Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
Седанова Анна Викторовна
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ УГЛЕРОДНЫЕ ГЕМОСОРБЕНТЫ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ СОРБЦИИ СОЕДИНЕНИЙ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ
Специальность 02.00.04 - Физическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Омск - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской академии наук
Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Лихолобов Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
Фисюк Александр Семенович, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Омский государственный университет им. Ф.М.
Достоевского, заведующий кафедрой органической химии ОМГУ, заведующий лабораторией органического синтеза Миронова Елена Юрьевна, кандидат химических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Омский государственный технический университет, доцент кафедры Физическая химия
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук
Защита состоится л17 апреля 2012 г. в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 212.178.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омский государственный технический университет по адресу: 644050, г. Омск, пр. Мира, 11, корпус 6, ауд. 340, тел. / факс: (3812) 65-64-92, e-mail: dissov_omgtu@omgtu.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Омский государственный технический университет
Автореферат разослан л12 марта 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Юрьева А. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время большое внимание уделяется изучению особенностей адсорбции белковых молекул из модельных растворов на поверхности сорбентов различной природы [1-2]. Актуальность данных исследований связана с разработкой биоспецифических сорбентов для избирательной адсорбции токсичных веществ белкового происхождения, накапливающихся в организме при онкологических, иммунных, инфекционных и других заболеваниях (прионы, провоспалительные цитокины, продукты вирусов и бактерий, бета амилоид, тау-белок и др.) [3-5]. Известно, что такие патогенные соединения относятся к белкам средней молекулярной массы.
Особый интерес представляют поверхностные явления в системе луглеродные материалы - белковые соединения.
Углеродные сорбенты перспективны в качестве носителей для создания биоспецифических сорбентов, что обусловлено их уникальными свойствами.
Для повышения адсорбционных свойств сорбентов по отношению к соединениям белковой природы используют химическое модифицирование углеродной поверхности функциональными группами: окисление поверхности, иммобилизация аминокислот, ферментов и т.д.
В данной работе впервые приводятся результаты исследований особенностей адсорбции белков углеродными гемосорбентами, модифицированными органическими кислотами с их последующей поликонденсацией. Данный способ используется впервые применительно к углеродным гемосорбентам и представляет значительный интерес, т. к. выбранное направление модифицирования позволяет получить широкий спектр эффективных сорбентов, специфически связывающих белковые соединения.
Соответствующие исследования актуальны как в теоретическом отношении (выявление и объяснение закономерностей адсорбции белков на углеродной поверхности, локально модифицированной полимерами), так и в практическом плане (создание биоспецифических углеродных гемосорбентов).
Цель работы: получение модифицированных углеродных гемосорбентов, целенаправленно настроенных на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы и исследование их физико-химических свойств.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Обосновать выбор способа химического модифицирования углеродной поверхности.
2. Определить основные требования к свойствам носителя и модификаторов для получения углеродных гемосорбентов, целенаправленно настроенных на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.
3. Установить параметры модифицирования, приводящие к целенаправленному изменению физико-химических характеристик углеродных гемосорбентов.
4. Исследовать физико-химические свойства углеродных гемосорбентов:
химический состав, текстурные характеристики, кислотно-основные и адсорбционные свойства.
5. Выявить закономерности, описывающие адсорбцию различных по размеру белков модифицированными гемосорбентами, с учетом текстуры сорбента, природы и количественного содержания модификатора, а также концентрации белков в растворе.
7. Сопоставить результаты исследований особенностей адсорбции белков углеродными гемосорбентами, полученные в модельных условиях и в реальных системах (стендовые медицинские испытания на плазме крови).
Научная новизна работы. 1. Определены основные требования к свойствам углеродного носителя и модификаторов для получения гемосорбентов, целенаправленно настроенных на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.
2. Впервые проведено модифицирование углеродного материала мезопористой структуры методом поликонденсации органических кислот с целью увеличения концентрации поверхностных функциональных групп, взаимодействующих с соединениями белковой природы.
3. Исследованы физико-химические свойства модифицированных углеродных гемосорбентов и сопоставлены со свойствами углеродного носителя: морфология поверхности, пористая структура, состав и содержание поверхностных функциональных групп, адсорбционные свойства по отношению к белкам различной молекулярной массы.
4. Установлено влияние природы модификатора, величины удельной поверхности, объема пор, состава и содержания поверхностных функциональных групп углеродных гемосорбентов на их адсорбционные свойства по отношению к белкам-маркерам (окситоцин, альбумин, иммуноглобулин G).
5. Впервые разработаны способы получения биоспецифических углеродных гемосорбентов на основе углеродного гемосорбента для извлечения из плазмы крови провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-, фактор некроза опухоли-) при панкреатите и вирусных частиц при гепатите В.
Практическая ценность работы.
Получены углеродные гемосорбенты, целенаправленно настроенные на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы:
- гемосорбент, модифицированный полимером -аминокапроновой кислоты, для адсорбции провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухоли- (ФНО-), интерлейкина 1- (ИЛ-1) из плазмы крови больных острым панкреонекрозом (патент № 2240844 Российской Федерации от 27.01.2012).
- гемосорбент, модифицированный полимером молочной кислоты с лактивированными карбоксильными группами и иммобилизованным биолигандом - полиальбумином для адсорбции вирусных частиц из плазмы крови больных гепатитом В (поверхностный антиген гепатита В HBsAg, ДНК вируса гепатита В) (положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 28.11.2011 по заявке на изобретение № 2011113927).
Модифицированные углеродные гемосорбенты успешно испытаны в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии (ЦНИЛ ОмГМА) г. Омска (стендовые медицинские испытания на плазме крови больных).
Вклад автора состоял в планировании, подготовке, проведении всех представленных экспериментов, обработке и анализе полученных результатов, в написании докладов и публикаций.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и российских симпозиумов и конференций: Всероссийской научной молодежной конференции Под знаком Сигма (Омск, Россия, 2007, 2008, 2010), Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности (Москва-Клязьма, Россия, 2008, 2009, 2010), Международном IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), III International Symposium on Carbon for Catalysis CarboCat III (Berlin, Germany, 2008), Международной научной конференции Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии (Новосибирск, Россия, 2009), а также были представлены на конкурсе молодых ученых на VI Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011) и на III Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Секция Нанотехнологии в медицине) III Международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2010.
Исследования диссертационной работы являлись составной частью планов НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем переработки углеводородов СО РАН в рамках приоритетного направления фундаментальных исследований РАН Современные проблемы химии материалов, включая наноматериалы. Программа Создание нового поколения материалов различного функционального назначения для использования в технике, в медицине, в химической технологии. Химия наночастиц и нанообъектов. Проект Развитие научных основ конструирования и методов синтеза структурно-организованных углеродных наносистем, в том числе модифицированных гетероатомами, как базы для разработки технологий получения функциональных углеродных материалов с заданными свойствами (2007 - 2009 гг.).
Результаты диссертационной работы входили составной частью в исследования, проводимые в рамках междисциплинарных интеграционных проектов фундаментальных исследований СО РАН № 60 "Изучение белков и белковонуклеиновых комплексов методами функциональной, структурной и медицинской протеомики" (2006-2008 гг.) и № 88 Разработка универсальных методологий на основе мультифункциональных пептидо-олигонуклеотидных конструкций для дифференциальной магнитно-резонансной визуализации клеток нормальных и опухолевых тканей и регуляции (2009-2011 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 20 тезисов доклада.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 175 страницах и включает 38 таблиц, 49 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 1источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, обозначена научная новизна и практическая значимость работы, определены цели и задачи исследования.
В первой главе обобщены литературные данные по получению и исследованию углеродных материалов, их применению для адсорбции соединений белковой природы. Рассмотрена современная классификация углеродных материалов медицинского назначения, представлена технология их получения.
Описаны особенности структуры углеродных сорбентов, свойства, применение углеродных материалов в качестве носителей для создания биоспецифических сорбентов. Указаны физико-химические свойства белков и некоторых патологических веществ белковой природы, в том числе вирусной частицы гепатита В.
Проанализированы отечественные и зарубежные исследования по изучению адсорбции на поверхности углеродных сорбентов. Описаны основные направления химического модифицирования, позволяющие повысить адсорбционную способность углеродных гемосорбентов к соединениям белковой природы.
Во второй главе представлены объекты исследования: углеродный гемосорбент; белки - маркеры (окситоцин, альбумин, иммуноглобулин);
используемые модификаторы. Приведены физико-химические методы исследования полученных материалов и соответствующие методики анализов (растровая электронная микроскопия, просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения, адсорбционный метод низкотемпературной адсорбции-десорбции азота, рентгеновский микроанализ, ИК спектроскопия, атомно-силовая микроскопия, титриметрические и спектрофотометрический методы исследования).
Представлены разработанные схемы и методики модифицирования углеродной поверхности образцов гемосорбента полимерами выбранных органических кислот.
Описана методика получения биоспецифического углеродного гемосорбента с иммобилизацией синтезированного полиальбумина. Приведены методики стендовых медицинских испытаний полученных гемосорбентов на плазме крови больных, выполненных на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии (ЦНИЛ ОмГМА).
Указаны способы проверки достоверности полученных результатов и их статистической обработки.
Определение основных требований к свойствам носителя и модификаторам, исследования физико-химических свойств углеродных гемосорбентов, изучение особенностей адсорбции патологических белков углеродными гемосорбентами в реальных системах (плазма крови) выполнены при участии кандидата биологических наук Пьяновой Л. Г.
В третьей главе приведены результаты физико-химических исследований исходного и модифицированных углеродных гемосорбентов. Описаны выбор углеродного носителя для модифицирования (углеродный гемосорбент с развитой мезопористой структурой, SБЭТ 400 м2/г), направление модифицирования (поликонденсация) и модификаторы (органические кислоты). Модификаторы (аминокапроновая кислота, молочная кислота, адипиновая кислота с сореагентом - этиленгликолем) образуют в результате реакции поликонденсации полимеры с кислородсодержащими группами, взаимодействующие с соединениями белковой природы с образованием межмолекулярных связей.
Определены основные параметры химического модифицирования.
Концентрации модификаторов подобраны с учетом их растворимости: для получения модифицированных образцов углеродного гемосорбента были использованы 1.5 М раствор -аминокапроновой кислоты, 2 М раствор молочной кислоты, 0.7 М раствор адипиновой кислоты в смеси с 1 М раствором этиленгликоля.
Модифицирование углеродного сорбента водным раствором адипиновой кислоты в смеси с этиленгликолем (образец МУС-АДКЭГ) проведено при комнатной температуре 25 5С в течение 4 ч. при непрерывном перемешивании при соблюдении соотношения сорбент/раствор модификатора - 1/20. Стадия поликонденсации (образование полиэтилендипината) протекает одновременно с пропиткой сорбента модифицирующим раствором.
Пропитку углеродного сорбента водными растворами -аминокапроновой кислоты (образец МУС-АМК) и молочной кислоты (образец МУС-МК) проводили при соотношении сорбент/раствор модификатора - 1/10, время пропитки - 3 ч, температуре 90 5С и непрерывном перемешивании. Установлено, что фиксация полимерных пленок поликапроамида (модификатор - аминокапроновая кислота) и полилактида (модификатор - молочная кислота) происходит при термообработке высушенных образцов в кварцевой лодочке в проточной печи в атмосфере аргона в течение 15 мин при температуре 200 5С.
Физико-химические свойства углеродных гемосорбентов, модифицированных полимерами органических кислот Рельеф (морфология) углеродных гемосорбентов. Электронномикроскопические исследования исходного и модифицированных образцов углеродного сорбента позволили получить сведения о распределении полимерных пленок на поверхности частиц. В качестве примера представлены электронномикроскопические снимки образцов УС и МУС-АМК (рис. 1). Для всех образцов модифицированного углеродного сорбента (МУС) полимерная пленка имеет неравномерный характер с локальным (лостровковым) распределением полимера на углеродной поверхности. Это связано с развитой пористой структурой исходного образца УС и выбранными условиями модифицирования.
Текстурные характеристики углеродных гемосорбентов. Установлено, что характер распределения полимерной пленки определяет величину удельной поверхности образцов МУС, а плотность ее распределения в порах углеродного носителя УС - объем пор полученных МУС (таб. 1).
Определено, что при поликонденсации модификаторов на поверхности углеродного сорбента происходит снижение общего объема пор за счет блокировки микропор и частичного закрытия горл узких мезопор. При этом удельная поверхность (SБЭТ) модифицированных образцов уменьшается по сравнению с исходным материалом ~ в 1,8-3,7 раз, общий объем пор - 1,2-2,1 раза, практически полностью исчезают микропоры.
1а 1б 1в 2а 2б 2в Рис. 1. Электронно-микроскопические снимки образцов углеродного сорбента при увеличении x100 (а), x1000 (б) и x3000 (в):
1 - исходный образец углеродного сорбента УС; 2 - образец углеродного сорбента, модифицированный полимером аминокапроновой кислоты (образец МУС-АМК) Таблица 1.
Текстурные характеристики исследуемых образцов углеродного сорбента Объем пор, см3/г Образец SБЭТ, м2/г Vобщий Vмакро Vмезо Vмикро УС 425 12 0,961 0,079 0,860 0,0МУС-АМК 139 4 0,541 0,091 0,450 - МУС-АДКЭГ 241 3 0,761 0,094 0,667 - МУС-МК 114 1 0,444 0,035 0,409 - Анализ текстурных характеристик исследуемых образцов показал, что функционализация поверхности образца УС при использовании выбранных модификаторов приводит к изменению его пористой структуры и перераспределению пор по размерам.
На рис. 2 представлены изотермы адсорбции-десорбции паров азота (Т = -195.7 С) для исследуемых образцов УС и МУС. Для модифицированных образцов углеродного сорбента тип изотерм остается прежним, что свидетельствует о сохранении мезопористой структуры. Таким образом, выбранные параметры модифицирования УС привели к изменению морфологических характеристик.
Сохранение мезопористой структуры МУС и наличие макропор отмечается как положительный эффект, который позволит обеспечить транспорт и адсорбцию среднемолекулярных белков (молекулярная масса до 120-150 кДа).
1, Состав и содержание 0,поверхностных функциональных 0,групп. Рентгеновский микроанализ 0,поверхности 0,гемосорбентов.Проведен 0,0,рентгеновский микроанализ 0,30 поверхности исследуемых образцов 0,углеродного сорбента. При закрытии 0,углеродной поверхности полимерной 0,0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,пленкой происходит ее относительное давление экранирование. На исследуемом Рис. 2. Изотермы адсорбцииучастке модифицированных образцов десорбции жидкого азота на содержание углерода уменьшается поверхности образцов углеродного (атомный %) от 100% до 85,7 %, а сорбента кислорода повышается (от 0% до 1 - образец углеродного сорбента; 2 - 14,3%).
образец, модифицированный полимером При поликонденсации молочной аминокапроновой кислоты; 3 - образец, кислоты на углеродной поверхности модифицированный полимером образуется наибольшее количество адипиновой кислоты с сореагентом; 4 - кислородсодержащих групп (до 14,3 % образец, модифицированный полимером атомов кислорода).
молочной кислоты ИК спектроскопия. Методом ИК 0,00,022 [4] спектроскопии показано, что C-O 0,00,018 C=O модифицирование образца C=C 0,0углеродного сорбента приводит к 0,0NH(CO) 0,0RCOOувеличению интенсивности полос [3] 0,00,008 [2] поглощения (п.п.) 0,0[1] 0,004 кислородсодержащих групп (рис. 3).
0,0Полоса поглощения при 1725 см-1, 0,0-0,0которая относится к колебаниям С=О 1000 1200 1400 1600 18Волновое число, см-1 в карбонильных и карбоксильных структурах в зависимости от природы Рис. 3. ИК-спектры исследуемых модификатора имеет различную образцов углеродного сорбента интенсивность.
1- образец углеродного сорбента; 2 - Модифицирование образца УС образец, модифицированный аминокапроновой кислотой; 3 - образец, полимером аминокапроновой кислоты модифицированный адипиновой кислотой в ИК спектре появляется п.п.
с этиленгликолем; 4 - образец, при 1635 см-1, которая соответствует модифицированный молочной кислотой образованию связи NH(CO) в амидах.
Для образцов, модифицированных полимерами адипиновой кислоты с этиленгликолем и молочной кислоты, в ИК спектрах появляются п.п. при 1695-1700 см-1, что может соответствовать колебанию связи С=О, характерной для сложноэфирных групп.
Таким образом, данные ИК спектроскопии свидетельствуют об изменении состава и содержания функциональных групп углеродного сорбента при сорбционнный объем, см / г Поглощение модифицировании. Появление определенных п. п. в спектрах образцов МУС подтверждает протекание реакции поликонденсации с образованием соответствующих полимеров (полиамида или полиэфира).
Титриметрический метод анализа. Определение содержания кислородсодержащих групп на поверхности образцов углеродного сорбента титриметрическим методом показал, что их содержание увеличивается в ряду сорбентов УС, МУС-АМК, МУС-АДКЭ, МУС-МК (таб. 2).
Таблица 2.
Содержание кислородсодержащих функциональных групп и общего азота исследуемых образцов углеродного сорбента Содержание кислородсодержащих групп, мэкв/г SБЭТ Содержани общее Образцы, рНтнз е азота, % количество карбоксильны фенольны м2/г кислого е е характера УС 425 7,42 0,086 0,058 0,028 - МУС-АМК 139 4,58 0,245 0,135 0,110 1,МУС241 4,30 0,736 0,614 0,122 - АДКЭГ МУС-МК 114 3,70 0,924 0,460 0,464 - Количество общих групп кислого характера в данном ряду соответственно возрастает в 3, 9 и 11 раз. Увеличение происходит в основном за счет карбоксильных групп, содержание которых возрастает в 2, 11 и 8 раз соответственно.
Показано, что поликонденсация кислородсодержащих органических кислот на поверхности углеродного материала при определенных параметрах процесса позволяет получить сорбент с локально распределенной на его поверхности полимерной пленкой. Можно предположить, что фиксация нанесенной полимерной пленки происходит за счет закрытия микропор углеродного сорбента с образованием межмолекулярных связей.
В четвертой главе изучены адсорбционные свойства полученных образцов углеродного сорбента по отношению к белкам-маркерам из модельных растворов.
При определении времени установления равновесия для исследуемых систем сорбент-белок подтверждено, что с течением времени снижается концентрация раствора белков в растворе (окситоцина, альбумина). Кинетические зависимости отражают влияние размеров и структуры макромолекул на процессы адсорбции: чем меньше размеры белка, тем быстрее в системе устанавливается равновесие и меньше влияет концентрация белка в растворе (рис. 4).
В области низких концентраций окситоцина и альбумина кинетические кривые для исследуемых образцов углеродного сорбента в течение 24 часов выходят на плато, что можно расценивать как установление определенного равновесия в системах к данному времени. При высоких концентрациях альбумина наблюдается монотонно возрастающая кривая сорбции, либо отмечается скачок вверх значения адсорбции. Это может быть связано с межмолекулярными взаимодействиями белковых молекул друг с другом и образованием полислоев на поверхности углеродных образцов.
Характер кривых сорбции низкомолекулярного белка окситоцина на сорбенте МУС-АДКЭГ совпадает с кривыми сорбции сорбента УС, хотя значения адсорбции различаются примерно в 1,5 раза. А сорбционные кривые для образцов МУС-АМК и МУС-МК не только близки по своему характеру, но и по значению сорбции в области и низких и высоких концентраций.
900 При установлении 1УС УС 81равновесия в системе 7МУС-АДКЭГ 1600 модифицированный сорбент - МУС-АДКЭГ 5белок, лимитирующей стадией 4300 процесса является транспорт МУС-АМК МУС-МК 2адсорбата к поверхности и в МУС-МК МУС-АМК 10 поры сорбента, т.к. часть 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 поверхности экранирована Время контакта, ч Время контакта, ч (закрыта) полимерной пленкой а) б) модификатора.
На время установления М УС-АМ К МУС-МК МУ С-М К МУС-АМК равновесия в системе при МУС-АДКЭГ 14 М УС-АДКЭГ УС сорбции альбумина дополнительно сказывается 6 УС влияние изменение конформации белковой макромолекулы и ее ориентация относительно 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Время контакта, ч Время контакта, ч поверхности гемосорбента.
Кинетические кривые исследуемых образцов в) г) углеродного сорбента в области Рис. 4. Кривые зависимости адсорбции высоких концентраций в белка окситоцина (а,б) и альбумина (в,г) от координатах F-f(t1/2) (степень времени контакта на образцах углеродного завершенности процесса от сорбента времени сорбции) имеют а,в-область малых концентраций выраженный линейный участок.
(Сисх(окс)=1,300,04 мг/мл; Сисх(альб)=0,200,Это свидетельствует о мг/мл); б,г - область высоких концентраций проявлении (Сисх(окс)=8,40,08 мг/мл, (Сисх(альб)=2,500,внутридиффузионного механизма мг/мл). Условия: рН фосфатного буферного сорбции, характерного для раствора 7,4; температура 202С, крупных органических молекул продолжительность адсорбции 24 ч.
(рис. 5).
Адсорбция белка, мг / г Адсорбция белка, мг / г Адсорбция белка, мг / г Адсорбция белка, мг / г 1,2 1,После контакта раствора с МУС-АДКЭГ МУС-АМК МУС-МК 1 сорбентом УС в течение 2 часов МУС-МК МУС-АМК УС 0,0,8 степень завершенности МУС-АДКЭГ 0,0,6 процесса достигает 91-99 %, для УС 0,0,4 образца МУС-АДКЭГ - 87-97%, 0,0,2 для образца МУС-АМК - 0 равновесие в системе 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 1/2 t приближается лишь к 24-50 %, 1/2 t t 1/наименьшее значение - для t 1/образца МУС-МК - 34-42%.
а) б) Степень завершенности Рис. 5. Вид кинетических кривых сорбции адсорбции для образца МУСокситоцина (а) и альбумина (б) на АМК наступает ближе к 16 ч и исследуемых образцах углеродного сорбента составляет 94-100%, для образца в области высоких концентраций МУС-МК процесс так и не завершается (83-91%).
Анализ расчетных данных подтверждает, что при адсорбции белка окситоцина быстрее всего равновесие наступает в системе сорбент-белок для исходного образца углеродного сорбента УС и образца, модифицированного полимером адипиновой кислоты с этиленгликолем.
При сорбции альбумина на исследуемых образцах углеродного сорбента процесс имеет общий характер: образование монослоя происходит в течение 16 ч.
Построены зависимости в координатах уравнения Г/Г = f(lg) ( - время, за которое достигается значение Г/Г=1, при условии, что адсорбция описывается данным уравнением до значения Г/Г=1). При расчетах условно принималось, что адсорбция белка необратима и количество белка в растворе больше монослоя Г (Г - адсорбция, отвечающая монослойному заполнению белка). По полученным уравнениям рассчитано время достижения равновесия для окситоцина (исходная концентрация 5,000,08 мг/мл) и альбумина (исходная концентрация 2,000,мг/мл) на исследуемых образцах углеродного сорбента. Рассчитанное время, необходимое для установления равновесия в исследуемых системах при условии образования монослоя, согласуется с временем установления равновесия на кинетических кривых. Следовательно, построение лизотерм сорбции белковмаркеров на углеродных сорбентах в равновесных условиях необходимо проводить по истечению 16 часов.
Проведено количественное описание кинетической зависимости процесса адсорбции Г=f(t) в координатах ln[Гmax/(Гmax-Гt)] - t. Определены средние величины констант скорости адсорбции. Рассчитанные константы скорости адсорбции для каждого из белков близки по значениям друг к другу (окситоцин ~ 0,33 с-1, альбумин ~ 0,25 с-1). Полученные результаты указывают на зависимость величины адсорбции белков исследуемыми образцами углеродного гемосорбента от их размеров.
F F 98УС УС 8776МУС-АДКЭГ 600 МУС-АДКЭГ 55443322МУС-МК МУС-АМК 100 МУС-АМК 1МУС-МК 0 2 4 6 8 0 2 4 6 Остаточная концентрация белка в Равновесная концентрация, мг/мл Равновесная концентрация, мг/мл растворе, мг/мл а) б) 867УС МУС-АДКЭГ 65500 10486400 5643400 332210 220 1 2 0 0,1 0,2 0,Остаточная концентрация белка в Равновесная мл растворе, мг/ 100 Остаточная концентрация 100 концентрация, мг/мл Равновесная концентрация, мг/мл белка в растворе, мг/мл 0 0,5 1 1,0 1 2 3 Остаточная концентрация белка в Равновесная концентрация, мг/мл Остаточная концентрация белка в Равновесная концентрация, мг/мл Равновесная концентрация, мг/мл растворе, мг/мл растворе, мг/мл в) г) 70 1МУС-АМК МУС-МК 1МУС-АМК МУС-МК 1110 2 4 6 8 0 2 4 6 Остаточная концентрация белка в Равновесная концентрация, мг/мл Равновесная концентрация, мг/мл растворе, мг/мл д) е) Рис. 6. Изотермы адсорбции окситоцина из раствора на исследуемых образцах углеродного сорбента при времени контакта 2 ч (а,д) и 24 ч (б,е) Анализ изотерм адсорбции окситоцина на поверхности образца МУС-АДКЭГ показал, что характер сорбции меняется с изотермы I типа на V (рис. 6 в, г). Данный тип изотерм для модифицированного образца характеризует наличие слабого взаимодействия в системе адсорбент-адсорбат и свидетельствует о наличии Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, мг / г мг / г Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, мг / г пористой структуры сорбента. Изотермы сорбции окситоцина на поверхности образца МУС-АМК ближе всего к IV типу, а для образца МУС-МК - V (рис. 6 д, е).
Анализ изотерм адсорбции окситоцина в области низких концентраций (0,952,48 мг/мл) подтвердил наличие области Генри для всех исследуемых систем сорбент-белок. По уравнению Генри был рассчитан средний адсорбционный коэффициент (константа Генри) (табл. 3).
Проведен анализ изотерм адсорбции окситоцина в логарифмических координатах Фрейндлиха. В области концентраций 1,3 - 8,4 мг/мл рассчитаны соответствующие константы уравнений исследуемых систем (табл.3).
Экспериментальные данные в логарифмических координатах уравнения Фрейндлиха представляют собой прямые линии с высоким коэффициентом корреляции R2=0,99.
Таблица 3.
Рассчитанные средние константы уравнений изотерм адсорбции окситоцина (1) и альбумина (2) на исследуемых образцах углеродного сорбента Константы уравнений по Генри по Фрейндлиху по Ленгмюру по БЭТ Образцы k (мг/г) Г (мг/г) b Г (мг/г) n 1 1 2 1 2 1 2 1 2 УС 3653 1096 8,2 0,41 0,65 11524 7 15,8 1,0 11,МУС246 251 9,3 0,76 0,23 393 37 0,50 2,4 20,АДКЭГ МУС27 37 14,0 0,66 0,24 51 56 0,35 1,4 33,АМК МУС28 37 15,3 0,63 0,21 19 77 0,67 3,8 22,МК Исследование изотерм адсорбции окситоцина на исходном и модифицированных образцах углеродного сорбента позволило подтвердить влияние развитой мезопористой структуры на механизм адсорбции окситоцина - проявление физической адсорбции, действия ситового эффекта: размеры пор сорбента (9 нм) сопоставимы с размером молекул белка окситоцина - (1,3-1,8) нм2.
Таким образом, адсорбционные свойства по отношению низкомолекулярному белку уменьшаются в ряду образец УС<образец МУС-АДКЭГ<образец МУСАМК<образец МУС-МК в соответствии с уменьшением удельной поверхности и суммарным объемом пор.
Изотермы адсорбции альбумина представлены на рисунке 7 а, б. Показано, что с течением времени увеличивается количество адсорбированного белка на поверхности образцов, при этом наибольшей адсорбционной способностью по отношению к белку альбумину обладают образцы МУС-АМК и МУС-МК.
18 МУС-АМК МУС-МК МУС-АМК УС 12 МУС-АДКЭГ УС 6 МУС-АДКЭГ МУС-МК 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,Равновесная концентрация, мг/мл Равновесная концентрация, мг/мл Остаточная концентрация белка в растворе, мг/мл а) б) Рис. 7. Изотермы адсорбции альбумина из раствора на исследуемых образцах углеродного сорбента при времени контакта 2 ч (а) и 24 ч (б) Кривые зависимости величины адсорбции от концентрации белка в растворе имеют различный характер: от типичного вида изотерм Ленгмюра, Фрейндлиха до достаточно сложных зависимостей. Сложность протекания процесса адсорбции альбумина по сравнению с окситоцином объясняется возможностью образования полимолекулярных слоев и конформационных изменений белка. Данные явления наиболее вероятны при изучении процесса адсорбции белка на поверхности сорбента в течение длительного времени. Это подтверждается близкими по характеру изотермами и значениями адсорбции альбумина на образцах углеродного сорбента, построенных при 24 ч. (рис. 7 б, образцы МУС-АМК, МУС-МК).
Вид лизотерм модифицированных образцов свидетельствует о формировании полислоя белка на поверхности. Образование полислоя на поверхности исходного углеродного сорбента, в отличие от модифицированных образцов, происходит уже через 2 ч. после контакта. Невысокая адсорбционная способность немодифицированного образца УС по отношению к среднемолекулярному белку альбумину вероятнее всего связана с его гидрофобной поверхностью и невысоким содержанием поверхностных функциональных групп при ориентации и адсорбции более крупной белковой молекулы (6х8х9 нм), по сравнению с окситоцином (0,7х0,8х1,6 нм).
По классификации С. Брунауэра, Л. Деминга и Э. Теллера (ББДТ) изотермы сорбции альбумина на исследуемых образцах углеродного сорбента относятся к изотермам IV типа. С течением времени характер изотерм существенно не изменяется. Изотермы данного типа описывают сорбенты мезопористой структуры.
Установлено, что при модифицировании углеродной поверхности полимерами кислот и с увеличением функциональных групп на углеродной поверхности повышается адсорбционная способность образцов по отношению к альбумину.
Анализируя экспериментальные изотермы адсорбции альбумина можно определить, что образцы МУС-АМК и МУС-МК обладают близкими адсорбционными свойствами в равновесных условиях (величина сорбции 23,80,1 и 26,90,2 мг/г Значение адсорбции, мг / г Значение адсорбции, мг / г соответственно, время контакта 24 ч.). Адсорбционные свойства модифицированных сорбентов МУС-МК и МУС-АМК можно объяснить высоким содержанием кислородсодержащих функциональных групп на их поверхности.
Отмечено, что для образца МУС-АМК высокие значения адсорбции достигаются быстрее, чем для образца МУС-МК. Особенностью образца МУС-АМК является наличие азотсодержащих групп на его поверхности.
Таим образом, наибольшими адсорбционными свойствами по отношению к белку альбумину - маркеру среднемолекулярных токсинов, обладает образец МУСАМК, имеющий в своей структуре реакционноспособные по отношению к белкам как азот-, так и кислородсодержащие группы. Увеличение и образование на поверхности модифицированного образца углеродного сорбента ЦNH, -COOH, C=O, -CONH-групп, оказывающих влияние на электростатическое притяжение заряженных участков макромолекулярной цепи альбумина, повышает его адсорбционную способность. Это является определяющим фактором при ориентации молекулы белка своими гидрофильными участками относительно функционализированной поверхности углеродного сорбента. Возможно образование O C N N H O C H межпептидной водородной связи и пептидной связи при химическом взаимодействии карбоксильных групп модифицированного сорбента с аминогруппами молекул белка.
В области концентраций альбумина 0,54 - 2,4 мг/мл рассчитаны соответствующие константы уравнений Фрейндлиха, Лэнгмюра, БЭТ для исследуемых систем (табл. 3) (коэффициент корреляции R2=0,99).
Согласно рассчитанным константам уравнений Фрейндлиха, Ленгмюра, БЭТ построены соответствующие изотермы адсорбции белков и сопоставлены с экспериментальными кривыми адсорбции.
Исследуемые образцы углеродного сорбента не проявляют адсорбционной способности по отношению к белкам высокомолекулярной массы. Значение равновесной концентрации иммуноглобулина в растворе через определенное время контакта с исследуемыми образцами было сопоставимо с его исходной концентрацией (2,60 0,05 мг/мл). Это явление отмечается как положительный эффект: иммуноглобулины являются белками, выполняющими защитную функцию в иммунной системе организма человека.
Изучение десорбции белков на образцах углеродного гемосорбента. Изучена десорбция белков на образцах углеродного сорбента водными растворами хлорида натрия, фосфатно-буферным раствором. В отличие от исходного углеродного сорбента, для модифицированных образцов наблюдалась частичная десорбция окситоцина и альбумина раствором хлорида натрия, что может свидетельствовать о необратимом характере сорбции.
В пятой главе описывается получение углеродного биоспецифического гемосорбента и его свойства.
Получение биоспецифического углеродного гемосорбента проводили следующим образом (рис. 8): 1) получение углеродного гемосорбента, модифицированного полимером молочной кислоты с высоким содержанием карбоксильных групп; 2) лактивация лактивации карбоксильных групп на поверхности модифицированного сорбента карбодиимидным методом; 3) синтез биолиганда - полиальбумина (инкубацией человеческого сывороточного альбумина с раствором глутарового альдегида); 4) иммобилизация биолиганда на лактивированной поверхности образца МУС-МК.
F F пентафторфенол HO F F F O F F O C N C N C O F polyalbumin OH F F N,NТ-дициклогексилкарбодиимид пентафторфеноловый эфир полиальбумин O polyalbumin C NH биоспецифический углеродный сорбент Рис. 8. Схема получения биоспецифического гемосорбента Наличие на поверхности углеродного биоспецифического сорбента иммобилизованного белка (полиальбумина) подтверждено физико-химическими методами (спектрофотометрическим методом анализа, методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР), атомно-силовой спектроскопией).
Для модифицированного образца МУС-МК с иммобизированным полиальбумином установлено увеличение интенсивности УФ-спектра белка.
Фурье-преобразование межслоевых расстояний, соответствующим белку полиальбумина и исходному углеродному сорбенту показало, что межплоскостное расстояние для углеродных слоев соответствует 0,35 нм (характерно в целом для графита и др.углеродных материалов). Для аморфной структуры белка отмечается большее расстояние между слоями - 0,6 нм, что может свидетельствовать о присутствии на поверхности образца МУС-МК молекул белков.
В спектрах, полученных методом энерго-дисперсионного анализа поверхности образца МУС-МК с иммобилизированным на его поверхности белком, присутствуют спектральные линии азота, которые можно отнести к азоту, входящего в структуру молекулы белка (модификатор - молочная кислота не имеет элемента азота в своей структуре). При наведении лазерного пучка на аморфные структуры, которые могут быть молекулами белков, с течением времени спектр азота постепенно уменьшается (постепенное разрушение белка при воздействии высоких температур).
Методом атомно-силовой микроскопии показано влияние модифицирования на изменение рельефа УС. Наибольшие изменения по сравнению с исходным образцом УС отмечены для образца МУС-МК с иммобилизованным белком. Изучение поверхности образца с иммобилизованным белком выявило сглаживание рельефа - заполнение каньонов и ямок, и уменьшение высоты шиповидных образований.
В шестой главе приводятся результаты стендовых медицинских испытаний образцов углеродного гемосорбента, модифицированных полимерами кислот.
Показано, что для модифицированные сорбенты избирательно удаляют из плазмы крови больных острым панкреонекрозом провоспалительные цитокины: белки ФНО- и ИЛ-1. Модифицированные образцы МУС-АМК и МУС-АДКЭГ практически полностью удаляют из плазмы крови токсичные белки, при этом содержание противовоспалительного белка цитокина ИЛ-4 остается неизменным (таб. 4). Проявление избирательных свойств модифицированных образцов при сорбции можно объяснить физико-химическими свойствами цитокинов в исследуемой системе - плазма крови/сорбент.
Таблица 4.
Результаты исследования плазмы крови больных панкреатитом образцов углеродного гемосорбента, модифицированные полимерами кислот Содержание Содержание белков после сорбции белков в Белки плазмы крови Образцы углеродного материала исходной УС МУС-АМК МУС-АДКЭГ плазме крови Интерлейкин 1, пг/мл 14,04,4 13,4 1,9 0,0 0,4 0,Фактор некроза 16,8 4,0 16,4 2,1 1,2 0,3 0,опухоли , пг/мл Интерлейкин 4 13,9 6,0 6,5 4,0 14,4 1,4 10,9 2,Иммуноглобулин А 1,2 0,2 1,4 0,3 1,3 0,1 1,3 0,Иммуноглобулин G 8,4 1,2 8,4 1,0 8,2 1,4 8,1 1,Иммуноглобулин М 1,2 0,4 1,2 0,2 1,1 0,3 1,3 0,Определено, что для модифицированных образцов МУС-АМК и МУС-АДКЭГ резко снижается адсорбционная способность в отношении низкомолекулярных белков (М.М. 1-5 кДа). К высокомолекулярным белкам - иммуноглобулинам (М.М.
140-900 кДа) модифицированные сорбенты не проявляют активности.
Основное влияние на взаимодействие молекул цитокинов с модифицированной поверхностью сорбентов оказало локальное нанесение полимерной пленки окси- и аминокислот (с участием сореагента и без) на поверхность углеродного носителя с соответствующими изменением его текстурных, кислотно-основных свойств.
Цитокины ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-4 - белки средней молекулярной массы (17, 17,и 17,5 кДа соответственно) они различаются по своей изоэлектрической точке (6,4, 5,8 и 10,0) аминокислотному составу. При рН плазмы крови 7,35-7,45 белковые молекулы цитокинов ФНО- и ИЛ-1 заряжены отрицательно: -0,92 и -0,98. Заряд молекулы интерлейкина 4 положительный +7,2. Так, молекулы цитокинов ФНО- и ИЛ-1 с зарядом поверхности близким к нулю при рН 7,4 и незначительным действием сил электростатического отталкивания легко сорбируются на поверхности сорбентов в отличие от заряженных молекул белка интерлейкина 4.
Молекулы белков цитокинов ФНО- и ИЛ-1 находятся при рН 7,4 в состоянии близкому к нативному - в виде компактных глобул. Таким образом, уменьшение вероятности разворачивания белковых молекул, снижает возможность образования крупных ассоциатов, препятствующих адсорбции белков на поверхности из жидкой фазы. В отличие от ФНО- и ИЛ-1 интерлейкин 4 в биологическом растворе при рН 7,4 имеет нестабильную структуру, теряет нативные свойства.
Полученные модифицированные сорбенты представляют значительный интерес для сорбционной терапии при коррекции цитокинового статуса больных панкреатитом.
Стендовые медицинские испытания образца углеродного биоспецифического гемосорбента. Изучение свойств полученных биоспецифических углеродных гемосорбентов на плазме крови больного гепатитом В проводили согласно методикам ЦНИЛ ОмГМА. Для проведения исследований была выбрана плазма крови нескольких больных гепатитом В (таб. 5).
Таблица 5.
Результаты стендовых медицинских испытаний образца углеродного биоспецифического гемосорбента с иммобилизованным полиальбумином Уровень HBsAg, ДНК гепатита В, МЕ/мл Образец мМЕ/мл (метод ПЦР) (метод ИФА) Плазма здорового человека Отсутствие HBsAg Отсутствие ДНК Исходная плазма крови 3,51 0,03 (2,28 0,30) х1человека больного гепатитом Углеродный сорбент 2,97 0,05 (2,18 0,15) х1Биоспецифический углеродный гемосорбент 1,14 0,02 (0,25 0,04) х1с иммобилизованным полиальбумином Анализ результатов методом твердофазного иммуноферментного анализа подтвердил проявление селективных свойств полученного углеродного биоспецифического сорбента. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) показал, что образец биоспецифического углеродного сорбента существенно снижает и концентрацию ДНК вирусов гепатита В в плазме крови больных.
Таким образом, показана возможность избирательной сорбции вирусных частиц гепатита В (ДНК вирусы гепатита В, поверхностный антиген) образцом биоспецифического углеродного гемосорбента из плазмы крови больных гепатитом В, и в целом - снижение вирусной нагрузки. Снижение вирусной нагрузки можно объяснить возможным взаимодействием биолиганда полиальбумина с рецепторами белковой оболочки вируса гепатита В HBsAg.
Показана принципиальная возможность избирательной сорбции патологических белков модифицированными образцами углеродного гемосорбента в плазме крови больных острым панкреатитом и гепатитом В.
ВЫВОДЫ 1. Определены основные требования к свойствам углеродного носителя и модификаторам для получения гемосорбентов, целенаправленно настроенных на извлечение соединений белковой природы средней молекулярной массы.
2. Разработан способ химического модифицирования углеродного гемосорбента - пропитка растворами органических кислот (с участием сореагента и без) с последующей их поликонденсацией на поверхности, позволяющий целенаправленно изменять его физико-химические характеристики.
3. Исследованы физико-химические свойства полученных образцов углеродного гемосорбента и установлены закономерности их изменения в процессе модифицирования:
- нанесение модификатора на углеродную поверхность с последующей его поликонденсацией приводит к образованию локально распределенной полимерной пленки на углеродной частице, к уменьшению удельной величины поверхности материала и общего объема пор;
- модифицирование углеродного сорбента происходит с образованием сложноэфирных или амидных связей, что подтверждается изменениями интенсивности и положения полос поглощения кислород- азотсодержащих групп в ИКС спектрах;
4. Изучено влияние модифицирования на адсорбционные свойства полученных образцов углеродного гемосорбента:
- величина адсорбции окситоцина зависит от величины удельной поверхности сорбента и уменьшается с увеличением количества нанесенного модификатора;
- модифицирование поверхности углеродного гемосорбента олигомерами аминокапроновой и молочной кислот приводит к повышению его адсорбционных свойств по отношению к среднемолекулярному белку альбумину (в 2-3 раза);
- увеличение содержания функциональных групп при модифицировании углеродного гемосорбента не влияет на его адсорбционную активность по отношению к высокомолекулярному белку иммуноглобулину G.
5. Установлено, что адсорбция белков на исследуемых образцах углеродного гемосорбента описывается различными теоретическими моделями в зависимости от их размеров (молекулярной массы):
- адсорбция низкомолекулярного белка - окситоцина протекает с образованием монослоя (модель Фрейндлиха);
- адсорбция среднемолекулярного белка - человеческого сывороточного альбумина - с образованием полислоев (модель полимолекулярной адсорбции);
6. Впервые разработаны способы получения биоспецифических углеродных гемосорбентов на основе углеродного гемосорбента для удаления из плазмы крови провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-, фактор некроза опухоли-) при панкреатите и вирусных частиц при гепатите В.
Основное содержание диссертации изложено в работах:
1. Лихолобов, В.А. Изучение особенностей сорбции некоторых белковых молекул на новом углеродном сорбенте / В. А. Лихолобов, Т. И. Долгих, В. В. Мороз, Л.
Г. Пьянова, В. Т. Долгих, Б. А Рейс, Л. С. Лузянина, Ф. И. Разгонов, Т. Ф.
Соколова, А. В. Глущенко, А. В. Веселовская (А. В. Седанова) // Общая реаниматология РАМН. - 2007. -Т. 3. - № 2. -. С. 50 - 52.
2. Лихолобов, В. А. Регулирование адсорбционной способности углеродного сорбента по отношению к белковым молекулам модифицированием его поверхности аминокапроновой кислотой / В. А. Лихолобов, Л. Г. Пьянова, О. Н.
Бакланова, В. А. Дроздов, Л. С. Лузянина, А. Н. Саланов, А. В. Веселовская, О.
А. Чиркова // Журнал прикладной химии. - 2010. - Т. 83. - № 3. - С. 407 - 414.
3. Пьянова, Л. Г. Изучение влияния воздействия ряда окислителей на изменение состава поверхностных функциональных групп, пористой структуры и адсорбционных свойств композиционного углеродного сорбента / Л. Г. Пьянова, Л. С. Лузянина, В. А. Дроздов, А. В. Веселовская, А. Б. Арбузов, В. А.
ихолобов // Физикохимия поверхности и защита материалов. - 2010. - Т. 46. - № 3. - С. 272 - 275.
4. Лихолобов, В.А. Состав и свойства функциональных групп на поверхности углеродных сорбентов, модифицированных аминокапроновой кислотой / В. А.
ихолобов, Л. Г. Пьянова, А. И. Боронин, С. В. Кощеев, А. Н. Саланов, О. Н.
Бакланова, О. А. Княжева, А. В. Веселовская // Физикохимия поверхности и защита материалов. - 2011. - Т. 47. - № 2. - С. 154 - 163.
5. Веселовская, А. В. Изучение кинетики сорбции альбумина на образцах углеродного сорбента / А. В. Веселовская, В. А Лихолобов., Л. Г. Пьянова - IV Всерос. науч. молодеж. конф. Под знаком Сигма, посв. 50-летию СО РАН, г.
Омск, 29-30 мая 2007. - Омск, 2007. - С. 89 - 90.
6. Пьянова, Л. Г. Дизайн углеродных материалов для специфической сорбции соединений белковой природы / Л. Г. Пьянова, А. В. Веселовская, Л. С.
узянина, В. А. Лихолобов Н. В. Кудряшова, Т. С. Годовикова, О. С. Федорова. - Материалы XII Всерос. симп. с участием иностранных ученых Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности, Москва-Клязма, 21-25 апреля 2008. - Москва-Клязма, 2008. - С. 112 - 113.
7. Пьянова, Л. Г. Новые углерод-углеродные сорбенты для целей протеомики / Л. Г.
Пьянова, А. В. Веселовская, Л. С. Лузянина, В. А. Лихолобов, Н. В. Кудряшова, О. С. Федорова. - Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11 - 15 мая 2008 г. - Новосибирск, 2008.- С. 281.
8. Веселовская, А. В. Особенности адсорбции белка альбумина на образцах углеродного сорбентов / А. В. Веселовская, Л. Г. Пьянова, О. Н. Бакланова, В. А.
ихолобов. - Материалы V Всерос. науч. молодеж. конф. Под знаком Сигма, Омск, 19-23 мая 2008ю - Омск, 2008. - С.62-64.
9. Пьянова Л. Г., Бакланова О.Н., Дроздов В.А., Веселовская А.В., Чиркова О.А., Лихолобов В. А., Кудряшова Н. В., Годовикова Т. С. Мезопористый углеродный композиционный сорбент для протеомных исследований. Сборник трудов международной научной конференции Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии, посвященная 25-летнему юбилею Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. 10 - 14 июня 2009 г. Новосибирск. 2009. С.49.
10. Лихолобов, В. А. Исследование химических свойств поверхности углеродных сорбентов, функционализированных азот- и кислородсодержащими группами / В.
А. Лихолобов, Л. Г. Пьянова, А. И. Боронин, А. Н. Саланов, А. В. Веселовская. - Материалы XIV Всероссийского симпозиума с участием иностранных ученых Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности, Москва-Клязьма, 26-30 апреля 2010. - Москва-Клязьма, 2010. - С.66-67.
11. Веселовская, А. В. Углеродный сорбент для протеомных исследований / А. В.
Веселовская, О. Н. Бакланова, Т. С. Годовикова, Л. Г. Пьянова, В. А. Лихолобов.
- Труды Всероссийской научной молодежной школы-конференции Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии, Омск, 16-24 мая 2010. - Омск, 2010. - С. 131.
Список цитируемой литературы:
1. Bansal, Chand R. Activated Carbon Adsorbtion / Chand R. Bansal, M. Goyal. - New York: Taylor&Francis Group, 2005. - 498 p.
2. Shen, Jia-Wei. Molecular simulation of protein adsorption and desorption on hydroxyapatite surfaces / Jia-Wei Shen [et all] // Biomaterials. - 2008. - Vol. 29. - P.
513-532.
3. McMahon, B. J. Hepatocellular carcinoma and viral hepatitis. / B. J. McMahon / In:
Wilson R.A., ed. Viral Hepatitis. - New York : Marcel Dekker, 1997. - P. 315 -330.
4. Симбирцев, А. С. Цитокины: классификация и биологические функции / А. С.
Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2004. - № 2. - С. 28.
5. Покровский, С. Н. Сорбционные технологии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний / С. Н. Покровский [и др.] // Кардиологический вестник. - 2006. - Т.13, №1. - С. 47 - 52.