Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Павлов Виталий Михайлович

Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических  наук

Оболенск - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, профессор аДятлов Иван Алексеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор аЗверев аВиталий Васильевич

доктор медицинских наук, профессор аАфанасьева Станислав Степанович

доктор медицинских наук, профессор аДядищева Николай Романович

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.аФ.аГамалеи РАМН

Защита состоится л26 мая 2011аг. в л13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии по адресу:а142279, Московская область, Серпуховской район, пос. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологииа

Автореферат разослан л _____________ 2011аг.а
а

аУченый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук  Н.аК.аФурсоваа

Актуальность проблемы

Разработка современных лекарственных препаратов для лечения инфекционных заболеваний и средств их профилактики основывается на детальных данных о молекулярных структурах факторов патогенности и механизмах их действия. В частности, для создания вакцин важно знать, какие антигены являются протективными, а какие компоненты бактерий подавляют защитную функцию иммунной системы организма. История изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, однако до настоящего времени нет исчерпывающих сведений о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (TitballаR.аW.аetаal., 2003; ДомарадскийаИ.аВ., 2004; SjostedtаA., 2006). Исследование генома туляремийного микроба является одним из магистральных направлений решения проблем, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов борьбы с туляремией. Проведенные недавно работы по определению нуклеотидных последовательностей геномов аттенуированного вакцинного штамма F.аtularensis subsp. holarcticaаLVS [ html] и природного вирулентного штамма F.аtularensis subsp. tularensis Schu4 (LarssonаP.аetаal., 2005) открыли широкие перспективы для изучения факторов патогенности и поиска протективных антигенов туляремийного микроба.

До недавнего времени адаптация общепринятых генетических методов для исследования генома F.аtularensis представляла собой достаточно сложную проблему, что существенно препятствовало эффективному применению всего современного методического потенциала микробиологии для решения задач по выявлению факторов патогенности и иммуногенности туляремийного микроба.

Детальное исследование молекулярной структуры криптической плазмиды из бактерий F.аnovicida like F6168 (РодионовааИ.аВ. иадр. 1991) позволит получить новые данные о влиянии данной плазмиды на биологические свойства бактерий рода Francisella и получить информацию, необходимую для конструирования плазмидных векторов. Важным этапом в исследованиях геномов микроорганизмов является перенос генетических структур в бактериальные клетки изучаемых микроорганизмов. Отсутствие информации о плазмидах, способных реплицироваться в F.аtularensis, до последнего времени сдерживало адаптацию переноса ДНК в клетки туляремийного микроба методами трансформации. Оптимизация методов криотрансформации и конъюгации для F.аtularensis позволит переносить в бактерии генетические конструкции для аллельного обмена и создавать модельные штаммы для изучения метаболизма туляремийного микроба.

Показано, что бактерии штамма F.аtularensisаLVS модулируют белковый синтез во время роста в макрофагах. Среди белков, индуцируемых при размножении бактерий F.аtularensis внутри макрофагов, выделяется белок с молекулярной массой 23акДа (GolovliovаI.аetаal., 1997). Однако, функциональная роль этого белка в патогенезе F.аtularensis до последнего времени выяснена не была. Одним из путей решения этой проблемы могло бы стать создание метода аллельного обмена генов в хромосоме F.аtularensis, позволяющего конструировать изогенные штаммы, отличающиеся только по изучаемому гену.

Первичным защитным барьером прокариотических и эукариотических клеток являются белки семейства суперокиддисмутаз (СОД), которые превращают токсичный радикал O2 - в молекулярный кислород (O2) и перекись водорода (H2O2) (MillerаR.аA.аetаal., 1997). У туляремийного микроба также выявлена СОД (ШимонякаН.аИ. иадр., 1992), тем не менее, роль этого фермента в патогенезе туляремии и в бактериальном метаболизме до последнего времени не была выяснена. Попытки инактивации СОД в других патогенных микроорганизмах приводили к потере жизнеспособности бактерий. Поскольку метод аллельного обмена позволяет не только инактивировать гены, но и модулировать их синтез, этот подход может быть использован для изучения СОД туляремийного микроба.

       Живая туляремийная вакцина на основе штамма F.аtularensisа15/10 была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (ОлсуфьеваН.аГ., 1975). На основе этого же штамма в США был получен штамм F.аtularensisаLVS и создана экспериментальная живая вакцина (EigelsbachаH.аT.аetаal, 1961).

Поскольку обе вакцины обладают определенной реактогенностью, обусловленной не охарактеризованными пока факторами патогенности (ОлсуфьеваН.аГ., 1975), то проводимый в настоящее время сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов вакцинного штамма LVS и природных штаммов, несомненно, облегчит задачу создания генетически охарактеризованного современного вакцинного штамма без остаточных факторов реактогенности. Очевидно, что без эффективных методов целенаправленного аллельного замещения невозможно достижение существенных успехов в понимании молекулярных основ действия факторов как реактогенности, так и иммуногенности туляремийного микроба.

       В качестве бактериальных векторов для получения рекомбинантных вакцин используют целый ряд микроорганизмов, среди которых: аттенуированные штаммы M.аtuberculosis (Ellner J.J., 1998; Senaratne R.H,аetаal., 2007; Henao-Tamayo M.аetаal., 2007), близкородственные микобактерии (Abou-Zeid C.аetаal., 1997),а также сальмонеллы (MollenkopfаH.J. etаal., 2001) и некоторые другие (MikiаK. etаal., 2004). Известно, что туляремийная вакцина, обладая умеренной реактогенностью, вызывает формирование длительного напряженного иммунитета (TarnvikаA.,1989). Кроме специфического иммунитета вакцинные штаммы F.аtularensis индуцируют краткосрочную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов (Legionella, Listeria иадр.) (BelyiаY.аF.аetаal., 1996). До последнего времени изучение иммуномодулирующих свойств штамма F.аtularensisа15/10 сдерживалось из-за отсутствия генетических методов по переносу дополнительных генов, кодирующих протективные антигены, в клетки вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма туляремийного микроба с гетерологичными протективными антигенами (в частности, наиболее иммуногенными антигенами M.аtuberculosis Ag85В и ESAT-6) позволит оценить потенциал вакцинного туляремийного штамма в качестве  нового бактериального вектора.

       Все вышеизложенное обосновывает актуальность разработки молекулярных инструментов для всестороннего исследования туляремийного микроба. Полученные модифицированные штаммы туляремийного микроба смогут открыть новые перспективы для изучения иммунобиологических свойств туляремийного микроба и получить детальную информацию о факторах патогенности и иммуногенности F.аtularensis.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка методологии молекулярно-генетического изучения F.аtularensis и оценка с ее помощью роли отдельных генетических структур в иммунопатогенезе туляремийной инфекции.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать и оптимизировать условия переноса плазмидных ДНК в клетки F.аtularensis методами трансформации, конъюгации и мобилизации.
2. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность криптической плазмиды из бактерий F.аnovicidaаlikeаF6168, а также исследовать функциональную активность выявленных плазмидных генов.
3. Создать ряд плазмидных векторов для клонирования промоторов и экспрессии гетерологичных генов протективных антигенов в F.аtularensis и изучить их свойства.
4. Создать варианты вакцинного штамма F.аtularensisа15/10, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза, и изучить иммунобиологические свойства полученных штаммов.
5. Разработать систему аллельного замещения генов в хромосоме туляремийного микроба и способ получения вариантов вакцинного штамма F.аtularensis с модифицированными генами iglC и sodB.
6. Изучить иммунобиологические свойства полученных вариантов F.аtularensisа15/10 и штамма LVS, дефектных по генам iglC и sodB.

Новизна исследования

       Впервые разработана система для аллельного замещения генов в хромосоме F.аtularensis. Созданы плазмидные векторы для конструирования плазмид, необходимых для осуществления аллельного обмена в хромосоме F.аtularensis. Предложенный метод позволяет: а) удалять определенные участки генома F.аtularensis, б) модифицировать регуляторные и другие области оперонов; в) получать генетически маркированные вакцинные штаммы F.аtularensis.

Впервые в геноме F.аtularensis выявлены две копии гена iglC, кодирующего белок с молекулярной массой 23акДа, и показана необходимость продукта гена iglC для внутримакрофагального размножения вакцинного штамма F.аtularensis. Вариант вакцинного штамма без генов iglC не защищал вакцинированных мышей от гибели при заражении штаммом F.аtularensisа503.

Показано снижение экспрессии гена sodB в F.аtularensis в результате замены последовательности нуклеотидов инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB. Вакцинный штамм со сниженным уровнем синтеза белка СОДаB обладает меньшей вирулентностью для мышей, чем немодифицированный вакцинный штамм.

Впервые показана возможность введения плазмид в вакцинный штамм туляремийного микроба методом криотрансформации. Оптимизированы условия криотрансформации F.аtularensis.

Впервые показана возможность мобилизации плазмид из клеток Escherichiaаcoli в клетки F.аtularensis и оптимизированы условия межвидового скрещивания. Созданы мобилизуемые плазмидные векторы, позволяющие переносить фрагменты ДНК из E.аcoli в F.аtularensis.

Впервые получен вариант конъюгативной плазмиды pSa, способный с высокой эффективностью переноситься из E.аcoli в F.аtularensis и, наоборот, из F.аtularensis в E.аcoli.

Проведено структурно-функциональное исследование криптической плазмиды из рода Francisella - плазмиды pFNL10. Выявлена способность плазмиды pFNL10 стабильно реплицироваться в клетках вакцинного штамма туляремийного микроба. Показано, что вклад в стабильность наследования плазмиды рFNL10 бактериями F.аtularensis вносят продукты плазмидных генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы фагааРа1.

Впервые созданы стабильные плазмидные векторы для вакцинного штамма F.аtularensis, позволившие приступить к изучению возможности использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании современных рекомбинантных вакцинных штаммов.

Впервые на основе F.аtularensisа15/10 созданы штаммы, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза. Показан повышенный синтез клетками F.аtularensis гибридных белков, состоящих из лидерной части предшественника основного белка внешней мембраны F.аtularensis FopаA и белкового антигена M.аtuberculosis.

Впервые показано формирование специфического иммунного ответа на туберкулезные антигены у мышей, вакцинированных штаммами F.аtularensis, синтезирующими протективные антигены возбудителя туберкулеза. Вакцинированные мыши обладали повышенной устойчивостью к аэрозольному заражению возбудителем туберкулеза.

Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

Практическая значимость

Разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих мутантов F.аtularensis, сочетающая локализованный мутагенез inаvitro и гомологичную рекомбинацию inаvivo, а также позволяющая получать достоверные данные о роли выбранных генов в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя туляремии.

Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках F.аtularensis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную продукцию туберкулезных антигенов в клетках вакцинного штамма F.аtularensis.

Сконструированы штаммы F.аtularensisаRVp17 и RVp18, способные к синтезу основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза, которые могут служить основой для разработки новой рекомбинантной живой туберкулезной вакцины.

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) депонированы 11 авторских штаммов, необходимые для изучения генетических детерминант факторов иммуногенности и патогенности возбудителя туляремии, а также сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба (Федеральный уровень внедрения, 2007аг.), Методические рекомендации Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба (Учрежденческий уровень внедрения, 2003аг.) и Методические рекомендации Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба (Учрежденческий уровень внедрения, 2009аг.)

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс методических приемов, позволяющих переносить плазмиды в бактерии F.аtularensisа15/10 методами криотрансформации и мобилизации. Вариант конъюгативной плазмиды pSa, при скрещивании который способен переходить из клеток E.аcoli в бактерии F.аtularensis15/10 и обратно. Методология переноса плазмид в клетки F.аtularensis позволяет создавать генетически маркированные штаммы, необходимые для всестороннего изучения факторов иммуногенности и патогенности туляремийного микроба.
2. Плазмида рFNL10, выделенная из штамма F.аnovicidaаlikeаF6168, способна реплицироваться в F.аtularensis и содержит все элементы для репликации по тета-механизму. Наличие в плазмиде рFNL10 генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы, обуславливает высокую стабильность наследования данной плазмиды бактериями F.аtularensis. Плазмида рFNL10 является основой для создания плазмидных векторов для F.аtularensis.
3. Плазмидные векторы для F.аtularensis, позволяющиеаклонировать промоторы и экспрессировать гетерологичные гены протективных антигенов в вакцинном штамме туляремийного микроба. Высокоэффективный способ экспрессии протективных антигенов M.аtuberculosis в вакцинном штамме F.аtularensisа15/10.
4. Штаммы F.аtularensis,а экспрессирующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6, которые индуцируют противотуберкулезный Тклеточный иммунный ответ у вакцинированных мышей и создают специфическую защиту мышей на модели легочной формы туберкулеза.
5. Способ целенаправленного создания вариантов вакцинного штамма F.аtularensis с модифицированными генами и делециями в хромосоме, основанный на методе аллельного обмена.
6. Ген iglC в хромосоме F.аtularensis находится в двух копиях. Направленное "выключение" синтеза 23акДa белка, кодируемого геном iglC, в штаммах F.аtularensisа15/10 и LVS приводит к подавлению способности клеток F.аtularensis к внутримакрофагальному размножению.
7. Продукт гена sodB F.аtularensis необходим для жизнеспособности туляремийного микроба. Замена инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB приводит к снижению уровня экспрессии гена sodB в клетках F.аtularensis. Штамм F.аtularensisа FtsodB , несущий модифицированный ген sodB, обладает сниженной вирулентностью для мышей по сравнению с исходным штаммом F.аtularensis LVS.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на 35 международных и 7 российских научных конференциях: Всесоюзной научной конференции Актуальные проблемы профилактики туляремии (Симферополь, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИаПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993); Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); 3-м Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2005); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Вакцинология 2008. Совершенствование иммуно-биологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней (Москва, 2008); First International Conference on Tularemia (Umea, Sweden, 1995); Second International Conference on Tularemia (Hradec Kralove, Czech Republic, 1997); 3rd International Conference on Anthrax (University of Plymouth, UK, 1998); International Conference 'Problems of Medical and Ecological Biotechnology (Obolensk, 1999); 4th International Conference on Tularemia (City of Bath, UK, 2003);  First International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2005" (Badajoz, Spain, March, 2005); NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs (Woods Hole, MA, USA, 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научном семинаре ГН - ПМБ 30аиюня 2010аг. протокол №а15.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 научных работ, в том числе 12 статей, представленных в научных журналах, рекомендованных ВАК; один патент и одна заявка на патент.

Структура и объем диссертации.

Работа состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 240 страницах, содержит 23 таблицы и 56 рисунков. Список литературы включает 215 работ.

содержание диссертации

Гава 1. Обзор литературы

В первых разделах главы обобщены данные о возбудителе туляремийной инфекции. Приведена современная классификация бактерий рода Francisella, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей туляремийных геномов. Изложены этапы истории создания живой туляремийной вакцины и попытки конструирования эффективных препаратов корпускулярных и химических туляремийных вакцин. Проанализирована литература об особенностях противотуляремийного иммунитета на основании данных, полученных, главным образом, на мышиной модели туляремии. Основная часть обзора посвящена работам по генетическому обмену у F.аtularensis. Особое внимание уделено вопросам переноса плазмид и генов в клетки F.аtularensis, влияния на этот процесс видовой и подвидовой принадлежности реципиента, а также системы рестрикции-модификации. Другим важным вопросом, освещенным в обзоре, является гомологичная рекомбинация в клетках F.аtularensis. Важной частью обзора литературы является раздел о плазмидах, способных реплицироваться и экспрессироваться в туляремийном микробе. Рассмотрены подходы использования таких плазмид в качестве основы для создания молекулярных инструментов изучения F.аtularensis.

Заключительная часть обзора посвящена работам по исследованию факторов патогенности и иммуногенности F. tularensis, проведенным в последние годы с использованием молекулярно-генетических методов.

Гава 2. Материалы и методы

В работе были использованы 2 штамма F.аtularensis, 20 штаммов E.аcoli, 3 штамма M.аtuberculosisа и штамм M.аbovisаBCG. Бактериальные штаммы были получены из ГКПМ-Оболенск. Штамм F.аtularensisаLVS был любезно предоставлен Карен Элкинс (Национальный институт здоровья, США).

Бактерии  E.аcoli выращивали в L-бульоне или L-агаре (МаниатисаТ.аС. иадр., 1984), при необходимости добавляли антибиотики: ампициллин (Ар), хлорамфеникол (Cm) или тетрациклин (Тс) в концентрациях 50, 10 и 20амг/л, соответственно.

Клетки F.аtularensis  выращивали на плотной питательной среде TA следующего состава: эритрит-агар, 1а% высушенной крови крупного рогатого скота, 1а% глюкозы, 0,05а% цистеина, 0,0025а% тиамина хлорида, рН 7,2, либо на FT-агаре (ФГУН ГН - ПМБ, Оболенск), при необходимости в среду добавляли антибиотики: сульфат полимиксина В (Pm) (100 мкг/мл), Сm (3-10амг/л),

Tc (3-10амг/л). При выращивании бактерий F.аtularensis в жидкой питательной среде использовали питательную среду ТВ (ЛапинаА.аА. иадр., 2010) или питательную среду Чемберлена (Chamberlain Medium) (Chamberlain R.E., 1965).

Штамм M.аtuberculosisаH37Rv культивировали на жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 или на твердой агаризованной среде Middlebrook 7H11 (Himedia Laboratories Pvt.Limited, Индия). Штаммы M.аbovisаBCG и M.аtuberculosisаН37Ra культивировали на глицерин-альбуминовой среде (конечная концентрация БСА - 0,1а%) без добавления Tween-20 при температуре 37аC в течение 20 сут в атмосфере 0,5а% СО2 .

В работе использовали беспородных белых мышей массой (19а±а2)аг, мышей линии Balb/C, кроликов породы шиншилла из вивария ГН - ПМБ. В ряде экспериментов использовали мышей линии C57BL/6 (возраст 8Ц16 недель), свободных от патогенов (specific pathogen free - SPF), полученных из питомника лабораторных животных "Пущино" ( г. Пущино, Московская область).

После заражения наблюдение за мышами проводили в течение 21 сут. Величину ЛД50 определяли по методу Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962). Мышей эвтаназировали ингаляцией СО2 .

Диссеминацию штаммов F.аtularensis в органах мышей (по 12 мышей линии С57BL/6 в группе, возраст 6-8 недель) определяли после подкожного введения 20аКОЕ/мышь. На 3, 5, 7 и 10 сут из каждой группы по 3 мыши была проведена некропсия печени и селезенки.

Мышей заражали бактериальной суспензией M.аtuberculosis (1аа106аКОЕ/мл в ЗФР c добавлением 0,05а% Tween-80) с использованием ингaляционной установки Glas-Col Inhalation Exposure System 099C (Terre Нaute, США, модель 4224). Органы мышей гомогенизировали в размельчителе тканей Seward stomacher 80 (Tekmar, США).

Все манипуляции с ДНК (выделение плазмидной ДНК из E.аcoli, рестрикция, дефосфорилирование, лигирование, электрофорез в агарозном геле, ДНК-ДНК гибридизация и трансформация плазмид в E.аcoli иадр.) проводили согласно руководству (МаниатисаТ.аС. иадр., 1984) и рекомендациям изготовителя (Fermentas, Латвия). Для определения размеров фрагментов в агарозном геле использовали маркеры молекулярных весов ДНК (Gibco-BRL, Grand Island, NY,и MBI Fermentas). Нуклеотидные последовательности определяли по методу Сэнджера (Sanger F.аetаal., 1977) на ABI373 ДНК-секвенаторе (Perkin-Elmer, Urayasu, Япония) и на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США).

Биоинформатический анализ последовательностей ДНК проводили с помощью программ FASTA и BLAST и баз данных GenBank и SWISSProt.

Плазмидную ДНК из штаммов рода Francisella выделяли щелочным методом (МаниатисаТ.аС.иадр., 1984, Pavlovаetаal., 1994), в случае необходимости препараты ДНК очищали с помощью центрифугирования в градиенте хлористого цезия (CsCl) в присутствии бромистого этидия (EtBr) (МаниатисаТ.аС иадр., 1984). Определение положения первых нуклеотидов матричных РНК проводили по (PomerantsevаAаP.аetаal.,2001). Перенос плазмидных ДНК в F.аtularensis проводили методом электростимуляции на электропораторе Gene Pulser II Electroporation System, (BioЦRad, Hercules, CA,США (BaronаG.аS.,аetаal., 1995) и криотрансформации (МокриевичаА.аН.и др., 1994). Скрещивание бактерий E.аcoli и F. tularensis проводили на плотной питательной среде.

ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

Плазмиды:

pHV33mob - создана в результате встраивания BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pDM4(25) (1,7 т.п.н.) с mob областью плазмиды RP4 в Bam HI сайт плазмиды pHV33. Селективный маркер - Ap;

pPV - получена в результате объединения фрагментов: BamHI фрагмента с oriT из плазмиды pDM4 (1,6 т.п.н.), PstI фрагмента плазмиды pDM4 с геном sacB Bacillus subtilis (2,6 т.п.н.) и HindIII-фрагмента плазмиды pSa с геном cat в плазмиде pUC19;

pVP5 - создана в результате встраивания BamHI-SnaI фрагмента ДНК плазмиды pML2.1 (МашкоаС.аВ. иадр., 1985) с геном cat в BamH1-Sma1сайты плазмиды pUC18;

вектор рРМС1 был получен в результате объединения четырех фрагментов ДНК: RepA-SphIЦNheI (2361 п.н.), cat-NheIЦXhoI (1013 п.н.), groES-XhoIЦSacI (367 п.н.) и RepB-SphIЦSacI (552 п.н.). Селективный маркер ЦCm.

Ампликон cat-NheI - XhoI, фланкированный сайтами NheI и XhoI, был получен с использованием пары праймеров Cm-NheI/Cm-XhoI и плазмидной ДНК pC194 в качестве матрицы. Ампликон groES-XhoIЦSacI, фланкированный сайтами XhoI и SacI, был получен с использованием пары праймеров groES-Xho/groES-Sac и ДНК F.аtularensis15/10 в качестве матрицы.

Фрагмент RepB-SphIЦSacI плазмиды pUC57-RepB был вырезан из плазмиды pUC57-RepB рестриктазами SphI и SacI. Плазмида pUC57-RepB была получена в результате встраивания ампликона RepB-PstIЦSphI (537 п.н.) между сайтами PstI и SphI плазмиды pUC57. Ампликон RepB-PstIЦSphI (537 п.н.) был синтезирован с помощью пары праймеров RepB-Pst/RepB-Sph и плазмидной ДНК pFNL10 в качестве матрицы.

Препарат ДНК, несущей последовательность гена SodаA, получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма M.аtuberculosisаH37Rv в качестве матрицы и пары специфических праймеров: 5ТGAATGGATCCAGCCGAATACACCTTGCCAGAC3Т и 5ТGCGGGAATTCCCGAATATCAACCCCTTGGT3Т. Амплифицированный фрагмент ДНК был встроен между BamHI и EcoRI сайтами в плазмиду pET23b(+)(Novagen, USA). Штамм E.аcoliаBL21а(pET23b(+)SodА) был использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка SODаА согласно инструкции производителя плазмиды pET23b(+) (Novagen, США).

Препарат ДНК, несущей последовательность модифицированного гена fbpB, кодирующего зрелый белок Ag85В получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма M.аtuberculosisаH37Rv в качестве матрицы и пары праймеров 5ТGATCATATGTTCTCCCGTCCGGGTCTG3Т и 5ТGGTGGATCCTGACAGCCT GCGCC3Т. Ампликон встроен между сайтами NdeI и BamHI в плазмиду pET23b(+)(Novagen, USA). Штамм E.аcoliаBL21(pET23-85B) был использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка Ag85В-(His)6, согласно инструкции производителя плазмиды pET23b(+) (Novagen, США).

Препарат ДНК, несущей последовательность модифицированного гена esat-6, кодирующего белок ESAT-6, получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма M.аtuberculosisаH37Rv в качестве матрицы и пары праймеров: 5ТGGACATATGACAGACCAGCAGTGGAAT3Т и 5ТTTTCTCGAGTCCGAA CATCCCAGTCAC3Т. Ампликон встроен между сайтами NdeI и XhoI в плазмиду pET24b(+) (Novagen, USA). Штамм E.аcoli BL21(pET24-ES) использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка ESAT-6-(His)6 согласно инструкции производителя плазмиды pET24b(+) (Novagen, США). Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией на Ni2+NTAHisBindо SuperflowЩ(Pharmacia Biotech, Швеция) по модифицированному протоколу, прилагаемому фирмой-производителем.

Антисыворотку к рекомбинантному белку SODаА получали с помощью подкожной иммунизации кроликов. Антисыворотки к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6 получали подкожной иммунизацией беспородных белых мышей. Иммунные сыворотки собрали через 7 дней после второй иммунизации. Титры специфических антител в сыворотках животных определяли с помощью твердофазного ИФА

При определении уровня синтеза IFN-γ спленоцитами мышей в качестве антиген-презентирующих клеток (АПК) использовали костно-мозговые макрофаги (КММ) мышей линии С57ВL6 категории SPF, которые получали по методу (Bosio C.M. etаal., 2001). Концентрацию IFN- в клеточных супернатантах проводили с помощью набора Interferon gamma [(mINFγ], Mouse ELISA BiotrakTM System по методу фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания).

Внутриклеточную выживаемость и способность к внутриклеточному размножению исходных и рекомбинантных штаммов F.аtularensis определяли с использованием макрофагоподобной клеточной линии мышиных моноцитов J774A.1, полученных из Российской коллекции культур клеток позвоночных  Института цитологии РАН (РККК И - РАН, С.-Петербург, Россия).

Оценку пролиферативной активности лимфоцитов проводили в реакции бласттрансформации лимфоцитов по методу (MishellаB.аB. etаal., 1980). Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по общепринятой методике (УчительаИ.аЯ., 1978.)

Оценку протективности штаммов F.аtularensis проводили с помощью иммунизации подкожно мышей линии С57BL/6 категории SPF (20аКОЕ/мышь). Двум контрольным группам вводили подкожно ЗФР и клетки M.аbovisаBCG в дозе 106аКОЕ/мышь, соответственно. На 28 сут после иммунизации проводили аэрозольное заражение животных Через 28 сут после экспозиции животных эвтаназировали ингаляцией СО2. Учет результатов высевов из легких и селезенок проводили на 21 сут.

Электрофорез в 12,5а% ПААГ с/без добавлением ДДС-Na проводили в буферной системе Леммли. Белковые зоны либо окрашивали Кумасси Rа250 или без окрашивания использовали для оценки ферментативной активности или постановки иммуноблота.

Оценку ферментативной активности белка СОДаА проводили по методу (BeauchampаC.аetаal., 1971). Определение количества белка проводили по Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Определение устойчивости к параквату проводили на чашках с плотной питательной средой, инкубируемых при 37аC в течение 48-72ач, по величине зоны подавления роста.

Иммуноблотингом проводили по методу (Towbin H.аetаal.,1979). Титры антител к антигенам в антисыворотках определяли методом твердофазного ИФА по общепринятой схеме.

Достоверность отличий численных значений результатов экспериментов определяли по t-критерию Стьюдента (P<0,05) с помощью статиcтических программ, встроенных в программу Windows Excel .

Гава 3 . Криотрансформация, мобилизация и конъюгация плазмид в клетки вакцинного штамма F.аtularensisа15/10

Криотрансформация туляремийного микроба. Для оптимизации условий передачи плазмид в клетки F.аtularensisа15/10 методом криотрансформации выбрана плазмида pC194, способная реплицироваться в клетках F.аtularensis и экспрессировать ген cat (ПомеранцеваА.аП. иадр., 1991). Выявлено, что особенностью переноса плазмид в клетки F.аtularensis при замораживании-оттаивании является необходимость присутствия в буфере для криотрансформации ионов магния. Показано, что оптимальным значением рН среды для трансформации является 7,5, оптимальное время инкубации перед замораживанием составляет 10 мин при температуре 22аС. Показано, что для замораживания смеси клеток F.аtularensis и ДНК может быть  использован как сухой лёд-этанол, так и жидкий азот, но последний дает наилучший результат по выходу трансформантов. Метод применим также и для других штаммов туляремийного микроба.

Плазмидную ДНК pC194 переносили в клетки F.аtularensisа15/10 не только в изолированном виде, но и в составе рекомбинантных плазмид, например, бирепликонной плазмиды pHV33. Плазмидные ДНК pHV33, выделенные из клеток E.асoliаHB101(pHV33) и F.аtularensisа15а(pHV33), трансформировали клетки F.аtularensisа15/10 практически с одинаковой эффективностью, что свидетельствовало об отсутствии системы рестрикции, по крайней мере, в штамме F.аtularensisа15/10.

Показано, что в клетках F.аtularensis обнаруживается только один фенотипический признак плазмиды pHV33 - устойчивость к Cm из трех признаков проявляемых данной плазмидой в клетках  E.аcoli - устойчивость к Cm, Ap и Tc. Однако, при селекции на среде с Tc (10амг/л) были отобраны клоны, в которых плазмида pHVT33 отличалась от исходной плазмиды наличием делеции размером 1,5 т.п.н. Таким образом, подтвержден факт возможности внутримолекулярных перестроек в плазмиде pHV33 в бактериях F.аtularensis.

Мобилизация плазмид из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis. С целью выяснения возможности мобилизации плазмид из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis и последующей оптимизации условий эффективного переноса плазмид между данными микроорганизмами создана плазмида pHV33mob, несущая mob область плазмиды RP4. Примечательно, что при селекции трансформантов на среде с Cm получены клоны, содержащие делеционный вариант плазмиды pHVmob, лишенный участка плазмиды pC194, прилегающего к области начала репликации. Показано, что полученный делеционный вариант pHVТmob содержал гибридный ген cat под промотором гена rep плазмиды pC194.

Функциональная активность области mob в плазмидах pHVаmob и pHVТmob была оценена при скрещивании между клетками штаммов E.асoliаS17(pHVаmob) и E.асoliаJM83а(pBR322), а также между клетками штаммов E.аcoliаS17(pHVТаmob) и E.асoliаJM83а(pBR322). В результате были получены клоны, способные расти на средах с Cm и Tc. Частота появления таких клонов составила 10-1 на донорную клетку при скрещивании в течение 3ач. При скрещивании клеток E.асoliаS17(pHV mob) (~1аа108аКОЕ) и F.аtularensisа15/10а(~ 1аа109аКОЕ) на L-агаре в течение 20ач при температуре 37аС, с последующей селекцией на агаровой среде ТА (100амг/л Pm и 3амг/л Cm) получены клоны (~104), содержащие плазмиду, совпадающую по размерам с плазмидой pHV33аmob. Результаты данного эксперимента позволили сделать вывод о возможности мобилизации плазмид из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis и о способности молекулярной машины E.аcoliаS17, кодируемой генами tra (из плазмиды RP4), переносить плазмиды из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis.

Клоны туляремийного микроба, полученные в результате мобилизации плазмиды pHVТmob, росли медленнее, чем клоны, несущие плазмиду pHVmob. Особенностью медленнорастущих клонов заключалась в том, что электрофоретически плазмидная ДНК в бактериях не выявлялась. Трансформирующая активность плазмиды pHVТmob клеток F.аtularensis методами электропорации и криотрансформации не отличалась от таковой плазмиды pHVmob, при этом отмечалось также формирование на селективной среде медленнорастущих колоний. Экспериментально подтверждена низкая копийность плазмиды pHVТmob в клетках F.аtularensis.

Изучение влияния условий скрещивания (состава среды, температура и время скрещивания, а также концентрация клеток донора и реципиента) позволило выбрать оптимальные параметры, обеспечивающие эффективный перенос плазмиды pHV33mob в клетки F.аtularensisа15/10.

С использованием выбранных условий мобилизации проведено конъюгационное скрещивание между клетками E.аcoli C600(pSa) и F.аtularensis 15/10. Частота появления туляремийных клонов, устойчивых к Cm, составила ~ 1.10-7 на бактерию реципиента. Плазмидный анализ клонов показал наличие в бактериальных клетках высокомолекулярных плазмидных ДНК (рис.1).

1  2  3 4 5 6  7 8  9 10  11 12 13 14 15 16 17	Рисунока1. - Плазмидные профили клонов F.аtularensis, полученных в результате скрещивания. 1,17 - маркеры молекулярных весов ДНК HindIII, 2-16 - плазмидные ДНК.

Электрофоретическая подвижность плазмидных ДНК, выделенных из разных клонов, различалась, что может быть объяснено либо различиями в размерах плазмид, либо разным количеством супервитков в ковалентно-замкнутых кольцевых плазмидах, что, очевидно, связано с нестабильностью самой плазмиды (pSa) (IrelandаC.аR., 1983). Для выяснения наличия изменений в составе плазмиды pSa изучали плазмиду pSa, выделенную из отдельного клона F.аtularensisа15а(pSa). Показано, что плазмида pSa способна к обратному конъюгационному переносу из клеток F.аtularensisа15(pSa) в клетки E.асoliаC600 с частотой ~ 1.10-4 на бактерию реципиента. Конъюгационный перенос плазмиды pSa из клеток E.асoliаC600 (pSa) в клетки F.аtularensisа15/10 происходил с частотой 5аа10-4 на реципиентную клетку, что на три порядка выше, чем частота конъюгационного переноса плазмиды pSa из клеток E.асoliааC600 (pSa) в клетки F.аtularensisа15/10. Электрофореграмма (рис.а2) демонстрирует гетерогенность препаратов плазмидных ДНК из E.аcoliаC600(pSa), что отражает нестабильность плазмиды pSa в клетках E.асoliаC600.

При изучении возможности внутривидового коньюгационного переноса  плазмиды pSa в результате скрещивания клеток F.аtularensisа15(pSa) и F.аtularensisа15(pKK202) получены единичные биплазмидные клоны с частотой ~ 4.10-10, что существенно меньше частоты появления коньюгационных клонов при скрещивании клеток F.аtularensisа15(pSa) и E.асoliаC600.

Различия в эффективности конъюгации могут быть объяснены наличием капсул как у донорных клеток, так и у реципиентных, что, вероятно, затрудняет процесс межклеточного переноса плазмидной ДНК. Полученные данные указывают на возможность конъюгационного переноса плазмиды pSa между штаммами F.аtularensis, хотя и с очень низкой частотой.

1 2  3  4 5  6  7 8  9 10	Рисунок 2. - Электрофореграмма препаратов ДНК, выделенных из клонов E.асoliаC600(pSa). 1-8,10 - ДНК трансконъюгантов E.асoliаC600(pSa), 9 - маркеры молекулярных весов ДНК HindIII.

Возрастание частоты переноса плазмиды pSa в клетки F.аtularensis по сравнению с исходной плазмидой pSa позволяет заключить, что плазмида pSa отличается от плазмиды pSa в области, ответственной за репликацию плазмиды. Показано, что трансформация клеток F.аtularensisа15/10 возможна только при использовании ДНК плазмиды pSa, но не плазмиды pSa.

Таким образом, результаты межвидового скрещивания показали, что плазмида pSa имеет нестабильную структуру. Кроме того, показано, что при коньгационном переносе плазмиды pSa в клетки туляремийного микроба возникает вариант плазмиды pSa, способный реплицироваться как в клетках E.аcoli, так и в клетках F.аtularensis. Установлено, что плазмида pSa способна переходить из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis без дополнительных (плунжерных) плазмид (ПомеранцеваА.аП. и др., 1991). Анализ приведенных выше данных позволяет заключиь, что сконструированные нами плазмиды pHVТ33, pHVТmob и pSa могут быть использованы в качестве векторов (pHVТ33) или в качестве основы для создания плазмидных векторов (pGM5 и др.) для изучения генома туляремийного микроба.

Следует отметить, в порядке обсуждения, что описанный нами факт эффективного межвидового переноса плазмид из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis, осуществляемый на простых питательных средах при температуре окружающей среды, позволяет предполагать возможность таких процессов в природных условиях и говорить об их вкладе в дальнейшую эволюцию вида F.аtularensis.

Гава 4. Структурно-функциональная организация криптической плазмиды pFNL10.

При поиске плазмид, способных к репликации в клетках F.аtularensis, было обнаружено, что такими свойствами обладает криптическая плазмида pFNL10, выделенная из штамма F.аnovicidaаlikeаF6168 (РодионовааИ.аВ.аи др., 1991). Изучене структурно-функциональной организации данной показало, что плазмида pFNL10 состоит из 3990ап.ан., а содержание А+Т-пар в ДНК плазмиды равно 68а%. Данные о нуклеотидной последовательности pFNL10 размещены в базе данных GenBank под номером AF121418.

По данным анализа нуклеотидной последовательности, в плазмиде pFNL10 находится 6 протяженных открытых рамок трансляции (ОРТ), занимающих около 75а% последовательности ДНК (рис. 3).

Две ОРТ (ОРТ1 и ОРТ2) расположены на У - У-цепи плазмиды, остальные - на У+Ф-цепи. Участок ДНК размером 250ап.ан. со свойствами домена начала репликации локализован между ОРТ1 и ОРТ5. В этом районе находятся три копии повтора, состоящего из 23 нуклеотидов: gatacaaaaagtagttttaaatt, разделенные двумя повторами, состоящими из 8 нуклеотидов: caaaaagt и двумя перекрывающимися повторами, состоящими из 17 нуклеотидов aatatataaagagaata. Наличие подобных прямых повторов характерно для доменов начала репликации плазмид, реплицирующихся по механизму тета-типа (delаSolar G.аetаal., 1998).

Показано, что в ОРТ1 закодирована аминокислотная последовательность, состоящая из 339 аминокислотных остатков (а.о.), подобная аминокислотной последовательности белков инициации репликации RepA плазмид, реплицирующихся по тета-механизму. Стартовый нуклеотид аденин матричной РНК, синтезируемой с промотора перед ОРТ1, находится в положении 1647 нуклеотида УЦУ-цепи pFNL10.

Рисунок 3 - Структурно-функциональная организация плазмиды pFNL10.

Терминатор транскрипции обозначен треугольником; область начала репликации выделена заштрихованным прямоугольником. Участки гидролиза для рестриктаз обозначены: B-BamHI; Bg-BglII; C-ClaI; E-EcoRV; H-HindIII; S-SalI; X-XbaI.

Для ОРТ2 стартовый нуклеотид матричной РНК вблизи начала ОРТ не был обнаружен, что позволило предположить, что ОРТ1 и 2 входят в один  оперон. В ОРТ2 кодирована аминокислотная последовательность из 140аа.ао., подобная последовательности белка АТФ-зависимой РНК-хеликазы из Sulfolobus solfataricus (GenBank № AE006810). Оперон, включающий ОРТ1 - ОРТ2, кодирует белки, отвечающие за репликацию, копийность и обеспечение мономерности плазмиды.

Стартовый нуклеотид тимин матричной РНК, синтезируемой с промотора, локализованного перед ОРТ3, находится в положении 3060 нуклеотида УЦУ-цепи плазмиды. В ОРТ3 кодирована аминокислотная последовательность, состоящая из 298аа.ао., подобная аминокислотной последовательности белка интегразы Salmonella enterica и рекомбиназы плазмиды pAO1 из Bacillus pallidus.

Стартовый нуклеотид аденин матричной РНК, синтезируемой с промотора перед ОРТ 5, находится в положении 1968 нуклеотида У+Фцепи плазмиды. ОРТ4, вероятно, не имеет собственного промотора и образует единый оперон с ОРТ5, так как последний нуклеотид терминирующего кодона ОРТ5 является первым нуклеотидом второго кодона ОРТ4: ОРТ5-5Таtt gaa gaa tgatact 3'-ОРТ4. ОРТ5 кодирует пептид размером 86аа.ао., который подобен в функционально-активной области Phd-белку фага Р1 (LehnherrаH.аetаal., 1993). ОРТ4 кодирует пептид размером 68аа.ао. Этот пептид подобен белкам E.аcoli., Sr.аcoelicolor, M.аtuberculosis и S.аaureus (по данным базы данных NCBI), кодируемых генами Phd-Doc системы этих микроорганизмов, но существенно отличается от белка Doc фага Р1.

BglII-EcoRV фрагмент ДНК плазмиды pFNL10, несущий оперон ОРТ5-ОРТ4, при встраивании в плазмиду pHV33 существенно снижает вероятность утраты плазмиды клетками штамма F.аtularensis15/10 (pHV33-phdЦdoc). При выращивании в жидкой питательной среде без антибиотиков за 10 генераций 99а% бактериальных клеток сохраняли устойчивость к Cm, тогда как популяция штамма F.аtularensisа15/10а(pHV33) содержала только 60а% клеток, устойчивых к Cm.

ОРТм кодирует пептид размером 56аа.ао. Гомология аминокислотной последовательности этого белка с другими белками не найдена.

Структура, находящаяся за ОРТ2, подобна прокариотическим терминаторам. Данная последовательность нуклеотидов содержит инвертированный повтор:

  1 acatagtaga tcgactcttc ttagggattt tatatttttt gataaatcat ctattttgct

  61 agttaaatca tcaaatttat catcttgttg tttgactaaa tctaagaatc tattctcttt

121 tttaaaatcg ttcatgcaaa ccgcctatag ctttcttctt tttctgaaat tatttgtctt

181 cacaccataa ttaaattccc atttttataa gtaaagtctt ttaaaagctt gtcagtctct

Функциональная активность этого терминатора в F.аtularensis была подтверждена экспериментально.

Таким образом, проведенные нами исследования криптической плазмиды pFNL10 позволили выявить генетические структуры, необходимые для репликации в клетках туляремийного микроба по тета-механизму. Поскольку данная плазмида содержит оперон, кодирующий PhdЦDoc-подобную систему, необходимую для ее стабильное наследование в F.аtularensis, то, очевидно, что плазмида pFNL10 может послужить основой для создания стабильных плазмидных векторов для изучения иммуно-биологических свойств F.аtularensis.

Гава 5. Экспрессия генов гетерологичных протективных антигенов в клетках вакцинного штамма F.аtularensisа15/10.

Возможность экспрессии гетерологичных протективных антигенов в клетках штамма F.аtularensisа15/10 изучена на примере экспрессии F1-антигена чумного микроба. Рекомбинантная плазмида pCF10, несущая гены оперона fra Y.аpestis создана на основе плазмидного вектора pHVT33. Фрагмент ДНК, содержащий гены оперона fra встроен в сайт Sal I плазмиды pHVT33. Полученная плазмида pCF10 (8,8ат.ап.ан.) введена в клетки F.аtularensis15/10 методом криотрансформации. Среди Tc-чувствительных клонов F.аtularensis были обнаружены клоны, которые, по данным РПГА с анти-F1 моноклональными антителами, синтезировали F1-антиген. Таким образом, показана возможность получения вакцинного штамма F.аtularensisа15/10 с синтезирующего F1-антиген чумного микроба, а также продемонстрированы векторные свойства плазмиды pHVT33.

Показана также возможность использования бациллярной плазмиды pTV24 в качестве плазмидного вектора для клонирования фрагментов ДНК, несущих гены протективных антигенов возбудителя сибирской язвы, в клетках F.аtularensis. Рекомбинантная плазмида pTVpag получена в результате встраивания фрагмента ДНК, несущего ген pag плазмиды pXO1 Bacillus.аanthracis в сайт BamаHI плазмиды pTV24. При трансформации F.аtularensisа15/10 плазмидной ДНК pTVpag был получен штамм F.аtularensisа15/10а(pTVpag), синтезирующий протективный антиген B.аanthracis.

Интересно отметить, что штаммы F.аtularensisа15/10, несущие векторные плазмиды pHVT33 и pTV24 , а также с рекомбинантные плазмиды, полученные на их основе, часто утрачивали плазмиды при культивировании на жидких питательных средах и  при пассировании в организме экспериментальных животных. Эта особенность затрудняла изучение иммунобиологических свойств туляремийного вакцинного штамма, несущего дополнительные протективные антигены других бактерий. В дальнейшем данная трудность была преодолена в результате создания плазмидного вектора pPMC1, стабильно наследуемого бактериями штамма F.аtularensisа15/10, на основе плазмиды pFNLа10. Плазмида рРМС1 (4259ан.ап.) несет ген cat из плазмиды pC194, а также промотор и участок инициации трансляции оперона groES F.аtularensis ( рис.а4).

Рисунок 4 - Генетическая карта плазмиды pPMC1.

Потенциальные возможности плазмиды pPMC1 в качестве плазмидного вектора были проверены на примере клонирования модифицированного гена sodA M.аtuberculosis в клетках F.аtularensisа15/10. Для повышения уровня экспрессии гетерологичного белка проведена замена в гене sodA редких для генома F.аtularensis кодонов. В результате сконструированы три плазмиды, кодирующие три различных варианта гена sodA: плазмида pSFC21с неизмененным геном, плазмида pSFC22 с заменой редких кодонов в части гена, кодирующей C-концевую область белка, и плазмида pFSС24 с заменой редких кодонов по всей протяженности гена (рис.а5). Показано, что замены редких кодонов практически не повлияли на уровень экспрессии полученных вариантов гена sodА в клетках вакцинного туляремийного штамма (рис.6).Присоединение к структурной части гена sodA нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид белка внешней мембраны F.аtularensis FopA(плазмида pFS51) привело к существенному повышению экспрессии рекомбинантного гена sodA в туляремийном микробе (рис 6).

Рисунок 5 ЦГенетическая карта плазмиды pFSC24.

1  2 3  4 5  6 7  8

Рисунок 6. - Иммуноблот рекомбинантного белка СОД с кроличьей антисывороткой.

1 - лизат клеток F.аtularensis 15/10, 2 Цлизат клеток F.аtularensis 15/10(pSFC21); 3 - клеточный лизат F.аtularensis 15/10 (pSFC22); 4-6 - клеточный лизат F.аtularensis 15/10 (pSFC24); 7 - клеточный лизат F.аtularensis 15/10 (pSFC51); 8 - рекомбинантный белок СОД.

На основе pPMCа1 созданы также плазмиды, кодирующие синтез рекомбинантных белков, состоящих из лидерного пептида белка внешней мембраны F.аtularensis FopA и антигена 85B M.аtuberculosis (плазмида pPMC-FLЦ85B) и лидерного пептида белка внешней мембраны F.аtularensisаFopA и белкаESAT-6 M.аtuberculosis (плазмида pPMC-FLЦ85BЦESAT-6).

В результате переноса названных выше плазмид в клетки вакцинного штамма F.аtularensisа15/10 получено два штамма F.аtularensisа RVp17 и RVp18, синтезирующих протективные антигены 85B M.аtuberculosis и гибридный белок, состоящий из антигенов 85B и ESAT-6 M.аtuberculosis, соответственно. Плазмиды pPMC-FLЦ85B и pPMC-FLЦ85BЦESAT-6 использованы также для получения штаммов F.аtularensis LVS (F.аtularensisаLVS17 и LVS18, соответственно), синтезирующих протективные антигены M.аtuberculosis. Показано, что штаммы F.аtularensisаRVp17 и RVp18, а также F.аtularensisаLVS17 и LVS18, стабильно наследуют рекомбинантные плазмиды и сохраняют уровень экспрессии клонированных микобактериальных белков при пассировании через организм экспериментальных животных.

Бактерии штамма F.аtularensisаRVp17 синтезировали две формы белка, содержащие антигенные детерминанты Ag85B, но отличавшиеся по размерам: белок с молекулярной массой ~33акДа, подобный белку FLЦAg85B, и белок с молекулярной массой ~30,6акДа, подобный микобактериальному белку Ag85B (рис.7, А). В бактериальных клетках F.аtularensisаRVp17 большая часть синтезируемого белка FLЦAg85B переходила в белок, подобный зрелому микобактериальному белку Ag85B.

Бактерии штамма F.аtularensisаRVp18 синтезировали белок, содержащий антигенные детерминанты Ag85B и ESAT-6. (рис.7, Б). Данный белок имел молекулярную массу 403акДа, соответствующую молекулярной массе рекомбинантного белка FLЦ85BЦESAT-6 (405 а.о.). Белок FLЦAg85ВЦESAT-6 находился в клетках, по-видимому, в непроцессированной форме.

		Рисунок 7. - Иммуноблоттинг лизатов штаммов F.аtularensisаRVp17 и RVp18 с антисывороткой к белку Ag85В-(His)6. А: 1 - концентрированная культуральная среда M.аbovisаBCG; 2 - штамм F.аtularensisаRVp17, белок Ag85В-(His)6; Б:1 - штамм  F.аtularensisаRVp18; 2 - штамм F.аtularensisа15/10(pPMC1); 3 - белок Ag85В-(His)6.
1  2 3  А	1  2 3 Б

Таким образом, проведенные исследования показали возможность экспрессии генов гетерологичных протективных антигенов Y.аpestis, B.аanthracis и M.аtuberculosis в клетках вакцинного штамма F.аtularensis. Показано, что использование сконструированного нами плазмидного вектора рРМС1 позволяет получать стабильные вакцинные штаммы, синтезирующие протективные антигены, которые будут далее изучены в аспекте использования  вакцинного штамма F.аtularensis в качестве бактериального вектора для создания рекомбинантных вакцин.

Глава 6. Аллельное замещение в хромосоме туляремийного микроба

Конструирование плазмидного вектора для аллельного обмена генов в хромосоме F.аtularensis. В качестве репликона векторной плазмиды для аллельного обмена в хромосоме F.аtularensis выбрана плазмида pUC19, не способная реплицироваться в клетках туляремийном микроба. Ген cat плазмиды pSa встроен в плазмиду pUC19 в качестве селективного маркера, так как наличие одной копии этого гена в хромосоме F.аtularensis позволяет бактериям расти на плотных средах, содержащих Cm в концентрации до 5амг/л, тогда как для штамма F.аtularensisа15/10 минимальная ингибирующая концентрация (МИК) Cm составляет менее 1амг/л. В качестве селективного маркера для отбора бактерий, утративших плазмидный вектор, выбран ген sacB, подавляющий рост бактерий , несущих этот ген. Для проверки функциональной активности гена sacB Pst I фрагмент плазмиды pDM4 (2,8 т.п.н.), несущий ген sacB встроен в сайт Pst I плазмиды pHV33. В результате получена плазмида pHV-sacB в штамме F.аtularensis 15/10 (pHV-sacB). Показано, что бактерии штамма F.аtularensis 15/10 (pHV-sacB) не способны к росту на среде с 5 %-ой сахарозой, что указывает на экспрессию гена sacB в клетках туляремийного микроба. Для повышения эффективности переноса рекомбинантных плазмид в клетки туляремийного микроба в создаваемый плазмидный вектор для аллельного обмена была встроена mob-область плазмиды RP4. Данная структура позволяла мобилизовать плазмидный вектор из клеток E.аcoli S17 в клетки F.аtularensisа15/10. В результате получен плазмидный вектор pPV для осуществления аллельного обмена в хромосоме Fа.tularensis, имеющий два сайта для встраивания целевых

фрагментов ДНК - SalI и XbaI (рис.а8).

Рисунок 8 - Генетическая карта плазмиды pPV , используемой для аллельного обмена в хромосоме F.аtularensis

Создание плазмиды для удаления гена iglC из хромосомы F.аtularensis. Для получения штамма F.аtularensis , лишенного гена iglC методом аллельного обмена, создана плазмида, несущая модифицированный фрагмент ДНК из области гена iglC. Для синтеза данного фрагмента ДНК без гена iglC использованы следующие праймеры:

23SalL15	5ТACGCGTCGACTACAATGCTAGAAACCTT3Т
23Bam	5ТTCGGGATCCTATACATGCAGTAGGA3Т
23Pst	5ТAAACTGCAGCTGCATAGTAAGATCGGA3Т
23SalR15	5ТGCGTGTCGACTTAGCCGTGCCAATTACCA3Т

В результате встраивания полученного фрагмента ДНК в сайт SalI плазмиды pPV была получена плазмида pPV23. В качестве реципиентного штамма для отбора трансформантов, несущих плазмиду pPV23, использовали штамм E.асoliаDH5; затем плазмиду pPV23 переносили в штамм E.асoliаS17.

Конструирование штаммов F.аtularensis, несущих делецию по гену iglC. Для удаления гена iglC из хромосомы вакцинного штамма F.аtularensisа15/10 плазмида pPV23 в результате скрещивания была перенесена мобилизацией из штамма E.асoliаS17(pPV23) в штамм F.аtularensisа15/10. Полученные в результате такого скрещивания резистентные к Cm клоны F.аtularensis не содержали плазмид, т.е. генетическая конструкция, несущая ген cat, была интегрирована в хромосому туляремийного микроба. ПЦР анализ ДНК, выделенной из клеток клонов показал, что в половине проанализированных трансконъюгантов рекомбинация между плазмидой pPV23 и хромосомой туляремийного микроба прошла по левому плечу, в другой половине - по правому плечу.

Спонтанная элиминация векторной части интегрированной структуры в результате повторной рекомбинации позволила получить на селективной среде, содержащей 5% сахарозу Cm-чувствительные клоны F.аtularensisа. ПЦР анализ показал, что у половины проверенных клонов ампликоны, полученные с помощью праймеров 23SalL15 и 23SalR15, имеют размеры, характерные для F.аtularensisа15/10, другая половина клонов (F.аtularensisа15/10-23) дает два вида ампликонов, появление которых возможно только при наличии двух копий гена iglC в хромосоме (рис.а9).

Вывод о наличии в геноме туляремийного микроба двух копий гена iglC. был подтвержден методом ДНК-гибридизации по Саузерну , между фрагментами ДНК F.аtularensisа15/10, полученными в результате гидролиза рестриктазами, и ДНК-зондом, содержащим последовательность гена iglC. Для инактивации второй копии гена проведено скрещивание клеток E.асoliаS17(pPV23) и F.аtularensisа15/10-23. В результате селекции клонов и ПЦР анализа их геномов получен штамм туляремийного микроба без двух копий гена iglC -F.аtularensis15/10-23-23. Аналогично получены варианты штамма F.аtularensisаLVS без одной и двух копий гена iglC.

A	Б

Рисунок 9 - Электрофореграммы ПЦР продуктов, полученных на матрице ДНК штаммов F.аtularensis с помощью праймеров, комплементарных (А) - левому плечу гена р23, (Б) - правому плечу гена р23

Создание плазмиды для модификации  гена sodB в хромосоме F.аtularensis. Для снижения уровня экспресии гена sodB в клетках F.аtularensis синтезирован фрагмент хромосомы F.аtularensis, в котором инициирующий кодон ATG гена sodB заменен на кодон GTG. Для синтеза левого плеча фрагмента использованы следующие праймеры:

Xba-sodB	5ТCACTCTAGATTATCCATTTGGTATTGAGG3Т
Pst-sodB	5ТATGCTGCAGTACTCTCCTTAAATTCGTG3Т
PstF-sodB	5ТGACCTGCAGTGAAATTTGAATTACCAAAAC3Т
Sal-sodB	5ТTATGTCGACAACCTAATCAGCGAATTGC3Т

При конструировании модифицированного гена sodB перед инициирующим кодоном GTG создан участок узнавания для рестриктазы PstI. Наличие этого сайта позволило отобрать с помощью рестрикционного анализа ампликоны, амплифицированные с ДНК клонов, несущих модифицированный ген sodB. В результате встраивания фрагмента ДНК, несущего модифицированный ген sodB между сайтами XbaI и SalI плазмиды pPV, получена плазмида pPV-sodB. В качестве реципиентного штамма для отбора трансформантов, несущих плазмиду pPV-sodB, использовали штамм E.аcoliаDH5, затем данная плазмида была перенесена в штамм E.аcoliаS17.

Конструирование штамма F.аtularensis LVS со сниженным уровнем экспрессии гена sodB. Попытки делеции гена sodB из хромосомы штаммов F.аtularensisа15/10 и LVS методом аллельного обмена оказались безуспешными, поскольку, вероятно, продукт гена sodB жизненно необходим для туляремийного микроба. Для выяснения влияния продукта гена sodB на иммунобиологические свойства туляремийного микроба  создан штамм F.аtularensisаLVS со сниженной экспрессией гена sodB. Данный штамм F.аtularensisа FtsodB получен в результате алелльного обмена природного гена sodB, локализованного в хромосоме, на модифицированный ген sodB, содержащий инициирующий кодон GTG и локализованный на плазмиде pPV-sodB. Плазмида pPV-sodB перенесена из клеток E.аcoliаS17-1 в клетки штамма F.аtularensisаLVS методом мобилизации. В результате селекции клонов, с последующим ПЦР- и рестрикционным анализом получен штамм F.аtularensisа FtsodB, содержащий ген sodB, кодирующий матричную РНК, начало  синтеза белка с которой затруднено из-за присутствия редкого стартового кодона GTG.

Гава 7. Изучение иммуно-биологических свойств штаммов, сконструированных на основе штаммов F.аtularensisа15/10 и LVS

Штаммы F.аtularensis, модифицированные по гену iglС. Изучение влияния гена iglC на иммуно-иологические свойства туляремийного микроба проводили с помощью: (i) методов оценки уровня устойчивости к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки (НКС); (ii) способности к внутримакрофагальному размножению бактерий в эукариотических макрофагоподобных клетках линии Jа774аA.1; (iii) способности полученных штаммов индуцировать клеточное звено иммунного ответа методом бласттрансформации, а также (iv) оценки протективности штаммов на мышиной модели эспериментальной туляремийной инфекции.

Показано, что устойчивость к бактерицидному действию НКС у бактерий штаммов F.аtularensisа15/10-23 и F.аtularensisа15/10-23-23 не изменилась по сравнению с таковой штамма F.аtularensisа15/10. Это свидетельствует об отсутствии влияния продукта гена iglC на клеточные структуры штамма F.аtularensisа15/10, определяющие устойчивость бактерий к НКС. Хотя полученные варианты вакцинных штаммов F.аtularensisа15/10 и LVS одинаково хорошо росли в жидких питательных средах, тем не менее, в отличие от исходных штаммов, они снизили и даже потеряли способность к размножению в клетках Jа774аA.1 (Табл. 2).

Таблица 2 - Размножение бактерий F.аtularensis в клетках Jа774аA.1

Штаммы F.аtularensis	Индекс размножения
15/10	540
15/10-23	30
15/10-23-23	1
LVS	4000
LVS -23	1000
LVS -23-23	4

Вакцинация мышей линии Balb/C клетками штамма F.аtularensis 15/10-23 приводила к формированию у животных протективного клеточного имму нитета, уровень которого был сходен с иммунитетом, формируемым у мышей при вакцинации штаммом F.аtularensisа15/10. Вакцинация мышей

инии Balb/C клетками штамма F.аtularensisа15/10-23-23 не индуцировала иммунного ответа у мышей. Реакция бласттрансформации спленоцитов при стимуляции суммарным антигеном F.аtularensis была отрицательной, т.е. не отличалась от индекса стимуляции спленоцитов, полученных от неимунизированных мышей. Следовательно, продукт гена iglC необходим для внутримакрофагального размножения туляремийного микроба. Полученные данные подтвердили рабочую гипотезу о том, что стадия внутримакрофагального размножения клетками вакцинного штамма F.аtularensis необходима для формирования протективного иммунного ответа живой туляремийной вакциной.

Штамм F.аtularensis, модифицированный по гену sodB. Изучение культуральных свойств показало, что рост бактерий штамма F.аtularensis аFtsodB замедлен по сравнению с бактериями штамма F.аtularensisаLVS. Так, при аэробном культивировании в жидкой питательной среде Мюллер-Хинтона (MHB) штамм F.аtularensis аFtsodB имел более длительную лаг-фазу. Ферментативная активность железо-зависимая супероксиддисмутаза (FeСОД) в бактериях штамма F.аtularensis аFtsodB оказалась существенно снижена по сравнению с таковой в бактериях штамма F. tularensisаLVS. На рост культуры штамма F.аtularensis аFtsodB в MHB при аэробных условиях существенно влияло присутствие перекиси водорода (H2O2). Повышенная чувствительность штамма F. tularensisа FtsodB к H2O2, несмотря на нормальную активность каталазы, позволило предположить, что часть повреждений клеток F.аtularensis была вызвана радикалами OH , которые образуются в присутствии избытка H2O2 и O2 - (Halliwell B. etаal.,  1984).

Клетки штамма F.аtularensis аFtsodB также оказались весьма чувствителеными к действию препарата Паракват (N,N'-диметил-4,4'-бипиридина дихлорид), который широко используется в биологии для моделирования оксидативного стресса. Зона подавления роста агаровой культуры штамма F.аtularensis аFtsodB составляла - (47,3аа3,5) мм по сравнению с зоной штамма F.аtularensis аLVS - (35,3аа2,8а) мм. Поскольку известно, что в присутствии Параквата увеличивается внутриклеточная концентрация радикала O2Ц, то дефицит FeСОД, вызванный модификацией гена sodB, вероятно, привел к подавлению роста культуры штамма F.аtularensis аFtsodB. Таким образом, показано, что ген sodB кодирует FeСОД, которая нейтрализует негативное действие оксидативного стресса.

Показано также, что штамм F.аtularensis FtsodB менее вирулентен для мышей линий C57BL/6 и Balb/C по сравнению с исходным штаммом F.аtularensis LVS. Органы мышей линии C57BL/6, инфицированных штаммом F.аtularensis FtsodB, были менее обсеменены бактериями F.аtularensis и элиминация бактерий из органов происходила быстрее по сравнению с органами животных, инфицированными штаммом F.аtularensis LVS. Полученные данные еще раз подтвердили гипотезу о том, что железо-зависимая супероксиддисмутаза, кодируемая геном sodB, необходима для выживания и размножения бактерий в организме инфицированных животных.

Штаммы F.аtularensis, синтезирующие протективные туберкулезные  антигены. Показано, что введение в клетки штаммов F.аtularensisа15/10 и LVS векторной плазмиды pPMC1и рекомбинантных плазмид, созданных на ее основе, не влияет на ростовые свойства полученных плазмидосодержащих бактерий. В частности, скорость размножения бактерий штаммов F.аtularensis RVp17 и RVp18 в мышиных клетках Jа774. A1. практически не отличалась от скорости размножения вакцинного штамма F.аtularensis а15/10. Динамика размножения клеток штаммов F.аtularensisа15/10 pPMC1, RVp17 и RVp18 в селезенке инфицированных мышей была подобна динамике размножения бактерий штамма F.аtularensisа15/10. Сходные данные, полученные для штаммов F.аtularensisаLVS17 и LVS18, синтезирующих Ag85B и гибридный антиген Ag85B-ESAT-6, приведены в таблице 3. Введение плазмид pPMC1, pPMC-FLЦ85B и pPMC-FLЦ85BЦESAT-6 в клетки F.аtularensisа15/10 не влияло на вирулентность полученных штаммов: LD50 была равна 30аа100аКОЕ/мышь. Индексы стимуляции спленоцитов суммарным антигеном F.аtularensis во всех группах мышей линии С57BL/6, вакцинированных штаммами F.аtularensisарРМС1,

Таблица 3. Динамика изменения обсемененности органов мышей линии С57BL, инфицированных штаммами F.аtularensisаLVS17 и LVS18.

	Обсемененность органов, Log КОЕ
Дни	3		6		14		21
Органы	Селезенка (С)	Печень (П)	С	П	С	П	С	П
Штаммы F.аtularensis
LVS	5.4	5.2	5.0	5.2	<3	<3	< 2	< 2
V(рРМС1)	5.2	4.9	4.9	4.1	<3	<3	< 2	< 2
LVS 17	4.1	3.9	4.5	4.7	<3	<3	< 2	< 2
LVS 1 8	6.3	5.7	6.4	6.3	<3	<3	< 2	< 2

RVp17, RVp18 и 15/10, были высокими и находились в пределах - (11,3аа1,35) (для штамма F.аtularensisа15/10) и (8,2аа0,9) (для штамма F.аtularensisа аRVp18). У животных, иммунизированных штаммами F.аtularensisааRVp17 и RVp18, отмечался выраженный специфический иммунный ответ на антиген Ag85B-(His)6. Индексы стимуляции составили - (8,6аа1,24) и (4,2аа0,95), соответственно, достоверно (P < 0,05) отличаясь от величин индекса стимуляции для интактных мышей - (1,2аа0,28) и для мышей, вакцинированных штаммом F.аtularensisа15/10 - (1,8аа0,56). Уровень стимуляции спленоцитов антигеном  ESAT-6-(His)6 в  группе мышей, вакцинированных клетками F.аtularensisаRVp18, был незначителен и составлял - (1,9аа0,18), достоверно (P<0,05) отличаясь от величин индекса стимуляуии для интактных мышей - (0,8аа0,42) и слабо отличаясь от индекса стимуляции для мышей, вакцинированных клетками F.аtularensisарРМС1 - (1,2аа0,68).

Показано, что спленоциты иммунных мышей в ответ на туляремийные и микобактериальные антигены секретируют IFN- в культуральную среду. Данные о концентрациях IFN- в супернатанте спленоцитов в ответ на стимуляцию антигенами inаvitro представлены в таблице 4.

Уровень секреции IFN- спленоцитами, полученными от мышей, иммунизированных бактериями F.аtularensisаRVp17, при стимуляции антигеном

Таблица 4. Уровни синтеза IFN- спленоцитами иммунных и не иммунных мышей С57BL

Штаммы F.tularensis	IFN-, нг/мл
	Туляремийный антиген	Ag85B-(His)6 2амкг/мл	ЕСАТ-6-(His)6 2амкг/мл
15/10	75,85,3	10,20,7	н/о
рРМС1	83,83,8	15,01,0	0,80,3
RVp17	82,51,2	31,90,7	н/о
RVp18	73,78,1	20,30,7	4,80,2
контроль	6,50,8	0,20,3	н/о

Примечание: н/о Цне определяли.

Ag85B-(His)6 превышал почти в 1,5 раза аналогичный уровень, определенный для мышей, иммунизированных бактериями F.аtularensisааRVp18. Вакцинация мышей штаммом F.аtularensisаRVp18 также индуцировала образование спленоцитов, специфичных к ESAT-6. Таким образом, однократная иммунизация мышей рекомбинантными штаммами F.аtularensis RVp17 и RVp18 активирует специфический Т-клеточный иммунитет. Выраженный иммунный ответ формировался также и на антигены туляремийного микроба, что позволило сделать вывод о том, что вакцинные свойства штаммов F.аtularensis RVp17 и RVp18 в отношении защиты животных от туляремийной инфекции не изменились.

Оценка выраженности гуморального звена иммунитета животных показала, что в сыворотках мышей, вакцинированных бактериями штаммов F.аtularensisаRVp17 и RVp18, значимые титры антител к микобактериальным антигенам Ag85B и ESAT-6 отсутствуют, тогда как титры антител к суммарному туляремийному антигену, индуцируемые бактериями F.аtularensisа15/10, F.аtularensis аRVp17 и F.аtularensis аRVp18, находились в диапазоне значений Ц(1а:а170аа1а:а2620).

Протективность полученных рекомбинантных штаммов F.аtularensis оценивали на мышиной модели легочной формы экспериментального туберкулеза, вызванной штаммами M.аtuberculosisаH37Rv и Erdman. Полученные данные по обсеменности легких и селезенки мышей, иммунизированных контрольными штаммами M.аbovisаBCG, F.аtularensisаLVS, F.аtularensisаLVS (рРМС1) и рекомбинантными штаммами F.аtularensisаLVS17 и LVS18, через 28 сут после заражения групп мышей бактериями вирулентного штамма M.аtuberculosisаErdman, приведены на рис.а10. Уровень обсемененности микобактериями легких и

егкие  селезенка

Рисунок 10 - Обсемененность органов иммунных мышей после аэрозольного заражения M.аtuberculosisаErdman.

селезенки мышей, вакцинированных штаммами F.аtularensisаLVS17 и LVS18, был существенно ниже, чем таковой у групп отрицательного контроля.

Протективность рекомбинантных штаммов, полученных на основе штаммов F.аtularensisа15/10 и LVS, не превышала таковую туберкулезного вакцинного штамма M.аbovisаBCG. Протективность рекомбинантных штаммов была подтверждена гистолочески. Гистограммы срезов легких иммунных мышей С57BL,

вакцинированных рекомбинантными бактериями штаммов F.аtularensisаLVS17, LVS18, F.аtularensisаLVS и M.аbovisаBCG, после аэрозольного заражения штаммом  M.аtuberculosisаErdman приведены на рис.а11.

  LVS  LVSа18

  LVSа17  BCG

Рисунок 11 - Гистологические срезы ткани легких мышей на 28 сутки после инфицирования бактериями M.аtuberculosisаErdman.

Таким образом, целенаправленная модификация вакцинных штаммов F.аtularensis позволяет получать информацию о влиянии изучаемого гена на иммуногенность и вирулентность туляремийного микроба. Полученные данные о протективных свойствах созданных стабильных рекомбинантных штаммов указывают на перспективность применения вакцинного штамма F.аtularensisа15/10 в качестве бактериального вектора для создания комбинированных вакцин нового поколения.

Созданные молекулярные инструменты для модификации генома вакцинного штамма F.аtularensisа15/10 открыли широкие перспективы для изучения молекулярно-генетических механизмах патогенности и иммуногенности F.аtularensis с целью создания туляремийных вакцин нового поколения.

ВЫВОДЫ

1. Адаптирован способ переноса плазмидных ДНК в клетки F.аtularensis методом криотрансформации. Наличие ионов магния является необходимым условием переноса плазмид в клетки F.аtularensis при использовании метода замораживания-оттаивания бактерий.
2. Впервые показана возможность мобилизации плазмидных ДНК из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis в результате скрещивания. Оптимизированы условия конъюгации и мобилизации плазмидных ДНК из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis
3. Показано, что при конъюгативном переносе плазмиды pSa из клеток E.аcoli в клетки F.аtularensis в результате спонтанной мутации появляется плазмида pSaТ, способная к высокоэффективному челночному переходу между клетками E.асoli и F.аtularensis, не требующему наличия плунжерных плазмид.
4. Впервые охарактеризована структурно-функциональная организация криптической плазмиды рFNL10 из штамма F.аnovicidaаlikeаF6168. Плазмида рFNL10, имеющая 3990 п.ан. и содержание Г+Ц-пар, равное 32а%, способна к репликации в бактериях F.аtularensis. Плазмида рFNL10 содержит все генетические элементы, необходимые для репликации по механизму тета-типа, а также оперон Phd-Doc системы.
5. созданы рекомбинантные плазмиды на основе репликонов плазмид pC194 и pTV24, позволяющие экспрессировать в клетках туляремийного микроба антигены Y.аpestis и B.аanthracis с целью создания поливалентных вакцинных препаратов.
6. Сконструирован стабильный плазмидный вектор рРМС1 на основе репликона плазмиды рFNL10 для экспрессии гетерологичных антигенов в вакцинном штамме туляремийного микроба.

7. Показана возможность повышения уровня экспрессии гибридных генов, кодирующих гетерологичные белки, в клетках F.аtularensis в результате присоединения к структурной части гена лидерной части предшественника основного белка внешней мембраны FopA F.аtularensis.

8. Созданы стабильные штаммы F.аtularensisаRVp17 и RVp18, экспрессирующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6 и индуцирующие специфический протективный противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ у вакцинированных мышей. Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве бактериального вектора при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

9. Показана возможность гомологичной рекомбинации в геноме F.аtularensis. Разработаны плазмидные векторы и метод аллельного обмена в хромосоме F.аtularensis, позволяющий удалять участки генома, модифицировать регуляторные и другие области оперонов и получать генетически маркированные штаммы, что позволяет  проводить детальный анализ влияния выбранных генов на вирулентность и иммуногенность туляремийного микроба.

10. Геном F.аtularensis содержит две копии гена iglC, кодирующего 23акДа белок. Вариант вакцинного штамма, лишенный двух копий гена iglC, не размножается в мышиных макрофагоподобных клетках и не защищает мышей от гибели при экспериментальной туляремийной инфекции.

11. Показано, что супероксиддисмутаза F.аtularensis, кодируемая геном sodB, необходима для жизнедеятельности туляремийного микроба. Бактерии F.аtularensis с пониженным содержанием FeСОД менее вирулентны для мышей, чем исходный штамм F.аtularensis аLVS.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

А) в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Павлов В.М., Мокриевич А.Н. Создание векторной плазмиды для Francisella tularensis // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1994.- Вып. 4 - № 74. . - С. 191Ц194.
2. Мокриевич А.Н., Фурсов В.В., Павлов В.М. Криотрансформация туляремийного микроба плазмидной ДНК // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1994. . - Вып. 4 - № 74. - С. 186Ц190
3. Павлов В.М., Родионова И.В., Мокриевич А.Н., Мещерякова И.С. Выделение и молекулярно-генетическая характеристика криптической плазмиды из Francisella novicida-подобного штамма F6168. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - № 3. - С. 39Ц40.
4. Pavlov V.M., Mokrievich A.N. and Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - V. 13. P. 253Ц256.
5. Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Носков А.Н. и  Ураков Н.Н. Туляремийный вакцинный штамм-потенциальный бактериальный вектор. // Вестн. Мед. Акад. Наук. - 1997. - № 3. - C. 15Ц17
6. Алимов А.П., Павлов В.М. Патент РФ на изобретение № 2110575 - рекомбинантная плазмидная ДНК pro PF5, определяющая синтез капсульного антигена F1 возбудителя чумы и протективного антигена возбудителя сибирской язвы, и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pro PF5 // Бюллетень № 13 от 10.05.1998.
7. Померанцев А.П., Павлов В.М. // Плазмида pCSE4 для клонирования промотор-содержащих фрагментов ДНК в туляремийном микробе // Вест. РАМН. - 1999. - № 12. - С. 29Ц32.
8. Pomerantsev A.P., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., Obuchi M., Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov V.M. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNL10 // Plasmid. - 2001. - V. 46 - N. 3. - P. 210Ц22.
9. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis // FEMS Microbiol Lett. - 2003. - V. 222 - N. 2. - P. 273Ц80.
10. Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M., and Sellati T.J. Superoxide dismutase B gene (sodB)-deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence // J Bacteriol.. - 2006. - V.188. - P. 6443Ц6448.
11. Кравченко Т.Б., Платонов М.Е., Вахрамеева Г.М., Баннов В.А., Кудрявцева Т.Ю., Мокриевич А.Н., Павлов В.М. Клонирование и экспрессия протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis Ag85 и ESAT-6 в клетках Francisella tularensis 15/10 // Биохимия - 2007. - т.72. - № 7. - с. 905Ц914.
12. апин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В.,  Храмов М.В.  Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis // Пробл. особо опасных инфекций.- Саратов, 2009. - № 102. - С. 66 - 67 
13. Мокриевич А.Н.,  Кондакова А.Н., Валаде Э., Платонов М.Е.,  Вахрамеева Г.М., Шайхутдинова Р.З., Миронова Р.И., Блаха Д., Бахтеева И.В.,  Титарева Г.М., Кравченко Т.Б., Комбарова Т.И., Видаль Д., Павлов В.М., Линднер Б., Дятлов И.А., Книрель Ю.А. Биологические свойства и строение липополисахарида вакцинного штамма Francisella tularensis, полученного при инактивации гена системы чувства кворума qseC* // Биохимия. - 2010. - Т. 75. - № а4. - С. 539 - 548.

Б) в прочих изданиях:

14. Павлов В.М., Мокриевич А.Н. Клонирование гена Francisella tularensis, кодирующего синтез RecAЦподобного белка, в Escherichia coli // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - Симферополь, 1991. - С.142.
15. Никитин А.Н.; Еремин С.А.; Павлов В.М., Дроздов И.Г. Генетическая  трансформация туляремийного микроба плазмидной ДНК // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - Волгоград, 1992. - С. 45
16. Родионова И.В., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Мещерякова И.С. Выделение и молекулярно-генетическая характеристика плазмидной ДНК pFNL10 из штамма Francisella novicida-like F 6168 // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Материалы Российской научной конференции.- Саратов, 1993. - С. 302
17. Pomerantsev, A.P., Pavlov V.M.,  Urakov N.N. Francisella tularensis: behaviour of heterologous plasmids // First International Conference on Tularemia (Aug.23-25, 1995). Umea, Sweden: Abstracts.- 1995.- P. 13
18. Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov V.M.,  Sandstrm G. Construction and characterization of a cloning vector for use in Francisella tularensis // First International Conference on Tularemia (Aug.23-25, 1995). Umea, Sweden : Abstracts- 1995.- P. 28.
19. Tedikov V.M., Mokrievich A.N., and Pavlov V.M. Cloning of ori pXO1 and pag gene of B. anthracis in Francisella tularensis // Salisbury Med. Bull.- Special Suplement no. 87.- 1996.-P. 98.
20. Pavlov V.M., Mokrievich A.N. and Pomerantsev A.P.  Plasmid vectors for vaccine strain Francisella tularensis // Medizinische B-Schutz-Tagung des BWVg  22 und 23 oct. 1997.- 1997.- P. 10.
21. Pavlov V.M. Methodical approaches to designing recombinant live vaccine Francisella tularensis straines // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy.-Suplementum.-1997.- Rocnik LXI. - P. 4-5.
22. Mokrievich A.N., Pavlov V.M., Rodionova I.V., Meshcheryakova I.S. Restriction map of pFNL10 plasmid // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997.- Rocnik LXVI. - P. 13-14
23. Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Staritsyn N.A., Shishkova N.A. RecЦA like Francisella tularensis strain: Isolation and properties // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997.- Rocnik LXVI. - P. 14-15
24. Рomerantsev A.P., Pavlov V.M. Molecular tools for study of transcriptional regulation in Francisella tularensis // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997.- Rocnik LXVI. - P. 10
25. Kravchenko T.B., Mokrievich A.N and Pavlov V.M. Immunobiological properties of recombinant vaccine strain of Francisella tularensis producing protective antigen of Bacillus anthracis // 3rd International Conference on Anthrax (University of Plymouth, 7-10 th September 1998): Abstract Book.- 1998.- P. 35.
26. Bannov V.A., Kudriavtseva T.Yu., Mokrievich A.N., Eruslanov B.V., Shishkova N.A., Verevkin V.V., Pomerantsev A.P., Pavlov V.M. Study of OmpS Legionella pneumophyla gene expression in the tularemia microbe vaccine strain // Problems of  Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 - 15). Obolensk, Russia. - 1999.- P. 13.
27. Kravchenko T.B., Titareva G.M., Bakhteeva I.V., Shishkova N.A., Pavlov V.M., Urakov N.N. Study of immune properties of the strain Francisella tularensis synthesizing Omps protein Legionella pneumophyla // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 -15). Obolensk, Russia. - 1999 - P. 81.
28. Kudriavtseva T.Yu., Pavlov V.M., Urakov N.N., Eruslanov B.V. Isolation of Legionella pneumophyla outer membrane protein and analysis of this protein expression by recombinant strains // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 - 15). Obolensk, Russia. - 1999.-  P. 87.
29. Pomerantsev A.P., Mokrievich A.N., Golovlev I.P., Pavlov V.M. Nucleotide sequence, structural organization and functional activity of the plasmid pFNL10 specific for bacteria of Francisella species // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 - 15). Obolensk, Russia. - 1999.- Р. 126.
30. Pavlov V.M. Genetics of tularemia microbe. // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 -15). Obolensk, Russia. - 1999.- P. 289.
31. Платонов М.Е., Мокриевич А.Н. и Павлов В.М. Conjugative transfer of plasmid DNA from Escherichia coli into Francisella tularensis // Международная конференция Проблемы биологической и экологической безопасности (22-24 мая). Государственный научный ценр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия. - 2000.- С. 76-78.
32. Platonov M.,аTitareva G.,ааKravchenko T. and PavlovаV.M. Immunobiological properties of Francisella tularensis with inactivated gene (iglC) encoding 23-kD protein // Fourth International Conference On Tularemia (September 15-19). City of Bath, Great Bretain. -  2003. - P. 48.
33. Mokrievich A.N., PavlovаV.M. 2003. Conjugal transfer pSa plasmid from Escherichia coli in Francisella tularensis. // Fourth International Conference On Tularemia (September 15-19). City of Bath, Great Bretain. - 2003. - P. 49.
34. аPlatonov M.,аMokrievich A., аKravchenko T., Shishkova N., and PavlovаV.M. 2003. Cloning of iron-dependent superoxide dismutase (SodA) of Mycobacterium tuberculosis in Francisella tularensis 15/10 // Fourth International Conference On Tularemia (September 15-19). City of Bath, Great Bretain. - 2003. - P. 50.
35. Мокриевич А.Н, Павлов В.М. Francisella tularensis и межвидовой обмен генетической информации. //Юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); -  2003. - С. 147.
36. Kravchenko T.B.,  Mokrievich A.N., Platonov M.E., Vahrameeva G.M., and PavlovаV.M. Development of recombinant Francisella tularensis vaccine strains carrying additional protective antigens. In the book of abstracts of the 1-st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. Badajoz, Spain, 2005, p.861
37. Platonov M.E., Mokrievich A.N., and PavlovаV.M. Plasmid conjugation and mobilization from Escherichia coli into Francisella tularensis // 1-st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (March 15-18). Badajoz, Spain. - 2005. - P. 861
38. Платонов М. Е., Мокриевич А. Н., Кравченко Т. Б., Вахрамеева Г. М., Шишкова Н. А., Павлов В. М. Экспрессия генов протективных антигенов туберкулезного микроба в вакцинном штамме Francisella tularensis 15/10 // 3-ий  Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития (14-18 марта). Москва, Россия. - 2005. - С. 85.
39. Pavlov V.M., MokrievichаA., PlatonovаM., Kravchenko T. Vachrameeva G., Titareva G.,а  Bakhteeva I., Mironova R., Parra M., Elkins K.L., Brennan M.J. New bacterial vector for Mycobacterium tuberculosis protective antigens // The 2006 NIAID Research Conference (June 24-30). Opatija, Croatia. - 2006.- P. 43
40. Кравченко Т.Б., Мокриевич А.Н., Платонов М.Е., Вахрамеева Г.М., Кудрявцева Т.Ю., Баннов В.А., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Потапов В.Д., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Ганина Е.А, Павлов В.М. Вакцинный штамм Francisella tularensis - новый бактериальный вектор для протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств группы восьми и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств/ VII-я Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ (3-5 октября). Оболенск, Россия. - 2006. - С. 147-148.
41. Павлов В.М., КравченкоаТ.аБ., МокриевичаА.аН., ПлатоноваМ.аЕ., ВахрамеевааГ.аМ., КудрявцевааТ.аЮ., БанноваВ.аА., МироновааР.аИ., КомбаровааТ.аИ., ПотаповаВ.аД., БахтеевааИ.аВ., ТитаревааГ.аМ., ГанинааЕ.аА. Противотуберкулезная протективная активность туляремийного вакцинного штамма с антигенами Mycobacterium аtuberculosis 85B и ESAT-6 // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиема Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней (11-12 ноября). Москва, Россия. - 2008. - С. 95.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии