[Fe(CN)6], 3 - 30 мин с 0,1 мМ персульфатом аммония, 4 - 1 мин с 15 мкМ ФМС, 5 - мин с 15 мкМ BQ, 6 - 20 мин с 40 мкМ феррицинием и 0,1 мМ персульфатом аммония, 7 - 1 мин с 16 мкМ BQCl4.
Действительно, при добавлении таких липофильных акцепторов электронов, как феррициний или BQCl4 наблюдается исчезновение интенсивной полосы при 648 нм в абсолютном спектре поглощения фермента, что говорит о распаде оксикомплекса и окислении гема d. Инкубация гемопротеина с BQ или ФМС также приводит к частичному разрушению оксикомплекса. Среди исследованных липофильных акцепторов электронов BQCl4 оказался наиболее эффективным. Довольно хорошо действует также феррициний, особенно в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония. Окисление оксикомплекса гема d BQCl4 происходит достаточно быстро (kэф = 6104 М-1с-1). Феррициний действует примерно в 300 раз медленнее (kэф = 2102 М-1с-1). BQ и PMS вызывают лишь частичное окисление оксикомплекса, но действуют довольно быстро (kэф соответственно около 103 и 104 М-1с-1).
Ингибитор хинолоксидазной активности цитохрома bd пентахлорофенол сильно тормозит окисление оксикомплекса гема d как BQCl4, так и феррицинием. Такое наблюдение свидетельствует о том, что гидрофобные акцепторы окисляют цитохром d через хинолоксидазный центр.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С H2OЦель - определить, какие из трех гемовых центров цитохрома bd взаимодействуют с H2O2 и какие спектрально различимые интермедиаты при этом образуются.
Описанный нами метод перевода цитохрома bd в полностью окисленное состояние позволил исследовать взаимодействие H2O2 с окисленной формой фермента. При добавлении H2O2 к оксикомплексу цитохрома bd регистрируется разностный спектр с максимумом при 680 нм и минимумом около 650 нм. Форма этого спектра схожа с таковой "перекисного состояния" комплекса bd, описанного Лоренсом и Геннисом [Lorence and Gennis, 1989].
Перекись водорода, добавленная к окисленному BQCl4 или феррицинием цитохрому bd, также вызывает появление пика при 680 нм. Форма разностного спектра (обработанный H2Oминус окисленный) напоминает спектр так называемого "перекисного интермедиата", описанного в работе Лоренса и Генниса [Lorence and Gennis, 1989] и остается постоянной во всем исследованном нами диапазоне концентраций H2O2, 5 мкМ-5 мМ. Разность между спектрами продуктов взаимодействия H2O2 с оксигенированной и полностью окисленной формами фермента близко напоминает разность между спектрами окисленного и оксигенированного цитохрома bd. Таким образом, добавление H2O2 как к оксигенированному, так и полностью окисленному ферменту приводит к возникновению интермедиата с максимумом при 680 нм.
При добавлении H2O2 к полностью окисленной форме фермента в разностном спектре поглощения также регистрируется неглубокий провал с минимумом около 740 нм, обусловленный исчезновением полосы переноса заряда высокоспинового окисленного гема d (рис. 2). В предшествующих работах исследования взаимодействия перекиси водорода с цитохромом bd ограничивались видимой областью спектра поглощения. Мы обнаружили, что увеличение экстинкции при 680 нм в спектре окисленного цитохрома bd под действием H2Oсопровождается спектральными изменениями и в полосе Соре. При внесении в образец H2Oв -области возникает разностный спектр с пиком при 440 нм и провалом в области 405-4нм, соответствующий длинноволновому сдвигу полосы Соре (рис. 2). Изменения поглощения в Соре и при 680 нм сравнимы по величине, тогда как в случае гемов типа a, b или c ответы в -области, как правило, в 5-10 раз больше, чем в видимом диапазоне длин волн [Poole, 1988].
Это указывает на то, что вызываемые перекисью водорода оптические изменения в области полосы Соре, сопутствующие возникновению максимума при 680 нм, принадлежат гему d.
Рис. 2. Сопоставление вызываемых H2Oспектральных ответов цитохрома bd E.coli в видимой области и полосе Соре.
Фермент прединкубировали 5 мин с мкМ BQCl4. Представлены разностные спектры, записанные через 5 мин после добавления 40 мкМ (а) и 0,5 мМ H2O2 (б).
Кривая титрования спектральных изменений цитохрома bd при 680 нм перекисью водорода имеет вид изотермы адсорбции. Величина кажущейся константы диссоциации (Kd) составляет 30-40 мкМ. Изучение кинетики взаимодействия H2O2 с окисленным цитохромом bd проводили с использованием метода быстрого смешивания. На рис. 3 представлена типичная кривая при конечной концентрации H2O2 после смешивания 5 мМ. Обнаружено, что скорость реакции удовлетворительно описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой и возрастает пропорционально увеличению концентрации H2O2 (рис. 3, вставка). Значение константы скорости второго порядка для цитохрома bd составляет 600 М-1с-1.
Рис. 3. Кинетика реакции H2O2 с окисленным цитохромом bd.
Цитохром bd прединкубировали мин с 28 мкМ BQCl4 с последующим быстрым смешиванием с H2O2 (конечная концентрация после смешивания - 5 мМ). Кинетику реакции отслеживали при 680 нм относительно 720 нм. Вставка:
зависимость константы скорости реакции первого порядка от [H2O2].
Таким образом, мы установили, что перекись водорода, добавленная к окисленному цитохрому bd, взаимодействует исключительно с гемом d3+, переводя его в оксоферрильную форму (d4+=O2-).
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛОСЫ СОРЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЕМА b5 Цель - вычленить индивидуальную полосу Соре восстановленного гема b595 из спектра цитохрома bd методом фемто/пикосекундной спектроскопии.
На рис. 4 представлены изменения в области Соре спектра поглощения полностью восстановленного несвязанного с лигандами цитохрома bd, вызванные возбуждением при 590 нм, - вблизи максимума -полосы восстановленого гема b595. В течение первых 0,5 пс в разностном спектре наблюдается падение поглощения при 438 нм. Затем это выцветание полосы частично обращается и абсорбционные изменения трансформируются в УкрасныйФ сдвиг полосы при 440 нм в пикосекундной временной шкале. Глобальный компьютерный анализ (global fitting) полученного массива спектров выявляет две основные фазы фотовыцветания с 460 фс и 4 пс. В принципе, субпикосекундные спектральные компоненты должны включать вклад поглощения возбужденного состояния. Однако, для субпикосекундных спектральных компонентов (к примеру, для 460-фс компонента полностью восстановленного цитохрома bd) такое поглощение не велико и сильно смещено в УкраснуюФ область, поэтому оно не оказывает существенного влияния на форму спектра выцветания основного состояния. Однако таким вкладом уже нельзя пренебречь для более медленного компонента возбужденного состояния, который демонстрирует отчетливый спектральный сдвиг. (см. рис. 4, спектры при 1,4 и 2 пс).
полностью восстановленный фермент возбуждение при 590 нм Рис. 4. Спектральные изменения во времени, вызванные фемтосекундным возбуждением полностью восстановленного цитохрома bd E.coli при 590 нм.
A=0,0Разностные спектры были 330 фс записаны против стационарной 600 фс формы R в указанные временные 870 фс 1.4 пс интервалы после 2 пс 4фотовозбуждения.
410 420 430 440 4Длина волны, нм На рис. 5 показан 460-фс спектральный компонент, представляющий собой обесцвечивание полосы около 440 нм и удовлетворительно описываемый функцией Гаусса (сплошная линия). Мы приписываем этот спектр выцветанию полосы Соре восстановленного гема b595. Полоса Соре гема b595, идентифицированная в этой работе, имеет тот же экстремум, что и соответствующая полоса восстановленной цитохром с пероксидазы (фермента, содержащего высокоспиновый гем b). Идентификация индивидуального спектрального вклада гема b595 в полосу Соре цитохрома bd необходима для интерпретации сложных спектральных изменений, вызываемых связыванием лигандов с восстановленным ферментом.
Рис. 5. -полоса поглощения 460 фс компонент восстановленного гема b5цитохрома bd E.coli, вычлененная путем фотовыцветания формы R при 590 нм-возбуждении () и аппроксимированная функцией Гаусса (сплошная линия).
полностью восстановленный фермент возбуждение при 590 нм 4410 420 430 440 4Длина волны, нм A A A=0,РЕАКЦИЯ ЦИТОХРОМА bd С СО Цель - выяснить, какие из трех гемовых центров цитохрома bd способны взаимодействовать с СО.
Взаимодействие СО с мембранной формой цитохрома bd. Добавление СО к связанному с мембраной восстановленному цитохрому bd вызывает в видимой области разностного спектра поглощения появление полосы с max = 644 нм и min = 624 нм, которая сопровождается пиком при 540 нм и W-образным ответом в области Соре. Красный сдвиг полосы поглощения около 630 нм обычно приписывают гему d. Что касается изменений в области Соре, то они, по мнению ряда авторов, объясняются вкладом гема b595 [Poole, 1994].
Мы обнаружили, что изменения в Соре, равно как и развитие пика при 540 нм, титруются СО параллельно с увеличением поглощения -полосы комплекса гема d с СО и достигают насыщения при 3-6 мкМ СО. В области Соре наблюдается также вторая фаза спектральных изменений, которая не достигает насыщения даже при концентрации СО 1 мМ и не вносит существенного вклада в полученную концентрационную зависимость спектральных изменений цитохрома d. Эта фаза отражает взаимодействие с лигандом незначительной части гема b558 (1-3%). Мы определили кажущуюся Kd комплекса СО с гемом d бактериальных мембран. Для этого проводили титрование СО спектральных изменений цитохрома bd и Mb, находившихся в одном растворе, следя за распределением лиганда между этими гемопротеидами и принимая Kd Mb равной 37 нМ. Величина Kd составляет около 70 нМ.
Взаимодействие СО с изолированным цитохромом bd. Разностный спектр выделенного цитохрома bd при низкой концентрации СО (рис. 6, спектр а) напоминает таковой комплекса СО с мембранной формой цитохрома d. Однако в случае выделенного фермента отличия между спектрами при высокой (1 мМ) и низкой (20 мкМ) концентрации СО гораздо более выражены: соответствующий разностный спектр представлен полосой с максимумом при 422 нм, минимумом при 434 нм и небольшим плечом около 440 нм в полосе Соре и двумя провалами, при 562 и 531 нм, в видимой области (рис. 6, кривая в).
Рис. 6. Спектральные изменения изолированного цитохрома bd, вызываемые СО. Представлены разностные спектры поглощения цитохрома bd E.coli:
обработанный 20 мкМ (а) и 1 мМ СО (б) после восстановления дитионитом минус восстановленный дитионитом; в - разность между (б) и (а).
Спектральные изменения выделенного цитохрома bd при 540 нм и 644-623 нм, как и в случае с мембранным ферментом, титруются одновременно, имеют вид кривых с насыщением и отражают один и тот же процесс - связывание СО с гемом d (рис. 7, кривые б и в). Пик при 540 нм может быть как -полосой комплекса гема d с СО, так и частью его расщепленной -полосы. Концентрационная зависимость спектральных изменений в Соре имеет ярко выраженный двухфазный характер: первая фаза соответствует наблюдаемым изменениям в видимой области; вторая фаза не насыщается даже при 1 мМ СО и вносит больший вклад в суммарную амплитуду изменений в -полосе, чем в случае мембранной формы фермента (рис. 7, кривая а). Амплитуда второй фазы соответствует взаимодействию лиганда с некоторой частью гема b558 (около 10-15%). Кажущуюся Kd выделенного цитохрома d с СО определяли как и для мембран. Ее значение оказалось равным ~80 нМ.
Рис. 7. Зависимость спектральных изменений изолированного цитохрома bd в разных диапазонах длин волн от концентрации СО.
Представлены кривые, полученные после обработки соответствующих разностных спектров поглощения: а - 470-4нм; б - 644-624 нм; в - 540 нм Исследование магнито-оптической активности изолированного восстановленного цитохрома bd и его комплекса с СО. Спектроскопия МКД все шире применяется при изучении гемопротеинов. В частности, она позволяет следить за изменением спинового состояния гемов при связывании лигандов. Спектр МКД восстановленного цитохрома bd, записанный при комнатной температуре, показан на рис. сплошной линией (кривая 1). На спектре можно выделить 3 основных сигнала. В видимой области основной вклад вносит сигнал типа А с центром при 560,7 нм (рис. 8,б, кривая 1).
Этот сигнал принадлежит низкоспиновому гему b5582+. Отрицательная полоса с минимумом около 600 нм по форме и положению типична для высокоспинового гема b2+, соответствуя высокоспиновому гему b5952+. В области Соре наблюдается асимметричный сигнал с максимумом при 437 нм (рис. 8,а), также напоминающий по форме и величине сигнал высокоспинового гемопротеида. Этот сигнал может включать вклады каждого из трех гемовых центров фермента.
Добавление 20 мкМ СО вызывает сужение сигнала в области Соре, что выражается в разностном спектре МКД кривой W-образной формы. При этом не наблюдается изменений сигнала типа А гема b558 и отрицательной полосы при 600 нм гема b595. Поэтому наиболее вероятно, что эти изменения МКД в области Соре отражают образование комплекса низкоспинового гема d с лигандом, d2+-CO. Увеличение концентрации СО до 1 мМ приводит к уменьшению сигнала А-типа низкоспинового гема b5582+ (рис. 8,б), соответствующему переходу 15% этого гема в комплекс с СО, b5582+-CO. В то же время мы не обнаружили изменения формы или интенсивности сигнала МКД гема b595 при 600 нм. В полосе Соре наблюдаются лишь незначительные добавочные изменения, главным образом выражающиеся в небольшом нарастании провала при 430 нм (рис. 8,а). При этом величина минимума при 442 нм практически не меняется.
Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует об отсутствии взаимодействия большей части (>95%) высокоспинового гема b5952+ с окисью углерода.
Рис. 8. Изменения сигнала МКД цитохрома bd в полосе Соре (а) и видимой области (б), вызываемые 1 мМ СО. Представлены спектры МКД изолированного фермента: - восстановленный дитионитом (сплошная линия); 2 - после добавления СО (пунктирная линия); 3 - разность между 2 и 1.
Взаимодействие СО с изолированным цитохромом bd при низкой температуре.
Мы сравнили спектральные изменения, обусловленные связыванием и фотодиссоциацией СО при комнатной и низкой температурах, используя один и тот же препарат изолированного цитохрома bd A.vinelandii. Освещение замороженного комплекса восстановленного цитохрома bd с СО сфокусированным белым светом в течение 3 мин вызывает изменения поглощения, указывающие на красный сдвиг полосы Соре. Форма этого спектра типична для фотодиссоциации СО от высокоспинового гема b. В этих условиях, фотоиндуцируемых изменений гема d в длинноволновой области не наблюдается по причине парной рекомбинации СО с гемом d, скорость которой очень высока даже при -100 С [Poole, 1988]. Благодаря этой особенности, исследования низкотемпературной фотодиссоциации являются селективными по отношению к гему b595. Таким образом, диссоциация СО от высокоспинового гема b595 - единственное событие, которое выявляют индуцированные светом спектры цитохрома bd при -100 С. Нормированные фотоиндуцированные изменения поглощения гема b595 соответствуют фотодиссоциации СО от ~6% гема b595 при -70 С и даже от меньшей фракции (~4%) при -100 С.
Рекомбинация СО с восстановленным цитохромом bd A.vinelandii в микро/миллисекундной временной шкале при комнатной температуре. Независимое подтверждение связывания СО с небольшой фракцией гема b595 в том же препарате цитохрома bd A.vinelandii получено при исследовании рекомбинации СО с восстановленным цитохромом bd в микро/миллисекундной временной шкале вслед за индуцированным лалерным светом фотолизом комплекса фермента с лигандом при комнатной температуре.
Рекомбинация проходила в несколько фаз. Быстрая фаза хорошо разделялась кинетически с характеристическим временем =183 мкс при ~1 мМ СО (константа скорости второго порядка - 5,5108 М-1с-1). Разностный спектр быстрой фазы типичен для связывания СО с гемом d. Более медленная часть рекомбинации включает 2-3 фазы со значениями в пределах 0,2-2,3 мс; однако разностные спектры этих фаз схожи между собой и указывают на связывание СО с гемом типа b. Из общей амплитуды спектральных изменений в медленной части ответа следует, что с СО при комнатной температуре взаимодействует не более 2-3% гема b595.
Изучение фотодиссоциации СО из комплекса с изолированным цитохромом bd E.coli, находящимся в полностью восстановленной форме (R) либо в состоянии смешанной валентности (MV) в пикосекундной временной шкале.
Мы сравнили изменения поглощения, вызываемые фотодиссоциацией СО от цитохрома bd E.coli в разных состояниях окисления в пикосекундной временной шкале. На рис. 9 приведены спектры фотолиза комплексов R-CO и MV-CO фермента. Как форма, так и динамика спектральных изменений заметно отличаются в этих двух комплексах. Разностные спектры фотодиссоциации СО, наблюдаемые в области Соре для формы R-CO фермента после завершения электронных релаксаций, показана на рис. 9А. Форма абсорбционных изменений напоминает обращенный разностный стационарный спектр, вызываемый связыванием СО с восстановленным цитохромом bd с его типичной W-образной формой.
Напротив, ответ комплекса MV-CO фермента характеризуется менее сложным разностным спектром, соответствующим нарастанию широкой полосы с максимумом при 431-434 нм (рис. 9Б). Мы склонны приписать эту полосу промежуточно генерируемому гему d, несвязанному с лигандами. Таким образом, впервые удалось зарегистрировать спектры изменения поглощения в области Соре при фотодиссоциации СО от цитохрома bd в MV состоянии.
Рис. 9. Фотодиссоциация СО из R (A) и MV (Б) редокс-состояний изолированного цитохрома bd E.coli.
Амплитуда изменений поглощения, наблюдаемая у MV-CO комплекса, увеличена в 2 раза. Длина волны возбуждения - 620 нм.
При сравнении изотропных пикосекундных спектров фотодиссоциации СО из комплексов R-CO и MV-CO фермента установлено, что взаимодействие СО с гемом d влияет на восстановленный гем b595, вызывая изменение поглощения в области 435 нм в пикосекундной временной шкале. Это свидетельствует о близком расположении гемов d и b595 и о формировании ими совместного двухъядерного центра восстановления кислорода.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С ЦИАНИДОМ Цель - изучить особенности реакции цитохрома bd с цианидом; установить, взаимодействует ли этот лиганд с окисленным гемом b595 мембранной и изолированной форм фермента.
Реакция KCN с цитохромом bd бактериальных мембран. Добавление 50 мМ KCN к субклеточным пузырькам E.coli, содержащим цитохром bd, вызывает распад оксикомплекса гема d (падение поглощения при 648 нм). При этом наблюдается не описанный ранее длинноволновый сдвиг полосы Соре и рост поглощения при 562 нм. Увеличение амплитуды разностного спектра в Соре коррелирует во времени с нарастанием оптической плотности при 562 нм, но не совпадает с возникновением провала при 648 нм. Большая часть изменений в -полосе отражает восстановление гема b558 эндогенными источниками электронов, а не собственно связывание лиганда. Прединкубация мембран с окислителями феррицинием и персульфатом не вызывает окисления гема d. При добавлении KCN к таким мембранам вслед за описанным выше увеличением амплитуды разностного спектра в Соре в течение первых 45 мин происходит медленное обращение спектральных изменений и в конце концов возникает устойчивый ответ с 429-410 20 мМ-1см-1. Его небольшая величина свидетельствует о связывании цианида преимущественно с гемом d.
Реакция KCN с окисленной формой изолированного цитохрома bd. На рис. представлен разностный спектр поглощения фермента (обработанный KCN минус окисленный BQCl4). В видимой области добавление субмиллимолярных концентраций KCN приводит к появлению полосы с максимумом при 624 нм и небольшими провалами около 5и 650 нм, а также пика при 577 нм (рис. 10,б, спектр 1). Кроме того, наблюдается исчезновение полосы при 740 нм, являющейся полосой переноса заряда высокоспинового окисленного гема d. В области Соре регистрируется небольшой длинноволновый сдвиг с максимумом при 431 нм и минимумом при 409 нм с 431-409 25-28 мМ-1см-1 (рис. 10,а, кривая 1), напоминающий таковой у цитохром d - содержащих мембран в присутствии окислителей. Небольшая величина изменений в Соре указывает на отсутствие взаимодействия цианида с гемами типа b при данной концентрации лиганда. Повышение концентрации KCN до 50 мМ приводит к увеличению амплитуды ответа в Соре и появлению пика при 537 нм (рис. 10, кривая 2). Приращение спектральных изменений в -полосе отражает связывание цианида дополнительно с частью ( 10%) низкоспинового гема b558.
Рис. 10. Сопоставление вызываемых цианидом спектральных ответов изолированного окисленного цитохрома bd E.coli в полосе Соре (а) и видимой области (б).
Представлены разностные спектры, записанные через 30 мин после добавления 0,5 мМ KCN (1) и через 10 мин после добавления 50 мМ KCN (2).
Исследование магнито-оптической активности выделенного полностью окисленного цитохрома bd и его комплекса с цианидом. Мы исследовали сигналы МКД изолированного полностью окисленного цитохрома bd и его цианидного комплекса при комнатной температуре. В области Соре спектра МКД окисленного цитохрома bd наиболее выражен характерный для низкоспинового гема b3+ интенсивный сигнал типа А (рис. 11, кривая 1 (сплошная линия). Этот сигнал в основном относится к низкоспиновому гему b5583+.
Добавление 0,5 мМ KCN к окисленному ферменту не вызывает изменений в спектре МКД.
Отсутствие значительных изменений в сигнале МКД окисленного фермента после добавления субмиллимолярных концентраций лиганда однозначно свидетельствует против того, что какая-либо существенная фракция гема типа b связывает цианид. Сигнал гема d, повидимому, очень мал. 50 мМ цианид, добавленный к ферменту, вызывает некоторые изменения сигнала МКД, которые выражаются в появлении полосы с максимумом при 4нм и минимумами около 412 и 433 нм в разностном спектре МКД (рис. 11, кривая 3). Это соответствует переходу 15-17% низкоспинового гема b5583+ в комплекс с цианидом. Хотя мы не можем исключить, что небольшая фракция высокоспинового окисленного гема b (<5%) также взаимодействует с цианидом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что большая часть гема b595 не связывает KCN даже при высокой концентрации лиганда.
Рис. 11. Изменения характеристик МКД цитохрома bd, вызываемые 50 мМ цианидом. Представлены спектры МКД изолированного фермента: 1 - окисленный (сплошная линия); 2 - после добавления KCN (пунктирная линия); 3 - разность между 2 и 1.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С КИСЛОРОДОМ Цель - определить сродство цитохрома bd к кислороду; сравнить кинетику связывания разных редокс-форм фермента с О2; охарактеризовать основные каталитические интермедиаты; выяснить, какие из стадий каталитического цикла фермента сопряжены с генерацией мембранного потенциала.
Определение кажущейся константы диссоциации (Kd(O2)) комплексов изолированного цитохрома bd E.coli и A.vinelandii с кислородом. В отличие от гем-медных терминальных оксидаз, изолированный цитохром bd находится преимущественно в виде стабильного оксигенированного комплекса (b5583+b5953+d2+-O2), который характеризуется полосой поглощения при 645-650 нм. Оксигенированный цитохром bd может быть легко переведен в одноэлектронную форму без кислорода путем уравновешивания образца с атмосферой аргона. За уходом кислорода от гема d можно следить по сдвигу -полосы поглощения гема от 645-648 нм в область 626-630 нм. Оксикомплекс гема d можно регенерировать путем титрования анаэробного одноэлектронного (MV) фермента кислородом. Добавление возрастающих концентраций О2 к анаэробной MV форме цитохрома bd E.coli вызывает пошаговое увеличение амплитуды разностных спектров поглощения, соответствующее красному сдвигу -полосы поглощения гема d. Зависимость спектральных изменений фермента E.coli при 648-626 нм от концентрации кислорода имеет вид кривой с насыщением, соответствуя кажущейся Kd(O2) = 280 нМ для оксикомплекса гема d. Таким же способом определили кажущуюся Kd(O2) для фермента A.vinelandii. Ее значение составило 0,5 мкМ. Таким образом, оксидазы bd-типа этих двух бактерий имеют сходное и довольно высокое сродство к кислороду.
Кинетика связывания кислорода с изолированным цитохромом bd A.vinelandii.
На рис. 12А показаны типичные кинетические кривые связывания О2 с MV формой фермента после фотолиза СО при разных концентрациях кислорода. Скорость реакции описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой. Кинетический спектр реакции (рис. 12Б) идентичен стационарному разностному спектру, характеризующему образование оксикомплекса гема d. Скорость реакции возрастает с увеличением концентрации О2, однако эта зависимость не является линейной, но описывается гиперболической функцией (рис.
12В). Реакция кислорода с R формой цитохрома bd не останавливается на стадии образования оксикомплекса, а идет дальше с образованием других интермедиатов.
Остановимся на самой первой стадии реакции R формы фермента с О2 - образовании комплекса d2+ЦО2. Кинетический спектр этой фазы идентичен таковому для MV формы фермента. В отличие от MV формы цитохрома bd, скорость образования оксикомплекса у R формы фермента возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2 без признаков насыщения (рис. 12В). Полученное значение константы скорости второго порядка (kon) для R формы цитохрома bd составляет 1,96109 М-1с-1. Это очень близко по величине к пределу, контролируемому диффузией кислорода в воде (6,5109 М-1с-1).
Рис. 12. Кинетика связывания кислорода с цитохромом bd A.vinelandii. (А) Кинетические кривые связывания О2 с MV формой фермента при 650 минус 630 нм, [О2] - 50, 100, 195 и 3мкМ. (Б) Кинетический спектр реакции для MV формы фермента. (В) Зависимость наблюдаемой скорости реакции от концентрации О2 (R форма - квадратные символы, MV форма - символы-кружки). Сплошные линии представляют собой теоретические кривые.
Четыре последовательные стадии каталитического цикла цитохрома bd.
Обнаружение нового интермедиата - перекисного комплекса гема d.
На рис. 13А показаны оптические изменения в течение первых 100 мкс реакции для фермента E.coli в форме R с кислородом. Начальное, неразрешаемое во времени падение поглощения отражает фотолиз СО из восстановленного фермента (R-COR переход), вслед за которым наблюдаются еще три перехода, которые хорошо разрешаются во времени (рис.
13Б). Эти три перехода описываются тремя последовательными стадиями с 1,4, 4,5 и 47 мкс (рис. 13Б, главная панель). Соответствующие разностные кинетические спектры этих фаз представлены на рис. 13В. Спектр 1,4-мкс фазы имеет минимум при 630 нм и максимум при 654 нм, что характерно для образования оксикомплекса - интермедиата А (RA переход).
Спектр 4,5-мкс фазы имеет минимум при 654 нм (исчезновение интермедиата А) и максимум при 635 нм, который отражает образование интермедиата, не зарегистрированного ранее. Мы обозначили этот новый интермедиат Р и 4,5-мкс фазу как AP переход. В ходе AP перехода гем b595 окисляется. Спектр 47-мкс фазы имеет минимумы при 561 нм (окисление гема b558) и 640 нм (распад интермедиата Р) и максимум при 680 нм. Пик при 680 нм характерен для оксоферрильного комплекса гема d (интермедиат F); таким образом, 47-мкс фаза соответствует PF переходу. Как показано во вставке к рис. 13Б, изменения поглощения цитохрома bd A.vinelandii, вызванные кислородом, очень напоминают таковые для фермента E.coli.
Поскольку цитохром bd несет три редокс-группы, R является трехэлектронной формой восстановленного фермента. Реакция трехэлектронной формы восстановленного фермента с кислородом останавливается на стадии образования интермедиата F. Однако при определенных условиях возможно получить изолированный цитохром bd E.coli, содержащий некоторое количество связанного хинола. Такая форма восстановленного фермента содержит пять восстановительных эквивалентов и реакция с кислородом идет дальше образования F.
Наши эксперименты с таким препаратом фермента выявляют дополнительную фазу с = 1,мс. Спектр 1,1-мс фазы имеет минимум при 680 нм и максимум при 645 нм (рис. 13В), что может соответствовать превращению F в полностью окисленный фермент (О) или, скорее, в оксикомплекс (А).
Рис. 13. Реакция полностью восстановленного изолированного цитохрома bd с кислородом при 21 С. (A) Спектральные изменения во времени после индуцированной лазерным светом диссоциации СО из фермента E.coli в присутствии О2. (Б) Кинетические кривые реакции при 654 минус 635 нм для цитохромов bd E.coli (главная панель) и A.vinelandii (вставка).
Теоретическая кривая, описывающая экспериментальные данные (точки), показывает, что за неразрешаемой во времени фазой фотолиза СО (R-COR) следуют три экспоненциальных перехода с 1,4 мкс (RA), 4,5 мкс (AP) и 47 мкс (PF). (В) Разностные кинетические спектры четырех фаз в видимой области: 1,4-мкс (мелкопунктирная линия), 4,5-мкс (сплошная линия), 47-мкс (крупнопунктирная линия) и 1,1-мс (сплошная линия серого цвета).
Сравнение электрометрической и оптической кривых во времени для реакции восстановленного цитохрома bd с кислородом. На рис. 14 сопоставлены кинетики образования мембранного потенциала (пунктирная линия) и спектральных изменений при А654-635 (сплошная линия) в ходе каталитического акта фермента. Электрометрический ответ в ходе одного молекулярного оборота цитохрома bd зарегистрирован нами впервые. Он состоит из начальной неэлектрогенной фазы, за которой следует фаза электрогенная. Анализ электрометрической кривой с использованием констант скоростей, полученных в спектрофотометрических измерениях, показывает, что первые два процесса, приписываемые образованию интермедиата А, за которым следует AP переход, не являются электрогенными. Таким образом, как RA, так и AP переход не сопряжены с переносом заряда поперек мембраны. В трехэлектронной форме восстановленного цитохрома bd (без связанного хинола), за неэлектрогенным плато следует электрогенная фаза (рис. 14, пунктирная линия), которая развивается параллельно с 47-мкс фазой, наблюдаемой в спектрофотометрическом эксперименте (рис. 14, сплошная линия). Таким образом, эта электрогенная фаза соответствует превращению интермедиата Р в форму F (PF переход).
В случае, когда фермент содержит связанный хинол, наблюдается дополнительная электрогенная фаза с 0,6-1,1 мс. Эта медленная электрогенная фаза совпадает во времени со спектральной фазой, отражающей FА переход.
Рис. 14. Сравнение электрометрической и оптической кривых во времени для реакции трехэлектронной формы восстановленного цитохрома bd E.coli с кислородом.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С NO Цель - исследовать механизм ингибирования активности цитохрома bd окисью азота; выяснить, с какими формами фермента способен взаимодействовать NO.
Связывание NO с MV и R формами цитохрома bd. Цитохромы bd из E.coli и A.vinelandii как в состоянии смешанной валентности, так и полностью восстановленной форме способны связывать NO. NO связывается с восстановленным гемом d, образуя нитрозильный комплекс (Fe2+ЦNO).
Ингибирование активности цитохрома bd окисью азота. NO является сильным ингибитором О2-редуктазной активности цитохрома bd E.coli. Кажущаяся константа ингибирования (Ki) для NO составляет 100 34 нМ (n = 10) при [O2] ~ 70 мкМ. Эта величина не сильно отличается от таковой для фермента A.vinelandii. При более высокой концентрации О2 (~ 1мМ O2) измеряли значительно большую величину Ki (~ 230 нМ NO), что свидетельствует о конкуренции между NO и О2. В аэробном растворе NO спонтанно деградирует, реагируя с кислородом. Когда концентрация NO падает ниже 200 нМ, происходит обращение ингибирования цитохрома bd и фермент постепенно восстанавливает первоначальную (до добавления NO) активность. Кинетику восстановления активности измеряли с использованием окси-Hb в качестве лутилизатора NO. При исчерпании NO после добавления Hb наблюдается быстрое и полное восстановление О2-редуктазной активности цитохрома bd E.coli. То же наблюдали для фермента, выделенного из A.vinelandii.
Тест на NO-редуктазную активность цитохрома bd. Способность терминальных оксидаз типа bd из E.coli и A.vinelandii катализировать восстановление NO в анаэробных восстанавливающих условиях проверяли амперометрически при концентрациях NO 3-мкМ, используя в качестве восстановителей ДТТ/Q1, либо пару аскорбат/ТМФД. Такая активность у фермента E.coli не обнаруживается; схожие результаты получены и для оксидазы A.vinelandii. В присутствии избытка восстановителей, NO действительно медленно разлагается, однако скорость этого процесса не меняется при добавлении как выделенного, так и предварительно восстановленного фермента.
Взаимодействие NO с оксоферрильным интермедиатом цитохрома bd.
Добавление цитохрома bd A.vinelandii в форме F к анаэробному буферу, содержащему избыток NO, вызывает исчезновение из раствора примерно равного количества NO (1,04 0,08 (n = 12) моль NO на моль фермента). При смешивании в анаэробных условиях с буфером, содержащим 100 мкМ NO, F состояние фермента исчезает в пределах 1 с и вместо него появляется форма с широкой полосой около 625 нм (рис. 15А). Реакция описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой. Константа скорости псевдо-первого порядка линейно зависит от концентрации NO (рис. 15Г). Полученное значение константы скорости второго порядка (kon) составляет 1,2 0,1 105 M-1 с-1. Продукт реакции оксоферрильной формы (F) цитохрома bd с NO является комплексом полностью окисленного фермента (О) с нитритом, по-видимому связанным с гемом d3+.
А Б 0.0.60.05 0.6-0.0.500 550 600 650 700 750 500 550 600 650 700 7Длина волны, нм Длина волны, нм 0.0.1В Г 0.10.-0.500 600 7 (нм) 0.0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 200 400 600 800 1000 12[NO], мкM Время, с Рис. 15. Кинетика реакции оксоферрильной формы цитохрома bd A.vinelandii с NO. (A) Абсолютные спектры поглощения после смешивания F с 100 мкМ NO. (Б) Разностные спектры поглощения. (В) Теоретическая кривая. Вставка: кинетический спектр, полученный при анализе. (Г) Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции от [NO].
A Поглощение A -k' ( с ) Амплитуда, отн.
ед.
ДИССОЦИАЦИЯ ЛИГАНДОВ (O2, NO, СО) ОТ ГЕМА d Цель - изучить диссоциацию O2, NО и СO от цитохрома bd; выяснить, зависит ли скорость диссоциации лиганда от редокс-состояния фермента.
Диссоциация О2. После смешивания выделенного цитохрома bd E.coli (представленного в основном формой MV-O2) с избытком NO, во времени разрешаются два процесса. Менее чем за 100 мс, исходная -полоса гема d уменьшается по величине и смещается от 645 до 641-642 нм, после чего наблюдается ее дальнейший синий сдвиг до 6нм, одновременно с исчезновением плеча при 680 нм. Первый интермедиат реакции, детектируемый через 75 мс после смешивания, является ферментом в MV форме, в которой NO связан с восстановленным гемом d (MV-NO). Таким образом, после смешивания с NO, O2, связанный с гемом d2+, быстро диссоциирует, замещаясь NO, без редокс изменений на уровне гемов. Происходящее вслед за этим исчезновение полосы 680 нм свидетельствует о том, что после обмена лигандов (O2/NO) происходит медленная (несколько секунд) реакция NO с маленькой фракцией оксоферрильного (F) фермента, присутствующая в цитохроме bd при выделении. Кинетические кривые изменения поглощения при 649 нм при разных концентрациях NO описываются суммой двух экспонент. Первая фаза соответствует обмену лигандов (O2/NO) на геме d2+, с константой, достигающей порогового значения (плато) 78 с-при 1 мM NO. Эту скорость-лимитирующую величину мы приписываем koff для O2, связанного с гемом d2+ в MV ферменте. Вторая фаза линейно зависит от концентрации NO, соответствуя реакции NO с фракцией оксоферрильного фермента.
Диссоциация NO. Связанный с NO цитохром bd быстро смешивали с уравновешенным с воздухом буфером, содержащим Mb-O2 и об высвобождении NO из фермента судили по появлению мет-Mb при 581 нм. Свободный NO убирался из раствора при взаимодействии с Mb-O2 за время перемешивания (< 2 мс); после этого NO, связанный с гемом d2+, вытеснялся О2, диссоциировал и окислял Mb-O2. Диссоциация NO протекает моноэкспоненциально с k = 0,133 0,005 с-1 и 0,036 0,003 с-1 из R и MV форм цитохрома bd, соответственно (рис. 16). После замещения NO с MV ферментом не происходит ничего, тогда как в случае R фермента, за NO/O2 обменом следует полное окисление цитохрома bd.
1580 (Mb-O2) Рис. 16. Диссоциация NO. Приведены кинетические кривые диссоциации NO от MV-NO -500 600 700 цитохрома bd. Регистрировали изменения 40 , нм поглощения при 581 нм после смешивания связанного с NO фермента с R-NO уравновешенным с воздухом буфером, содержащим Mb-O2. Вставка: разностный 0 20 40 60 80 1спектр поглощения - Mb-O2 минус мет-Mb.
Время, с --, м M c м Амплитуда, отн.
ед.
Диссоциация СО. В похожем эксперименте исследовали кинетику диссоциации СО из цитохрома bd; при этом в качестве замещающего лиганда использовали О2. О вытеснении СО из MV фермента судили по моноэкспоненциальному падению поглощения при 632 нм и его одновременному увеличению при 648 нм, при этом величина k сотавила 4,20 0,34 с-1.
Реакция О2 с СО-связанным ферментом в R форме, измеряемая при 632 и 560 нм, протекала быстрее, моноэкспоненциально (k = 6,0 0,2 с-1); и являлась скорость-лимитирующей стадией для полного окисления фермента кислородом.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА Е445А И ОКСИДАЗЫ ДИКОГО ТИПА Цель - с помощью каталитически неактивного мутантного фемента Е445А выяснить роль гема b595 в активном центре, а также специфическую функцию высококонсервативного остатка Е445 в сопряжении электронного транспорта с переносом протонов в цитохроме bd.
Недавно вышло сообщение о том, что точечная замена глутамата-445 на аланин в субъединице I цитохрома bd E.coli приводит к инактивации фермента и потере гема b5[Zhang et al., 2001]. В данной работе мы показали, что гем b595 в мутанте Е445А сохраняется, но теряет способность к восстановлению даже в присутствии сильного восстановителя (дитионита). Столь уникальная возможность получить двухэлектронную форму фермента была использована для анализа роли гема b595.
Гем b595 присутствует в мутантной форме Е445А цитохрома bd. При сравнении изменений поглощения после фотолиза СО из гема d2+ в восстановленных дитионитом ферментах дикого типа и мутантном Е445А оказалось, что в случае дикого типа, разностный спектр рекомбинации СО в присутствии 1% СО имеет минимум при 642 нм и максимум при 622 нм, что соответствует ресвязыванию СО с гемом d2+. Напротив, в мутантном ферменте, спектр фазы рекомбинации СО включает не только связывание СО с гемом d2+, но также и некоторое перераспределение электрона, соответствующее переносу электрона от восстановленного гема b595 к окисленному гему d. Разностный спектр рекомбинации СО мутанта Е445А и дикого типа имеет максимумы при 595 и 562 нм и минимум при 630 нм, что очень напоминает восстановленный минус окисленный спектр гема b595, с добавлением провала при 630 нм, свидетельствующего об окислении гема d при фотолизе СО у мутанта.
Таким образом, гем b595 в мутантном ферменте присутствует. Применение метода пиридингемохромогена подтвердило этот вывод: как в мутантном ферменте, так и в оксидазе дикого типа, стехиометрия гемов b558/d составляет 1 и обшее отношение гемов b к гему d равно 2.
Заключение о том, что гем b595 присутствует в мутанте Е445А, но сохраняет высокоспиновую окисленную форму даже в присутствии избытка дитионита, подтверждается данными ЭПР. После добавления дитионита, сигналы ЭПР у дикого типа не обнаруживаются, поскольку все три гема восстанавливаются до ЭПР-лмолчащих ферроформ. Однако, в случае мутанта, регистрируется сигнал с g-фактором ~6 (рис. 17), принадлежащий высокоспиновому окисленному гему b несмотря на присутствие дитионита.
Рис. 17. Спектры ЭПР локисленного на воздухе (пунктирная линия) и восстановленного дитионитом (сплошная линия) мутантного фермента Е445А.
Спектр, обозначенный сплошной линией, получали в присутствии 5 мМ дитионита натрия.
Замена Е445А сильно ингибирует перенос заряда поперек мембраны, сопряженный с окислением цитохрома bd кислородом. Проведены электрометрические измерения генерации , ассоциированной с реакцией мутантной оксидазы и фермента дикого типа с кислородом в одинаковых экспериментальных условиях. Кинетика электрометрического ответа полностью восстановленного фермента дикого типа (рис. 18, кривая 1) хорошо моделируется четырьмя последовательными реакциями. Первые два перехода не являются электрогенными и соответствуют образованию оксикомплекса фермента (RA переход) и его превращению в перекисный комплекс (AP переход).
Третья фаза является электрогенной ( ~ 90 мкс; амплитуда, Ц3,2 мВ) и отражает переход перекисного комплекса в оксоферрильную форму (PF переход). Поскольку в этом эксперименте фермент содержит связанный хинол, наблюдается дополнительная, четвертая фаза, являющаяся электрогенной ( ~ 600 мкс; амплитуда, Ц1,6 мВ). Эта самая медленная, электрогенная фаза отражает переход оксоферрильного (F) фермента дикого типа в окисленную (О) и/или оксигенированную (А) форму. Как и в случае цитохрома bd дикого типа, в реакции восстановленного мутантного фермента Е445А с кислородом наблюдается начальная неэлектрогенная стадия. Однако мутант, в отличие от дикого типа, не выявляет какой-либо микросекундной фазы генерации . Вместо этого у мутанта наблюдается более медленная, небольшая электрогенная фаза ( ~ 1,3 мс; амплитуда, Ц0,36 мВ), за которой следует электрогенный переход гораздо большей амплитуды ( ~ 12,5 мс; амплитуда, Ц1,мВ), что видно на рис. 18. Обе электрогенные фазы скорее всего отражают PF переход в разных субпопуляциях фермента.
Рис. 18. Генерация мембранного потенциала в реакции восстановленного цитохрома bd E.coli с кислородом. Кривая 1 - фермент дикого типа, кривая 2 - мутантный фермент Е445А. Вставка:
генерация в реакции восстановленного мутантного цитохрома bd с О2 во временной шкале 0 40 мс.
Замена Е445А не ингибирует обратный перенос электрона с гема d2+ на гемы b5и b595, вызванного фотолизом СО от гема d2+ в одноэлектронной форме цитохрома bd.
Мы сравнили реакции обратного переноса электрона для ферментов дикого типа и мутанта Е445А. Удивительно, но полученные данные оказались очень схожими. Рекомбинация СО с гемом d после фотолиза одноэлектронной формы цитохрома bd включает (а) ресвязывание СО с гемом d после вспышки и (б) возврат электронов из временно восстановленных гемов b558 и b595 на гем d. Поэтому спектр ресвязывания СО для одноэлектронной формы фермента состоит из спектральных изменений, индуцируемых связыванием СО с гемом d, а также изменений, вызванных перераспределением электрона, сопровождающим это связывание.
Спектральный вклад, вызванный оксидоредукцией гемов демонстрирует восстановление гема d и сопутствующее окисление гемов b558 и b595. Примерно 25% гема d подвергается редокс-превращению в результате фотолиза. Если количество гема d, которое подвергается восстановлению при ресвязывании с СО, принять за 100%, получается, что только ~20% этого восстановительного эквивалента соответствует окислению гема b558 в оксидазе дикого типа и ~18% в мутантном ферменте. Другим источником электронов, возвращающихся на гем d, должен быть гем b595. Таким образом, в обоих ферментах, фотолиз СО от гема d2+ в одноэлектронной форме оксидазы приводит к частичному восстановлению гемов b558 и b595, причем большая часть электрона (~80%) оказывается на геме b595.
Замена Е445А не ингибирует генерацию мембранного потенциала, сопряженную с внутримолекулярным перераспределением электрона между гемами d2+ и b558.
Перераспределение электронов также сопряжено с перемещением протонов поперек мембраны, приводя к генерации обратного знака по-сравнению с наблюдаемой в прямой реакции оксидазы с кислородом. Разделение зарядов в цитохроме bd вызывается трансмембранным перемещением именно протонов, а не электронов. Анализ кинетических кривых генерации после фотодиссоциации СО из одноэлектронного фермента дикого типа выявляет две электрогенные фазы с 1 = 112 мкс и 2 = 385 мкс. Соответствующий электрогенный ответ мутантного фермента Е445А также описывается двумя экспонентами с 1 = 83 мкс и 2 = 278 мкс. Значения этих констант скоростей близки к таковым для фермента дикого типа. Этот результат расходится с данными по генерации в реакции О2 с восстановленными ферментами, где электрогенные процессы, наблюдаемые при окислении мутанта, существенно замедлены по-сравнению с таковыми у цитохрома bd дикого типа.
Сравнение стационарных спектров поглощения мутантного фермента Е445А и цитохрома bd дикого типа. Мы сравнили абсолютные спектры поглощения восстановленных дитионитом мутантного фермента Е445А и оксидазы дикого типа. Полосы поглощения гемов d (630 нм) и b558 (561 и 531 нм) в мутанте сохраняются. Однако, отсутствие полосы при 595 нм, заметное уменьшение пика при 561 нм и исчезновение плеча около 440 нм в полосе Соре указывают на потерю вклада восстановленного гема b595 в суммарный спектр поглощения мутанта. Этот вывод полностью согласуется с нашими данными ЭПР-спектроскопии и фотолиза СО, изложенными ранее. Итак, гем b595 в мутантном ферменте Е445А присутствует, но не восстанавливается дитионитом.
Спектры кругового дихроизма (КД) мутантного фермента Е445А и цитохрома bd дикого типа: экситонные взаимодействия между восстановленными гемами d и b595.
Оптическую активность цитохрома bd ранее не исследовали. Спектр КД фермента дикого типа (рис. 19А, сплошная линия) характеризуется максимумом при 629 нм, а также интенсивным асимметричным сигналом в области Соре с минимумом при 440 нм и небольшим максимумом при 416 нм с плечом при 397 нм. Интенсивность сигнала КД в области Соре (416-440 ~ 400 мМ-1см-1) исключительно велика для гемопротеинов с единственным (например, цитохром с или миоглобин) или несколькими, слабо взаимодействующими гемами (к примеру, гемоглобин). Обычно такие значения составляют 10-50 мМ-1см-1 [Myer, 1985; Palmer and Esposti, 1994]. Полученные данные указывают на то, что в спектре КД цитохрома bd преобладает оптическая активность гема d, тогда как вклад гемов b558 и b595 незначителен. Этот вывод хорошо иллюстрируется спектром КД восстановленного мутантного фермента L65C, у которого имеются гемы b558 и b595, но отсутствует гем d (рис. 19А, крупно-пунктирная линия). На рис. 19А (мелко-пунктирные линии) представлены спектры КД мутантной формы фермента Е445А. В дальней красной области, спектры КД мутанта и дикого типа идентичны, - как в восстановленном дитионитом (главная панель), так и в локисленном на воздухе состояниях (вставка). Это наблюдение согласуется с данными абсорбционной спектроскопии. В то же время, мутация Е445А вызывает существенные изменения в области Соре: спектр уменьшается по амплитуде и сдвигается в коротковолновую область.
Разность между спектрами КД восстановленных дитионитом ферментов дикого типа и мутанта Е445А (рис. 19Б) представляет собой кривую с амплитудой (426-442 ~ 300 мМ-1см), близкой к таковой исходных спектров. КД сигнал столь высокой интенсивности беспрецедентен для изолированного гема в белке [Myer, 1985; Palmer and Esposti, 1994].
Индуцированные сигналы КД глобинов или комплексов гем-пептидов обычно гораздо меньше (< 50 мМ-1см-1) и очень асимметричны [Blauer et al., 1993; Goldbeck et al., 1997]. С другой стороны, сигнал такой формы и амплитуды следует ожидать в случае экситонного расщепления электронных переходов двух взаимодействующих хромофоров. Такие взаимодействия наблюдали в спектрах КД двухгемового цитохрома b хромаффинных гранул [Degli Esposti et al., 1989a], комплексов II [Esposti et al., 1991] и III [Degli Esposti et al., 1989b] дыхательной цепи и в комплексе b6f хлоропластов [Schoepp et al., 2000]. Поэтому можно сделать заключение, что интенсивный разностный спектр КД, представленный на рис. 19Б, отражает экситонное взаимодействие между восстановленными гемами d и b595 в цитохроме bd дикого типа. Такого рода взаимодействия не наблюдаются в мутантном ферменте Е445А, поскольку гем b595 остается в окисленном состоянии несмотря на присутствие избытка дитионита.
2"Дикий тип" - E445A 2"Дикий тип" 4639741Б A L65C 14-1E445A Оксикомплекс E445A -264"Дикий тип" 620 640 6-1-344-4-2400 500 600 700 350 400 450 5Длина волны, нм Длина волны, нм Рис. 19. Спектры кругового дихроизма восстановленных дитионитом цитохромов bd. (А) Абсолютные спектры КД ферментов дикого типа (сплошная линия), а также мутантных форм Е445А (мелко-пунктирная линия) и L65C (крупно-пунктирная линия) Вставка:
ближняя инфракрасная область КД гема d из спектров локисленных на воздухе ферментов дикого типа и мутанта Е445А. (Б) Разность между нормированными спектрами КД восстановленных дитионитом ферментов дикого типа и Е445А в области Соре.
Моделирование экситонных взаимодействий между гемами d и b595 позволяет оценить расстояние между этими гемами. Расчетное расстояние между гемовыми атомами железа (Feb595Fed) оказалось равным ~10 .
ОБСУЖДЕНИЕ Почему MV и R формы цитохрома bd имеют разные концентрационные зависимости наблюдаемых скоростей связывания О2? Концентрационные зависимости наблюдаемых скоростей связывания кислорода с гемом d2+ для MV и R форм цитохрома bd A.vinelandii заметно отличаются. Для R формы, зависимость имеет линейный характер и хорошо описывается простой одноступенчатой реакцией связывания кислорода с kon = 1,96109 М-1с-1.
Напротив, когда цитохром bd A.vinelandii находится в MV форме, зависимость наблюдаемых скоростей связывания от концентрации О2 носит явно гиперболический характер. Эти данные могут означать, что (а) реакция О2 с MV формой фермента включает более чем одну стадию, ----, M --КД, M c м КД c м КД, M c м так что модель простого одностадийного связывания недостаточна для описания этого процесса; либо (б) ход реакции связывания кислорода с гемом d2+ контролируется редокссостоянием гема(ов) b.
obs kon kon k2+ Схема X + O2 X - O2 d - O2, koff obs on k k2 kon closed open open bd bd + O2 bd - O2, Схема k-2 koff Можно рассмотреть две модели (см. Схемы 1 и 2). Согласно первой модели (Схема 1), существует спектрально неразличимое предсвязывание кислорода с центром Х (отличным от гема d2+), из которого молекула О2 в дальнейшем переносится на гем d2+. Поскольку такое связывание О2 с центром Х не сопровождается спектральными изменениями, маловероятно, что Х - один из гемовых центров. Кроме того, в MV форме фермента гемы b558 и b5находятся в окисленном состоянии и потому не могут принимать участие в связывании кислорода. Более вероятно, что в качестве Х выступает некая полость, расположенная недалеко от гема d.
Согласно Схеме 1, наблюдаемые кинетики будут почти моноэкспоненциальными.
obs kon, определяемая из формулы [O2] obs kon ~ k1 Kd ( X ) + [O2] есть наблюдаемая скорость связывания О2 с гемом d2+; Kd(X) - равновесная константа obs диссоциации для комплекса Х-О2. Из анализа зависимости [О2] от kon по указанной выше obs формуле следует, что значение kon при максимальной [О2] соответствует константе скорости k1 = 7,2105 с-1, кажущаяся константа диссоциации Kd(X) = 5,510-4 М, а касательная к начальному участку соответствует бимолекулярной константе скорости 1,3109 М-1с-1.
Последнее значение определяет верхнюю границу для истинной константы скорости связывания кислорода (kon).
Согласно второй модели, MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать О2 он может только в одном из них (Схема 2). Находясь в закрытой (closed) конформации, MV цитохром bd не обеспечивает доступ кислорода к гему d2+, тогда как в лоткрытой (open) конформации кислород легко связывается. Полностью восстановленный фермент (R) всегда находится в лоткрытой конформации. Доля закрытой конформации в MV ферменте (или К2 для Схемы 2) определяется через отношение konMV/konR = 0,67 (то есть, К2 = 1,5). Анализ кинетических кривых в соответствии со Схемой 2 при разных концентрациях О2 дает k2 = 5,1105 с-1. В R форме цитохрома bd, доступ О2 к гему d все время открыт и фермент по-видимому постоянно пребывает в лоткрытой конформации, тогда как в MV форме (гем b595 окислен) происходит переход между лоткрытой и закрытой конформациями. Оценочное время открытия и закрытия канала для доступа кислорода составляет 2 мкс (1/k2) и 3 мкс (К2/k2), соответственно. Два сделанных нами наблюдения говорят в пользу вышеизложенной гипотезы. (а) Фотолиз комплекса СО с R цитохромом bd E.coli приводит к полной фотодиссоциации молекулы СО в водную фазу. Если эксперимент повторить с MVЦСО комплексом, значительная часть СО, лотстреленной от гема d2+ (до 70%), не покидает молекулы белка и вступает в парную рекомбинацию с гемом d2+ в суб-наносекундной временной шкале. (б) Кажущиеся константы скорости самопроизвольной диссоциации лигандов, таких как СО или NO, от гема d2+ заметно ниже для MV формы цитохрома bd E.coli по сравнению с R формой фермента. Мы полагаем, что у цитохрома bd, редокс-состояние гемов типа b (скорее всего, гема b595) контролирует путь, по которому происходит перемещение лиганда между гемом d и водной фазой.
Обнаружение нового интермедиата каталитического цикла - перекисного комплекса (Р). Полагают, что гем-содержащие ферменты (пероксидазы, каталазы, цитохромы Р450 и терминальные оксидазы) имеют очень похожие каталитические интермедиаты, а именно, перекисный и оксоферрильный. Реакция пероксидаз с Н2О2 приводит к последовательному образованию перекисного комплекса (Соединение 0, Fe3+ЦOOH) и двух оксоферрильных интермедиатов - Соединение I (Fe4+=O R, где R - порфириновый или аминокислотный радикал) и Соединение II (Fe4+=O). Соединение 0 смогли зарегистрировать при низких температурах [Baek and Van Wart, 1989], но не при комнaтной температуре [Shintaku et al., 2005]. При изучении терминальных оксидаз гем-медного семейства выявили интермедиаты, аналогичные Соединению I (PM) и Соединению II (PR и F). Промежуточное образование перекисного интермедиата (Соединения 0) у гем-медных оксидаз предполагали, но никогда не регистрировали.
Мы исследовали реакцию цитохромов bd из E.coli и A.vinelandii в форме R с кислородом. Согласно ранее опубликованным данным, в этой реакции первоначально образованный интермедиат А переходит непосредственно в F, без какого-либо промежуточного интермедиата между А и F [Hill et al., 1994]. Это противоречит той же самой реакции, катализируемой цитохром с оксидазой, в которой при идентичных условиях между А и F наблюдается промежуточное образование интермедиата PR [Morgan et al., 1996].
Считалось, что в реакции цитохрома bd с кислородом между А и F совсем не образуется интермедиата, либо такой интермедиат имеет слишком короткое время жизни, чтобы быть зарегистрированным. Нам удалось разрешить во времени промежуточное образование спектрально-различимого интермедиата между А и F с =4,5 мкс при 21 С, который обозначили Р. Мы полагаем, что Р не был замечен прежде [Hill et al., 1994] из-за некоторых ограничений в использованном методе исследования.
В ходе реакции восстановленного цитохрома bd с О2, Соединение А распадается до интермедиата (обозначенного Р) с максимумом поглощения при 635 нм с характеристическим временем 4,5 мкс. AP переход совпадает с окислением гема b595.
Восстановление О2 двумя электронами достаточно для генерации двухэлектронной формы восстановленного О2 в активном центре, то есть, связанной (гидро)перекиси. Однако, не вполне ясно, расщепляется ли ОЦО связь на этой стадии реакции. Если ОЦО связь все еще цела, Р соответствует Соединению 0 в пероксидазах, то есть, настоящему перекисному комплексу (Fed3+ЦOЦOЦ(H)). Соединение 0 наблюдали у пероксидаз при низких температурах [Baek and Van Wart, 1989], но никогда не регистрировали у цитохром с оксидазы.
Если ОЦО связь уже разрушена, Р является оксоферрильным комплексом. Для образования оксоферрильной формы требуется четыре электрона, чтобы разрушить ОЦО связь. В состоянии Р, два электрона могут прийти от гема d и один - от гема b595. Однако, четвертый электрон не может быть взят от гема b558, поскольку на этой стадии реакции окисления гема b558 не наблюдается. Следовательно, если Р является оксоферрильным комплексом, четвертый электрон должен прийти от находящейся рядом группы, - скорее всего, от аминокислотного остатка (Fed4+=O2- R). В последнем случае, Р должен быть аналогом Соединения I цитохром с пероксидазы или интермедиата PM цитохром с оксидазы.
Однако, изъятие электрона от аминокислотного остатка требует довольно высокого редокс потенциала, обычно выше +0,8 В [Stubbe and van Der Donk, 1998], и в этом случае окисление гема b558 (Eс ~ +0,17 В) было бы более предпочтительным (разница в потенциалах ~ 0,63 В). В то же время, в наших экспериментах образование Р не сопровождается окислением низкоспинового гема, которое, к примеру, наблюдается в ходе образования оксоферрильного комплекса PR у гем-медных оксидаз. Окисление низкоспинового гема b558 регистрируется только в процессе распада Р, то есть, на следующей стадии реакции. Именно по этой причине мы считаем, что в случае цитохрома bd, Р является истинным перекисным интермедиатом.
Поскольку интермедиат, спектрально и кинетически очень схожий с Р цитохрома bd E.coli, также наблюдается у фермента A.vinelandii, Р скорее всего является каталитическим интнрмедиатом, присущим всем терминальным оксидазам класса bd.
Предлагаемая схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом. На рис. 20 показана схема, описывающая реакцию фермента в полностью восстановленном состоянии с кислородом. Первоначальный комплекс R формы цитохрома bd с CO (R-CO) подвергается фотолизу в присутствии кислорода. Свободная от лиганда форма R фермента, генерируемая фотолизом, связывает О2 с высокой скоростью, образуя оксикомплекс восстановленного гема d (А). RA переход не является электрогенным процессом и его скорость пропорциональна [О2] (kon = 1,9 109 M-1с-1). За образованием А следует перенос электрона от гема b595, чтобы получить Р. АР переход происходит с k = 2, 105 с-1 и также не является электрогенным процессом. Как показано на схеме, Р вероятно является перекисным комплексом окисленного гема d. Если это так, связанная перекись вероятно не находится в полностью анионной форме, а по крайней мере частично протонирована. Протон мог бы прийти от одной из двух протонируемых групп, сопряженных с b595/d двухъядерным центром при его окислении. Мы не можем исключить, что в состоянии Р ОЦО связь уже разрушена и Р напоминает интермедиат PM цитохром с оксидазы, хотя это явно не соответствует происходящему в той же реакции, катализируемой формой R цитохром с оксидазы, где не наблюдали образования интермедиата, похожего на PM, которое бы предшествовало образованию PR [Morgan et al., 1996]. Интермедиат Р в дальнейшем превращается в F с k = 2,1 104 с-1. Это сопровождается окислением гема b558. Образование F сопряжено с генерацией мембранного потенциала. Нет сомнений, что в состоянии F гемы b окислены, а гем d находится в форме оксоферрильного комплекса. В случае, когда цитохром bd содержит связанный хинол, реакция проходит дальше и образуется окисленный фермент (О). Переход FА происходит с k = 0,9 103 с-1 и является электрогенным.
Рис 20. Схема реакции. Три ромбических символа обозначают соответственно гемы b558, b5и d. Знак л- показывает, что гем находится в восстановленном состоянии. Константы скорости относятся к цитохрому bd E.coli.
Взаимодействие цитохрома bd с окисью азота. Поскольку NO продуцируется хозяином как часть иммунного ответа против бактериальных инфекций, а цитохром bd играет важную роль у патогенных микроорганизмов, мы сочли уместным исследовать реакции NO с цитохромом bd. Мы показали, что MV и R формы цитохрома bd связывают NO на уровне восстановленного гема d. Подобно СО и О2, связывание NO вызывает красный сдвиг полосы гема d при ~630 нм. О2-редуктазная активность цитохромов bd из E.coli и A.vinelandii быстро тормозится NO. Таким образом, в оксидазах типа bd ингибирование NO происходит в конкуренции с О2 и in vivo при очень низкой концентрации О2 ингибирование NO должно быть даже более эффективным. Если NO и О2 связываются с восстановленным гемом d со схожими скоростями, быстрое начало ингибирования NO даже в присутствии большого избытка О2 может свидетельствовать о существовании по крайней мере одного каталитического интермедиата, более склонного реагировать с NO, чем с О2. Эта гипотеза нашла полное подтверждение.
Ингибирование NO цитохромов bd полностью обратимо. Вслед за исчерпанием NO после добавления избытка окси-Hb, восстановление активности у оксидаз типа bd происходит быстрее, чем в сходных условиях (т.е., в присутствии избытка восстановителей) у митохондриальной цитохром с оксидазы. В таких условиях, восстановление активности митохондриального фермента лимитируется скоростью диссоциации NO в водную фазу [Sarti et al., 2000]. Более быстрое восстановление активности должно коррелировать с более высокой величиной koff для диссоциации NO из восстановленного цитохрома bd, что и обнаружено в нашей работе.
В отличие от ряда бактериальных гем-медных оксидаз, оксидазы типа bd, изученные в этой работе, не проявляют NO-редуктазной активности (<0,1 моль NO/моль bd мин, что можно сравнить, к примеру, со значением ~100 моль NO/моль фермента мин, измеренным для cbb3 оксидазы из Pseudomonas stutzeri [Forte et al., 2001]). Неспособность цитохрома bd катализировать восстановление NO до N2O указывает на то, что CuB играет ключевую роль в этой реакции. По-видимому, присутствие негемового иона металла в активном центре (FeB в бактериальной NO редуктазе, либо CuB в гем-медных оксидазах) является необходимым условием для NO-редуктазной активности у терминальных оксидаз. Отсутствие такой активности у митохондриальной цитохром с оксидазы из сердца быка [Stubauer et al., 1998] и гомолога NO редуктазы из Roseobacter denitrificans [Matsuda et al., 2004], содержащих ион меди в двухъядерном центре, может свидетельствовать о том, что восстановление NO терминальными оксидазами требует особых структурных черт окружения CuB, возможно модулирующих сродство CuB+ к NO.
Мы показали, что каталитический интермедиат F цитохрома bd A.vinelandii быстро реагирует с NO, со стехиометрией 1:1. Реакция протекает с kon = 1,2 0,1 105 M-1 с-1, что даже быстрее, чем аналогичная реакция, описанная для интермедиата F бычьей цитохром с оксидазы (kon ~ 1 - 2 104 M-1 с-1 [Giuffre et al., 2000]). Продукт реакции демонстрирует абсорбционные характеристики комплекса полностью окисленного фермента с нитритом, связанным с гемом d, состояние, которое, как ожидается, является заингибированным.
Сравнительно высокая стабильность интермедиата F в аэробных условиях и в то же время его повышенная реакционоспособность по отношению к NO делают форму F вероятным кандидатом на взаимодействие с NO при работе фермента. Эта реакция вероятно ответственна за быстрое начало ингибирования, наблюдаемое при низких соотношениях [NO]/[O2]. Быстрая реакция NO с интермедиатом F цитохрома bd могла бы отчасти объяснить низкую величину Ki (~100 нМ при ~70 мкМ O2). Поскольку цитохром bd патогенных бактерий, как полагают, задействован в развитии инфекционного процесса [Baughn and Malamy, 2004; Endley et al., 2001; Jones et al., 2007; Shi et al., 2005; Way et al., 1999], ингибирование оксидаз типа bd окисью азота могло бы быть использовано хозяином для противодействия бактериальной пролиферации и/или переходу в вирулентное состояние.
В случае бычьей цитохром с оксидазы предположили, что в реакцию интермедиата F с NO вовлечена окисленная CuB (Схема 3); NO отдает один электрон на CuB2+, приводя к возникновению иона нитрозония (NO+) и CuB+. Восстановленная CuB затем быстро реокисляется находящимся рядом оксоферрилом гема а3, переходя в окисленное состояние (Fea33+); при этом NO+ гидратируется до нитрита (HNO2/NO2-), который связывается с Fea33+, вызывая ингибирование фермента. Однако CuB отсутствует у оксидаз типа bd, поэтому результаты, полученные нами на цитохроме bd A.vinelandii, могут подвергнуть сомнению вышеописанный механизм. Нельзя исключить. что в реакции NO с интермедиатом F, гем b5в цитохроме bd выполняет роль CuB в цитохром с оксидазе (Схема 4). Однако мы не наблюдали изменений поглощения, отражающих связывание NO с гемом b595 ни в одном из его редокс-состояний. Поэтому мы полагаем, что гораздо более вероятна прямая реакция NO с оксоферрильной формой гема d (Схема 5). Такой механизм реакции гораздо проще и согласуется с механизмом, предложенным для миоглобина и гемоглобина [Herold and Rehmann, 2001].
Схема [Fea34+=O2- CuB2+] + NO [Fea34+=O2- CuB1+NO+] + H2O [Fea33+ HNO2 CuB2+] + OH- Схема [Fed4+=O2- Feb-5953+] + NO [Fed4+=O2- Feb-5952+NO+] + H2O [Fed3+ HNO2 Feb-5953+] + OH- Схема Fed4+=O2- + NO Fed3+-NO2- Диссоциация лигандов из цитохрома bd. Мы обнаружили, что в R состоянии фермента, NO диссоциирует из гема d2+ с необычайно высокой скоростью (koff = 0,133 0,005 с-1). Эта величина примерно в 30 раз больше, чем константа скорости диссоциации, измеренная в сходных экспериментальных условиях для восстановленного гема а3 митохондриальной цитохром с оксидазы (koff = 0,004 с-1 [Sarti et al., 2000]). Аналогично, диссоциация СО из полностью восстановленного цитохрома bd происходит гораздо быстрее, чем в случае полностью восстановленной цитохром с оксидазы из быка. Возможно, в гем-медных оксидазах CuB служит воротами, контролирующими связывание лиганда с гемом в активном центре. Другое интересное наблюдение при изучении диссоциации лигандов из цитохрома bd состоит в том, что значения koff, полученные для NO и СО в MV ферменте, хотя достаточно высоки в сравнении с гем-медными оксидазами, тем не менее значительно ниже, чем koff, измеренные для R формы цитохрома bd. Это свидетельствует о том, что редокс-состояние гемов b (скорее всего, гема b595) контролирует кинетический барьер для диссоциации лиганда из активного центра цитохрома bd. Необычайно высокие скорости диссоциации NO из цитохрома bd E.coli могли бы объяснить наше наблюдение, что лотравленный окисью азота цитохром bd восстанавливает свою дыхательную функцию гораздо быстрее, чем митохондриальная гем-медная цитохром с оксидаза. Как известно, NO вовлечена в часть иммунного ответа против бактериальных инфекций, поэтому необычно высокая скорость диссоциации NO из оксидаз bd-типа, приводящая к быстрому восстановлению дыхания, может быть связана с патофизиологией бактериальной инфекции. Можно ожидать, что экспрессия оксидаз bd-, а не гем-медного типа усиливает устойчивость бактерии к нитрозирующему стрессу, тем самым способствуя патогенности микроорганизмов. Это предположение представляется весьма вероятным в свете недавних данных о том, что (а) у мутантов патогенных бактерий (таких, как Brucella abortus, Shigella flexneri и Mycobacterium tuberculosis), лишенных цитохрома bd, вирулентность заметно снижена [Endley et al., 2001;
Shi et al., 2005; Way et al., 1999]; (б) экспрессия цитохрома bd у M. tuberculosis носит временный характер и увеличение транскрипции сопряжено только с одной специфической фазой инфекции [Shi et al., 2005]; (в) под воздействием сублетальных концентраций NO, у M.
tuberculosis [Shi et al., 2005] и Staphylococcus aureus [Richardson et al., 2006] наблюдается усиление экспрессии цитохрома bd.
Почему гем b595 не восстанавливается дитионитом в мутантном ферменте Е445А? Возможная модель путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd. Чтобы объяснить, почему гем b595 не восстанавливается дитионитом в стационарных условиях, но способен к промежуточному восстановлению после отстрела СО от гема d, мы предлагаем следующую модель (рис. 21). (а) Гемы d и b595 расположены близко к друг другу и функционально сопряжены, образуя двухгемовый центр восстановления кислорода. (б) Имеются две протонируемые группы, которые сопряжены с гемами d и b595. Одной из таких групп как раз и является Е445; другую, пока неидентифицированную, обозначим XP. (в) Сродство к протону группы XP выше, чем Е445. Имеется также протонируемая группа XN (по нашим предварительным данным - это аминокислотный остаток Е107 субъединицы I), которая является концом длинного протонного канала, идущего от цитоплазматической стороны мембраны. Группа XN сопряжена с группами XP и Е445 (рис. 21).
Как в мутанте, так и в диком типе, первый электрон, пришедший в двухъядерный центр от гема b558, распределяется между гемами d и b595 в соответствии с их редокспотенциалами, так что 80% электрона оказывается на геме d, и 20% - на геме b595. Приход электрона в биядерный центр компенсируется электрогенным захватом протона группой XР.
В диком типе, приход второго электрона завершает восстановление биядерного центра, что сопровождается захватом второго протона - на сей раз группой Е445. У мутанта восстановления биядерного центра вторым электроном не происходит, так как это восстановление нельзя компенсировать захватом второго протона.
В момент, когда СО отстреливается от гема d в мутанте, в биядерном центре находится один электрон и один протон. Отстрел СО понижает редокс-потенциал гема d, поэтому часть электронов с гема d уходит на гем b595, однако для этого не нужно подавать протон на группу Е445, поскольку это перемещение происходит в пределах биядерного центра и электрон уже скомпенсирован протоном на группе XР. Такое объяснение действительно подтверждается экспериментальным фактом, что перенос электрона между гемами d и b595 не сопряжен с генерацией мембранного потенциала, то есть с электрогенным захватом протона.
Рис 21. Предполагаемая схема внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd.
Мутация по аминокислотному остатку Е445 предотвращает полное двухэлектронное восстановление дитионитом двухгемового центра.
ВЫВОДЫ 1. Разработан простой и быстрый метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленную форму с использованием липофильных акцепторов электронов.
Проведено систематическое исследование взаимодействия окисленного, а также частично и полностью восстановленного фермента с лигандами - перекисью водорода, окисью углерода, цианидом, кислородом и NO с применением различных методов спектроскопии, электрометрии и амперометрии с высоким временным разрешением.
2. В окисленном ферменте, Н2О2 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Kd) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом b595. Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=O2-). Константа скорости второго порядка (kon) реакции перекиси с окисленным цитохромом bd оказалась равной 600 М-1 с-1.
3. Как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d. Кажущаяся Kd гема d с СО составляет 70-80 нМ. При высокой концентрации СО и цианида, в реакцию может вступать часть низкоспинового гема b558 (10-20%). Связывание СО с гемом b595 не превышает 6% даже при низких температурах. Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (~) гемов b595 и d, проявляющих антикооперативность в связывании лигандов.
4. Методом фемто/пикосекундной спектроскопии идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема b595 с максимумом поглощения около 440 нм.
5. Определено сродство цитохромов bd из E. coli и A. vinelandii к кислороду.
Кажущиеся значения Kd для оксикомплекса гема d составляют 280 и 500 нМ соответственно.
Измерены скорости связывания О2 с одноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd. В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2. Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер. Предполагается, что MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать О2 может только в одном из них.
6. Зарегистрированы быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента.
Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема d (Fe3+ЦOЦOЦ(H)). Связывание восстановленного цитохрома bd с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии - переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными. Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом.
7. Показано, что NO взаимодействует с гемом d в MV, R и оксоферрильной формах цитохрома bd. В MV и R ферментах, связывание NO приводит к образованию нитрозильного комплекса гема d (Fe2+ЦNO). NO реагирует с оксоферрильным интермедиатом цитохрома bd с kon = 1,2 105 M-1 с-1, образуя комплекс окисленного гема d с нитритом. Активность цитохрома bd ингибируется NO с кажущейся константой ингибирования 100 нМ при концентрации O2 ~70 мкМ.
8. Определены константы скорости спонтанной диссоциации O2, NО и СO от цитохрома bd в разных редокс-состояниях фермента. NO и СО диссоциируют из цитохрома bd гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз. Диссоциация этих лигандов из MV формы цитохрома bd замедлена в сравнении с R ферментом. Предполагается, что редокс-состояние гема b595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из активного центра цитохрома bd.
9. Проведена сравнительная характеристика мутантной формы фермента Е445А и цитохрома bd дикого типа. Мутация по высококонсервативному аминокислотному остатку Е445 предотвращает полное двухэлектронное восстановление дитионитом двухгемового центра фермента. Замена Е445А сильно тормозит перенос заряда поперек мембраны, связанный с окислением цитохрома bd кислородом, но не ингибирует генерацию потенциала, сопряженную с внутримолекулярным перераспределением электрона между гемами d и b558.
Е445 является одной из двух протонируемых групп, сопряженных с гемами b595 и d в активном центре. Анализ спектров кругового дихроизма цитохрома bd указывает на экситонные взаимодействия между восстановленными гемами b595 и d. Предлагается модель внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Борисов В.Б., Смирнова И.А., Красносельская И.А., Константинов А.А. (1994) Оксигенированный цитохром bd из Escherichia coli может быть превращен в окисленную форму липофильными акцепторами электронов. Биохимия, 59, 598-606.
2. Борисов В.Б., Геннис Р.Б., Константинов А.А. (1995) Взаимодействие цитохрома bd из Escherichia coli с перекисью водорода. Биохимия, 60, 315-327.
3. Borisov V., Gennis R., Konstantinov A.A. (1995) Peroxide complex of cytochrome bd:
kinetics of generation and stability. Biochem. Mol. Biol. Int., 37, 975-982.
4. Борисов В.Б. (1996) Цитохром bd: строение и свойства. Биохимия, 61, 786-799.
5. Azarkina N., Borisov V., Konstantinov A.A. (1997) Spontaneous spectral changes of the reduced cytochrome bd. FEBS Lett., 416, 171-174.
6. Borisov V., Arutyunyan A.M., Osborne J.P., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (1999) Magnetic circular dichroism used to examine the interaction of Escherichia coli cytochrome bd with ligands. Biochemistry, 38, 740-750.
7. Azarkina N., Siletsky S., Borisov V., Wachenfeldt C., Hederstedt L., Konstantinov A.A.
(1999) A cytochrome bbТ-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168. J. Biol. Chem., 274, 32810-32817.
8. Vos M.H., Borisov V.B., Liebl U., Martin J.-L., Konstantinov A.A. (2000) Femtosecond resolution of ligand-heme interactions in the high-affinity quinol oxidase bd: a di-heme active site? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 1554-1559.
9. Jasaitis A., Borisov V.B., Belevich N.P., Morgan J.E., Konstantinov A.A., Verkhovsky M.I. (2000) Electrogenic reactions of cytochrome bd. Biochemistry, 39, 13800-13809.
10. Borisov V.B., Sedelnikova S.E., Poole R.K., Konstantinov A.A. (2001) Interaction of cytochrome bd with carbon monoxide at low and room temperatures. Evidence that only a small fraction of heme b595 reacts with CO. J. Biol. Chem., 276, 22095-22099.
11. Borisov V.B. (2002) Defects in mitochondrial respiratory complexes III and IV, and human pathologies. Mol. Aspects Med., 23, 385-412.
12. Borisov V.B., Liebl U., Rappaport F., Martin J.-L., Zhang J., Gennis R.B., Konstantinov A.A., Vos M.H. (2002) Interactions between heme d and heme b595 in quinol oxidase bd from Escherichia coli: a femtosecond photoselection study. Biochemistry, 41, 1654-1662.
13. Borisov V.B. (2004) Mutations in respiratory chain complexes and human diseases. Ital.
J. Biochem., 53, 34-40.
14. Borisov V.B., Forte E., Konstantinov A.A., Poole R.K., Sarti P., Giuffre A. (2004) Interaction of the bacterial terminal oxidase cytochrome bd with nitric oxide. FEBS Lett., 576, 201204.
15. Belevich I., Borisov V.B., Zhang J., Yang K., Konstantinov A.A., Gennis R.B., Verkhovsky M.I. (2005) Time-resolved electrometric and optical studies on cytochrome bd suggest a mechanism of electron-proton coupling in the di-heme active site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3657-3662.
16. Belevich I., Borisov V.B., Konstantinov A.A., Verkhovsky M.I. (2005) Oxygenated complex of cytochrome bd from Escherichia coli: Stability and photolability. FEBS Lett., 579, 4567-4570.
17. Borisov V.B., Forte E., Sarti P., Brunori M., Konstantinov A.A., Giuffre A. (2006) Nitric oxide reacts with the ferryl-oxo catalytic intermediate of the CuB-lacking cytochrome bd terminal oxidase. FEBS Lett., 580, 4823-4826.
18. Borisov V.B., Forte E., Sarti P., Brunori M., Konstantinov A.A., Giuffre A. (2007) Redox control of fast ligand dissociation from Escherichia coli cytochrome bd. Biochem. Biophys.
Res. Commun., 355, 97-102.
19. Belevich I., Borisov V.B., Bloch D.A., Konstantinov A.A., Verkhovsky M.I. (2007) Cytochrome bd from Azotobacter vinelandii: evidence for high-affinity oxygen binding.
Biochemistry, 46, 11177-11184.
20. Belevich I., Borisov V.B., Verkhovsky M.I. (2007) Discovery of the true peroxy intermediate in the catalytic cycle of terminal oxidases by real-time measurement. J. Biol. Chem., 282, 28514-28519.
21. Arutyunyan A.M., Borisov V.B., Novoderezhkin V.I., Ghaim J., Zhang J., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (2008) Strong excitonic interactions in the oxygen-reducing site of bd-type oxidase: the Fe-to-Fe distance between hemes d and b595 is 10 . Biochemistry, 47, 1752-1759.
22. Борисов В.Б. (2008) Взаимодействие хинолоксидазы типа bd из Escherichia coli и окиси углерода: гем d связывает СО с высоким сродством. Биохимия, 73, 18-28.