Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
БАЙКОВ Вадим Валентинович
МНОЖЕСТВЕННАЯ МИЕЛОМА (МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.00.15 - патологическая анатомия 14.00.29 - гематология и переливание крови А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Санкт-Петербург 2008
Работа выполнена на кафедре патологической анатомии и на кафедре гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.
акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Рыбакова Маргарита Григорьевна доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Ариэль Борис Михайлович член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Савченко Валерий Григорьевич
Ведущая организация: ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН
Защита состоится л 16 мая 2008 г. в _____ час. на заседании диссертационного совета Д 208.090.03 при ГОУ ВПО СанктПетербургский государственный медицинский университет им. акад.
И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 6/8, зал Ученого совета).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СанктПетербургского государственного медицинского университета им.
акад. И.П.Павлова
Автореферат разослан л ____________________2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук профессор В.Ф.Митрейкин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Изучение множественной миеломы (ММ) (син.: миеломная болезнь) было и остается одной из актуальных задач медицины. В предисловии к первой изданной в СССР монографии по миеломной болезни (Алексеев Г.А. и Андреева Н.Е., 1966) выдающийся гематолог акад.
АМН СССР И.А.Кассирский писал: Можно без преувеличения сказать, что за последние годы изучение миеломной болезни из частного вопроса гематологии переросло в общепатологическую проблему современной лейкозологии и даже онкологии. Эта мысль отражала скачок в понимании миеломной болезни, связанный с осознанием ее как опухоли из плазматических клеток, способных продуцировать аномальный белок - биохимическую метку злокачественности, по терминологии И.А.Кассирского.
Действительно, в 1953 г. был введен иммуноэлектрофорез, который сделал возможной точную идентификацию миеломных белков, а в 1956 L. Korngold и R. Lipari обратили внимание на то, что протеины Bence-Jones и миеломные белки в сыворотке крови имеют отношение к нормальному сывороточному -глобулину. Качественный скачок в терапии ММ относится к 60-м годам XX века. В 1953 г. в СССР был синтезирован сарколизин, на основе которого получен мелфалан (алкеран).
В 1958 г. впервые показан клинический эффект сарколизина у миеломных больных (Н.Н.Блохин). В 1969 R. Alexanian продемонстрировал эффект сочетания мелфалана с преднизолоном - сочетания, ставшего классическим. Таким образом, успехи в изучении ММ в 50Ц60-е гг.
ХХ века не только позволили улучшить ее диагностику и лечение, но и открыли пути к пониманию ряда физиологических закономерностей развития В-клеточной лимфоидной популяции, а также фундаментальных закономерностей онкогенеза.
Но в дальнейшем на протяжении 30 лет существенного прогресса в терапии ММ не было. Схемы химиотерапии совершенствовались, но проведенный в 1992 году мета-анализ (Gregory W.M. et al.) показал, что ни одна из них не имеет преимущества над комбинацией мелфаланпреднизолон. Болезнь остается неизлечимой. Современные высокодозные схемы с последующей трансплантацией костного мозга позволили увеличить выживаемость больных, но едва ли способны обеспечить длительную безрецидивную жизнь или излечение.
Поэтому сегодня мы осознаем ММ как пример заболевания, проявляющего удивительное упорство и сопротивление современным методам терапии, а следовательно, использующего в своем развитии и прогрессировании еще неизвестные общебиологические закономерности. Именно поэтому исследования множественной миеломы сохраняют актуальность и, как и 50 лет назад, могут служить решению ряда проблем общебиологического значения.
С точки зрения патологоанатомической, диагностика миеломы кажется рутинной процедурой, суть которой заключается в том, чтобы выявить очаги опухолевого роста в костном мозге и классифицировать опухолевые клетки как клетки с плазматической дифференцировкой.
Однако с уточнением диагностических критериев возникает необходимость определения истинного количества плазматических клеток в костном мозге, их пролиферативного потенциала, черт фенотипа, которые могут иметь диагностическое и прогностическое значение.
С позиций общебиологических - множественная миелома представляет собой, пожалуй, наиболее яркий пример того, как злокачественная опухоль сохраняет чрезвычайную зависимость от сигналов, поступающих из микроокружения (в данном случае, костномозгового).
Действительно, по современным представлениям, первичные онкогенные мутации В-клеток при ММ происходят в ходе рекомбинации в гене тяжелых цепей со сменой изотипа иммуноглобулина (т.е. на уровне постфолликулярной клетки в периферических лимфоидных органах (Tricot G., 2000)), после чего трансформированные клетки перемещаются в костный мозг (Hallek M. et al., 1998). Вплоть до последних стадий болезни костный мозг остается чуть ли не единственным местом их локализации, несмотря на циркуляцию в крови трансформированных клеток, способных к размножению (Алмазов В.А. и соавт., 1993).
Однако такая зависимость миеломного клона от факторов микроокружения означает и его уязвимость. Можно надеяться, что исследования механизмов зависимости ММ от костномозгового микроокружения позволит разработать пути подавления этой зависимости и получить терапевтический результат.
В настоящем исследовании мы проанализировали структуру опухоли с позиций патологоанатомической диагностики (на текущем материале за 1988-2003 гг.), суммировали данные о фенотипе опухоли, а также изучили некоторые важнейшие стороны структуры и физиологии опухолевых клеток, в частности, пролиферацию, адгезию и миграцию, с применением как классических морфологических, так и ряда современных методик, которые позволяют действительно расширить понятие структуры в патологии до молекулярного уровня. Установление молекулярных механизмов пролиферации, адгезии и миграции миеломных клеток является основой для разработки средств целенаправленной терапии заболевания.
Цель исследования Изучить патологическую анатомию множественной миеломы на материале трепанобиоптатов, изучить закономерности и механизмы пролиферации, миграции миеломных клеток и адгезии их к матриксным белкам.
Задачи исследования 1. Проанализировать структуру опухоли с позиций патологоанатомической диагностики, суммировать данные о фенотипе, изучить клеточный состав миеломного клона на материале трепанобиоптатов.
Изучить зависимость клеточного состава и ряда других параметров от клинической стадии ММ.
2. Установить зависимость пролиферативного индекса от клинической стадии ММ на материале трепанобиопсий. Изучить пролиферацию клеток миеломных клеточных линий, их чувствительность к важнейшим цитокинам и ингибиторам сигнальных каскадов.
3. Оценить экспрессию некоторых молекул адгезии на миеломных клетках на материале трепанобиопсий. Оценить экспрессию интегринов на клетках основных миеломных клеточных линий. На материале миеломных клеточных линий и клетках пациентов с миеломной болезнью изучить способность миеломных клеток к адгезии к основным внеклеточным белкам, механизмы ее усиления и возможности подавления с помощью ингибиторов.
4. Охарактеризовать механизмы адгезии миеломных клеток к фибронектину при стимуляции цитокинами и двухвалентными катионами, уточнить роль интегринов и синдекана в адгезии миеломных клеток к матриксным белкам.
5. На модели миеломных клеточных линий и клетках пациентов ММ изучить роль фактора роста гепатоцитов (HGF) в биологии миеломных клеток. Изучить возможность блокирования HGF-зависимых функций с помощью ингибитора рецептора HGF.
6. Изучить возможную роль остеопонтина и серглицина в патогенезе миеломной болезни.
7. Проанализировать обнаруженные эффекты стимуляторов и ингибиторов пролиферации, адгезии и миграции с позиций поиска объектов для целенаправленной терапии.
Научная новизна Впервые на материале трепанобиопсий проведено исследование клеточного состава миеломного клона с выделением четырех основных типов миеломных клеток (по J.E. Goasguen и соавт., 1999), показаны различия в клеточном составе опухоли в зависимости от клинической фазы, подтверждена корреляция пролиферативного индекса с клинической стадией миеломы и клеточным составом.
Впервые в рамках одного исследования проведен скрининг клеточных линий миеломы на предмет зависимости пролиферации от действия цитокинов и ингибиторов важнейших внутриклеточных сигнальных каскадов, и на этом материале продемонстрирована крайняя гетерогенность молекулярной организации разных миеломных клонов.
Получены новые данные об ускорении пролиферации клеток миеломных линий при адгезии их к белкам матрикса. Впервые показано, что фактор роста гепатоцитов является активным стимулятором адгезии и миграции миеломных клеток.
Впервые показано, что цитокин-стимулированная адгезия клеток миеломы к белкам матрикса требует участия синдекана, что приводит к колокализации синдекана и интегрина VLA-4. Продемонстрировано, что ионы Mn2+ стимулируют адгезию миеломных клеток к фибронектину. Это может иметь значение для фиксации миеломных клеток в зонах резорбции кости.
Впервые показано, что остеопонтин может быть субстратом для адгезии миеломных клеток. Установлено, что клетки миеломных клеточных линий синтезируют и в большинстве своем секретируют серглицин. Серглицин на поверхности миеломных клеток может усиливать адгезию миеломных клеток к белкам матрикса.
Впервые на модели клеточной линии миеломных клеток INA-раскрыты существенные молекулярные механизмы адгезии и миграции. Показано, что адгезия и миграция клеток критически зависит от активности PI-3K, при этом сигнал не передается ни через комплекс AKT, ни через mTOR. Миграция оказалась зависима не только от PI3K, но и от MAPK.
Практическая значимость Критерии диагностики ММ включают количественные параметры - процентное содержание клеток с плазматической дифференцировкой в костном мозге. В настоящей работе показано, что в препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD138 выявляется, в среднем, на 30% клеток больше, чем при использовании гистологических методик. Таким образом, рекомендация обязательного проведения реакции на CD138 способна существенно улучшить диагностику ММ.
Особенно это касается наблюдений с малым (<10%) количеством опухолевых клеток в костном мозге, по данным обзорных исследований.
Кроме того, в иммуногистохимических препаратах существенно легче оценить тип и распространенность поражения костного мозга при ММ.
В настоящем исследовании показано, что плазмобластный морфологический вариант ММ существенно отличается от остальных вариантов по критериям клеточного состава и индекса пролиферации.
Это позволяет рассматривать его как самостоятельную форму болезни.
Новые данные об особенностях регуляции пролиферации, адгезии и миграции миеломных клеток имеют общебиологическое значение и уже учитываются при проведении дальнейших научных исследований по проблеме. Они позволяют лучше понять биологическую основу существования миеломных клонов. Кроме того, молекулярные механизмы поддержания пролиферации и выживания миеломных клонов могут рассматриваться как мишени для разработки средств целенаправленной терапии множественной миеломы.
Результаты работы используются в диагностике и преподавании патологической анатомии в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и Санкт-Петербургском городском патологоанатомическом бюро.
Апробация работы состоялась 11 декабря 2007 г. на совместном заседании кафедры патологической анатомии и проблемной комиссии Патология и 14 декабря 2007 г. на совместном заседании кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии и проблемной комиссии Молекулярная медицина Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.
Материалы диссертации обсуждались на IX, X и XI международных конгрессах по множественной миеломе (Саламанка, Испания, 2003; Сидней, Австралия, 2005; Кос, Греция, 2007), 34-й Скандинавской конференции по гематологии (Рейкъявик, Исландия, 2003); Российско-норвежской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2003); заседаниях Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2004, 2005), XX и XXI Европейском конгрессе патологов (Париж, Франция, 2005; Стамбул, Турция, 2007), IV Конференции Российских патологоанатомов Новые методы и разработки в онкоморфологии, посвященной 100-летию со дня рождения Н.А.Краевского (Москва, 2005); Российско-американской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2006); конференции с международным участием Диагностика в медицине (Хургада, Египет, 2007), Российско-норвежском рабочем совещании по гематологии (СанктПетербург, 2007), Российско-немецкой конференции, посвященной 10летию сотрудничества Санкт-Петербург-Гамбург (Гамбург, Германия, 2007), пленуме правления Российской ассоциации патологоанатомов (Омск, 2007).
ичный вклад автора Автором сформулированы цель, задачи исследования и рабочие гипотезы, разработана методика исследования, выполнено обобщение и анализ результатов исследования, научно обоснованы выводы и практические рекомендации. Патологоанатомические, иммуногистохимические исследования, конфокальная микроскопия, а также эксперименты по изучению пролиферации, адгезии и миграции миеломных клеток клеточных линий и больных ММ выполнены автором. Исследования методами проточной цитометрии, иммуноблоттинга, ELISA, ряд экспериментов с линией мезенхимальных стволовых клеток и линией остеосаркомы, экспериментальная модель ММ у мышей выполнены в соавторстве.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Множественная миелома крайне неоднородна в отношении генетической основы, морфологических вариантов и стереотипов биологического поведения. По мере прогрессирования опухоли меняется клеточный состав, увеличивается количество сосудов и уменьшается количество Т-клеток. Множественная миелома характеризуется очень низкими показателями пролиферации, за исключением плазмобластного варианта. Плазмобластный вариант множественной миеломы необходимо рассматривать в качестве самостоятельной формы заболевания. Адгезия миеломных клеток к белкам матрикса приводит к ускорению пролиферации.
2. Адгезия и миграция миеломных клеток опосредуются интегрином VLA-4 (41) и усиливаются при стимуляции цитокинами HGF, IGF-1 и SDF-1. Адгезия, кроме того, усиливается в присутствии ионов марганца. Усиление адгезии при стимуляции цитокинами и ионами марганца достигается различными механизмами. При стимуляции цитокинами происходит взаимодействие интегринов и синдекана на поверхности миеломных клеток с колокализацией их в активных сайтах мембраны; это не сопровождается увеличением аффинности интегринов. Усиление адгезии при стимуляции ионами марганца возникает за счет изменения конформации молекулы интегрина и не требует участия синдекана.
3. Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует пролиферацию, адгезию и миграцию миеломных клеток. В клеточных линиях и миеломных клетках пациентов существует аутокринный порочный круг, представленный HGF и его рецептором. Показана секреция HGF в культуре мезенхимальных стволовых клеток. Все эффекты HGF подавляются под действием ингибитора рецептора HGF - c-Met.
4. Цитокин-стимулированная адгезия и миграция критически зависят от активности PI-3K и зависят от активности NF-B. Миграция, кроме того, зависит от активности MAPK. Ингибирование mTOR, AKT, протеинкиназы С, комплекса Jak2/Stat3 не оказывает влияния на адгезию и миграцию. Ключевые элементы сигнальных путей, регулирующие пролиферацию, адгезию и миграцию, могут быть мишенями целенаправленной терапии.
Публикации По материалам исследования опубликовано 23 работы, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, данные собственных исследований, обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы (399 источников, в том числе 28 - на русском и 371 - на иностранных языках). Работа иллюстрирована 79 рисунками и 16 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Настоящее исследование проводилась на материале трепанобиоптатов пациентов с миеломной болезнью и подозрением на нее (в первичный материал вошло 350 наблюдений), а также клеток миеломных клеточных линий (INA-6, IH-1, OH-2, ANBL-6, CAG, JJN-3, RPMI 6228 и U266), клеток линии Saos-2 остеосаркомы человека и линии мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC). Кроме того, часть экспериментов проводили на материале миеломных клеток больных множественной миеломой. Для выделения миеломных клеток использовали материал диагностических пунктатов костного мозга больных миеломной болезнью, остающийся после проведения необходимых диагностических процедур. Проводили также исследования крови животных в экспериментальных моделях ММ, разработанных и описанных H. Hjorth-Hansen и соавт. (1999).
Общая характеристика методов исследования, использованных в работе, дана в таблице 1.
Таблица 1. Методы исследования, использованные в работе № п/п Метод Характеристика Цель исследования метода использования 1. Гистологическое Микроскопическое Характеристика струкисследование исследование гистоло- туры и клеточного согических препаратов с става костного мозга количественным анализом клеточного состава миеломного клона 2. Иммуногисто- Иммунофенотипиро- Диагностика и диффехимическое ис- вание в срезах трепа- ренциальная диагноследование нобиоптатов, залитых стика ММ.
в парафин Анализ количества сосудов, Т-клеток и индекса пролиферации 3. Проточная Иммунофенотипиро- Определение экспресцитометрия вание в клеточной сии интегринов на повзвеси верхности миеломных клеток;
Аннексин-PI-тест Определение жизнеспособности клеток при действии ингибиторов адгезии и миграции 4. Конфокальная Лазерная конфокаль- Определение локализамикроскопия ная сканирующая ции молекул интегримикроскопия с ком- нов, синдекана и сергпьютерной реконст- лицина в клетках;
рукцией и анализом изображения Продолжение табл.№ п/п Метод Характеристика Цель исследования метода использования 5. Культивирова- Культивирование кле- Исследование пролиние клеток ток миеломных кле- ферации, адгезии, миточных линий; грации Краткосрочные куль- То же туры миеломных клеток больных;
Долгосрочные культу- Изучение влияния строры стромальных кле- мальных факторов на ток больных миграцию миеломных клеток 6. Метод тимиди- Культивирование кле- Исследование пролиновой метки ток в модельных усло- ферации виях с добавлением меченого тритием тимидина 7. Моделирование Краткосрочные куль- Изучение адгезии клеадгезии туры в планшетах, дно ток различных клеточкоторых покрыто тес- ных линий и клеток патируемым белком циентов к матриксным белкам, изучение влияния стимуляторов и ингибиторов адгезии 8. Моделирование Планшеты УTranswellФ Изучение миграции миграции клеток различных клеточных линий и клеток пациентов к матриксным белкам, изучение влияния цитокинов и ингибиторов 9. Вестерн- иммуноблоттинг Изучение активности блоттинг (фосфорилирования) молекул каскадов MAPK и PI-3K в модельных условиях 10. ELISA Твердофазный имму- Определение конценноферментный анализ трации остеопонтина в сыворотке крови 11. PCR ПЦР с использованием Определение РНК факобратной транскрип- тора роста гепатоцитов тазы (HGF) в культивируемых клетках Окончание табл. № п/п Метод Характеристика Цель исследования метода использования 12. Моделирование Имплантация клеток Изучение источника ММ у мышей клеточных линий ММ продукции остеопонтиANBL-6 и JJN-3 мы- на при ММ шам линии NOD/SCID Морфологическое исследование. Для морфологического исследования использован архивный материал патологоанатомического отделения клиник СПб государственного медицинского университета им. акад.
И.П.Павлова (СПбГМУ) за 1988-2005 год. За это время в отделение были доставлены для гистологического исследования трепанобиоптаты около 350 больных с диагнозом миеломная болезнь или с подозрением на нее.
Биоптаты направлялись из гематологического отделения факультетской терапевтической клиники СПбГМУ, консультативнодиагностического гематологического центра при поликлинике № 31, клиники трансплантации костного мозга СПбГМУ (с 2000 г.), а также больницы № 31 и ряда других медицинских учреждений города. В 1наблюдениях диагноз поражения костного мозга при плазмоцитарной опухоли (клинико-морфологически - ММ) был подтвержден.
Для исследования клеточного состава миеломного клона использованы трепанобиоптаты 69 больных при соблюдении следующих условий: достаточный объем и удовлетворительное качество биоптата, наличие признаков поражения костного мозга при ММ, наличие информации о клинической картине заболевания (что позволяло определить стадию болезни по Durie и Salmon). 30 пациентов были первичными больными, 39 - с признаками рецидива болезни. У 11 больных диагностирована I стадия ММ, у 27 - II и у 31 - III стадия. Средний возраст пациентов составлял 63 года (с колебаниями 45-78), соотношение мужчин и женщин - 1,2:1.
Проводили обзорное гистологическое исследование трепанобиоптатов. Проводили также иммуногистохимические реакции с антителами к CD3 (poly), CD20 (клон L26), CD29 (клон 7F10), CD 34 (клон QBEnd10), СD79 (клон JCB117), CD138 (клон MI 15) легким цепям иммуноглобулинов и (poly), иммуноглобулинам IgG и IgA (poly).
Интенсивность пролиферации оценивали по иммуногистохимической реакции с антителами к Ki-67 (клон MIB-1) (антитела к CD29 и CDпроизводства Novocastra, Newcastle upon Tyne, Великобритания, остальные - производства Dako, Glostrup, Дания). При изучении экспрессии серглицина миеломными клетками (совместно с C. Seidel и A.
Hjerpe) использовали поликлональные антитела, полученные в InVitrogen (Осло, Норвегия). Иммуногистохимическое исследование проводилось 3-х шаговым авидин-биотин-перокидазным методом в срезах с парафиновых блоков толщиной 5 мкм.
В препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD3 подсчитывали CD3-положительные клетки в 10 полях зрения при х400.
Данные выражались в процентах к общему числу миелокариоцитов.
Сосуды подсчитывали в препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD34 (не менее 10 полей зрения при х400) по методу hot spot (Kvasnicka H., Thiele J., 2002). При наличии очагов роста ММ исследовали в первую очередь эти очаги, остальные поля отбирались случайно.
Результат выражали в количестве сосудов в одном поле зрения.
Кроме того, в 21 наблюдении проведено сравнение количества плазматических (миеломных) клеток, выявляемое в окраске гематоксилином и эозином, азуром и эозином и в препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD138. Подсчет проводили в параллельных срезах при иммерсионном увеличении микроскопа (х900). Результат выражали в процентах по отношению к общему количеству миелокариоцитов. Сосчитывали 500 клеток в каждом препарате и количество миеломных клеток выражали в процентах к общему числу миелокариоцитов.
Антитела и реагенты, использованные при исследовании пролиферации, адгезии, миграции. Меченые фикоэритрином (PE) антитела к цепям интегринов: 4 (CD49d), aL (CD11a), aM (CD11b), aX (CD11c), 1 (CD29), b2 (CD18) и b7 (CD61), а также к активной изоформе CD(HUTS-21), анти-CD54 и анти-CD56, контрольные IgG1 и IgG2 мыши, нейтрализующие антитела - к 4 (CD49d) и 1 (CD29). Меченые флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) антитела к a5 (CD49e), av (CD51), контрольные IgG1 и IgG3 мыши, антитела к серглицину (poly). Для лазерной конфокальной микроскопии использовали меченые FITC антитела к 4 (CD49d) и меченые PE антитела к CD138. Использовали также холерный токсин (В), конъюгированный с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 633. В качестве субстратов адгезии изучали коллаген плаценты человека IV, фибронектин плазмы, ламинин и витронектин, коллаген I, VCAM-1. Для изучения роли синдекана в процессе адгезии использовали гепаритиназу, хондроитиназу АВС и гепарин.
Ингибиторы: ингибитор рецептора HGF c-Met - PHA-665752; Gбелков - коклюшный токсин; Jak2/Stat3 - AG 490, mTOR - рапамицин, PI-3 киназы - вортманнин и LY294002, протеинкиназы С - Ro31-8220 и Bis-1, MAP киназы - PD98059 и U0126, AKT - SH-5 и SH-6, протеасом - бортезомиб и ингибитор NF-B - PS-1145.
Для стимуляции клеток использовали ряд цитокинов/хемокинов:
IL-6, IGF-1, SDF-1, HGF, стимулятор PKC форбол 12-миристат 13ацетат (РМА). В предварительных экспериментах использовали также IL-1, IL10, IL-15, IL-21, BMP-7, EGF, INF- , VEGF, TNF. Все перечисленные вещества разводились до конечной концентрации в среде RPMI-1640 c добавлением L-глутамина (2 mM) и гентамицина (g/mL) (далее в тексте - RPMI).
Клеточные культуры. Большинство экспериментов проводили с использованием линии IL-6-зависимых неадгезивных миеломных клеток человека INA-6. Клетки культивировали в среде RPMI с добавлением IL-6 и телячьей сыворотки (FCS), инактивированной нагреванием.
В части экспериментов в дополнение к INA-6 исследовали клетки еще 7 клеточных линий - четырех IL-6-независимых (RPMI-8226, U266, CAG и JJN-3) и трех IL-6-зависимых (ANBL-6, OH-2 и IH-1).
Миеломные клетки больных. Изучали также миеломные клетки, выделенные из аспиратов костного мозга у больных ММ. Аспираты брались с диагностической целью, остатки материала передавались в лабораторию при информированном согласии пациентов и одобрении регионального этического комитета. Мононуклеарную фракцию получали центрифугированием на градиенте Lymphoprep, миеломные клетки выделяли на колонках Miltenyi Biotech с помощью иммуномагнитных частиц (бус) Macs CD138 Micro Beads. Чистота популяции выделенных миеломных клеток превышала 97%, что было доказано центрифугированием с осаждением клеток на стекло с последующей окраской по Романовскому-Гимзе.
Исследование пролиферации. Пролиферацию оценивали по включению [3Н]-тимидина. Клетки промывали в HBSS и переносили в лунки 96-луночного планшета с плоским дном (2х104 клеток в 200 L RPMI+0,1% BSA на лунку). Инкубировали во влажной среде (37 C, 5% CO2). Через 48 час в каждую лунку добавляли 0,75 Ci метил-[3Н]тимидина. Клетки собирали на фильтре, включение тимидина оценивали по испусканию -частиц.
Исследование адгезии. Планшеты с 96 лунками с округлым дном в течение ночи инкубировали с р-ром фибронектина в PBS (pH 7,2) (20g/mL фибронектина, 80 L р-ра на 1 лунку). Затем в течение 1 час блокировали поверхность лунок BSA (1 mg/mL, 100 L р-ра на 1 лунку) и споласкивали. Отмытые клетки ресуспендировали в 5 mL RPMI+0,1% BSA и инкубировали 1 час при комнатной температуре в р-ре суправитального флуоресцирующего агента BCECF-AM (ацетоксиметилэстер2Т,7Т-бис-(2-карбоксиэтил)-5,6-карбоксифлуоресцеин). В лунки добавляли ингибиторы, цитокины и отмытые клетки в концентрации 5х1на лунку в объеме среды 100 L. Для уточнения роли боковых цепей гепаран-сульфата клетки коинкубировали с гепарином или хлоратом или обрабатывали гепаритиназой или хондроитиназой. После инкубации час во влажной среде (5% СО2, 37 С) неадгезированные клетки удаляли ополаскиванием. Оставшиеся клетки лизировали. Интенсивность адгезии оценивали по разности флуоресценции до и после ополаскивания на планшетном детекторе ( = 458 nm, =538 nm). Адгезия к возб детект остеопонтину исследовалась аналогичным образом.
Исследование миграции. Отмытые клетки INA-6 и ANBL-6 ресуспендировали в RPMI-1640+0.1% BSA+0.1 ng/mL IL-6. Клетки (2x105 в 100 L среды) помещали в верхнюю камеру поликарбонатных двухкамерных планшетов системы Transwell с диаметром пор 5 m. Нижнюю камеру заполняли средой (600 mL). В камеры добавляли цитокины и/или ингибиторы. После инкубации во влажной среде (22-24 час, влажная среда, 5% CO2, 37 С) верхние камеры удаляли. Количество клеток в нижних камерах оценивали с помощью счетчика Coulter Counter Z1.
Проточная цитометрия. Отмытые клетки помещали в планшеты с 24 лунками с плоским дном (2,5х105 клеток в 300 L на лунку) в RPMI+0,1% BSA+0,1 ng/mL IL-6. Клетки стимулировали HGF (100 ng/ mL), IGF-1 (100 ng/mL), SDF-1 (75 ng/mL) или Mn2+ (0,5 mM), инкубировали 25 мин при 37 С. В экспериментах с использованием Mn2+ клетки ресуспендировали в модифицированном буфере Hepes/NaCl, чтобы избежать образования осадка марганца фосфата. После промывания в холодном PBS+0,1% BSA или Hepes/NaCl инкубировали на льду с 5 L РЕ-конъюгированных антител к 4, 1, HUTS-21 или контрольного IgG.
Проточную цитофотометрию проводили на приборе Coulter Epics XLMCL (Beckton) с использованием пакета программ EXPO32 ADC. С помощью проточной цитометрии и APOPTEST-FITC-kit доказано, что используемые концентрации антител и ингибиторов, подавляя специфические функции, не влияют на жизнеспособность клеток.
Иммуноблоттинг. Отмытые клетки ресуспендировали в RPMI (2х106/mL), клетки в объеме среды 1 mL/лунку оставляли без стимуляторов в течение 3 час, затем вносили ингибиторы и через 60 мин - цитокины. После промывания в холодном PBS клетки ресуспендировали в 80 L лизирующего буфера. После инкубации 20 мин на льду ядра осаждали центрифугированием при 12000g, 4 C, 5 мин. Аликвоты 25L смешивали с 8 L 3.6LDS буфера, содержащего100 mM DTT, выдерживали при 98 C в течение 5 мин и затем сепарировали на 10 % Bistris геле NuPAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны толщиной 0.45 M. Мембраны блокировали в 4% BSA в Твине20 на Трис-буфере и затем инкубировали в течение ночи при 4 С с антителами к фосфо-AKT (Ser473), общему AKT, фосфо-митогенактивированной протеин-киназе (MAPK) (p44/42, Thr202/Tyr204) общей MAPK (p44/p42). Сигнал выявляли с помощью антител, конъюгированных с пероксидазой, и хемилюминесцирующего агента ECL.
Иммунофлюоресценция и лазерная конфокальная сканирующая микроскопия (LSM). Планшеты для конфокальной микроскопии инкубировали с фибронектином (4 С) и блокировали BSA (1 mg/mL). Отмытые клетки переносили на планшеты в RPMI + 0,1% BSA в концентрации 2,5х104/150 L. В среду вносили цитокины и/или Mn2+. Инкубировали в течение 40 мин. Неадгезированные клетки удаляли, оставшиеся фиксировали 1% формальдегидом. Наносили антитела к CD138 (PE) и CD49d (FITC), каждое на 20 мин. Конфокальную микроскопию проводили в PBS на приборе LSM 510 (Karl Zeiss, Германия).
Изучение продукции остеопонтина (OPN) миеломными клетками проводили с помощью наборов для ELISA согласно инструкции производителя. Чувствительность метода составила: для OPN человека - ng/mL, для OPN мыши Ц1 ng/mL.
Экспериментальные исследования на животных проводили по методике, предложенной H. Hjort-Hansen и соавт. (1999).
Генерация долгосрочных культур клеток костного мозга. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга 9 больных ММ и 4 здоровых доноров переносили в модифицированную среду Iscove-Dulbecco в соответствии с имеющимися рекомендациями (Gartner S., Kaplan H.S., 1980). Слой прилипающих клеток удаляли трипсинизацией через 5 - недель, РНК выделяли по T.Rasmussen и соавт. (1999).
Выделение РНК, обратная транскрипция и PCR кДНК проводилось для изучения продукции HGF мезенхимальными стволовыми клетками. РНК из клеток линии мезенхимальных стволовых клеток выделяли с помощью RNeasy mini kit. кДНК синтезировали с использованием набора Superscript III для обратной транскрипции (InVitrogen) согласно рекомендациям производителя. В качестве матрицы использовали 2 g РНК. При PCR кДНК использовали праймеры: HGF - прямой (5ctccccatcgccatcccc-3), обратный (5-ggtcggctccggtaccac-3), -актин прямой - (5Т-gatggggtacttcagggt- 3Т) и обратный (5Т-cgtcttcccctccatcgtЦ3Т).
Реакционная среда включала буфер 1X GeneAmp PCR Gold (Applied Biosystems), 1.5 mM MgCl2, 0.4 mM dNTP, 0.6 mM каждого праймера и 1 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold в общем объеме 25 mL. Осуществляли 40 циклов полимеризации. Результаты оценивали с помощью диффузии в 2% агарозном геле (SeaKem). Результаты визуализировали с помощью этидиумбромида и УФ облучения.
Эксперименты с культурами клеток и исследования на животных выполнялись автором в институте молекулярной медицины и онкологии Норвежского университета науки и технологий (NTNU), г. Тронхейм, Норвегия, в соответствии с договором о сотрудничестве между СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова и NTNU. Автор глубоко благодарен руководству института и норвежским коллегам (профессорам M.Brset, A.
Waage, A.Sundan) за предоставленную возможность работы.
Результаты исследования и их обсуждение При морфологическом исследовании была в целом подтверждена связь структурных особенностей миеломных клеток, типа и объема поражения костного мозга с клинической стадией (и, соответственно, прогнозом) болезни (Bartl R., et al., 1982; Bartl R., Frish B., 2002). Так, доля миеломных клеток в костном мозге нарастала от I к III стадии (табл. 2), количество незрелых вариантов миеломных клеток оказалось наибольшим в III стадии болезни (табл. 3).
Таблица 2. Содержание миеломных клеток в костном мозге больных ММ в зависимости от стадии Стадии I II III Содержание МК в ко26 36 47I,II* стном мозге (А+Э), (8-50) (10-66) (22-95) средние (диапазон) *) Примечание: достоверность различий по сравнению с показателями I и II стадии при p<0, Таблица 3. Клеточный состав миеломного клона (%) Стадии I II III Плазмобласты 2 6 14I,II* 23 31 I,II* Проплазмоциты II 19 Проплазмоциты I Плазмоциты 68 51 30 I,II* *) Примечание: достоверность различий по сравнению с показателями I и II стадии при p<0,В первой стадии преобладал интерстициальный тип поражения костного мозга, во II и III стадии преимущественно наблюдали очаговые скопления миеломных клеток, в т.ч. в виде паратрабекулярных пластов, узелков, тотальный вариант составил четверть наблюдений в III стадии и не встретился в I стадии ММ (табл. 4).
Таблица 4. Типы поражения костного мозга при множественной миеломе в зависимости от клинической стадии Стадии I II III всего Интерстициальный 8 12 10 30 (43%) (И) И+паратрабекулярные 1 6 5 12 (17%) пласты И+узелки 1 4 4 9 (13%) Узелковый 1 3 3 7 (10%) Тотальный 0 3 8 11 (16%)* Итого: 11 27 31 *) Примечание: сумма не равна 100% из-за округления.
Была продемонстрирована возможность выделения клеточных типов в соответствии с предложением Goasguen J.E. и соавт. (1999), разработанным для классификации клеток в мазках. Соответственно, прогностическая классификация, релевантность которой доказана в исследовании автором, может быть использована и на материале трепанобиопсий.
Одной из задач исследования было сопоставление полноты выявления миеломных клеток в трепанобиоптате с помощью различных методик. Оказалось, что окраска азуром и эозином позволяет в целом лучше выявлять плазматические\ миеломные клетки в костном мозге. В препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD138, в среднем, выявлялось на 30% больше клеток, чем в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Наибольший прирост получен в наблюдениях с небольшим (до 20%) количеством плазматических клеток в препарате. Это может иметь существенное значение для диагностики, поскольку доля плазматических (миеломных) клеток в миелограмме до настоящего времени используется как один из критериев диагноза ММ. Кроме того, среднее содержание миеломных клеток в костном мозге у большинства больных ММ в I стадии не достигает порогового критерия (см. табл. 2).
В ряде случаев плазмоклеточная дифференцировка опухоли была неочевидной (по крайней мере, в части клеток), что требовало иммуногистохимического исследования, прежде всего с антителами к CD138.
Детальное изучение иммунофенотипа не входило в задачи исследования, результаты выполненных в диагностических целях иммуногистохимических реакций в целом совпали с описанными в литературе. Нам не встретились CD138-негативные наблюдения ММ, в большинстве случаев опухолевые клетки имели фенотип CD79a+, CD20-, IgH (L)+. Встретилось несколько циклин-D1-позитивных наблюдений, в которых опухолевые клетки имели, как правило, лимфоплазмоцитарную структуру.
При дифференциальной диагностике плазмоклеточных новообразований и метастатического процесса (например, метастазов рака в костный мозг), ограничиваться несколькими иммуногистохимическими реакциями не следует. Так, лэкономичная панель, состоящая, к примеру, из антител к CD45RB (LCA), CD138 и ЕМА, способна ввести в заблуждение, поскольку опухолевые плазматические клетки, как правило, утрачивают общий лейкоцитарный антиген, а ЕМА и CD138 постоянно выявляются на клетках эпителия. В таких случаях нужно убедиться в том, что опухолевые клетки являются антителопродуцентами, например с помощью реакций на цепи иммуноглобулинов. Кроме того, использование антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов позволяет доказать клональное происхождение плазматических клеток, что является критерием опухолевого роста.
При диагностических исследованиях трепанобиоптатов в нашей лаборатории всегда применяется окраска азуром и эозином. При плазмоцитозе более 30% фенотипирование проводится только при сомнении в диагнозе. Во всех остальных случаях, т.е когда при обзорном исследовании количество клеток плазмоцитоидного вида не достигает 30%, проводится иммуногистохимическое исследование с антителами к CD138 и легким цепям иммуноглобулинов, а в случае сомнений в гистогенезе - используется широкая панель антител.
Исследование пролиферации миеломных клеток. Неконтролируемая пролиферация - важнейший признак опухолевого роста и, в конечном итоге, основная мишень цитостатической терапии. При иммуногистохимическом исследовании (Ki-67) мы подтвердили относительно невысокую пролиферацию миеломных клеток (van Marion A. et al., 2003), которая, однако, несколько увеличивалась по мере прогрессирования болезни (около 1% в I стадии и 6% в III). Увеличение пролиферативной активности коррелировало с изменением клеточного состава миеломного клона: у больных ММ III стадии количество незрелых клеток было достоверно бльшим, чем в I стадии (см. табл.3).
В опухолевой ткани постоянно обнаруживались реактивные Тлимфоциты. Т-клетки являются важнейшим механизмом противоопухолевого иммунитета, в норме способны ограничивать пролиферацию Вклеток и индуцировать их дифференцировку. В настоящем исследовании не удалось обнаружить достоверных различий содержания Т-клеток на разных стадиях болезни. Имелась лишь тенденция к снижению количества Т-клеток по мере прогрессии. Литературные данные об объеме реактивной популяции Т-лимфоцитов при ММ противоречивы.
Пролиферативная активность клеток плазмобластной миеломы была на порядок выше, чем при других вариантах ММ (40% против 6%), что позволяет считать ее самостоятельным вариантом болезни. В пользу этого свидетельствуют и результаты сопоставления морфологии, генотипа и прогноза. Плазмобластная морфология опухолевых клеток является независимым фактором плохого прогноза (Greipp P.R. et al., 1998).
A.K.Steward и R.Fonseca (2007) показали, что при наличии t(4;14) и t(14;16) - наиболее прогностически неблагоприятных мутаций - миеломные клетки наиболее часто имеют структуру плазмобластов.
Однако бльшая часть миеломных клонов все же не имеет плазмобластной морфологии и, тем не менее, проявляет клиническую агрессивность и резистентность к терапии вопреки очень низкой, даже в III стадии болезни, пролиферативной активности. Сигнал к пролиферации является отчасти результатом генетических перестроек, в результате которых (прямо или косвенно) создаются избыточные концентрации мессенджеров, контролирующих вхождение клетки в цикл, отчасти - результатом избыточной стимуляции цитокинами. Последнее может быть особенно справедливо для ММ, учитывая ее зависимость от микроокружения. Поэтому была поставлена задача изучить пролиферативную активность миеломных клонов под действием цитокинов, а также возможности подавления пролиферации с помощью ингибиторов важнейших внутриклеточных сигнальных каскадов.
Пролиферация была исследована на модели 7 миеломных клеточных линий. Миеломные клеточные линии, свободные от инфекции вирусом Эпштейна-Барр, представляют, по единодушному мнению исследователей, адекватную модель для изучения особенностей клеточной биологии ММ (Pellat Deceunynck C.,1995; Drexler H.G., 2000 и др. ).
Эксперименты проводились с тремя цитокин-зависимыми линиями (INA-6, IH-1, OH-2) и четырьмя цитокин-независимыми (RPMI8226, JJN3, U266, CAG). Исследовалось влияние на пролиферацию ряда цитокинов - IL-6, IL-10, IL-15, IL-21, TNF, IGF-1 и HGF, а также ингибиторов основных звеньев внутриклеточных сигнальных каскадов Jak2/Stat3, mTOR, PI-3K MAPK, NF-B и протеасом. Эксперименты с использованием ингибиторов преследуют две основные цели: изучение механизмов регуляции пролиферации в исследуемой клеточной системе и изучение возможности их применения как средств целенаправленной терапии.
Пролиферацию оценивали по включению меченого тритием тимидина, который добавляли за 18 час до окончания эксперимента к клеткам, культивируемым в присутствии цитокинов и/или ингибиторов.
Используемые цитокины вызывали прогнозируемый эффект, многократно ускоряя пролиферацию клеток цитокин-чувствительных линий.
Каждая клеточная линия характеризовалась индивидуальным спектром чувствительности к цитокинам. В цитокин-зависимых линиях стимулированная пролиферация в целом была весьма чувствительна к действию ингибиторов. Однако некоторые цитокины придавали определенным клеточным линиям известную защищенность от действия ингибиторов. Таким эффектом обладал IL-6 в отношении клеток INA-6, IL-15 в отношении IH-1, TNF в отношении OH-2. Интересно, что ингибирование Jak2/Stat3 при стимуляции трех цитокин-зависимых линий и IL-6, и IGF-1 приводило к отмене эффекта цитокина, хотя известно, что IL-стимулирует сигнальные системы Jak/Stat, PI-3K и MAPK (Hideshima T., 2001), а IGF-1 - только PI-3K и MAPK (Qiang Y.W., 2002). Также ингибирование и PI-3K, и AKT-mTOR подавляло пролиферацию клеток IH-и OH-2, стимулированную IL-6, хотя воздействие IL-6 не приводит к фосфорилированию AKT в этих клетках.
Цитокин-независимая линия JJN-3 оказалась совершенно нечувствительна к подавлению PI-3K и mTOR, наблюдался небольшой эффект подавления MAPK и NFB. В то же время ингибитор Jak2/Stat3 вызывал выраженный эффект, приводя к полному подавлению пролиферации. Такой же эффект наблюдался и в клетках U-266, для которых показана конститутивная активация Stat3 (Quintanilla-Martinez L., 2003 ). Это позволяет предположить, что пролиферация JJN-3 также зависит от конститутивной активации в системе Jak2/Stat3. По крайней мере, имеющиеся сведения о регуляторном профиле этой клеточной линии (наличие аутокринной петли HGF (Brset M. et al., 1996 ) и конститутивная активация NFB (Brset M. et al., 1999) не в состоянии объяснить обнаруженный феномен.
В остальных клеточных линиях подавление активности PI-3K вызывало различное по интенсивности, но в целом - существенное снижение пролиферации клеток, подтверждая важную роль системы PI-3K в модуляции пролиферативных сигналов (Hideshima T. et al., 2001).
Различные клеточные линии оказались неодинаково чувствительны к подавлению активности mTOR (рис.1, а), физиологическая роль которой заключается в стимулировании клеточного роста при достаточности нутриентов (Rohde J. et al., 2001). Пролиферация клеток цитокиннезависимых линий JJN-3 и CAG совершенно не зависела от подавления mTOR, пролиферация RPMI 8226 снижалась почти наполовину, а цитокин-зависимых линий INA-6, IH-1 и OH-2 - на 75%. Столь же выраженное снижение пролиферации наблюдали в клетках U-266. Эта клеточная линия независима от внешних источников цитокинов, но обладает аутокринной петлей IL-6 (Schwab G. et al., 1991). Таким образом, активность mTOR представляется необходимой в первую очередь для пролиферации клеток, испытывающих потребность в стимуляции цитокинами.
Изучались изменения пролиферативной активности при подавлении NFB непосредственно - стабилизацией комплекса NFB и IB (PS1145) или препятствуя утилизации IB в протеасомах (бортезомиб). Эффект PS-1145 (рис. 1, б) был частичным и умеренным. Бортезомиб подавлял пролиферацию изученных цитокин-зависимых и независимых клеточных линий независимо от стимуляции клеток различными цитокинами (рис. 2). Можно предположить, что спектр действия бортезомиба не ограничивается ингибированием NFB. К такому же выводу пришли T. Hideshima и соавт. (2002). Несколько неожиданным оказалось ускорение нестмулированной и стимулированной HGF пролиферации одной из цитокин-зависимых клеточных линий, OH-2, при действии PS1145. Механизм этого явления неясен. Ускорение пролиферации под действием NFB связывают преимущественно со стимуляцией промотора гена циклина D1. Однако в некоторых типах лимфоидных (и других) клеток описано подавление перехода в S-фазу клеточного цикла при активации NFB за счет стабилизации p53 (Sheehy A.M.,1999).
а б INA INA 1IH 1 3IH OH OH 2JJN RPMI 82RPMI 82JJN U 2U 21CAG CAG 0 1 0 0.1 PS-1145, M (lg) Рапамицин, ng/mL (lg) Рис. 1 Изменение нестимулированной пролиферации цитокин-зависимых и цитокин-независимых миеломных линий при действии ингибиторов сигнальных молекул: рапамицина (а) и PS-1145 (б).
Темными значками обозначены цитокин-зависимые, светлыми - цитокиннезависимые клеточные миеломные линии. По оси Х - lg концентрации ингибитора, по оси Y - пролиферация ( %) по отношению к исходной нестимулированной пролиферации, принятой за 100%.
контроль Рис. 2. Изменение пролиферации клеток линии OH-2 под действием бортезомиба без стимуляции и при стимуляции IL-6, IL-10 и TNF По оси Х - lg концентрации ингибитора, по оси Y - пролиферация (включение тимидина, абс. ед.).
Бортезомиб nM (lg) Полученные данные свидетельствуют о том, что все клеточные линии характеризуются различной чувствительностью к ингибиторам сигнальных каскадов. Профиль этой чувствительности индивидуален и не всегда соответствует известным сведениям об организации системы внутриклеточной передачи сигналов.
Изучение механизмов зависимости миеломного клона от микроокружения. Адгезия. Прогрессирование ММ, как и большинства опухолей, сопровождается одновременным ростом стромы, и редукция кровоснабжения является одной из возможностей противоопухолевой терапии. На нашем материале обнаружен трехкратный прирост количества сосудов от I к III стадии. Таким образом, подтверждается целесообразность исВключение тимидина Включение тимидина Включение тимидина пользования при ММ препаратов, подавляющих рост сосудов, например, талидомида и его производных, а также разработки новых препаратов с аналогичным эффектом.
Как уже говорилось, ММ представляет собой пример опухоли, которая, несмотря на злокачественность, сохранила зависимость от микроокружения. Важнейшим механизмом селекции и удержания клонов ММ в костном мозге является взаимодействие опухолевых клеток со стромальными компонентами костного мозга (адгезия). Основными рецепторами адгезии являются интегрины и синдекан-1 (CD138).
Интегрины - это / гетеродимеры. Был изучен интегриновый спектр миеломных клеток с помощью проточной цитометрии с использованием антител к 6 -цепям (4, 5, L, M, V, X) и 3 -цепям (1, 2, 7) 8 миеломных клеточных линий. Среди цепей резко преобладала 4, а среди -цепей - 1. Таким образом, наиболее распространенным интегрином на миеломных клетках является 41-интегрин (VLA-4, CD49d/CD29). При морфологическом исследовании экспрессия CDбыла гетерогенна в пределах биоптатов и не связана со стадией ММ.
Изучение адгезии цитокин-зависимых клеточных линий к коллагену I и IV типа, фибронектину, ламинину, витронектину и VCAM-1 показало, что выраженными адгезивными свойствами обладают клетки двух линий - INA-6 и ANBL-6, а свойствами лигандов - только фибронектин и VCAM-1. Из всех тестированных цитокинов (BMP-7, EGF, IGF-1, TNF, SDF-1, HGF, IL-1, IL10, IL-15, IL-21, INF- и VEGF) выраженной проадгезивной способностью обладали только три - HGF, IGF1 и SDF-1 (рис.3, а). Поэтому дальнейшие эксперименты проводили преимущественно с клетками INA-6 при стимуляции указанными цитокинами и используя в качестве лиганда фибронектин. Способность к цитокин-стимулированной адгезии обнаружена у 7 из 11 изученных клонов миеломных клеток больных (пример на рис.3, б).
А Б а б (-) Рис. 3. Адгезия клеток INA-6 (А) и миеломных клеток больного (Б) к фибронектину без стимуляции и при стимуляции цитокинами ( - p<0,05; -p<0,01) Известно, что адгезия является одним из факторов лекарственной устойчивости миеломных клонов (Damiano J.S. et al., 1999). В наших экспериментах стимулированная HGF и IGF-1 пролиферация клеток при адгезии к фибронектину была приблизительно на 20% выше, чем в контроле (рис. 4). Этот, казалось бы, небольшой прирост темпа размножения может быть важным фактором прогрессии опухоли. Для медленно пролиферирующих опухолей даже небольшое увеличение пролиферации существенно: сохраняясь в течение длительного времени, оно Fn - приводит к существенному увели Fn + чению опухолевой массы.
Способность клеток к адгеHGF, ng/mL зии совершенно не коррелирует с Рис. 4. Увеличение пролиферации уровнем экспрессии интегринов клеток INA-6 при адгезии к фибронектину.
на их поверхности. Без стимуляции максимальное количество 4 выявлено на клетках линии IH-(MFI=196). При стимуляции HGF экспрессия усиливалась приблизительно на треть, но клетки IH-1 слабо прилипали к фибронектину, в т.ч. после стимуляции. В то же время клетки линии INA-6, с умеренной эксАдгезия ( %) Адгезия, отн.ед Включение тимидина прессией 4 (MFI=77), характеризуются слабой нестимулированной адгезией, которая многократно возрастает при стимуляции. Однако при этом экспрессия 4 снижалась на треть. То есть наличие интегринов на поверхности клеток является необходимым, но не достаточным условием для адгезии. По-видимому, имеет значение их состояние и взаимодействие с другими молекулами.
Гетеродимеры интегринов могут иметь несколько конфигураций, которые соответствуют их различной активности (аффинности). Перевести интегрин из низкоаффинной конфигурации в высокоаффинную могут внутриклеточные сигналы, а также дивалентные катионы.
Поскольку костная ткань является одним из важнейших депо марганца в организме, была изучена способность ионов Mn2+ к стимуляции адгезии миеломных клеток. Впервые продемонстрировано усиление адгезии миеломных клеток в присутствии ионов Mn2+ (рис. 5, а). Этот феномен был описан ранее для других типов клеток (Sigurdson S.L. et al., 2003). При резорбции кости локальная концентрация Mn2+ превышает M (Smith J.W. et al., 1994). Активная резорбция кости постоянно встречается при ММ, поэтому можно предположить, что ионы Mn2+ играют определенную роль в адгезии ММ к строме костного мозга.
А Б контроль Mn2+ Mn2+ + IGF- IGF-Mn2+ (M) Рис. 5. Адгезия клеток INA-6 к фибронектину в присутствии ионов марганца в возрастающих концентрациях (А). Состояние интегрина 1 при стимуляции клеток INA-6 цитокинами и ионами Mn (Б).
CD29 (интегрин 1) на клетках INA-6 был активирован при стимуляции ионами марганца, но не после стимуляции цитокинами (25 мин, 37 C). Наличие активированного CD29 определялось с помощью антител HUTS-21.
На графике сигнал высокоаффинного CD29 (связывающего HUTS-21) показан полужирной линией, сигнал меченых PE контрольных антител - тонкой линией..
Адгезия (%) Кинетические параметры адгезии при стимуляции ионами Mn2+ и цитокинами различались. Так, усиление адгезии клеток INA-6 в присутствии ионов Mn2+ наблюдали уже через 6 мин, адгезия достигала максимума на 20Ц30-й минуте эксперимента и затем снижалась. При стимуляции цитокинами усиление адгезии наблюдали только на 10Ц15-й минуте, адгезия нарастала в течение последующего часа наблюдения и сохранялась в течение суток. Для уточнения состояния интегринов при стимуляции ионами Mn2+ и цитокинами мы, как и ряд других исследователей (Lorentz A. et al., 2002), использовали моноклональные антитела HUTS21, которые взаимодействуют только с активированной формой 1 (Luque A. et al., 1996). Показано, что только ионы Mn2+, но не цитокины, вызывают увеличение аффинности интегрина (рис. 5, б). При стимуляции цитокинами не было обнаружено и возрастания экспрессии интегринов.
Таким образом, увеличение адгезии клеток миеломы к фибронектину при стимуляции цитокинами не связано ни с увеличением аффинности интегринов, ни с усилением их экспрессии. Это послужило поводом для более глубокого исследования других молекул клеточной поверхности, участвующих в адгезии, в частности синдекана-1 (CD138).
CD138 - маркер плазматических\миеломных клеток. На нашем материале только в одном случае количество миеломных клеток, выявленное при обзорной окраске, превышало количество CD138+ клеток. В этом наблюдении в костном мозге определялся очаговый внеклеточный осадок реакции на CD138, особенно в участках фиброза, что соответствует феномену сбрасывания синдекана (Bayer-Garner I.B. et. al., 2001).
Внеклеточный синдекан ускоряет рост миеломных клеток in vitro (Yang Y. et al. 2002). Синдеканы - это семейство трансмембранных протеогликанов, содержащих сердцевинный белок и боковые цепи гепарансульфата. Сердцевинный белок связан с элементами цитоскелета, поэтому синдеканы могут участвовать и в процессах адгезии (и миграции) клеток. Сведений о кооперации интегринов и синдеканов в миеломных клетках в литературе нет; на ряде других клеточных моделей (Beauvais D.M., Rapraeger A.C., 2003; McQuade K.J. et al., 2006) получены первые данные, которые позволяют считать такое взаимодействие вероятным.
Для выяснения роли боковых цепей синдекана в процессе адгезии в серии экспериментов отрезали (с помощью гепаритиназы), блокировали синтез (с помощью натрия хлората) или конкурентно тормозили функцию (с помощью гепарина) гепаран-сульфатов (рис. 6, а-г). В результате цитокин-стимулированная адгезия снижалась примерно наполовину. Базальная адгезия, а также адгезия, стимулированная Mn2+, не менялась. Полученные данные позволили предположить, что базальная (нестимулированная) адгезия, а также адгезия, стимулированная ионами Mn2+, мало зависит от синдекана (по крайней мере, от наличия боковых цепей гепаран-сульфата), но при стимуляции цитокинами усиление адгезии требует обязательного участия синдекана-1.
Контроль NaClONaClO3+Na2SOГепаритиназа (0,01 U/mL) Г Б А Г Конт HGF IGF-1 HGF+ Конт HGF Mn2+ FnIGF-1 HGF+ роль IGF-роль IGF-Контроль Контроль Гепарин (20 g/mL) Гепарин (20 g/mL) В Г контроль IGF-1 HGF контроль FnHGF HGF 100ng/mL 130ng/mL до во время адгезии адгезии Рис. 6. Влияние гепаритиназы (А) и хлората натрия (Б), гепарина (В,Г) на адгезию клеток INA-6 к фибронектину при стимуляции HGF и IGF-1 отдельно или вместе, а также Mn2+ (0,5mM). На графике (Г) - результаты исследования адгезии при стимуляции клеток HGF до или во время адгезии.
Адгезия (%) Адгезия (%) Адгезия (%) Адгезия (%) Роль синдекана была уточнена с помощью конфокальной микроскопии. Исследовались клетки линии INA-6 при адгезии к фибронектину. Изучали оптический срез глубиной, в среднем, 0,5 m, нижней границей которого было дно специальной емкости для конфокальной микроскопии, покрытое фибронектином. В покоящихся клетках интегрины 4 локализуются в центре области адгезии в виде пятна, синдекан формирует кольцо по периферии, и в подавляющем большинстве клеток флуоресцентные сигналы этих молекул не смешиваются. При стимуляции цитокинами интегрины смещаются латерально, в большинстве клеток возникает отчетливая колокализация сигналов обеих молекул. Она происходит в активных участках мембраны, богатых холестерином, что доказано при маркировании этих участков холерным токсином В. Аналогичную картину наблюдали в клетках больных ММ. Это свидетельствует о фундаментальном характере описанного взаимодействия.
Интегрины и синдекан исследуются как потенциальные мишени терапии. Имеются сведения о положительном эффекте введения антител к 4-интегрину на мышиной модели ММ (Mori Y. et al., 2004; Olson D.L. et al., 2005); суперантиген-активированные Т-клетки повреждали миеломные клетки в культурах после связывания их с антителами к синдекану-1/CD138 (Ragnarsson L. et al., 2001), а ингибирование цепей гепаран-сульфата ограничивало экспансию миеломного клона у мышей (Yang Y. et al., 2007). Однако интегрины и синдекан-1 присущи не только миеломным клеткам. Таким образом, хотя они могут рассматриваться в качестве мишеней лекарственного воздействия, это воздействие не будет строго целенаправленным. Предлагаемая гипотеза механизма цитокинстимулированной адгезии описывает гораздо более избирательный феномен для миеломных клеток, во всяком случае, сведения о такого рода взаимодействиях в литературе до настоящего времени отсутствуют.
Следовательно, этот механизм может быть одной из возможных мишеней для разработки новых средств лечения ММ.
Исследование роли остеопонтина (OPN) и серглицина (СГ) при множественной миеломе. Был изучен ряд других гликопротеинов и протеогликанов в аспекте их возможного участия в патогенезе ММ. Показано, что миеломные клетки продуцируют OPN, а стромальные клетки больных миеломой экспрессируют более высокие уровни OPN, чем аналогичные клетки здоровых лиц. Клетки миеломных клеточных линий INA-6 и ANBL-6 способны к адгезии к OPN (рис. 7). Этот факт, наряду с усиленной экспрессией OPN клетками стромы, указывает на то, что адгезия к OPN может играть роль в фиксации и лудержании миеломных клеток в костном мозге.
Таким образом, синтез OPN опухолевыми клетками, а также индуцированная ими продукция OPN клетками стромы формируют порочный круг, включающый миеломный клон и его микроокружение.
Рис. 7. Адгезия клеток INA-6 и ANBL-6 к остеопонтину. Мы также принимали участие Условия эксперимента те же, что в фундаментальном исследовании и при использовании фибронектина в качестве лиганда. ( - p<0,01) роли серглицина (СГ) в патогенезе миеломной болезни (Theocharis A. D. et al., 2006). Было показано, что СГ синтезируется и секретируется клетками миеломных клеточных линий.
При проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и иммуногистохимическом исследовании показано, что СГ присутствует на поверхности и в цитоплазме миеломных клеток.
При полуколичественном анализе содержания СГ в аспиратах костного мозга больных ММ в момент диагностики заболевания выяснилось, что содержание СГ повышено примерно у 30% пациентов по сравнению со здоровыми лицами. Не исключено, что содержание СГ может отражать объем поражения костного мозга при ММ. Требует исследования и прогностическое значение этого показателя.
Хорошо известно, что протеогликаны также участвуют в минерализации кости, регулируя кристаллизацию гидроксиаппатита. СГ оказался мощным ингибитором кристаллизации (Theocharis A. D. et al., 2006).
Механизмы формирования внутриклеточных проадгезивных сигналов были изучены при моделировании адгезии в присутствии ингибиторов важнейших сигнальных каскадов. Блокада c-met (рецептора HGF) с помощью низкомолекулярного ингибитора PHA-665752 отменяла только адгезию, индуцированную HGF. Коклюшный токсин блокирует Gбелки, ассоциированные только с рецептором SDF-1 (из изученных цитокинов) и существенно снижал только адгезию, стимулированную SDF1. Таким образом, на уровне рецепторных комплексов сигналы, модулируемые рецепторами HGF, IGF-1 и SDF-1, передаются параллельными, неперекрещивающимися путями.
Известно, что под действием цитокинов HGF, IGF-1 и SDF-1 в миеломных клетках активируются два основных сигнальных каскада - фосфатидилинозитол-3 киназы (PI-3K) и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) (Hideshima T. et al., 2002; Derksen P.W. et al., 2002;
Qiang Y.W. et al., 2002) Активация PI-3K приводит к веерообразному распределению сигнала в клетке, с вовлечением AKT и mTOR. При использовании ингибиторов PI-3K - вортманнина и LY29002 было обнаружено, что цитокин-индуцированная адгезия к фибронектину критически зависит от активности PI-3K (рис. 8). Эти данные в целом согласуются с имеющимися представлениями (Hideshima T. et al., 2002; Tai Y.T.
et al., 2003). С помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к фосфо-Ser473 показано, что адгезия, стимулированная HGF и IGF-1, PI3K-зависимы, а SDF-1-стимулированная адгезия зависит от PI-3K в значительно меньшей степени.
SH-5 и SH-6 - это аналоги фосфатидилинозитола, которые препятствуют фосфорилированию AKT в положении Ser473 и таким образом ингибируют активацию комплекса AKT. В низких концентрациях ингибиторы AKT усиливали адгезию, индуцированную цитокинами HGF и IGF-1. Это можно объяснить торможением отрицательной обратной связи AKTЦPI-3K при снижении фосфорилирования AKT. Таким образом, внутриклеточная передача проадгезивного сигнала от рецепторов изученных цитокинов включает комплекс PI-3K, что приводит к стимуляции AKT, но интенсивность адгезии зависит от PI-3K и не зависит от AKT.
Исследования с ингибитором mTOR рапамицином показали, что адгезия также не зависит от активности mTOR (рис. 8). То есть должны существовать альтернативные пути, связывающие PI-3K и интегрины.
Ранее показано, что SDF-1a активирует NF-B в клетках миеломных клеточных линий (Hideshima T. et al., 2002). T. Landowski и соавт.
(2003) обнаружили, что адгезия клеток к фибронектину изменяет экспрессию ряда генов и ведет к активации NF-B, что, в частности, обеспечивает лекарственную резистентность миеломных клеток. В настоящей работе показано, что NF-kB оказывает влияние и на процесс адгезии. Действительно, стимулированная адгезия снизалась на 50Ц60 % при использовании PS-1145, который блокирует фосфорилирование I-B, и в конечном итоге - активацию NF-kB (Hideshima T. et al., 2002 ).
Блокаторы MAPK 1HGF (150 ng/ml) IGF-1 (100 ng/ml) (PD98059 и U0126) и PKC 1SDF-1alpha (75 ng/ml) (Bis-1 и Ro 31-8220) не оказывали существенного влияния на стимулированную адгезию. Активация 0 PKC (с помощью PMA) неконт ворт LY294 рапа U0126 DMSO роль маннин 002 мицин 15M 0,2% сколько увеличивала ба(1M) (20 M) (100 ng/mL) Рис. 8. Влияние ингибиторов PI-3K (вортман- зальную, но не увеличивала нина и LY294002), ингибитора mTOR (рапамистимулированную адгезию цина) и ингибиторов MAPK (U0126 и PD98059) на адгезию клеток INA-6 к фибронектину, стик фибронектину. Таким обмулированную цитокинами.
относительная адгезия (%) разом, цитокин-стимулированная адгезия зависит от PI-3K и NF-kB и не зависит ни от MAPK, ни от PKC (см.рис.8).
Поскольку HGF, IGF-1, SDF-1a и ряд внутриклеточных сигнальных комплексов оказывают существенное влияние на адгезивные способности клеток ММ, их можно рассматривать как возможные цели для разработки новых терапевтических средств. Настоящее исследование позволило включить HGF в список проадгезивных цитокинов для клеток ММ. HGF-стимулированная адгезия была опосредована почти исключительно VLA-4, поэтому подавление рецептора HGF и VLA-4 может быть полезно по крайней мере у части больных ММ.
Изучение миграции миеломных клеток. Хоминг миеломных клеток в костном мозге предполагает не только адгезию, но и миграцию. Обнаружение проадгезивных свойств HGF поставило вопрос о том, в какой степени HGF может стимулировать миграцию миеломных клеток. Миграцию изучали с помощью планшетов системы Transwell с порами диаметром 5m, что в два с лишним раза меньше диаметра клеток. Стимуляция HGF приводила к усилению миграции клеток INA-6 в 5 раз, а клеток ANBL-6 - в 2 раза. Миграция также усиливалась под действием IGF1 и SDF-1 (рис.9, а). Было обнаружено, что HGF (и другие цитокины) FGFКонт HGF IGF-1 IL-15 VEGF конт HGF IGF-SDF- TNF роль роль 1 - Рис. 9. Миграция клеток INA-6 (А) и клеток больных ММ (Б) под действием важнейших цитокинов. По вертикали: доля клеток в нижней камере от общего количества внесенных клеток (%). ) - p<0,01.
миграция (%) миграция (%) индуцирует миграцию в части образцов миеломных клеток больных (рис.9, б), что позволяет считать обнаруженный феномен компонентом физиологического стереотипа миеломных клонов. Y. Alsayed и соавт.
(2006) продемонстрировали, что SDF-1 является важнейшим регулятором хоминга клеток ММ в костном мозге. В настоящей работе подтверждена роль SDF-1a и установлено, что HGF является столь же мощным хемоаттрактантом для миеломных клеток.
HGF стимулировал миграцию при наличии градиента (рис. 10).
Когда градиент был отрицательным или отсутствовал, усиления миграции не наблюдали. То есть, миеломные клетки способны перемещаться к органам и тканям с высоким содержанием HGF, в частности, к костному мозгу. Таким образом, Рис. 10. Миграция клеток INA-6 под HGF может действием HGF при внесении его быть важным в нижнюю, верхфактором хонюю или обе камеры планшета минга клеток Transwell.
HGF:
верхняя камера - + + ММ в костном нижняя камера - - + + мозге.
Как показано выше, интегрин 41 (VLA-4) наиболее распространен на поверхности клеток ММ. Адгезия, стимулированная HGF, зависит от VLA-4. В экспериментах с нейтрализующими антителами к a4 HGFстимулированная миграция снижалась на 50%. Это свидетельствует о том, что адгезия является составной частью миграции, и что в осуществлении миграции могут участвовать другие молекулы адгезии.
Для уточнения основных путей внутриклеточного сигналинга, играющих роль при миграции, мы использовали ингибиторы PI-3K и нисходящих сигнальных комплексов AKT, mTOR, MAPK, NFB. Выяснилось, что миграция критически зависит от PI-3K. AKT и mTOR не влияют на HGF-стимулированную миграцию (рис. 11).
миграция (%) Контроль Рис. 11. Подавление HGFHGF 150 ng/mL стимулированной миграции клеток INA-6 под действием антител к интегрину 4 и ингибиторов важнейших сигнальных каскадов: ингибиторов PI-3K (вортманнина и LY294002) ингибитора АКТ (SH-5), ингибиторов MAPK (PD98059 и U0126), ингибитора IKK (PS1145), ингибитора mTOR (рапамицина), ингиби (-) анти LY ворт SH-5 PD U0 PS Рапа AG тора Jak2/Stat3 (AG490).
4 294002 маннин 98059 126 1145 мицин 4Кроме PI-3K, определенную роль в осуществлении миграции могут играть MAPK и NF-kB (см. рис.11). Наши данные находятся в соответствии с данными R.L. Klemke и соавт. (1997), показавших, что MAP киназы усиливают активность киназы легкой цепи миозина, что активирует акто-миозиновый комплекс, усиливая тем самым подвижность раковых клеток. Также известно, что NF-kB снижает активность PTEN в клетках рака толстой кишки человека (Kim S. et al., 2004). PTEN представляет собой фосфатазу, удаляющую 3Тфосфат, который добавляется PI-3 киназой, и ингибирование PTEN обычно приводит к увеличению концентрации внутриклеточного фосфатидилинозитолтрифосфата (Nakashima N. et al., 2000). Таким образом, подавление активности NF-kB способно приводить к увеличению активности PTEN, что может быть механизмом подавления миграции в наших экспериментах.
Роль HGF в патогенезе множественной миеломы. Поиск возможных мишеней целенаправленной терапии. Согласно существующим гипотезам, взаимодействие миеломных и стромальных клеток костного мозга приводит к продукции цитокинов, обеспечивающих удержание клеток ММ в костном мозге, их выживание и размножение (Uchiyama H.
et al., 1993; Lokhorst H.M. et al., 1994). Известно, например, что в присутствии клеток стромы клетки ММ (клеточных линий и пациентов) могут утрачивать зависимость от сигнального пути IL-6/gp130/Stat3. В относительная миграция проведенном исследовании подтверждена роль HGF как цитокина, стимулирующего пролиферацию клеток миеломных клеточных линий, и впервые показано, что HGF стимулирует как миграцию, так и адгезию миеломных клеток к фибронектину. Было доказано, что мезенхимальные стволовые клетки секретируют HGF, что может иметь значение в создании градиента HGF, необходимого для миграции миеломных клеток в костный мозг, и приводить к генерации сигналов, необходимых для их выживания и пролиферации.
Единственным известным высокоаффинным рецептором HGF является c-Met - рецептор с тирозин-киназной активностью. Рецептор присутствует как на нормальных плазматических клетках (Tarte K. et al., 2003), так и при миеломе (Brset M. et al., 1996). Но в отличие от плазматических клеток здоровых людей, миеломные клетки часто коэкспрессируют HGF (Zhan F. et al., 2002). Интересно, что ген HGF был единственным геном цитокина среди 70 генов, высоко активированных в миеломных клетках по сравнению с нормальными плазматическими (всего тестировано почти 7000 генов с использованием технологии микрочипов - Zhan F. et al., 2002). В сыворотке крови больных ММ концентрация HGF повышена (Di Raimondo F. et al., 2000). и коррелирует с неблагоприятным прогнозом (Seidel C. et al., 1998, 2002; Iwasaki T. et al., 2002). Концентрация HGF в костном мозге больных ММ в 4 - 6 раз выше, чем в периферической крови (Seidel C., et al., 1998, 2000; Kara I.O. et al., 2006).
Таким образом, HGF может быть одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих выживание и размножение миеломных клеток. Это позволяет рассматривать лиганд и его рецептор как потенциальные объекты целенаправленной терапии.
В настоящем исследовании показано, что в клетках ANBL-6 существует аутокринная петля HGF - c-Met, и ее эффекты могут быть блокированы ингибитором рецептора c-Met PHA-665752 (рис. 12). ПролифераБ А + IL- - IL-PHA-6657DMSO 0 1.3 6.4 32 160 800 40 0 15 44 133 4PHA-665752, nM PHA-665752, nM Г В контроль 0 7 22 67 200 6PHA-665752 0 0 3.1 12.5 50 200 (nM) HGF (150ng/mL) PHA-665752, nM - + + + + + Рис. 12. Ингибитор c-Met PHA-665752 подавляет пролиферацию клеток ANBL-6 (А), клеток пациентов (Б), подавляет адгезию (В) и миграцию (Г) клеток INA-6.
ция миеломных клеток в четырех из пяти образцов костного мозга больных ММ снижалась параллельно увеличению дозы PHA-665752, указывая на универсальность такого механизма ауторегуляции. Ингибитор препятствует миграции и адгезии миеломных клеток (рис.12, в, г). Адгезия является не только способом удержания клеток ММ в костном мозге, но и одним из важнейших механизмов лекарственной устойчивости (Uchiyama H. et al., 1993; Hazlehurst L.A. et al., 2000). Таким образом, ингибитор рецептора c-Met может нарушать миграцию клеток через эндотелиальные барьеры, адгезию их к белкам матрикса и/или клеткам стромы костного мозга и повышать чувствительность к химиотерапевтическим агентам.
HGF может играть роль и в развитии костной деструкции у больных миеломой. Возможным механизмом участия HGF в повреждении кости является прямое стимулирующее действие на остеокласты (Fuller K. et al., 1995) или стимуляция их через индукцию секреции IL-11 ос(-частиц в мин ) (-частиц в мин ) Включение тимидина Миграция ( кол-во клеток ) Включение тимидина Адгезия ( флуоресценция ) теобластами (Hjertner . et al., 1999). В работе показано, что ингибирование c-Met ведет к остановке всех видов стимуляции миеломных клеток HGF, а также к прекращению секреции IL-11 клетками линии остеосаркомы человека.
Таким образом, HGF и его рецептор c-Met играют важную роль в патогенезе миеломной болезни и могут быть мишенями целенаправленной терапии.
Результаты проведенных исследований указывают, что пролиферация, адгезия и миграция миеломных клеток зависит от активности PI3K. Это позволяет считать, что антагонисты (ингибиторы) этого энзима могут рассматриваться как потенциальные терапевтические средства.
Недавно аналогичную гипотезу высказали H. Younes и соавт. (2007).
Значительная часть клонов ММ зависит от сигналов, исходящих от рецепторов SDF-1 и IGF-1. Пролиферация миеломных клеток индивидуально чувствительна к подавлению ключевых сигнальных каскадов. Адгезия и миграция определяются наличием и состоянием интегринов VLA-4 и синдекана-1. Таким образом, спектр потенциальных молекулярных мишеней довольно широк.
Заключение В ходе нашего исследования был проанализирован текущий материал трепанобиопсий пациентов с миеломной болезнью и подозрением на нее. Подтверждена связь структурных особенностей миеломных клеток, типа и объема поражения костного мозга с клинической стадией (и, соответственно, прогнозом) болезни. Показана возможность выделения клеточных типов миеломы по Goasguen, что имеет прогностическое значение. Установлено, что в наблюдениях с небольшим количеством плазматических клеток, наличием клеток с сомнительной дифференцировкой в костном мозге в целях диагностики необходимо иммуногистохимическое выявление CD138. Изучение биологических свойств опухолевых клеток, которые в значительной степени определяют злокачественный фенотип (пролиферация, адгезия, миграция) требует привлечения методов молекулярной и клеточной биологии и экспериментальных исследований.
Экспериментальная часть работы выполнялась на материале клеточных линий и клеток больных миеломной болезнью, выделенных путем сепарирования на колонках с помощью CD138-иммуномагнитных бус. Эти эксперименты позволили установить ряд фундаментальных закономерностей биологии миеломных клеток. Изучена пролиферация миеломных клеточных линий при стимуляции цитокинами и подавление ее ингибиторами сигнальных каскадов. В отношении каждой из изученных линий получен профиль чувствительности. Показано, что миеломные клоны гетерогенны в отношении чувствительности к цитокинам и ингибиторам. Детально изучена адгезия миеломных клеток к фибронектину. Установлено, что адгезия стимулируется ограниченным кругом цитокинов - HGF, IGF-1 и SDF-1. Впервые показана роль ионов марганца для адгезии миеломных клеток к белкам матрикса костного мозга.
Доказано, что адгезия, стимулированная цитокинами и ионами марганца, реализуется через различные механизмы активации интегринов. В присутствии ионов марганца резко возрастает аффинность интегринов, а при стимуляции цитокинами вовлечен более сложный механизм, включающий взаимное сближение (и взаимодействие?) интегринов и синдекана-1 без изменения конформации интегринов. Впервые показано, что HGF является мощным фактором и адгезии, и миграции миеломных клеток, что, наряду с другими его биологическими свойствами, делает рецептор HGF потенциальным объектом направленной терапии. В этом аспекте были проанализированы эффекты низкомолекулярного ингибитора рецептора c-Met и показано, что он специфически подавляет все основные биологические эффекты HGF в миеломных клетках.
Основным препятствием на пути разработки способов целенаправленного воздействия на миеломные клоны является их крайняя гетерогенность. Она была продемонстрирована нами в отношении структуры, пролиферации, адгезии и миграции клеток как на модели миеломных клеточных линий, так и на клетках пациентов. По крайней мере отчасти объяснением этому является гетерогенность генома миеломных клеток - высокая частота различных мутаций, охватывающих разнообразные гены (Bergsagel P.L., Kuel W.M., 2001). В связи с этим совершенно необходимым представляется разработка и введение в практику критериев субклассификации болезни, что позволило бы выделить группы, требующие однотипных терапевтических подходов. До настоящего времени такие попытки делаются только в отношении состояния генов/продуктов генов циклинов. Альтернативой субклассификации является изучение регуляторного профиля миеломного клона у отдельно взятого пациента для уточнения типа регуляции и определения оптимальной мишени перед выбором средств лцеленаправленной терапии.
ВЫВОДЫ 1. Морфологическое и молекулярно-биологическое исследование показало, что генетическая неоднородность множественной миеломы проявляется неоднородностью ее структуры и биологического поведения.
2. Морфологическая диагностика ММ (и родственных поражений) предполагает обязательную комплексную оценку цитологических, гистологических данных и результатов иммунофенотипирования.
В III клинической стадии болезни клеточный состав миеломного клона меняется, с увеличением количества незрелых форм и увеличением темпа пролиферации. Это сопровождается увеличением количества сосудов в ткани костного мозга.
3. Плазмобластный вариант миеломной болезни резко отличается от других вариантов по критериям пролиферации и клеточного состава и должен рассматриваться в качестве самостоятельной формы заболевания.
4. Клетки миеломных клеточных линий и больных ММ пролиферируют медленно и обладают индивидуальным профилем чувствительности к цитокинам и ингибиторам важнейших путей внутриклеточной передачи сигналов. Единственным универсальным ингибитором (из изученных) является бортезомиб. Вероятно, спектр его действия не ограничивается ингибированием протеасом.
5. Пролиферация миеломных клеток ускоряется при адгезии клеток к белкам матрикса (фибронектину). Адгезия является свойством части клеток миеломных линий и клеток пациентов. Важнейшими стимуляторами адгезии выступают цитокины HGF, IGF-1 и SDF-1. Адгезия подавляется при ингибировании системы PI-3-киназы и не зависит от mTOR, а также от MAPK.
6. Адгезия миеломных клеток осуществляется преимущественно за счет интегрина VLA-4. При стимуляции цитокинами для осуществления адгезии необходимо взаимодействие интегрина с синдеканом-(CD138). Указанные молекулы перемещаются в клеточной мембране и колокализуются в ее активных участках, богатых холестерином. Увеличения аффинности интегрина при этом не происходит, таким образом, адгезия осуществляется за счет увеличения авидности интегринов.
7. Ионы марганца способны усиливать адгезию миеломных клеток к фибронектину. Механизмом усиления адгезии является увеличение аффинности - приобретение интегринами лактивной конформации. Этот процесс не требует участия синдекана. Адгезия, стимулированная ионами марганца, может иметь значение для выживания миеломных клеток, прежде всего в зонах резорбции кости.
8. Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует не только пролиферацию, но и адгезию и миграцию миеломных клеток. В клеточных линиях и миеломных клетках пациентов показано существование аутокринного порочного круга, представленного HGF и его рецептором. Показана секреция HGF в культуре мезенхимальных стволовых клеток. Все эффекты HGF подавляются под действием ингибитора рецептора HGF - c-Met.
9. Миеломные клетки способны секретировать серглицин и остеопонтин и стимулировать стромальные клетки к секреции остеопонтина. Эти лиганды участвуют в адгезии миеломных клеток, нарушают обновление кости и таким образом могут способствовать выживанию миеломных клеток в костном мозге и усиливать резорбцию кости.
10. Особенности молекулярной организации клеток миеломных клонов могут быть объектами целенаправленной терапии. Однако применение таких средств должно быть индивидуализировано в соответствии с существованием отдельных форм ММ, различающихся по генетической основе и биологическому поведению.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Байков В.В., Крестинская Т.В., Харланова Е.М. Некоторые принципы морфологической оценки трепанобиопсий при лимфопролиферативных болезнях // Сб. научн. трудов У100 лет кафедре факультетской терапии имени академика Г.Ф. Ланга. Важнейшие достижения и верность традициямФ. - СПб, 2000. - С. 285-287.
2. Holt R.U., Baykov V., R T.B., Brabrand S., Sundan A., Waage A., Brset M. Human myeloma cells adhere to fibronectin and migrate in response to HGF, IGF-1 and SDF-1 // The Hematology Journal. - 2003. - Vol. 4, Suppl.1. - S. 150.
3. Fagerli U.-M., Baykov V., R T.B., Waage A., Sundan A., Brset M. Effects of PS-341 and PS-1145 on cytokine-mediated proliferation and anti-apoptosis in myeloma cells // The Hematology Journal. - 2003. - Vol.
4, Suppl.1. - S. 253.
4.Holt R.U., Baykov V., R T.B., Brabrand S., Sundan A., Waage A., Brset M. Human myeloma cells adhere to fibronectin in response to HGF, IGF-1 and SDF-1 // Proc. of 34th Nordic Hematological Spring Meeting (28-31 May 2003, Reykjavik, Iceland). - Reykjavik, 2003. - P. 33.
5. Fagerli U.-M., Baykov V., R T.B., Waage A., Sundan A., Brset M. Effects of PS-341 and PS-1145 on cytokine-mediated proliferation in myeloma (MM) cells // Proc. of 34th Nordic Hematological Spring Meeting (28-31 May 2003, Reykjavik, Iceland). - Reykjavik, 2003. - P. 17.
6. Байков В.В. Адгезия и миграция миеломных клеток // Тезисы докладов российско-норвежской конференции по гематологии, С.Петербург, 4-7 сентября 2003. - Санкт-Петербург, 2003. - C. 39-41.
7. Standal T., Hjort-Hansen H., Rasmussen T., Dahl I.M., Lenhoff S., Brenne A.-T., Seidel C., Baykov V., Waage A., Brset M., Sundan A., Hjertner . Osteopontin is an adhesive factor for myeloma cells and is found in increased levels in plasma from patients with multiple myeloma // Haematologica. - 2004. ЦVol. 89, №2. - P. 174-182.
8. Hov H., Holt R.U., R T.B., Fagerli U.-M., Hjort-Hansen H., Baykov V., Christensen J.G., Waage A., Brset M., Sundan A. A selective c-met inhibitor blocks an autocrine Hepatocyte growth factor growth loop in ANBL-6 cells and prevents migration and adhesion of myeloma cells // Clinical Cancer Research. - 2004. - Vol. 10, № 19. - P. 6686-6694.
9. Holt R.U., Baykov V., R T.B., Brabrand S., Waage A., Sundan A., Brset M. Human myeloma cells adhere to fibronectin in response to hepatocyte growth factor // Haematologica. - 2005. - Vol. 90, № 4. - P. 479-488.
10. Holt R.U., Baykov V., R T.B., Brabrand S., Waage A., Sundan A., Brset M. Hepatocyte growth factor induces VLA-4-dependent cell adhesion without increasing VLA-4 expression or converting VLA-4 to a high affinity state // Haematologica. - 2005. - Vol. 90, Suppl. 1. - P.173.
11. Baykov V. Plasma cell morphology correlates with proliferation rate in multiple myeloma // Virchows Archiv. - 2005. - Vol. 447, № 2. - P.
258-259.
12. Baykov V.V., Brset M. Heterogeneity of multiple myeloma:
histopathology, genetics, cell behaviour // Proc. Russian-American Conference in Hematology (21-23 June 2006). - St. Petersburg, 2006. - P. 58-59.
13 Brset M., Baykov V. The myeloma cell: malignant, but still dependent on its environment // Proc. Russian-American Conference in Hematology (21-23 June, 2006). - St. Petersburg, 2006. - P. 60-61.
14. Байков В.В. Морфологическая диагностика плазмоцитарной миеломы по трепанобиопсиям (гистологические и иммуногистохимические критерии) // Архив патологии. - 2007. - Т. 69, № 2. - С. 50-52.
15. Theocharis A.D., Seidel C., Brset M., Dobra K., Baykov V., Labropoulou V., Kanakis I., Dalas E., Karamanos N.K., Sundan A., Hjerpe A.
Serglycin constitutively secreted by myeloma plasma cells is a potent inhibitor of bone mineralization in vitro // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281, № 46.
- P. 35116-35128.
16. Байков В.В., Фагерли У.-М., Борсет М., Сундан А. Пролиферация клеток миеломных клеточных линий при действии цитокинов и ингибиторов основных узлов внутриклеточных сигнальных каскадов // Медицинский академический журнал. - 2006. - T. 6, №4. - C. 63-73.
17. Байков В.В., Дарская Е.И. Концепция целенаправленной терапии в гематологии: множественная миелома и хронический миелолейкоз // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. - 2006. - T.
13, №4. - C. 61-65.
18. Байков В.В. Трудности морфологической диагностики множественной миеломы // Онкогематология. - 2007. - №2. - C. 10-15.
19. Baykov V., Slrdahl T., Holt RU., Waage A., Sundan A., Brset M. Cytokine-activated VLA4 adhesion of myeloma cells to fibronectin involves heparan sulfates // Haematologica. - 2007. - Vol. 92, №6, Suppl. 2. - P.116.
20. Slrdahl T.S., Holt R.U., Baykov V., Waage A., Sundan A., Brset M. Manganese induces myeloma cell adhesion to fibronectin // Haematologica. - 2007. - Vol. 92, № 6, Suppl. 2. - P.116.
21. Holt R.U., Fagerli U.M., R T.B., Baykov V., Waage A., Sundan A., Brset M. HGF promotes migration of myeloma cells // Haematologica.
- 2007. ЦVol 92, № 6, Suppl. 2. - P.124.
22. Baykov V., Slrdahl T., Holt R.U., Waage A., Sundan A., Brset M. Syndecan-1 and VLA-4 integrin molecules may co-operate in myeloma cells upon stimulation // Virchows Archiv. - 2007. - Vol. 451, № 2. - P. 566.
23. Рыбакова М.Г., Байков В.В.. Морфологические и молекулярно-биологические аспекты диагностики множественной миеломы: современное состояние и перспективы // Омский научный вестник. - 2007. - №3 (61), прил.1 (материалы III пленума Президиума Российского общества патологоанатомов). - С. 40-46.