Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Силкин Павел Павлович
МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГОДИЧНЫХ КОЛЕ - В ДЕНДРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
03.00.02 - биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Красноярск-2009
Работа выполнена в ФГОУ ВПО Сибирский Федеральный Университет
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Евгений Александрович Ваганов
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Рэм Григорьевич Хлебопрос доктор биологических наук, профессор Алексей Дмитриевич Груздев доктор биологических наук, профессор Игорь Николаевич Павлов
Ведущая организация: Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
Защита состоится 6 октября 2009 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН Автореферат разослан л 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.А. Франк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В течение жизни древесного растения реализуются различные сочетания физических факторов окружающей среды, которые находят свой отпечаток в строении годичных колец. Годичные кольца сохраняют свою структуру и химический состав на протяжении всей жизни дерева, а также в течение долгого времени после его гибели. Всё это делает древесные растения уникальным объектом исследования процессов взаимодействия в системе живой организм - окружающая среда, предоставляя исследователю богатый статистический материал проведённых самой природой тысячелетних экспериментов в масштабах всей планеты.
Извлечение полезной информации, содержащейся в структуре годичных колец, невозможно без понимания механизмов её записи. В связи с этим, актуальным является изучение закономерностей формирования годичных колец древесных растений на клеточном, тканевом и организменном уровнях, что является основной целью данной диссертационной работы. Важным моментом в работе было создание и использование методов многопараметрического анализа структуры годичных колец на клеточном уровне, т.к. минимальным элементом годичного кольца, в рамках которого набор физических параметров обретает биологический смысл, является клетка. В качестве набора физических параметров выступают гистометрические, денситометрические характеристики структуры годичных колец и элементный состав клеточных стенок.
В силу того, что годичные кольца являются интеграторами влияния различных факторов среды обитания, актуальным является поиск независимых друг от друга параметров структуры годичных колец, отражающих различные физиологические процессы, идущие в дереве и, как следствие, отражающие влияние различных факторов внешней среды. Также актуальным является создание алгоритмов, методов и программного обеспечения, позволяющих осуществлять измерение и обработку больших массивов многопараметрических данных в приемлемые сроки, т.к., с одной стороны, необходимые методы отсутствуют или нуждаются в доработке, а с другой - применение существующего универсального программного обеспечения приводит к большим временным затратам. В случае изучения элементного состава клеточных стенок, то программное обеспечение по их обработке и построения на их основе хронологий просто отсутствует.
Основная цель работы - изучение закономерностей формирования годичных колец древесных растений на клеточном, тканевом и организменном уровнях, в ходе достижения которой решались следующие задачи:
1) Разработка методов, алгоритмов и программного обеспечения для рентгенографического и гистометрического анализа годичных колец хвойных, а также их элементного состава, позволяющих с высокой эффективностью проводить измерение и обработку денситометрических, гистометрических и элементных данных.
2) Разработка метода измерения рентгенографической массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных.
3) Измерение массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных с помощью созданных методов, анализ связи рентгенографической плотности клеточной стенки с её толщиной.
4) Исследования влияния элементного состава клеточных стенок трахеид хвойных на их рентгенографические параметры в разных зонах годичного кольца.
5) Исследования связи концентраций элементов между собой и с параметрами клеточной структуры годичного кольца в различных условиях произрастания деревьев.
6) Анализ перспектив использования рентгенографической массы, плотности и элементного состава клеточных стенок трахеид хвойных в задачах дендрохронологии, дендроэкологии и дендроклиматологии.
Научная новизна. С помощью разработанных методов и программного обеспечения проведены измерения и многопараметрический анализ гистометрических, денситометрических характеристик клеточной структуры и данных элементного состава клеточных стенок годичных колец древесных растений четырёх видов хвойных из родов Picea, Abies, Pinus, Larix, произрастающих в различных климатических условиях. Экспериментально доказана и теоретически обоснована изменчивость рентгенографической плотности клеточной стенки в пределах годичного кольца, её связь с толщиной клеточной стенки и её элементным составом, а так же высокие рентгенографические плотности клеточных стенок в ранней древесине годичных колец лиственницы, сосны и ели. Впервые показано существование связи концентраций элементов в клеточных стенках, как между собой, так и со структурными параметрами годичных колец, наиболее явно выраженные для кальция, стронция и величины их отношения (Sr/Ca). Обнаруженные виды связей между гистометрическими, рентгенографическими данными и данными элементного состава наблюдаются для всех исследованных образцов древесных растений, что позволило сделать вывод об их универсальном характере и независимости от вида древесного растения и места его произрастания.
Предложены новые характеристики структуры годичных колец на основе гистометрических, рентгенографических данных и данных элементного состава для их применения в задачах дендрохронологии, дендроклиматологии и дендроэкологии.
Практическое значение. Разработанные методы, алгоритмы и программное обеспечение позволяют проводить с высокой эффективностью измерение и обработку денситометрических и гистометрических показателей структуры годичных колец хвойных, а так же их элементного состава, что позволяет получать и использовать новые параметры годичных колец в задачах дендроклиматологии и дендроэкологии. Также возможно применение разработанных методов и новых клеточных характеристик в исследованиях закономерностей контроля дифференциации ксилемы годичных колец хвойных, процессов формирования клеточных стенок и биосинтеза их полимеров, имитационного моделирования роста годичных колец, динамики накопления биомассы клеточными стенками трахеид, формирования их элементного состава, химического загрязнения окружающей среды и его влияния на жизнедеятельность древесных растений, а так же многих других научных направлений, связанных с индикацией изменения внешней среды и изучающих фундаментальные закономерности роста и развития древесных растений.
Положения, выносимые на защиту.
1. Методы, алгоритмы и программное обеспечение для многопараметрического анализа структуры годичных колец древесных растений.
2. Экспериментально доказана и теоретически обоснована изменчивость рентгенографической плотности клеточной стенки в пределах годичного кольца, её связь с толщиной и элементным составом клеточной стенки, и высокая рентгенографическая плотность клеточной стенки в ранней древесине годичных колец хвойных.
3. Существует связь между концентрациями отдельных элементов и их связь со структурными параметрами годичных колец, независимые от вида и места произрастания древесного растения.
4. Новые характеристики структуры годичных колец на основе гистометрических, рентгенографических и элементных данных для их применения в задачах дендрохронологии, дендроклиматологии и дендроэкологии.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на семинарах дендроклиматологии и истории лесов, конференции молодых учёных Института леса им. В.Н. Сукачёва СО РАН (2002), III Международном симпозиуме Строение, свойства и качество древесины - 2000 (Петрозаводск), Всероссийском Совещании Реакция растений на глобальные и региональные изменения природной среды (Иркутск, 2000), Всероссийском совещании Дендрохронология: достижения и перспективы (Красноярск, 2003), III и IV Конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву (Новосибирск 2003, 2004), Международной конференции Future of Dendrochronology. Tree Rings and People (Davos, Switzerland, 2001), Всероссийской научной конференции с международным участием Новые методы в дендроэкологии (Иркутск, 2007), Всероссийской конференции, посвящённой 50-летию Сибирского отделения РАН Дендроэкология и лесоведение (Красноярск, 2007), Байкальской Всероссийской конференции Информационные и математические технологии в науке и управлении (Иркутск, 2008), Международном симпозиуме Растительные волокна: взгляд фундаментальной биологии (Казань, 2009), Международной научной конференции Проблемы современной дендрологии (посвященная 100-летию со дня рождения член-корреспондента АН СССР П.И. Лапина) (Москва, 2009).
Разработанные в рамках данной работы методы и программное обеспечение используются в лабораториях ИЛ СО РАН, ИФБиБТ СФУ, НО - Енисей СФУ, Лаборатории функционирования лесных экосистем ИФБиБТ СФУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ (12 статей в рецензируемых журналах).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и основных выводов, списка литературы, приложения. Общий объем составляет 506 страниц, из них приложение занимает 175 страниц.
Список литературы включает 171 наименование, в том числе 95 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Показатели структуры годичных колец древесных растений и их использование в дендроэкологии.
В главе дан обзор физических факторов внешней среды, которые оказывают влияние на рост и формирование годичных колец деревьев. Все внешние факторы разделены на две группы. В первую группу включены те физические факторы, которые, как правило, связаны с катастрофическими событиями разного масштаба, происходящими вокруг дерева и непосредственно влияющие на ксилему годичных колец. К ней можно отнести температурное воздействие, вызванное пожарами (Арбатская, 1997), прямое механическое воздействие, вызванное оползнями, камнепадами и проч.
(Schweingruber, 1996), радиационное воздействие в результате аварий на объектах атомной промышленности (Козубов, 1994; Мусаев, 1993, 1996).
Вторую группу физических факторов объединяет их косвенное, опосредованное влияние на формирование годичных колец деревьев через физиологические процессы в нём, интенсивность которых определяется степенью воздействия этих факторов. К ней можно отнести целый комплекс постоянно и переменно действующих факторов в течение вегетационного периода, влияющих на фотосинтетические процессы, баланс гормонов роста, ассимилятов и других питательных веществ, которые определяют динамику ростовых процессов дерева и формирование его органов и структуры годичных колец (Philipson, 1971; Kozlowski, 1997; Savidge, 1996). В первую очередь, это физико-географические факторы места произрастания древесных растений (рельеф, высота над уровнем моря, режим инсоляции), почвенные факторы (содержание минеральных веществ, состав, температурный и гидрологический режим почвы) и погодные факторы (температурный режим воздуха и внутрисезонное распределение влаги) (Антанайтис, 1981; Битвинскас, 1974;
Ваганов, 1985, 2000; Ефремов, 1987; Лобжанидзе, 1961; Ловелиус, 1979;
Поздняков 1986; Рассел, 1955; Шиятов, 1986; Fritts, 1976; Larson, 1994;
Schweingruber, 1988,1996; Spieker 1987, 1991; Schulze, 1995; Tranquillini, 1979).
Рассмотрены основные измеряемые параметры годичных колец деревьев и их индикационные возможности по отношению к физическим факторам внешней среды. Изменение строения годичных колец хвойных под внешним воздействием позволяет использовать годичные кольца деревьев в качестве косвенных индикаторов изменения климата и условий среды в природных экосистемах на длительных временных интервалах. Развитие новых физических методов и аппаратуры даёт возможность использовать в этом качестве не только ширину годичного кольца, но и его гистометрические параметры, позволяющие получать более полную информацию об изменениях условий роста в течение вегетационного периода (Ваганов, 1985, 1996, 1990, 1992, 1996, 2000; Высоцкая, 1985; Schweingruber, 1993; Vysotskaya, 1989; Wilpert, 1990, 1991). Кроме гистометрических параметров годичных колец широкое применение на практике получил рентгенографический метод, в основе которого лежит денситометрия с использованием негативных изображений образцов древесины, полученных в рентгеновском диапазоне длин волн, на рентгеновских плёнках (Polge, 1966; Schweingruber, 1988). В результате применения методов рентгеновской денситометрии было показано, что изменение плотности древесины внутри годичных колец часто является лучшим индикатором условий среды, чем ширина годичного кольца (Polge, Keller, 1969; Polge, 1978; Schweingruber, 1979, 1980; Rothlisberger, 1980).
Интересная область открывается в исследовании влияния факторов внешней среды на рост древесных растений в связи с погодичной динамикой изменения концентрации химических элементов в годичных кольцах.
Современные физические методы позволяют с помощью характеристического излучения атомов древесных колец получать профили концентрации элементов в годичных кольцах с точностью в десятки и сотни микрон (Золотарёв, 2004).
Показано наличие связи между динамикой изменения содержания хлора в древесине и среднегодового уровня осадков в месте произрастания деревьев (Goldberg, 2007). Серия работ российских исследователей посвящена оценке возможности использования элементного состава годичных колец хвойных для индикации загрязнения окружающей среды, тепловым режимом вегетационного периода и его влагообеспеченностью (Адаменко, 1985;
Адаменко, 1982, 1985; Четвериков, 1982, 1983, 1986; Хантемиров, 1991, 1996;
Hantemirov, 1992). Показано, например, что наблюдается хорошая согласованность кривых элементного состава с ходом интегральной суммы температур воздуха. Исследование химического состава годичных колец сосны обыкновенной в зоне промышленного загрязнения выявило влияние на распределение элементов как протекания физиологических процессов в древесном растении, так и уровня загрязнения среды в год формирования данного годичного кольца. Предложен метод стандартизации данных о содержании меди в годичных кольцах сосны обыкновенной, который позволяет исключить влияние подвижных форм элемента и индивидуальных различий деревьев. Существует большой объём работ, посвящённый связи элементного состава годичных колец деревьев с уровнем загрязнения окружающей среды, авторы которых исходят из предположения, что химический состав годичных колец отражает только изменение состояния окружающей среды. Так, проводились исследования химического состава годичных колец вблизи меде- и цинкоплавильных заводов (Аржанова, 1987; Arp, 1988; Guyette, 1987;
Robitaille, 1981; Symeonides, 1979), исследовались связи элементного состава годичных колец с загрязнением окружающей среды автомобильным транспортом вблизи дорог (Baes, 1981; Karandinos, 1985; Kardell, 1978; Rolfe, 1974; Ward, 1974; Wickern, 1983), изучался химический состав годичных колец вдали от источников загрязнения (Baes, 1984; Berish, 1985; Bondietti, 1989; Hall, 1986; Meisch, 1986). Вместе с тем, практически отсутствуют работы, в которых бы изучался вопрос связи параметров клеточной структуры годичных колец с их элементным составом. Кроме того, до сих пор существуют две противоположные точки зрения на возможность использования элементного состава годичных колец в решении задач биоиндикации.
Среди основных нерешённых вопросов рентгеновской денситометрии можно выделить влияние химического состава древесины на результат денситометрических измерений. Рентгенографические методы измерения плотности древесины основаны на взаимодействии рентгеновских фотонов с атомами вещества клеточных стенок годичных колец, поэтому их химический состав должен оказывать влияние на результаты денситометрических измерений. Существуют отдельные работы, в которых указывается на это влияние в пределах 2% (Fletcher, 1970; Pernestal, 1991; Kouris, 1981). Также в рентгеновской денситометрии применяется единый корректирующий коэффициент для данной породы дерева, несмотря на то, что существует различие в концентрации химических элементов не только между деревьями, но и в одном образце (Jonsson, 1990), что может привести к погрешности денситометрических результатов. Далее, вариации плотности древесины обычно объясняются вариацией гистометрических параметров годичного кольца, подразумевая при этом, что плотность клеточной стенки является величиной постоянной. Это не совсем корректно, т.к. говоря о плотности древесины, обычно подразумевают плотность, измеренную методами рентгеновской денситометрии, т.е. плотность рентгенографическую, которая, в отличие от гравиметрической, должна зависеть от химического состава годичных колец. Проведённые автором предварительные оценки рентгенографической плотности клеточных стенок в годичных кольцах лиственницы и сосны на небольшом статистическом материале показали, что рентгенографическая плотность клеточных стенок имеет нелинейную отрицательную связь с толщиной клеточной стенки и достигает величин в ранней древесине, сравнимых с плотностью лёгких металлов (Silkin, 2001), несмотря на то, что плотности химических компонентов, слагающих клеточную стенку, незначительно варьируют в пределах породы (Stamm, 1966; Kellogg, 1969). Анализ полученных результатов показал, что невозможно правильно восстановить профиль рентгенографической плотности годичного кольца по результатам гистометрических измерений, считая плотность клеточных стенок одинаковой во всех зонах годичного кольца. На несоответствие между измеренной плотностью годичного кольца в поздней древесине и её рассчитанным значением по гистометрическим данным обратили внимание и другие исследователи (Park, 1993), отнёсшие этот эффект на счёт погрешности измерения и нерегулярностей строения древесины.
С плотностью клеточной стенки тесно связан вопрос об измерении массы клеточных стенок. Некоторые исследователи считают, что масса клеточных стенок или их объём биологически более адекватно отражают изменения условий роста (Антонова, 1986, 1990; Park, 1990; Jagels, 1990; Antonova, 1997).
Проведённые косвенные измерения массы клеточных стенок годичных колец лиственницы с использованием денситометрических данных и радиальных размеров клеток и дальнейший дендроклиматический анализ полученных величин показал, что масса клеточных стенок трахеид лиственницы может быть перспективным показателем для использования в задачах дендроклиматологии и дендроэкологии (Силкин, 1999, 2000; Silkin, 2003). Массу клеточных стенок можно рассчитать, используя гистометрические показатели клетки и плотность клеточной стенки. Вместе с тем остаётся открытым вопрос, какую именно плотность клеточной стенки следует использовать при косвенном измерении массы клеточных стенок, т.к. её величина, измеренная разными способами, варьирует в широких пределах от 1000 мг/см3 до 2000 мг/см3 и более (Антонова, 1990; Haygreen, 1989; Silkin, 2001), а в последнем случае она ещё и связана с толщиной клеточной стенки.
Глава 2. Основные методы и приборы для измерения структуры годичных колец.
В качестве измерителя плотности годичных колец использован денситометр DENDRO-2003 производства швейцарской фирмы Walesсh Electronic (рис. 1).
ампа Рис.1. Денситометр DENDRO-2003 и его оптическая схема.
Для измерения плотностных характеристик годичных колец с высоким разрешением используют явление поглощения рентгеновского излучения веществом. Интенсивность рентгеновского излучения, проходящего через вещество, зависит от плотности этого вещества, и пройденного в нём пути.
Общая схема измерений сводится к получению изображения на фотопластинке (фотопленке) образцов древесины в рентгеновском диапазоне длин волн с последующим измерением интенсивности проходящего света через выбранный участок изображения годичного кольца и дальнейшим пересчетом уровня светового потока в реальную плотность. Свет (1) от стабилизированного источника (рис.1) проходит через рентгеновскую фотоплёнку (2) и через систему линз и зеркал (3) попадает на матовый экран (4), имеющий возможность вращения, в центре которого находится фотосенсор (5).
Компьютер, сопряжённый с денситометром, по измеренному уровню светового потока, падающего на фотосенсор, производит вычисление плотности. Шаг сканирования фотоплёнки составляет 3 мкм, ширина фотосенсора - 10 мкм. В работе обычно используется пятидесятикратное увеличение.
Приведено описание основных этапов, связанных с приготовлением образцов для денситометрии и получения их изображения в рентгеновском диапазоне длин волн. Это удаление смол и других экстрактивных веществ из образцов, сильно поглощающих рентгеновское излучение, приготовление образцов в виде плоскопараллельных, тонких (1,14 мм.) пластинок с дальнейшим их экспонированием в рентгеновских лучах с энергией квантов 810 кэв перед рентгеновской фотоплёнкой. В результате, после проявки фотоплёнки получается негативное изображение годичных колец (рис.2).
Y (xpi,ypi) a i сред (x0,y0) (xi,yi) Путь фотосенсора X Рис.2. Участок рентгеновской Рис.3. Проекция точек пути фотоплёнки с изображением фотосенсора на радиальное образцов и калибровочного направление в годичном кольце.
клина.
Стандартное программное обеспечение DENDRO-2003 представляет результаты денситометрических измерений в виде пиковых и средних значений профиля плотности годичных колец, а также данные профиля плотности вдоль пути движения фотосенсора, который может иметь криволинейный вид. Между тем, необходимо иметь данные профиля плотности годичных колец вдоль радиального направления в дереве (перпендикулярное к границе годичных колец). С этой целью были выведены формулы (1) и (2) для расчёта координат точек проекции (xip ; yip ) пути движения фотосенсора на радиальное направление по измеренным координатам (xi; yi ) точек пути (рис. 3):
xip = xi cos2 (сред ) + x0 sin (сред ) + (yi - y0 )sin(сред ) cos(сред ), (1) yip = y0 cos2 (сред ) + yi sin (сред ) + (xi - x0 )sin(сред ) cos(сред ), (2) где сред - средний угол поворота нормали фотосенсора в пределах годичного кольца (радианы), (x0; y0 ) - координаты первой точки годичного кольца.
Значение плотности точки (xi ; yi ) присваивается точке (xip ; yip ).
Алгоритм коррекции профиля плотности реализован в виде компьютерной программы Dendro2003 автором данной работы.
Для измерения гистометрических параметров годичных колец использовался микроскоп Axioskop 20 (Карл Цейс), оснащённый видеокамерой.
Видеосигнал, сформированный видеокамерой, поступает на вход специализированной видеокарты, где оцифровывается и передаётся на шину данных компьютера (рис.4). В работе использовался объектив Plan-NEOFLUAR x40. Размер точки изображения составляет 0,26х0,27 мкм.
Измерения геометрических размеров трахеид осуществлялись для тех же годичных колец, для которых проводились измерения плотности.
Микротомные препараты (срезы толщиной 25-30 мкм) приготавливались по стандартной методике, окрашивались сафранином или метиленовым синим и затем заключались в глицерин между предметными и покровными стеклами.
Стандартное программное обеспечение измерительного комплекса (KS300) использовалось только для получения изображений отдельных участков годичного кольца.
Видеосигнал Видеокамера Микроскоп Системный блок Монитор компьютера Рис.4. Структурная схема комплекса получения и обработки изображений микроскопических объектов (Image-System).
Разработанная автором программа SuperMoment в D автоматическом режиме за доли секунды совмещает их в единое WW изображение годичного кольца и сохраняет на жёстком диске в T виде стандартного графического L файла (*.jpeg или *.bmp).
Для проведения измерений гистометрических параметров W годичных колец была разработана специализированная программа Lineyka, имеющая ручной и полуавтоматический режим Рис.5. Измеряемые измерения. В полуавтоматическом гистометрические параметры.
режиме измерения оператор задаёт траекторию сканирования изображения и уровень яркости, определяющий принадлежность точки изображения к люмену или клеточной стенке. Далее программа без участия оператора рассчитывает размеры люмена и толщину двойной клеточной стенки, выделяя их цветными линиями на изображении клетки, что позволяет оператору проводить контроль. Измеряемые гистометрические параметры показаны на рис.5. Это радиальный размер клетки D и люмена L, тангентальный размер клетки T, толщина одинарной W и двойной WW клеточной стенки. В целом, разработка специализированного программного обеспечения позволило резко сократить время создания изображений годичных колец и измерение их клеточной структуры, чего нельзя было бы достичь, используя стандартное программное обеспечение.
Проводились оценки необходимого числа измерений рядов клеток для получения статистически обеспеченных средних гистометрических параметров.
Показано, что достаточно провести измерение клеточных параметров для числа рядов не менее пяти в каждом годичном кольце, а в случае тангентального размера необходимо измерить этот параметр у 100-120 рядов один раз для всего образца.
Исследование элементного состава годичных колец проводилось на станции рентгено-флуоресцентного анализа РФА-СИ (СИ - синхротронное излучение) Института ядерной физики им. Г.И. Будкера СО РАН. В качестве источника синхротронного излучения применяется ускоритель элементарных частиц ВЭПП-3.
На рисунке 6А дана принципиальная схема станции. Пучок синхротронного излучения от ускорителя поступает на кристаллмонохроматор, где из него вырезается монохроматичный пучок рентгеновского излучения, который будет возбуждать характеристическое излучение атомов исследуемого образца древесины. Энергия квантов пучка устанавливается заведомо выше, чем максимальная энергия излучения исследуемых элементов.
Далее, пучок через систему коллиматоров попадает на щель, где из него формируется узкий пучок излучения. Ширина пучка в данной работе устанавливалась равной 200 мкм. Полученный таким образом пучок попадает на образец древесины, возбуждая характеристическое излучение элементов.
Характеристическое излучение элементов улавливается полупроводниковым энергодисперсионным детектором (Oxford Instrument), охлаждаемым жидким азотом для уменьшения собственных шумов и увеличения чувствительности.
В качестве держателя образцов выступает вытянутая прямоугольная дюралюминиевая рамка (рис. 6Б), имеющая периодически расположенные отверстия вдоль края длинных сторон и позволяющая закрепить образец с максимальными размерами 2х20 см. Держатель образцов ориентируется вертикально и может перемещаться в этом направлении с помощью механической системы. Шаг сканирования задаётся программно и, как правило, равен ширине пучка.
Держатель образцов Щель А Образец Детектор Пучок Кристалл- монохроматор Б В Образец древесины Годичное Держатель образца кольцо Направление перемещения Поперечное образца сечение пучка возбуждающего Пучок СИ рентгеновского после щели излучения Ширина пучка Рис.6. Принципиальная схема модуля измерения элементного состава станции РФА-СИ. А - вид сверху. Б - пучок СИ и образец древесины. В - одновременное возбуждение флуоресценции от нескольких годичных колец.
На установке РФА-СИ щель установлена жёстко и положение её в процессе сканирования образца не изменяется, что при наличии кривизны границы годичных колец может привести к одновременному возбуждению флуоресцентного излучения от разных зон кольца или от нескольких колец.
(рис. 6В). В связи с этим, следует отбирать образцы для проведения исследований методом РФА так, чтобы границы годичных колец по возможности были параллельны щели.
Подготовка образцов древесины для элементного анализа сводится к получению прямоугольных кусочков равной толщины с помощью двухдисковой пилы, которую применяют при подготовке образцов для денситометрических измерений.
Результатом сканирования и предварительной обработки флуоресцентных сигналов является набор параметров, включающих в себя расстояние точки сканирования от начала образца в сантиметрах, интенсивности сигналов для каждого исследованного элемента в этой точке, а так же интенсивность когерентного и некогерентного излучения. Калибровка измеренных интенсивностей флуоресценции проводилась по методу фундаментальных параметров (Афонин, 1991; Ревенко, 1994) специалистом станции РФА-СИ А.Д.Шапоренко.
Глава 3. Измерение массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных.
Корректность процедур обработки клеточных параметров определяет точность метода измерения массы и плотности клеточных стенок. К настоящему времени наиболее проработанной является только процедура стандартизации клеточных размеров (Ваганов и др. 1985; Ваганов и др. 1996).
Для ускорения процедуры измерения клеточных параметров и повышения точности обычно измеряется толщина двойной клеточной стенки. Далее толщина одинарной клеточной стенки вычисляется по формуле W = (W12 + W23 ), где W12 и W23 - толщина двойной клеточной стенки одной клетки с левой и правой стороны люмена. Данный подход приводит к большим погрешностям W в переходной зоне и на границах годичного кольца. Особенно сильно этот эффект наблюдается в годичных кольцах лиственницы.
Теоретический анализ данных прямых измерений толщины одинарной и двойной клеточной стенки одних и тех же клеток позволил создать алгоритм расчета W, согласно которому, для диапазона толщины двойной клеточной Wстенки, удовлетворяющего неравенству > 1,5, следует использовать W(W12 + W23 ) выражение W =, а в остальных случаях - выражение W23 0,4 + 1 W12 W = (W12 + W23 ).
Другая проблема связана с сопоставлением параметров годичных колец образцов, находящихся в разных физических средах. Так, денситометрические измерения проводятся для образцов, находящихся в воздушно-сухом состоянии, а гистометрические измерения проводятся для срезов, заключённых в глицериновую среду, что делает невозможным совместное использование этих данных. В работе проводились гистометрические измерения одних и тех же срезов, находящихся в глицериновой среде и в воздушно-сухом состоянии.
Анализ результатов измерений показал наличие хорошо выраженной положительной линейной связи между ними. Полученные в результате проведённого регрессионного анализа коэффициенты линейных уравнений можно использовать при пересчёте клеточных размеров образцов, находящихся в глицериновой среде к клеточным размерам воздушно-сухого состояния.
Как правило, измерение площади клетки и клеточной стенки проводят косвенным путём, напрямую измеряя линейные клеточные размеры и в дальнейшем рассчитывая площади по известным формулам. При этом полагается, что форма поперечного сечения клеток является прямоугольной.
Для оценки вносимой погрешности прямоугольной моделью поперечного сечения клетки в косвенное измерение площадей проводились прямые измерения (объектив х100, иммерсия) клеточных линейных размеров клеток (D,T,W), площади поперечного сечения клетки SC и клеточной стенки SW, а также периметра клетки P. По линейным клеточным размерам были вычислены площади поперечного сечения клетки Sc _ calc = DT и клеточной стенки Sw _ calc = 2W (D + T - 2W ). Показано, что связь между вычисленными площадями и измеренными имеет чётко выраженный линейный характер. Вычисленные значения площадей клетки и клеточной стенки получаются систематически завышенными на 7-8% по сравнению с прямыми измерениями.
Плотность Профиль плотности Б А Picell Расстояние от начала кольца Di Рис.7. Профиль плотности и радиальный ряд клеток.
4S Индекс округлости I = для лиственницы составляет 0,722, а для сосны P 0,767, что очень близко к индексу квадрата (0,785). Таким образом, для расчёта площадей поперечного сечения клетки и клеточной стенки можно пользоваться прямоугольной моделью формы клетки с использованием линейных уравнений коррекции.
Ключевым моментом метода косвенного измерения массы и плотности клеточных стенок является расчёт средней плотности клетки, т.к. именно на этом этапе совмещаются денситометрические и гистометрические данные (рис.7). Производится расчёт средней плотности Picell участка профиля плотности А-Б, имеющего длину, равную радиальному размеру клеточной TRWdens стенки Di, умноженному на корректирующий коэффициент KTRW =, TRWcell т.к. ширина годичного кольца (TRW), полученная из клеточных и денситометрических данных может немного различаться. Профиль плотности имеет дискретный характер с нефиксированным шагом около 3 мкм (рис.8). В случае, когда граница отрезка А-Б попадает между точек профиля, строится прямая (1 или 2), проходящая через эти точки. Зная уравнение прямой, вычисляется величина плотности на границе А-Б.
Плотность Точки профиля плотности А Б Расстояние от X XN-X j начала кольца Рис.8. Точки дискретного профиля плотности.
Средняя плотность клетки вычисляется согласно выражению N -+ Pi( )X (Pij j+1) j j=Picell =, где Picell - средняя плотность i-ой трахеиды, Pij - N -X j j=измеренная денситометром плотность годичного кольца для i-ой клетки в j-ой точке отрезка А-Б, X - расстояние между точками j и j+1, N - количество j точек профиля плотности, попадающих в отрезок А-Б.
Удельная масса и плотность клеточной стенки рассчитывается согласно Sc выражениям M = PcSc и Pw = Pc, где M - удельная масса клетки, Sc, Sw - Sw площадь поперечного сечения клетки и клеточной стенки, Pc, Pw - плотность клетки и клеточной стенки.
Система анализа изображений Денситометр DENDRO-20лDendro2003 Lineyka Программа предназначена для Программа предназначена для измерения клеточных структур обработки файлов денситометра DENDRO 2003. В процессе обработки получаются профили Измеряются люмен (Lu), двойная (WW) плотности годичных колец и или одинарная (W) толщина клеточной ширина годичного кольца стенки и средний тангентальный размер рядов образца (T) ProcessorKR W T TRWDENS WW Lu Преобразование Датировка WW в W клеточных данных Преобразование глицериновых TRWCELL размеров в воздушно-сухие Расчёт ширины Расчёт радиального годичного размера клетки (D) кольца (TRW) T D W D Стандартизация числа клеток к их среднему количеству в годичном кольце.
Профиль Стандартизируются ряды D и W.
плотности Среднее по рядам годичных колец D,W,T Рис.9. Общая схема расчёта массы и плотности клеточных стенок.
Все процедуры обработки гистометрических данных и алгоритм расчёта массы и плотности клеточных стенок оформлены в виде компьютерных программ ProcessorKR и SpektrMP для операционной системы Windows.
Как и все программы, созданные в данной работе, они написаны на языке программирования Delphi, имеют удобный графический интерфейс и позволяют оперативно изменять параметры расчётов и проводить предварительный анализ рассчитанных величин. На рисунках 9 и представлена общая схема расчёта массы и плотности клеточных стенок.
Глава 4. Физические основы изменчивости массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных.
Расчёты рентгенографической массы и плотности клеточных стенок осуществлялись с помощью разработанного метода и алгоритмов для годичных колец лиственницы и сосны, произрастающих в зоне средней тайги Средней Сибири (дендрохронологическая станция BUG, 610 51/ с.ш., 940 19/ в.д.).
D,W,T Профиль плотности SpektrMP Коррекция края D,T профиля плотности W,D,T Расчёт площади Расчёт площади поперечного поперечного сечения сечения клетки Sc клеточной стенки Sw D,W Расчёт средней плотности трахеиды Коррекция Sc Коррекция Sw Pc Pc Sc Расчёт удельной массы клетки Sw Расчёт плотности клеточной стенки трахеиды Рис.10. Общая схема расчёта массы и плотности клеточных стенок.
Проводился теоретический анализ возможного распределения плотности в оболочках клетки. Показано, что невозможно адекватно объяснить экспериментальные данные без введения зависимости плотности P1 слоя L1 от k W в виде P1(W ) = + b, где n1 равен 1,2 для лиственницы и 1,4 для сосны.
nW Плотность L2 - константа или изменяется незначительно вблизи слоя L1. Тогда L M выражение связи P(W ) = + + B выводится аналитически (L,M,B - константы).
n W W На рисунке 11 показан результат работы в графическом виде модуля нелинейное оценивание программы Statistica-6.0 по оцениванию констант выражения и показателя степени n.
иственница Сосна y=((2153,75)/(x^2,2))+((463,755)/x)+(1123,97) y=((1748,96)/(x^2,4))+((425,395)/x)+(1191,19) 2800 3526302422252018201614151210108651 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,Толщина клеточной стенки, мкм. Толщина клеточной стенки, мкм.
Рис.11. Связь рентгенографической плотности клеточной стенки с толщиной клеточной стенки.
Благодаря наличию функциональной связи между коэффициентами L, M, B и k, b была получена связь плотности слоя L1 с W в явном виде. Анализ поведения функции P1(W) показал, что плотность внешнего слоя Люмен в модели достигает величины 3500 мг/см3 в ранней древесине и стремится к величине 1600-1700 мг/см3 в поздней. Плотность внутренней оболочки L2 находится в пределах 1200-1300 мг/см3.
Проводились теоретические оценки влияния L2 LW основных химических компонентов клеточных стенок Рис.12. Модель на результаты рентгеновской денситометрии. Это строения клеточной целлюлоза (C6H10O5), лигнин (C57H60O10), пектат стенки.
кальция (C32H36O28Ca2) и пектат кальция без атомов кальция (C32H38O28). Массовые коэффициенты поглощения углерода, водорода, кислорода и кальция были определены по справочнику (Блохин, Швейцер, 1982) для длины волны рентгеновской трубки, соответствующей максимальной интенсивности излучения. Далее рассчитывались линейные и массовые коэффициенты ослабления компонентов k k клеточной стенки по формулам = M mi и m = M mi, а также ni i ni i M M i=1 i=степень ослабления рентгеновского излучения, проходящего через вещество I толщиной 1 мм с плотностью 1,4 г/см3 согласно выражению = e-x. Анализ Iработы денситометра DENDRO-2003 позволил теоретически вывести и экспериментально подтвердить связь между измеряемой денситометром плотностью образца и степенью ослабления рентгеновского излучения, Плотность, мг/см Плотность, мг/см I проходящего через данный образец в виде формулы P = -0,4ln . Благодаря I последнему выражению, были теоретически получены рентгенографические плотности компонентов клеточной стенки. Анализ результатов расчёта представлен в таблице 1. Видно, что наличие пектата кальция в клеточной оболочке приводит к высоким рентгенографическим плотностям. Пектат кальция концентрируется в сложной срединной пластинке, что соответствует внешней оболочке L1 (рис.12). Таким образом, когда толщина клеточной стенки мала и приближается к толщине L1, появляются высокие значения плотностей клеточных стенок. С увеличением W и, следовательно, слоя L2, всё большую роль начинают играть целлюлоза и лигнин оболочки L2 и плотность клеточной стенки снижается.
Табл.1. Рентгенографические плотности химических компонентов клеточной стенки.
Пектат Пектат кальция без Вещество Лигнин Целлюлоза кальция кальция Плотность 0,95 1,37 3,2 - 3,6 1,г/см Проводился анализ влияния единого корректирующего коэффициента денситометра DENDRO-2003 для каждой древесной породы на результат денситометрических измерений. Показано, что применение единого корректирующего коэффициента в условиях влияния химического состава клеточных стенок на результат измерений приводит к систематическому завышению измеренных значений плотности в ранней древесине (в пределе до 60%) и занижению в зоне поздней древесины для годичных колец лиственницы и сосны (до 15%). Данный эффект также приводит к завышению рентгенографической массы клеточных стенок в ранней древесине и занижению в поздней древесине по сравнению с гравиметрической массой клетки, рассчитанной как произведение площади поперечного сечения клетки и гравиметрической плотности клеточной стенки, равной 1,5 г/см3.
Проводились гистометрические и рентгенографические исследования годичных колец хвойных разных пород из контрастных мест обитания с помощью методов и программного обеспечения, разработанных в рамках данной диссертационной работы. Образец лиственницы Nr был взят в районе города Норильск. Образцы древесины ели Be, в количестве трёх, были взяты в Томской области вблизи деревни Халдеево. Образцы лиственницы в KHA_LaSi и ели KHA_PiOb (пять деревьев каждой породы) были взяты в районе реки Хантайка с близко расположенных участков. Анализ результатов исследования показал, что вид связи рентгенографической плотности клеточной стенки с её толщиной остаётся инвариантным относительно породы дерева и места его произрастания. Наиболее значащим является почти полное совпадение вида связи и абсолютных значений параметров в годичных кольцах у ели и лиственницы, произрастающих в достаточно контрастных климатических условиях - в Томской области и вблизи г. Норильска (рис. 13).
35Nr 30Be 252015105024W, мкм Рис. 13. Связь рентгенографической плотности клеточной стенки с её толщиной в годичных кольцах лиственницы (Nr), произрастающей вблизи г. Норильск и ели (Be), произрастающей в Томской области.
Для всех образцов наблюдается расхождение только в диапазонах изменения толщины клеточной стенки и её рентгенографической плотности, что связано как с видоспецифическими особенностями строения ксилемы годичных колец разных пород деревьев, так и разными условиями мест произрастания. Например, диапазон изменения толщины клеточных стенок годичных колец ели в Томской области выше, чем в годичных кольцах ели, произрастающей в районе р. Хантайка, что связано с лучшими условиями обитания в Томской области. При этом диапазон изменения рентгенографической плотности клеточной стенки остаётся примерно одинаковым.
Глава 5. Взаимосвязи показателей структуры годичных колец и примеры их использования в дендроэкологии.
Предложен новый параметр годичных колец - индекс рентгенографической плотности клеточной стенки (IPW), отражающий изменение концентрации элементов с высоким коэффициентом ослабления рентгеновского излучения, который рассчитывается по формуле Pw I =, где Pw - экспериментальная рентгенографическая плотность Pw Pw _ calc (W ) клеточной стенки, Pw _ calc (W ) - рентгенографическая плотность клеточной стенки, рассчитанная по толщине клеточной стенки W (глава 4).
Предложен новый способ индексации клеточных параметров, выделяющий связь между ними (рис.14), которая не зависит от условий начала сезона роста.
Pi Индексация проводится по формуле I =, где I - индекс параметра Pi Pi Pi PmR для i-ой клетки, PmR - среднее значение параметра P в текущем годичном кольце. Хорошо выраженный вид связи (рис.14) после применения индексации Pw, мкг/см может свидетельствовать о значительном генетическом контроле дифференцировки ксилемы годичного кольца. Независимо от абсолютных средних размеров клеток текущего вегетационного периода всегда реализуется однотипная программа, задающая характерные относительные размеры D и W для каждой зоны годичного кольца, которые, возможно отражают их оптимальные относительные размеры, необходимые для выполнения специализированных функций каждой зоны годичного кольца (водопроводимость и механическая прочность).
иственница A Лиственница Б 2,2,1,1,1,1,1,0, 0,0,0,0 10 20 30 40 50 60 70 80 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2, D, мкм D, индекс Рис.14. Связь толщины клеточной стенки W с радиальным размером клетки D до индексации (А) и после (Б) на примере годичных колец лиственницы.
Подобная связь наблюдается и для годичных колец сосны.
На основании предложенного способа индексации создана новая методика разделения клеточных данных по зонам годичного кольца (рис.15). В отличие от существующих способов разделения, данная методика позволяет более точно идентифицировать принадлежность клетки к зоне годичного кольца.
Посредством предложенной методики разделения клеточных данных по зонам годичного кольца, были построены столетние хронологии всех измеренных в данной работе клеточных параметров (D, W, SC, SW,PC, M, PW, IPW) для каждой зоны годичного кольца. SC, SW - площадь Лиственница поперечного сечения клетки и клеточной Поздняя 2,древесина Переходная 2,0 стенки, PC, PW - плотность клетки и 1,зона клеточной стенки, M, IPW - масса и 1,1,индекс рентгенографической плотности 1,клеточной стенки.
1,0,Для обнаружения общих скрытых 0,0,факторов, проводился факторный анализ 0,0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 всей совокупности клеточных данных.
Ранняя 0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2,Анализ результатов свидетельствует о древесина D, индекс том, что клеточные данные могут быть разложены по трём независимым Рис.15. Разделение клеточных факторам. Третий фактор имеет высокую данных по зонам годичного связь с IPW (0,8), второй фактор - с SW кольца.
(0,9) и M (0,84). С первым фактором W, мкм W, индекс W, индекс связаны все остальные клеточные параметры.
Исследовались основные свойства хронологий SW, M и IPW. Показано, что IPW не зависит от радиального размера клетки D в ранней и переходной зоне годичных колец. В поздней древесине наблюдается уменьшение IPW с уменьшением D, ярко выраженное для годичных колец сосны и в меньшей степени для лиственницы. Sw и М имеют связь с D. Эта связь резко выделяется при проведении индексации этих параметров в пределах годичного кольца по предложенному в данной работе методу. Это свидетельствует о том, что величины масс клеток в кольце не являются случайными и накопление фитомассы клетками прямо либо косвенно находится под генетическим контролем механизмов, обеспечивающих функционирование ксилемы годичных колец.
Ipw не зависит от толщины клеточной стенки W, вместе с тем можно наблюдать, что дисперсия Ipw увеличивается с уменьшением W. Это может быть следствием того, что элементы, сильно поглощающие рентгеновское излучение, концентрируются во внешней оболочке клеточной стенки и отсутствуют во внутреннем слое. В этом случае внутренняя оболочка будет нивелировать дисперсию рентгенографической плотности внешней оболочки при увеличении W, т.к. вклад в Pw клеточной стенки внутренней оболочкой при больших W становится определяющим. Таким образом, связь дисперсии Ipw с W является дополнительным аргументом в пользу предложенного объяснения связи Pw(W), данного в четвёртой главе.
Средние по всем образцам хронологии Ipw в разных зонах кольца изменяются синхронно и имеют тесную связь между собой как в годичных кольцах лиственницы, так и сосны. Всё это исключает возможность интерпретировать Ipw как параметр, имеющий случайную природу вследствие погрешностей измерения рентгенографической плотности клеточной стенки и указывает на наличие какого-то общего внешнего фактора или группы факторов, влияние которых на физиологические процессы в дереве отражается в изменчивости Ipw. Между хронологиями Ipw лиственницы и сосны отсутствует корреляционная связь, что может указывать или на разную природу внешних факторов, или на разную природу Ipw у лиственницы и сосны, либо на то и другое. Все хронологии Sw и М высоко коррелированны между собой независимо от того, относятся они к одной породе деревьев или рассматриваются связи Sw и М между лиственницей и сосной.
Ipw, в отличие от других клеточных параметров годичных колец, не зависит от энергии роста дерева (ширина годичного кольца). Разность между Ipw ранней и поздней древесины также не зависит от ширины годичного кольца, в отличие от гравиметрической и рентгенографической массы клеточных стенок. Наблюдается увеличение значений Sw и М при росте ширины годичного кольца (TRW) до его некоторого критического значения (приблизительно 0,5 мм), после чего увеличение Sw и М прекращается совсем, либо продолжает слабо расти. Обнаружена связь между разностью масс клеточных стенок в ранней и поздней древесине и шириной годичного кольца.
С увеличением TRW разница масс уменьшается, а после TRW=0,5мм - стабилизируется.
Для оценки влияния климатических факторов на формирование клеточной стенки проводился стандартный дендроклиматический анализ хронологий SW, M, IPW. Показано, что динамика температурного режима вегетационного периода находит своё отражение в хронологиях Ipw лиственницы и сосны. Для Ipw всех зон кольца лиственницы чётко прослеживается связь с температурой начала августа, в то время как только Ipw переходной зоны годичных колец сосны имеет положительную значимую корреляционную связь с температурой начала июня, хотя можно заметить, что положительные незначимые коэффициенты корреляции Ipw всех зон колец сосны группируются в начале вегетационного периода. Таким образом, реакция Ipw лиственницы и сосны на температурный режим проявляется по-разному, что может свидетельствовать или о различии физиологической реакции на температуру лиственницы и сосны, или на различную природу самих параметров Ipw. Хронологии Sw и M имеют тесную положительную связь с температурным режимом вегетационного периода. Эта связь усиливается с увеличением широты места произрастания деревьев.
Исследовалось влияние поражающих факторов Тунгусского взрыва на формирование структуры годичных колец лиственницы и ели, произрастающих в эпицентре взрыва и переживших это событие. Обнаружено, что Ipw лиственницы активно реагирует на шоковое состояние деревьев, вызванное Тунгусским феноменом. Реакция Ipw наблюдается и в после катастрофные годы, несмотря на нормальное развитие структуры годичных колец, что может свидетельствовать о том, что Ipw отражает динамику внутренних физиологических процессов древесных растений. Наблюдается резкое снижение массы клеток в годичных кольцах, сформированных в год Тунгусской катастрофы. В последующие годы наблюдается восстановление величины масс клеток до нормального уровня, несмотря на депрессию прироста ширины годичного кольца.
Изучалась возможность восстановления профиля плотности годичных колец только по гистометрическим данным. Показано, что необходимо учитывать связь рентгенографической плотности клеточной стенки с её толщиной. Использование постоянного значения плотности клеточной стенки возможно при условии применения его к выделенным зонам годичного кольца, как, например, в случае восстановления максимальной плотности годичного кольца по гистометрическим данным. Вместе с тем, при восстановлении профиля плотности годичных колец по гистометрическим данным, в хронологиях теряется часть информации об изменениях внешней среды, заключённых в индексе рентгенографической плотности клеточной стенки, что необходимо учитывать при сравнении денситометрических хронологий, полученных прямым измерением, с восстановленными по структуре годичных колец.
Глава 6. Исследование элементного состава годичных колец.
Результаты измерений элементного состава годичных колец представляют собой наборы числовых данных интенсивности флуоресцентного, когерентного и некогерентного излучений, без какого-либо разделения их по годичным кольцам, что вызывает затруднение для их дальнейшей обработки и использования. Разработан метод разделения элементных данных по годичным кольцам с чёткой привязкой каждой точки измерения относительно внутренних координат годичного кольца. В качестве маркера границ годичных колец используются данные когерентного и некогерентного излучений, интенсивность которых пропорциональна плотности древесины. Координаты точек внутри годичного кольца рассчитываются по данным шага сканирования образца.
При исследовании элементного состава вещества методами РФА, как правило, используются гомогенные образцы. В случае сильной неоднородности объекта исследования, его гомогенизируют и из полученного порошка прессуют таблетки одинаковой плотности, элементный состав которых затем исследуют. Годичные кольца имеют неоднородное строение с высокими вариациями плотности, которые влияют на результаты РФА.
Вся масса трахеиды и химические элементы сосредоточены в веществе клеточной стенки, в связи с чем, исследовался вопрос о влиянии распределения элементов внутри клеточной стенки на результаты измерения их концентрации методами РФА. Разработан метод коррекции данных РФА, предусматривающий два варианта распределения элементов. Первый вариант предусматривает равномерное распределение исследуемых элементов в клеточной стенке, согласно второму варианту элементы концентрируются в сложной срединной пластинке. Получены математические выражения коррекции первичных данных РФА годичных колец древесины хвойных для обоих случаев. Если элементы распределены равномерно в пределах клеточной стенке, данные РФА следует нормировать на плотность древесины в точке измерения или на интенсивность когерентного (некогерентного) излучения от этого участка. В этом случае получаются данные удельных концентраций элементов в клеточной стенке. Если исследуемые элементы концентрируются в сложной срединной пластинке, для нормировки используется выражение DT I = Ii , где D и T - радиальный и тангентальный размер NORMi - 4WL2 + 2WL (D + T ) клетки, WL - толщина сложной срединной пластинки, Ii и INORMi - интенсивности исходного и нормированного флуоресцентного сигнала. В этом случае получаются данные удельных концентраций элементов в сложной срединной пластинке. Применение того или иного выражения для нормирования данных РФА зависит от распределения исследуемых элементов в клеточной стенке и задачи исследования. Не исключено, что элементы могут концентрироваться в оболочках клеточных стенок по-разному. Точный ответ на этот вопрос могут дать исследования с помощью методов элементного анализа электронной микроскопии с пространственным разрешением на уровне оболочек клеточной стенки.
Разработан метод сопоставления данных многопараметрических измерений клеточной структуры годичных колец, имеющих разный пространственный масштаб, для изучения связи между ними. Согласно предложенному методу, клеточные параметры более высокого разрешения усредняются в пределах разрешающей способности метода с низким пространственным разрешением. Наиболее низкой разрешающей способностью обладает станция элементного анализа РФА-СИ, шаг сканирования которой составляет 200 мкм. Участок таких размеров может захватить от четырёх до двадцати клеток, в зависимости от породы дерева и зоны годичного кольца.
В процессе измерения элементного состава станцией РФА-СИ, ширина пучка возбуждающего синхротронного излучения остаётся постоянной на фоне высокой вариабельности ширины годичных колец, следствием чего является разное число точек данных в пределах каждого годичного кольца. Это приводит к тому, что невозможно корректно проводить сравнительный анализ динамики изменения элементного состава как в пределах одного дерева, так и для группы деревьев. В работе обоснован метод стандартизации числа точек данных элементного состава внутри годичных колец по типу стандартизации числа клеток (глава 3). Возможность применения метода стандартизации для элементных данных является следствием применения этого метода для клеточных данных.
Согласно описанным выше методам были разработаны алгоритмы обработки элементных данных, которые реализованы в виде компьютерной программы ConvElementINF автором данной диссертационной работы на языке Delphi для операционной системы Windows. Программа ConvElementINF включает в себя модуль разделения элементных данных по годичным кольцам с последующей их датировкой с помощью хронологии ширины годичного кольца, модули сопоставления элементных, гистометрических и рентгенографических данных, стандартизации числа точек элементных данных в годичных кольцах, а так же модуль построения погодичных хронологий элементного состава для любой точки внутри кольца.
Нормирование элементных данных может быть осуществлено в любом модуле программы по желанию оператора.
В работе исследовался химический элементный состав в диапазоне Cl-Sr у разных древесных пород, произрастающих в разных климатических зонах.
Массовые измерения по группе деревьев были сделаны для двух пород хвойных - ели (Be) и пихты (Hp), произрастающие в Томской области. Также были проведены измерения элементного состава для образцов лиственницы, произрастающей вблизи г. Норильска (Nr), в эпицентре Тунгусского взрыва (TM) и сосны из центральной части Республики Саха (Yak). Сканирование образцов на станции РФА-СИ проводилось для последних 20 годичных колец деревьев, которые, как правило, относятся к зоне ствола дерева (заболонь), транспортирующей воду, т.е. активно участвующей в росте и развитии древесного растения. Исследование распределения концентраций элементов в ядровой древесине - отдельная задача, т.к. эта область ствола не участвует в активном текущем метаболизме дерева. Кроме того, существует изменение элементного состава годичных колец при переходе от заболонной древесины к ядровой (Hantemirov, 1992; Хантемиров, 1996; Baes, 1984; Momoshima, 1990), что так же требует отдельного изучения.
По результатам сканирования указанного диапазона можно выделить три группы химических элементов. Первая группа элементов встречается во всех точках сканирования образцов. Это элементы K, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, Rb, Sr.
Крайне редко содержание Rb в точке сканирования ниже чувствительности оборудования. Концентрации элементов второй группы не всегда детектируются. Это элементы Cl, Sc, Ti, V, Ni, As, Br, Kr. У пихты томской области (Hp), сосны из Якутии (Yak) и лиственницы Норильска (Nr) встречается элемент Ga, отсутствующий у образцов других пород и мест произрастания. У лиственницы из эпицентра падения Тунгусского метеорита (ТМ) отмечен хром. Третья группа элементов не определяется в образцах древесины оборудованием станции РФА-СИ. Это элементы Cr, Co, Ge, Se.
Интенсивности флуоресценции химических элементов достаточно сильно варьируют. Минимальные и максимальные величины интенсивности могут отличаться на порядки в одних и тех же образцах. Во всех образцах древесины наименьшей вариабельностью отличается аргон (5%-16%). Самые высокие значения относительного среднеквадратического отклонения наблюдаются для галлия в образцах Yak (189%), Nr (659%), и для железа в образцах Yak (142%) и TM (422%). В среднем по всем элементам для всех исследованных образцов, величина относительного среднеквадратического отклонения лежит в пределах 80%. Для кальция она колеблется в пределах 18-90%.
Структура распределения концентраций элементов в образцах древесины по порядку величины совпадает с литературными данными. Вместе с тем, наблюдаются серьёзные различия в распределении относительных концентраций элементов для исследованных образцов. Так, например, концентрация калия колеблется в пределах от 14% до 178% относительно концентрации кальция, хлора - от 18% до 157% и т.д.
Исследовались общие закономерности связей между концентрациями химических элементов в годичных кольцах образцов методами многомерного статистического анализа с помощью статистического пакета программ Statistica-6. Анализ результатов кластерного, факторного и корреляционного анализа показал наличие устойчивых кластеров одних и тех же химических элементов, вид связи внутри которых инвариантен относительно породы и места произрастания дерева. Это комбинации Coherent+InCoherent+Sr/Ca (иногда +Rb/K), Ca+Mn+Sr, K+Rb, As+Kr. Интенсивности когерентного и некогерентного излучений имеют линейный вид связи между собой и высокий коэффициент корреляции 0,99-1.
Обнаружено, что отношение Sr/Ca также имеет линейный вид связи с интенсивностью когерентного и некогерентного излучения (рис.16) с коэффициентом корреляции, в среднем по участкам равным 0,77, достигая в максимуме 0,86 для образца лиственницы Nr. Следствием линейной связи Sr/Ca с Coherent (и InCoherent) является то, что изменение величины Sr/Ca чётко описывает профиль интенсивности Coherent, а, следовательно, и профиль плотности годичного кольца (рис.16). В некоторых случаях подобное поведение характерно и для отношения Rb/K, вместе с тем, часто нарушаемое на разных участках одного и того же образца.
Coherent 2,5 4,4,Sr/Ca 3, 3,2,5 1,2, y = 1,6258x + 0,461,R2 = 0,860,1,0,5 1 1,5 2 2,0,5 Coherent, отн. ед.
Рис. 16. Связь отношения концентраций Sr/Ca с интенсивностью когерентного излучения (Coherent) в годичных кольцах ели. Подобная картина наблюдается для всех исследованных образцов.
Элементы Ca, Mn и Sr имеют высокие значимые коэффициенты корреляции между собой (максимально до 0,88). Кластерный и факторный анализы также объединяют эти элементы в одну группу, потенциально находящуюся под влиянием общего фактора. Изменение концентрации кальция и стронция находятся в противофазе друг другу в пределах годичного кольца (рис. 17). Концентрация Ca максимальна в ранней древесине и уменьшается к зоне поздней древесины. Концентрация стронция минимальна в ранней древесине и увеличивается в зоне поздней. Вместе с тем, общий тренд изменения этих элементов одинаков в пределах каждого образца, что приводит к высоким положительным коэффициентам корреляции между ними.
Концентрация Ca изменяется в противофазе к изменению интенсивности когерентного излучения, изменение концентрации Sr происходит синфазно ему (рис. 17).
Coherent Ca Sr --1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 Номер точки в образце Рис.17. Графики изменения интенсивностей когерентного излучения (Coherent), концентрации кальция (Ca) и стронция (Sr) в годичных кольцах ели.
Распределение концентрации марганца в пределах годичного кольца не проявляет такой однозначности как Ca и Sr, но изменение тренда концентрации Sr/Ca, отн. ед.
Sr/Ca, отн. ед.
Coherent, отн. ед.
Концентрация, отн. ед.
Mn так же совпадает с Ca и Sr, что, в свою очередь, приводит к высоким коэффициентам корреляции с ними. Причиной общности тренда концентраций Ca и Sr и их изменения в противофазе друг к другу может быть вхождение в состав одного из полимеров клеточной стенки, в котором они взаимно вытесняют или дополняют друг друга, в зависимости от условий их связывания и в силу их химического сродства. Наиболее вероятно, такими полимерами являются пектиновые вещества, неметилированные карбоксильные группы которых связываются между собой ионами Ca2+ таким образом, что образуется структура, имеющая название лячейки для яиц (Горшкова, 2007).
Кроме того, отмечено, что похожие структуры могут образовываться и с другими двухвалентными катионами, такими как Mg2+, Sr2+, Ba2+. Марганец, судя по тренду, также прямо или косвенно связан с пектиновыми веществами или процессами образования их комплексов с ионами кальция и стронция.
Распределение концентраций Rb и K и их связь с интенсивностью когерентного излучения напоминает распределение для Sr и Ca, но, в отличие от них, не так ярко выражено и периодически нарушается на разных участках образцов.
Калий и рубидий тоже имеют химическое сродство друг другу, что может послужить основой для объяснения связи их концентраций в древесине.
Интересным является совпадение трендов изменения концентрации мышьяка и криптона в годичных кольцах хвойных, независимо от породы древесного растения и места его обитания. Первый из них является сильным ядом для живых организмов, а второй - инертным к биохимическим процессам. Можно предположить совпадение их трендов наличием общего для них механизма переноса по проводящим путям дерева.
2400 3,Pw 222,Ca 201,18160,14-0,12-1000 -1,024W, мкм Рис.18. Связь рентгенографической плотности клеточной стенки (Pw) и удельной концентрации кальция (Ca) с толщиной клеточной стенки (W).
С помощью разработанного метода и программного обеспечения проведён анализ связи рентгенографических, гистометрических и элементных данных в годичных кольцах хвойных. Отмечено совпадение профилей интенсивности когерентного и некогерентного излучения с рентгенографическим профилем плотности годичных колец. Таким образом, при исследовании элементного состава годичных колец отпадает необходимость в дополнительных денситометрических измерениях. Показана связь рентгенографической Ca, отн. ед.
Pw, мкг/см плотности клеточной стенки с её толщиной и удельной концентрацией кальция в ней (рис. 18), что является экспериментальным подтверждением влияния концентрации кальция на величину рентгенографической плотности клеточной стенки.
Не нашла подтверждения связь индекса рентгенографической плотности клеточной стенки (Ipw) с элементным составом клеточной стенки. Проводились теоретические оценки влияния элементного состава клеточной стенки на степень поглощения рентгеновского излучения как с использованием экспериментальных данных по элементному составу, полученных в рамках данной работы, так и с использованием литературных данных. Анализ результатов расчёта линейных коэффициентов поглощения показал, что элементы, тяжелее кальция, не оказывают существенного влияния на рентгенографические параметры клеточных стенок. Напротив, элементы, легче кальция, могут составить ему конкуренцию в поглощении рентгеновского излучения. В соответствии с данными теоретических оценок, сделано предположение, что величина индекса рентгенографической плотности клеточной стенки определяется содержанием элементов, концентрации которых не были измерены. Предположительно, это кремний и фосфор.
Кремний является инкрустирующим элементом клеточных стенок, увеличивающий их механическую прочность, а фосфор играет важную роль в жизнедеятельности растений, поэтому их концентрация в клеточных стенках может быть связана с гистометрическими и рентгенографическими характеристиками.
С помощью программы ConvElementINF были построены хронологии изменения концентраций элементов в ранней и поздней древесине годичных колец ели и пихты, произрастающие в Томской области. Обнаружено, что в разных деревьях одной породы, произрастающих на одном участке, наиболее синхронно изменяются концентрации кальция и стронция. Также согласованно изменяются концентрации таких элементов, как K, Mn, Fe, Cu, Zn, Rb.
Синхронности изменения концентраций других элементов не отмечено.
Хронологии элементного состава поздней древесины более согласованы между собой, чем хронологии элементного состава ранней древесины. Усреднённые хронологии элементов K, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, Rb, Sr, рассчитанные для каждого элемента по индивидуальным хронологиям отдельных деревьев показывают хорошую согласованность между собой. В большей степени это относится к зоне поздней древесины. Связь между средними хронологиями ранней и поздней древесины наблюдается для лёгких элементов, до кальция включительно. Связь между средними хронологиями элементов, тяжелее кальция, отсутствует. Отсутствует связь хронологий элементного состава с хронологией по ширине годичных колец.
ВЫВОДЫ 1) Созданы методы, алгоритмы и программное обеспечение для проведения измерений, обработки и анализа гистометрических, рентгенографических характеристик годичных колец хвойных и их элементного состава.
2) Экспериментально доказано наличие высокой рентгенографической плотности клеточной стенки в ранней древесине годичных колец лиственницы и сосны, сравнимой с плотностью алюминия. Доказан факт изменчивости рентгенографической плотности клеточной стенки в пределах годичного кольца и её отрицательная нелинейная связь с толщиной клеточной стенки, которая носит универсальный характер и не зависит от породы древесного растения и места его обитания.
3) Теоретический анализ экспериментальных данных показал, что рентгенографическая плотность сложной срединной пластинки (PL) зависит от общей толщины клеточной стенки W. Уравнение связи вида kL PL (W ) = + bL позволяет адекватно описать экспериментальные данные m W на основе гетерогенного строения клеточной стенки.
4) Теоретические оценки влияния химического состава оболочек клеточной стенки на эффективность поглощения рентгеновского излучения показали, что пектиновые вещества, связывающие ионы кальция (пектат кальция), приводят к высоким рентгенографическим плотностям клеточных стенок. Элементы, по массе тяжелее кальция, не оказывают существенного влияния на рентгенографические параметры клеточных стенок.
5) Доказано, что изменчивость рентгенографической плотности клеточной стенки в годичном кольце и существующий метод калибровки денситометра DENDRO-2003 приводит к завышению рентгенографической массы и плотности клеток в ранней древесине, и их занижению в поздней древесине относительно их гравиметрических значений. Вместе с тем, средние рентгенографические показатели годичного кольца не будут иметь больших расхождений с их средними гравиметрическими значениями.
6) Предложен новый метод индексации клеточных параметров в годичных кольцах, позволяющий анализировать связи между ними и идентифицирующий принадлежность клетки к той или иной зоне годичного кольца. Впервые удалось показать наличие чётко выраженных связей между клеточными параметрами, независимых от общей климатической характеристики вегетационного периода.
7) Объединение гистометрических и рентгенографических характеристик годичных колец позволило предложить новые параметры структуры годичных колец древесных растений: рентгенографическую массу и индекс рентгенографической плотности клеточной стенки (Ipw) для использования их в задачах дендроэкологии и дендроклиматологии.
8) Показано, что хронологии массы и индекса рентгенографической плотности клеточных стенок связаны с изменением условий внешней среды и отражают воздействие фактора или группы факторов, отличных от тех, которые являются определяющими для остальных клеточных параметров годичных колец. Это указывает на перспективность их применения в задачах дендроэкологии и дендроклиматологии.
9) Обнаружены три группы элементов, наличие связей между которыми не зависит от вида древесного растения и места его произрастания. Это группы Ca+Sr+Mn, K+Rb, As+Kr. Связь между элементами в первых двух группах чётко проявлена в пределах годичного кольца и обусловлена их химическим сродством. Связь As и Kr обусловлена общностью изменения их трендов концентраций.
10) Обнаружена линейная положительная связь отношения концентрации Sr/Ca с плотностью годичного кольца. Профиль распределения Sr/Ca и профиль плотности годичного кольца практически совпадают. Данная связь носит универсальный характер и не зависит от вида древесного растения и места его произрастания. Менее выраженный характер связи с профилем плотности обнаруживает и отношение Rb/K.
11) Показано наличие связи удельных концентраций элементов с гистометрическими и рентгенографическими характеристиками клеток и клеточных стенок. Характер связи концентрации Ca с толщиной клеточной стенки (W) и её рентгенографической плотностью (Pw) позволяет сделать вывод о вкладе концентрации Ca в формирование величины Pw. Результаты теоретических оценок влияния элементного состава на поглощение рентгеновского излучения показали, что величину Ipw могут определять элементы, по массе легче хлора, концентрации которых не были измерены в рамках данной работы.
12) Показано наличие синхронных изменений концентраций элементов в зонах годичных колец разных деревьев одной породы, произрастающих на одном участке при слабой связи хронологий элементов между зонами годичных колец. Синхронные изменения концентраций элементов указывают на наличие общего для них синхронизирующего внешнего фактора или группы факторов, что говорит о перспективности использования элементного состава в задачах дендроэкологии и дендроклиматологии.
Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Ваганов E.A., Кирдянов А.В., Силкин П.П. Значение раннелетней температуры и сроков схода снежного покрова для роста деревьев в субарктической зоне Сибири // Лесоведение.-1999.-N6.-С.3-14.
2. Силкин П.П., Кирдянов А.В. Масса клеточных стенок трахеид ранней и поздней древесины в годичных кольцах лиственницы // Лесоведение.-1999.N6.-С.55-59.
3. Vaganov E.A., Hughes M.K., Kirdyanov A.V., Schweingruber F.H., Silkin P.P.
Influence of snowfall and melt timing on tree growth in subarctic Eurasia // Nature.-1999.-Vol.400, # 6740.-P.149-151.
4. Kirdyanov A.V., Silkin P.P. Cell and density structure of tree-rings of different conifers as an indicator of different climatic parameter changes // GeoLines.2000.-Vol.11.-P.127-129.
5. Kirdyanov A.V., Hughes M.K., Vaganov E.A., Schweingruber F.H., Silkin P.P.
The importance of early summer temperature and date of snow melt for tree growth in Siberian Subarctic // Trees.-2003.-Vol.17.-P.61-69.
6. Silkin P.P., Kirdyanov A.V. The relationship between variability of cell wall mass of earlywood and latewood tracheids in larch tree-rings, the rate of tree-ring growth and climatic changes // Holzforschung.-2003.-Vol.57.-P.1-7.
7. Vaganov E.A, Hughes M.K., Silkin P.P., Nesvetailo V.D. The Tunguska event in 1908: Evidence from tree-ring anatomy // Astrobiology.-2004.-V.4.-N3.-P.391399.
8. Силкин П.П., Кирдянов А.В., Круглов В.Б., Кнорре А.А. Коррекция измерений толщины клеточной стенки в переходной зоне годичных колец лиственницы // Вестник КГУ.-2005.-№5.-С. 85-88.
9. Кирдянов А.В., Силкин П.П., Кнорре А.А., Круглов В.Б. Региональные особенности климатической реакции радиального прироста лиственницы на севере средней Сибири и на Урале // Вестник КГУ.-2005.-№5.-С. 79-84.
10. Кнорре А.А., Кирдянов А.В., Круглов В.Б. Силкин П.П. Использование измерений радиального прироста для оценки годичной продукции древостоев // Вестник КГУ.-2005.-№5.-С. 74-78.
11. Зуев В.В., Бондаренко С.Л., Зуева Н.Е., Силкин П.П., Шашкин А.В., Золотарёв К.В., Шапоренко А.В. Комплексные исследования значимых откликов в годичных кольцах хвойных деревьев на воздействие солнечной УФ-В-радиации //Оптика атмосферы и океана, 20, № 5, 2007, С.438-442.
12. Екимова Н.В. Числа хромосом и кариотипы некоторых видов семейства Polygonaceae / Н.В. Екимова, Ю.А. Хроленко, Е.Н. Муратова, П.П. Силкин // Бот. журн. - 2009. - Т. 94. - №. 2. - С. 148-153.
13. Кузьмин С.Р. Плотность устьиц хвои сосны обыкновенной в географических культурах Приангарья / С.Р. Кузьмин, Е.А. Ваганов, Н.А.
Кузьмина, Л.И. Милютин, П.П. Силкин // Лесоведение. -2009.-№2.-С.35-40.
14. Силкин П.П., Кирдянов А.В. Влияние климатических факторов на накопление массы клеточными стенками трахеид в годичных кольцах лиственницы // Материалы III Международного симпозиума Строение, свойства и качество древесины - 2000 в Петрозаводске.-2000.-С.89-92.
15. Silkin P.P., Nesvetailo V.D., Vaganov E.A., Hughes M.K. The Tunguska event in 1908: Evidence from tree-ring anatomy // International Conference on the Future of Dendrochronology УTree Rings and PeopleФ. Davos, Switzerland.-2001.-P.202203.
16. Силкин П.П. Влияние тунгусского события 1908 года на структуру годичных колец деревьев // Материалы конференции молодых ученых КН - СО РАН в Красноярске: ИВМ СО РАН.-2002.-С.43.
17. Силкин П.П. Измерение массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных // Материалы Всероссийского совещания Дендрохронология:
достижения и перспективы в Красноярске.-2003.-С.30-31.
18. Силкин П.П. Метод измерения массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных. Оценка работоспособности метода // Материалы III Конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву в Новосибирске.2003.-С.129-133.
19. Силкин П.П. Влияние химического состава и толщины клеточной стенки на её рентгенографическую плотность // Материалы IV Конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву в Новосибирске.-2004.С.122-124.
20. Силкин П.П. Метод измерения массы и плотности клеточных стенок трахеид хвойных. Оценка работоспособности метода // Сборник научных статей, посвящённый памяти академика РАН В.Е.Зуева Современные достижения в исследованиях окружающей среды и экологии. Томск. - 2004.-С.241-246.
21. Екимова Н.В. Кариотип абрикоса сибирского Armeniaca sibirica (L.) Lam.
(Rosaceae) / Н.В. Екимова, Е.Н. Муратова, П.П. Силкин // Turczaninovia. - 2004. - № 3. - С. 96-100.
22. Силкин П.П., Ваганов.Е.А. Корреляция основных дендрохронологических параметров годичных колец с колебанием общего содержания озона в стратосфере // Биоиндикация стратосферного озона / под общей ред. В.В.
Зуева; Рос. Акад. наук, Сиб. отд-ние, Ин-т оптики атмосферы [и др.] - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2006. - 228 с. - (Интеграционные проекты СО РАН; вып.10).
23. Силкин П.П. Связь хронологий клеточных параметров годичных колец хвойных с колебанием общего содержания озона в стратосфере // Биоиндикация стратосферного озона / под общей ред. В.В. Зуева; Рос. Акад.
наук, Сиб. отд-ние, Ин-т оптики атмосферы [и др.] - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2006. - 228 с. - (Интеграционные проекты СО РАН; вып.10).
24. Кирдянов А.В., Силкин П.П., Кнорре А.А., Шишов В.В., Панюшкина И.П., Ваганов Е.А. 2007. Преимущества и перспективы многопараметрического подхода в дендроэкологии. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием Новые методы в дендроэкологии, Иркутск, 10-13сентября, с. 34-35.
25. Силкин П.П., Шапоренко А.Д., Кирдянов А.В., Брешко И.В. Связь содержания кальция с плотностью годичных колец древесины ели сибирской в Западной Сибири. Материалы Всероссийской конференции, посвящённой 50-летию Сибирского отделения РАН Дендроэкология и лесоведение, Красноярск, 2-4 октября 2007, С.132-134.
26. Силкин П.П., Шапоренко А.Д. Екимова Н.В. Связь концентрации кальция с характеристиками структуры годичных колец древесины ели и лиственницы / Информационные и математические технологии в науке и управлении.
Труды XIII Байкальской Всероссийской конф. Часть II. Иркутск, 2008. - С.
66-71.
27. Силкин П.П. Анализ микроструктуры и химического состава годичных колец в дендрологических исследованиях / П.П. Силкин // Проблемы современной дендрологии: м-лы. междунар. конф. посв. 100-летию со дня рождения член-корр. АН СССР П.И. Лапина. - М. - 2009. - С. 645-651.