Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Коломеец Наталья Степановна
МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МОЗГЕ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ШИЗОФРЕНИИ (УЛЬТРАСТРУКТУРНО-МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2010 г.
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр психического здоровья РАМН.
Научный консультант:
доктор медицинских наук Уранова Наталия Александровна
Официальные оппоненты:
академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Боголепов Николай Николаевич академик РАМН, профессор, доктор биологических наук Акмаев Ильдар Ганиевич член-корр. РАЕН, профессор, Дубовая Татьяна Клеониковна доктор медицинских наук
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Защита диссертации состоится л--- --------------- 2010 г. в ------- часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу 117198 ГСП, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198 ГСП, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.
Автореферат разослан л --------------2010 г.
Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Саврова Ольга Борисовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Шизофрения является одной из основных проблем современной психиатрии, имеющей существенное социально-экономическое значение, поскольку ею страдает около 1% популяции (Жариков Н.М., 1972; Тиганов А.С., 1999). По прогнозу ВОЗ, к 2020 г. шизофрения может выйти на пятое место среди болезней, вызывающих потерю трудоспособности.
Несмотря на длительный период изучения шизофрении, в настоящее время отсутствует единая точка зрения в отношении этиологии и патогенеза этого тяжелого психического заболевания. К средине прошлого века на основании результатов качественных нейроморфологических исследований сложились представления о том, что для шизофрении характерна особая стертая картина дистрофического процесса с очаговыми выпадениями нейронов коры в сочетании с ареактивностью глии (Александровская М.М., 1939; Снесарев П.Е., 1950; Гиляровский В.А., 1955; Левкович- Соколова А.П., 1958). Современный этап исследований шизофрении характеризуется появлением объективных стереологических методов морфометрических исследований в нейроморфологии, а также внедрением в практику клинических исследований чувствительных методов прижизненной структурной (компьютерная, магнито-резонансная и диффузионно-тензорная томография) и функциональной (позитронно-эмиссионная томография, магнито-резонансная спектроскопия) визуализации мозга. Применение стереологической морфометрии позволило установить, что дефицит нейронов в мозге не является характерной особенностью этого заболевания. Отсутствие астро- и микроглиоза в мозге также рассматривается большинством авторов как свидетельство отсутствия дегенеративного процесса в мозге при шизофрении (Harrison P., 1999, 2004; Weinberger D., McClure R., 2002). Но что за патологический процесс лежит в основе этого заболевания остается неясным.
В настоящее время на первый план вышла гипотеза, согласно которой в основе патогенеза шизофрении лежат нарушения межнейрональных синаптических связей, определяемые гиперфункцией дофаминергических нейронов среднего мозга (в том числе черной субстанции), а также снижением активности глутамат-зависимого проведения нервных импульсов. Наиболее четко это представлено в концепции A. Carlsson (2000, 2006), который говорит о дисбалансе между активностью ряда структур дофаминергической и глутаматергической нейронных систем мозга на уровне базальных ганглиев мозга.
Синаптическая гипотеза находит косвенные подтверждения в результатах прижизненных и нейроморфологических исследований мозга больных шизофренией. Были установлены как нарушения микроструктурной организации миелиновых трактов и пучков, связывающих различные отделы мозга пациентов по данным диффузионно-тензорной томографии (Kuroki N. et al., 2006; Nestor P. et al., 2007), так и изменения корреляционных взаимосвязей между активацией ряда структур головного мозга при шизофрении по данным позитронно-эмиссионной томографии и магнито-резонансной спектроскопии (Suzuki M. et al., 2005; Goodrich-Hunsaker N. et al., 2005).
Важным результатом нейроморфологических исследований являются данные об уменьшении размеров нейронов и/или редукции их дендритного дерева, которое является основным рецептивным полем нейрона, в различных областях мозга (Kalus P. еt al., 2000;
Rosoklija G. et al., 2000). Многие авторы расценивают эти изменения как нарушение развития мозга (Cotter D., Pariante C., 2002; Arnold S. et al., 2005). Исследования, проведенные с использованием методов гистохимии, авторадиографии и гибридизации in situ позволили выявить нарушения плотности глутаматергических и дофаминергических аксонов, а также нарушения экспрессии различных синаптических маркеров и связывания рецепторов медиаторов в областях коры и гиппокампе при шизофрении (Benes F., 2000;
Lewis D.A., Gonzlez-Burgos G., 2008). Выявленные изменения затрагивают, по крайней мере, три нейротрансмиттерные системы: дофаминергическую, глутаматергическую и ГАМК (-амино-маслянная кислота) - ергическую, и касаются как внутренних ассоциативных связей, так и путей, связывающих различные структуры мозга. Однако полученные в этом направлении результаты не позволяют заключить, связаны ли выявляемые нарушения с изменениями собственно синаптических контактов.
Большое значение для подтверждения основных положений синаптической гипотезы имеют исследования ультраструктуры и числа синаптических контактов в указанных областях мозга. Однако такие исследования немногочисленны и касаются в основном таких ключевых структур синаптической гипотезы патогенеза шизофрении, как префронтальная кора и полосатое тело, поэтому многие вопросы остаются нерешенными.
До сих пор не получено подтверждения гиперфункции дофаминергических нейронов среднего мозга, изначально постулировавшейся синаптической гипотезой шизофрении. A. Carlsson (2000) выдвинул предположение, что для шизофрении характерно нарушение регуляции активности дофаминергических нейронов, а не их гиперфункция.
Последнее нашло подтверждение в данных о качественных изменениях при шизофрении ультраструктуры синапсов в черной субстанции, которая является одним из основных источников дофамина в мозге (Уранова Н.А., Левите О.И., 1987). Для выяснения вопроса, приводят ли эти изменения к нарушениям иннервации именно дофаминергических нейронов необходимо использование иммуноцитохимической идентификации постсинаптических мишеней измененных аксонных терминалей с количественной оценкой числа соответствующих синапсов.
Что касается глутаматергической составляющей синаптической гипотезы (особенно в аспекте связи между дофаминергической и глутаматергической системами), в этом отношении большой интерес представляет гиппокамп, который осуществляет обработку и интеграцию информации, поступающей от ассоциативных зон коры всех сенсорных представительств (Vinogradova O., 2004). Имеются как клинические, так и экспериментальные свидетельства влияния повреждения нейронов гиппокампа на активность дофаминергических нейронов среднего мозга (Csernansky I., Bardgett M., 1998;
Lodge D., Grace A., 2007). Показаны также прижизненные нарушения кортикогиппокампальных взаимодействий при шизофрении (Goodrich-Hunsaker N. et al., 2005;
Suzuki M., 2005).
По данным позитронно-эмиссионной томографии дисфункция гиппокампа при шизофрении положительно коррелирует преимущественно с тяжестью позитивной (бред, галлюцинации и т.п.), а не негативной симптоматики (эмоциональная дефицитарность, расстройства мышления и др.) (Tamminga C.A. et al., 1992; Lahti A.C. et al., 2006).
Подавление активации гиппокампа связано также с когнитивными расстройствами у пациентов, такими, как нарушения вербальной памяти и внимания, которые авторы связывают с проявлениями психоза (Goldberg T.E. et al., 1994; Heckers S. et al., 1998).
По данным магнито-резонансной спектроскопии в основе дисфункции гиппокампа при шизофрении лежат нарушения глутаматергической нейромедиации (Maier М. et al., 2000;
Blasi G. et al., 2004). Результаты исследований рецепторов глутамата и синаптических маркеров в аутопсийном мозге указывают на преимущественное поражение поля САгиппокампа (Eastwood S.et al., 1995a,b; Harrison P.. et al., 2003). Гигантские глутаматергические синаптические контакты, образуемые мшистыми волокнами на шипиках пирамидных нейронов поля СА3, играют ведущую роль в экспрессии когнитивных функций у человека и животных (Kesner R. et al., 2004; Vinogradova O., 2004) и являются важным звеном афферентного пути, осуществляющего кортико - гиппокампальные взаимодействия (Замбржицкий И.А., 1972; Vertes R., 2006). Эти синапсы обладают уникальной ультраструктурой и могут быть легко идентифицированы без дополнительных маркеров (Amaral D., Dent J., 1991). Тем не менее, ультраструктура и число синаптических контактов в гиппокампе при шизофрении до настоящего времени практически не изучены.
В рамках вопроса о состоянии межнейрональных синаптических связей при шизофрении большое место занимает патология глиальных клеток и нарушения глио нейрональных и глио-глиальных взаимодействий. Это связано с появлением в последние годы целого ряда новых данных. Во-первых, установлено, что глиальные клетки непосредственно участвуют в передаче нервных импульсов, при этом астроциты являются полноценным участником глутаматергической нейромедиации (Ventura R., Harris K., 1999;
Haydon P., Carmignoto G., 2006), а олигодендроциты, как известно, образуют миелиновые оболочки аксонов, регулирующие скорость проведения нервных импульсов (Fields D.R., 2005). Во-вторых, астроциты, олигодендроглия и микроглия участвуют в поддержании адекватной цито-, миело и синаптоархитектоники мозга (Cuadros M.A., Navascues, 1998;
Streit, 2002). В-третьих, глиальные клетки осуществляют энергетическую и трофическую поддержку нейронов, а также экспрессируют специфические факторы, от которых зависят размеры и архитектура дендритного дерева нейронов (Dai X., et al., 2003; Foster R. et al., 2006). Наконец, микроглия и астроциты являются иммунокомпетентными клетками мозга, они экспрессируют широкий спектр цитокинов и трофических факторов, посредством которых глиальные клетки взаимодействуют между собой, а также с нейронами и их отростками (Lehnardt S. et al., 2002; Sloane J.A., 1999, 2003; Hinman J.D. et al., 2004).
При шизофрении по последним данным речь идет о дисфункции глии. При этом в такой глутаматергической структуре как гиппокамп изменения обнаруживаются наиболее часто и касаются всех видов глиальных клеток. Показаны нарушения экспрессии и активности ферментов обмена глутамата в астроцитах гиппокампа, которые по некоторым данным прогрессируют в течении заболевания (Steffek A. et al., 2006; Bendikov I., 2007).
Получены данные о нарушениях при шизофрении экспрессии целого ряда миелин- и олигодендроцит-связанных генов в мозге, при этом гиппокамп является областью с наибольшей выраженностью таких изменений (Dracheva S. et al., 2006). Появление новых маркеров микроглиальных клеток для позитронно-эмиссионной томографии позволило установить, что для шизофрении характерна активация микроглии в мозге (van Berckel et al., 2008), наиболее выраженная в гиппокампе (Doorduin J. et al., 2009).
В связи с этим в настоящее время изменения глии при шизофрении стали привлекать к себе и повышенное внимание нейроморфологов. Особенно это касается олигодендроглии, что связано с многократно показанными в прижизненных исследованиях нарушениями структуры миелинизированных трактов мозга у пациентов. Был установлен дефицит олигодендроцитов в сером и белом веществе ряда областей мозга (Востриков В.М. и др., 2004; Byne W. et al., 2006), который, по последним данным, характерен и для гиппокампа (Schmitt A. et al., 2009). В префронтальной коре обнаруженный дефицит олигодендроцитов сочетается с выраженными изменениями их ультраструктуры (Uranova N.A. et al., 2001).
Но в гиппокампе эти клетки исследованы недостаточно, особенно в плане возможных изменений аксо-глиальных взаимодействий и структуры миелинизированных аксонов.
Интерес к микроглии обусловлен данными об активации этих иммунокомпетентных клеток в мозге пациентов, а также полученными доказательствами важной роли иммунных нарушений в патогенезе шизофрении. Принято считать, что микроглиоз не характерен для шизофрении, однако в последние годы существенно расширились представления о разнообразии морфологических форм микроглии, а также о связи их морфологии с особенностями функционального статуса. Описаны (в том числе в мозге человека) новые морфологические формы активированной микроглии - палочковидные (лrod) и круглые, которые характеризуются определенными особенностями взаимодействия с нервными клетками ( Wierzba-Bobrowicz T., et al., 2004; Xue Q.-S. et al., 2007). Эти новые аспекты реактивности микроглии при шизофрении еще не изучались.
Исследования глии и в особенности межклеточных взаимодействий требуют электронномикроскопического подхода, однако до сих пор имеются только единичные описания изменения ультраструктуры глии. Эти ранние работы, выполненные на небольшом количестве случаев, проводились без использования количественных методов, что лишает их необходимой доказательности (Глезер И.И., Сухорукова Л.И., 1966;
Сухорукова Л.И., 1966). Тем не менее, авторы считают, что при шизофрении изменены все типы глиальных клеток и тяжесть этих изменений заметно больше при прогредиентном течении заболевания.
Приведенные данные позволяют выдвинуть в качестве актуальной задачи при выяснении патогенеза шизофрении исследование на ультраструктурном уровне особенностей межнейрональных, глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий в мозге при этом заболевании. Возможности для решения такой задачи дает электронномикроскопический метод в сочетании с иммуноцитохимическими и количественными стереологическими подходами, что позволит одновременно идентифицировать синаптические контакты, различные типы глиальных клеток, нейроны и их отростки и комплексно охарактеризовать особенности межклеточных взаимодействий.
Учитывая клиническую гетерогенность шизофрении для выяснения роли нарушений межклеточных взаимодействий в формировании патологии мозга при шизофрении необходимо проведение клинико-морфологического анализа.
Цель исследования. Выявить изменения ультраструктуры и числа межнейрональных синаптических связей в структурах дофаминергической (черная субстанция) и глутаматергической (гиппокамп) систем мозга, а также изучить особенности глионейрональных и глио-глиальных взаимоотношений в гиппокампе при шизофрении и оценить возможную связь изменений межклеточных взаимодействий с клиническими особенностями шизофрении.
Задачи исследования.
1. Изучить качественные и количественные характеристики ультраструктуры, а также число синаптических контактов на дендритах тирозингидроксилаза - иммунопозитивных дофаминергических нейронов черной субстанции в норме и при шизофрении.
2. Провести качественное и количественное исследование ультраструктуры синаптических контактов между аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции и шипиками пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа и определить их численную плотность в норме и при шизофрении.
3. Провести качественное исследование ультраструктуры олигодендроцитов, а также качественное и количественное исследование ультраструктуры миелинизированных аксонов в поле СА3 гиппокампа в норме и при шизофрении.
4. Определить качественные и количественные характеристики ультраструктуры астро- и микроглии и оценить их объемную фракцию и численную плотность в поле САгиппокампа в норме и при шизофрении.
5. Провести анализ возможных взаимосвязей между изменениями ультраструктурных морфометрических параметров миелинизированных аксонов и глиальных клеток в поле СА3 гиппокампа при шизофрении.
6. Провести сопоставление выявленных изменений межнейрональных, глионейрональных и глио-глиальных взаимодействий с клиническими особенностями шизофрении по показателям длительности болезни, возраста пациентов к периоду начала заболевания, типа течения заболевания и преобладанию позитивной или негативной симптоматики шизофрении к моменту смерти.
Научная новизна. В настоящей работе впервые описаны изменения ультраструктуры синаптических контактов и снижение их числа на дендритах иммуноцитохимически идентифицированных дофаминергических нейронов черной субстанции в мозге больных шизофренией, свидетельствующие о нарушении афферентной регуляции активности этих нейронов.
Получены новые данные о снижении численной плотности гигантских глутаматергических синаптических контактов между аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции и гигантскими шипиками пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа.
Показано, что характер изменений ультраструктуры этих синаптических контактов связан с преобладанием позитивной или негативной симптоматики шизофрении: снижение размеров шипиков наблюдалось только в случаях шизофрении с преобладанием позитивной симптоматики заболевания.
Получены новые данные о дистрофических и деструктивных изменениях ультраструктуры олигодендроцитов в сочетании с нарушением аксо-глиальных взаимодействий и атрофией части миелинизированных аксонов пирамидном слое гиппокампа при шизофрении.
Впервые в мозге человека в норме и при шизофрении на ультраструктурном уровне описан весь спектр известных на сегодняшний день морфологических форм микроглиальных клеток: рамифицированная, амебоидная, круглая и палочковидная микроглия. Установлено, что при шизофрении происходит сдвиг в количественном составе популяции микроглиальных клеток в сторону преобладания либо амебоидной, либо палочковидной микроглии, и этот сдвиг тесно связан с возрастом манифестации психоза.
При ранней манифестации психоза преобладали микроглиальные клетки амебоидного типа, при начале заболевания в зрелом возрасте - палочковидная микроглия.
Впервые обнаружена тесная связь выраженности атрофии миелинизированных аксонов и патологии олигодендроглии с преобладанием определенных морфологических форм микроглии при шизофрении: для случаев шизофрении с преобладанием палочковидной микроглии характерна большая выраженность изменений ультраструктуры олигодендроцитов и достоверное повышение численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов.
Впервые выявлены прогрессирующие с течением заболевания дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах гиппокампа при шизофрении. Показано увеличение численной плотности и объемной фракции перинейрональных астроцитов пирамидном слое гиппокампа при шизофрении.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные в работе нарушения ультраструктуры и дефицит синаптических контактов, образованных на дендритах дофаминергических нейронов черной субстанции, являются морфологическим подтверждением существующей гипотезы о том, что нарушения дофаминергической нейромедиации в мозге при шизофрении связаны с нарушением регуляции активности нейронов дофаминовой системы мозга. В клинических исследованиях показана тесная связь между дисфункцией дофаминовых нейронов черной субстанции, нарушениями мотивационного обучения и проявлениями психоза у пациентов.
Теоретическая значимость данных о дефиците синаптических контактов между мшистыми волокнами зубчатой фасции и шипиками пирамидных нейронов поля САгиппокампа при шизофрении определяется тем, что эти синапсы играют важную роль в экспрессии гиппокамп-зависимых когнитивных функций и являются существенным звеном афферентного пути, ответственного за кортико-гиппокампальные связи, нарушения которых при шизофрении легли в основу одной из существующих теорий психоза.
Теоретическое значение имеют данные, обосновывающие существенное значение изменений межклеточных глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий в нарушениях межнейрональных связей при шизофрении. При шизофрении патология олигодендроглии сочеталась с нарушением аксо-глиальных взаимодействий и атрофией части миелинизированных аксонов. Гетерогенность в распределении морфологических форм микроглии при шизофрении проявлялась как преобладание либо амебоидной, либо палочковидной микроглии, при этом только с преобладанием последней связано достоверное увеличение численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов и большая выраженность изменений олигодендроглии. Снижение численной плотности глутаматергических синаптических контактов в гиппокампе сочеталось с прогрессирующим в течение болезни дефицитом митохондрий и накоплением липофусцина в астроцитах, непосредственно участвующих в глутаматергической нейромедиации. Увеличение численной плотности и объемной фракции перинейрональных (но не свободных) астроцитов можно расценивать как проявление компенсаторных процессов в гиппокампе при шизофрении, направленных на поддержание функционирования нейрона.
Учитывая клиническую гетерогенность шизофрении, важным результатом исследования является обнаружение связи особенностей выявленных нарушений межклеточных взаимодействий с клиническими характеристиками заболевания: снижение размеров постсинаптических шипиков на дендритах пирамидных нейронов поля САгиппокампа найдено только в случаях шизофрении с преобладанием позитивных психотических симптомов; преобладание амебоидных или палочковидных микроглиальных клеток и связанная с ним выраженность патологии олигодендроглии и миелинизированных аксонов зависели от возраста манифестации психоза; дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах нарастали в процессе заболевания. Вывяленные клиникоморфологические корреляции являются существенным вкладом в развитие патогенетических представлений, и в дальнейшем могут послужить основой для выработки новых, патогенетически обоснованных терапевтических подходов к лечению заболевания.
Предложенный автором комплексный подход к оценке патологии мозга путем исследования межклеточных взаимодействий с использованием современных стереологических методов морфометрии, иммуноцитохимии и статистических методов для анализа ультраструктуры ткани мозга на достаточно больших площадях срезов, сравнимых с используемыми при светооптических количественных исследованиях (метод оптического диссектора), был внедрен в практику лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья РАМН и может быть применен при изучении ткани мозга в экспериментальных и клинико-анатомических исследованиях.
Апробация работы. Основное содержание работы
отражено в 24 научных публикациях, в том числе в 11 статьях. Из них в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России, опубликовано 10 статей (5 в отечественных и 5 в зарубежных журналах).
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на объединенной межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН 29 сентября 2009 года, протокол № 4.
Основные положения работы доложены и обсуждены на 9-ом Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Париж, Франция, 2009), 2-й Всероссийской конференции с международным участием Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии (Томск, 2008), на Российской конференции Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии (Москва, 2007), на 8-ом Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Вена, Австрия, 2005), на 13-й Российской конференции по нейроиммунологии (Санкт-Петербург, 2004), на 10-ом зимнем рабочем совещании по шизофрении (Давос, Швейцария, 2000), на 29-ом ежегодном заседании общества нейронаук США (Майами Бич, США, 1999), на 17-й Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, Черноголовка, 1998), на международном конгрессе по шизофрении (Колорадо Спрингс, США, 1997), на 8-ом зимнем рабочем совещании по шизофрении (Кранс-Монтана, Швейцария, 1996).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, включая 52 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает 44 наименования работ отечественных и 562 зарубежных авторов.
Положения, выносимые на защиту 1. Получены прямые морфологические доказательства гипотезы нарушений межнейрональных связей в мозге при шизофрении: выявлены дефицит синаптических контактов, образованных на дендритах дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции, а также гигантских глутаматергических синапсов между аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции и шипиками пирамидных нейронов поля САгиппокампа.
2. Выявленный при шизофрении дефицит синаптических контактов сопровождался выраженными изменениями ультраструктуры пресинаптических аксонных терминалей (появление аномальных миелиноподобных включений и темная дегенерация части терминалей) в черной субстанции, а также нарушениями ультраструктурной пластичности синапсов в гиппокампе: снижение размеров шипиков не сопровождалось изменениями пресинаптической части синапса, достоверные корреляции между размерами аксонных терминалей и объемной фракцией митохондрий в них выявлены только при шизофрении.
3. Выявленная при шизофрении атрофия части миелинизированных аксонов, связанная с набуханием периаксонального отростка олигодендроцита, свидетельствует о нарушении взаимодействия между олигодендроцитами и аксонами и является важным свидетельством нарушений межнейрональных связей при этом заболевании. Олигодендроциты являются наиболее измененными клетками гиппокампа при шизофрении, для которых характерны выраженные дистрофические и деструктивные изменения ультраструктуры, приводящие к гибели клетки.
4. Микроглия в гиппокампе в норме представлена рамифицированными, амебоидными и круглыми клетками, единичные палочковидные клетки встречаются в отдельных случаях.
Состав микроглиальных клеток изменяется при шизофрении и эти изменения связаны с возрастом больного к периоду манифестации психоза: при раннем начале заболевания преобладает амебоидная микроглия, а в случаях начала заболевания в зрелом возрасте - палочковидная микроглия, что может свидетельствовать о разных типах активации этих клеток.
5. Патологические изменения миелинизированных аксонов и олигодендроцитов тесно связаны с реактивностью микроглии:
а) достоверное повышение численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов найдено только в случаях с преобладанием микроглии палочковидного типа;
б) олигодендроциты с признаками тяжелых дистрофических изменений чаще встречаются в случаях шизофрении с преобладанием палочковидной микроглии, для них характерны тесные контакты с палочковидной микроглией.
6. При шизофрении выявлены достоверные отрицательные корреляционные связи между длительностью заболевания и объемной фракцией и численной плотностью митохондрий в астроцитах и положительные - между длительностью заболевания и объемной фракцией липофусцина в них, а также достоверное снижение объемной фракции и численной плотности митохондрий в случаях шизофрении с большой длительностью заболевания, что свидетельствует о прогрессирующей дисфункции астроцитов при этом заболевании.
7. Увеличение численной плотности и объемной фракции перинейрональных астроцитов в гиппокампе может быть проявлением защитной компенсаторной реакции в ответ на прогрессирующую функциональную неполноценность астроцитов и патологические процессы, связанные с олигодендроглией, миелинизированными аксонами и микроглией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Демографическая и клиническая характеристика аутопсийного материала Работа выполнена на образцах мозга (40 случаев шизофрении и 37 случаев без психической патологии) из коллекции лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья РАМН. Особенностью использованного аутопсийного материала является короткий постмортальный интервал (в среднем - 6 часов), что обеспечило хорошую сохранность ультраструктуры ткани мозга и позволило провести ультраструктурно-морфометрический анализ. Соответствующие временные границы были определены в специальных исследованиях ранее (Савулев Ю.И., Агафонов В. А., 1977;
Коломеец Н.С. и др., 1982) и согласуются с данными, имеющимися в литературе (Sheleg S.
et al., 2008).
Образцы мозга больных шизофренией были получены в процессе аутопсий, проводившихся в патологоанатомических отделениях Московских психиатрических больниц № 1 и № 15, являющихся клиническими базами центра, а также городской клинической больницы № 55 и судебно-медицинского морга № 2, где был получен контрольный материал.
При подборе образцов учитывалось соответствие между случаями шизофрении и контрольными по длительности постмортального интервала, возрасту и полу, а также отсутствие в анамнезе травм, нейродегенеративных и сосудистых заболеваний мозга.
Данные о возрасте пациентов к периоду начала заболевания, длительности заболевания и нейролептической терапии были получены из историй болезни. Демографические и клинические данные представлены в таблице 1.
Непосредственные причины смерти в основной и контрольной группе были сходными:
преобладали острая сердечно-сосудистая недостаточность, инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии.
Диагностика шизофрении проводилась по МКБ-10. В работу были вовлечены только случаи шизофрении, не вызывающие сомнений в диагностическом отношении (после консультации с сотрудниками НИИ клинической психиатрии НЦПЗ РАМН). В 30 случаях диагностирована параноидная шизофрения. Кроме того, группа включала 2 случая кататонической шизофрении (F20.21); 6 случаев - недифференцированной шизофрении (F20.30 и F20.31); 1 случай - гебефренической формы (F20.10); 1 случай - неуточненной формы шизофрении (F20.98).
ТАБЛИЦА 1. Характеристика основной и контрольной групп наблюдений (М ).
КОНТРОЛЬ ШИЗОФРЕНИЯ Пол женщины 11 мужчины 26 Возраст (годы) 54.0 15.5 56.5 16.Постмортальный 5.9 1.1 6.0 1.интервал (часы) Длительность ----------------- 27.2 13.заболевания (годы) Возраст пациентов к началу ----------------- 29.6 14.заболевания (годы) Для целей клинико-морфологического анализа были также выделены клинические признаки, позволившие разделить случаи шизофрении на соответствующие подгруппы, допускающие количественную оценку различий между ними (таблица 2).
ТАБЛИЦА 2. Выделенные для целей клинико-морфологического анализа подгруппы случаев шизофрении Подгруппа 1 Подгруппа Признак Градация Число Градация Число случаев случаев Возраст пациентов к периоду начала болезни, годы. до 23 19 более 28 Длительность течения болезни, годы до 21 15 более 21 Тип течения болезни непрерывно- приступо- текущая 25 образная Преобладающая симптоматика позитивная 20 негативная Оценка преобладающих симптомов (негативные или позитивные) во время последней госпитализации (к периоду наступления летального исхода) проводилась по шкалам SANS и SAPS (соответственно, Scale for the Assessment of Negative/Positive Symptoms; Andreasen N.C., 1982; Andreasen N.C., Olsen S., 1982).
Кроме того, оценивали интенсивность нейролептической терапии, для чего использовали суммарный хлопромазиновый эквивалент (American Psychiatric Association, 1997).
Методы световой и электронной микроскопии Кусочки ткани черной субстанции и гиппокампа вырезали из левого полушария мозга, руководствуясь стереологическим атласом мозга человека (Савельев С.В., 1996), а также цитоархитектоническими схемами черной субстанции (Braak H., Braak E., 1986; Gibb W., Lees A., 1991) и гиппокампа (Lorente de No, 1934; Rosene D., Van Hoesen G., 1987).
Все образцы мозга были подвергнуты предварительному нейрогистологическому исследованию срезов, окрашенных по Нисслю, лаксолевым синим, конго красным, которое не выявило признаков существенных травматических или сосудистых повреждений, равно как и признаков нейродегенеративных изменений.
Иммуноцитохимическое выявление дофаминергических нейронов. В качестве маркера дофаминергических нейронов использовали антитела к тирозингидроксилазе - ключевому ферменту обмена дофамина. Иммуноцитохимическая реакция на тирозингидроксилазу проводилась ПАП-методом на вибратомных срезах толщиной 30-мкм с использованием мышиных моноклональных антител к тирозингидроксилазе (1-е антитела, разведение 1:200, Boeringer Manheim Biochemica), а также козьей антисыворотки к IgG мыши (2-е антитела, разведение 1:100, Sigma) и мышиного комплекса пероксидазаантипероксидаза (1:500, ПАП, Sigma). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена диаминобензидин тетрагидрохлорид (ДАБ; 0,01%, Sigma). Затем часть срезов каждой серии монтировали на предметные стекла, покрытые раствором желатины, и заключали в канадский бальзам для световой микроскопии.
Контрольные эксперименты. Для проверки специфичности выявления тирозингидроксилазы были проведены отдельные серии контрольных опытов, в которых часть срезов обрабатывали в соответствии со стандартным протоколом, однако первые или, соответственно, вторые антитела заменяли соответствующими неиммунными сыворотками или 0.9% раствором NaCl на фосфатном буфере (рН 7,4). Во всех контрольных опытах результаты окрашивания были отрицательными.
Электронно-микроскопический метод. После завершения иммуногистохимической реакции, часть серии срезов черной субстанции заключали в Аралдит (Fluca, Швейцария) на предметных стеклах. Идентифицированные участки компактной части черной субстанции иссекали скальпелем и наклеивали на готовые блоки эпоксидной смолы.
Образцы гиппокампа фиксировали в виде фронтальных срезов толщиной 2-3 мм, после чего из фиксированной ткани иссекали область, содержащую материал СА3 поля гиппокампа и заключали в Аралдит (Fluka, Швейцария). Для выбора участка для ультратонкой резки использовали полутонкие (1 мкм) срезы, окрашенные толуидиновым синим.
Полутонкие и ультратонкие срезы гиппокампа и черной субстанции получали с помощью ультрамикротома Reichert-Jung Ultracut E (Reichert, Австрия). Ультратонкие срезы собирали на медные бленды с подложкой из формвара, окрашивали последовательно растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали с помощью электронного микроскопа Philips-420 (Philips, Голландия).
Морфометрические методы Для измерений перечисленных ниже параметров использовали ультратонкие срезы с блоков, содержащих материал черной субстанции или гиппокампа (для каждого случая).
Для исследования ультраструктуры и числа синаптических контактов на тирозингидроксилаза иммунопозитивных дендритах компактной части черной субстанции методом систематического случайного отбора отбирали и снимали при увеличении 10 500х 25 поперечных срезов тирозингидроксилаза-иммунопозитивных дендритов. Определяли следующие параметры ультраструктуры компактной части черной субстанции в контрольных случаях и при шизофрении: площадь и периметр дендрита, площадь и периметр аксонной терминали, площадь и число митохондрий в аксонной терминали, численная плотность (Na) митохондрий в аксонной терминали, длина постсинаптического уплотнения, число синаптических контактов на дендрит. Учитывая вариабельность диаметра и плоскости поперечных срезов дендритов, число синаптических контактов на дендрит выражали как число синапсов на единицу периметра дендрита.
Все измерения проводили с помощью системы полуавтоматического анализа изображения MOP-videoplan фирмы Kontron (Германия) на негативах. Изображение на негативе с помощью телекамеры передавалось на монитор системы, с помощью которого осуществлялся контроль над процессом обводки измеряемых объектов.
Для исследования ультраструктуры синаптических контактов, образованных аксонными терминалями мшистых волокон (ТМВ) гранулярных клеток зубчатой фасции на шипиках пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа (ТМВ-синапсы) получали микрофотографии 30 случайно выбранных ТМВ-синапсов при увеличении 6 350х.
Определяли следующие параметры синаптических контактов: площадь аксонных терминалей мшистых волокон (ТМВ) гранулярных нейронов зубчатой фасции, площадь и число головок инвагинированных в ТМВ шипиков пирамидных нейронов поля СА3, площадь и число митохондрий на ТМВ, объемная фракция (Vv) шипиков на ТМВ, Vv и численная плотность (Na) митохондрий на ТМВ, число синаптических контактов в единице объема (Nv) ТМВ.
Для определения численной плотности ТМВ - синапсов в единице объема индивидуальной ТМВ, использовали стереологический метод двойного физического диссектора (Hovard, Reed, 1998; Mandarim-de-Lacerda 2003). Подсчет проводили на серии последовательных ультратонких срезов stratum lucidum из 10-16 последовательных микрофографий для каждого из 15-25 ТМВ-синапсов. Определение числа синаптических контактов осуществляли в соответствии с принятыми правилами подсчета (Hovard, Reed, 1998; Mandarim-de-Lacerda 2003).
Объемную плотность синаптических контактов рассчитывали по формуле:
v син = / V син, где N - общее число синапсов на диссектор, V синапсов - общий объем диссектора.
Общий объем диссектора (V син) подсчитывали по принципу Cavalieri:
V син = T a/p n(syn), где n(syn) - число точек, покрывающих ТМВ на каждом срезе, a/p - площадь, ассоциированная с каждой точкой сетки, T - толщина срезов. Толщину срезов определяли при помощи метода малых складок на срезе (Geinisman Y. et al., 1996).
Для исследования численной плотности миелинизированных аксонов снимали систематическим случайным образом по 72 участков нейропиля пирамидного слоя поля СА3 гиппокампа при увеличении 3 800х, общая площадь анализа составила 24 768 мкмдля одного случая. Определяли общую численную плотность миелинизированных аксонов в пирамидном слое гиппокампа, а также Na и пропорцию миелинизированных аксонов с различными патологическими изменениями миелиновых оболочек и аксонов, которую вычисляли как частное от деления Na миелинизированных аксонов соответствующего типа к Na миелинизированных аксонов в целом и выражали в процентах.
Определяли следующие параметры ультраструктуры и числа глиальных клеток:
- для астроцитов: площадь астроцитов, их цитоплазмы и ядер, Vv и Na митохондрий и Vv липофусциновых гранул в астроцитах, а также Vv и Na свободных и перинейрональных астроцитов в пирамидном слое;
- для микроглии: площадь микроглиальных клеток, их цитоплазмы и ядер, ядерноцитоплазматическое соотношение, Vv и Na микроглии в нейропиле пирамидного слоя.
Для оценки объемной фракции и численной плотности глиальных клеток в пирамидном слое гиппокампа общая площадь анализа составляла в среднем 200x103 57.2x10 мкм на случай и была сравнима с используемой для светооптических исследований (Highley J. et al., 2003; метод оптического диссектора). Учитывая, что объем поля СА3 в мозге человека составляет около 60мм3, как было показано в стереологическом исследовании с использованием метода Кавалери (Walker M.A. et al., 2002), это обеспечило достаточную точность измерений (коэффициент ошибки составлял 0.05-0.17 для Vv и Na астроцитов; 0.13 - 0.15 для микроглии). Полученные нами величины численной плотности астроцитов и микроглии в гиппокампе были сравнимы с имеющимися в литературе данными, полученными при светооптических исследованиях (Damadzic R. et al., 2001;
Steiner J. et al., 2006b).
Для исследования цитологических параметров астроцитов были получены микрофотографии 40-50 клеток, в ядрах которых присутствовали ядрышки. Смысл этого критерия отбора заключается в относительной стандартизации уровня прохождения среза через такие крупные клетки, как астроциты, и уменьшении разбросов средних значений.
Для морфометрического анализа ультраструктуры микроглии использовали микрофотографии 25-30 клеток.
Все площади измеряли на негативах, снятых при соответствующих каждому объекту увеличениях, и увеличенных затем с помощью фотоувеличителя Minolta в 8 раз. На негативы накладывали тестовые сетки для двумерных подсчетов (Hovard, Reed, 1998;
Mandarim-de-Lacerda 2003). Шаг сетки подбирали в соответствии с размерами измеряемого объекта. Площади вычисляли путем умножения числа точек, покрывающих индивидуальный профиль (ТМВ, клетки, органеллы) на площадь, ассоциированную с каждой точкой, и выражали в мкм (Gundersen et al., 1988; Hovard, Reed, 1998). На основании полученных данных вычисляли объемную фракцию объекта.
Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Статистика 6.0. При соблюдении условий нормальности распределения (критерий КолмогороваСмирнова) и гомогенности дисперсий (Levene-тест) применяли дисперсионный ковариационный анализ (двухфакторный ANCOVA) с диагнозом и полом в качестве независимых переменных и возрастом и постмортальным интервалом в качестве ковариат, а также дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим Уpost-hocФ тестом (критерий Данкана). При использовании дисперсионного анализа для малых выборок (ТМВ-синапсы) применяли анализ мощности. Групповые коэффициенты ошибки вычисляли для каждой из групп сравнения для определения точности оценки среднего.
В случае несоблюдения условий нормальности распределения и гомогенности дисперсий для сравнения параметров использовали непараметрические методы: ANOVA Краскала-Уоллиса и U тест Манна-Уитни. Корреляционный анализ применяли для выявления взаимосвязей между исследованными параметрами. Корреляционный и регрессионный анализ использовали также для выявления связи исследованных параметров с возрастом, постмортальным интервалом, продолжительностью заболевания, интенсивностью нейролептической терапии. Статистические гипотезы проверяли при уровне значимости p = 0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследования ультраструктуры и числа синапсов, а также ультраструктуры глиальных клеток и миелинизированных аксонов серого вещества при шизофрении требуют применения количественных методов, однако до сих пор такие исследования немногочисленны и касаются избранных областей мозга, таких как префронтальная кора и полосатое тело. Во многом это объясняется ограниченными возможностями в получении материала, пригодного для количественного ультраструктурного анализа. Коллекция образцов аутопсийного мозга лаборатории клинической нейроморфологии НЦПЗ РАМН (более 200 случаев), обработанных для электронной микроскопии, является одной из немногих в мире и отличается коротким постмортальным интервалом (в среднем 6 часов).
Для материала коллекции характерна хорошая сохранность ультраструктуры нейронов и нейропиля, которые, как известно особенно чувствительны к процессам посмертных изменений мозга. По данным литературы изменения ультраструктуры ткани мозга минимальны в течение 6 часов после наступления смерти (Лушников Е.Ф., Шапиро Н.А., 1974; Савулев Ю.И., Агафонов В. А., 1977; Sheleg S. et al., 2008). Материал коллекции также позволяет осуществить адекватный подбор случаев психических заболеваний и контрольных по возрасту и полу. По каждому случаю шизофрении собраны и запротоколированы клинические и патологоанатомические данные, а также информация о нейролептических препаратах, которые получал больной, что позволило при проведении статистического анализа вводить такие показатели, как возраст, пол, длительность постмортального интервала и хлорпромазиновый эквивалент для случаев шизофрении в качестве переменных в корреляционный и/или регрессионный анализ. Эти параметры использовали также в качестве независимых переменных или ковариат в 2-факторном ANCOVA. Ни для одного из исследованных параметров не выявлено влияния перечисленных факторов, единственным исключением является влияние возраста на параметры ультраструктуры астроцитов, которое будет описано в соответствующем разделе.
Нарушения ультраструктуры и дефицит синаптических контактов на дендритах дофаминергических нейронов черной субстанции Применение в настоящей работе иммуноцитохимической идентификации (антитела к тирозингидроксилазе [ТГ]) дофаминергических нейронов позволило установить, что число синапсов, образованных на их дендритах в компактной части черной субстанции, достоверно снижено (р < 0.001) при шизофрении по сравнению с контролем (рис.1). Анализ ультраструктуры этих синапсов показал, что при шизофрении для них характерны выраженные патологические изменения аксонных терминалей.
Аксонные терминали, образующие синаптические контакты на дендритах дофаминергических нейронов, как в контрольных случаях, так и в случаях шизофрении представлены тремя разновидностями. Для аксонных терминалей 1-го типа (диаметр 0,5 1,5 мкм) характерны круглые и овальные прозрачные синаптические пузырьки, одна- две митохондрии и синаптическая специализация асимметричного типа. Более крупные (диаметр 1,5- 3,5 мкм) аксонные терминали 2-го типа отличались большим числом митохондрий и наличием единичных крупных гранулярных пузырьков. Относительно редко встречались аксонные терминали 3-го типа (диаметр 1.5-2.0 мкм), заполненные мелкими Рисунок 1. Число синапсов, 0,образованных на ТГ-иммунопозитивных дендритах достоверно 0,снижено в компактной части черной p < 0.0субстанции при шизофрении по 0,сравнению с контролем.
0,0,контроль(n=9) шизофрения (n=10) средние полиморфными синаптическими пузырьками, и содержащие многочисленные крупные гранулярные пузырьки и 1-2 митохондрии. Описанные терминали 2-го и 3-го типа образуют на дофаминергических дендритах черной субстанции преимущественно асимметричные синаптические контакты, симметричные синапсы встречались редко. Выявленные нами особенности синаптических контактов, образованных на дендритах дофаминергических N синапсов/периметр дендрита нейронов черной субстанции соответствуют имеющимся в литературе описаниям таких синапсов в мозге приматов (Smith Y. et al., 1996).
К наиболее частым изменениям ультраструктуры аксонных терминалей при шизофрении относится появление в них включений в виде концентрических мембранных структур. В результате аксонная терминаль отделяется от дендрита несколькими слоями мембран, а синаптические пузырьки часто оказываются заключенными внутри концентрических мембран такого включения. Аксонные терминали с описанными изменениями ультраструктуры образуют синапсы преимущественно на дендритах дофаминергических нейронов. Механизм образования мембранных включений не ясен, однако к аксонным терминалям с такими включениями часто прилежат тонкие профили, напоминающие мелкие уплощенные астроцитарные отростки и внедряющиеся в терминаль.
Другой характерной особенностью синаптических контактов в случаях шизофрении было наличие терминалей, которые отличались небольшими размерами, неправильной формой и повышенной электронной плотностью матрикса аксоплазмы, в результате чего плотноупакованные синаптические пузырьки становились плохо различимыми. Такие темные аксонные терминали образуют контакты и на иммунонегативных дендритах. При максимальной выраженности изменений их ультраструктура соответствует темной дегенерации.
Таким образом, выраженные нарушения ультраструктуры аксонных терминалей в компактной части черной субстанции при шизофрении характерны преимущественно для синаптических контактов, образованных на дендритах ТГ-иммунопозитивных нейронов.
При шизофрении наблюдается достоверное снижение числа синаптических контактов на дендритах дофаминергических нейронов компактной черной субстанции.
Значение выявленных нарушений межнейрональных связей в черной субстанции при шизофрении определяется тем, что адекватная афферентация дофаминергических нейронов черной субстанции играет решающую роль в экспрессии электрической активности фазического типа этих нейронов, существенной для организации мотивационного обучения и целенаправленного поведения индивидуума (Berridge K., 2007). Взаимосвязь между нарушениями оценки мотивационных стимулов, отклонениями в активности дофаминергических нейронов черной субстанции и проявлениями психоза показана при шизофрении с использованием методов прижизненной функциональной нейровизуализации (Murray G. et al., 2008), и может, как считают, лежать в основе неадекватной оценки значимости индифферентных стимулов пациентами (Kapur S., 2003).
Дефицит синаптических контактов между аксонными терминалями мшистых волокон и шипиками пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа Синаптические контакты, образованные аксонными терминалями мшистых волокон (ТМВ) гранулярных нейронов зубчатой фасции на шипиках пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа (ТМВ-синапсы), являются глутаматергическими и могут быть легко идентифицированы без использования специфических маркеров благодаря своей уникальной ультраструктуре - разветвленные шипики инвагинированы в гигантскую пресинаптическую терминаль (Amaral D., Dent J., 1991).
Использование современного стереологического метода физического диссектора позволило установить, что число синаптических контактов в единице объема ТМВ достоверно и существенно снижается при шизофрении. Обнаруженный дефицит синапсов не зависел от преобладания у пациентов негативной или позитивной симптоматики (рис.2).
Нами не выявлено качественных изменений ультраструктуры ТМВ-синапсов при шизофрении. Однако при шизофрении были изменены взаимоотношения между размерами пресинаптических терминалей и числом митохондрий в них: достоверная отрицательная корреляция между объемной фракцией митохондрий в ТМВ и площадью пресинаптических терминалей выявлена в случаях шизофрении (R = - 0.8, p = 0.0009), но не в контрольных (R = 0.5, p = 0.9).
Рис.2. Средние и индивидуальные значения числа синаптических контактов в единице объема (Nv) ТМВ в р < 0.контроле (треугольники; n = 10) и при 1,шизофрении (кружки; n = 8). В подгруппах шизофрении с преобладанием позитивной (белые кружки) и негативной (серые кружки) симптоматики Nv ТМВ-синапсов 0,достоверно снижено по сравнению с контролем.
0 2 4 Кроме того, для случаев шизофрении с преобладанием позитивной (но не негативной) симптоматики заболевания характерно достоверное уменьшение числа головок шипиков на ТМВ (рис.3), а также объемной фракции шипиков в ТМВ, что говорит об уменьшении размеров шипиков. Важно, что при этом не выявлено достоверных различий по площади Nv синапсов на ТМВ (N/мкм ) аксонных терминалей между подгруппами шизофрении с преобладанием позитивной или негативной симптоматики и контрольной группой (для всех сравнений р 0.09).
* Б В Д p<0.p=0.0* Е Рисунок 3. Индивидуальные и средние значения: А - площади пресинаптических терминалей мшистых волокон (ТМВ), Г - числа головок шипиков на ТМВ в контроле (треугольники) и в подгруппах шизофрении с преобладанием позитивной (белые кружки) и негативной (серые кружки) симптоматики заболевания и отсутствие связи этих параметров с возрастом (Б, Д) и длительностью посмортального интервала (ПМИ) [В, Е]. Звездочкой отмечен случай шизофрении не получавший нейролептической терапии в течение 2-х месяцев.
Выявленные при шизофрении нарушения взаимосвязей между изменениями пре- и постсинаптических структурных компонентов ТМВ-синапсов свидетельствуют о нарушении их ультраструктурной пластичности при этом заболевании. По данным экспериментальных исследований функциональной морфологии ТМВ-синапсов изменения их пре- и постсинаптической части тесно взаимосвязаны (Madeira M. et al., 1993; Sousa N. et al., 2000).
Митохондрии являются особенно важным фактором синаптической пластичности, поскольку процесс синаптической передачи, связанный с генерацией мощных ионных градиентов, существенно зависит от энергетического обеспечения (Nicholls D., Budd S., 2000). Обнаруженная только при шизофрении достоверная отрицательная корреляция между площадью аксонных терминалей мшистых волокон и объемной фракцией митохондрий в них может свидетельствовать об относительном дефиците митохондрий в крупных ТМВ при шизофрении.
Таким образом, при шизофрении установлено достоверное снижение численной плотности ТМВ-синапсов в гиппокампе, при этом различия, касающиеся изменений размеров шипиков в случаях шизофрении с преобладанием позитивной или негативной симптоматики заболевания, предполагают существование различных механизмов, лежащих в основе дефицита ТМВ-синапсов у этих пациентов.
Описанные в настоящем исследовании нарушения межнейрональных синаптических связей в гиппокампе при шизофрении могут быть одной из причин нарушений кортикогиппокампальных взаимодействий при этом заболевании, установленных в прижизненных функциональных исследованиях (Goodrich-Hunsaker N.J. et al., 2005; Suzuki M., 2005), поскольку мшистые волокна гранулярных клеток зубчатой фасции являются частью афферентного пути, осуществляющего опосредованный перенос информации от ассоциативных областей коры к гиппокампу.
Нарушения возрастных закономерностей изменений ультраструктуры астроцитов Астроциты не только осуществляют энергетическое обеспечение нейронов, являются полноценным участником процессов нейромедиации, но и представляют собой резидентные иммунокомпетентные клетки мозга. Это в значительной мере определяет их высокую реактивность даже в отсутствие астроглиоза и нейродегенерации (Drage M.G. et al., 2002;
John G.R. et al., 2004; Silva M.C. et al., 2005). Изменения ультраструктуры астроцитов, описанные при ишемии мозга, деменциях, нормальном старении, а также в единичных имеющийся работах при шизофрении достаточно однотипны и включают патологию митохондрий и накопление липофусцина в клетках (Глезер И.И., Сухорукова Л.И., 1966;
Боголепов Н.Н.,1979; Peters A. et al., 1991). Установление связи нарушений ультраструктуры астроцитов с заболеванием при шизофрении требует доказательного морфометрического анализа и учета таких факторов, как возраст и длительность постмортального интервала при статистическом анализе.
По нашим данным изменения ультраструктуры астроцитов, включающие увеличение размеров митохондрий и частичную потерю крист, а также накопление многочисленных липофусциновых гранул, можно было наблюдать как в случаях контролей и шизофрении старше 50 лет, так и в более молодых случаях шизофрении с большой длительностью заболевания.
Морфометрический анализ позволил установить, что возрастные закономерности изменений ультраструктуры астроцитов гиппокампа, характерные для контрольных случаев, нарушаются при шизофрении. Так, для контрольных случаев старше 50 лет характерно достоверное увеличение площади астроцитов, их ядра и цитоплазмы (для всех параметров: ~22%, р 0.01), а также уменьшение объемной фракции и численной плотности митохондрий в астроцитах (2-факторный ANOVA, 30%, р < 0.005) по сравнению с контролями моложе 50 лет.
При шизофрении аналогичных различий между случаями, принадлежащими к разным возрастным группам, не обнаружено. Более того, в обеих возрастных подгруппах шизофрении размеры астроцитов были достоверно больше, а объемная фракция и численная плотность митохондрий в астроцитах достоверно меньше, по сравнению с подгруппой контролей моложе 50 лет (для обоих параметров p 0.005), но не отличались от старшей возрастной подгруппы контролей. Тот факт, что параметры ультраструктуры астроцитов гиппокампа при шизофрении вне зависимости от возраста соответствуют таковым в старшей возрастной группе контролей предполагает определенное сходство механизмов нарушений при этом заболевании с имеющими место при старении мозга.
Кроме того, выявлены нарушения взаимосвязей между размерами астроцитов и распределением митохондрий и липофусцина в них при шизофрении: Na митохондрий, также как и Vv липофусциновых включений, достоверно коррелировали с площадью астроцитов и их цитоплазмы в контроле, такие корреляции отсутствовали при шизофрении (таблица 3).
Полученные результаты позволяют предположить, что нарушение возрастных закономерностей изменений ультраструктуры астроцитов при шизофрении связано с болезнью, что и было подтверждено при дальнейшем анализе.
Таблица 3. Корреляции цитологических параметров астроцитов в контроле и при шизофрении КОНТРОЛЬ ШИЗОФРЕНИЯ ПАРАМЕТРЫ (N=16) (N=19) Площадь цитоплазмы / Vv митохондрий R = - 0.6 R = -0.астроцита p=0.013 p = 0.Площадь астроцита / Vv митохондрий R = - 0.62* R = -0.p=0.01 p = 0.Площадь цитоплазмы / Na митохондрий R = - 0.7* R = -0.астроцита p=0.003 p = 0.Площадь астроцита / Na митохондрий R = - 0.7* R = -0.p=0.003 p = 0.0Площадь цитоплазмы /Vv липофусцино-лизосо- R = 0.68* R = 0.астроцита мальных включений p=0.004 p = 0.Площадь астроцита /Vv липофусцино- лизосо- R = 0.7* R = 0. мальных включений p=0.002 p = 0. Значения R и p для корреляции Пирсона, * - статистически значимые (р 0.01) корреляции.
Связь изменений ультраструктуры астроцитов с длительностью заболевания при шизофрении Связь нарушений возрастных закономерностей изменений ультраструктуры астроцитов при шизофрении с болезнью подтверждают данные корреляционного анализа: в группе шизофрении выявлены достоверные отрицательные корреляции между Vv митохондрий (R = -0.66, p=0.002), а также Na митохондрий (R = -0.72, p = 0.001) и длительностью заболевания (рис. 4А). Напротив, Vv липофусцина коррелировала достоверно и положительно (R = 0.72, p = 0.001) с длительностью заболевания (рис.4 Б).
Важно подчеркнуть, что эти параметры не коррелировали с возрастом, ни в контроле, ни при шизофрении (рис. 4 В-Г).
Кроме того, обнаружены достоверные различия между подгруппами шизофрении, различающимися по длительности заболевания: снижение Vv и Na митохондрий в астроцитах наблюдалось в подгруппе шизофрении с большой длительностью заболевания (более 21 года) по сравнению с подгруппой с меньшей (менее 21 года) длительностью заболевания, а также по сравнению с контролем (рис. 5).
Поскольку астроцитам принадлежит ведущая роль в сопряженных между собой процессах энергетического обеспечении нейронов и глутаматергической нейромедиации (Бокша И.С., 2006; Haydon P.G., Carmignoto G., 2006), выявленный при шизофрении прогрессирующий дефицит митохондрий в них является важным показателем нарушения глио-нейрональных взаимодействий при этом заболевании. По нашим данным, нарушения R = - 0.72, p = 0.00R = 0.7, p = 0,0 4 6 8 10 12 14 0 4 8 12 16 Na митохондрий в цитоплазме Vv липофусциновых гранул астроцита ( N/100 мкм2) в цитоплазме астроцита (%) А Б 90 R = - 0. p = 0.070 50 30 R = 0.p = 0.10 4 6 8 10 12 14 0 4 8 12 16 Na митохондрий в цитоплазме Vv липофусцина в B Г цитоплазме астроцита (%) астроцита (N/100 мкм2) 90 R =0.R = - 0.p = 0.p = 0.06 8 10 12 14 16 -2 2 6 10 14 18 22 Na митохондрий в цитоплазме Vv липофусцина в Д астроцита (N/100 мкм 2 ) Е цитоплазме астроцита (%) Рисунок 4. Достоверные корреляции численной плотности (Na) митохондрий (A) и объемной фракции (Vv) липофусцино-лизосомных включений (Б) в астроцитах с длительностью заболевания при шизофрении. Отсутствие корреляций этих параметров с возрастом при шизофрении (В, Г) и в контроле (Д, Е).
(годы) (годы) Длительность Длительность заболевания заболевания Возраст (годы) Возраст (годы) Возраст (годы) Возраст (годы) 4,Рисунок 5. Индивидуальные и средние значения объемной фракции (Vv) митохондрий в 3,астроцитах в контроле p < 0.00(треугольники; n =16) и подгруппах шизофрении с 2,длительностью заболевания 2 менее 21 года (белые кружки; n = 6) и более 21 года (серые кружки;
p < 0.01,n = 13).
0,0 1 2 3 ультраструктурной пластичности, связанные с относительным дефицитом митохондрий в крупных аксонных терминалях, характерны и для ТМВ-синапсов, дефицит которых выявлен при шизофрении. Это положение подтверждается имеющимися в литературе данными о том, что, подобно дефициту митохондрий в астроцитах, нарушения, касающиеся экспрессии синаптических маркеров и рецепторов глутамата, а также астроцитарных ферментов обмена D-серина, в гиппокампе при шизофрении могут прогрессировать с течением заболевания (Eastwood S.L. et al., 1995a,b; Harrison P.J. et al., 2003; Bendikov I. et al., 2007).
Увеличение объемной фракции и численной плотности перинейрональных астроцитов при шизофрении Хотя преобладает мнение, что астроглиоз при шизофрении отсутствует, вопрос о числе астроцитов в гиппокампе нельзя считать окончательно решенным, так как для их идентификации обычно использовались антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (ГФКБ), экспрессия которого существенно подавлена при шизофрении (Webster M.J.
et al., 2001а, 2005; Rajkowska G. et al., 2002). Поскольку астроциты могут быть легко идентифицированы по ультраструктурным признакам, метод определения объемной фракции и численной плотности клеток был адаптирован нами для оценки числа астроцитов на ультраструктурном уровне. Полученные нами величины численной плотности астроцитов в гиппокампе сравнимы с имеющимися в литературе данными, полученными при светооптических исследованиях (Damadzic R. et al., 2001).
Vv митохондрий в астроцитах (%) Выявлено достоверное увеличение объемной фракции (+20%, р< 0.005) и численной плотности (+28%, p< 0.005) астроцитов в пирамидном слое поля СА3 гиппокампа при шизофрении по сравнению с контролем. Это увеличение происходит за счет объемной фракции и численной плотности астроцитов - перинейрональных сателлитов (соответственно, +60%, р < 0.001 и +70%, р < 0.001), тогда как Vv и Na свободных астроцитов не отличались от контрольных (рис. 6).
Важно подчеркнуть, что по данным современных стереологических исследований в гиппокампе при шизофрении показано отсутствие изменений в объеме пирамидного слоя его различных полей (СА1 - СА3), а также в числе и плотности нейронов в них (Walker M.A. et al., 2002; Highley J. et al., 2003). Тот факт, что при шизофрении увеличивается только численная плотность перинейрональных астроцитов, тогда как число свободных астроцитов остается неизменным, также свидетельствует, что выявленные изменения не являются результатом уменьшения объема гиппокампа.
Рисунок 6. Объемная фракция перинейрональных (заштрихо1,ванные прямоугольники) астроцитов достоверно повышена при шизофрении (n = 25), тогда 1,как параметры распределения свободных астроцитов (серые 0,8 прямоугольники) не изменяются по сравнению с контролем (n = 25).
0, p <0.00,0,контроль шизофрения При сравнении подгрупп случаев шизофрении, разделенных по длительности заболевания, возрасту манифестации психоза, по типу течения заболевания, а также по преобладанию позитивной или негативной симптоматики заболевания (рис.7), объемная фракция и численная плотность перинейрональных астроцитов не различались между соответствующими подгруппами и были достоверно выше, чем в контрольной группе [2факторный ANСOVA; p 0.009, для всех сравнений].
Объемная фракция астроцитов (%) 0,Рисунок 7. Объемная фракция (Vv) перинейрональных астроцитов 0,достоверно повышена по сравнению с контролем в 0,подгруппах шизофрении с преобладанием позитивной 0,(шизофрения 1) и негативной (шизофрения 2) симптоматики заболевания.
0,0,p < 0.00, контроль шизофрения шизофрения В связи с тем, что большинство исследователей пришло к выводу об отсутствии астроглиоза в мозге при шизофрении и расценивает этот факт как одно из доказательств отсутствия дегенеративного процесса в мозге при этом заболевании (Arnold S.E. et al., 1998;
Harrison P., 1999, 2004), важно подчеркнуть, что увеличение числа астроцитов не обязательно является проявлением астроглиоза и следствием дегенеративных процессов.
Увеличение числа астроцитов описано в гиппокампе животных при ряде экспериментальных воздействий (таких, как врожденные судорожные расстройства, введение лигандов глутаматных рецепторов), не вызывающих потери нейронов или их патологических изменений (Araujo M. et al., 1996; Drage M. et al., 2002). Важно отметить, что при сравнительной послойной оценке числа ГФКБ-иммунореактивных астроцитов в префронтальной коре при шизофрении выявлено значительное увеличение численной плотности тел астроцитов исключительно в V пирамидном слое. Такого увеличения не наблюдалось в III и IV слоях, для которых характерно избирательное снижение размеров пирамидных нейронов в отличие от слоя V (Rajkowska G. et al., 2002). В настоящем исследовании увеличение численной плотности и объемной фракции астроцитов обнаружено в пирамидном слое поля СА3, также содержащем наиболее крупные пирамидные нейроны гиппокампа, и, более того, оно касалось только перинейрональных астроцитов.
Таким образом, выявленное в настоящем исследовании увеличение числа перинейрональных астроцитов в гиппокампе при шизофрении отражает изменение глионейрональных взаимодействий при этом заболевании и может рассматриваться как (%) Vv перинейрональных астроцитов проявление компенсаторной реакции в ответ на прогрессирующую дисфункцию астроцитов, направленной на поддержку функционирования нейронов.
Изменения ультраструктуры олигодендроглиоцитов и миелина и нарушения аксо-глиальных взаимодействий в мозге при шизофрении Подавляющее большинство олигодендроцитов в пирамидном слое гиппокампа в контрольных случаях, и часть их при шизофрении характеризовались интактной ультраструктурой, типичные особенности которой многократно описаны для данных клеток (Peters A. et al., 1991a,b). Однако для случаев шизофрении характерны дистрофические изменения ультраструктуры олигодендроцитов: увеличение глыбок конденсированного хроматина в ядрах, набухание и потеря части органелл цитоплазмы, появление электронноплотных включений в ней, встречавшиеся иногда и в контроле. Деструктивные изменения олигодендроцитов заключались в пикнозе и эктопии ядра, резком набухании цитоплазмы с потерей органелл, нарушении целостности цитоплазматической мембраны. Пропорция таких клеток в случаях шизофрении составляет около 20%, однако в контроле они практически не встречались. Гораздо реже (практически только в двух случаях шизофрении) встречались изменения ультраструктуры олигодендроцитов, которые характеризовались массивной агрегацией конденсированного хроматина вдоль ядерной оболочки, уменьшением размеров и повышением электронной плотности цитоплазмы, в которой при этом присутствовали рибосомы и митохондрии, что соответствует морфологическим критериям апоптоза (Saraste A., 1999).
Таким образом, олигодендроциты являются клетками с наиболее выраженными изменениями ультраструктуры, включая необратимые деструктивные нарушения, в поле СА3 гиппокампа при шизофрении. Это положение согласуется с недавно опубликованными данными о выраженном дефиците олигодендроглии в гиппокампе при шизофрении (Schmitt A et al., 2009), а также о существенном подавлении экспрессии ряда олигодендроцит- и миелин-связанных генов в гиппокампе при этом заболевании (Dracheva S. et al., 2006). По нашим данным патология олигодендроцитов в гиппокампе сочеталась с существенными нарушениями ультраструктуры миелинизированных аксонов, свидетельствующими о нарушении аксо-глиальных взаимодействий при шизофрении.
В пирамидном слое поля СА3 гиппокампа как в контрольных случаях, так и при шизофрении преобладали миелинизированные аксоны с диаметром 2-4 мкм, которые были диффузно распределены в нейропиле. Наряду с множеством волокон с хорошей сохранностью ультраструктуры миелиновых оболочек и аксона, как в контроле, так и при шизофрении встречаются три основных типа повреждений в части миелиновых волокон:
окальное выпячивание наружной части миелиновой оболочки, которое часто оказывается погруженным в прилежащий отросток астроцита; грыжеподобное выпячивание части миелиновой оболочки внутрь волокна; набухание периаксиального отростка олигодендроцита при резком уменьшении диаметра аксона и смещении его от центра волокна к миелиновой оболочке. Последний тип изменений ультраструктуры, свидетельствующий об атрофии части миелинизированных аксонов, часто встречался в случаях шизофрении, и, гораздо реже, в контроле. Чаще всего в таких случаях миелиновая оболочка состояла всего из нескольких ламелл.
Морфометрический анализ позволил подтвердить достоверное повышение при шизофрении численной плотности (в 2 раза, р = 0.003) и пропорции (на 140%, p = 0.0014, U тест Манна-Уитни) атрофичных миелинизированных аксонов. Полученные результаты согласуются с экспериментальными данными, свидетельствующими, что дисфункция олигодендроцитов и нарушения экспрессии белков миелина индуцируют грубые нарушения цитоскелета нейронов, приводящие к патологии аксонов (Griffiths I. et al., 1998;
Yin X. et al., 1998).
Однако, сравнение подгрупп случаев шизофрении, разделенных по клиническим особенностям заболевания, показало, что достоверное увеличение численной плотности и пропорции атрофичных миелинизированных аксонов по сравнению с контролем наблюдалось только в подгруппе шизофрении (13 случаев) с началом заболевания в зрелом возрасте (ANOVA Краскала-Уоллиса, для всех параметров р 0.001), тогда как случаи с ранним началом заболевания (до 23 лет, 12 случаев) не отличались по этим параметрам от контролей (рис.8).
Выявленные взаимосвязи между нарушениями аксо-глиальных взаимодействий, сопровождающимися атрофией части аксонов, и возрастом манифестации психоза являются важным показателем дисфункции гиппокампа при шизофрении, поскольку данные прижизненных исследований свидетельствуют, что при начале заболевания в раннем возрасте отсутствуют уменьшение объема гиппокампа, а также площади сечения свода мозга (в котором проходят основные волокна гиппокампа), характерные для вновь заболевших пациентов зрелого возраста (Davies D. et al., 2001; Matsumoto H. et al., 2001).
Однако корреляционный анализ не выявил взаимосвязи между численной плотностью и пропорцией атрофичных миелиновых волокон и возрастом пациентов к началу заболевания (R = 0.2, p = 0.2), также как и с длительностью болезни или возрастом. Это позволяет предположить, что различия по числу атрофичных миелиновых волокон между подгруппами шизофрении, различающимися по возрасту манифестации психоза могут быть опосредованы дополнительными факторами.
Рисунок 8. Достоверное повышение численной плотности (Na) атрофичных миелинизированных аксонов по сравнению с контролем p < 0.обнаружено только в подгруппе шизофрении с манифестацией психоза в зрелом возрасте, но не в подгруппе с ранней манифестацией психоза.
контроль (n=25) шизофрения, манифестация психоза до 23 лет (n =12) шизофрения, манифестация психоза после 28 лет (n=13) средние Таким образом, выявленные в гиппокампе при шизофрении нарушения ультраструктуры олигодендроцитов сочетались с выраженными нарушениями аксоглиальных взаимодействий и атрофией части миелинизированных аксонов, что может быть важной составляющей нарушений межнейрональных связей при этом заболевании.
Редукция дендритного дерева пирамидных нейронов гиппокампа при шизофрении была убедительно показана с использованием метода Гольджи и иммуноцитохимических подходов, однако данные об атрофии части миелинизированных аксонов в гиппокампе при этом заболевании получены впервые благодаря применению ультраструктурноморфометрического подхода.
Ультраструктура микроглиальных клеток в норме и при шизофрении В настоящее время преобладает мнение об отсутствии микроглиоза в мозге при шизофрении (Александровская М.М., 1939; Arnold S.E. et al., 1998; Steiner J. et al., 2006).
Наши результаты подтвердили эти данные: ни объемная фракция, ни численная плотность микроглиальных клеток в СА3 поле гиппокампа не различались достоверно между случаями шизофрении и контрольными, а также между подгруппами шизофрении, выделенными по клиническим особенностям заболевания. Однако случаи шизофрении (в отличие от контрольных) существенно различались, по тому, какой из типов микроглиальных клеток преобладал в поле СА3 гиппокампа.
аксонов (N/1000 мкм ) Na атрофичных миелинизированны х Согласно полученным данным, как в контроле, так и при шизофрении микроглия была представлена 4 основными морфологическими типами: рамифицированная, амебоидная, палочковидная и круглая микроглия, что соответствует современным представлениям о морфологической гетерогенности микроглии. В гиппокампе, как в случаях шизофрении, так и в контрольных, рамифицированная микроглия представляет собой клетки с узким ободком цитоплазмы, содержащей единичные органеллы и овальными ядрами с гладкими контурами. Для микроглии амебоидного типа характерны более крупные размеры и развитая цитоплазма с неправильными очертаниями, содержащая многочисленные органеллы и вакуоли, а также включения в виде конгломератов крупных осмиофильных глыбок. Палочковидная микроглия представляет собой мелкие клетки с очень узким ободком цитоплазмы, ядром палочковидной или подковообразной формы, заполненным конденсированным хроматином и 1-2 очень тонкими отростками. Круглая микроглия представлена клетками правильной круглой формы, очень узким ободком цитоплазмы, иногда с тонким коротким отростком или отростком в виде небольшой псевдоподии. Две последние формы микроглиальных клеток были описаны в мозге животных (Zhang Z. et al., 1997; Xue Q.-S. et al., 2007) и в культуре нервной ткани (Tanaka J. et al., 1998; Cheepsunthorn P. et al., 2001; Ovanesov M. et al., 2006) при различных экспериментальных воздействиях. В мозге человека при нейродегенеративных заболеваниях описаны, в том числе на ультраструктурном уровне, палочковидные (УrodФ) микроглиальные клетки (WierzbaBobrowicz T. et al., 2004; Lewandowska E., et al., 2004).
Полуколичественный анализ позволил показать, что при шизофрении примерно в 50% случаев (преимущественно с ранним началом заболевания), микроглиальные клетки представлены преимущественно клетками амебоидного типа (более 50%), а также рамифицированной и круглой микроглией, тогда как единичные палочковидные клетки встречались только в половине этих случаев. В остальных 13 случаях (с началом заболевания в зрелом возрасте, после 28 лет) палочковидные микроглиальные клетки составляли от 1/3 до 2/3 всей микроглии, а амебоидные клетки встречались редко. В контрольных случаях не выявлено гетерогенности в распределении морфологических форм микроглиальных клеток между случаями, здесь представлены в разных пропорциях первые три типа микроглии: амебоидная, рамифицированная и круглая микроглия. Единичные палочковидные микроглиоциты выявлены только в 15% контрольных случаев (3 случая из 25).
При выборе количественных критериев для статистического анализа различий в распределении морфологических форм микроглии исходили из того, что амебоидные и палочковидные клетки, очевидно, отличаются по размерам цитоплазмы и ядерно цитоплазматическому соотношению. Количественный анализ подтвердил эти различия:
величина ядерно-цитоплазматического соотношения для соответствующих подгрупп шизофрении составляла, соответственно, от 0.45 до 0.96 (М : 0.7 0.14) и от 1.0 до 1.(М : 1.2 0.24) Поэтому случаи шизофрении и контрольные были разделены на подгруппы в соответствии с величиной ядерно-цитоплазматического соотношения (соответственно, больше или меньше 0.96) с целью дальнейшего использования для выявления связи изменений различных параметров с преобладающей морфологией микроглии.
Статистический анализ подтвердил, что различия в ядерно-цитоплазматическом отношении и площади цитоплазмы микроглиальных клеток между соответствующими подгруппами не объясняются уровнем среза, а достаточно адекватно отражают особенности морфологии микроглиальных клеток. Так, соответствующие подгруппы шизофрении и контролей достоверно различались между собой по площади цитоплазмы, но не ядер. В обеих группах наблюдений ядерно-цитоплазматическое соотношение коррелировало достоверно и отрицательно только с площадью цитоплазмы микроглиальных клеток (R = - 0.73, p = 0.0001), но не их ядер (R = 0.22, p = 0.13).
Случаи шизофрении и контрольные не различались достоверно по площади микроглиальных клеток, их цитоплазмы и ядер, как показал анализ с использованием 2факторного ANCOVA с диагнозом (контрольная группа и группа шизофрении) и полом в качестве независимых переменных, а также возрастом и постмортальным интервалом как ковариатами. Не было выявлено также значимых эффектов пола, возраста и постмортального интервала на исследованные параметры микроглиальных клеток (для всех сравнений F 1.71; p 0.2).
Однако при сравнении подгрупп шизофрении, различающихся по клиническим особенностям заболевания, выявлено достоверное влияние возраста пациентов к началу заболевания на параметры микроглиальных клеток: в случаях с ранним началом заболевания площадь микроглиальных клеток (+40%, р < 0.001) и их цитоплазмы (+60%, р = 0.0001) были достоверно выше (рис.9), а величина ядерно-цитоплазматического отношения меньше, по сравнению со случаями с началом заболевания в зрелом возрасте.
p<0.0Рис. 9. График индивидуальных и средних значений p = 0.00площади цитоплазмы микроглиальных клеток (МК) в пирамидном слое СА3 области гиппокампа в контроле (треугольники; n = 25) и в подгруппах шизофрении с началом заболевания до 23 лет (белые кружки; n = 12) и после 28 лет (серые кружки; n = 13) Поскольку подгруппы шизофрении, выделенные по возрасту пациентов к началу заболевания, достоверно отличались по возрасту между собой (М , соответственно: 43. 16.6 лет, 68.2 9.2 лет), но не от контрольной группы (54.6 15.7 лет), мы провели сравнение площади микроглиальных клеток и их цитоплазмы между возрастными подгруппами контролей моложе 50 лет (2- факторная ANOVA, 9 случаев контролей и случаев шизофрении) и старше 50 лет (16 случаев контролей и 14 случаев шизофрении старше 50 лет).
Рисунок 10. Достоверные различия по площади цитоплазмы микрор = 0.020 глиальных клеток выявлены между возрастными подгруппами шизофрении, но не контролей контроль, возраст < 50 лет контроль, возраст > 50 лет шизофрения, возраст < 50 лет шизофрения, возраст > 50 лет средние Этот вид анализа показал, что достоверные различия по этим параметрам наблюдаются только между возрастными подгруппами шизофрении, но не контролей (рис.10): площадь Площадь цитоплазмы МК (мкм ) Площадь цитоплазмы МК (мкм ) цитоплазмы микроглиальных клеток была достоверно выше в подгруппе случаев шизофрении моложе 50 лет (+ 40%, р< 0.05) по сравнению с подгруппой старше 50 лет.
Различия между возрастными подгруппами шизофрении по размерам микроглиальных клеток были существенно меньше по величине, чем между подгруппами, различающимися по возрасту манифестации психоза.
Результаты свидетельствуют, что существенные различия в морфологии микроглиальных клеток связаны преимущественно с возрастом начала заболевания:
преобладание амебоидной микроглии наблюдается при ранней манифестации психоза, палочковидной - при начале заболевания в зрелом возрасте.
Корреляционный анализ подтвердил эту связь: выявлены достоверные отрицательные корреляции между площадью микроглиальных клеток, а также их цитоплазмы и возрастом манифестации психоза (рис.11 А). При этом площадь микроглиальных клеток и площадь их цитоплазмы не коррелировали с возрастом ни при шизофрении (рис.11 Б), ни в контроле (рис. 11 В). Возраст начала заболевания достоверно коррелировал с возрастом при шизофрении (R = 0.73, p = 0.00001).
R = - 0.4, p = 0.R = - 0.53, p = 0.020 16 0 20 40 60 8 13 18 23 28 34 45 51 А Б Возраст (годы) Возраст к началу заболевания (годы) R = 0.3, p = 0.Рисунок 11. Отрицательная корреляционная связь между площадью цитоплазмы микроглиальных клеток (МК) и возрастом пациентов к началу заболевания (А), отсутствие связи с возрастом в группе шизофрении (Б) и в контрольной группе (В).
0 20 40 60 В Возраст (годы) (мкм ) МК (мкм ) Площадь цитоплазмы Площадь цитоплазмы МК (мкм ) Площадь цитоплазмы МК Многочисленные данные о возможности взаимных трансформаций различных типов микроглии в соответствии с изменениями их функционального статуса, описанные как в культурах ткани, так и в мозге животных (Tanaka J. et al., 1998; Cheepsunthorn P. et al., 2001;
Ovanesov M. et al., 2006; Xue Q.-S. et al., 2007), а также данные относительно общности спектра синтезируемых этими клетками антигенов (Melzer P. et al., 2001; Guillemin G., Brew B., 2004), позволяют заключить, что различные морфологические формы микроглии отражают особенности их функциональной активности и не представляют собой самостоятельных клеточных типов.
Связь между преобладанием амебоидной или палочковидной микроглии и возрастом манифестации психоза при шизофрении может быть опосредована особенностями иммунного статуса пациентов, так как имеются данные о зависимости между типом активации микроглиальных клеток и состоянием периферического Т-клеточного иммунитета (Town T. et al., 2005). При шизофрении одни группы пациентов могут характеризоваться активацией Тh-1, другие - Тh-2 клеток (Arolt V. et al., 2002; Strous R., Shoenfeld Y., 2006), при этом ряд показателей, определяющих соотношение, отрицательно коррелирует с возрастом пациентов к периоду начала заболевания (Ganguli R. et al.,1995;
Avgutin B. et al., 2005). Наши собственные данные свидетельствуют, что добавление сыворотки крови больных шизофренией к органотипической культуре эмбрионального мозга человека способно активировать микроглиальные клетки, и этот эффект зависел от особенностей клинического и иммунного статуса пациентов (Коломеец Н.С. и др., 2004).
Переход микроглии в активированную амебоидную форму вызывали только сыворотки пациентов с высоким уровнем психоза (оцененным по шкале PANSS) и относительно сохранным Т-клеточным иммунитетом (способность лимфоцитов продуцировать интерлейкин 2).
Таким образом, случаи шизофрении достоверно различались, по тому какой морфологический тип микроглиальных клеток преобладает в поле СА3 гиппокампа. Эти особенности зависят от возраста манифестации психоза и могут свидетельствовать о разных типах активации микроглии при этом заболевании. Полученные данные согласуются с результатами прижизненных исследований, выявивших активацию микроглии в мозге при шизофрении, в том числе на ранних стадиях заболевания (van Berckel B. et al., 2005, 2008), которая по некоторым данным особенно выражена в гиппокампе (Doorduin J. et al., 2009).
Взаимосвязь особенностей ультраструктуры микроглии с изменениями олигодендроглии и миелинизированных аксонов В настоящем исследовании выявлены особенности взаимодействий различных типов микроглиальных клеток с олигодендроцитами и миелинизированными аксонами в контроле и при шизофрении, которые также подтверждают, что различия между случаями шизофрении по преобладанию определенных морфологических типов микроглии могут объясняться различным характером активации микроглиальных клеток.
В подавляющем большинстве контрольных случаев микроглиальные клетки, непосредственно прилежащие к олигодендроглии, относились к круглому типу, при этом для олигодендроцитов характерна нормальная ультраструктура или минимальные ее изменения в виде незначительного набухания цитоплазмы и появления небольших электронно-плотных включений. Такие контакты, когда микроглиальная клетка и олигодендроцит соприкасались цитоплазматическими мембранами, обнаружены в контрольных случаях из 25. При шизофрении большинство микроглиальных клеток в непосредственном контакте с олигодендроцитами относились к морфологическому типу палочковидных (60%-70% микроглиальных клеток, непосредственно контактирующих с олигодендроглией). В этих случаях олигодендроциты характеризовались выраженными дистрофическими изменениями ультраструктуры, вплоть до необратимых. Соответственно, микроглиальные клетки гораздо чаще локализовались в непосредственной близости с олигодендроцитами подгруппе шизофрении с преобладанием палочковидной микроглии: в 70% таких случаев обнаружено более четырех палочковидных клеток в контакте с олигодендроцитом.
Эти наблюдения ставят вопрос и о возможной связи патологии миелинизированных аксонов с особенностями морфологии микроглии при шизофрении. Для проверки предположения было проведено сравнение численной плотности и пропорции миелинизированных аксонов, включая и патологически измененные, в подгруппах контролей и шизофрении, характеризующихся низким или высоким значением ядерноцитоплазматического соотношения микроглиальных клеток (подгруппы 1 контролей и шизофрении, ядерно-цитоплазматическое соотношение 0.96; подгруппы 2, ядерноцитоплазматическое отношение > 0.96). Это позволило установить, что случаи шизофрении с преобладанием микроглии палочковидного типа (подгруппа 2) характеризуются достоверно большей численной плотностью и пропорцией атрофичных миелинизированных аксонов (в 2.5-3.5 раза, для всех сравнений р < 0.005, ANOVA Краскала-Уоллиса), как по сравнению с обеими подгруппами контролей, так и по сравнению с подгруппой шизофрении с преобладанием микроглии амебоидного типа (Рис. 12).
Рис. 12. Численная плотность (Na) атрофичных миелинизированных аксонов (МА) в нейропиле пирамидного слоя поля САгиппокампа достоверно выше в подгруппе шизофрении с p 0. преобладанием микроглии p < 0.палочковидного типа (ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦ) > 0.96) по сравнению с подгруппой шизофрении с преобладани1 ем микроглии амебоидного типа (Я - 0.96) и контрольными случаями.
контроль, Я/ - 0.96 (n = 9) контроль, Я/ - > 0.96 (n = 16) шизофрения, Я/ - 0.96 (n = 13) шизофрения, Я/ - > 0.96 (n = 12) средние Различий в численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов между соответствующими подгруппами контролей не выявлено (р = 0.98).
Корреляционный анализ позволил подтвердить наличие взаимосвязи между численной плотностью атрофичных миелинизированных аксонов и преобладанием определенного морфологического типа микроглии при шизофрении. Только при шизофрении численная плотность атрофичных миелинизированных аксонов коррелировала достоверно как с величиной ядерно-цитоплазматического соотношения (R = 0.55, p = 0.005), так и с площадью цитоплазмы (R = - 0.53, p = 0.007) микроглии (рис.13).
Таким образом, численная плотность атрофичных миелинизированных аксонов достоверно коррелирует с цитологическими параметрами микроглиальных клеток в группе шизофрении, но не с возрастом пациентов к началу заболевания, при этом размеры микроглиальных клеток с возрастом пациентов к началу заболевания достоверно коррелируют. Результаты исследования позволяют предположить, что число атрофичных миелинизированных аксонов зависит преимущественно от преобладания той или иной формы микроглиальных клеток, и влияние возраста пациентов к началу заболевания на выраженность этих изменений также опосредовано реактивностью микроглии.
Na атрофичных МА (N/1000 мкм ) R = 0.5 5, p = 0.0Рисунок 13. Корреляционная связь между численной плотностью (Na) атрофичных миелинизированных волокон и 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 ядерно-цитоплазматическим соА Ядерно-цитоплазматическое соотношение МК отношением микроглии (МК) при шизофрении (А) и отсутствие R = 0.05, p = 0.8 таковой в контроле (Б) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,Б Ядерно-цитоплазматическое соотношение МК Роль микроглиальных клеток, как возможных триггеров патологии олигодендроглии и миелина, показана неоднократно в экспериментальных исследованиях (Lehnardt S. et al., 2002; Sloane J., 1999, 2003; Hinman J. et al., 2004). Имеются данные о высокой чувствительности олигодендроглии к повреждающему действию ряда цитокинов, экспрессируемых микроглией (фактор некроза опухолей , лимфотоксин) (Selmaj K. et al., 1991; Qi Y., Dal Canto M., 1996). Однако микроглия экспрессирует и более специфические факторы, от которых зависит структурная и функциональная целостность миелиновых оболочек, такие, как микроглиальный фермент калпаин-1 (Hinman J. et al., 2004). В мозге больных шизофренией обнаружено существенное повышение уровня калпротектина, белка семейства S100, который синтезируется преимущественно микроглией, является неспецифическим маркером воспаления и способен вызывать редукцию дендритного дерева нейронов (Foster R. et al., 2006).
Полученные данные о связи между особенностями морфологии микроглиальных клеток и выраженностью изменений олигодендроглии и миелинизированных аксонов при аксонов ( N/1000 мкм ) Na атрофичных миелинизированных (N/1000 мкм ) Nа атрофичных миелинизированных аксонов шизофрении свидетельствуют, что реактивность микроглии может быть важным связующим звеном между изменениями иммунного статуса пациентов, изучение которых в настоящее время является самостоятельным направлением в биологической психиатрии (Коляскина Г.И и др., 2004; Клюшник Т.П. и др., 2005; Strous R. et al., 2006), и нарушениями межнейрональных и глио-нейрональных взаимодействий при этом заболевании.
Оценка влияния нейролептической терапии на исследованные параметры При исследовании аутопсийного мозга больных шизофренией необходимо принимать во внимание возможное влияние длительного приема нейролептиков на исследуемые параметры. Для оценки интенсивности нейролептической терапии мы использовали хлопромазиновый эквивалент, который определяли общепринятым способом (American Psychiatric Association, 1997). Этот показатель, введенный J.M.Davis (1974), служит для оценки усредненной дозы нейролептиков (мг/день), принимаемой больным в течение последнего года перед смертью.
Ни для одного параметра, исследованного в настоящей работе, не выявлено достоверных корреляций с хлорпромазиновым эквивалентом. Кроме того, часть параметров различались достоверно между случаями шизофрении, получавшими нейролептики, но выделенными по клиническим особенностям заболевания в разные подгруппы. Для ряда параметров наш вывод об отсутствии влияния нейролептической терапии подтверждается экспериментальными данными.
Так, длительное введение крысам галоперидола приводило к достоверному увеличению числа синапсов на дендрит в компактной части черной субстанции (Benes F. et al., 1983), то есть к изменениям противоположной направленности по сравнению с выявленными нами при шизофрении. Для гиппокампа показано отсутствие изменений экспрессии ряда синаптических маркеров при экспериментальном введении галоперидола, клозапина и оланзапина (Eastwood S. et al., 1995а, 1997). Установлено, что длительное введение нейролептиков не вызывает изменений ультраструктуры и числа митохондрий в нейропиле гиппокампа по данным электронно-микроскопического исследования (Eyles D. et al., 2000) или приводит к увеличению активности митохондриальных моноамиоксидаз, которые могут считаться маркером числа митохондрий в гиппокампе крыс (Prince J. et al., 1997). Нейролептики также подавляют накопление липофусцина в нейронах мозга стареющих животных (Roy D, et al., 1984). К сожалению, на настоящий момент очень мало известно о влиянии нейролептической терапии на число и структуру глиальных клеток в мозге. Однако показано, что эти препараты способны редуцировать как общее число глиальных клеток (окрашивание по Нисслю) (Konopaske G. et al., 2007), так и S100B иммунореактивных астроцитов в париетальной коре приматов (Konopaske G. et al., 2008) в противоположность изменениям, выявленным нами при шизофрении. С другой стороны, имеются сообщения о стимуляции глиогенеза в мозге животных при действии нейролептиков (Kodama M. et al., 2004).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, использованный в настоящем исследовании ультраструктурноморфометрический метод позволил получить доказательства нарушений межнейрональных синаптических связей в двух важных с точки зрения нейрофизиологии психоза областях мозга, черной субстанции и гиппокампе, а также существенной роли изменений глиальных клеток и межклеточных глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий в нарушении связей между нейронами при шизофрении. Выявленный в гиппокампе при шизофрении комплекс изменений межклеточных взаимодействий включал дефицит глутаматергических синаптических контактов, прогрессирующий с течением заболевания дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах, патологические изменения олигодендроцитов в сочетании с нарушением аксо-глиальных взаимодействий и атрофией аксонов, взаимосвязь патологии олигодендроцитов и атрофии миелинизированных аксонов с реактивностью микроглии, а также компенсаторные изменения, выражавшиеся в увеличении объемной фракции и численной плотности перинейрональных астроцитов.
Естественно, что взятый в отдельности каждый из описанных в работе феноменов не является специфичным для шизофрении и может встречаться при многих других формах патологии мозга. Однако ряд фактов позволяет заключить, что комплекс выявленных изменений связан с болезнью и достаточно типичен для шизофрении. Так, особенности изменений межклеточных взаимодействий были достоверно связаны с клиническими характеристиками шизофрении, что определяло специфику ультраструктурной патологии поля СА3 гиппокампа в связи с преобладанием негативной или позитивной симптоматики заболевания, с возрастом манифестации психоза, с длительностью заболевания. Кроме того, при анализе и сборе материала было исключено влияние на результаты таких важных факторов, как возраст, длительность посмертного интервала и интенсивность нейролептической терапии, для оценки которой, в соответствии с общепринятой практикой, использовался хлорпромазиновый эквивалент.
На современном этапе биологической психиатрии получили широкое распространение представления о том, что в патогенезе шизофрении ведущую роль играют нарушения развития мозга, в том числе обусловленные генетически (Cotter D., Pariante C., 2002; Arnold S. et al., 2005). Однако ряд данных, полученных в последние годы при прижизненных исследованиях мозга пациентов, ставят вопрос о том, что прогрессирующая редукция объема мозга и активация микроглии при этом заболевании могут быть результатом текущего патологического процесса По данным настоящего исследования картина ультраструктурной патологии гиппокампа при шизофрении, наряду с сохранностью ультраструктуры нейронов, включает в себя дистрофические и деструктивные изменения олигодендроцитов; прогрессирующие с течением заболевания дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах;
морфологические признаки различных типов активации микроглиальных клеток; атрофию части миелинизированных аксонов, что можно рассматривать как проявления текущего патологического процесса, а также компенсаторные пролиферативные перестройки со стороны астроцитов. С другой стороны, эти нарушения проявлялись как выраженные изменения межклеточных взаимодействий в гиппокампе при шизофрении и могут быть существенным фактором нарушений межнейрональных связей в мозге при этом заболевании.
Полученные нами данные свидетельствуют о перспективности использования ультраструктурно-морфометрического метода для изучения роли межклеточных взаимодействий в патологии мозга при психических заболеваниях.
Исследования межклеточных глио-глиальных и глио-нейрональных взаимодействий важны и с точки зрения поисков новых эффективных препаратов с антипсихотической активностью. В этой связи представляют особый интерес активно изучающиеся в плане их терапевтической эффективности при шизофрении лиганды метаботропных рецепторов глутамата, обладающих нейропротекторными свойствами при развитии NMDAопосредованной глутаматной токсичности (Baskys A. et al., 2005). Имеются данные, свидетельствующие, что эти вещества способны подавлять активацию микроглии (Taylor D. et al., 2003). Кроме того, агонисты метаботропных глутаматных рецепторов (mGluR1) обладают выраженными олигопротекторными свойствами (Deng W. et al., 2004).
Доказанная клиническая эффективность глицина и D-серина (Gof D., Coyle J., 2001; Coyle J., Tsai G., 2004), основными источниками которых в мозге являются астро- и микроглия, также свидетельствует в пользу того, что глия может быть перспективной мишенью для поиска новых подходов в лечении эндогенных психозов.
ВЫВОДЫ 1. Применение методов электронной микроскопии, морфометрии и иммуноцитохимии, с учетом возрастных и посмертно возникающих сдвигов в нервной ткани, позволило выявить комплекс ультраструктурных изменений в мозге при шизофрении, который включает нарушения межнейрональных синаптических связей, а также глио-нейрональных и глиоглиальных взаимодействий.
2. Впервые выявлено снижение числа синаптических контактов на дендритах иммуноцитохимически идентифицированных дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции при шизофрении. Эти данные являются морфологическим подтверждением существующей гипотезы о нарушении регуляции активности дофаминовых нейронов черной субстанции при этом заболевании.
3. С помощью современного морфометрического стереологического метода физического диссектора выявлен дефицит синаптических контактов между гигантскими окончаниями аксонов мшистых волокон гранулярных нейронов зубчатой фасции и шипиками пирамидных нейронов в поле СА3 гиппокампа. Эти данные свидетельствуют о дисфункции важного глутаматергического входа в гиппокамп, опосредованно связывающего его с областями коры.
4. Для синаптических контактов гиппокампа характерно достоверное уменьшение размеров шипиков в случаях шизофрении с преобладанием позитивной (то есть острой психотической) симптоматики, что не наблюдалось при преобладании негативных симптомов заболевания.
5. Показано, что при шизофрении олигодендроциты являются наиболее поврежденным типом клеток в гиппокампе, что сопровождается нарушением аксо-глиальных взаимодействий:
- выявлены выраженные дистрофические и деструктивные изменения их ультра- структуры вплоть до необратимых;
- доказано наличие аксонопатии в виде атрофии части миелинизированных аксонов в гиппокампе при шизофрении, связанной с набуханием периаксонального отростка олигодендроцита.
6. Установлена не описанная ранее гетерогенность в распределении морфологических типов микроглии в гиппокампе при шизофрении, не наблюдавшаяся в контроле:
- микроглиальные клетки в гиппокампе мозга психически здоровых людей представлены в разных пропорциях рамифицированными, амебоидными и круглыми клетками, а единичные палочковидные клетки встречались редко;
- при шизофрении выделены подгруппы случаев с преобладанием микроглии либо амебоидного, либо палочковидного типа, что свидетельствует о различных видах функциональной активации микроглиальных клеток при этом заболевании.
7. При шизофрении амебоидная микроглия преобладала в случаях с ранней манифестацией психоза, а палочковидная - в случаях с началом заболевания в зрелом возрасте.
8. Выявлена связь между преобладанием определенных морфологических типов микроглиальных клеток и особенностями глио-глиальных и глио-нейрональных взаимодействий при шизофрении:
- для олигодендроцитов с признаками деструктивных изменений характерны непосредственные контакты с палочковидными микроглиальными клетками;
- достоверное увеличение численной плотности и пропорции атрофичных миелинизированных аксонов выявлены только в случаях с преобладанием микроглии палочковидного типа.
9. Достоверное увеличение размеров астроцитов и снижение численной плотности и объемной фракции митохондрии в них с возрастом, выявленные при сравнении подгрупп контрольных наблюдений старше и моложе 50 лет, отсутствовали при шизофрении.
10. Показано, что нарушения ультраструктуры астроцитов при шизофрении прогрессируют в течение заболевания:
- численная плотность и объемная фракция митохондрий в астроцитах достоверно снижена в подгруппе случаев шизофрении с длительностью заболевания более 21 года по сравнению с контролем и подгруппой шизофрении с меньшей длительностью заболевания;
- при шизофрении выявлены достоверные отрицательные корреляционные связи между объемной фракцией и численной плотностью митохондрий в астроцитах и и длительностью болезни и положительные - между объемной фракцией липофусцина в астроцитах и длительностью болезни, что может свидетельствовать о нарастании с течением болезни дисфункции астроцитов при этом заболевании.
11. Показано достоверное повышение численной плотности и объемной фракции перинейрональных астроцитов в пирамидном слое гиппокампа при шизофрении, что может быть проявлением защитной компенсаторной реакции в ответ на прогрессирующую функциональную неполноценность астроцитов при этом заболевании.
12. Выявленные при шизофрении структурные нарушения в изученных областях дофаминергической и глутаматергической систем мозга, отражающие изменения межнейрональных, глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий, достоверно связаны с некоторыми клиническими особенностями заболевания, что дает основание полагать их непосредственное отношение к патогенезу заболевания.
Список опубликованных работ по теме диссертации:
1. Kolomeets N.S., Uranova N.A., Orlovskaya D.D. The ultrastructure of synaptic contacts on the dopaminergic neurons in postmortem substantia nigra of schizophrenics // Abstract for VIIIth Biennial winter workshop on schizophrenia, March 22-27 1996. - Crans-Montana, Switzerland, 1996. // Schizophr. Res. -18, -V.2. -P. 180.
2. Uranova N.A., Orlovskaya D.D., Kolomeets N.S., Vikhreva O.V., Zimina I.S., Denisov D.V. Morphometric study of synaptic size in autopsied prefrontal cortex, caudate nucleus and substantia nigra of schizophrenics // Abstract for International Congress on Schizophrenia Research, April 12-16 1997. -Colorado Springs, U.S.A., 1997. Schizophr. Res. -1997. -V. 24. -P.
41-42.
3. Коломеец Н.С., Уранова Н.А. Синаптические контакты при шизофрении:
исследование с иммуноцитохимической идентификацией дофаминергических нейронов // Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. -1997. - Т. 97. ЦС.39-43.* Kolomeets N.S., Uranova N.A. Synaptic contacts in schizophrenia: studies using immunocytochemical identification of dopaminergic neurons // Neurosci. Behav. physiol. -1997. - V. 29. -P. 217-221.
4. Уранова Н.А., Вихрева О.В., Коломеец Н.С., Зимина И.С., Орловская Д.Д., Денисов Д.В. Количественная оценка численной плотности межнейрональных синаптических связей в мозге человека в норме и при психической патологии // XYII Российская конференция по электронной микроскопии: Тезисы докладов. - Москва, Черноголовка, 1998. - С. 298.
5. Uranova N.A., Orlovskaya D.D., Kolomeets N.S., Zimina I.S., Vikhreva O.V., Rachmanova V.I., Klintsova A.Y., Black J.E., Greenough W.T. Abnormal patterns of cortical neuronal connectivity in schizophrenic brain: a postmortem electron microscopic study // 29th Annual Meeting: Abstracts for Society for Neuroscience. - Miami Beach, U.S.A., 1999. Soc. Neurosci. 1999. -V. 25. -P. 817.
6. Orlovskaya D.D., Uranova N.A., Zimina I.S., Kolomeets N.S., Vikhreva O.V., Rachmanova V.I., Black J.E., Klintsova A.Y., Greenough W.T. Effect of professional status on the number of synapses per neuron in the prefrontal cortex of normal human and schizophrenic brain // 29th Annual Meeting : Abstract for Society for Neuroscience. -Miami Beach, U.S.A., 1999. Soc.
Neurosci. -1999. -V. 25. -P. 818.
* Здесь и далее курсивом выделены статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России 7. Уранова Н.А., Орловская Д.Д., Коломеец Н.С., Зимина И.С., Вихрева О.В., Денисов Д.В. Дезорганизация межнейрональных синаптических связей в мозге больных шизофренией // Шизофрения и расстройства шизофренического спектра / Под ред.
Смулевича А.Б. - Москва, 1999. -С. 351-353.
8. Kolomeets N.S., Rachmanova V.I., Orlovskaya D.D., Uranova N.A. Ultrastructural alterations of glutamatergic mossy fiber synapses in postmortem hippocampus of schizophrenics // Abstract for Xth biennial winter workshop on schizophrenia, February 5-11 2000. Davos, Switzerland, 2000. Schizophr.Res. -2000. -V. 41. -P. 110.
9. Uranova.A., Orlovskaya D.D., Vikhreva, O.V., Zimina, I.S., Kolomeets,.S., Vostrikov V.M., Rachmanova V.I. Electron microscopic study of oligodendroglia in severe mental illness // Brain Res. Bull. -2001. -V. 55. -P. 597-610.
10. Коломеец Н.С., Востриков В.М., Андросова Л.В., Секирина Т.П., Коляскина Г.И., Морозова М.А., Уранова Н.А. Влияние сыворотки крови больных шизофренией на ультраструктуру микроглии в культуре эмбрионального мозга человека: связь с психопатологией и продукцией интерлейкина-2. // 13-ая Российская конференция по нейроиммунологии: Тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2004. Нейроиммунология. 2004.
- № 2. ЦС. 51-52.
11. Kolomeets.S., Orlovskaya D.D., Rachmanova V.I., Uranova.A. Ultrastructural alterations in hippocampal mossy fiber synapses in schizophrenia: a postmortem morphometric study // Synapse. -2005. -V. 57. -P.47-55.
12. Uranova N.A, Vostrikov V.M., Vichreva O.V., Zimina I.S., Kolomeets N.S., Rachmanova V.I., Orlovskaya D.D. Oligodendroglia in schizophrenia: findings from postmortem studies // Abstract for 8th World Congress of Biological Psychiatry, June 28-July 3, 2005. -Vienna, 2005. World J. Biol. Psychiatry. -2005. -V. 6. -P. 74-75.
13. Kolomeets.S., Orlovskaya D.D., Uranova.A. Decreased numerical density of CAhippocampal mossy fiber synapses in schizophrenia // Synapse. -2007. -V. 61. -P. 615-621.
14. Uranova.A., Vostrikov V.M., Vichreva O.V., Zimina I.S., Kolomeets.S., Orlovskaya D.D. The role of oligodendrocyte pathology in schizophrenia // Int. J. neuropsychopharm. -2007. V. 10. -P. 537-545.
15. Уранова Н.А., Востриков В.М., Вихрева О.В., Зимина И.С., Коломеец Н.С., Рахманова В.И., Орловская Д.Д. Роль олигодендроглии в патогенезе шизофрении // Психиатрия. -2007. -Т. 04(28). -С. 49-54.
16. Коломеец Н.С. Атрофия миелинизированных аксонов и ультраструктура микроглиальных клеток в гиппокампе при шизофрении // Тезисы докладов Российской конференции Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии, 9-11 октября 2007.- Москва, 2007. -С. 336-337.
17. Коломеец Н.С. Патология гиппокампа при шизофрении // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2007. -Т.107. -С. 103-114.
18. Коломеец Н.С. Астроцитарная глия гиппокампа при шизофрении // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2008. -Т.108. -С. 70-76.
19. Коломеец Н.С., Уранова Н.А. Прогрессирующие изменения ультраструктуры астроцитов гиппокампа при шизофрении // 2 Всероссийская конференция Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии: Тезисы докладов. - Томск, 2008. -С.
119-120.
20. Коломеец Н.С., Орловская Д.Д., Уранова Н.А. Патология олигодендроглии и миелинизированных волокон в гиппокампе при шизофрении (ультраструктурноморфометрическое исследование) // Журнал неврологии и психиатрии.-2008. ЦТ. 108. ЦС. 5260.
21. Kolomeets N.S. The ultrastructure of astrocytes in the hippocampus in schizophrenia. // Abstract for 9th World Congress of Biological Psychiatry, June 28-July 2, 2009. -Paris, 2009.
World J. Biol. Psychiatry. -2009. -V. 6. -P. 330.
22. Коломеец Н.С. Значение реактивности микроглии в патологии мозга при шизофрении. // Журнал неврологии и психиатрии.-2009. ЦТ. 109. ЦС. 60-63.
23. Коломеец Н.С., Уранова Н.А. Изменения синаптических контактов на дофаминергических нейронах черной субстанции при шизофрении (иммуноцитохимическое исследование) // Материалы общероссийской конференции Взаимодействие специалистов в оказании помощи при психических расстройствах, 27-октября 2009. ЦМосква, 2009. ЦС. 382.
24. Kolomeets.S., Uranova.A. Ultrastructural abnormalities of astrocytes in the hippocampus in schizophrenia and duration of illness: a postmortem morphometric study// World J. Biol. Psychiatry. -2010. -V. 11. -P. 282-292.