Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ПЕТРОВ

еонид Николаевич

Микроэкологические и биотехнологические основы

создания и эффективного применения новых

бактериальных пробиотических препаратов

03.02.03 Ц микробиология

03.01.06 Ц биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2011

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Федерального Медико-Биологического Агентства Российской Федерации

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор

Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Яковлева Елена Павловна

Доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

Доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич

Ведущая организация:

ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Роспотребнадзора

Защита состоится л  _________2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного

Совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН,

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова,12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан л  ________2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Нежинская Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Повышенный интерес к использованию бактериальных пробиотиков в клинической практике - ответ на вызов времени. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в мире от инфекционных заболеваний ежегодно умирают 16-18 млн. человек (Лобзин Ю.В., 2006, Онищенко Г.Г.,2008). На первом месте стоят острые респираторные и кишечные заболевания различной этиологии, в том числе эндогенные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, входящими в составы нормальных микробиоценозов человека. В этих случаях стандартные схемы лечения с использованием антибиотиков не всегда оказываются состоятельными, альтернативой являются препараты, нормализующие микробиоценозы - пробиотики (Шендеров Б.А., 2001). Внимание к пробиотикам также связано с тем, что практически при всех заболеваниях у пациентов наблюдаются дисбактериозы, что объяснимо с позиций медицинской микробной экологии (ММЭ). Так, показано, что одной из причин возникновения не только инфекционных, но и соматических заболеваний человека, являются нарушения микроэкологического их статуса (Уголев А.М. 1991, Шендеров Б.А. 1998, 2000, 2001, Morgan D. 2002, OТHara, F.Shanahan 2006, Бондаренко В.М. 2007, Ткаченко Е.И., Суворов А.Н. 2007, 2009). Следовательно, для повышения результативности лечебного процесса и придания ему каузального характера, в терапевтические схемы включают бактериальные пробиотики. Но положительный результат наблюдают не всегда (Sullivan A., Nord C.E., 2005). Такое положение можно объяснить отсутствием научно-обоснованных критериев выбора, как препарата, так и его формы применения, адекватных заболеванию пациента, т. е. выбор пробиотика носит случайный характер, в то время как использование препаратов на основе живых микроорганизмов имеет определенную специфику, которую необходимо учитывать практикующим врачам.

При приеме пробиотика входящие в его состав бактерии вступают во взаимодействие со сложной системой макроорганизм-микробиота, которая включает всю совокупность микробиоценозов макроорганизма. Характер этих взаимодействий зависит от штаммов пробиотика, формы препарата, способов его введения, характера заболевания пациента, остроты течения процесса и ряда других причин. Учесть особенности этих взаимодействий можно, имея модель механизма пробиотического действия, которая выявит свойства бактериальных препаратов, предопределяющие их терапевтическую эффективность. Построить молекулярную или молекулярно-клеточную модель такого механизма на современном уровне не представляется возможным из-за сложности взаимодействующих систем. Однако вполне реально построить феноменологическую модель, основанную на анализе экспериментального материала в области популяционной микробиологии чистых и смешанных культур, микробной экологии, структурно-функциональных иммунологических особенностей эпителия слизистых покровов и микробной биотехнологии.

Безусловно, разработка модели пробиотического действия бактериальных препаратов, описывающей механизм восстановления нарушенных микробиоценозов, относится к актуальным задачам медицинской микробной экологии. Такая модель необходима и для разработки критериев выбора бактериального пробиотика в клинической практике и, следовательно, для повышения терапевтической эффективности их использования в лечении заболеваний человека.

В технологии бактериальных препаратов обсуждаемая модель нужна в качестве теоретической основы для целенаправленных разработок новых высокоэффективных пробиотиков для профилактической и клинической медицины.

Настоящая работа выполнена в рамках ряда научно-технических программ, в том числе: федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения по государственному контракту № ГНТД/ГК-055 от 14.01.2000г.; по государственным контрактам № 43.600.14.0055 от 27.01.2003г., № 43.600.11.10484.4 от 18.03.2004г.; программы Интеграция; по государственному контракту № 40.003.06.0 от 29.12.2005г. Разработка иммунобиотиков для повышения эффективности вакцинных препаратов и по космическим проектам РКК Энергия - Биоэмульсия и Лактолен (2006-2009 гг.)

Цель работы - Разработка основ повышения эффективности применения бактериальных пробиотиков и биотехнологических подходов к созданию новых препаратов для профилактической и клинической медицины.

Поставленная цель предполагает решение следующих основных задач:

- разработать модель пробиотического действия бактериальных препаратов, которая позволяет описать механизм их влияния на измененные микробиоценозы и иммунную систему слизистых;

- обосновать подходы к созданию новых, востребованных медициной бактериальных пробиотических препаратов;

- разработать технологию получения пробиотика с оптимальным составом штаммов, провести полный цикл доклинических исследований пробиотика, получить разрешение на использование и организовать его выпуск;

- сформулировать критерии выбора бактериальных пробиотиков и их форм применения в профилактике и лечении ряда заболеваний (ОРЗ, ОКИ, хеликобактериозов и др.);

- оценить эффективность использования разработанного пробиотика Витафлоро и сформулированных критериев выбора пробиотика и различных его форм в клинических испытаниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Эффективность модели пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает особенности взаимодействия пробиотических штаммов и их метаболитов с микробиоценозами и местной лимфоидной тканью слизистых покровов.
  2. Оригинальность технологии получения бактериального пробиотика на основе симбиотической системы штаммов.
  3. Технологии получения различных форм Симбиотического комплекса ацидофильных бактерий Витафлоро и результаты полного цикла их доклинических исследований.
  4. Алгоритмы выбора бактериального пробиотика для решения терапевтических задач и положительные результаты их использования в клинической практике.

Научная новизна работы. Впервые разработана феноменологическая модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает их влияние на состав измененных микробиоценозов пациентов и местную лимфоидную ткань слизистых поверхностей.

Впервые предложено в качестве активного начала бактериальных препаратов использовать симбиотические системы пробиотических штаммов. Благодаря симбиозу пробиотический потенциал штаммов значительно возрастает, при этом переход бактериального штамма препарата в состояние активного метаболизма меньше зависит от особенностей энтеральных сред пациента и осуществляется в укороченные сроки.

Впервые сформулированы алгоритмы выбора пробиотика для решения терапевтических задач, эффективность использования которых подтверждена клиническими данными.

Научно-практическое значение работы. Сформулированные алгоритмы выбора пробиотиков изложены в пособии для врачей Теоретические предпосылки и практика клинического применения пробиотика Витафлор в педиатрии (издательство Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, 2004), в методических рекомендациях Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения острых кишечных инфекций (издательство ВМА, Санкт-Петербург, 2009).

Модель позволила показать преимущества использования симбиотической композиции пробиотических штаммов в качестве активного начала препаратов. На основе подобранной симбиотической бикультуры Lactobacillus acidophilus (штаммы Д №75 и Д №76) разработан новый пробиотик Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий Витафлоро, производство которого организовано в 1997 году на базе ФГУП Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА РФ в различных формах и зарегистрированного как БАД.

Научная и практическая значимость полученных результатов подтверждена патентами России на способы получения пробиотика и лечения ряда заболеваний. Как продукт современной биотехнологии, обладающий высокими целевыми характеристиками, Витафлоро  награжден Дипломом IV международной выставки-конгресса Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (1999) и большой золотой медалью международного фонда биотехнологии им. академика И.Н.Блохиной (2004).

Решением Президиума Российской Академии Естественных Наук за разработку и выпуск препарата Витафлоро институт награжден Почетной золотой медалью И.И.Мечникова За практический вклад в укрепление здоровья нации (2002).

Материалы диссертации использованы в курсе лекций Бактериальные технологии медицинского и технического назначения кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института.

ичный вклад автора в проведенные исследования. Работа выполнена на базе ФГУП Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов Федерального Медико-Биологического Агентства России (1989 - 2009). Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Автором разработана концепция эффективного применения бактериальных пробиотиков в терапевтической практике, включающая модель механизма их пробиотического действия, алгоритмы выбора пробиотика и используемой формы, а также сформулированы требования к новым пробиотикам. Под руководством диссертанта разработана технология и организовано производство пробиотика Витафлоро. В большом объеме работы участие принимали сотрудники института к.б.н. Вербицкая Н.Б., д.б.н. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., к.т.н. Кобатов А.И., д.м.н., профессор Добрица В.П., д.м.н., профессор Симбирцев А.С., к.м.н. Пигарева Н.В., к.м.н. Петров А.В.. Полученные результаты опубликованы, доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу авторов. Соискатель выражает своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы обсуждались в виде пленарных докладов на следующих международных, всесоюзных и всероссийских конференциях и симпозиумах: International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991; International Conference "Biotechnology St. Petersburg 94", St. Petersburg, 1994; Всесоюзная научно-практическая конференция "Дисбактериоз и эубиотики", Москва, 1996; Российская научная конференция Современная микробиология. Состояние, достижения и перспективы, Санкт-Петербург, 1998; Международная конференция Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека, Москва, 1999; Международная научно-практическая конференция памяти Г.И.Гончаровой Пробиотические микроорганизмы - современное состояние и перспективы использования, Москва, 2002; 5 Российский съезд врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург., 2003; 6, 7, 8, 9, 10 Славяно-Балтийский научный форум Санкт-Петербург - Гастро - 2004, -2005, -2006, -2007, -2008; Международная конференция Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы - Москва, 2004; Донозология - 2007 Проблемы диагностики и коррекции эндоэкологического статуса в современных условиях, Санкт-Петербург, 2007; Объединительный иммунологический форум, Санкт-Петербург, 2008; Вакцинология 08, Москва, 2008; 6-ая Международная Германо-Российская конференция Форума КохЦМечников, Санкт-Петербург, 2008, Family Health in the XX1 Century, 29 April - 7 May, Eilat, Israel, 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 работы, из них одна монография, два методических пособия для врачей, 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК, 13 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, включающего 3 части, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 175 источников, в том числе 100 на русском и 75 на иностранных языках. Работа содержит 24 таблицы и 20 рисунков. Общий объем работы 260 страницы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы проведен анализ основных положений микробной медицинской экологии, устойчивости микроэкологических равновесий и последствиям их нарушений, классификация бактериальных пробиотиков, биотехнологические особенности их получения и некоторые элементы механизма их влияния на микроэкологический статус макроорганизма.

Объекты, материалы и методы исследования Объектами служили:

- производственные штаммы различных пробиотиков - Lactobacillus acidophilus Д№75, Lactobacillus acidophilus Д№76, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus АТСС 21815, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90T-C4, Lactobacillus acidophilus 12б, Escherichia coli М-17, Bifidobacterium adolescentis МС-4;

- музейные штаммы патогенных и УПМ (из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва - 8 штаммов; из коллекции ГУП НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи , Москва - 43 штамма; из коллекции ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России - 12 штаммов).

-  клинические изоляты (54), полученные из клинических лабораторий Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, ВМедА, ДГБ №1, НИИДИ, Областной клинической больницы, С.-Петербург, Инфекционной больницы им. С.П.Боткина, С.-Петербург.

Культуры хранили в сублимированном или криоконсервированном виде.

актобациллы выращивали в жидких (обезжиренное молоко, ГМС, МРС-1) и на плотных (МРС-4, МРС-5) средах. Бифидобактерии выращивали на среде Блаурока (ФС 42-3947-00 на Бифидумбактерин). E. coli K-12 и E. coli K-165 выращивали на среде NBE (Serva, США) с глюкозой (3 г/л); S. marcescens - на МПБ; S.аenteritidis - на среде М-9 с 0,5 г/л глюкозы и 12 мл/л АПБ. Остальные бактерии культивировали на Standart 1 (Nutrient Broth и Standart Nutrient Agar, Serva, США). Дрожжи выращивали на стандартной среде ГРМ № 2 (ФС 42-0054-00 на Лактобактерин). Среды стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 0,5 атм. в течение 30 мин.

Спектры мутности регистрировали на 2-5 длинах волн в диапазоне 460-620 нм (СФ-46 с диафрагмой для уменьшения малоуглового рассеяния). Диаметр колоний измеряли при помощи программы "ВидеоТесТ-Морфо 3.2".

Соотношение штаммов L. acidophilus Д №75 и Д №76 в структуре популяции Витафлоро определяли по оригинальной методике. На 5-10 чашек со средой МРС-5 наносили по 0,1 мл бактериальной суспензии, содержащей 200-500 КОЕ/мл, растирали шпателем и инкубировали при 37оС в течение 48 часов. После этого каждую индивидуальную колонию с чашек переносили в стерильное обезжиренное молоко, предварительно разлитое в полистироловые 96-ячеечные планшеты. Исследованию подвергали не менее 200 колоний, контролем служили рабочие культуры производственных штаммов. Посевы культивировали 18-20 часов при 37оС, после чего охлаждали 2-3 часа при 4-6оС. Штаммы дифференцировали по характеру сгустка в молоке.

Антагонистическую активность лактобацилл определяли стандартным методом перпендикулярных штрихов на среде МРС-5. Учет результатов производили по величине зоны задержки антагонистом роста тест-культур (мм). Кислотообразование лактобацилл определяли титриметрическим методом. Активности стимуляторов роста определяли по способности инициировать рост E.coli M-17 при низких (50-50000 кл/мл) плотностях засева и по изменению скорости роста культур.

Хроматографию ФНМ проводили на сефадексах G-10, G-25 и TSK-геле HW-40. Градиентную гидрофобную хроматографию осуществляли на колонке "Labar" (241 см). Для ионообменной хроматографии использовали сорбенты Dowex AG, 50W2 и Dowex 12. Препаративную хроматографию среднего давления и хроматографию высокого давления проводили на колонках с обращенной фазой (Partisil 10 ODS-3, Whatman, 8250 мм, хроматограф Hewlett Packard HP 1090) в воде с градиентом ацетонитрила.

Спектры 1Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker CXP 300 (100-300 накоплений) в D2O. УФ-спектры - на спектрофотометре Hitachi-330, масс-спектры - на приборе ММ 7070 HS (VG) в режиме FAB MS с ионизацией атомами аргона (8 кВ). Для аминокислотного анализа использовали AccQЦTag Method анализа флуоресцирующих производных и метод анализа DABS-производных аминокислот. Разделение осуществляли на приборе HP 1090 (колонка Waters Delta Pak (Millipore) 3,9×150 мм с октадецилсиликагелем).

В иммунологические исследования брали мышей линий (CBA C57BL/6) F1 весом 18-20 г, полученных из питомника Рапполово. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20-220 С и 12 часовом световом режиме, со свободным доступом к воде. Витафлоро и плацебо в различных дозах вводили мышам per os (по 0,2 мл) в течение 5 или 10 дней (растворитель - дистиллированная вода). За 5 суток до последнего введения пробиотика животных иммунизировали эритроцитами барана (2106 кл./мышь, внутривенно) или овальбумином (20 мкг/мышь, внутрибрюшинно). Через 3 суток мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации, получали сыворотку крови, лаваж перитонеальной полости, клетки тимуса и селезенки. Изучали лейкоцитоз, формулу крови, фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении пекарских дрожжей, реакцию бласттрансформации тимоцитов и спленоцитов с использованием конканавалина А (КонА). Интенсивность пролиферации определяли по включению 3Н-тимидина, используя жидкостный сцинтилляционный счетчик Rackbeta 1217 (Wallac). Продукцию  ИЛ-2 спленоцитами мышей, стимулированную КонА, определяли с помощью ИЛ-2-зависимой клеточной линии CTLL-2 (Gillis S. et al., 1982). Количество антителообразующих клеток определяли в селезенке (Cunningham A.J., Szenberg A., 1968), а титр антител - в сыворотке крови (Рекомендации по доклиническим исследованиям, 2000).

Токсикологические исследования проведены на белых беспородных крысах, мышах и собаках обоего пола, которые получали пробиотик в широком интервале доз. Исследовали: ректальную температуру, вес тела, потребление воды и пищи, состояние слизистых оболочек глаз по анализу роговичных рефлексов, величине зрачка и ширине глазной щели, физиологические показатели (спонтанная двигательная активность - тест лоткрытое поле, суммационной способности ЦНС, электрокардиографию, измерение систолического артериального давления), нагрузочные пробы с феноловым красным (тестирование секреторной функции почек) и гексеналовая проба (тестирование антитоксической функции печени) до начала введения пробиотика, на 30-й и 90-й день. Исследования включали гематологические характеристики, биохимию сыворотки крови, коагулограмму, анализ мочи и кала. Патоморфологическое исследование (некропсия, макроскопия, взвешивание и гистологическое исследование внутренних органов) проведено у всех животных в конце исследования.

Фармакологическая активность Витафлора в дозах 20 мкг/кг оценивалась с использованием моделей резерпинового язвенного поражения кишечника (резерпин в дозе 2 мкг/кг вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 3 дней) и дисбактериоза при свинцовой интоксикации (ацетат свинца в дозе 0,3 мг/кг вводили крысам внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 2 месяцев). В первом случае проводили макроскопический анализ слизистой кишечника и оценивали общее состояние животных (поведенческие реакции, массу тела, потребление пищи, состояние волосяного покрова), во втором Ц  исследовали микрофлору кала.

Процесс получения сухой формы симбиотического пробиотика Витафлор проводили на сублимационной установке ТГ-50 (Хох вакуум, Германия). Оптимизировали условия хранения и реактивации производственных штаммов; состав среды и условия культивирования, состав защитной среды, концентрации антиоксиданта, температуру, при которой осуществляется приготовление, время эквилибрации; режим сублимационного высушивания, условия предварительного замораживания, и последующего досушивания, получение конечной формы препарата. Контроль различных форм пробиотика осуществляли в соответствии с разработанными требованиями ТУ9197-003-00479741-06.

Все экспериментальные данные обрабатывали статистически, используя параметрические и непараметрические критерии достоверности. Повторность всех экспериментов составляла не менее 3-х раз.

Результаты исследования и их обсуждение. На резерпиновой модели язвенной болезни у крыс показана роль нативных бактериальных клеток Витафлор и их метаболитов в проявлении лечебного действия пробиотика. Установлено, что наиболее эффективным является препарат, содержащий жизнеспособные бактериальные клетки пробиотика, фильтрат культуральной жидкости, включающий весь спектр метаболитов, и Актофлор-С - синтетический аналог фракции низкомолекулярных метаболитов оказались менее активными, по сравнению  с Витафлором (рис.1). В группе контроля (крысы не получали пробиотик) животные становились вялыми, отказывались от пищи, масса их тела к 7 суткам составляла 65% от массы тела интактных животных. На 3 сутки при макроскопическом исследовании слизистой кишечника отмечались гиперемия, иногда синюшность, отек и нарушение нормального расположения желудочных складок и кишечных крипт. Дефекты слизистой, вызванные резерпином, были овальной формы и располагались в железистой части по верхушкам складок или между ними. Наиболее значительные нарушения слизистой кишечника наблюдались на 7 сутки (слизистая гиперемирована, покрыта сгустками крови, складки ее сглажены; на железистой части - язвенные дефекты в количестве 44±3 диаметром от 2 до 5 мм). К 20 суткам у трети крыс отмечалось восстановление слизистой, у остальных наблюдались язвы диаметром 1 мм (среднее их число 10±2).

Рис.1. Количество резерпиновых язвенных дефектов в кишечнике крыс, получавшим Витафлор, фильтрат культуральной жидкости или Актофлор-С.

Состояние животных значительно улучшалось при лечении резерпиновых язв Витафлором: масса их тела прогрессивно нарастала (на 20 сутки она была на 30% выше, чем в контроле). На 3 и 7 сутки по данным макроскопии слизистая кишечника имела характерные повреждения, возникающие после введения резерпина, но уменьшалась тяжесть поражения: число язвенных дефектов на 3 сутки составляло 5±1 и на 7 сутки 3±1. К 10 суткам у большинства крыс слизистая желудка не имела видимых изменений. Назначение фильтрата бактериального препарата или Актофлора-С приводило к снижению  средней массы тела крыс на 7 сутки лечения (150±5 г), однако к 20 суткам прибавка массы была на 15 % выше, чем у контрольных животных. Макроскопические характеристики слизистой аналогичны контролю, но резко отличались по степени выраженности поражений (среднее число деструкций на 3 сутки равнялось 14±2, а на 7 сутки - 10±2). Однако, несмотря на резкое уменьшение числа деструкций, ускорения заживления язв не наступало. На 20 сутки у половины животных слизистая оставалась гиперемированной.

Таким образом, положительное влияние на макроорганизм в большей степени оказывают жизнеспособные бактериальные клетки препарата. При этом в реализации эффекта пробиотиков значительную  роль играют продукты метаболизма производственного штамма и действие, в основном, связано с низкомолекулярной их фракцией. Поэтому при описании механизма влияния бактериальных пробиотиков на макроорганизм, необходимо учитывать взаимодействия как бактериальных клеток препарата, так и их метаболитов с эпителием слизистой, микробиоценозами и с местной лимфоидной тканью. Замещение микроорганизмов в составах микробиоценозов на штамм препарата при приеме пробиотика маловероятно.

При приеме пробиотика бактериальные клетки препарата во внутренних средах организма переходят из анабиоза в стадию активного метаболизма. Следовательно, в модели пробиотического действия обсуждаемых препаратов взаимодействия можно рассмотреть в отдельности на трех уровнях: на процесс восстановления составов нормальных микробиоценозов метаболитами пробиотика, на иммуномодуляцию местной лимфоидной ткани слизистых бактериальными клетками пробиотика и их метаболитами и на нейромодуляцию метаболитами пробиотика.

Для понимания механизмов восстановления составов микробиоценозов под действием метаболитов бактериального пробиотика  были выделены и охарактеризованы современными физико-химическими и микробиологическими методами метаболиты, накапливающиеся в среде при культивировании или при голодании пробиотической культуры E. coli M-17. Наибольший интерес представляла низкомолекулярная их фракция (ФНМ), выделенная ультрафильтрацией (молекулярная масса менее 1500 Д). Анализ её состава с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, двумерной тонкослойной хроматографии, масс-спектрометрии, спектральных и резонансных методов показал, что она состоит из соединений различной природы (табл.1) и отличается выраженной биологической активностью. При добавлении в определенных концентрациях ФНМ в среду культивирования продуцента или других бактерий наблюдается сокращение лаг-фазы и повышение скорости роста (табл.2). Высокие концентрации ФНМ действовали противоположным образом, то есть подавляли рост бактерий. Соответствующие зависимости доза - эффект имели вид кривых с выраженным максимумом, что свидетельствует о регуляторном характере воздействия. Надо отметить, что реакции бактериальных культур на добавление в среду роста ФНМ характеризуются специфичностью (табл. 2). Максимальные значения стимуляции роста культур при низких концентрациях ФНМ наблюдали в экспериментах со штаммом-продуцентом метаболитов, несколько меньшие значения - с родственными микроорганизмами и еще более низкие - с видами бактерий, не характерными для составов микробиоценозов, в которые обычно входит продуцент. В опытах с E.coli M-17 это касается, например, бактерий Salmonella enteritidis и Serratia marcescens. Высокие дозы ФНМ, напротив, прежде подавляли рост других штаммов, а затем и собственно продуцента. При изучении роста бактериальных клеток в смешанных культурах пробиотических и других (патогенных или условно патогенных) штаммов показано, что добавление ФНМ приводит к увеличению

Таблица 1. Состав ФНМ в культуральной среде E.coli M-17

Метод анализа

Компонент

Концентрация, мМ

Рост

Голодание

1Н-ЯМР

Ацетат

13,50

0,88

Формиат

3,50

0,7

актат

4,80

0,20

Сукцинат

0,37

1,02

Аланин

0,27

0,22

Валин

0,64

0,15

Аминокислотный анализ

Глутамат

0,14

0,11

Глицин

0,16

0,27

Метионин

0,03

0,02

Изолейцин

0,05

0,07

ейцин

0,02

0,12

Фенилаланин

0,01

0,05

Аспартат

0,06

0,09

Треонин

0,16

0,06

Серин

0,36

0,05

Гистидин

0,06

0,01

Аргинин

-

0,01

Цистеин

-

0,01

изин

0,02

0,04

УФ

Нуклеотиды

0,10

0,17

Флуоресценция

фолиевая к-та

2,2610-3

3,1210-4

Триптофан

9,7810-7

1,3010-6

Рибофлавин

1,7610-6

4,7910-7

Примечание. Погрешности при определении состава зависели от метода анализа, но не превышали 20% от измеряемой величины.

процентного содержания клеток пробиотика и подавлению роста бактерий-конкурентов, то есть происходит вытеснение последних. Такое действие ФНМ объясняется тем, что состав входящих в нее карбоновых кислот оказался близок к составу кислот, выделяемых совокупностью других представителей нормофлоры (лактобацилл, бифидобактерии, бактероидов и др.), и составу соответствующих кислот в энтеральных средах кишечника человека. В последнем случае, однако, присутствуют некоторые компоненты, не содержащиеся в ФНМ E. coli M-17 (например, масляная кислота).

Таблица 2. Влияние ФНМ на рост чистых культур микроорганизмов

Концентрация ФНМ, мг/мл

Индексы стимуляции (ИС)

E.coli M-17

E.coli K-12

S.enteritidis

S.marcescens

B.adolescentis

0 (контроль)

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

0,125

3,40,3

2,70,3

1,70,3

Ч

1,00,1

0,25

5,60,5

3,90,4

2,00,2

2,40,2

Ч

0,5

5,80,5

4,00,4

2,50,3

2,70,3

2,00,2

1,0

5,70,5

2,60,3

1,30,2

1,10,2

5,01,0

2,0

4,20,4

0,90,5

0,80,05

0,750,05

11,02,0

Примечание. Индекс стимуляции определялся как отношение приростов биомассы за контрольный срок в культурах с добавлением и без добавления ФНМ

Добавление ФНМ в определенных концентрациях благоприятствует развитию пробиотических штаммов и повышает их антагонистическую активность по отношению к штаммам-конкурентам. Таким образом, восстановление нормального состава микробиоценозов пробиотиками можно представить так: при энтеральном приеме пробиотика бактериальные клетки препарата попадают во внутренние среды, обеспечивающие их развитие и выделение метаболитов, которые способствуют увеличению численности резидентной микрофлоры, близкой по своему экологическому статусу штамму пробиотика. В результате резидентная бифидо- и лактофлора в составе измененных биоценозов под действием низкомолекулярных метаболитов пробиотика переходит в интенсивную фазу развития и, имея селективные преимущества, снижает численность УПМ до физиологической нормы.

Этому эффекту способствует наличие муцинового слоя, который представляет диффузионный барьер для высокомолекулярных соединений и прозрачен для биологически активных низкомолекулярных продуктов. Высказанное предположение косвенно подтверждается тем, что созданный нами синтетический препарат Актофлор-С - аналог фракции низкомолекулярных метаболитов по содержанию компонентов и их взаимному соотношению, проявляет свойства, характерные для пробиотиков, как в серии доклинических экспериментов (рис.1), так и в клинических исследованиях. В восстановлении составов микробиоценозов участвуют и продукты жизнедеятельности пробиотического штамма, ответственные за его антагонизм к другим микроорганизмам. Чрезвычайно важно наличие антагонизма пробиотика к конкретному возбудителю заболевания и отсутствие его к. полезной микрофлоре пациента, а последняя не подавляет активность штамма препарата. Эти принципиальные для реализации пробиотического эффекта данные могут быть получены стандартными методами в условиях клинических лабораторий.

Второй уровень механизма пробиотического действия бактериальных препаратов рассмотрен, опираясь на появившиеся публикации. В иммуномодуляции местной лимфоидной ткани участвуют как микробные метаболиты, способные индуцировать синтез дефенсинов клетками Панета и синтез интерлейкина-8 (IL8) в эпителеоцитах, так и нативные бактериальные клетки, которые непосредственно взаимодействуют с MALT (Hart A.L., 2004, Sansonetti P. 2004, D. Kelly et al., 2005, OТHara and F.Shanahan, 2006). Влияние бактерий пробиотика носит штаммовый характер, что является аргументом в пользу необходимости выбора пробиотика. Во всех случаях, учитывая, что захват из полости клеток пробиотика дендритными или М-клетками осуществляется пассивно, для наблюдения иммуномодулирующего эффекта, необходимо создание высокой плотности клеток препарата на участке слизистой (которая может создаваться при использовании подходящей формы пробиотика).

И, наконец, третий уровень механизма влияния бактериальных пробиотиков на макроорганизм, т.е. осуществление нейромодуляции, практически не исследован. Значение обсуждаемого эффекта предстоит понять и оценить в будущем, однако среди метаболитов пробиотиков (табл.1) присутствуют соединения, которые относятся к нейромодуляторам. Схематично модель представлена на рис.2.

Рис. 2. Схематическое представление феноменологической модели пробиотического действия бактериальных препаратов (МАЛТ- мукозоассоциированная лимфоидная ткань, МК, ДК, КП и ЭК - М-, дендритные, Панета и эпителиальные клетки; НМ и ВМ - низко и высокомолекулярные метаболиты, Д- дефенсины, ИЛ-8 - интерлейкин 8.

Модель пробиотического действия бактериальных препаратов использована для обоснования нового  направление в создании пробиотиков повышенного терапевтического потенциала. Согласно модели положительный эффект наблюдается при переходе бактериального штамма в энтеральных средах пациента из анабиоза в состояние активного метаболизма. При этом очевидно, что внутренние среды пациента, состав которых зависит от характера заболевания, тяжести его течения и индивидуальных особенностей, могут не подходить для развития пробиотического штамма. Именно по этой причине моноштаммовые пробиотики часто не эффективны. Свои недостатки имеют и полиштаммовые пробиотики. Согласно закономерностям экологии, у бактерий, развивающихся в пределах одной экологической ниши, возникает конкуренция за ресурсы внешней среды (Громов Б.В., Павленко Г.В, 1989). В результате в полиштаммовых пробиотиках активность штаммов направлена на реализацию конкурентных отношений друг с другом. При этом неясно, какой из штаммов будет доминировать в организме конкретного пациента, следствием чего является поливариантность терапевтического действия препарата.

Перечисленных недостатков лишена симбиотическая культура микроорганизмов мутуалистического типа, т.е. сообщество штаммов, взаимно полезных друг другу (Пиневич А.В., 2009). Как следствие пробиотические характеристики штаммов (жизнеспособность, уровни и спектр антагонизма, устойчивость к антибиотикам и т.д.) возрастают, а система в целом приобретает повышенный адаптационный потенциал к неблагоприятным факторам среды обитания (Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н., 2001), в том числе и к условиям реактивации. Это означает, что помимо прочих преимуществ, полезные свойства пробиотика на основе симбиотических культур меньше зависят от индивидуальных особенностей макроорганизма.

Искусственная симбиотическая система, основа нового пробиотика, создана на основе первичного скрининга штаммов ацидофильных лактобацилл (L.acidophilus), выделенных от здоровых детей первого года жизни. Использование штаммов, полученных от детей, было продиктовано желанием получить пробиотик, не проявляющий антагонизм к нормальной микрофлоре человека. Далее методом подбора количества и соотношения штаммов при засеве получали полиштаммовые культуры и изучали их биологические, пробиотические и технологические свойства. В итоге получена бикультура L.acidophilus с экспериментально подтвержденными эффектами синтрофии и синергизма ряда свойств (титр, уровень и спектр антагонизма, устойчивость к антибиотикам и технологическим стрессам) (патент 2170023 РФ, 1997) и на её основе разработана технология получения нового пробиотика Витафлоро.

Принципиальным требованием к симбиотической культуре, используемой в качестве основы пробиотика, является её стабильность. Показано, что структура популяции Витафлор сохраняется на протяжении значительного числа генераций (табл.3) и мало меняется на стадиях выращивания и получения сухого пробиотика (табл.4). При использовании сублимированного пробиотика в качестве инокулята, двухштаммовая формула сохраняется (табл.5) в широком диапазоне величин засева. Представленные данные свидетельствуют об устойчивости симбиоза штаммов Витафлоро.

Таблица 3. Структура популяции симбиотической культуры Витафлоро в зависимости от числа генераций

Процентное

содержание

Штамма

Число генераций (n)

0

5

15

25

Д-75

314

294

355

406

Д-76

694

714

655

606

Таблица 4. Структура популяции симбиотической культуры Витафлоро на стадии производства.

Штамм

L. acidophilus

Процентное содержание штамма

инокулят

производственная культура

сухой препарат

Д №75

334

255

255

Д №76

665

745

745

Таблица 5. Структура популяции лактобацилл в зависимости от величины засева сублимированным пробиотиком Витафлоро

Процентное содержание штамма

Инокулят (регидратированный препарат)

Величина засева

1 %

(5х106 КОЕ/мл)

0,1 %

(5х105 КОЕ/мл)

0,01 %

(5х104 КОЕ/мл)

Д-75

254

445

605

697

Д-76

754

565

405

317

Штаммы симбиотической культуры Витафлоро идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам. Свойства как моноштаммов, так и симбиотической культуры (уровни и спектр антагонистической активности в отношении стандартных референс-культур S. flexneri 331, S. flexneri 170,E. coli 0157, S. sonnае 5063, P. vulgaris 177, S. aureus 209, рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича), удовлетворяют требованиям, предъявляемым к производственным штаммам пробиотиков. Витафлоро проявляет выраженный антагонизм к клиническим изолятам S. flexneri, H. pylori, E. coli, S. aureus, K. pneumonia, C. freundii, C. albicans. Анализ антибиотикограмм показал, что в случае разной устойчивости моноштаммов к антибиотику (тетрациклин, ванкомицин, нетилмицин, левомицетин) симбиотическая культура приобретает свойства наиболее устойчивого штамма, а при одинаковой устойчивости моноштаммов симбиотическая культура характеризуется тем же уровнем (офлоксацин, циплофлоксацин, амикацин, гентамицин, цефтазидим и др.). Штаммы по данным молекулярно-генетического анализа имеют хромосомную устойчивость к антибиотикам (не содержат плазмид).

Исследование острой и подострой токсичности различных форм Витафлорао при введении их per os крысам и собакам показали хорошую переносимость препарата и отсутствие токсического действия на организм, свидетельствуя о безвредности препарата даже в дозах  в сотни и тысячи раз превышающих максимальные терапевтические дозы (10 мг/кг). Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационный период острого отравления, а также данные некропсии позволяют отнести все формы Витафлорао к V классу нетоксичных лекарственных веществ.

На модели дисбактериоза у белых крыс, вызваном внутрижелудочным введением ацетата свинца, установлено, что Витафлоро оказывает нормализующее влияние на микрофлору кишечника.

Производство пробиотика Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий Витафлоро, зарегистрированного как БАД в следующих формах: лиофилизат биомассы в пенициллиновых флаконах, лингвальные таблетки и Витафлоро-сырье - порошок лиофилизированной биомассы (6 патентов РФ 1997-2002) организовано в 1997 году на базе ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России. Лиофилизат биомассы в пенициллиновых флаконах (23010 мг в 1 флаконе) содержит не менее 100 млн жизнеспособных клеток, аскорбиновую кислоту (витамин С), молоко сухое обезжиренное, сахарозу, желатин пищевой, автолизат пекарских дрожжей, лукаротин (-каротин). Эту форму применяют в виде водной суспензии перорально, интраназально, интравагинально, ректально (в виде микроклизм), а также местно.

Инновационной формой являются пористые быстрорастворимые (лингвальные) таблетки, полученные методом сублимационного формования (ПМ №а14514 РФ, патент №2169574 РФ), характеризующиеся высокоразвитой поверхностью (объем пор составляет более 50% объема таблетки) (рис.3).

  Рис.3 Сканаграмма скола лингвальной

  таблетки Витафлор

Форма Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий Витафлоро-сырье, предназначена для обогащения кисломолочных пищевых продуктов и производства биологически активных добавок. Кисломолочную форму Витафлоро получают ферментацией молока содержимым флакона, пористой таблеткой или порошка. Эта форма содержит высокий титр бактериальных клеток пробиотика в физиологически активном состоянии, с повышенной устойчивостью к действию агрессивных факторов среды. Витафлоро-сырье используется для изготовления суппозиториев, саше, капсул кишечного и желудочного растворения. Биологическая активность капсулы (масса - 35010 мг) составляет не менее 108 КОЕ. Основой суппозиториев служит  синтетический продукт витепсол (твердый раствор триглицеридов), биологическая активность суппозиториев  не менее  5 108 КОЕ.

Эффективность использования пробиотиков зависит от обоснованности выбора типа препарата и его формы применения в каждом клиническом случае.  Анализ модели пробиотического действия бактериальных препаратов позволяет сформулировать критерии выбора. Безусловно важным критерием выбора являются содержание жизнеспособных клеток в 1 дозе препарата. Этот критерии тесно связан с другим - возможностью перехода пробиотического штамма в состояние активного метаболизма в энтеральных средах пациента. Следующие критерии определяются спектром антагонистической активности штамма пробиотика. Так пробиотик должен проявлять выраженный  антагонизм к этиологическим агентам, вызвавшим заболевание или определяющим тяжесть его течения, одновременно необходима устойчивость к контрантагонизму этих агентов и биосовместимость пробиотика с нормальной микрофлорой пациента. И, безусловно, наличие иммуномодулирующей активности у пробиотика и информация о её особенностях, являющихся характеристикой штамма препарата, могут рассматриваться как критерии выбора.

Если о содержании (титре) в препарате жизнеспособных бактериальных клеток указываются производителем, то вероятность перехода штамма препарата в энтеральных средах пациента в состояние активного метаболизма может быть оценена из анализа свойств штамма, но  в первом приближении она пропорциональна титру. Преимущества по этим характеристикам имеют пробиотики на основе симбиотических композиций штаммов, т.е. Витафлор. Другие критерии, связанные с антагонизмом, имеют строгую штаммовую принадлежность и могут быть определены только в исследованиях in vitro в клинических лабораториях.

Критерии выбора, учитывающие влияние пробиотиков на иммунную систему, пока не могут быть сформулированы, так как отсутствуют сравнительные исследования различных пробиотиков на одних иммунологических моделях. Так установлено, что Витафлор увеличение содержания IgA в составе энтеральных сред и обладает адъювантными свойствами, усиливая действие  белковых (овальбумин) и корпускулярных (эритроциты барана) антигенов. Но, эта информация не означает, что аналогичными свойствами не обладают, или обладают другие пробиотики. Только после накопления сравнительного экспериментального материала можно будет сформулировать этот критерий. Вместе с тем, для наблюдения иммуномодуляции необходимо создание повышенной концентрации клеток пробиотика на участке слизистой путем использования соответствующей формы пробиотика. Этот пример показывает, что помимо выбора пробиотика по микробиологическим характеристикам, чрезвычайно важен выбор адекватной формы применения, позволяющей реализацию возможностей препарата. В зависимости от характера заболевания, его тяжести и задачи, решаемой врачом, форму применения пробиотика подбирают исходя из общих представлений, желаемом месте локализации пробиотика на слизистой и т.д. Пробиотики длительного срока хранения выпускают в следующих формах: лиофилизат биомассы во флаконах или ампулах, в капсулах, в ректальных или вагинальных суппозиториях, прессованных таблетках. В ряде клинических случаев эффективной формой является продукт на основе молока, ферментированного пробиотиком. Инновационной формой являются пористые таблетки лингвального применения.

Таким образом, алгоритм выбора пробиотика для конкретного клинического применения основан на анализе жизнеспособности содержащегося в его составе штамма, его пробиотических характеристик, определенных in vitro, а также подбора соответствующей формы препарата.

Так, в педиатрии остро стоит проблема подверженности детей частым простудным заболеваниям (от 2 до 11 раз в год), которые нередко сопровождаются аллергическими проявлениями и осложнениями со стороны ЛОР-органов. Заболевания проходят под диагнозом ОРВИ и стандартные схемы лечения (с использованием антибиотиков) не всегда оказываются состоятельными. При хроническом воспалительном процессе в носоглотке присутствуют стафилококки, стрептококки, аденовирусная инфекция, что поддерживает рецидивирующие воспалительные процессы. Хронизация носоглоточных болезней происходит на фоне местных и системных иммунодефицитов. Все это приводит к необходимости включения в терапевтические схемы пробиотиков. Выбор оптимального пробиотика для этих пациентов нами базировался на сравнительном анализе трех пробиотиков -Бифидумбактерина (B. bifidum №1), Лактобактерина (L. plantarum 8P-A3) и Витафлорао (L. аcidophilus Д№75 и Д№76). Определение спектра и уровня антагонистической активности производственных штаммов пробиотиков к стафилококкам (9 тест-культур), стрепто-, пепто-, микро- и криптококкам (5 тест-культур) и псевдомонадам (9 тест-культур) показали, что максимальным антагонизмом обладали штаммы Витафлорао, а минимальным - Бифидумбактерина. Поэтому, для клинического использования был выбран Витафлоро. Пробиотик применяли лингвально (в форме пористой таблетки) или интраназально в виде концентрированной водной суспензии. При этом способе применения создаются условия для непосредственного контакта штамма препарата с возбудителем инфекции, а высокие локальные концентрации бактериальных клеток повышают вероятность осуществления местной иммуномодуляции. Клинические исследования подтвердили обоснованность использования алгоритма выбора пробиотика и его формы. Так, у 45 детей в возрасте от 2 до 8 лет с рецидивирующими респираторными заболеваниям и аллергической энтеропатией проведен 3-х недельный курс Витафлорао на фоне стандартной терапии и отмечена положительная динамика. Повторные заболевания носоглотки стали редкими и возникали не чаще 1-2 раза в год, при этом течение болезни протекало без повышения температуры и были непродолжительными.

На представительной группе исследованных (450 волонтеров) показано, что доля назофарингиального носительства при интраназальном применении Витафлорао значительно снижается (табл.6). Одновременно с нормализацией микроэкологии происходит активация индукторного звена местного иммунитета. На фоне предварительного трехдневного интраназального применения суспензии Витафлоро значительно повышается эффективность гриппозной (Гриппол) и пневмококковой (Пневмо-23) вакцин. Заболеваемость пневмониями, острыми бронхитами и ОРЗ среди привитых двумя вакцинами - Грипполом и Пневмо-23 на фоне приема Витафлоро была в 2,9 и 2,5-4,1 раза ниже по сравнению с группой, не получавшей пробиотик. При этом возрастало количество специфических антител приблизительно на порядок, титр которых в течение 5 месяцев практически не менялся. Антитела при этом сохраняли повышенную аффинность и авидность. Важно отметить, что тяжесть клинического течения пневмоний у привитых лиц, получавших Витафлоро, значительно снижалась, и сократилось число трудопотерь (табл. 7).

Табл. 6 Влияние Витафлоро на уменьшение носительства патогенов

Вид возбудителя

Носоглоточное носительство по группам (%)

Индекс эффективности

Группа №1

(Витафлор + Гриппол)

Группа №2

(Витафлор + Гриппол

+ Пневмо 23)

Группа №3

(Гриппол)

- группа сравнения

№3/№1

№3/№2

S. pneumoniae

16,6

16,4

30,0

1,8

1,8

Н. influenzae

3,1

2,5

26,6

8,6

10,6

S.aureus

9,0

10,5

19,3

2,1

1,8

М. pneumoniae

6,4

5,5

8,3

1,3

1,5

С. pneumoniae

1,6

1,4

1,9

1,2

1,4

Вирусы ОРВИ

1,6

1,3

2,1

1,3

1,6

Аналогичный алгоритм выбора пробиотика был применен у больных вагинитами и вульвовагинитами неспецифического генеза. К набору возбудителей этих воспалительных процессов, включающем дрожжи рода Candida, наибольший антагонизм среди сравниваемых пробиотиков оказывали штаммы Витафлорао. В этом случае применялся пробиотик в виде вагинальных суппозиториев или местного орошения суспензией. Клинически показан каузальный характер такого лечения, что проявилось в профилактике рецидивов воспалительных процессов влагалища.

Таблица 7. Сравнительная характеристика тяжести клинического течения пневмоний у привитых лиц и не получивших Витафлорао

Характеристика

клинического течения

Число случаев

Не получали Витафлор

Получали Витафлор

Абс. ч.

%

Абс. Ч.

%

Формы

клинического течения

егкая

11

52,4

5

88,3

Средняя

9

42,8

1

16,7

Тяжелая

1

4,7

0

0

Осложнения,

в т.ч. плевриты

3 1

14,3 4,8

0

0

0

0

Среднее число

трудопотерь

25,2

21,5

Для экадикации H. pylori у пациентов с хроническими гастродуоденитами, ассоциированными с этим возбудителем, также был выбран Витафлоро, так как его штаммы проявили высокий антагонизм к 5 изолятам H. pylori , а штаммы L.plantarum и B.bifidum №1 не активны. Выбор формы пробиотика, обеспечивающей контактные взаимодействия в месте локализации возбудителя, т.е. в желудок, является кисломолочный продукт, так как он устойчив к агрессивной среде желудка (рис.4). В кисломолочном продукте совокупность свойств штаммов сохраняется и титр микробных клеток достигает величины 15109 КОЕ/мл. Бактериальные клетки пробиотика в этой форме защищены от инактивирующего действия желудочного сока слоем денатурированного казеина, что позволяет им длительно находиться в желудке без потери жизнеспособности. Клинические исследования показали, что применение кисломолочной формы Витафлорао в течение 3-х недель в комплексной терапии детей с эрозивно-язвенным поражением ЖКТ способствовало быстрому купированию синдрома верхней диспепсии и нормализации стула у детей, страдавших запорами. Восстановление

Рис.4  Изменение титра L. acidophilus, выращенных в среде ГМС (А) и молоке (Б), при инкубации в желудочном соке.

нормальной кинетической деятельности кишечника приводило к нормальному функционированию клапанно-сфинктерного аппарата ЖКТ. Эндоскопическое исследование после применения Витафлорао выявило уменьшение гиперплазии слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, уменьшение частоты дуоденогастрального рефлюкса, нормализацию тонуса привратника. У 54 больных группы сравнения эрадикация H.pylori с использованием антибиотиков приводила к снижению титров бифидо- и лактофлоры до 105-106 КОЕ/мл., в то время как у детей, получавших Витафлоро, лакто- и бифидофлора сохранилась на прежнем уровне - 108 КОЕ/мл.

ечение MALT-лимфомы (mucosa-associated limpoid tissue) - экстранодальная, низкой степени злокачественная лимфома (В-лимфома маргинальной зоны), которая встречается обычно в желудке и в 72-92% случаев ассоциирована с H. pylori, возможно с осущетвлением эрадикаций H. pylori. Это приводит к уникальной в онкологической практике регрессии лимфомы (Isaacson P., 1994). На практике эрадикацию проводят большими дозами антибиотиков, что приводит к возникновению серьезных осложнений и при этом MALT-лимфомы желудка в 20-30% случаев остаются резистентной к эрадикационной терапии, поэтому приходится прибегать к хирургическому вмешательству, лучевой терапии и химиотерапии. Сотрудники НИИ онкологии им проф. Н.Н.Петрова проверили эффективность эрадикации H. pylori у больных данной категории кисломолочной формой Витафлорао. Под наблюдением находились 25 женщин в возрасте от 48 до 70 лет, страдающих MALT-лимфомой желудка, верифицированной в патоморфологической лаборатории НИИ онкологии. Витафлоро назначали только в случае неэффективности схемы лечения с антибиотиками. Клиническое обследование включало общий и специальный анализы крови и периодическую фиброгастродуоденоскопию. Переход MALT-лимфомы в диффузную В-клеточную крупноклеточную лимфому имел место у одной больной (летальный исход) в остальных случаях наблюдался положительный эффект. Повторная фиброгастродуоденоскопия показала полный регресс опухолевых изменений в 62,5%, стабилизация наблюдалась в 12,5%. Ремиссия констатирована в течение всего срока наблюдений. Тесты на H. pylori стали отрицательными, а пробы на пепсинообразующую функцию стенки желудка изменились с нулевого показателя до 48 мг/г ткани. Таким образом, клинически показано, что кисломолочная форма пробиотика, имеющего высокий антагонизм к H. pylori, максимально эффективна при лечении MALТ-лимфомы желудка. Разработанный способ не имеет побочных эффектов и отражает этиопатогенетический характер лечения.

окализация участка слизистой, контактирующего с пробиотиком, оказывается важной для проявления терапевтического эффекта. Показана клиническая эффективность Витафлоро в составе суппозиториев и в виде микроклизм суспензии при лечении 95 больных с синдромом раздраженной кишки (СРК), из них СРК с запорами - у 15 человек, СРК с поносами - у 66 больных. Возраст пациентов - от 6 до 18 лет. Монотерапия Витафлоро проведена у 37 детей с диагнозом СРК (1-я группа). В группу сравнения (2-я группа) включены 30 больных, получавших комплексную терапию без Витафлоро. 58 пациентам проводилась комплексная терапия с использованием базисных препаратов и комбинации разных форм Витафлора (3-я группа). В частности, микроклизмы или суппозитории сочетали с приемом кисломолочной формы пробиотика. Комплексная терапия пациентов с СРК включала прием прокинетиков, желчегонных препаратов растительного происхождения, ферментных препаратов. Выбор схемы лечения в известной степени определялся диагнозом, характером функциональных и структурных изменений кишечника. При анализе динамики клинических проявлений у данного контингента больных учитывались те симптомы, в развитии которых ведущую роль играют нарушения кишечного микробиоценоза. К ним относятся боли в животе, нарушения стула, сочетающиеся с метеоризмом. Динамика их проявления у пациентов, получавших разные схемы лечения, представлена на рис.5.

Рис. 5 Динамика изменений клинических симптомов на фоне различных схем терапии. 1-я группа - курс монотерапии витафлором, 2-я группа - стандартный курс терапии и 3-я группа, прошедшая комплексный курс, включающий стандартную терапию и Витафлор

Анализ динамики клинических симптомов показал, что Витафлоро эффективен как в комплексной терапии с прокинетиками и желчегонными препаратами, так и в качестве монотерапии в купировании основных клинических признаков. Клинические симптомы коррелировали с изменениями в составе кишечной флоры, что подтверждает их патогенетическую связь.

Перспективной формой пробиотика является пористая таблетка для лингвального применения. Эта форма ориентирована на достижение максимального иммуномодулирующего эффекта, так как учитывает особенности строения эпителия подъязычной области и быстрый распад таблетки при её контакте со слюной. В процессе распада таблетки образуется концентрированная бактериальная суспензия, в результате чего вероятность захвата клеток штамма пробиотика местной лимфоидной тканью повышается. Клинические исследования показали, что использование пробиотика в форме лингвальной таблетки чрезвычайно эффективно при купировании осложнений химио- и лучевой терапии онкологических больных в генерализованной стадии заболевания и в инфекционной клинике при лечении больных сальмонеллезами в тяжелой фазе.

Рис.6. Изменение титра L. acidophilus, внесенных в среду МРС-1 при температуре 37оС в виде порошка сублимированной биомассы (2) и порошка в кишечно-растворимых капсулах (1)

В кишечнорастворимых капсулах пробиотические бактерии защищены от инактивирующего действия желудочного сока. При растворении капсул в кишечнике пробиотические штаммы попадают в состав транзиторной микрофлоры, где переходят в состояние активного метаболизма. На рис.6 показан процесс реактивации капсульной формы пробиотика во времени. Такие формы бактериальных препаратов эффективны для профилактики, на стадии реабилитации после перенесенных заболеваний, а также при лечении болезней средних отделов ЖКТ, например болезни Крона.

За последние 10 лет алгоритмы выбора пробиотика и препарат Витафлоро были использованы в педиатрии, гастроэнтерологии, гинекологии, аллергологии, онкологии, хирургии, при лечении инфекционных заболеваний и при вакцинации, а также в профилактике инфекционных заболеваний и показали эффективность их применения. Общая численность пациентов, участвовавших в апробации, превысила 2 тысячи. Выпуск пробиотика Витафлоро осуществляется в течение 12 лет с предельной нагрузкой имеющегося оборудования.

ВЫВОДЫ

  1. Показано, что пул низкомолекулярных экзометаболитов выполняет функции регулятора численности и уровня антагонистической активности бактерий при развитии их популяций в составах чистых и смешанных культур и осуществляет коммуникационные связи внутри микробиоценозов. Низкомолекулярные экзометаболиты пробиотических бактерий участвуют в восстановлении нарушенных составов микробиоценозов.
  2. Разработана модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов на микроэкологический статус макроорганизма. Согласно модели восстановление состава нормальных микробиоценозов при приеме бактериального препарата происходит в следующей последовательности: переход штамма пробиотика в состояние активного метаболизма, выделение экзометаботитов, селективная стимуляция ими роста представителей нормального микробиоценоза. Активированный штамм препарата проявляет собственную антагонистическую активность и повышает уровень антагонизма нормальной микрофлоры, что способствует элиминации возбудителей заболевания.
  3. Высказано предположение, что эффективность пробиотиков во многом определяется вероятностью перехода бактерий в состояние активного метаболизма в энтеральных средах макроорганизма. Повышение вероятности перехода бактерий в физиологически активное состояние достигается путем использования адекватной формы препарата, или путем внесения низкомолекулярных стимуляторов роста.
  4. Обосновано новое направление в медицинской биотехнологии - создании пробиотиков с повышенным терапевтическим потенциалом на основе бактериальных симбиотических комплексов мутуалистического типа, которое является логическим следствием анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.
  5. Создан устойчивый симбиотический комплекс - бикультура L. acidophilus на основе штаммов Д №75 и Д №76, который обладает эффектами синтрофии и синергизма. По сравнению с моноштаммами симбиотическая бикультура характеризуется повышенным пробиотическим потенциалом (высокой жизнеспособностью, широким спектром и уровнем антагонистической активности, устойчивостью к терапевтическим дозам ряда антибиотиков, адаптивной способностью, резистентностью к абиотическим факторам среды).
  6. Разработаны технологии получения пробиотика на основе симбиотической бикультуры L. acidophilus (штаммы Д№75 и Д№76) в различных формах: лиофилизат биомассы в среде культивирования во флаконах, лингвальные таблетки, лиофилизат биомассы в порошке. Производство пробиотика Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий Витафлоро , который зарегистрирован как БАД, организовано на базе ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России (1997).
  7. Витафлоро во всех формах выпуска по данным полного цикла доклинических исследований относится к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ, не обладающих аллергенными и токсигенными свойствами, с выраженной фармакологической активностью (на моделях экспериментального язвенного поражения ЖКТ и дисбактериоза, вызванного свинцовой интоксикацией).
  8. Предложен алгоритм выбора эффективного бактериального пробиотика и формы его применения с учетом этиологии, характера и степени выраженности заболевания. Критерии выбора сформулированы на основе анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.
  9. Целесообразность использования предложенных алгоритмов выбора, повышающих эффективность пробиотикотерапии, и высокие лечебно-профилактические свойства различных форм пробиотика Витафлоро  подтверждены в многолетних клинических наблюдениях в педиатрии, гастроэнтерологии, гинекологии, инфектологии, аллергологии, онкологии и хирургии (более 2000 пациентов).

       Список работ, опубликованных по теме диссертации, состоит из 86 названий, основные из них:

Монография и методические пособия

1. Мельникова И.Ю., Рябчук Ф.Н., Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б. Теоретические предпосылки и практика клинического применения пробиотика Витафлор в педиатрии.// Методическое пособие для врачей, СПб., Изд. СПб МАПО, 2004, с.37

2. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Добрица В.П., Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора.//СПб., ФГУП Гос.НИИ ОЧБ, 2008, с.136

3.- Гончар Н.В., Вербицкая Н.Б., Березина Л.В., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения острых кишечных инфекций. //Методические рекомендации. СПб., ВМА. 2009, с. 20

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Багрянцева Е.А., Свентицкий Е.Н., Петров Л.Н. Исследование водного обмена в клетках Е. coli в присутствии D2O методом ИК-спектроскопии.// Биофизика - 1983, т. XXVIII, вып. 5, стр. 835-837.

2.- Рощина Е.К., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Спектрофлуориметрический анализ Е. coli в процессе хранения в физиологическом растворе.// Микробиология - 1984, т. 53, вып. 6, стр. 1016-1020.

3.- Никитин Н.В., Николаев Б.П., Торопов Д.К., Петров Л.Н Изучение физиологической активности клеток Escherichia coli методом спинового обмена // Микробиология - 1985, -т. 54, вып. 4, стр. 566-572.

4.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Термостабильность пространственной организации молекул белков и механизм ее поддержания.// Доклады Академии Наук СССР, 1989, т. 308,стр. 218-222.

5.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Состояние воды в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ по данным ИК-спектроскопии.// Журнал структурной химии, 1991, т. 32, стр. 81-85.

6.- Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Выживаемость клеток при хранении в суспензиях различной концентрации // Микробиология- 1992, т 61,вып.6, стр.1087-1095.

7.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин СВ., Петров Л.Н. Состояние белка в микрорасслаивающихся водно-органических растворителях // Биофизика- 1993, т. 38, №3, стр. 524-525.

8.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин СВ., Петров Л.Н. Изменение конформации белков в водных растворах гетерофункциональных неэлектролитов.// Биофизика -1996, т. 41, №3, стр. 581-587.

9.- Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Королюк А.М., Петров Л.Н. Изучение действия препарата аутостимуляторов роста E.coli M-17 (препарат Актофлор) на рост чистых и смешанных культур бактерий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2000, №3, стр. 20-24

10.- Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Влияние препаратов Актофлор на выживаемость E.coli M-17 и S.enteritidis при голодании в смешанных культурах // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000, №6, стр. 67-69

11.- Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Задаура Е.Ю., Петров Л.Н. Сравнительное изучение действия аутостимуляторов роста Escherichia coli M-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистическую активность лактобацилл // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001, №3, стр. 80-83

12.- Вахитов Т.Я., Виснольд Н.В., Протасов Е.А., Толпаров Ю.Н., Петров Л.Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003, №2, стр. 7-12

13.- Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Состав и биологическая активность экзометаболитов  Escherichia coli М-17 // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003, №6, стр. 20-25

14.- Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Петров Л.Н. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты//Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005, №5, стр. 108-114

15.- Петров Л.Н., Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов.// Вестник Российской АМН, 2006, №1, стр.38-45

16.- Vakhitov T.Y., Petrov L.N. Regulatory functions of bacterial exometabolites // Microbiology. - 2006. - Vol. 75. - № 4. - P. 483Ц488.

17.- Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Воробьев А.А Перспективы создания пробиотических препаратов на основе чувства кворума у бактерий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006, №3, стр. 105-113.

18.- Кобатов А.И., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Пробиотик Витафлор как возможное средство защиты космонавтов от негативных последствий воздействия ионизирующего излучения.// Медицина экстремальных ситуаций- 2007, № 2 ( 20 ), с. 72 - 79

19.- Кобатов А.И., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Рыбальченко О.В., Петров Л.Н. Изучение пробиотических характеристик Lactobacillus acidophilus, выращенных в условиях космического полета.//Медицина экстремальных ситуаций, 2008, № 4 ( 26 ), с. 66 - 78.

20.- Гончар Н.В., Березина Л.В., Тихомирова О.В., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Выбор пробиотика для рациональной терапии клебсиеллезной инфекции у детей.// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009, №2, стр. 85-89.

21. Вахитов Т.Я., Чалисова Н.И., Балыкина Н.А., Петров Л.Н., Ноздрачёв А.Д. Модулирующее влияние метаболитов микрофлоры человека и животных на культуру лимфоидной ткани.//Доклады Академии Наук - 2009,том 428, № 1, с. 121-124.

Патенты и полезные модели

1.- Патент № 2170023 РФ, МКИ А 23 С 9/12. Штамм Lactobacillus acidophilus A-91, используемый для приготовления кисломолочных продуктов, штамм Lactobacillus acidophilus Н-91, используемый для приготовления кисломолочных продуктов, закваска для приготовления кисломолочных продуктов и препарат, способствующий адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям. // Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б. Заявка № 97122258. Заявлено 25.12.97. Опубликовано 10.07.01. Бюл № 19. - 7с.

2.- Патент № 2160992 РФ, МКИ А 23 С 9/12. Сухой биопрепарат и способ его получения. //Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Кобатов А.И., Петров Л.Н. Заявка № 99117491/13. Заявлено 17.08.99. Опубликовано 27.12.00. Бюл. № 36. - 8 с.

3.- Патент № 2169574, МКИ А 61К 35/74, 35/76 Способ получения препарата и сухой биопрепарат // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н. Заявка №а2000101754.Ч Заявлено 27.01.00. Опубликовано 27.06.01. Бюл. № 18. - 8с.

4.- ПМ № 22420 РФ, МКИ А 61К 9/127, 31/00 . Препарат // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Белов Г.В. Заявка № 2001131754/20. Заявлено 27.11.01. Опубликовано 10.04.02. Бюл. № 10. - 1с.

5.- ПМ №а12967 РФ, МКИ А 61 К 31/13. Суппозиторий // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Заручевская Н.В., Молдавер Б.Л. Заявка №а99124264/20. Заявлено 23.11.99.. Опубликовано 20.03.00. Бюл. №а8.-1с.

6.- ПМ №а14514 РФ, МКИ А 61 К 9/127, 31/00. Таблетка // Кобатов А.И., Добролеж О.В. Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Белов Г.В. Заявка №а2000102001/20. Заявлено 27.01.00. Опубликовано 10.08.00. Бюл. №а22. Ц 1с.

7.- Патент №2269353 Способ лечения MALT-лимфомы желудка. // Гершанович М.А., Добрица В.П., Петров Л.Н.  заявка №2004117585 от 10.06.2004 публикация 10.02.06 бюл. №4

8.- Патент №2278682 Способ лечения желудочно-кишечных заболеваний // Мельникова И.Ю., Добрица В.П., Петров Л.Н. заявка №20074983431 от 18.02.2004 публикация 27.2.06 бюл. №2

9.- Патент №2342174 Способ повышения эффективности вакцинации против бактериальных и вирусных инфекций // Лобзин Ю.В., Добрица В.П., Петров Л.Н., Жоголев С.Д., Огарков П.И., Осмоловский С.К. заявка №2006104531 от 13.02.2006 публикация 27.12.08  бюл. №38

10.- Патент №2339389 Способ профилактики назофарингиального носительства патогенной микрофлоры.// Лобзин Ю.В., Добрица В.П., Цыган В.Н., Петров Л.Н., Жоголев С.Д., Огарков П.И., Осмоловский С.К., Зуева Н.В., Суханов Б.С. заявка № 2006104532 от 13.02.2006 публикация 27.12.08 бюл. №38

11.- Патент № 2090612 Стимулятор роста бактериальной культуры. // Вахитов Т.Я., Яшина  Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений 20 сент. 1997.

12.- Патент № 2233875 Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coli.// . Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Петров Л.Н. заявка № 2000129026 от 22.11.2000 публикация 10.08.2004 бюл. №22

13.- Патент №2291192 Стимулятор роста микроорганизмов Полифлор и препарат для лечения желудочно-кишечного тракта.// Вахитов Т.Я. ,Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Шалаева О.Н. заявка № 2005108334 от 24 марта 2005 г. публикация 10 01.2007  бюл. № 1

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии