Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Кутумова Елена Олеговна МОДУЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК:
ПОСТРОЕНИЕ, ВЕРИФИКАЦИЯ И УПРОЩЕНИЕ 03.01.02 - биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Красноярск - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Конструкторско-технологическом институте вычислительной техники СО РАН.
Научный консультант: доктор физико-математических наук Голушко Сергей Кузьмич
Официальные оппоненты:
Белобров Петр Иванович, доктор физико-математических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики СО РАН, ведущий научный сотрудник;
Садовский Михаил Георгиевич, доктор физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт вычислительного моделирования СО РАН, ведущий научный сотрудник.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Защита состоится 25 декабря 2012 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д003.007.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, д. 50 стр. 50.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики СО РАН.
Автореферат разослан 21 ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Л.А. Франк
Общая характеристика работы
Актуальность работы. Процесс генетически запрограммированной гибели клеток (апоптоз) играет важную роль в ходе развития многоклеточных организмов. Его нарушение тесно связано с серьезными патологиями, включающими развитие рака, нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний (MacFarlane et al., 2004). Однако многие иммуногенетические аспекты этого процесса (например, влияние его ингибиторов на процент гибели клеток) еще недостаточно изучены, и применение методов математического моделирования для их понимания является весьма актуальным.
Существует два основных подхода для моделирования сложных биологических систем. Первый из них основан на абстрагировании от конкретной физико-химической структуры биосистемы и исследовании ее функциональной организации при использовании принципов теории категорий. Второй подход, используемый в данной работе, направлен на изучение отдельных процессов, с одной стороны, отражающих ключевые аспекты системы и законы, которым она подчиняется, а с другой стороны, предполагающих достаточно простое математическое описание (Левич, 1982). Изучение внутриклеточных механизмов апоптоза при таком подходе привело к накоплению ряда математических моделей, каждая из которых характеризует различные сигнальные пути процесса. Поэтому в настоящее время стал актуальным вопрос их объединения и создания единой модели, позволяющей изучать его свойства при широком диапазоне начальных условий.
Объединение индивидуальных моделей апоптоза затрудняется тем, что они имеют разный уровень абстракции, т.е. могут описывать одни и те же сигнальные пути, используя разные цепочки реакций, химическую кинетику или множества параметров разного порядка. При этом размерность большинства из них существенно превосходит объем экспериментальных данных, используемых для их верификации, что позволяет усомниться в адекватности некоторых предсказаний, порождаемых данными моделями. Таким образом, становится обоснованной редукция моделей, позволяющая упростить процесс их объединения посредством выявления ключевых элементов (белков, реакций и т.д.), влияющих на экспериментальную динамику процесса.
Для формального описания исследуемых нами моделей используются системы обыкновенных дифференциальных уравнений, которые, как правило, являются нелинейными и жесткими. Для их решения, сложность которого состоит в необходимости использования очень малых шагов по времени, существует ряд численных методов (Ракитский, 1979; Новиков, 1997; Новиков и др., 2010), к которым, например, относятся VODE (Brown, 1989) и методы типа Розенброка (Rosenbrock, 1963). Моделируемое при этом решение соответствует поведению одной клетки или их популяции с одинаковыми начальными данными. Для учета стохастических эффектов, при которых динамика клеток в популяции различается, может быть применен метод Gillespie (Gillespie, 1977) или одна из его модификаций, например, Gibson-Bruck (Gibson, Bruck, 2000).
Цель работы заключается в построении комплексной модели про- и антиапоптотических путей, ее верификации, проведении качественного и количественного анализа ее свойств, изучении влияния ингибиторов апоптоза на уровень гибели клеток млекопитающих.
Объектом исследования являются механизмы регуляции апоптоза внутренними и внешними сигналами. В качестве предмета исследования рассмотрены сигнальные пути, индуцируемые Урецепторами смертиФ CD95, TNFR-1 и TRAIL-R, инициация апоптоза за счет каспазы-12, а также его регуляция стимулами выживания (NF-B, p53, EGF). Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.
1. Построить модель про- и антиапоптотических путей на основе известных моделей, а также информации, накопленной в базах данных биохимических путей (Reactome, BioModels).
2. Используя известные экспериментальные данные, выполнить верификацию сигнальных путей апоптоза, индуцируемого CD95 и регулируемого транскрипционным фактором NF-B:
в ходе редукции исходных моделей определить ключевые параметры и реакции, которые влияют на динамику переменных, фиксируемых экспериментальными данными;
проанализировать последовательность шагов, необходимых для объединения редуцированных моделей;
выполнить идентификацию параметров объединенной модели;
осуществить анализ ее предсказаний.
3. На основе верифицированной модели при помощи методов стохастического моделирования:
определить критические концентрации лиганда CD95L, превышение которых ведет к гибели 50% и 100% клеток на примере клеточных линий SKW 6.4 и HeLa;
исследовать влияние повышенного и пониженного уровня ингибитора апоптоза сFLIP на эти концентрации.
Положения, выносимые на защиту.
1. Комплексная модель регуляции апоптоза с учетом идентификации кинетических параметров и концентраций веществ сигнальных путей CD95 и NF-B, включая анализ предсказательной способности этих путей.
2. Значения концентрации CD95L, необходимые для гибели 50% и 100% клеток SKW 6.4 и HeLa, приведенные в таблице 1 с учетом увеличения и уменьшения концентрации cFLIP в два раза.
Таблица 1. Критические концентрации CD95L, превышение которых ведет к гибели соответствующего процента клеток (точность - 0.2%).
Концентрация anti-CD95 (CD95L), нг/мл Процент Комплексная Пониженный Повышенный гибели модель cFLIP (в 2 раза) cFLIP (в 2 раза) клеток SKW 6.4 HeLa SKW 6.4 HeLa SKW 6.4 HeLa 50% 25.1 80.4 12.5 40.5 50.2 160.100% 48.2 92.7 24.1 47.2 96.4 184.Научная новизна.
1. Предложен подход к объединению математических моделей на основе их редукции, который позволил построить новую модель сигнальных путей CD95 и NF-B, воспроизводящую динамику экспериментальных данных исходных моделей.
2. Исследована зависимость уровня гибели клеток от концентрации CD95L с учетом влияния ингибитора апоптоза cFLIP.
Практическая значимость полученных результатов включает следующие аспекты:
рекомендуемый подход к редукции и объединению моделей может быть применен для анализа и развития широкого круга математических моделей биологических систем;
построенная модель апоптоза может быть использована для решения прикладных задач молекулярной биологии, таких как изучение механизмов его регуляции и проведение in silico исследований различных хемотерапевтических веществ.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации были представлены на следующих научных мероприятиях: IX, XI и XII международных конференциях по системной биологии ICSB (Гетеборг, Швеция, 2008; Эдинбург, Великобритания, 2010; Хайдельберг, Германия, 2011), VII международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии BGRS (Новосибирск, 2010), международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии MCCMB (Москва, 2011), международной конференции по современным проблемам математики, информатики и биоинформатики, посвященной 100-летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР Алексея Андреевича Ляпунова (Новосибирск, 2011), объединенном семинаре Института вычислительных технологий СО РАН, Конструкторскотехнологического института вычислительной техники СО РАН и Новосибирского государственного университета (научные руководители: академик Ю.И. Шокин, чл.-корр. РАН А.М. Федотов, д.ф.-м.н. С.К. Голушко; Новосибирск, 2012), семинаре по теоретической биофизике Института биофизики СО РАН (научный руководитель:
д.ф.-м.н. С.И. Барцев; Красноярск, 2012).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в печатных работах [1-11], включая 3 статьи в рецензируемых научных журналах [1-3], 1 статью в трудах международной конференции [4], публикаций в сборниках тезисов международных конференций [5-11].
ичный вклад. Результаты, составляющие основное содержание диссертации, получены автором самостоятельно. В совместных работах [1, 5-7, 9] автор разработал модульную модель апоптоза. В работах [3, 10] автором проведен анализ моделей, включая их редукцию, сравнение и объединение. В работах [4, 8] автор участвовал в создании программных модулей методов редукции, оптимизации и анализа моделей на базе платформы BioUML (
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, списков обозначений и литературы, а также 4-х приложений. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, включая 27 рисунков и 32 таблицы, 8 из которых приведены в приложениях. Список литературы содержит 125 наименований.
Автор выражает глубокую признательность д.ф.-м.н. C.К. Голушко и к.б.н. Ф.А. Колпакову за всестороннюю поддержку и внимание в ходе выполнения работы, а также благодарит к.ф.-м.н. А.Ю. Зиновьева, PD Dr. rer. nat. И.Н. Лаврик и Р.Н. Шарипова за ценные обсуждения и критические замечания.
Содержание диссертации Во Введении обоснована актуальность темы исследований, сформулированы цель работы и поставленные задачи, раскрыта научная новизна и практическая значимость работы, перечислены основные положения, выносимые на защиту.
Глава 1. Обзор литературы В данной главе освещены научные публикации по изучаемой тематике, включая описание исследуемого процесса и методов анализа математических моделей биологических систем.
В з 1.1 дано определение апоптоза, характеризация его функций и фаз, изложено развитие представлений о нем.
В з 1.2 содержится описание биологических стандартов моделирования SBML (Hucka M et al., 2003) и SBGN (Le Novre N et al., 2009), а также электронных баз данных биохимических путей Reactome (Joshi-Tope et al., 2005) и BioModels (Le Novre et al., 2006), используемых в ходе работы.
В з 1.3 приведен обзор методов анализа математических моделей биологических систем, включая работы таких авторов как А.Н. Горбань, А.Ю. Зиновьев, P. Mendes, H.V. Westerhoff, W. Klonowski и J.J. Tyson.
Глава 2. Методы исследования биологических систем Данная глава формализует методологию моделирования биологических систем, а также реализацию всех необходимых методов анализа в программном комплексе BioUML.
В з 2.1 даны необходимые определения. Математическая модель представляет собой четверку множеств, где - множество веществ, концентрации которых зависят от времени,, и задаются вектором ;
- множество биохимических реакций со скоростями ;
- множество кинетических констант, где для и :
o - константы скоростей реакций;
o - константы Михаэлиса;
- множество дискретных событий, каждое из которых рассматривает некоторый логический оператор,, и определяется следующим образом: если существует момент времени, такой что значение истинно, а значения для всех ложны, то в этот момент времени происходит скачкообразное изменение параметров и концентраций заданного подмножества веществ :
Скорости реакций вычисляются согласно одному из стандартных кинетических законов на основе закона действующих масс или уравнения Михаелиса-Ментен (Коган и др., 2005). Для описания поведения системы во времени рассматривается задача Коши:
(1) где - стехиометрическая матрица. Будем говорить, что вектор является стационарным состоянием системы (1), если При этом - вектор стационарных скоростей модели.
Идентификация параметров и начальных концентраций системы (1) осуществляется на основе экспериментальных данных, которые соответствуют набору точек, фиксирующих значения переменных,, вектора в заданные моменты времени,,. Задача идентификации сводится к нахождению минимума целевой функции расстояний (Hoops et al., 2006):
(2) где и - экспериментальные и полученные в ходе численного моделирования значения переменных в момент времени, а веса вычисляются по формуле среднего квадратичного значения и учитываются для того, чтобы все переменные имели одинаковую значимость. При этом.
Для решения указанной задачи существует ряд оптимизационных методов (Mendes, Kell, 1998). При этом важным аспектом в ходе анализа модели является нахождение ключевых параметров, которые влияют на изменение динамики переменных, фиксируемых экспериментальными данными. В связи с этим на основе информационного критерия Акаике (Quaiser et al., 2011) вычисляется относительная сложность модели (3) где соответствует мощности множества параметров, функция определяется по формуле (2) с весами (вместо ), а значения вычисляются по правилу (Schilling et al., 2009):
Если для некоторого индекса выполняется или полагаем.
Уменьшить относительную сложность моделей позволяют методы редукции (Gorban et al., 2009), направленные на преобразование системы (1) в систему более низкого порядка без существенного изменения динамики переменных.
Минимальной аппроксимацией модели будем называть модель с минимальным числом элементов (веществ и реакций), для которой значение функции (2) превышает исходное значение не более чем на 20%. Указанный порог обусловлен тем, что в текущей работе рассматриваются экспериментальные данные, полученные с помощью технологии Вестерн-блот с учетом стандартного отклонения 15-20% (Bentele et al., 2004; Neumann et al., 2010).
Еще один подход, позволяющий упростить анализ больших моделей - разбиение четверки на подмножества, называемые модулями [9].
Каждый модуль содержит множество входных, выходных и контактных портов. Первые два типа портов характеризуют переменные модели, вычисляемые в одном модуле и передаваемые в другой посредством ориентированного соединения. Контактные порты определяют общие переменные при помощи неориентированных соединений. Модульное представление позволяет анализировать отдельные части модели и комбинировать различные модули в зависимости от решаемой задачи.
В з 2.2 приводится информация о методах оптимизации [8], предназначенных для решения нелинейных задач идентификации параметров модели (1) путем минимизации функции расстояний (2).
Описана реализация этих методов в программном комплексе BioUML.
В з 2.3 изложены реализованные в BioUML методы анализа моделей [4], включая исследование законов сохранения массы веществ (Sauro, Ingalls, 2004), чувствительности стационарных состояний (Rabitz et al., 1983), контроля метаболизма (Reder, 1988) и квазистационарных состояний системы (Choi et al., 2008).
В з 2.4 дано описание методов редукции, используемых в работе.
Глава 3. Построение модульной модели апоптоза Процесс создания комплексных моделей на основе индивидуальных моделей различных сигнальных путей одной и той же системы в некотором роде представляет собой собирание конструктора, в котором каждая модель - отдельная деталь [5].
В з 3.1 дана характеристика моделей апоптоза, использованных для построения модульной модели этого процесса.
В з 3.2 приводится описание модульной модели. Сигнальные пути апоптоза, выделенные на основе исходных моделей, а также биохимических путей, накопленных в электронных базах данных Reactome и BioModels, можно разделить на 13 модулей (рис. 1А). К ним относятся активация каспазы-8, индуцируемая рецепторами смерти (TRAIL-R, CD95, TNFR-1); внутренний путь апоптоза, ведущий к высвобождению цитохрома - и Smac из митохондрий; активация каспазы-3 под действием этих молекул; активация эффекторных каспаз, вызываемая каспазами-8 и -12; модуль инактивации PARP, деградационная фаза апоптоза, а также его регуляция стимулами выживания NF-B, p53 и EGF [1, 6, 7].
Модель содержит 280 белков, включая их комплексы, модификации (например, фосфорелирование) и различные формы одной молекулы (каспаза и прокаспаза), 372 реакции на основе кинетики МихаелисаМентен и закона действующих масс, а также 459 параметров.
В з 3.3 перечислены трудности, связанные с идентификацией параметров модели. Первым шагом в этом направлении стал анализ сигнальных путей апоптоза, индуцируемого рецептором CD95 и регулируемого транскрипционным фактором NF-B.
Рис. 1. Модульная модель апоптоза. А. Модель, состоящая из 13 функциональных модулей. Б. Графическая нотация представления модели в BioUML.
Глава 4. Комплексная модель сигнальных путей рецептора CDВ данной главе рассматриваются две математические модели, описывающие сигнальные пути рецептора CD95 (Bentele et al., 2004;
Neumann et al., 2010). Первая из них касается проапоптотических свойств CD95 после его стимуляции природным лигандом CD95L или агонистическими антителами (anti-CD95). Эта стимуляция ведет к образованию сигнального комплекса DISC, активации каспазного каскада и расщеплению поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), после которого процесс апоптоза становится необратимым (рис. 2А).
Рис. 2. Модель индукции апоптоза рецептором CD95 и результаты ее редукции. А.
Исходная модель, разделенная на модули. Белки, сохраненные в ходе редукции, выделены цветом. Б. Модульное представление модели. Пунктирные линии обозначают соединения, удаленные в ходе редукции. В. Минимальная модель, полученная в результате редукции. Г. Графическая нотация SBGN, используемая для представления моделей А и В.
Вторая модель характеризует состояние системы, при котором CDпомимо клеточной гибели способствует активации антиапоптотических путей посредством индукции транскрипционного фактора NF-B, что является возможным за счет расщепления клеточного белка cFLIPL до элемента p43-FLIP внутри комплекса DISC (рис. 3А). Анализ этих моделей позволил построить комплексную модель сигнальных путей CD95, которая объединяет экспериментальную динамику исходных моделей и обладает хорошей предсказательной способностью [3].
В з 4.1 изложен алгоритм объединения математических моделей со сравнимыми множествами параметров.
Рис. 3. Модель CD95-индуцируемого апоптоза, регулируемого NF-B, и результаты ее редукции. A. Исходная модель, разделенная на модули. Белки, сохраненные в ходе редукции, выделены цветом, реакции - сплошными линиями. Б. Модульное представление модели.
Шаг 1. Разбиение моделей на модули. Этот шаг позволяет упорядочить процессы, происходящие в моделях, и упрощает их анализ.
Шаг 2. Нахождение минимальной аппроксимации каждого из модулей на основе экспериментальных данных. Соотношения между параметрами моделей при фиксированных значениях устанавливают область их применимости. Использование методов редукции в этих областях помогает сократить число реакций и белков, попадающих в пересечение моделей [10] и, следовательно, облегчает их объединение.
Шаг 3. Объединение моделей выполняется последовательно для каждого из модулей на основе аналитических рассуждений. В частности:
если экспериментальные данные моделей были получены для разных клеток, начальные концентрации белков для них могут различаться;
константы скоростей реакций, за исключением процессов деградации и синтеза белков, едины для всех клеточных линий; скорости указанных процессов в разных клетках могут не совпадать и, более того, зависеть от начальной концентрации CD95L (Bentele et al, 2004);
клеточные линии в зависимости от типа могут характеризоваться разными цепочками реакций; например, в клетках типа I и типа II (Scaffidi et al., 1998) различаются механизмы активации каспазы-3;
если модели используют разные законы кинетики или цепочки реакций, описывающие один и тот же процесс, то выбор между ними осуществляется на основании сложности, вычисленной согласно критерию Акаике (3) и отнесенной к числу экспериментальных точек, фиксирующих динамику элементов рассматриваемой цепочки.
Шаг 4. Идентификация параметров. Если в ходе объединения моделей их экспериментальная динамика нарушилась, необходимо выполнить идентификацию параметров с использованием одного из методов оптимизации.
Шаг 5. Связь с исходными моделями устанавливается на основе соотношений, определяемых на шаге 2. Если при объединении моделей эти соотношения сохранились, комплексная модель может быть дополнена удаленными в ходе редукции элементами.
В з 4.2 описана редукция модели Bentele и соавт. [2-3, 11], в результате которой эта модель, разделенная на 3 модуля (рис. 2Б) и состоящая из 43 переменных, 80 реакций и 45 параметров, была сведена к минимальной аппроксимации, включающей 18 переменных (динамика 11 из которых задается экспериментальными данными), 25 реакций и параметров без учета постоянных концентраций белков (табл. 2, рис.
2В). Экспериментальная динамика модели, сформулированная авторами для клеточной линии SKW 6.4, при этом не изменилась (рис. 4).
В з 4.3 описана аппроксимация модели Neumann и соавт. [11].
Поскольку эта модель (рис. 3А-Б) уже была упрощена (авторы производили упрощение на основе аналитических рассуждений до тех пор, пока качество согласия моделируемых и экспериментальных значений переменных снижалось незначительно), наше изменение модели оказалось не таким масштабным, как в предыдущем случае. Тем не менее нам удалось сократить число переменных модели с 23 до 20, реакций - с 23 до 18, а кинетических констант - с 17 до 15. Динамика переменных, экспериментально измеренных при использовании клеток HeLa, осталась неизменной (рис. 5).
В з 4.4 объединение моделей сигнальных путей CD95 производилось согласно алгоритму, описанному в параграфе 4.1. Итоговая модель (рис.
6А-Б) содержит 30 белков, 38 реакций и 30 параметров. Модель показала хорошее соответствие между результатами вычислительных и натурных экспериментов (рис. 3, 5) и согласно критерию Акаике имеет тот же уровень сложности, что и упрощенные модели Neumann и соавт., а также Bentele и соавт. Анализ чувствительности стационарных состояний модели для разных начальных концентраций CD95L показал, что эти состояния являются более устойчивыми по сравнению с первоначальными моделями [3].
В з 4.5 исследуется предсказательная способность объединенной модели. Для этого предсказания, сформулированные авторами исходных моделей, были разделены на две группы: качественные и количественные. Первая из них характеризует белковые взаимодействия Таблица 2. Список реакций модели Bentele и соавт. (без учета реакций деградации белков) и соответствующие им реакции упрощенной модели.
Исходная модель Упрощенная модель № Реакции (Кинетика)1 № Реакции (Кинетика) Активация каспазы-8, индуцированная CDbr1 CD95L + CD95R СD95R:СD95L (МК) br1* CD95L DISC (kLR CCD95R br2 FADD + СD95R:СD95L DISC (МК) CCD95L, CCD95R - функция от CCD95R(0), CCD95L(0) и t).
br3 pro8 + DISC DISC:pro8 (МК) br4 pro8 + DISC:pro8 DISC:pro82 (МК) br5 DISC:pro82 DISC:p43/p41 (МК) br2* pro8 ЦDISC caspbr6 DISC:p43/p41 casp8 + DISC (МК) (kDISC_pro8 Сpro8 CDISC) Активация каспазы-8 под действием каспазы-br7 pro6 -casp3 casp6 (M-M) br3* pro8 Цcasp3 caspbr8 pro8 -casp6 casp8 (M-M) (k38 Ccasp3) Ингибирование комплекса DISC br9 DISC + cFLIPL DISC:cFLIPL (МК) br4* cFLIP + 2DISC + pro8 br10 pro8 + DISC:cFLIPL DISC:cFLIPL:pro8 (МК) DISC:FLIP:pro(kDISC_FLIP CFLIP CDISC) br11 DISC + cFLIPS blocked DISC (МК) br12 DISC:pro8 + cFLIPL DISC:cFLIPL:pro8 (МК) br5* DISC:FLIP:pro8 p43/pbr13 DISC:pro8 + cFLIPS blocked DISC (МК) (kDFp8 CDISC:FLIP:pro8) br14 DISC:cFLIPL:pro8 p43/p41 + blocked DISC (МК) Активация каспазы-9 под действием цитохрома - br15 Cyt C stored Cyt C (frelease(t)CCyt C stored(0)) br6* pro9 (функция от Cpro9(0), br16 Apaf-1 + Cyt C Cyt C:Apaf-1 (МК) CCyt C stored(0) и t) br17 Cyt C:Apaf-1 Apaf-1 + Cyt C (МК) br18 pro9 + Cyt C:Apaf Apop (МК) br19 Apop -casp3 casp9 + Cyt C:Apaf-1 (M-M) br20 Apop casp9 + Cyt C:Apaf-1 (МК) Активация Bid br21 pro2 Цcasp3 casp2 (M-M) br7* Bid Цcasp8 tBid br22 Bid Цcasp8 tBid (M -M) (k8Bid/Km8Bid Ccasp8CBid) br23 Bid Цcasp2 tBid (M -M) br8* pro2 Цcasp3 (k32 Ccasp3 Cpro2/(Cpro2 + Km32)) Блокирование IAP посредством Smac br24 Smac stored Smac (frelease(t)CSmac stored(0)) br25 Smac + IAP IAP:Smac (МК) - br26 IAP:Smac Smac + IAP (МК) Активация каспаз-3 и -br27 pro3 Цcasp8 casp3 (M-M) br9* pro3 Цcasp8 casp3 (M-M) br28 pro3 Цcasp9 casp3 (M-M) br29 pro7 Цcasp8 casp7 (M-M) br10* pro7 Цcasp8 br30 pro7 Цcasp9 casp7 (M-M) (k78/Km78 Ccasp8Cpro7) Инактивация PARP br31 PARP -casp3 cPARP (М-М) br11* PARP -casp3 cPARP (k3act/Km367act Ccasp3CPARP) br32 PARP Цcasp7 cPA RP (М-М) Ингибирование каспаз-3, -7 и -br33 casp3 + IAP casp3:IAP (МК) br12* casp3 + IAP inhibition (MK) br34 casp7 + IAP casp7:IAP (МК) br35 casp9 + IAP casp9:IAP (МК) br36 casp3:IAP casp3 + IAP (МК) br37 casp7:IAP casp7 + IAP (МК) br38 casp9:IAP casp9 + IAP (МК) Продуцирование виртуальной переменной Apoptotic Activity (AA) br39 AA ((1 - CAA) / (Km367act + 1 - CAA) (k36act Ccasp3 + br13* AA ((k36act + 0.18 k7act) / k36act Ccasp6 + k7act Ccasp7)) Km367act (1 - CAA) Ccasp3) МК - массовая кинетика, М-М - кинетика МихаэлисаЦМентен Рис. 4. Результаты аппроксимации экспериментальных данных Bentele и соавт.
(точки) для исходной модели (красный), упрощенной модели (черный) и объединенной модели (синий). При совпадении значений синие и черные точки были опущены. Поскольку данные были получены при помощи технологии Вестернблот и выражены в условных единицах измерения, точные значения вычислялись относительно результатов численного моделирования концентраций. При рассмотрении концентрации прокаспазы-8 в исходной модели необходимая динамика наблюдалась только для отдельного белка, а не для суммарной концентрации, как ожидалось из экспериментов. Поэтому при идентификации параметров объединенной модели рассматривался общий уровень концентрации.
моделей. К этой группе мы отнесли утверждение о том, что про- и антиапоптотические пути CD95-индуцируемого апоптоза расходятся в комплексе DISC (Neumann и соавт.). Поскольку цепочка реакций, соответствующая этому факту, в ходе объединения моделей была сохранена, данное предсказание осталось в силе.
Вторая группа количественных предсказаний описывает поведение моделей в ответ на изменение начальных концентраций лиганда CD95L, рецептора CD95R, прокаспазы-8, белков cFLIPL и cFLIPS, а также ингибитора IAP. Анализ этой динамики для объединенной модели показал, что все предсказания, сформулированные Neumann и соавт., остались в силе (табл. 3). При этом поведение объединенной модели несколько отличается от поведения модели Bentele и соавт. Тем не менее динамика исследуемых переменных остается в согласии с экспериментальными данными этих авторов (табл. 4).
В з 4.6 описана связь объединенной модели с исходными моделями апоптоза. Эта связь определяется на основе параметрических ограничений, использованных для редукции моделей.
В з 4.7 исследуется предсказываемая объединенной моделью зависимость уровня гибели клеток от начальной концентрации Рис. 5. Сравнение экспериментальных данных Neumann и соавт. (точки) с результатами численного моделирования концентраций для упрощенной модели (сплошные линии) и объединенной модели (пунктирные линии). Данные представлены для трех концентраций anti-CD95: 1500 нг/мл (черный), 500 нг/мл (синий) и 250 нг/мл (красный). Относительные значения экспериментальных данных были пересчитаны (как и в случае модели Bentele и соавт.) для прокаспазы-3 и каспазы-3. Для остальных белков этого не делалось, т. к. отклонение между значениями, полученными для обеих моделей, было незначительно. Для указанных элементов вычисленные значения были нормированы с целью визуального восприятия графиков функций (нормировочный коэффициент - 0.1).
anti-CD95. С этой целью находится последовательность численных решений модели при помощи стохастического алгоритма Gibson-Bruck.
Каждое решение описывает поведение одной клетки в ответ на стимуляцию соответствующей концентрацией anti-CD95. В случае когда концентрация cPARP (расщепленный белок PARP) достигает 10% от начальной концентрации PARP, клетка считается погибшей (Gaudet, 2012). На рис. 7 показан уровень гибели в популяции 104 клеток с учетом влияния концентрации ингибитора апоптоза cFLIP.
Рис. 6. Объединенная модель сигнальных путей CD95 и NF-B. A. Представление модели в формате SBGN. Реакции, имена которых начинаются с УnrФ, взяты из модели Neumann и соавт., с УbrФ - из модели Bentele и соавт. Символ У*Ф обозначает реакции редуцированных моделей. Индекс УmФ указывает на реакции, измененные в ходе объединения моделей. Б. Модульное представление модели.
Таблица 3. Анализ предсказаний объединенной модели для клеток HeLa.
№2 Динамика модели Предсказания Neumann и соавт.Концентрация anti-CD95, необходимая для индукции апоптоза, составляет 30-100 нг/мл и не изменяется при уменьшении уровня CD95 в 12 раз. Время численного эксперимента - 1* часов.
Понижение концентрации рецептора влечет ослабление сигнальных путей CD95 и NF-B.
Для подтверждения этого факта анализируются скорости расщепления каспазы-8 и деградации 2* белка IB- после стимуляции клеток с помощью 500 нг/мл anti-CD95 при исходном (сплошные линии) и уменьшенном в 12 раз (пунктирные линии) уровне CD95.
При увеличении концентрации антител antiCD95 с 500 нг/мл до 1500 нг/мл концентрация p43/p41 достигает максимального уровня (пика) раньше, в то время как время пика p43-FLIP не 3* изменяется.
Увеличение концентрации cFLIPS сдерживает сигнальные пути CD95 и NF-B. При этом генерация p43-FLIP ингибируется при более низком уровне cFLIPS, чем генерация p43/p41.
Повышение cFLIPL ведет к резкому росту p43FLIP. Пониженный уровень cFLIPL соответствует малому количеству p43-FLIP, но не влияет на уровень p43/p41.
5* При очень высоких концентрациях cFLIPL белок p43-FLIP не генерируется, что не было подтверждено авторами экспериментально.
Только средний уровень cFLIPL способствует активации NF-kB. Снижение концентрации прокаспазы-8 ведет к снижению уровня p43FLIP и, следовательно, NF-B. На рисунке 6* показана логарифмическая зависимость максимальной концентрации NF-B от начальных значений прокаспазы-8 и cFLIPL.
Предсказания, отмеченные *, экспериментально протестированы Neumann и соавт.
Время численных экспериментов в предсказаниях 3-7 - 360 мин. Концентрация anti-CD95 в предсказаниях 4-7 - 1000 нг/мл.
Таблица 3 (продолжение).
Высокая концентрация cFLIPL также как и пониженная концентрация прокаспазы-8 ведут к устойчивому подавлению апоптоза.
На рисунке показана та же зависимость, что и в 7* предыдущем предсказании, только для каспазы3 вместо NF-B.
Таблица 4. Предсказания моделей для клеток SKW 6.4.
Экспериментальные наблюдения Bentele и № Поведение моделей соавт., предсказания моделейЭксперименты Bentele и соавт.:
для 1 нг/мл anti-CD95 расщепление PARP не наблюдается;
для 10 нг/мл anti-CD95 смертность клеток составляет 20-30%.
Исходная модель (красный):
1 апоптотическая граница5 - 1.9 нг/мл;
резкий рост cPARP при достижении antiCD95 апоптотической границы.
Объединенная модель (синий):
апоптотическая граница - 3.5 нг/мл;
плавный рост cPARP с увеличением концентрации anti-CD95.
Эксперименты Bentele и соавт.: снижение регуляции cFLIP (на 70%) в клетках SKW 6.посредством добавления циклогексимида ведет к гибели клеток (40% за 1 день) уже при 1 нг/мл anti-CD95.
Исходная (красный) и объединенная (синий) модели:
апоптотическая граница чувствительна к концентрации cFLIP;
уменьшение концентрации cFLIP на 51% для исходной и 49% для объединенной модели ведет к клеточной гибели при 1 нг/мл antiCD95.
Время численных экспериментов во всех предсказаниях - 2880 мин. (2 дня).
Апоптотическая граница соответствует концентрации anti-CD95, для которой уровень cPARP превышает 10% от начальной концентрации PARP.
Таблица 4 (продолжение).
Эксперименты Bentele и соавт.: в случае, когда уровень anti-CD95 составляет 10 нг/мл, рост концентрации каспазы-8 наблюдается более чем через 4 часа.
Исходная (красный) и объединенная (синий) модели: концентрации anti-CD95, немного превосходящие апоптотическую границу, способствуют значительной задержке в активации каспазы-8.
На рисунке показана зависимость времени пика каспазы-8, превышающей 0.1% концентрации прокаспазы-8, от уровня anti-CD95.
Исходная модель:
низкие концентрации IAP (не более нмоль/л) ведут к полной гибели клеток;
высокие концентрации IAP предотвращают значительный рост каспазы-3 даже при высоких концентрациях лиганда.
Объединенная модель:
4 низкие концентрации IAP (не более нмоль/л) блокируют апоптоз при уровне CD95L, не превосходящем 0.3 нмоль/л;
высокие концентрации CD95L ведут к клеточной гибели.
На рисунках показана логарифмическая зависимость максимальной концентрации каспазы-3 от начальных значений IAP и CD95L.
Рис. 7. Зависимость уровня гибели клеток SKW 6.4 (A) и HeLa (Б) от начальной концентрации anti-CD95 согласно предсказаниям объединенной модели апоптоза при исходном (красный), уменьшенном в два раза (черный) и увеличенном в 2 раза (синий) уровне cFLIP.
В Заключении сформулированы основные выводы работы.
1. Построена модульная модель апоптоза, регулируемого стимулами выживания, с учетом сигнальной фазы (рецепторно-зависимый и митохондриальный пути, индукция апоптоза каспазой-12), эффекторной (каспазный каскад) и деградационной фаз, а также антиапоптотических сигнальных путей (NF-B, EGF, p53).
2. Проведена полная или частичная верификация различных модулей модели: модуля CD95L, модулей активации эффекторных каспаз каспазой-8, активации NF-B и инактивации PARP, модуля цитохрома Ц, а также митохондриального модуля.
3. Для верифицированной подмодели проведен анализ предсказаний и установлена зависимость уровня гибели клеток (SKW 6.4 и HeLa) от начальной концентрации anti-CD95. Исследовано влияние концентрации белка cFLIP (ингибитора апоптоза) на этот уровень.
Список публикаций по теме диссертации В рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК 1. Kutumova E.O., Kiselev I. N., Sharipov R.N., Lavrik I.N., Kolpakov F.A.
A modular model of the apoptosis machinery // Advances in Experimental Medicine and Biology. 2012. V. 736, Part 2. PP. 235-245.
2. Кутумова Е.О. Редукция модели CD95-индуцируемого апоптоза // Математическая биология и биоинформатика. 2012. Т. 7, № 1. С. 139151.
3. Кутумова Е.О., Зиновьев А.Ю., Шарипов Р.Н., Колпаков Ф.А.
Применение методов редукции для построения комплексной модели апоптотических путей // Математическая биология и биоинформатика. 2012. Т. 7, № 2. C. 572-588.
В трудах международных конференций 4. Kutumova E.O., Zinovyev A.Y., Sharipov R.N. BioUML: a plug-in for model reduction // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology. Jul 21-24, 2011. Moscow, Russia.
PP. 188-189.
В сборниках тезисов международных конференций 5. Likhovidova E., Sharipov R., Kolpakov F. Integrated model of apoptosis // The 9th International Conference on Systems Biology. Aug 22-28, 2008. Gteborg, Sweden. P. 124.
6. Kutumova E.O., Sharipov R.N., Lavrik I.N., Kolpakov F.A. Modular modeling of the apoptosis machinery // The 7th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Jun 20-27, 2010.
Novosibirsk, Russia. P. 156.
7. Kutumova E., Sharipov R., Kolpakov F. Modular approach to modeling of the apoptosis machinery // The 11th International Conference on Systems Biology. Oct 10-16, 2010. Edinburgh, UK. P. 17.
8. Kutumova E., Tolstykh N., Sharipov R., Kolpakov F. The Optimization Plug-in for the BioUML Platform // The 11th International Conference on Systems Biology. Oct 10-16, 2010. Edinburgh, UK. P. 188.
9. Kiselev I., Kutumova E., Sharipov R., Kolpakov F. BioUML plug-in for Modular Modeling // The 12th International Conference on Systems Biology. Aug 28-Sep 1, 2011. Heidelberg, Germany. P. 229.
10. Kutumova E., Sharipov R., Zinovyev A., Kolpakov F. Comparison of CD95 signaling and mitochondria-dependent apoptosis models using methods of model reduction // The 12th International Conference on Systems Biology. Aug 28-Sep 1, 2011. Heidelberg, Germany. P. 142.
11. Кутумова Е.О. Редукция модели CD95-индуцируемого апоптоза // Международная конференция УСовременные проблемы математики, информатики и биоинформатикиФ, посвященная 100-летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР А.А. Ляпунова, 11-октября. 2011. Новосибирск, Россия. С. 76.