Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт химической биологии и фундаментальной медицины

На правах рукописи

ХОДЫРЕВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДНК В ИССЛЕДОВАНИИ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РЕПАРАЦИИ И РЕПЛИКАЦИИ ДНК

03.01.04 - биохимия Диссертация в виде научного доклада на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2010

Научный консультант: д.х.н., профессор, член-корреспондент РАН Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна д.х.н., профессор, член-корреспондент РАН Кочетков Сергей Николаевич д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, химический факультет

Защита состоится л29 октября 2010 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск 630090, пр-кт акад. Лаврентьева,

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Диссертация в виде научного доклада разослана л ____ сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Точность воспроизведения и сохранения генетической информации в клетках определяется функционированием двух ключевых систем - репликации и репарации ДНК. ДНК каждой клетки подвергается действию разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Повреждение ДНК может провоцировать гибель клеток, их злокачественную трансформацию или вызывать мутации. Чтобы предотвращать такие последствия, клетки располагают несколькими специализированными системами репарации ДНК с частично перекрывающимися функциями. Системы репарации ДНК различаются используемыми субстратами, механизмами и ансамблями белков, участвующих в процессе. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных и наиболее важных систем репарации ДНК, поскольку ее действия направлены на исправление наиболее многочисленных повреждений, вызываемых эндогенными и экзогенными факторами, которые включают ионизирующее излучение, активные формы кислорода и некоторые противоопухолевые препараты [Schrer, 2003]. Согласно господствующему в настоящее время представлению, ЭРО осуществляется двумя путями, так называемые коротко- и длиннозаплаточная ЭРО, которые отличаются используемыми субстратами, размером ресинтезируемого участка ДНК и вовлеченными в процесс белками. У высших эукариот в классическом короткозаплаточном пути с замещением одного нуклеотида (dN) используются специфичные для этого процесса белки: ДНК-гликозилазы, апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (APE1), ДНК-полимераза (Pol ) и ДНКлигаза III. В длинозаплаточном пути заменяются несколько dN, и в процессе дополнительно участвуют репликативные белки: ДНК-полимеразы и/или , флэпэндонуклеаза 1 (FEN1) и ДНК-лигаза I. Для каждого из путей ЭРО известно несколько минорных вариантов (запасных путей), в том числе, с вовлечением в процесс дополнительных белков. Представление о механизме функционирования ЭРО в живых клетках постоянно расширяется. К настоящему времени обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы репарации, в этом процессе задействованы белковые факторы, которые могут способствовать сборке комплекса ферментов на сайте повреждения, модулировать активность ферментов и обеспечивать сопряжение ЭРО с другими клеточными процессами, индуцируемыми в ответ на повреждение генома. К числу дополнительных факторов ЭРО относятся, например, поли(АDPрибозо)полимераза 1 (PARP1), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), белок из группы комплементации, обусловливающей чувствительность клеток к рентгеновскому излучению (XRCC1).

В целом, для процесса ЭРО нехарактерно существование стабильного белкового комплекса, который бы полностью проводил устранения повреждения в ДНК. ЭРО функционирует, скорее, по принципу конвейера, где последовательные стадии репарации осуществляются временными относительно неустойчивыми комплексами белков без освобождения ДНК. В этих комплексах по мере протекания репарации один из ферментов (факторов) заменяется белком, необходимым для следующей стадии процесса. Такой принцип организации процесса вносит ограничения в исследование структурной организации репарационного ансамбля рентгеноструктурным анализом и другими биофизическими методами.

Использование модифицированных ДНК, в том числе химически активных, то есть способных образовывать ковалентные сшивки с белками, представляется перспективным в исследовании структурно-функциональной организации надмолекулярных ансамблей эксцизионной репарации оснований. При изучении реконструированных из очищенных белков систем, аффинная модификация, основанная на применении химически активных аналогов ДНК-интермедиатов, позволяет детализировать структурно-функциональную организацию комплексов репарации/репликации ДНК и определять взаимное влияние белковых компонентов при взаимодействии с ДНК. Аффинная модификация в сочетании с иммунохимическими методами и современной масс-спектрометрией в применении к клеточным экстрактам обеспечивает возможность идентификации белков-участников того или иного комплекса репарации/репликации ДНК, в том числе ранее неизвестных.

Кроме того, этот подход может быть применен для идентификации белковых компонентов систем репарации/репликации ДНК у мало изученных организмов.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучение молекулярных механизмов взаимодействия белковых компонентов ансамблей репарации/репликации ДНК с ДНК и между собой с использованием аффинной модификации, функциональных тестов и других методов, основанных на применении модифицированных ДНК, имитирующих интермедиаты определенных стадий этих процессов.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

разработка способов получения аффинных ДНК-реагентов, которые содержат структурные элементы, характерные для ДНК-интермедиатов определенной стадии репарации/репликации ДНК, и химически активные группы в заданных точках ДНК;

изучение факторов, определяющих эффективность модификации белков фотоактивными ДНК; создание новых фотоаффинных реагентов;

изучение функциональных взаимодействий белков репарации/репликации ДНК в реконструированных из очищенных белков системах и клеточных экстрактах, основанное на применении модифицированных ДНК;

изучение структурно-функциональной организации комплексов белок-ДНК с использованием модифицированных ДНК;

отработка подходов к идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с модифицированными ДНК-интермедиатами репликации/репарации ДНК;

поиск белков (в том числе ранее неизвестных), взаимодействующих со специфическими ДНК в экстрактах эукариотических клеток и установление их функций в репарации ДНК.

Научная новизна и практическая значимость работы. Выполнено первое комплексное исследование по созданию, оптимизации и применению модифицированных ДНК-интермедиатов в изучении белковых ансамблей репарации и репликации. Проведенное исследование позволило выявить ряд новых деталей структурной организации некоторых комплексов белок-ДНК и уточнить механизмы функциональных взаимодействий белков с ДНК, а также обнаружить новые белкифакторы эксцизионной репарации оснований и неизвестные ранее взаимодействия белков другой системы репарации ДНК - негомологичного соединения концов ДНК - с ДНК-интермедиатами ЭРО.

Полученные данные свидетельствуют о результативности применения модифицированных ДНК в исследовании указанных систем и открывают перспективы в исследовании других систем репарации ДНК путем создания специфичных для исследуемого процесса ДНК-интермедиатов.

Область практического применения - создание химически активных ДНК-зондов для определения статуса некоторых систем репарации ДНК в клетках человека. Основной мишенью при использовании ионизирующего излучения и лекарств-радиомиметиков в противораковой терапии является ДНК. Системы репарации ДНК, исправляя повреждения, могут снижать эффективность терапии, поэтому определение статуса систем репарации ДНК и механизмов регуляции этих процессов в опухолевых клетках может быть использовано в качестве прогностического фактора при определении целесообразности использования радиотерапии и повышения эффективности такого воздействия.

Публикации и апробация работы. Основные результаты работы отражены в 65 статьях (из них 7 обзоров), 1 патенте и более 60 тезисах докладов. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances (Новосибирск, 1998);

International conference Trends in Nucleic Аcid Chemistry (Москва, 2000); IVth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on Basic Science in ISTC Activities (Новосибирск, 2001); RNA as Therapeutic and Genomics Target (Новосибирск, 2001); The third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure (Новосибирск, 2002); Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference (Новосибирск, 2003); Chemical and Biological Problems of Proteomics (Новосибирск, 2004); Responses to DNA Damage: Insights from Chemical, Biochemical, Structural Biology and Cellular Studies (Brighton, 2005); International Conference on Chemical Biology (Novosibirsk, 2005); 2nd EU-US DNA Repair Meeting (Erice, 2005); Международная конференция Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д. Г.

Кнорре (Новосибирск, 2006); The first meeting of international workgroup on Early events in human pathologies (Москва, 2007); RussianЦEuropean Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability (Санкт-Петербург, 2008); ARCUS workshop:

Development of new tools for fundamental research in health and disease (Strasbourg, 2008);

IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Vth International Symposium Supramolecular Systems in Chemistry and Biology (Kyiv, 2009); First symposium Supramolecular Chemistry for Materials and Life Sciences (Новосибирск, 2010).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение модификаций в структуру ДНК при разработке ДНК-интермедиатов для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий может использоваться для разных целей: создание аналогов ДНК-субстратов, устойчивых к действию исследуемых ферментов; стабилизация/дестабилизация ДНК-дуплексов; изменение сродства ДНК к связывающим ее белкам; введение структурных элементов для имитации ДНКинтермедиатов определенных процессов или для обеспечения селективного связывания ДНК на определенных сорбентах; получение флуоресцентных ДНК-зондов; создание реакционноспособных аффинных реагентов, обеспечивающих образование ковалентных продуктов с исследуемыми белками. В зависимости от цели исследования модификации в ДНК можно вводить в состав любого из структурных элементов ДНК:

гетероциклическое основание, углевод, межнуклеотидные или концевые фосфатные группы. В настоящей работе введение модификаций в ДНК использовано для конструирования аффинных реагентов и создания аналогов субстратов с измененными субстратными характеристиками.

Работа состоит из 4 разделов и содержит типичные примеры исследований по созданию, характеризации и совершенствованию фотоактивируемых ДНК-интермедиатов; изучению белково-нуклеиновых взаимодействий в модельных системах репарации/репликации ДНК, реконструированных из очищенных белков, и в клеточных экстрактах с применением модифицированных ДНК; применению специфических модифицированных ДНК в поиске белков репарации/репликации ДНК в клеточных экстрактах и в идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с этими ДНК.

1. СОЗДАНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ АФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ДНК Метод аффинной модификации, широко используемый для изучения специфических взаимодействий между биополимерами или биополимеров с низкомолекулярными лигандами, базируется на формировании специфического нековалентного комплекса между мишенью (белок или нуклеиновая кислота) и реагентом (реакционноспособным аналогом биополимера или низкомолекулярного лиганда) с последующим образованием ковалентной связи между реагентом и связывающим ее центром мишени.

В арсенале химически активных аффинных реагентов для исследования белковонуклеиновых взаимодействий значительное место принадлежит аналогам ДНК, содержащим ароматические азиды. При активации УФ-светом арилазидных групп генерируются высокореакционноспособные частицы, которые могут атаковать ближайшие атомы с образованием ковалентной связи между контактирующими частями биополимеров. Последующий анализ образовавшихся продуктов фотосшивки белокДНК позволяет получать информацию о структурной организации белково-нуклеиновых комплексов.

Химическая нейтральность в условиях рутинных биохимических процедур и способность к активации в заданное время обусловливают несомненные преимущества арилазидных фотореагентов по сравнению с другими типами сшивающих группировок. В частности, это позволяет, наряду с химическими способами, использовать ферментативные подходы при создании ДНК с фотоактивируемыми группами в требуемом положении. В некоторых случаях получение фотореакционноспособных ДНК можно осуществлять in situ за счет ферментативной активности исследуемых систем. Для систем репликации/репарации ДНК наиболее удобно введение модифицированных dNMP с использованием ДНК-полимераз, поэтому основные усилия были направлены на создание dNTP с арилазидными группами, присоединенными к основанию, исследование их фотохимических характеристик и субстратных свойств в модельных системах. При создании аналогов dNTP варьировали тип фотореакционноспособной группы, длину и структуру ликера, присоединяющего ее к основанию.

1.1. Арилазидные производные дезоксинуклеозид-5-трифосфатов в синтезе фотоактивных ДНК, катализируемом ДНК-полимеразами. Сравнительный анализ субстратных свойств и фотохимических характеристик Первые эксперименты по аффинной модификации ДНК-полимераз фотоактивируемыми ДНК, синтезированными in situ за счет включения аналогов dNMP, с одной стороны, продемонстрировали перспективность используемого подхода [Doronin et al., 1992, Doronin et al., 1994, Lavrik et al., 1996], и, с другой стороны, выдвинули ряд новых требований в отношении субстратных и фотохимических характеристик аналогов dNTP. Для всех вновь синтезируемых фотоактивируемых аналогов dCTP и dТTP проводили детальный анализ спектральных, фотохимических и субстратных свойств в синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека (ОТ ВИЧ-1), ДНК-полимеразой крысы (Pol ) и ДНК-полимеразой Thermus thermophilus (Tte pol) в сравнении с ранее использованными аналогами.

Для минимизации неспецифической фотоинактивации биополимеров под действием УФ-света актуально получение аналогов dNTP, в том числе dCTP, активируемых более длинноволновым УФ-светом (>300 нм). Кроме того, было синтезировано производное dCTP, содержащее нитроазидобензамидную группу, генерирующую преимущественно триплетный нитрен [Leiva et al., 1989, Keana&Cai, 1990], что должно повышать избирательность действия фотореагента на белки по сравнению с ДНК.

Эта фотоактивная группа в составе 5-[ N-(2-нитро-5-азидобензоил)-транс3-аминопропенил-1]-2-дезоксиуридин5-трифосфата уже использовалась нами для исследования топографии активного центра ОТ ВИЧ-1.

Структурные формулы заместителей, названия и обозначения новых аналогов dCTP представлены на рис. 1.

Для характеризации аналогов определено время полуфотолиза (1/2) при облучении УФ-светом в диапазоне 303-313 нм (Табл. 1). В этих условиях аналоги (III)-(V) в 10 раз, а аналог (VI) Рис. 1. Структурные формулы заместителей, в 20 раз более фотоактивны, чем ранее названия и обозначения аналогов dCTP описанные аналоги (I) и (II).

Следовательно, по фотохимическим свойствам из перфторированных аналогов dCTP соединение (VI) наиболее перспективно для фотоаффинной модификации биополимеров.

Таблица 1. Спектральные и фотохимические свойства аналогов dCTP Аналог dCTP **FAB-dCTP **AlFAB-dCTP NAB-dCTP FABC-dCTP FABO-dCTP FABG-dCTP (I) (II) (III) (IV) (V) (VI) 270 260 256 320 279 284 3max, нм , М-1см-1 0.9104 2.3104 2.8104 0.8104 3.6104 2.7104 2.611/2, с* - 1200 1200 100 120 120 *Условия фотолиза: УФ-свет с длиной волны 303-313 нм. **AlFAB-dCTP - 5-[N-[(4азидотетрафторбензоил)-транс-3-амино]-пропенил-1]-2-дезоксицитидин-5-трифосфат; FAB-dCTP - экзо-N-[2-(4-азидотетрафторбензоиламино)-этил]-2-дезоксицитидин-5-трифосфат **Эффективность Таблица 2. Кинетические пришивки характеристики аналогов dCTP в Кинетические характеристики фотоактивных элонгации праймеров, катализируепраймеров, %, мой Pol , и эффективность 11/2/31/пришивки к матрице и ферменту праймеров, синтезированных in situ dNTP KМ 105, M* Vmax108, McЦ1* EPol EДНК с использованием производных dCTP dCTP 2.0 0.2 6.5 0.2 - - * - Среднее значение и стандартное отклонение (n=3).

FAB-dCTP 9.0 1.0 7.1 0.3 1.0/1.5 42.0/56.** - Эффективность пришивки - NAB-dCTP 36.0 4.0 8.3 0.6 <0.5/<0.5 1.0/2.доля (%) фотоактивных праймеFABC-dCTP 21.0 2.0 15 1.0 1.5/2.5 4.0/6.5 ров, присоединившихся к Pol (EPol) и матрице (EДНК). Времени FABO-dCTP 19.0 4.0 0.31 0.04 12.5/20.0 3.5/5.1/2 соответствует 50%-ный фотоFABG-dCTP 9.0 0.2 6.0 0.7 1.0/2.5 0.5/1.5 лиз реагента, а 31/2 - 85%-ный Исследование субстратных свойств аналогов dCTP в реакции синтеза ДНК, катализируемого ОТ ВИЧ-1, показало, что аналоги (I)-(IV) и (VI) используются как dCTP и dTTP, аналог (V) - только как dTTP. Направленная модификация основания в dCTP от экзо-N-алкил- к экзо-N-оксиалкил- и экзо-N-аминокарбонильным производным dCTP (FAB-, NAB-, FABC-, FABO- и FABG-dCTP соответственно), приводящая к сдвигу таутомерного равновесия гетероциклического основания от амино- к имино-форме, вызывает изменение субстратных свойств от характерных для dCTP к соответствующим для dTTP. Дальнейшая характеризация экзо-N-замещенных аналогов dCTP как базовых соединений в ферментативном синтезе фотоактивируемых ДНК для их применения в аффинной модификации белков и ДНК, проводилась с использованием Pol , которая относится к ферментам репарации (Табл. 2).

Все аналоги не терминируют синтез ДНК после включения в 3'-конец праймера, но могут снижать эффективность его последующего удлинения. Pol , в отличие от ОТ ВИЧ-1, не использует FAB-dCTP, NAB-dCTP и FABC-dCTP как dTTP и идентифицирует все 5 аналогов как dCTP. Таким образом, специфику узнавания аналогов dCTP ДНКполимеразами из разных источников необходимо учитывать при синтезе фотоактивных ДНК in situ.

Поскольку введение в арилазид атомов фтора (особенно в орто- и пара-положения к азидогруппе) способствует образованию электрофильного синглетного нитрена [Schuster&Platz, 1992, Schapp et al., 1993], играющего ключевую роль в фотохимической модификации нуклеиновых кислот и белков [Blackwell&Borowiec, 1996, Добриков с соавт., 1996], в качестве альтернативы ранее использованным производным 4-азидо2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензальдегида можно применять полифторированные гетероциклические соединения. Были синтезированы производные ТTP, содержащие N-(3-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-6-ил)--аланин и N-(3-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-6-ил)-глицин, присоединенные к 5-ому положению основания (FAP-8-dUTP и FAP-7-dUTP соответственно). Для характеризации аналогов определены их фотохимические параметры, субстратные свойства в реакции Tte pol-зависимого синтеза ДНК и эффективность модификации фермента синтезированными in situ ДНК. При облучении УФ-светом (334-365 нм) ДНК, содержащие эти аналоги dUMP, обеспечивали сопоставимые уровни модификации Tte pol (9.3 и 8.6 % присоединенной ДНК), которые превышали соответствующий параметр для NAB-4-dUМP-содержащих ДНК (3.9%). Дальнейшая характеризация нескольких фотоактивируемых аналогов dUTP с использованием двух ДНК-полимераз (рис. 2) при облучении УФ-светом с длиной волны 313-365 нм, показала, что FAP-8-dUMP (в составе ДНК) обеспечивает более высокие уровни модификации обеих полимераз, указывая на перспективность использования такой фотоактивируемой группы в создании аналогов ДНК для аффинной модификации белков.

Рис. 2. Эффективность модификации ДНКполимераз и ДНК-матрицы праймерами, синтезированными in situ c использованием аналогов dUTP Условия облучения: при 25C в течение 11/светом лампы ДРШ-120 при длинах волн падающего света 313-365 нм или >280 нм.

Заместители: NAB-4 - 5-[N-(2-нитро-5-азидобензоил)-3-аминопропенил-1]; NAB-12 - 5-[N(N-(2-нитро-5-азидобензоил)-7-аминогептаноил)-3-аминопропенил-1]; FAB - 4 - 5-[N-(2,3,5,61/2=lg(2)/k, где kЦконстанта скорости тетрафтор-4-азидобензоил)-3-аминопропенил-1] модификации Pol , определенная для и 4-S- - 4-тио- соответственно.

каждого фотореагента.

Учитывая накопленную к этому времени информацию о том, что производные dCTP, в целом, проявили себя как более эффективные фотореагенты в составе ДНК, а также свойства FAP-группы, был синтезирован аналог dCTP - экзо-N-{2-[N-(4-азидо-2,5дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]аминоэтил}-2-дезоксицитидин-5-трифосфат (FAP-dCTP) (структура заместителя приведена на рис. 1). Кинетические характеристики в реакции синтеза ДНК, катализируемой Pol , для этого аналога практически не отличаются от соответствующих параметров для dCTP, а ДНК, полученные с его применением, обеспечивают наибольший выход продуктов сшивки с Pol . Данные сравнительного анализа модификации Pol ДНК, синтезированной in situ c использованием нескольких аналогов dCTP, представлены на рис. 3.

Рис. 3. Эффективность модификации Pol и ДНКматрицы фотоактивируемыми праймерами, синтезированными in situ c использованием аналогов dCTP Условия облучения: 25C в течение 11/2 светом лампы ДРШ-120 при длинах волн падающего света 313-3нм. 1/2Цвремя полуфотолиза фотоактивной группы в использованных условиях облучения.

Таким образом, в результате синтеза новых аналогов dNTP и планомерного исследования их свойств удалось создать соединения, которые сочетают хорошие субстратные и фотохимические характеристики. ДНК, получаемые на их основе, обеспечивают увеличение выхода продуктов сшивки с модельным белком - Pol - не менее чем на порядок для производных dCTP, и в 2-3 раза для производных dUTP.

Поскольку концентрации эндогенных ДНК-полимераз в экстрактах лимитированы, при введении фотоактивных dNMP в состав ДНК непосредственно ДНК-полимеразами экстрактов, субстратные свойства используемых аналогов dNТP могут оказаться критическим параметром, определяющим впоследствии выход сшивок ДНК-белок.

Сравнительный анализ эффективности включения разных аналогов dСТP в ДНК-дуплекс с выступающей матричной цепью и последующая количественная оценка выхода продуктов пришивки ДНК к белкам экстракта клеток HeLa полностью подтвердил это предположение (рис. 4).

Рис. 4. Сравнение эффективности встраивания в ДНК фотоактивируемых аналогов dCTP эндогенными ДНК-полимеразами экстракта клеток HeLa и модификации белков экстракта полученными ДНК а - Эффективность удлинения праймера эндогенными ДНК-полимеразами экстракта клеток HeLa. Эффективность определяли как долю (в %) праймера, удлиненного аналогом dCMP;

б - Эффективность модификации (ЭМ) белков экстракта клеток HeLa фотоактивируемыми ДНК, синтезированными in situ.

ЭМ - количество радиоактивной ДНК (в относительных единицах), присоединенной к белкам экстракта (значение нормировано на общее количество радиоактивности в образце). Структура ДНК схематично представлена над гистограммой.

Действительно, FABO-dCTP, обеспечивавший максимальный уровень сшивок с Pol в реконструированной системе, в которой благодаря условиям проведения эксперимента (4-кратный избыток фермента по отношению к ДНК) происходило эффективное включение аналога в ДНК, несмотря на неудовлетворительные субстратные свойства (Табл. 2), оказался абсолютно неэффективным в экстракте. Напротив, FABC-dCTP, обладающий худшими фотохимическими характеристики (более низкий выход сшивок Pol с FABC-dCМP-содержащей ДНК), но лучшими субстратными характеристиками (Табл. 2), при синтезе фотоактивируемых ДНК ДНК-полимеразами экстракта обеспечивал значительно более высокий уровень сшивок с белками (рис. 4б).

Максимальную эффективность модификации белков экстрактов продемонстрировал аналог FAP-dCTP, сочетающий хорошие фотохимические характеристики и хорошие субстратные свойства в реакции Pol -зависимого синтеза ДНК.

1.2. Ферментативный синтез ДНК, содержащих фотоактивируемые нуклеотиды во внутренних позициях цепи ДНК. Аффинная модификация белков этими ДНК При детальном исследовании систем репарации/репликации ДНК часто возникает проблема создания широко спектра ДНК-интермедиатов различных стадий этих процессов со структурными элементами, которые характерны для какой-то конкретной стадии. Зачастую, одна из цепей ДНК может не отличаться для достаточно большого набора ДНК-интермедиатов, поэтому именно в эту цепь целесообразно вводить химически активную функцию, обеспечивающую сшивку с белком. При изучении взаимной ориентации отдельных полипептидов в мультибелковых комплексах, взаимодействующих с ДНК, изменение положения химически активной группы относительно элементов структуры, узнаваемых комплексом, может дать дополнительную информацию о его топографии. Достаточно универсальным подходом в создании требуемых химически активных ДНК представляется ферментативное введение фотоактивируемых нуклеотидов во внутренние положения цепи ДНК, схематично представленное на (рис. 5а).

В 3-конец инициирующего праймера в составе ДНК-дуплекса с однонуклеотидной брешью за счет активности Pol вводят фотоактивируемый dNMP комплементарно а б в Рис. 5. Синтез, характеризация и применение ДНК с фотоактивируемыми нуклеотидами во внутренних положениях цепи для аффинной модификации белков ЭРО а - Схема синтеза ДНК с фотоактивируемыми нуклеотидами во внутренних положениях цепи, б - Расщепление фотоактивируемых флэп-ДНК флэпэндонуклеазой 1. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ (7 М мочевина). Дор. 1 и 2 соответствуют флэп-21-AZ-ДНК с 21-нт одноцепочечным участком, дор. 3 и 4 - аналогичной ДНК с 8-нт флэпом, где AZ обозначает FABG-dCMP; в - Фотоаффинная модификация белков ЭРО флэп-8-AZ-ДНК. Дор. 1-4 - FEN1, Pol , APE1 и PARP1 соответственно.

основанию матрицы и затем лигируют разрыв Т4 ДНК-лигазой. Наличие большого спектра фотоактивируемых аналогов dNTP, обладающих хорошими субстратными свойствами в реакции синтеза ДНК, позволяет получать реакционноспособные праймеры с высокими выходами. Для формирования необходимой структуры ДНК-дуплексов целевой фотоактивируемый олигонуклеотид выделяют и отжигают с дополнительными олигонуклеотидами.

Эффективность такого подхода продемонстрирована на примере 5-флэп-ДНК, в которых одна из цепей непрерывна, а противоположная цепь представлена двумя фрагментами, один из которых полностью спарен, а второй олигонуклеотид имеет неспаренный одноцепочечный участок и содержит фотоактивируемый нуклеотид в районе узнавания ДНК флэпэндонуклеазой 1 (FEN1) - специфической эндонуклеазой длиннозаплаточного пути ЭРО. Полученные флэп-структуры с различной длиной одноцепочечной части, содержащие реакционноспособный нуклеотид в точке перехода одноцепочечной части в дуплекс, эффективно связываются и расщепляются FEN(рис. 5б), что позволяет рассматривать такие ДНК как аналоги интермедиатов этого пути репарации и использовать в исследовании системы ЭРО. Пример аффинной модификации белков ЭРО, демонстрирующий их способность взаимодействовать с ДНКинтермедиатом длиннозаплаточного пути, для флэп-ДНК с 8-звенным одноцепочечным участком и FABG-dCMP представлен на (рис. 5в).

1.3. Ферментативное введение фотоактивных групп в 5-конец олигонуклеотидов и использование полученных фотоактивных ДНК в модификации белков Для расширения возможностей создания фотоактивируемых ДНК-интермедиатов репарации и репликации ДНК, которые бы содержали олигонуклеотиды, модифицированные по 5Т-концу, был предложен универсальный ферментативный подход, основанный на использовании Т4 полинуклеотидкиназы (Т4 ПНК) и замещенных -амидов АТР в качестве доноров модифицированной фосфорильной группы. Структурные формулы использованных -амидов АТР представлены на рис. 6а.

Рис. 6. Введение фотоактивируемых групп в 5-конец олигонуклеотидов Tполинуклеотидкиназой и использование полученных ДНК для модификации белков а - Структурные формулы -амидов АТР.

NAB-ATP - -N-[2-(5-азидо-2-нитробензоил)аминоэтил]амид АТР, FAB-ATP - N-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)аминоэтил]амид АТР, FABO-ATP - -N-[2(4-азидо-2,3,5,6-тетрафтобензилиденаминооксиметилкарбамил)этил]амид АТР;

б - Субстратные свойства -амидов АТР в реакции фосфорилирования 14-звенного рибоолигонуклеотида, катализи-руемой ТПНК. Дор. 1-3 - 90, 180 и 900 мкМ -FABATP, дор. 4 - 75 мкМ АТР, дор. 5 - контроль без NTP, дор. 6-8 - 33,166 и 332 мкМ -FABO-ATP соответственно; в - Фотоаффинная модификация репликативного белка А (RPA) и FEN1 синтезированными ДНК. Структура ДНК схематично изображена над радиоавтографом. Положение фотоактивируемой группы (FAB) в 18звенном радиоактивномеченом олигодезоксирибонуклеотиде обозначено символом Az, радиоактивной метки - 32Р. Концентрация ДНК - 1.3 мкМ.

Концентрационные зависимости катализируемого Т4 ПНК переноса модифицированных фосфорильных групп на 5-ОН конец 14-звенного рибоолигонуклеотида, представленные на рис. 6б в качестве примера, свидетельствуют о влиянии структуры заместителя в - амидах АТР на эффективность реакции, однако можно добиться высоко уровня выхода продукта для всех аналогов. Полученные таким способом 18-звенные дезоксирибоолигонуклеотиды с FAB-группой и радиоактивномеченым 3-концевым нуклеотидом в дуплексе с 45-звенным дезоксирибоолигонуклеотидом использованы для модификации FEN1 и репликативного белка А (RPA) - трехсубъединичного белка, содержащего полипептиды 14, 32 и 70 кДа (р14, р32 и р70 соответственно). Закономерности модификации белков такие же, как и при использовании фотореакционноспособных ДНК, полученных химическим синтезом.

В случае RPA основной мишенью присоединения ДНК является р70, что хорошо согласуется с полярным связыванием этого белка на ДНК (См. раздел 3.1).

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСПЕКТОВ БЕЛКОВО-БЕЛКОВЫХ И БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДНК Эксцизионная репарация оснований у высших эукариот осуществляется двумя путями, короткозаплаточным (КЗ) и длиннозаплаточным (ДЗ), которые отличаются используемыми субстратами, размером ресинтезируемого участка ДНК и вовлеченными в процесс белками (рис.7).

Рис. 7. Cхема короткозаплаточного и длиннозаплаточного путей эксцизионной репарации оснований В КЗ-пути Pol после встраивания одного нуклеотида удаляет 5дезоксирибозофосфатные (5-dRP) остатки за счет присущей ей лиазной активности, затем разрывы лигируются. Если 5'-dRP-остатки модифицированы, то репарация осуществляется через ДЗ-путь, в котором 5'-dRP-остатки после синтеза ДНК с вытеснением цепи удаляются FEN 1 вместе с несколькими нуклеотидами, а разрывы лигируются.

К настоящему времени достигнут значительный прогресс в изучении структур и функций ферментов ЭРО, охарактеризованы отдельные стадии и реконструированы основные пути этого процесса. Однако многие вопросы регуляции ЭРО остаются открытыми. В частности, это относится к соотношению репарации по КЗ- и ДЗ-путям в клетках и факторам, регулирующим выбор пути. В ЭРО, помимо ферментов, катализирующих основные реакции, участвуют белковые факторы которые, взаимодействуя с ферментами и ДНК-интермедиатами, могут модулировать процесс.

Использование модифицированных ДНК для исследования взаимовлияния белков ЭРО при их взаимодействии с ДНК в ходе репарации позволяет получать детальную информацию о факторах, определяющих эффективность процесса в целом.

2.1. Модифицированные ДНК как аналоги субстратов в исследовании некоторых стадий ЭРО К числу наименее изученных аспектов функционирования ЭРО относятся способы обеспечения точности синтеза ДНК и факторы, регулирующие протекание ЭРО по КЗ- и ДЗ-пути. В классическом КЗ-пути синтез ДНК осуществляется ДНК-полимеразой , в ДЗ - Pol или ДНК-полимеразы / [Frosina et al., 1996]. Однако Pol с низкой эффективностью катализирует синтез на протяженных участках ДНК и не обладает собственной 3'5' экзонуклеазной активностью, уступая репликативным ДНКполимеразам / в точности синтеза ДНК. Предполагается, что в комплексе с Pol может функционировать 3'5' экзонуклеаза, обеспечивающая удаление ошибочно включенных при синтезе ДНК нуклеотидных остатков. Часть этих ключевых вопросов можно исследовать, используя функциональные тесты, базирующиеся на модифицированных ДНК-интермедитах ЭРО, в том числе фотоактивируемых.

2.1.1. Исследование 3'5' экзонуклеазной активности апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 с использованием модифицированных ДНК Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1) высших эукариот - полифункциональный белок; она способна выщеплять 3'-концевой нуклеотидный остаток в одноцепочечном разрыве, причем эта активность выше при неправильно спаренных нуклеотидах [Chou et al., 2002], что позволяет рассматривать этот фермент в качестве 3'5' экзонуклеазы, осуществляющей коррекцию ошибок в процессе Pol зависимого синтеза ДНК. Проведено систематическое исследование зависимости катализируемого АРЕ1 3'Ц5'-экзонуклеазного гидролиза природных дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (dNMP) в составе канонической или неканонической пары от ионной силы и рН для нескольких типов ДНК-дуплексов, структура которых имитирует интермедиаты репарации ДНК. В частности, ДНКдуплексы с разрывом цепи содержали на 5'-конце олигонуклеотида, экспонированном в сторону разрыва, фосфатную, гидроксильную или тетрагидрофуранофосфатную группы, что позволяет рассматривать эти ДНК как аналоги различных путей ЭРО. Изучены все возможные сочетания пар на 3'-конце олигонуклеотида, обращенном в сторону разрыва.

Анализ выявил следующие закономерности: а) 3'-концевые dCMP, dGMP и dTMP менее эффективно выщепляются из канонических пар, C/G, T/A и G/C (в обозначении Х/Y первый нуклеотид относится к праймеру а второй - к расположенному напротив нуклеотиду матричной цепи), независимо от типа ДНК-дуплекса; б) эффективность гидролиза возрастает в ряду C/G

Предпочтительными субстратами являются частичный ДНК-дуплекс, ДНК с 5'свисающим одноцепочечным участком (флэпом) или 5'-гидроксильной группой, по сравнению с ДНК с 5'-фосфатной или 5'-тетрагидрофуранофосфатной группой в одноцепочечном разрыве.

Для различных реакционных условий проанализирована зависимость 3'Ц5'экзонуклеазной активности АРЕ1 от каноничности пары, формируемой расположенным на 3'-конце фотоактивируемым аналогом dCMP (FABG-dCМP, FABCdCМP, FAP-dCМP и FABO-dCMP) и основанием матрицы (A или G) напротив аналога.

Дополнительный анализ включал оценку эффективности встраивания Pol природного dNMP после фотоактивируемого аналога и лигирования разрыва цепи Т4 ДНК-лигазой.

Согласно литературным данным Pol неэффективно удлиняет цепь после неправильно спаренных 3'-концевых остатков dNMP [Beard et al., 2004], а неправильное спаривание нуклеотидов на 3'-конце разрывов в ДНК снижает эффективность лигирования разрыва Т4 ДНК-лигазой [Wu&Wallace, 1989]. По совокупности данных FABG-dCМP, FABCdCМP и FAP-dCМP являются в большей степени аналогами dCMP, чем dTMP, а FABOdCMP в равной степени имитирует dCMP и dTMP, что хорошо согласуется с данными о субстратной специфичности аналогов в реакции синтеза ДНК, катализируемого ОТ ВИЧ-1 и Pol .

В работе [Chou&Cheng, 2003] было выдвинуто предположение, что различия в оптимуме условий экзонуклеазной и эндонуклеазной активностей АРЕ1 могут быть обусловлены влиянием ионной силы на конформацию белка. Однако такие различия могут быть связаны еще и с влиянием ионной силы на стабильность ДНК-дуплекса.

Термическая денатурации ДНК-дуплексов является информативным методом для выявления влияний структурных особенностей ДНК на ее стабильность. Для нескольких ДНК-структур в одних и тех же реакционных условиях было проведено систематическое сопоставление данных термической денатурации ДНК и 3'Ц5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 в зависимости от каноничности пары, в которую входит выщепляемый dNMP.

Из сопоставления термической стабильности ДНК-дуплексов, особенностей их структуры и активности АРЕ1 следует, что специфичность экзонуклеазного гидролиза определяется природой группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, а эффективность в значительной мере зависит от способности ДНК-дуплекса УподплавлятьсяФ с 3'-конца.

2.1.2. Создание и характеризация модифицированных субстратов флэпэндонуклеазы Взаимодействия между компонентами ансамблей репарации ДНК исследуют как в системах, реконструированных из очищенных белков, так и в клеточных экстрактах.

Белки клеточного экстракта могут процессировать ДНК с образованием структур другого типа. В частности, использование фотоактивируемых флэп-структур для аффинной модификации белков в экстрактах затруднено из-за их расщепления флэпэндонуклеазой 1 экстрактов в присутствии Mg2+, поэтому была предпринята попытка создать ДНК, которые были бы устойчивы к действию FEN1, что позволило бы с большей уверенностью выявлять белки клеточного экстракта, способные взаимодействовать с такими структурами. FEN1 - ключевой фермент длиннозаплаточного пути ЭРО - отщепляет свисающий 5'-конец ДНК вблизи точки перехода оцДНК в нормальный ДНК дуплекс (точка ветвления). Для исследования влияния изменений структуры ДНК в точке потенциального расщепления флэпэндонуклеазой 1 в состав флэп-формирующего олигонуклеотида вводили модифицирующие остатки и определяли скорости расщепления этих ДНК (рис. 8а и 8б).

Для ДНК Fd с остатком декан-1,10-диола, находящимся в свисающей части непосредственно рядом с первым спаренным с матрицей нуклеотидом, скорость гидролиза снижена не менее, чем в три раза по сравнению с немодифицированной ДНК Fn. Для ДНК Fde с дополнительной модифицирующей группой (остаток диэтиленгликоля), расположенной после второго спаренного с матрицей основания, скорость снижена практически на порядок (рис. 8б). Аналогичные результаты получены и для ДНК с двумя остатками декандиола в тех же положениях. Согласно данным метода задержки в геле, FEN1 хуже формирует комплексы с модифицированными флэпструктурами, но для ДНК Fd и Fde количество комплексов сопоставимо (данные не проиллюстрированы).

a б в Рис. 8. ДНК c ненуклеотидными вставками как субстраты ферментов ЭРО а - Расщепление флэп-ДНК с ненуклеотидными вставками FEN1 (радиоавтограф геля). Структуры ДНК схематично обозначены вверху; б - Кинетические кривые расщепления флэп-структур FEN1;

в - Влияние FEN1 на элонгацию праймера в составе флэп-ДНК, катализируемую Pol .

Следовательно, повышение устойчивости к действию FEN1, вызванное введением модифицирующих групп, обусловлено снижением эффективности, как связывания ДНК, так и каталитической стадии.

Позиции расщепления флэп-формирующих олигонуклеотидов были определены из сопоставления электрофоретической подвижности продуктов гидролиза ДНК FEN1 и химического расщепления олигонуклеотидов по остаткам пиримидинов и пуринов (данные не проиллюстрированы). Необходимо отметить отсутствие продуктов расщепления ДНК непосредственно по положению ненуклеотидных вставок, что свидетельствует о высокой специфичности взаимодействия FEN1 с сахарофосфатным остовом ДНК. Чтобы оценить применимость модифицированных флэп-ДНК в качестве аналогов ДНК-интермедиатов ЭРО проведено сравнение субстратных свойств в реакции синтеза ДНК, катализируемого Pol , и выщепления нуклеотида с 3'-конца инициирующего праймера экзонуклеазной функцией АРЕ1 для модифицированных и немодифицированных флэп-ДНК. Эффективность синтеза ДНК с вытеснением цепи выше для модифицированных флэп-ДНК, и стимулируется FEN1 как и для немодифицированных флэп-ДНК (рис. 8в), но 3'-экзонуклеазная активность АРЕнесколько снижена (данные не проиллюстрированы). Фотоактивируемые флэп-ДНК c ненуклеотидными вставками и остатком FABG-dCMP на 3-конце инициирующего праймера эффективно модифицируют белки системы ЭРО: Pol , АРЕ1, FEN1, PARP1 и XRCC1, и белки клеточных экстрактов (данные не проиллюстрированы). Таким образом, созданные флэп-структуры с ненуклеотидными вставками взаимодействуют с несколькими белками ЭРО и могут рассматриваться как аналоги ДНК-интермедиатов ЭРО с повышенной устойчивостью к действию FEN1.

2.2. Взаимодействие флэпэндонуклеазы-1 с репликативным белком А FEN1, связываясь с ДНК, скользит вдоль всего неспаренного участка цепи к точке перехода оцДНК в ДНК-дуплекс. Аддукты, локализованные в пределах одноцепочечного участка ДНК, ингибируют связывание FEN1 с ДНК, снижая ее активность [Murante et al., 1995]. В роли такого природного аддукта, регулирующего активность FEN1, может выступать репликативный белок А. RPA - эукариотический белок, связывающий одноцепочечную (ОЦ) ДНК, является важным участником ряда процессов метаболизма ДНК (репликации, репарации, рекомбинации), в которых комплементарные цепи разделяются на определенной стадии, и последующие события протекают с участием одноцепочечных интермедиатов. Считают, что RPA стабилизирует одноцепочную ДНК, препятствуя формированию вторичных структур. Для RPA характерно образование двух типов комплексов с одноцепочечной ДНК, в которых белок взаимодействует с 8 и нуклеотидными остатками (нт), причем 8 нт - это минимальная длина ДНК, для которой зафиксированы комплексы с RPA [Iftode et al., 1999]. Литературные данные о роли RPA в процессе ЭРО противоречивы, поэтому представляло интерес оценить его влияние на активность FEN1 - ключевого фермента длиннозаплаточного пути ЭРО.

а б в Рис. 9. Взаимодействие RPA и FEN1 c флэп-субстратами с разной длиной одноцепочечной части а - Влияние RPA на активность FEN1. Концентрация RPA в реакционных смесях варьировала от 0 до 0.4 мкМ; б - Количественная оценка эффективности расщепления флэп-субстратов; в - Связывание RPA с ДНК, содержащей флэпы различной длины (по данным метода задержки в геле). [RPA]=0.4 мкМ. Положения комплексов ДНКЦRPA и ДНК обозначены стрелками.

Учитывая влияние длины О - участка на эффективность связывания RPA, для изучения его влияния на активность FEN1 были сконструированы ДНК с длиной О - участков (флэпов) равной 4, 8 и 21 нт. Длины одноцепочечных свисающих участков во флэп-структурах были выбраны так, чтобы RPA либо не мог связываться с ОЦ-частью (флэп-4-ДНК), либо связывался непрочно (флэп-8-ДНК), либо формировал стабильный комплекс (флэп-21-ДНК). Для этих флэп-субстратов определены способность формировать комплексы с RPA и FEN1, а также влияние RPA на расщепление ДНК FEN1. RPA ингибирует расщепление субстрата флэп-21-ДНК, но не влияет на гидролиз ДНК с флэпами длиной 4 и 8 нуклеотидов (рис. 9а и 9б), что, скорее всего, обусловлено неэффективным связыванием RPA с короткими флэпами, как следует из данных, полученных методом задержки в геле, которым обнаруживается комплекс RPA только с флэп-21-ДНК (рис. 9в, дор.4). С учетом данных по связыванию RPA с флэп-ДНК и его влиянию на активность FEN1 синтезированы две фотоактивируемые ДНК с остатками FABG-dCMP в точке ветвления и флэпами длиной 8 и 21 нт, флэп-8-AZ-ДНК и флэп-21AZ-ДНК соответственно, и использованы для модификации белков. RPA образует сшивки только с флэп-21-AZ-ДНК (рис. 10, дор. 1) в отличие от FEN1, которая модифицируется обеими флэп-ДНК (рис. 10, дор. 2 и 5).

Рис. 10. Влияние длины флэпа в фотоактивируемой флэпДНК на модификацию FEN1 и RPA Стрелками обозначены положения полос, соответствующих продуктам модификации FEN1 и субъединиц RPA 70 кДа - pили 32 кДа - p32. Положение фотоактивируемого нуклеотида обозначено звездочкой. Дор. 1-3 - флэп-21-AZ-ДНК, дор. 4,5 - флэп-8-AZ-ДНК.

Этот факт позволяет предположить, что взаимодействие RPA с флэп-структурами осуществляется за счет связывания этого белка с одноцепочечным участком ДНК. При совместной модификации RPA и FEN1 субстратом флэп-21-AZ-ДНК уровни модификации обоих белков уменьшаются по сравнению с контролями (модификацией белков по отдельности), что свидетельствует о конкуренции RPA и FEN1 за субстрат с длинным одноцепочечным участком. При использовании флэп-8-AZ-ДНК уровень модификации FEN1 при добавлении RPA не изменяется (данные не проиллюстрированы). Уровень модификации р32 значительно выше, чем р70 (рис. 10, дор. 1), что согласуется с данными о полярности взаимодействия RPA с ДНК (см. раздел 3.1.). При УпосадкеФ RPA на одноцепочную часть флэп-структуры субъединица ррасполагается ближе к 5'-концу оцДНК, а p32 контактирует с участком перехода двух/одноцепочечная ДНК, где расположен реакционноспособный нуклеотид.

При репарации оснований по длиннозаплаточному пути, размер ресинтезируемого участка ДНК варьирует от 2 до 10 нуклеотидов [Frosina et al., 1996]. Поскольку FEN1 с одинаковой эффективностью отщепляет флэпы длиной до 20 нуклеотидов, она едва ли является фактором, ограничивающим размер ресинтезируемого участка [Harrington&Lieber, 1994]. Флэп-структуры с короткими флэпами (до 10 нуклеотидов) недостаточно эффективно взаимодействуют с RPA, чтобы происходило ингибирование активности FEN1. При длине флэпа, достаточной для эффективного связывания RPA, может происходить блокирование синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО, и RPA, возможно, является одним из факторов, определяющих размер ресинтезируемого участка ДНК.

2.3. Влияние поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 и ее автомодификации на некоторые стадии ЭРО (по данным, полученным в реконструированных из очищенных белков системах) К числу белков-регуляторов ЭРО относится поли(ADP-рибозо)полимераза (PARP1), которая активируется при взаимодействии с разрывами ДНК, возникающими под действием генотоксических соединений или ферментов репарации ДНК. PARPкатализирует синтез поли(ADP-рибозы) из NAD+, осуществляя ковалентную модификацию ряда ядерных белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе собственную [D'Amours et al., 1999]. Автополи(ADP-рибозил)ирование PARP1 приводит к уменьшению ДНК-связывающей активности этого фермента и рассматривается как механизм, обеспечивающий регуляцию взаимодействия PARP1 с разрывами ДНК [Lindahl et al., 1995]. Для PARP1 характерно взаимодействие не только с ДНКинтермедиатами репарации, но и формирование прямых либо опосредованных ДНК белок-белковых контактов с другими ферментами и факторами ЭРО [Dantzer et al., 1999]. Несмотря на большой интерес к исследованию PARP1, многие детали, касающиеся ее роли в координации функциональной активности ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО, еще не выяснены, поэтому изучение взаимодействия PARP1 с ДНК-интермедиатами и белками, участвующими в репарации ДНК, необходимо для понимания механизма регуляции ЭРО на молекулярном уровне.

Данные о взаимодействии PARP1 с ДНК-интермедиатами, формирующимися на различных этапах ЭРО, в литературе практически отсутствуют, поэтому представляло интерес исследовать взаимодействие PARP1 с такими ДНК. Для этих целей использовали ДНК-дуплексы, содержащие фотоактивируемый остаток FABG-dCMP, который вводили в 3'-конец 5'-[32Р]-меченого праймера за счет активности Pol .

Схематическое изображение ДНК с фотоактивируемым нуклеотидом на 3'-конце и тетрагидрофуранофосфатной (pF)/фосфатной группой (p) на 5'-конце олигонуклеотидов, ограничивающих брешь/разрыв и количественная оценка эффективности модификации PARP1 приведены на рис. 11.

ДНК-дуплексы, содержащие остаток pF, невыщепляемый dRР-лиазной активностью Pol , могут рассматриваться как ДНК-интермедиаты ДЗ-пути ЭРО. Az-DNA-gap-pF и Az-DNA-nick-pF моделируют интермедиаты ДЗ-пути, а Az-DNA-gap-p и Az-DNA-nick-p - интермедиаты КЗ-пути ЭРО.

Рис. 11. Аффинная модификация PARP1 фотоактивируемыми ДНК-интермедиатами коротко- и длиннозаплаточного путей ЭРО а - Схематичное изображение фотоактивируемых ДНК. AzC=FABG-dCMP. pF - 3-гидрокси-2гидроксиметилтетрагидрофуранофосфат, p - фосфат; б - Зависимость эффективности модификации PARP1 от ее концентрации. Эффективность модификации PARPфотоактивируемыми ДНК-дуплексами определяли как долю (%) [32P]-меченого праймера, присоединенного к белку.

В целом, эффективность мечения PARP1 выше для ДНК с однонуклеотидной брешью, чем для ДНК с разрывом, и мало зависит от типа группы (фосфат или pF) на 5конце олигонуклеотида, запирающего брешь.

Учитывая различия в эффективности модификации PARP1 фотоактивируемыми ДНК с брешью/разрывом можно ожидать более значительного влияния PARP1 на заполнение бреши, чем последующую элонгацию праймера, сопровождающуюся вытеснением цепи ДНК, фланкирующей разрыв. Однако данные количественной оценки влияния PARP1 на элонгацию праймера, катализируемую Pol , в составе ДНК-дуплексов с однонуклеотидной брешью, фланкированной pF- или p-группами, которые могут рассматриваться как интермедиаты ДЗ- и КЗ-путей ЭРО соответственно, продемонстрировали, что для обеих ДНК PARP1 в концентрациях 50 нМ и 100 нМ вызывает уменьшение средневзвешенной длины продуктов элонгации праймера (синтез с вытеснением цепи) без заметного влияния на застраивание бреши (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние PARP1 на средневзвешенную длину продуктов и эффективность синтеза ДНК, катализируемого Pol Концентрация PARP1 (нМ) 0 50 100 5Средневзвешенная длина продукта (эффективность синтеза*) ДНК-pF 17.3 (93) 17.4 (92) 16.8 (92) 15.6 (60) Рис. 12. Влияние PARP1 на ДНК-p 16.3 (96) 16.2 (96) 16.0 (96) 15.8 (78) взаимодействие Pol с ДНК (по данным фотоаффинной модификации) *Эффективность синтеза определяли как долю (%) 15мерного праймера, удлиненного в ходе реакции. Структура ДНК обозначена вверху, С*FABG-dCMP.

Представлены данные трех независимых определений.

Ошибка не превышала 1.5%.

Однако при 500 нМ концентрации PARP1 ингибирует и застраивание бреши, и синтез ДНК с вытеснением цепи. В целом, PARP1 в большей степени ингибирует активность Pol на стадии синтеза ДНК с вытеснением цепи, чем на стадии заполнения бреши (Табл. 3).

Ингибирование Pol -зависимого синтеза ДНК с вытеснением цепи, вызываемое PARP1, может быть обусловлено конкуренцией этих белков за взаимодействие с ДНКинтермедиатами, формирующимися после застраивания бреши. Данные фотоаффинной модификации белков (рис. 12) с использованием Az-DNA-nick-p и Az-DNA-nick-pF (см.

структуру на рис. 11а) демонстрируют, что увеличение концентрации PARP1 вызывает снижение уровня мечения Pol PARP1, по-видимому, вытесняет Pol с 3'-конца инициирующего праймера, что приводит к ингибированию синтеза с вытеснением цепи.

Как уже отмечалось выше, регуляция взаимодействия PARP1 с ДНК осуществляется путем ее поли(ADP-рибозил)ирования, поэтому представляло интерес изучить влияние поли(ADP-рибозил)ирования PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol .

Рис. 13. Влияние PARP1 и ее поли(ADPрибозил)ированной формы на элонгацию праймеров Pol в составе ДНК-дуплексов с однонуклеотидной брешью Синтез ДНК, катализируемый Pol , проводили в смесях, содержащих ДНК-gap-p (а) или ДНК-gap-pF (б), Pol , 4 dNTP в присутствии PARP1 (дор. 1-3), в присутствии PARP1 и NAD+ (дор. 4-6), и в отсутствие PARP1 и NAD+ (дор. 7-9).

Для этого анализировали продукты элонгации праймера в составе ДНК, содержащей однонуклеотидную брешь и фуранофосфатную или фосфатную группы на 5-краю бреши, в присутствии PARP1, или PARP1 и NAD+ (рис. 13). В условиях поли(ADP-рибозил)ирования эффективность застраивания бреши восстанавливается до уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1 (рис. 13а и 13б, дор. 4 и 7). Эффективность же синтеза ДНК с вытеснением цепи восстанавливается частично, но не достигает уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1 (рис. 13а и 13б, дор. 6 и 9). В целом, PARPснижает активность Pol и на стадии застраивания однонуклеотидной бреши, но в значительно большей степени ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи.

Восстановление активности Pol в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи при поли(ADP-рибозил)ировании PARP1 свидетельствует о возможности регуляции Pol зависимого синтеза ДНК в ДЗ-пути репарации с помощью PARP1 и ее автомодификации.

Как уже отмечалось, АРЕ1 способна выщеплять 3'-концевой dNMP в одноцепочечном разрыве, что предполагает ее участие в комплексе с Pol в качестве 3'5' экзонуклеазы, обеспечивающей удаление нуклеотидных остатков, ошибочно включенных полимеразой при синтезе ДНК. С другой стороны APE1, расщепляя апуриновый/апиримидиновый сайт в ДНК, генерирует одноцепочечный разрыв, который эффективно опознается PARP1. Детальное исследование взаимного влияния APE1, Pol и PARP1 (попарно и при совместном присутствии трех белков), проведенное с использованием ДНК-интермедиатов ЭРО, в том числе с ошибочно спаренными нуклеотидами на 3-конце элонгируемого праймера, позволило установить ряд закономерностей взаимодействия этих белков в репаративном синтезе и роль поли(ADPрибозил)ирования в этом процессе. В качестве примера на рис. 14 приведены зависимость степени экзонуклеазного гидролиза от концентрации АРЕ1 (б) и влияние Pol (в) и PARP1 (г) на экзонуклеазную активность APE1.

Рис. 14. Зависимость 3-5-экзонуклеазной активности АРэндонуклеазы 1 от структуры ДНК и присутствия Pol и PARPа - Схематическое изображение структур ДНК;

б - Зависимость степени гидролиза от концентрации АРЕ1;

в - Ингибирование экзонуклеазной активности АРэндонуклеазы 1 в присутствии Pol ;

г - Ингибирование экзонуклеазной активности АРэндонуклеазы 1 в присутствии PARP1.

В целом, установлено, что: a) АРЕ1 стимулирует активность Pol в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на 3'-конце разрыва АРЕ1 выщепляет 3'-концевой нуклеотидный остаток, обеспечивая точность репарационного синтеза ДНК, катализируемого Pol ; б) PARP1 умеренно снижает эффективность застраивании однонуклеотидной бреши и значительно ингибирует синтез с вытеснением цепи, катализируемый Рol . PARP1 подавляет стимулирующее влияние APE1 на синтез ДНК и ингибирует 3'5' экзонуклеазную активность этого белка.

Поли(ADP-рибозил)ирование PARP1 ослабляет ее ингибирующее действие, указывая на определяющую роль этого белка в регуляции репаративного синтеза в длиннозаплаточном пути. Автомодификация PARP1, по-видимому, является необходимым условием для реализации Pol -зависимого синтеза ДНК с участием АРЕв качестве 3'5' корректирующей экзонуклеазы.

2.4. Влияние поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 и ее 24 кДа-фрагмента на репарацию ДНК по КЗ- и ДЗ-пути ЭРО (по данным, полученным в экстрактах) Поскольку в реконструированной системе было обнаружено различие во влиянии PARP1 на синтез ДНК в КЗ- и ДЗ-путях ЭРО, представляло интерес исследовать влияние этого белка на эффективность процесса в целом и выявить все стадии репарации, находящиеся под контролем PARP1. При переходе к апоптозу PARP1 подвергается протеолизу каспазой 3 с образованием фрагментов р89 и р24 (Kaufmann et al., 1993). рсодержит ДНК-связывающий мотив "цинковые пальцы", обеспечивающий функциональное узнавание интактным ферментом ДНК-разрывов. р24 сохраняет способность связывать ДНК, но его взаимодействие с ДНК уже не регулируется через поли(ADP-рибозил)ирование. Предполагается, что p24 может ингибировать репарационный процесс, создавая стерическое препятствие взаимодействию ферментов с повреждением в ДНК [DТAmours et al., 2001]. Удобной модельной системой для оценки влияния определенных белков на общую эффективность процесса могут быть клеточные экстракты. Добавление экзогенного исследуемого белка позволяет вычленить его влияние на фоне полного набора белков системы репарации.

Для исследования влияния PARP1 и p24 на репарацию ДНК-дуплексов по ДЗ- и КЗпутям использовали ядерный экстракт из семенников крупного рогатого скота и ДНКgap-pF и ДНК-gap-p с однонуклеотидной брешью, фланкированной на 5'-конце остатками фуранофосфата или фосфата. За репарацией ДНК-дуплексов следили по образованию [32P]-меченого 34-мерного олигонуклеотида при инкубации с белками экстракта в присутствии четырех dNTP и ATP (рис. 15).

PARP1 и p24 снижают эффективность репарации, но ДЗ-путь (ДНКgap-pF) ингибируется в значительно большей степени, чем КЗ-путь (ДНКgap-p). В этих же условиях поли(ADP-рибозил)ирование PARP1 приРис. 15. Анализ репарации ДНК-дуплексов, содержащих водит к восстановлению однонуклеотидную брешь, ферментами экстракта в только ДНК-синтезируюприсутствии экзогенных PARP1 и pщей активности белков Эффективность репарации (%) - доля [32P]-меченого 34-мерного экстракта, а ингибироолигонуклеотида.

вание последующих стадий репарации для ДНК-gap-pF сохраняется. Таким образом, PARP1 и pпрактически не оказывают влияния на репарацию по КЗ-пути, но блокируют ДЗ-путь на стадиях, следующих за включением нуклеотидного остатка в брешь. Репарация ДНКgap-pF реализуется с участием FEN1, которая должна отщеплять "свисающий" 5'-конец цепи ДНК с фуранофосфатным остатком, возникающий в результате синтеза с вытеснением цепи [Klungland et al., 1997]. В связи с этим важно исследовать влияние PARP1 и p24 на процессинг олигонуклеотида, запирающего брешь с 5'-края, под действием FEN1 экстракта в ходе ДЗ-пути. Для анализа продуктов расщепления олигонуклеотида, запирающего брешь, за счет активности белков экстракта была использована ДНК-gap-pF, аналогичная ДНК-gap-pF, но в которой радиоактивная метка [32P] находилась в составе фуранофосфатной группы на 5'-конце запирающего брешь олигонуклеотида. За продуктами гидролиза, катализируемого эндогенной FENэкстракта, следили по расщеплению 5'-[32P]-меченого олигонуклеотида (рис. 16а).

Основным продуктом является нуклеотид с фуранофосфатной группой (pF-N1) (рис. 16а, дор. 1-3). Количественная оценка показывает, что в условиях синтеза ДНК на долю pF-Nприходится около 27%, а при добавлении ATP (или ATP и NAD+) его количество возрастает до 40% от общего количества продуктов расщепления ДНК-gap-pF.

Полученные данные указывают на то, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в ДЗпути в значительной степени осуществляется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". Ранее такой механизм синтеза ДНК был обнаружен в реконструированной из рекомбинантных белков системе [Liu et al., 2005]. Согласно этому механизму Pol катализирует застраивание однонуклеотидной бреши, далее FENудаляет один нуклеотидный остаток с 5'-конца разрыва вместе с фуранофосфатной группой и снова формируется однонуклеотидная брешь. В реконструированной системе, так же, как и в экстракте, pF-N1 является основным продуктом расщепления этой ДНК.

При добавлении экзогенных PARP1 или p24 расщепление ДНК-gap-pF белками экстракта ингибируется, и главным образом снижается количество pF-N1 (рис. 16а, дор.

2, 3 и 4, 5; 8, 10 и 9, 11). При совместном добавлении PARP1 и NAD+ активность FENэкстракта восстанавливается лишь частично (рис. 16а, дор. 3 и 6). Аналогичные тенденции наблюдаются и в реконструированной системе (рис. 16б). Анализ полученных данных указывает, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в ДЗ-пути может эффективно осуществляться по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" за счет согласованного действия Pol и FEN1. PARP1 и p24 практически не оказывают влияния на репарацию ДНК по КЗ-пути ЭРО, но, подавляя синтез ДНК и активность FEN1, ингибируют ДЗ-путь.

Рис. 16. Влияние PARP1 и p24 на расщепление олигонуклеотида, запирающего брешь с 5'-конца, за счет активности белков экстракта (а) и рекомбинантной FEN1 (б).

Положения исходного олигонуклеотида (pF-1N18) и продуктов его расщепления обозначены стрелками.

Поли(ADP-рибозил)ирование PARP1, приводящее к снижению ДНК-связывающей активности этого белка, по-видимому, необходимо для эффективного протекания ДЗпути, когда синтез ДНК осуществляется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". Детальное исследование влияния экзогенных PARP1 и р24 на модификацию белков экстракта с использованием фотоактивируемых аналогов ДНК-интермедиатов ДЗ- и КЗ-путей ЭРО позволило установить, что эти белки снижают уровни модификации белков экстракта (данные не проиллюстрированы). С учетом результатов функциональных тестов можно заключить, что ингибирующее влияние PARP1 и р24 на репарацию ДНК обусловлено функциональной конкуренцией этих белков с ферментами репарации экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО. Такая конкуренция, вероятно, играет важную роль в процессе координации репарации, т.е. в обеспечении передачи ДНК-субстрата от одного белка к другому в ходе ЭРО и регуляции состава белков, входящих в репаративный комплекс.

2.5. Взаимодействие XRCC1 с ДНК, содержащими AP-сайты XRCC1 - белок, входящий в группу комплементации, которая обусловливает чувствительность клеток к рентгеновскому излучению - является одним из кофакторов процесса ЭРО. Он не обладает собственной ферментативной активностью, но способен взаимодействовать с несколькими ферментами ЭРО, модулируя их активность, и рассматривается как белок, координирующий короткозаплаточный путь ЭРО [Caldecott, 2003, Marsin et al., 2003]. При исследовании взаимодействия XRCC1 с ДНКинтермедиатом начального этапа ЭРО - ДНК, содержащей 8-oxoG - в присутствии 8oxoG-гликозилазы (OGG1) обнаружены два типа основных продуктов пришивки белков к ДНК, формирование которых опосредовано присутствием боргидрида. Остатки дезоксирибозы в AP-сайтах находятся в равновесии циклической фуранозной и ациклической альдегидной форм. Альдегидная форма может реагировать с первичными аминогруппами белков, образуя основание Шиффа. Образование основания Шиффа - обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать за счет восстановления боргидридом [Левина с соавт., 1980]. С учетом кажущейся молекулярной массы продуктов, оцененной по электрофоретической подвижности, можно предположить, что их образуют OGG1 и XRCC1. Поскольку без OGG1 или в присутствии ее каталитически неактивной формы (K249Q) такие продукты отсутствовали, было выдвинуто предположение, что сшивки с XRCC1 формирует ДНКструктура, возникшая в результате катализируемой OGG1 реакции. При взаимодействии с 8-oxoG-ДНК бифункциональная ДНК-гликозилаза OGG1 образует два типа продуктов, которые способны формировать основание Шиффа ЦДНК с интактным АР-сайтом и ДНК с одноцепочечным разрывом, фланкированным 3'-,-4-гидроксипентен-2-алем (3'dRP) [Fromme et al., 2004]. C использованием АР-ДНК обнаружено формирование ковалентных аддуктов с XRCC1, а также экспериментами по пришивке АР-ДНК к XRCC1 в присутствии конкурентных ДНК (рис. 17) продемонстрирована специфичность взаимодействия XRCC1 с АР-сайтами. ДНК-дуплекс с синтетическим аналогом АР-сайта - остатком остаток 2-гидроксиметил-3-гидрокситетрагидрофурана (THF) - значительно снижает уровень пришивки, а обычный ДНК-дуплекс практически не влияет на образование ковалентных продуктов.

Рис. 17. Специфичность взаимодействия XRCC1 с АР-ДНК XRCC1 инкубировали с 32P-меченой АР-ДНК в отсутствие (дор. 4) или в присутствии немеченых конкурентных ДНК, в качестве которых использовали THF-содержащий (дор. 1Ц3) или обычный (дор. 5Ц7) ДНК-дуплексы. Реакционные смеси содержали 20 нМ АР-ДНК и 250 нМ XRCC1. Концентрации конкурентных ДНК приведены на рисунке.

При анализе влияния активной (wtOGG1) и каталитически неактивной (K249Q) форм OGG1 на взаимодействие XRCC1 с АР-ДНК установлено, что при низких концентрациях wtOGG1 увеличивает количество сшивок XRCC1-ДНК в 3-4 раза, а мутантная OGG1 не влияет на этот параметр (рис. 18а). Таким образом, увеличение уровня пришивки XRCC1 к АР-ДНК в присутствии OGG1 обусловлено ее каталитической активностью, по-видимому, за счет создания структуры ДНК, обладающей большим сродством к XRCC1, ДНК-дуплекса с разрывом [Mani et al., 2004], который является продуктом АР-лиазной активности OGG1. При гидролизе АР-сайта АРЕ1 образуется ДНК-дуплекс с разрывом, содержащий 3'-ОН и 5'дезоксирибозофосфатную (5'-dRP) группы. 5'-dRP остаток также может образовывать основание Шиффа с первичными аминогруппами белков. Для регистрации продуктов пришивки к белку в этом случае необходимо переместить радиоактивную метку в соответствующее положение, например, на 3'-конец исходного АР-сайт-содержащего олигонуклеотида. С использованием такой ДНК также были обнаружены ее сшивки с полноразмерной XRCC1 и формой, лишенной С-концевого домена (I2) (рис. 18б).

Рис. 18. Взаимодействие XRCC1 с ДНК, image description содержащими АР-сайты (а) - 5'-32P-AP-ДНК и XRCCинкубировали в присутствии активной (WT) или мутантной (K249Q) форм OGG1; (б) - ДНК-дуплекс с АР-сайтом, гидролизованным АРЕ1, инкубировали с XRCC1 или I2. Исходная АР-ДНК содержала радиоактивную метку на 3конце (обозначено звездочкой).

Таким образом, XRCC1 может взаимодействовать с несколькими ДНКинтермедиатами, содержащими как интактный АР-сайт, так и расщепленный АРЕ1 с 5'dRP группой или 3'-dRP, который формируется при действии на АР-сайт некоторых бифункциональных ДНК-гликозилаз. Такие взаимодействия XRCC1 могут быть вовлечены в ее известную регуляторную функцию в КЗ-пути ЭРО [Caldecott, 2003, Marsin et al., 2003], однако это предположение требует дальнейших исследований.

3. ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДНК В ИССЛЕДОВАНИИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КОМПЛЕКСОВ ДНК-БЕЛОК Ковалентное присоединение химически активных ДНК к белкам позволяет маркировать поверхность белка, контактирующую с ДНК. В случае многосубъединичных белков с использованием таких ДНК, в особенности, при изменении положения химически активной группы в структуре ДНК, можно получать информацию об ориентации полипептидных цепей в комплексе с ДНК и в некоторых случаях регистрировать изменение конформации белков. Разрешающая способность будет зависеть от нескольких факторов, включающих расположение аминокислотакцепторов, длину и гибкость линкера, через который присоединена химически активная группа. Для реагентов с нулевой длиной линкера, по-видимому, можно ориентироваться на идентификацию доменов белка, непосредственно контактирующих с ДНК. Продуктивность применения химически активных ДНК в комбинации с другими подходами в изучении структурной организации комплексов ДНК-белок иллюстрируется на примере двух белков, один из которых - RPA - является многосубъединичным и состоит из трех полипептидных цепей - р70, р32 и р14.

3.1. Исследование структурной организации комплексов RPA с ДНК Для решения задач такого рода фотоаффинная модификация была впервые применена нами в изучении репликативного белка А. Согласно литературным данным, в составе RPA присутствуют высокогомологичные ДНК-связывающие домены (DBD-A, DBD-B и DDB-C в р70, а DBD-D - в р32) [Iftode et al., 1999]. Малая субъединица рпредставляет собой отдельный домен с высоким уровнем структурной гомологии с ДНКсвязывающими доменами DBD-AЦDBD-D. Наличие нескольких ДНК-связывающих доменов предопределяет возможность существования различных по архитектуре комплексов RPA-ДНК (типов связывания ДНК) [Wold, 1997; Iftode et al., 1999], что, в свою очередь, обеспечивает возможность динамического изменения характеристик взаимодействия белка с ДНК и является основой многофункциональности RPA. К началу исследования нами RPA было известно, что он образует непрочные комплексы, взаимодействуя с 8 нт, и стабильные - с 30 нт, и, что изменение типа комплекса сопряжено со значительными конформационными перестройками белка [Iftode et al., 1999]. Однако вклад субъединиц и отдельных доменов во взаимодействие с ДНК не был точно установлен. С использованием частичного ДНК-дуплекса (5-выступающая одноцепочечная цепь длиной 19 нт) (см. рис. 19) было показано, что р32-субъединица является основной мишенью присоединения 3-концевого фотоактивного нуклеотида [Lavrik et al., 1998]. Для детального исследования был сконструирован набор частичных ДНК-дуплексов с одноцепочечной (ОЦ) выступающей 3- или 5-концевой частями и соответственно расположенными фотоактивируемыми группами, а также набор одноцепочечных ДНК с вариабельным положением 4-тиоурацила (схематическое изображение использованных ДНК представлено на рис. 19).

Рис. 19. Схематичное изображение фотоактивируемых ДНК, использованных для исследования структурной организации комплексов RPA с ДНК Положения фотоактивируемой группы, радиоактивной метки и вариабельной одноцепочечной части ДНК-дуплекса обозначены символами Az или sU, Р и фигурной скобкой соответственно.

С использованием ДНК с 3-концевым фотоактивным нуклеотидом в праймерной цепи и переменной длиной 5-выступающей одноцепочечной части показано, что при уменьшении длины ОЦ-части (141394 нт) интенсивность мечения рувеличивается, и она становится основной мишенью пришивки. Увеличение длины одноцепочечного участка до 30 нт уже практически не изменяет соотношение сшивок субъединиц р70 и р32 с ДНК. В параллельном исследовании, выполненном с использованием ДНК с аналогичной структурой, в которых фотоактивная 2-нитро-5азидобензоильная группа была присоединена к 5-ому положению урацила линкерами длиной 2, 4 и 7-12 атомов, либо представляла собой фотореагент с нулевой длиной линкера - 4-тио-ТМР, было установлено, что изменение соотношения мечения р70/р32 в основном определяется длиной одноцепочечной части ДНК, а не размером линкера [Lavrik et al., 1998, Kolplashchikov et al., 2000]. Это дает основания относить наблюдаемый характер мечения субъединиц к конформационным изменениям RPA при связывании с ДНК.

Для 5-концевого фотореагента (фотоактивируемая группа присоединена к 5концевому фосфату олигонуклеотида) основной мишенью сшивок на 3-выступающей одноцепочечной части является р70, а соотношение мечения р70/р32 практически не зависит от длины одноцепочечной части дуплекса.

Наблюдаемое перераспределение интенсивностей мечения субъединиц р70/р32 при варьировании длины одноцепочечной части ДНК-дуплексов и изменении соотношения RPA/ДНК, в целом, хорошо согласуются с предположением о полярности расположения субъединиц RPA на одноцепочечной ДНК и с изменением конформации белка, обусловленной последовательным вовлечением в связывание отдельных ДНКсвязывающих доменов р70 и р32 субъединиц при изменении типа связывания от 8-нт к 30-нт.

Мечение р14-субъединицы не обнаружено ни в одном случае. Аффинная модификация отдельных субъединиц RPA (в составе химерных полипептидов с мальтозосвязывающим белком) с использованием частичного ДНК-дуплекса с 5выступающей одноцепочечной частью и 3-концевым фотоактивируемым нуклеотидом в праймерной цепи также не выявила сшивок р14, хотя две другие субъединицы подвергались модификации. Субъединица р14 при взаимодействии с частичными ДНКдуплексами, по-видимому, экранирована от фотоактивируемой группы двумя другими субъединицами.

Хотя при использовании частичных ДНК-дуплексов различных типов не удалось обнаружить сшивок с р14, наличие в р14 ДНК-связывающего домена и абсолютная необходимость этой субъединицы, как и двух других, для жизнедеятельности клеток [Wold, 1997, Iftode et al., 1999], предполагают, наряду с известными типами связывания, в которых задействованы домены р32 и р70 субъединиц, возможность взаимодействия RPA с одноцепочечной ДНК, опосредованного р14 субъединицей.

Использование одноцепочечных олигонуклеотидов длиной 30 нт с остатками 4тиоурацила - фотореагента с нулевой длиной спейсера - в различных положениях (8, 16, и 22 положения с 5-конца) дает возможность варьирования типов связывания при изменении молярного соотношения RPA:ДНК для выявления субъединиц RPA, непосредственно контактирующих с соответствующими участками ДНК. При анализе результатов фотоаффинной модификации субъединиц RPA такими ДНК (рис. 20а) с учетом типов образующихся комплексов (по данным метода задержки в геле) получены прямые свидетельства полярной укладки белка на одноцепочечную ДНК и данные о существовании непосредственных контактов с ДНК малой субъединицы белка - p14.

Наличие прямых контактов p14 с одноцепочечной ДНК было позднее подтверждено с использованием аналогичного подхода. ДНК содержала 4-тиотимидин в качестве химически активной функции [Salas et al., 2009].

а б Рис. 20. Взаимодействие RPA с одноцепочечной ДНК а - Анализ продуктов аффинной модификации RPA одноцепочечными ДНК, содержащими S4dUMP в различных положениях цепи. Положения ковалентных аддуктов ДНК с различными субъединицами RPA обозначены слева; б - Зависимость мечения отдельных субъединиц RPA (процентной доли ДНК, присоединенной к определенной субъединице, по отношению к суммарному количеству ДНК, присоединенной к белку в целом) от типа комплекса RPA-ДНК и положения S4-dUMP в цепи ДНК.

Ограниченный протеолиз часто используется для структурных исследований белково-нуклеиновых комплексов. Для картирования доменов RPA, взаимодействующих с 3-концом в составе ДНК с 5-выступающей цепью (32 нт), был использован ограниченный протеолиз в комбинации с фотоаффинной модификацией (рис. 21).

Рис. 21. Ограниченный протеолиз RPA, ковалентно присоединенного к 3-концу праймера, в составе частичного ДНК-дуплекса (радиоавтограф геля и схематическое обозначение фрагментов) Анализ данных о наборе пептидов, образующихся в условиях ограниченного протеолиза RPA, о принадлежности пептидов к определенному участку (или субъединице) белка, полученных с использованием антител, специфичных к определенным эпитопам, и данных о пептидах, сшитых с ДНК, позволил однозначно идентифицировать участки белка, взаимодействующие с ДНК в точке перехода одно/двухцепочечная ДНК в частичных ДНК-дуплексах с 5-выступающей одноцепочечной частью. Во взаимодействие вовлечены центральная часть р(аминокислоты 39Ц180) и С-концевая часть р70 (аминокислоты 432Ц616).

3.2. Идентификация доменов XRCC1, взаимодействующих с АР-сайтами Благодаря способности дезоксирибозы в AP-сайтах реагировать с первичными аминогруппами белков с образованием основания Шиффа, АР-сайты можно использовать как сшивающие группировки нулевой длины для выявления непосредственных контактов между белком и ДНК. В составе XRCC1 выделяют три домена NTD, BRCT1 и BRCT2 (рис. 22а).

Рис. 22. Идентификация доменов XRCC1, участвующих в формировании основания Шиффа с АР-сайтом а - Доменная организация XRCC1 и его домены, использованные для идентификации в составе химерных белков с MBP; б - Схема аффинного осаждения модифицированных фрагментов XRCC1; в, г - Анализ продуктов пришивки MBP-содержащих фрагментов XRCC1 к АР-ДНК: окраска белков Кумасси голубым и радиоавтограф геля соответственно.

Способность домена NTD связывать ДНК была установлена ранее [Marintchev et al., 1999]. Поскольку было обнаружено, что XRCC1 образует сшивки с АР-ДНК (см. раздел 2.5.), для определения доменов XRCC1, участвующих в формировании основания Шиффа с АР-сайтами, и, следовательно, непосредственно контактирующих с ДНК, были использованы синтезированные в клетках E. coli химерные белки, состоящие из мальтозосвязывающего белка (MBP) и одного из фрагментов XRCC1. Методом аффинного осаждения установлено, что модификации АР-ДНК подвергаются химерные белки, содержащие в своем составе фрагмент I2 (домены NTD + BRCT1) или домены NTD и BRCT1, но не BRCT2 (рис. 22в). Данные о доменах, взаимодействующих с АРсайтами, подтверждены результатами ограниченного протеолиза белка в составе ковалентных аддуктов XRCC1-АР-ДНК. Таким образом, показано, что домены BRCT1 и NTD непосредственно контактируют с сахарофосфатным остовом ДНК. Для BRCT1 это установлено впервые.

4. ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДНК В ИДЕНТИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ АНСАМБЛЕЙ РЕПАРАЦИИ И РЕПЛИКАЦИИ ДНК В сложных смесях, например, клеточных экстрактах, образование сшивок химически активных ДНК с белками однозначно маркирует те из них, которые способны связываться с данным типом ДНК. Радиоактивная метка в ДНК облегчает анализ и обеспечивает высокую чувствительность при детекции ковалентных аддуктов ДНКбелок. Кроме того, в состав ДНК можно вводить дополнительные группировки, например, остатки биотина, которые в последующем могут облегчить выделение и анализ образовавшихся ковалентных аддуктов. В таких исследованиях наряду с фотоактивируемыми ДНК определенной структуры могут применяться ДНК, содержащие АР-сайты, которые способны образовывать основания Шиффа с первичными аминогруппами белков. Кроме того, ДНК с АР-сайтом, расщепленным за счет лиазной активности бифункциональных ДНК-гликозилаз (с ,-4-гидроксипентен-2алем на 3-конце) или гидролизованным АР-эндонуклеазами (с 5дезоксирибозофосфатом), также могут образовывать основания Шиффа. АР-сайты (в том числе расщепленные) более селективны как сшивающая группа, по сравнению с фотоактивируемыми группами, поэтому АР-ДНК более перспективны при поиске белков, специфически взаимодействующих с такими ДНК-структурами.

Возможность сочетания с иммунологическими, и, в особенности, с развитыми в последнее время масс-спектрометрическими методами идентификации белков, делают аффинную модификацию незаменимой в поиске белков, взаимодействующих с ДНКинтермедиатами репарации/репликации в недостаточно охарактеризованных организмах, и обнаружении ранее неизвестных белков-участников процессов репарации/репликации ДНК. Этот подход довольно универсален и может применяться в исследовании разных систем процессинга ДНК благодаря возможности создания ДНК, содержащих структурные элементы, которые характерны для определенного пути/стадии. Кроме того, варьируя структуру ДНК, можно создавать высокоселективные ДНК-зонды для сравнительного анализа содержания определенных белков в клеточных экстрактах.

4.1. Фотоактивные ДНК в характеризации компонентов репликативной системы Плазмодий миксомицета Physarum polycephalum представляет собой синцитий с практически синхронно делящимися ядрами. Его репликативный аппарат, а именно набор существующих в организме ДНК-полимераз и репликативных факторов не был полностью охарактеризован. Базируясь на методе фотоаффинной модификации, удалось впервые выделить и охарактеризовать ДНК-полимеразу . В качестве матричнозатравочной системы для синтеза фотоактивируемой ДНК использовали ДНК из молок лосося (частично гидролизованную ДНК-азой I) или олигонуклеотиды. При синтезе ДНК, осуществляемом эндогенными ДНК-полимеразами, в ее состав вводили радиоактивные dNMP и остатки FAB-dCMP. После индуцированного УФ-светом присоединения ДНК к белкам, часть ДНК, выступающую за пределы белковых глобул, удаляли нуклеазой, продукты разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ и осуществляли электроперенос белков на мембрану, которую экспонировали с рентгеновской пленкой.

Результаты фотоаффинной модификации частично очищенного препарата ДНКполимераз и выделенного индивидуального препарата ДНК-полимераза представлены на рис. 23. Данные ингибиторного анализа активности очищенного препарата ДНКполимеразы N-этилмалеимидом, афидиколином, бутифенил-dGTP и гепарином, а также предпочтительное использование выделенным ферментом определенных типов матрично-затравочных комплексов, свидетельствуют, что ДНК-полимераза P.

polycephalum проявляет характеристики, хорошо согласующиеся с опубликованными данными для этого фермента у высших эукариот.

Рис. 23. Фотоаффинная модификация частично очищенного препарата ДНК-полимераз из P.

polycephalum (a) и очищенного препарата ДНКполимеразы (б) Для синтеза фотоактивируемой ДНК были использованы ДНК из молок лосося, частично гидролизованная ДНК-азой I (а) или синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (б).

Кроме того, с использованием этого же подхода, дополненного иммуноферментным окрашиванием, идентифицировано несколько белков, модифицированных фотоактивируемыми ДНК в экстракте. Отнесение продуктов модификации к определенным белкам основано на совпадении положения радиоактивной метки, входящей в состав ковалентно присоединенной ДНК, и сигнала, полученного при иммуноферментном окрашивании. Среди белков экстракта плазмодия, образовавших сшивки с ДНК, с использованием антител к известным компонентам системы репликации ДНК идентифицированы полипептиды ДНК-полимеразы -праймазы и ДНК-полимеразы .

4.2. Поиск клеточных белков человека, взаимодействующих с AP-сайтами.

Идентификация Ku-антигена Апуриновые/апиримидиновые сайты - один из наиболее часто встречающихся типов нарушений в структуре ДНК; они возникают в клетках млекопитающих с частотой 104 в сутки за счет спонтанного или катализируемого в процессе ЭРО ДНК-гликозилазами гидролиза N-гликозидной связи между дезоксирибозой и основанием [Lindahl, 1972].

Нерепарированные АР-сайты цитотоксичны и мутагенны [Loeb, 1985], поэтому представляет интерес идентификация белков, взаимодействующих с ними и, возможно, участвующих в регуляции их репарации.

Большинство белков, которые способны формировать основания Шиффа с дезоксирибозой АР-сайта (в том числе и с его расщепленными формами), связано с процессом ЭРО, но, в тоже время, такой тип взаимодействий обнаружен у некоторых белков, формально не относимых к этому процессу [Hegde et al., 2004, Postel et al., 2000].

Для поиска белков в клетках человека, способных к формированию ковалентных аддуктов с АР-сайтами (с последующим восстановлением NaBH4), был использован радиоактивно меченый ДНК-дуплекс (32 н.п.), содержащий АР-сайт в средине одной из цепей. В цельноклеточных экстрактах HeLa, легочных фибробластов человека, К-562 и MCF-7 преобладающие продукты сшивки АР-ДНК с белками обладают одинаковой электрофоретической подвижностью. Кажущаяся молекулярная масса такого продукта, оцененная по электрофоретической подвижности, соответствует приблизительно 95 кДа (рис. 24а, дор. 1).

Рис. 24. Идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с АР-сайтами а - Модификация белков экстракта клеток HeLa: дор. 1 - продукты сшивки АР-ДНК с белками экстракта клеток HeLa, дор. 2 - контроль - замена АР-сайта в ДНК на его аналог - остаток 2гидроксиметил-3-гидрокситетрагидрофурана - THF, и дор. 3 - контроль без обработки NaBH4; б - Сравнение продуктов сшивки полипептидов в экстракте клеток HeLa и препарате ДНК-ПК с АР(дор. 1 и 2) и фотоактивируемой ДНК (дор. 3 и 4) ; в - Идентификация белка по суперсдвигу комплексов Ku-антигена с АР-ДНК в присутствии моноклональных антител против Ku80 в условиях нативного электрофореза в ПААГ; г - Идентифкация белка методом иммунопреципитации с использованием моноклональных антител против Ku80 (дор 1. - аликвота реакционной смеси, дор. и 3 - продукты несвязавшие и связавшиеся с Protein A-сефарозой соответственно ; д - Схема идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с АР-ДНК с использованием массспектрометрии.

Следует отметить, что кажущаяся молекулярная масса продуктов сшивки приблизительно соответствует сумме масс белка и ДНК. При замене в структуре ДНК АР-сайта на его аналог - остаток THF - (рис. 24а, дор. 2) или без обработки NABH(рис. 24а, дор. 3) продукты сшивки ДНКЦбелок не регистрируются.

Ни один из белков, для которых достоверно установлено взаимодействие с АРсайтами через образование основания Шиффа, не обладает подходящей молекулярной массой, чтобы формировать продукты с наблюдаемой электрофоретической подвижностью. Для идентификации белка использовали несколько подходов. Аффинная модификация белков экстракта клеток HeLa фотоактивируемыми ДНК, имитирующими ДНК-интермедиаты более поздних стадий ЭРО, выявила продукты сшивки с белками с кажущимися молекулярными массами около 92 и 80 кДа (рис. 24б, дор. 3). Учитывая набор, молекулярные массы продуктов сшивки белков с АР- и фотоактивируемыми ДНК, а также длину присоединяемого к белку олигонуклеотида (16 и 32 н.о. для фотоактивируемой и АР-ДНК соответственно), мы предположили, что возможным кандидатом является Ku-антиген.

Ku-антиген - эукариотический гетеродимерный ДНК-связывающий комплекс, состоящий из субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ku70) и 83 кДа (Ku80). Его основная функция связана с репарацией двухцепоченых разрывов ДНК путем негомологичного соединения концов. Ku-антиген, наряду с каталитической субъединицей, входит в состав ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК).

Каталитическая субъединица (ДНК-ПКкс) способна связываться с концами ДНК, но Kuантиген примерно в 100 раз увеличивает сродство ДНК-ПКкс к ДНК [Downs&Jackson, 2004].

Природа модифицированного белка подтверждена: 1) сопоставлением электрофоретической подвижности продуктов сшивки полипептидов в экстракте и коммерческом препарате ДНК-ПК (в состав которой входит Ku-антиген) с АР-ДНК и фотоактивируемой ДНК (рис. 24б); 2) уменьшением электрофоретической подвижности в условиях нативного электрофореза в ПААГ комплекса белок-АР-ДНК, образованного в экстракте из клеток HeLa, которое наблюдается в присутствии анти-Kuиммуноглобулинов (рис. 24в); 3) данными иммунопреципитации продуктов сшивки белков экстрактов с АР-ДНК с использованием Protein A-сефарозы и моноклональных анти-Ku80 иммуноглобулинов (рис. 24г). И в завершение, идентичность белка подтверждена методом пептидного картирования на основе данных MALDI-TOF-MS.

Идентификации подвергался белок в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК в соответствии со схемой, представленной на рис. 24д. Ku80-полипептид идентифицирован как наиболее достоверный кандидат (Mowse score 115, coverage 15%).

В дальнейшем с использованием клеточных экстрактов и ДНК-ПК, в состав которой входит Ku-антиген, были установлены некоторые характеристики взаимодействия Kuантигена с АР-ДНК. Специфичность взаимодействия Ku-антигена экстракта с АР-ДНК была подтверждена с использованием конкурентных ДНК (рис. 25а). ДНК, содержащая аналог АР-сайта - остаток THF, снижает пришивку АР-ДНК к Ku80 в значительно большей степени, чем обычный ДНК-дуплекс, что указывает на более эффективное взаимодействие этого белка с АР-ДНК. Инкубация АР-ДНК в присутствии ДНК-ПК не приводит к расщеплению АР-сайтов (данные не проиллюстрированы).

Поскольку АР-эндонуклеаза 1 - это основной фермент ЭРО в клетках высших эукариот, гидролизующий АР-сайты [Wilson&Barsky, 2001], было оценено влияние Kuантигена (составе ДНК-ПК) на активность АРЕ1 (рис. 25б). ДНК-ПК при эквимолярной концентрации по отношению к ДНК значительно ингибирует гидролиз АР-сайтов, что указывает на возможную функциональную значимость взаимодействия Ku-антигена с АР-сайтами. Формирование оснований Шиффа с АР-сайтами потенциально может быть вовлечено в их временную защиту или регуляцию репарации, как было предположено для монофункциональной ДНК-гликозилазы MutY, формирующей с АР-сайтами значительно более стабильные комплексы, чем бифункциональные ДНК-гликозилазы [Zharkov&Grollman, 1998]. Проведенная оценка стабильности комплексов Ku-антигена с АР-ДНК не обнаружила значимого их распада в течение 4 часов (рис. 25в).

а б в Рис. 25. Взаимодействие Ku-антигена с АР-сайтами а - Влияние конкурентных ДНК на пришивку АР-ДНК к Ku80. Белки экстракта клеток HeLa инкубировали с АР-ДНК (дор. 1), АР-ДНК в присутствии обычного ДНК-дуплекса (дор. 2-4) или ДНК с аналогом АР-сайта - остатком THF - (дор. 5-7); б - Ингибирование активности АРЕ1 Kuантигеном (в составе ДНК-ПК). АР-ДНК инкубировали в отсутствие белков (дор. 1-4), в присутствии АРЕ1 (дор. 5-8) или в присутствии АРЕ1 и ДНК-ПК (дор. 9-12); в - Оценка стабильности комплексов АР-ДНК с Ku-антигеном. Белки экстракта клеток HeLa инкубировали с АР-ДНК в течение 15 мин (дор. 1). Затем, чтобы предотвратить повторное связывание АР-ДНК с Kuантигеном, освобождаемым при диссоциации его комплексов с АР-ДНК, добавляли конкурентную ДНК с аналогом АР-сайта (остатком THF) (дор. 2-7), отбирали аликвоты в указанные промежутки времени, обрабатывали их NaBH4 и анализировали.

Поскольку пришивка АР-ДНК к Ku80 (см. рис. 24а) в экстрактах происходит с высокой селективностью и эффективностью, этот подход потенциально может быть использован для оценки содержания активных в связывании ДНК форм Ku-антигена в экстрактах клеток в присутствии других клеточных белков (рис. 26).

Рис. 26. Оценка относительного количества активной формы Ku80 в экстрактах клеток человека. Идентификация укороченной формы Kuа - Сравнительный анализ содержания Ku-антигена в экстрактах клеток с использованием АР-ДНК и дот-ЭЛИСА; б - Идентификация укороченной формы по изменению электрофоретической подвижности комплекса Ku-антиген-АР-ДНК в присутствии антител, специфичных к С- или N-концу Ku80.

Сравнительный анализ содержания Ku80 в экстрактах клеток нескольких культивируемых линий меланом и HeLa, проведенный с использованием дот-ЭЛИСА и АР-ДНК, показал, что количество ковалентных аддуктов Ku80 с АР-ДНК варьирует в значительных пределах и, в целом, положительно коррелирует с содержанием этого белка, оцененным иммуноферментным окрашиванием (рис. 26а). В некоторых образцах обнаружен интенсивный продукт сшивки с меньшей кажущейся молекулярной массой (рис. 26а, дор. 6 и 7, выделено синим овалом). Согласно литературным данным в некоторых культивируемых клетках человека представлена укороченная с С-конца форма Ku80 (Ku80v), возникающая под действием трипсиноподобной протеазы, существующей в этих клетках и активирующейся в определенных условиях [Sallmyr et al., 2002, Jeng et al., 1999]. Соответствующая Ku80v мРНК не обнаружена [Han et al, 1996, Muller et al., 1998]. Ku80v образует гетеродимеры с Ku70, сохраняющие активность в связывании ДНК, но не взаимодействующие с каталитической субъединицей ДНК-ПК, что уменьшает негомологичное соединение концов [Han et al, 1996, Muller et al., 1998].

Образцы 5Ц7 (выделено малиновым прямоугольником) относятся к одной клеточной линии Mel 051102k, но отличаются по условиям приготовления экстрактов. Экстракт в образце 7 готовили по стандартной методике, а в случае образцов 5 и 6 предпринимали специальные меры для уменьшения вероятности протеолиза Ku80. Дальнейший анализ с использованием антител, специфичных к С- и N-концам Ku80 (рис. 26б), позволил отнести указанные продукты к укороченному с С-конца полипептиду Ku80. Для этой клеточной линии, по-видимому, также характерна экспрессия такой специфической протеазы. Таким образом, с использованием АР-ДНК в экстрактах клеток возможна детекция активных в связывании ДНК форм Ku-антигена, в том числе укороченных. В таких сложных случаях адекватность оценки количеств белка с использованием антител будет зависеть от правильности их выбора, а часто применяемая оценка, основанная на определении количества мРНК, может давать искаженные данные.

4.3. Поиск белков клеток человека, взаимодействующих с AP-сайтами.

Идентификация PARP Учитывая конкуренцию Ku-антигена с белками при связывании с линейной АР-ДНК, при дальнейшем поиске в клеточных экстрактах белков, взаимодействующих с АРсайтами, были использованы кольцевые ДНК, синтезированные на основе одноцепочечной ДНК фага М13, которые содержат случайно распределенные АР-сайты в одной цепи. Для M13 AP-ДНК во всех экстрактах основные продукты сшивки с одной и той же электрофоретической подвижностью соответствуют белку с кажущейся молекулярной массой около 120 кДа (рис. 27). Было выдвинуто предположение, что эти продукты относятся к PARP1. В экспериментах с индивидуальной рекомбинантной PARP1 установлена способность белка образовывать сшивки с линейной и кольцевой АР-ДНК, опосредованные образованием основания Шиффа (данные не проиллюстрированы).

Рис. 27. Анализ продуктов сшивки АР-ДНК с белками различных экстрактов Дор. 1Ц4 - продукты пришивки кольцевой АР-ДНК к белкам цельноклеточных экстрактов HeLa, фибробластов человека (ФЧ), MCF-7 и ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота (СКРС) соответственно. Перед анализом ДНК, выступающую за пределы белковых глобул, гидролизовали нуклеазой. Дор. 5 - контрольный образец сшивки белков экстракта клеток HeLa с 32мерной линейной АР-ДНК (без обработки нуклеазой).

Ранее [Lavrik et al., 2001] было показано, что PARP1, ковалентно присоединенная к фотоактивируемой ДНК, способна подвергаться поли(ADP-рибозил)ированию, что приводит к уменьшению электрофоретической подвижности продуктов сшивки ДНКPARP1. Это позволяет идентифицировать продукты, относящиеся к PARP1, среди других сшивок белокЦДНК. С использованием кольцевой и линейной АР-ДНК и очищенной рекомбинантной PARP1 установлена способность белка повергаться поли(ADP-рибозил)ированию в составе ковалентного аддукта с ДНК (данные не проиллюстрированы). Обнаруженное при использовании экстрактов изменение электрофоретической подвижности продуктов сшивки АР-ДНК-белок в присутствии NAD+ дает основания для отнесения продукта сшивки к PARP1 (рис. 28, дор. 3, 6, 12).

Рис. 28. Автополи(ADP-рибозил)ирование PARPэкстрактов клеток HeLa и СКРС, ковалентно присоединенной к АР-ДНК Дор. 1Ц6 - сшивка белков экстрактов с кольцевой АР-ДНК, дор. 7Ц12 - с линейной АР-ДНК. Положение продуктов поли(ADP-рибозил)ирования PARP1, ковалентно присоединенной к АР-ДНК (дор. 3, 6, 12), обозначено символом PARP1-(ADP)n.

Идентичность белка в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК подтверждена методом пептидного картирования, проведенного в соответствии с процедурой, представленной на рис. 24д. Для идентификации был использован экстракт из семенников крупного рогатого скота (СКРС), поскольку в нем не образуются продукты, соответствующие Ku80, а продукты, относимые к PARP1, преобладают (рис. 28, дор. 10).

PARP1 идентифицирована как наиболее достоверный кандидат (Mowse score 248, coverage 38%).

Представляло интерес оценить возможные каталитические функции PARP1 в отношении АР-сайтов. PARP1 не обладает значимой АР-лиазной активностью (данные не проиллюстрированы).

Возможно, это взаимодействие связано с регуляцией процессинга АР-сайтов, которая особенно важна при репарации АР-сайтов, входящих в состав кластерных повреждений, поскольку установлено образование двухцепочечных разрывов при репарации таких АРсайтов [Yang et al., 2004]. АРЕ1 - основная АР-эндонуклеаза клеток млекопитающих [Wilson&Barsky, 2001], поэтому было определено влияние PARP1 на гидролиз этим ферментом АР-сайтов в составе ДНК-дуплексов, содержащих напротив АР-сайта либо dAMP (АР-ДНК-А) либо остаток THF - синтетический аналог АР-сайта (АР-ДНК-THF).

В использованных условиях для AP-ДНК-A и AP-ДНК-THF глубина гидролиза АРсайтов (в %) составляла 945 и 938 соответственно, а в присутствии PARPсоответствующие параметры равны для AP-ДНК-A - 935, и AP-ДНК-THF - 6210.

Таким образом, PARP1 ингибирует гидролиз АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1, если напротив него находится аналог АР-сайта, то есть, если АР-сайт находится в составе кластерного повреждения.

4.4. Поиск новых участников процесса ЭРО. Идентификация HMGB1 как кофактора этого процесса Согласно господствующему в настоящее время представлению выбор пути ЭРО - короткозаплаточный или длиннозаплаточный - зависит от эффективности удаления 5dRP остатка за счет лиазной активности Pol , которая является основным известным белком высших эукариот, осуществляющим эту функцию [Horton et al., 2000; Srivastava et al., 1998].

Для поиска других белков с 5-dRP лиазной активностью использовали ДНКинтермедиат ЭРО, содержащий остаток 5-dRP и экстракт эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), нокаутных по гену Pol и экспрессирующих Pol с флаг-эпитопом (FE).

В МЭФ-экстрактах обнаружен белок, формирующий ковалентные аддукты с ДНКдуплексом с разрывом, фланкированным 5-dRP остатком (Рис. 29а, дор. 1 и 2). Эта ДНК для своей репарации требует активности 5-dRP-лиаз. С использованием подхода, схематично представленного на рис. 24д, проведена идентификация белка в составе ковалентного аддукта, образованного белком экстракта клеток HeLa c ДНК, содержащей остатки 5-dRP и биотина. В качестве наиболее достоверного кандидата идентифицирован HMGB1 (Mowse score 102, sequence coverage 32%).

HMGB1 - высококопийный негистоновый архитектурный белок хроматина - обладает способностью изгибать ДНК и влиять на процессы эксцизионной репарации нуклеотидов и ошибочно спаренных нуклеотидов [Yuan et al., 2004, Zhang et al., 2005].

Обнаруженная способность HMGB1 взаимодействовать с ДНК-интермедиатом ЭРО ставит вопрос о его роли в этом процессе. Для выделенного из клеток HeLa HMGBустановлено, что он проявляет слабую 5-dRP-лиазную активность и стимулирует активность ферментов ЭРО: APE1 (рис. 29б) и FEN1 (рис. 29в).

а в г б д Рис. 29. HMGB1 как кофактор ЭРО а - поиск белков экстрактов, взаимодействующих с 5-dRP остатком в ДНК-дуплексе: дор. 1 и 2 - продукты пришивки 5-dRP-ДНК к белкам в экстрактах МЭФ, экспрессирующих Pol с флагэпитопом (FE) и нокаутных по этому белку соответственно, дор. 3 - то же для индивидуальной Pol ;

б - влияние HMGB1 на активность АРЕ1; в - влияние HMGB1 на активность FEN1; г - взаимодействие GFP-HMGB1 с сайтами повреждений ДНК в клетках HeLa, вызванных микрооблучением лазером (=405 нМ) без сенсибилизатора и в присутствии 8-метоксипсоралена; д - влияние HMGB1 на повреждение ДНК метилметансульфонатом (MMS) в присутствии метоксиамина (MX).

С использованием клеток HeLa, экспрессирующих HMGB1 в виде химерного белка с зеленым флуоресцентным белком (GFP-HMGB1), обнаружена способность HMGBлокализоваться в местах повреждений ДНК, вызванных микрооблучением лазером (рис. 29г). В использованных условиях облучения наряду с одноцепочечными разрывами и другими повреждениями в значительном количестве образуются окисленные основания [Lan et al., 2005, Orimo et al., 2006]. Действительно, ДНК-гликозилазы (GFPOGG1 и GFP-NTH1) эффективно аккумулируются в сайтах облучения в отличие от белков, узнающих двухцепочечные разрывы ДНК (GFP-Ku70 и GFP-RAD52) (рис. 29г).

Эмбриональные фибробласты мыши HMGB1+/+-типа проявляют большую чувствительность, чем HMGB1-/--клетки, к совместному действию метилметансульфоната и метоксиамина (данные не проиллюстрированы), и в ДНК HMGB1+/+-клеток присутствует значительно большее количество одноцепочечных разрывов (рис. 29д). Обработка АР-ДНК метоксиамином повышает ее устойчивость к действию АРЕ1 [Horton et al., 2000]. HMGB1 стимулирует расщепление таких модифицированных АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1 (данные не проиллюстрированы).

По-видимому, накопление в клеточной ДНК одноцепочечных разрывов обусловлено стимуляцией активности АР-эндонуклеазы 1 под действием HMGB1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование модифицированных ДНК в изучении систем репарации/репликации ДНК продемонстрировано на типичных примерах, но из-за ограниченного объема, не охватывает всех исследований, выполненных с их применением.

Среди модифицированных ДНК особое место занимают фотоактивируемые ДНК.

Благодаря разработанным подходам появилась возможность создания ДНК-структур с заданным положением фотоактивируемой группы, и с их использованием удалось получить информацию о структурной организации комплексов RPA с ДНК, которую не могут дать другие методы и подходы.

В результате целенаправленной работы по созданию новых фотореакционноспособных производных dNTP получены соединения, обеспечивающие эффективный синтез фотоактивируемых ДНК в экстрактах, и увеличение выхода сшивок с белками в 5-10 раз, что значительно расширяет возможности метода фотоаффинной модификации.

В настоящей работе с использованием АР-ДНК впервые установлена способность двух регуляторных белков ЭРО - PARP1 и XRCC1 - взаимодействовать с ранними интермедиадами этого процесса - АР-сайтами - посредством образования основания Шиффа. Кроме того, для двух белков, ранее не относимых к системе эксцизионной репарации оснований - Ku80 субъединица Ku-антигена и HMGB1, установлена способность взаимодействия с ДНК-интермедиатами ЭРО с использованием такого же механизма.

Интересно отметить, что обнаруженное взаимодействие регуляторных белков репарации - PARP1, Ku80, HMGB1 и XRCC1 - с АР-сайтами, не сопровождающееся эффективным расщеплением цепи ДНК по положению АР-сайтов, выдвигает вопрос о функциональной значимости таких взаимодействий. С одной стороны, вероятно, что ковалентное, но обратимое присоединение белков к АР-ДНК через основание Шиффа, может служить для временной защиты АР-сайтов. Временная защита АР-сайтов особенно важна, когда они входят в состав кластерных повреждений, например, близко расположенных в комплементарной цепи разрывов или АР-сайтов, поскольку в результате попытки репарации могут образовываться двухцепочечные разрывы, которые более токсичны для клеток [Gulston et al., 2004, Yang et al., 2004].

Действительно, в работе обнаружено, что PARP1 ингибирует гидролиз АР-сайтов, если напротив аналога АР-сайта. С другой стороны, не исключено, что проявление АРлиазной активности белками, образующими основания Шиффа, зависит от структурных особенностей ДНК. Так, например, в недавно опубликованной работе [Roberts et al., 2010] показано, что Ku-антиген проявляет слабую АР-лиазную активность, когда АРсайт расположен непосредственно вблизи двухцепоченых концов (второе положение с 5-конца в свисающей одноцепочечной части ДНК-дуплекса). Однако если АР-сайт расположен на расстоянии более одного витка спирали от конца АР-лиазная активность Ku-антигена не проявляется, как и в случае использованных нами АР-ДНК. Кроме того, такая ковалентная фиксация белков на ДНК сама может вносить вклад в известную токсичность АР-сайтов.

Еще одним перспективным направлением развития аффинной модификации белков оказалось использование модифицированных ДНК в сочетании с методами массспектрометрии для поиска и идентификации ранее неизвестных белков-участников определенных процессов/стадий репарации ДНК. В данной работе этим подходом в составе конъюгатов, образованных белками экстрактов с ДНК, содержащими интактный или расщепленный АР-сайты, были идентифицированы PARP1, Ku80 субъединица Kuантигена и HMGB1. Этот подход довольно универсален и может применяться для идентификации различных ДНК-связывающих белков с использованием ДНК, содержащих структурные элементы, специфически узнаваемыми белками.

ВЫВОДЫ Данная работа представляет собой систематическое исследование, в результате которого разработана новая стратегия в изучении механизмов репарации/репликации ДНК, основанная на использовании модифицированных, в том числе химически активных, ДНК-интермедиатов этих процессов. Их использование в сочетании с функциональным анализом и другими подходами позволило изучить важные аспекты организации и функционирования систем репарации/репликации ДНК, а также идентифицировать новые белковые факторы - компоненты этих систем.

1. Разработаны универсальные подходы к получению и характеризации модифицированных ДНК-интермедиатов репарации/репликации ДНК, которые содержат фотоактивируемые или другие модифицирующие группы в определенных положениях цепи ДНК:

с целью создания более эффективных фотореагентов на основе ДНК, для широкого ряда аналогов пиримидиновых dNTP с фотоактивируемыми группами различной реакционной способности, присоединенными к экзоциклической аминогруппе цитидина и в 5-ом положении тимидина линкерами различной длины и структуры, проведен детальный анализ их субстратных свойств в синтезе ДНК, катализируемом ДНКполимеразами вирусного, бактериального и эукариотического происхождения;

определены факторы, влияющие на эффективность образования сшивок фотоактивируемых ДНК с белками; к ним относятся: тип фотоактивируемой группы, структура линкера, присоединяющего ее к основанию, а при введении фотоактивируемых нуклеотидов в ДНК эндогенными ДНК-полимеразами экстрактов - субстратные характеристики аналогов dNTP;

предложены универсальные ферментативные способы введения фотоактивируемых групп в 5-конец ДНК и фотоактивируемых нуклеотидов во внутренние положения цепи ДНК;

2. На примере системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО) продемонстрирована продуктивность использования модифицированных ДНК, включая химически активные, в сочетании c другими методами, для установления закономерностей взаимодействия белков с ДНК и функционального взаимовлияния белков в ходе репарации:

показано, что апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1) стимулирует активность ДНК-полимеразы (Рol ) в синтезе ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на 3'-конце разрыва, АРЕ1 выщепляет 3'-концевой нуклеотид, обеспечивая последующее эффективное удлинение праймера. Установлены закономерности влияния комплементарности и типа пары, в которую входит 3-концевой нуклеотид, условий реакции (ионная сила и рН) и структурных особенностей ДНК на 35 экзонуклеазную активность АРЕ1;

впервые детально исследована регуляторная роль поли(ADP-рибозо)полимеразы (PARP1) и ее автополи(ADP-рибозил)ирования в длиннозаплаточном (ДЗ) и короткозаплаточном (КЗ) пути эксцизионной репарации оснований. Как регулятор ЭРО PARP1 умеренно снижает эффективность КЗ-пути и значительно влияет на ДЗ-путь, ингибируя синтез с вытеснением цепи, стимулирующее влияние APE1, 3'5' экзонуклеазную активность APE1 и активность флэпэндонуклеазы 1 (FEN1).

Автомодификация PARP1 ослабляет ее ингибирующее действие и, по-видимому, является необходимым условием для реализации Pol -зависимого варианта ДЗ-пути с участием АРЕ1 в качестве корректирующей экзонуклеазы.

обнаружено, что репликативный белок А (RPA) - эукариотический белок, связывающий одноцепочечную ДНК, ингибирует отщепление FEN1 одноцепочечного участка ДНК, возникающего в результате синтеза ДНК с вытеснением цепи, если длина этого участка достаточна для эффективного связывания RPA, что может регулировать длину ресинтезируемого участка ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО;

3. Показано, что аффинная модификация в сочетании с другими методами может эффективно применяться в исследовании структурной организации комплексов белокДНК.

для RPA - гетеротримерного белка, содержащего субъединицы р70, р32 и р14 - с использованием частичных ДНК-дуплексов с 3- или 5-выступающими одноцепочечными участками и фотоактивируемыми группами на 5- или 3-концах комплементарной цепи соответственно, установлено, что связывание RPA с одноцепочечной частью ДНК происходит полярно. р70 преимущественно взаимодействует с 5-концевой частью одноцепочечной ДНК независимо от структуры ДНК-дуплекса и конформации белка. Ориентация р70 и р32 относительно 3-конца цепи определяется длиной 5-выступающей одноцепочечной части и конформацией RPA; в непосредственное взаимодействие с 3-концом цепи такой ДНК вовлечены центральная часть р32 и С-концевая часть р70. Cубъединица р14 не контактирует с точками перехода одно/двухцепочечная ДНК. При связывании с одноцепочечной ДНК также реализуется полярная укладка белка на ДНК, и обнаруживаются прямые контакты p14 с ДНК.

с использованием ДНК, содержащей АР-сайты, обнаружено, что NTD- и BRCT1домены XRCC1 (белка, входящего в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению) непосредственно контактируют с сахарофосфатным остовом ДНК. Для BRCT1-домена такие контакты обнаружены впервые.

4. На ряде примеров продемонстрирована результативность использования химически активных ДНК в сочетании с иммунологическими и масс-спектрометрическими методами в поиске и идентификации новых белков репликации/репарации ДНК, а также поиске новых функций и типов взаимодействий белков:

на примере плазмодия Physarum polycephalum показано, что в случае мало изученных организмов фотоактивируемые ДНК могут использоваться для характеризации белков репликативного аппарата. С применением фотоактивируемой ДНК впервые выделена ДНК-полимераза . С использованием специфических антител среди белков экстракта плазмодия, модифицированных фотоактивируемой ДНК, идентифицированы полипептиды ДНК-полимеразы -праймазы и ДНК-полимераз и ;

отработана и апробирована универсальная процедура идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с химически активными ДНК, основанная на данных масс-спектрометрического анализа пептидов. В экстрактах клеток млекопитающих Kuсубъединица Ku-антигена и PARP1 впервые идентифицированы как белки, взаимодействующие с интактными АР-сайтами, а белок HMGB1 (High Mobility Group Box 1) - с 5-дезоксирибозофосфатным остатком, возникающим при гидролизе АР-сайта;

установлена новая функция белка HMGB1 как кофактора процесса ЭРО: он образует комплексы с Рol , АРЕ1 и FEN1, стимулируя активность обеих нуклеаз, проявляет слабую 5Т-дезоксирибозофосфатлиазную активность и накапливается в сайтах повреждения ДНК в живых клетках;

впервые показано, что XRCC1 - регуляторный белок ЭРО - взаимодействует с образованием основания Шиффа с ДНК-интермедиатами этого процесса: интактными АР-сайтами и продуктами расщепления АР-сайтов ферментами ЭРО: 5'дезоксирибозофосфатом и 3'-,-4-гидроксипентен-2-алем.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Обзоры 1. Лаврик О.И., Хлиманков Д.Ю., Ходырева С.Н. (2003) Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации. Молекуляр. биология, 37, 563-572.

2. Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2003) Photoaffinity probes in molecular biology of DNA replication and DNA repair, in: Chemical probes in Biology, Ed. Schneider M., Kluwer Academic Publishers, 193-205.

3. Lavrik O.I., Pestryakov P.E., Nazarkina J.K., Khodyreva S.N. (2003) Study of human replication protein А by photoaffinity labeling technique, in: Chemical probes in Biology, Ed.

Schneider M., Kluwer Academic Publishers, 181-192.

4. Суханова М.В., Лаврик О. И., Ходырева С.Н. (2004) Поли(ADP-рибозо)полимераза Ч регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии. Молекуляр. биология, 38, 834-847.

5. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. (2005) Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair. Curr. Med. Chem., 12, 641-655.

6. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2007) Полифункциональная апуриновая/апирими-диновая эндонуклеаза 1 человека: роль дополнительных функций.

Молекуляр. биология, 41, 450-466.

7. Назаркина Ж.К., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2008) Флэпэндонуклеаза-1 и ее роль в процессах метаболизма ДНК в клетках эукариот. Молекуляр. биология, 42, 405-421.

Статьи в рецензируемых изданиях 8. Khodyreva S.N., Podust V.N., Sergeev D.S., Ivanova E.M., Frolova E.I., Koshkin A.A., Godovikova T.S., Zarytova V.F., Ricchetti M., Lavrik O.I. (1993) Comparison of interactions of 5Т-derivatives of deoxyoctathymidylate with human DNA polymerase and HIV reverse transcriptase. Mol. Biol. Reports, 12, 43-47.

9. Щербик Н.В., Ходырева С.Н., Власов В.А., Добриков М.И., Дымшиц Г.М., Лаврик О.И. (1997) Фотоаффинная модификация обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека аналогом дезоксиуридин-5'-трифосфата, содержащим арилазидную группу. Молекуляр. биология, 31, 344-352.

10. Сафронов И.В., Щербик Н.В., Ходырева С.Н., Власов В.А., Добриков М.И., Шишкин Г.В., Лаврик О.И. (1997) Новые фотоактивные экзо-N4-замещенные аналоги dCTP: получение, фотохимические и субстратные свойства при синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой ВИЧ-1. Биоорган. химия, 7, 576-585.

11. Doerhoefer S., Khodyreva S., Safronov I., Wlassoff W.A., Anarbaev R., Lavrik O.I., Holler E. (1998) Molecular constituents of the replication apparatus in the plasmodium of Physarum polycephalum: identification by photoaffinity labeling. Microbiology, 144, 31813193.

12. Захаренко А.Л., Ходырева С.Н., Речкунова Н.И., Сафронов, И.В,. Пышный Д.В,.

Дегтярев С. Х., Лаврик О.И. (1998) Аффинная модификация ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus и ДНК-матрицы с помощью фотореакционноспособных производных dCTP. Биохимия, 63, 1090-1096.

13. Kolpashchikov D.M., Rechkunova N.I., Dobrikov M.I., Khodyreva S.N., Lebedeva N.A., Lavrik O.I. (1999) Sensitized photomodification of mammalian DNA polymerase beta. A new approach for highly selective affinity labeling of polymerases. FEBS Lett., 448, 141-144.

14. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.-P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. (1999) Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs pto the 3'-end of nascent DNA. FEBS Lett., 450, 131-134.

15. Lavrik O.I., Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H-P., Khodyreva S.N., Favre A.

(1999) RPA subunit arrangement near the 3-end of the primer is modulated by the length of the template-strand and cooperative protein interactions. Nucleic Acids Res., 27, 4235-4240.

16. Колпащиков Д.М., Захаренко А.Л., Дежуров С.В., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. (1999) Новые реагенты для аффинной модификации биополимеров. Фотоаффинная модификация Tte-ДНК-полимеразы.

Биоорган. химия, 25, 129-136.

17. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2000) Исследование взаимодействия репликативного фактора А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dТТР. Биохимия, 65, 194-198.

18. Колпащиков Д.М., Aлександрова Л.А., Закирова Н.Ф., Ходырева С.Н., Лаврик О.И.

(2000) Фотореакционноспособный аналог 2',3'-дидезоксиуридин-5'-трифосфата:

получение и использование для фотоаффинной модификации фактора репликации А человека. Биоорган. химия, 26, 151-155.

19. Колпащиков Д.М, Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2000) Репликативный фактор А связывает одноцепочечную ДНК полярно. Докл. Акад. Наук, 372, 824-826.

20. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Yu., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. (2001) Polarity of human replication protein A binding to DNA. Nucleic Acids Res., 29, 373-379.

21. Драчкова И.А., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Захаренко А.Л., Шишкин Г.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2001) Реагенты для модификации белково-нуклеиновых комплексов. II. Сайт-специфическая фотомодификация комплексов ДНК-полимеразы праймерами, элонгированными экзо-N-замещенными арилазидными производными dCTP. Биоорган. химия, 27, 197-204.

22. Хлиманков Д.Ю., Петрусева И.О., Речкунова Н.И., Белоусова Е.А., Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2001) Получение фотореакционноспособных олигонуклеотидных дуплексов и их применение для фотоаффинной модификации ДНКсвязывающих белков. Биоорган. химия, 27, 205-209.

23. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И.

(2001) Аффинная модификация флэпэндонуклеазы FEN-1 фотореакционноспособными ДНК. Биохимия, 66, 905-912.

24. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Фавр А., Лаврик О.И. (2001) Исследование взаимодействия репликативного белка А человека с ДНК-дуплексами, содержащими бреши различного размера. Молекуляр.

биология, 35, 827-835.

25. Сафронов И.В., Драчкова И.А., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Добриков М.И., Иванова Т.М., Шишкин Г.В., Лаврик О.И. (2001) Реагенты для модификации белковонуклеиновых комплексов. III. Сайт-специфическая фотомодификация элонгирующего комплекса ДНК-полимеразы арилазидными производными праймеров, сенсибилизированная флуоресцентными -амидами ATP. Биоорган. химия, 27, 372-382.

26. Захаренко А.Л., Колпащиков Д.М, Ходырева С.Н., Лаврик О.И., Менендес-Ариас Л.

(2001) Исследование dNTP-связывающего участка обратной транскриптазы ВИЧ-1 с помощью фотореакционноспособных аналогов dNTP. Биохимия, 66, 1227-1237.

27. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Петрусева И.О., Назаркина Ж.К., Белоусова Е.А., Лаврик О.И. (2002) Исследование взаимодействия RPA и FEN-1 с ДНКдуплексами, содержащими одноцепочечные разрывы и флэп-структуры. Молекуляр.

биология, 36, 1044-1053.

28. Lebedeva N., Rechkunova N., Khodyreva S., Favre A., Lavrik O. (2002) Photoaffinity labeling of proteins in bovine testis nuclear extract. Biochem. Biophys. Res. Commun., 297, 714-721.

29. Petrousseva I.O., Safronov I.V., Komarova N.I., Kamynina T.P., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2002) An enzymatic synthesis of 5'-end substituted oligonucleotides using Tpolynucleotide kinase and gamma-amides of ATP, bearing photoreactive groups. Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk, IC&G: 4, 16-18.

30. Khodyreva S.N., Nazarkina J.K., Petruseva I.O., Safronov I.V., Lavrik O.I. (2002) Interaction between flap endonuclease-1 and replication protein A. Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk: IC&G. 4, 13-15.

31. Sukhanova M.V., Lavrik O.I., Safronov I.V., Khodyreva S.N. (2002) Site-specific photomodification of mammalian poly(ADP-ribose)polymerase-1 with photoreactive DNA base excision repair intermediate, Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20, Novosibirsk: IC&G. 4, 22-24.

32. Lebedeva N.A., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. (2003) AP endonuclease 1 has no biologically significant 3'-5'-exonuclease activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 300, 182187.

33. Pestryakov P.E., Weisshart K., Schlott B., Khodyreva S.N., Kremmer E., Grosse F., Lavrik O.I., Nasheuer H.P. (2003) Human replication protein A: The C-terminal RPA70 and the central RPA32 domains are involved in the interactions with the 3'-end of a primer-template DNA. J. Biol. Chem., 278, 17515-17524.

34. Дежуров С.В., Ходырева С.Н., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Лаврик О.И.

(2003) Сравнительное изучение эффективности модификации ДНК-полимераз и ДНКматрицы различными фотоактивными группами на 3Т-конце ДНК-праймера. Биоорган.

химия, 29, 74-81.

35. Петрусева И.О., Сафронов И.В., Комарова Н.И., Камынина Т.П., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2003) Новый способ синтеза фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов, замещенных по 5'-концевому фосфату, с использованием Тполинуклеотидкиназы и гамма-амидов АТР. Докл. Акад. Наук, 389, 701-704.

36. Назаркина Ж.К., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2003) Исследование взаимодействия флэпэндонуклеазы-1 с репликативным белком А с использованием фотоактивных интермедиатов репарации ДНК. Биохимия, 68, 1138-1148.

37. Суханова М.В., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2004) Поли(ADP-рибоза)-полимераза1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой .

Биохимия, 69, 558-568.

38. Лебедева Н.А., Середина Т.А., Сильников В.Н, Левина А.С., Ходырева С.Н., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. (2005) Сравнительный анализ взаимодействия ДНКполимеразы и обратных транскриптаз вируса иммунодефицита человека и лейкемии мышей с аналогами dNTP, модифицированными по рибозе. Биохимия, 70, 5-13.

39. Dezhurov S.V., Khodyreva S.N., Plekhanova E.S., Lavrik O.I. (2005) A new highly efficient photoreactive analogue of dCTP. Synthesis, characterization, and application in photoaffinity modification of DNA binding proteins. Bioconjug. Chem., 16, 215-222.

40. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lebedeva N.A., Prasad R., Wilson S.H, Lavrik O.I.

(2005) Human base excision repair enzymes apurinic/apyrimidinic endonuclease1 (APE1).

DNA polymerase beta and poly(ADP-ribose) polymerase 1: interplay between stranddisplacement DNA synthesis and proofreading exonuclease activity. Nucleic Acids Res., 33, 1222-1229.

41. Anarbaev R.O., Khodyreva S.N., Zakharenko A.L., Rechkunova N.I., Lavrik O.I. (2005) DNA polymerase activity in water-structured and confined environment of reverse micelles. J.

Mol. Catal. B: Enzymatic, 33, 29-34.

42. Назаркина Ж.К., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2005) Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований. Биохимия, 70, 1613-1622.

43. Дежуров С.В., Грин И.Р., Сафронов И.В., Шишкин Г.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2005) Высокоэффективная модификация ДНК-полимеразы бета в условиях прямой и сенсибилизированной активации фотоактивных ДНК. Модификация белков клеточного экстракта. Известия Акад. Наук. Серия химическая, 54, 1273-1283.

44. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Суханова М.В., Сафронов И.В., Дежуров С.В., Лаврик О.И. (2006) 3'Ц5'-экзонуклеазная активность aпуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека по отношению к ДНК, содержащим dNMP и их модифицированные аналоги. Биохимия, 71, 254-265.

45. Dyrkheeva N.S., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. (2006) Efficiency of exonucleolytic action of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 towards matched and mismatched dNMP at the 3' terminus of different oligomeric DNA structures correlates with thermal stability of DNA duplexes. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 699-706.

46. Grin I.R., Khodyreva S.N., Nevinsky G.A., Zharkov D.O. (2006) Deoxyribophosphate lyase activity of mammalian endonuclease VIII-like proteins. FEBS Lett., 580, 4916-4922.

47. Суханова М.В., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2006) Влияние экзогенной поли(ADPрибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНКдуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. Биохимия, 71, 909-923.

48. Nazarkina Z.K., Khodyreva S.N., Marsin S., Lavrik O.I., Radicella J.P. (2006) XRCCinteractions with base excision repair DNA intermediates. Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г.

Кнорре, Новосибирск, 53Ц54.

49. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Influence of 24 kDa apoptotic fragment of poly(ADP-ribose) polymerase-1 on repair of DNA duplexes in bovine testis nuclear extract.

Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 63Ц64.

50. Khodyreva S.N., Nazarkina Z.K., Plekhanova E.S., Sukhanova M.V., Lavrik O.I.

Chemically reactive DNA intermediates as a tool in study of DNA replication and DNA repair.

Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 71Ц72.

51. Dyrkheeva N., Khodyreva S., Lavrik O. Interaction of Ape1 towards DNA-duplexes containing dNMP or modified dCMP analog at the 3 end. Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г.

Кнорре, Новосибирск, 2006, 110Ц111.

52. Пестряков П.Е., Красикова Ю.С., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Роль субъединицы p14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной ДНК. Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 153-154.

53. Плеханова Е.С., Солодова Е.И., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Взаимодействие белков клеточных экстрактов с химически активными ДНК. Сборник трудов международной конференции Физико-химическая биология, посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006, 157-158.

54. Prasad R., Liu Y., Deterding L.J., Poltoratsky V.P., Kedar P.S., Horton J.K., Kanno S., Asagoshi K., Hou E.W., Khodyreva S.N., Lavrik O.I., Tomer K.B., Yasui A., Wilson S.H.

(2007) HMGB1 is a cofactor in mammalian base excision repair. Mol. Cell, 27, 829-841.

55. Nazarkina Z.K., Khodyreva S.N., Marsin S., Lavrik O.I., Radicella J.P. (2007) XRCCinteractions with base excision repair DNA intermediates. DNA Repair, 6, 254-264.

56. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. (2007) Suppression of base excision repair reactions by apoptotic 24kDa-fragment of poly(ADP-ribose) polymerase 1 in bovine testis nuclear extract. DNA Repair, 6, 615-625.

57. Назаркина Ж.К., Ходырева С.Н., Марсан С., Радичелла П., Лаврик О.И. (2007) Исследование взаимодействия XRCC1 с ДНК и белками эксцизионной репарации оснований методом фотоаффинной модификации. Биохимия, 72, 1078-1089.

58. Пестряков П.Е., Красикова Ю.С., Петрусева И.О, Ходырева С.Н., Лаврик О.И.

(2007) Роль субъединицы р14 репликативного белка А в процессе связывания с одноцепочечной ДНК. Докл. Акад. Наук, 412, 118-122.

59. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2008) Взаимодействие AРЕ1 и других репарационных белков с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации и репликации ДНК. Биохимия, 73, 322-335.

60. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. (2008) Количественный анализ 3Т-5Т экзонуклеазной реакции АРЕ1 с ДНК, содержащими природные dNMP или их модифицированные аналоги в одноцепочечном разрыве. Биоорган. химия, 34, 210-219.

61. Ilina E.S., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. (2008) Ku antigen interacts with abasic sites.

Biochim. Biophys. Acta, 1784, 1777-1785.

62. Ильина Е.С., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. (2009) Идентификация Ku80субъединицы Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами. Докл. Акад. Наук, 42, 411Ц414.

63. Ilina E.S., Khodyreva S.N., Berezhnoy A.E., Larin S.S., Lavrik O.I. (2010) Tracking Ku antigen levels in cell extracts with DNA containing abasic sites. Mutat. Res., 685, 90-96.

64. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. (2010) Poly(ADP-ribose) polymerase 1 regulates activity of DNA polymerase in long patch base excision repair. Mutat. Res., 685, 80-89.

65. Ходырева С.Н., Ильина Е.С., Кутузов М.М., Суханова М.В., Лаврик О.И. (2010) Взаимодействие поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами. Докл. Акад. Наук, 431, 132-135.

Патент 66. Ильина Е.С., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Способ детекции Ku-антигена в экстрактах клеток человека. Патент на изобретение № 2384623, приоритет от 07.10.2008.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии