Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
СУХОВЕРШИН Роман Александрович
МЕТАБОЛИЗМ АРГИНИНА И ЕГО МЕТИЛИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ И ПРИ ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС
03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Новосибирск - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель доктор биологических наук ГИЛИНСКИЙ Михаил Абрамович
Официальные оппоненты:
ИВАНОВА Людмила Николаевна академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, советник РАН ВАВИЛИН Валентин Андреевич доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, руководитель лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинетики Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится 30 мая 2012 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4; тел.: 8-383-33489-61).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения Научноисследовательский институт физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4).
Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бузуева Ирина Ивановна Общая характеристика диссертации
Актуальность темы Оксид азота (NO) выполняет в организме многие жизненно важные функции. Анализу этих функций посвящено несколько обзоров [Lowenstein and Snyder, 1992; Марков, 2001]. Нарушение продукции NO вовлечено в развитие ряда заболеваний, включая эндотелиальную и эректильную дисфункции, гипертензию и атеросклероз [Родионов и др., 2008].
Аминокислота аргинин (АРГ) и её метилированные аналоги (метиларгинины) играют ведущую роль в регуляции биодоступности NO в организме [Гилинский, 2007]. АРГ служит субстратом внутриклеточного фермента NO-синтазы (NOS), производящего эндогенный NO [Sessa, 1994]. Монометиларгинин (ММА) и асимметричный диметиларгинин (АДМА) являются конкурентными ингибиторами всех изоформ NOS. Они блокируют АРГ-связывающий участок фермента, препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса [Rees et al., 1990; Vallance et al., 1992]. Даже небольшое повышение концентрации АДМА вне клетки соответствует такому изменению внутриклеточного уровня АДМА, которое достаточно для подавления активности NOS [Cardounel et al., 2007]. Структурный изомер АДМА - симметричный диметиларгинин (СДМА), не влияет на активность NOS, но конкурирует с АРГ за трансмембранные переносчики в клетку, ограничивая доступность АРГ для NOS [Closs et al., 1997].
В этой связи изучение метаболизма АРГ и метиларгининов, а также особенностей регуляции продукции NO эндогенными метиларгининами в физиологических условиях и при различной патологии in vivo в последнее время привлекает внимание всё большего количества исследователей [Bger, 2009].
Известно, что АРГ синтезируется в организме, а также высвобождается из клеточных белков и поступает с пищей [Morris, 2006].
Метиларгинины образуются при посттрансляционной модификации АРГ-содержащих белков и высвобождаются в результате протеолиза [Anthony et al., 2005]. Только свободные АДМА и ММА способны ингибировать NOS.
Элиминация свободных ММА и АДМА осуществляется преимущественно путём ферментативного гидролиза диметиларгинин диметиламиногидролазой (ДДАГ) [Ogawa et al., 1987]. Лишь небольшая доля данных веществ выводится с мочой в неизменном виде [Achan et al., 2003]. Напротив, СДМА не подвергается ферментативной деградации и элиминируется путём экскреции с мочой [Yudkoff et al., 1984].
Важным органом для метаболизма АРГ и его метилированных аналогов являются почки. Они не только обеспечивают экскрецию данных веществ с мочой, но участвуют в реализации и других механизмов, связанных с поддержанием определённого уровня циркулирующих в крови АРГ и метиларгининов. Клетки проксимальных канальцев почки являются основным местом продукции АРГ в организме млекопитающих [Dhanakoti et al., 1990] и этот метаболический путь служит важным источником циркулирующего в крови АРГ [Featherson et al., 1973]. Кроме того, в ткани почки содержится большое количество ДДАГ, обеспечивающее ферментативную элиминацию АДМА и ММА [Tojo et al, 1997; Leiper et al., 1999].
В крови пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) зарегистрированы повышенные уровни АДМА и СДМА [Schwedhelm and Bger, 2011]. Увеличение циркулирующего в крови АДМА сопровождалось подавлением синтеза NO, и ассоциировалось с развитием сердечно-сосудистой патологии (эндотелиальная дисфункция, атеросклероз, гипертензия и пр.) [Siroen et al., 2006]. Из представленных в литературе данных видно, что роль почек в метаболизме метиларгининов комплексная и изучена недостаточно. Большинство исследований в отношении метаболизма АРГ и его метилированных аналогов при нарушении функции почек являются клиническими и сфокусированы на ХБП. В то же время в литературе отсутствуют работы, направленные на изучение влияния острого повреждения почек на уровни циркулирующих в крови метиларгининов и их экскрецию с мочой. Однако такие исследования, вероятно, могли бы способствовать более полному пониманию роли почек в регуляции уровней метиларгининов. Кроме того, эти исследования помогли бы выяснить, имеют ли метиларгинины какую-либо патогенетическую значимость при синдроме острой почечной недостаточности (ОПН).
Цель работы Определить влияние острого повреждения почек на почечную экскрецию и метаболизм аргинина и его метилированных аналогов, а также выяснить роль данных веществ в нарушении продукции оксида азота при остром повреждении почек на модели глицериновой острой почечной недостаточности.
Задачи исследования 1. Исследовать суточную экскрецию аргинина, монометиларгинина, асимметричного и симметричного диметиларгининов с мочой в физиологических условиях и при остром повреждении почек.
2. Определить концентрации аргинина, монометиларгинина, асимметричного и симметричного диметиларгининов, а также их соотношения в плазме крови и почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.
3. Оценить активность диметиларгинин диметиламиногидролазы в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.
4. Измерить скорость продукции аргинина в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.
5. Определить концентрацию в крови и суточную экскрецию с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота (нитрит/нитрат-ионов) в физиологических условиях и при остром повреждении почек.
Научная новизна Впервые показано, что почечная экскреция аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина не изменяется при остром повреждении почек, индуцированном глицерином у крыс, а экскреция асимметричного диметиларгинина многократно увеличивается.
Обнаружено, что при острой почечной недостаточности у крыс концентрация циркулирующего в крови асимметричного диметиларгинина значимо не меняется, несмотря на значительный рост экскреции этой аминокислоты с мочой. Напротив, на фоне сохран ной почечной экскреции аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина, уровень аргинина в системном кровотоке снижается, а симметричного диметиларгинина значительно увеличивается.
Выявлено, что содержание аргинина и его метилированных аналогов в почечной ткани при остром повреждении почек, индуцированном глицерином, уменьшается вдвое.
Впервые продемонстрировано, что при остром повреждении почек в организме возрастает продукция симметричного диметиларгинина, несмотря на то, что общий метаболизм монометиларгинина (предшественника симметричного диметиларгинина) не изменяется.
Установлено, что активность диметиларгинин диметиламиногидролазы и скорость продукции аргинина в почечной ткани уменьшаются под влиянием острой почечной недостаточности. Подавление активности диметиларгинин диметиламиногидролазы в ткани почки не приводит к повышению концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме за счёт увеличения его экскреции с мочой.
Впервые выявлено, что при остром повреждении почек, как в крови, так и в почечной ткани уменьшается отношение АРГ/(ММА+АДМА). Изменение баланса субстрата и эндогенных ингибиторов NO-синтазы приводит к снижению биодоступности оксида азота (количество эндогенного оксида азота, доступного для клеток-мишеней) в организме.
Научно-практическая значимость Данная работа носит преимущественно фундаментальный характер и существенно расширяет представления о механизмах регуляции уровня циркулирующих в крови аргинина и его метилированных аналогов. Полученные данные также демонстрируют вклад изменений метаболизма аргинина и метиларгининов в снижение синтеза оксида азота и являются шагом к разработке способов коррекции нарушений биодоступности оксида азота при патологии почек.
Полученные результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.
Положения, выносимые на защиту 1. Острое повреждение почек у крыс не оказывает влияния на почечную экскрецию аргинина, монометиларгинина, симметричного диметиларгинина и увеличивает экскрецию асимметричного диметиларгинина. При этом продукция симметричного диметиларгинина в организме увеличивается, а метаболизм монометиларгинина не изменяется.
2. Ферментативный путь элиминации асимметричного диметиларгинина в почечной ткани при остром повреждении почек подавляется, однако это нарушение не приводит к повышению концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови за счёт компенсаторного увеличения его почечной экскреции.
3. Продукция аргинина почечной тканью при остром повреждении почек подавляется, а его концентрация в крови и ткани почки снижается, что приводит к уменьшению количества субстрата NOсинтазы (аргинина) на единицу её эндогенных ингибиторов (монометиларгинина и асимметричного диметиларгинина) и, как следствие, к снижению биодоступности оксида азота в почке и в целом организме.
Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации, представлены на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 1925 сентября 2010 г.), на XLVII ERA-EDTA Congress (г. Мюнхен, Германия, 25-28 июня 2010 г.), 5th International Symposium on ADMA (г. Чикаго, США, 11-12 ноября 2010 г.), на I всероссийской научной конференции молодых учёных Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия (г. Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 г.), на конкурсе молодых учёных ФГБУ НИИ физиологии СО РАМН на лучшую научно-исследовательскую работу (г. Новосибирск, марта 2012 г.).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ (из них - 5 статей в центральной печати).
Объем и структура диссертации Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы. Диссертация содержит 13 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы включает 182 источника, в том числе 8 отечественных и 1зарубежных авторов.
Материалы и методы исследования Эксперименты проведены на половозрелых самцах крыс Wistar массой 180 - 220 г. Животные содержались индивидуально в метаболических клетках (Tecniplast, Italy) при 12-часовом цикле освещения со свободным доступом к воде и пище. Экспериментальный протокол одобрен этическим комитетом ФГБУ НИИ физиологии СО РАМН и выполнен в соответствии с директивами 86/609/EC.
Острое повреждение почек (n=33) инициировали инъекцией 50% водного раствора глицерина в мышцы обеих задних конечностей (всего 10 мл/кг веса) [Zager, 1996]. За 24 ч до инъекции животных лишали доступа к воде. Сразу после введения глицерина доступ к воде восстанавливали. Животным контрольной группы (n=31) вводили 0.9% раствор NaCl в том же объёме. Спустя 72 ч после инъекции регистрировали суточный объём мочи и забирали образец мочи для анализа. Затем животных декапитировали для забора крови и ткани почки.
Концентрации креатинина и мочевины в плазме и суточной моче определяли стандартными диагностическими наборами (Fluitest, Biocon, Germany). Почечный клиренс вещества (XCL) рассчитывали по формуле XCL=UX*V/PX/1440, где XCL - клиренс вещества X (мл/мин), UX - концентрация X в моче, PX - концентрация X в плазме крови, V - объём мочи (мл). Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) принимали равной клиренсу креатинина. Экскретируемую фракцию вещества (EFX) рассчитывали по формуле EFX=XCL*100/СКФ, где EFX - экскретируемая фракция (%), XCL - клиренс вещества X (мл/мин). Долю реабсорбции (R, %) клубочко вого фильтрата рассчитывали как R=100*(СКФЦминутный диурез)/СКФ.
Концентрации АРГ и метиларгининов в плазме крови, суточной моче и гомогенатах почечной ткани определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентной детекцией после твердофазной экстракции [Teerlink, 2007].
Вкратце, 200 мкл плазмы, мочи или депротеинизированного гомогената смешивали со 100 мкл 40 мкМ раствора внутреннего стандарта (гомоаргинин) и 700 мкл фосфатного буфера (pH 7.0). Эту пробу наносили на картридж Oasis MCX (1cc, 30mg, Waters, USA) для твердо-фазной экстракции основных аминокислот. Картриджи кондиционировали 1 мл метанола и 1 мл воды. После нанесения пробы на сорбент, картриджи последовательно промывали 1 мл 0.1 М HCl и 1 мл метанола. Аналиты элюировали с помощью 1 мл смеси концентрированного аммиака/воды/метанола/1 М NaOH (10/40/50/0.5).
После упаривания раствора под током азота, аминокислоты растворяли в 200 мкл воды и дериватизировали ортофтальдиальдегидным реагентом, содержащим 3-меркаптопропионовую кислоту. Дериваты разделяли на колонке Luna C18(2) (3 мкм, 100x2 мм, Phenomenex, USA), объём инжекции - 20 мкл (аутоинжектор SIL-10AD, Shimadzu, Japan). В качестве подвижной фазы использовали 50 мM KH2PO4 буфер (pH 6.5) содержащий 8.7% ацетонитрила при скорости потока 0.2 мл/мин (насос LC-10ADvp, Shimadzu, Japan) и температуре колонки 45оС. Флуоресцентную детекцию аналитов проводили детектором RF-10A (Shimadzu, Japan) на волнах возбуждения - 340 нм, эмиссии - 455 нм. После выхода последнего аналита колонку промывали 25% ацетонитрилом в буфере. Расчёт концентраций аналитов осуществляли по отношению площадей пиков стандартных и исследуемых образцов с поправкой на внутренний стандарт (софт LCSolution, Shimadzu, Japan).
Активность ДДАГ в почечной ткани определяли прямым измерением количества АДМА, метаболизированного ферментом [Nonaka et al., 2006]. Гомогенат разделяли на две части: к 90 мкл гомогената и 180 мкл 0.1 М Na2HPO4 буфера (pH 6.5) добавляли 30 мкл 5мкМ АДМА. Для инактивации ДДАГ в одну из пробирок немедленно добавляли 30 мкл 30% 5-сульфосалициловой кислоты (ССК), затем инкубировали на водяной бане 60 мин при 37oC. В этой пробирке активность ДДАГ образца принималась равной 0. Другую про бирку с гомогенатом инкубировали 60 мин при 37oC перед тем, как добавить 30% ССК. Затем все образцы центрифугировали 10 мин при 9100g и 4oC. Супернатант подвергался процедуре твёрдофазной экстракции и ВЭЖХ анализу, описанным выше. Активность ДДАГ выражали как снижение количества АДМА (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC. Концентрацию белка в образцах определяли методом Бредфорда [Bradford, 1976].
Продукцию АРГ в почечной ткани оценивали способом, подобным определению активности ДДАГ, но без использования экзогенного АДМА. Скорость синтеза АРГ выражали как увеличение количества АРГ (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC.
Нитрит-ионы определяли реакцией Грисса [Navarro-Gonzlvez et al., 1998]. 150 мкл образца помещали в лунку 96-луночной планшеты, последовательно добавляли 75 мкл 60 мМ раствора сульфаниламида (в 7% HCl) и 75 мкл 0.77 мМ нафтилэтилендиамина дигидрохлорида (NEDA). Спустя 5 мин определяли поглощение света образцом на длинах волн 540 нм и 630 нм в бихроматическом режиме (ELx 808iu, Bio-Tek, USA). Нитрат-ионы восстанавливали до нитрит-ионов гранулами кадмия (Cd), покрытыми медью [NavarroGonzlvez et al., 1998]. Все образцы депротеинизировали раствором ZnSO4 [Ghasemi et al., 2007]. К 250 мкл супернатанта добавляли мкл 0.2 М глицин-NaOH буфера (pH 9.7). В пробирку с образцом помещали 4 гранулы (d~2мм) покрытого медью Cd и встряхивали мин. Затем образец переносили в чистую пробирку и центрифугировали 7 мин при 12000g. Супернатант забирали для определения нитрит-иона. Для покрытия медью, гранулы Cd трижды промывали деионизованной водой и помещали в 5 мМ раствор CuSO4 на 5 мин.
Помешивали на протяжении всей инкубации. Затем дважды промывали глицин-NaOH буфером, подсушивали и сразу использовали.
Анализ данных осуществляли при помощи пакета Statistica (StatSoft, USA). Данные представлены как MSE. Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова. Значимость различий средних значений между группами определяли tтестом для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p<0.05. Корреляционный анализ проводили по всей выборке с использованием линейного коэффициента Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение Экскреторная функция почек при острой почечной недостаточности Внутримышечная инъекция 10 мл/кг 50% раствора глицерина значительно нарушала экскреторную функцию почек. Спустя 72 ч после введения глицерина в суточной моче животных значимо уменьшались количества креатинина и мочевины (рис. 1). СКФ, рассчитанная по клиренсу эндогенного креатинина, и почечный клиренс мочевины были также снижены (рис. 2).
а) б) а) б) 1,2 1,8 0,8 0,0,4 0,* * * * 0,0 0,К О К О К О К О Рис. 1. Количество креатинина (а) и Рис. 2. Почечный клиренс креатинина мочевины (б), экскретированное с (а) и мочевины (б) у животных конмочой за сутки у животных кон- трольной группы (К) и при острой трольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данпочечной недостаточности (О). Дан- ные представлены как Mm. * - ные представлены как Mm. * - p<0.000001 между К и О.
p<0.0001 между К и О.
Данные изменения сопровождались накоплением креатинина и мочевины в плазме крови животных с ОПН (рис. 3).
Объём суточной мочи животных спустя 72 ч после индукции ОПН не отличался значимо от такового в контрольной группе (рис.
4а). Однако реабсорбция клубочкового фильтрата в этот период была значимо снижена (рис. 4б).
При визуальной оценке макропрепаратов почек крыс с ОПН, полученных после забоя животных, выявлены тотальные мелко- и крупноочаговые повреждения (некроз) почечной паренхимы. Данные очаги поражения распространялись через всю толщу коркового вещества вплоть до мозгового вещества почки.
мл / мин мл / мин моль / 24 ч ммоль / 24 ч б) а) а) б) 300 60 1* * 200 40 * 100 0 0 К О К О К О К О Рис. 3. Концентрация креатинина (а) Рис. 4. Суточный объём мочи (а) и и мочевины (б) в плазме животных реабсорбция клубочкового фильтрата контрольной группы (К) и при острой (б) у животных контрольной группы почечной недостаточности (О). Дан- (К) и при острой почечной недостаные представлены как Mm. * - точности (О). Данные представлены p<0.000001 между К и О.
как Mm. * - p<0.001 между К и О.
Известно, что глицерин вызывает некроз мышц (рабдомиолиз) и высвобождение миоглобина в кровь. Свободный миоглобин оказывает нефротоксическое действие, образует сгустки в канальцах нефронов, а также связывает NO, вызывая интраренальную вазоконстрикцию и ишемию почечной ткани. Гиповолемия вследствие отёка некротизированных мышц тоже вносит вклад в ишемическое повреждение почек. Все эти события в комплексе приводят к развитию ОПН [Zager, 1996; Bosch et al., 2009].
Наблюдаемые нами нарушения экскреторной функции почек после введения глицерина (снижение экскреции креатинина и мочевины, их аккумуляция в крови, уменьшение реабсорбции клубочкового фильтрата) типичны для ОПН и согласуются с данными других исследователей [Айзман и соавт., 2000; Soares et al., 2002; Rosenberger et al., 2008].
АРГ и метиларгинины в моче при острой почечной недостаточности Концентрация АРГ и его метилированных аналогов в моче, приведенная к концентрации креатинина у животных с ОПН увеличивалась (рис. 5). АДМА в моче большинства контрольных животных присутствовал в концентрациях ниже порога чувствительности % мл мМ мкМ детектора, однако его концентрация возрастала более чем в 100 раз при ОПН.
АРГ СДМА АДМА 80 1,2ММА * ** * 1,2 * 0,0,8 0,0,4 0 0,0 0,0 К О К О К О К О Рис. 5. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в моче, приведенные к концентрации креатинина (Кр) у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как Mm. * - p<0.05, ** - p<0.005 между К и О.
Несмотря на выраженное нарушение экскреторной функции почек, суточная экскреция АРГ и метиларгининов с мочой не уменьшалась (рис. 6). Более того, количество АДМА, выводимого из организма с мочой, увеличивалось более чем в 100 раз.
АРГ ММА АДМА СДМА 162* 1230 18140 0 К О К О К О К О Рис. 6. Количество аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в суточной моче у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как Mm. * - p<0.001 между К и О.
нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч Экскретируемые фракции АРГ и его метилированных аналогов при остром повреждении почек значительно возрастали (рис. 7), и имели обратные корреляционные связи с реабсорбцией клубочкового фильтрата (r=-0,94 для АРГ, r=-0,93 для ММА, r=-0.90 для АДМА и r=-0.82 для СДМА, p<0.05).
ММА АДМА СДМА АРГ 1*** ** * *** 60 40 20 0 0 0 К О К О К О К О Рис. 7. Экскретируемые фракции аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как Mm. * - p<0.05, ** - p<0.01, *** - p<0.005 между К и О.
Низкие значения экскретируемых фракций свидетельствуют о практически полной реабсорбции АРГ и метиларгининов у здоровых крыс. Интересно, что экскретируемая фракция СДМА, имеющего близкую структурную аналогию с АДМА, значительно выше, чем у последнего. Такие различия могут объясняться как более низкой реабсорбцией СДМА, так и его секрецией клетками канальца.
Пренебрежительно малое количество АДМА в суточной моче животных контрольной группы свидетельствует о том, что элиминация АДМА, образующегося в организме данных животных, полностью обеспечивается ферментативным гидролизом ДДАГ. Сходные данные получены и другими авторами [Al Banchaabouchi et al., 2000; Nijveldt et al., 2003].
На сегодняшний день в литературе нет сведений о почечной экскреции ММА у крыс. Нами впервые показано, что экскреция ММА у половозрелого самца крысы Wistar составляет около нмоль в сутки. При этом экскретируемая фракция ММА у крысы по % % % % данным нашей работы оказалась в 2.5 раза выше, чем у человека [по Torremans et al., 2003].
Примечательно, что экскреция АРГ и метиларгининов при остром повреждении почек оставалась сохранной, несмотря на низкую СКФ. Это может быть обусловлено секрецией или нарушенной реабсорбцией данных веществ, что подтверждается значимым увеличением их экскретированных фракций при развитии ОПН, и сильными отрицательными связями с реабсорбцией клубочкового фильтрата. В модели хронической болезни почек у крыс также были обнаружены увеличение суточной экскреции АДМА и отсутствие изменений в экскреции СДМА [Al Banchaabouchi et al., 2000; Matsuguma et al., 2006].
АРГ и метиларгинины в крови при острой почечной недостаточности Острое повреждение почек оказывало разное влияние на циркулирующий в крови АРГ и его метилированные аналоги. Так, концентрация АРГ в плазме крови снижалась. Уровень СДМА в крови, напротив, значительно возрастал. Концентрации ММА и АДМА в плазме при ОПН не изменялись значимо (рис. 8).
ММА СДМА АРГ АДМА 2,** 20,6 0,6 1,160 1,0,3 0,* 0,10,0 0,0 0,К О К О К О К О Рис. 8. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в плазме крови животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как Mm. * - p<0.005, ** - p<0.00001 между К и О.
Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между уровнем СДМА в крови и маркёрами функции почек: r=0. мкМ мкМ мкМ мкМ для креатинина плазмы, r=0.95 для мочевины плазмы, и r=-0.90 для СКФ (p<0.05 для всех связей). Концентрация АРГ в крови также имела связь с данными маркёрами: r=-0.78 для мочевины, r=-0.для креатинина, и r=0.63 для СКФ (p<0.05 для всех связей).
В настоящее время СДМА признаётся эндогенным маркером почечной функции. Элиминация СДМА из организма осуществляется путём экскреции с мочой [Yudkoff et al., 1984]. В крови пациентов с терминальной стадией ХБП обнаружено увеличение концентраций СДМА и АДМА [Vallance et al., 1992], и большинство авторов связывают высокие уровни диметиларгининов в крови с нарушением их экскреции [Schwedhelm and Bger, 2011]. Однако, результаты нашей работы свидетельствуют об увеличении продукции СДМА при повреждении почек, поскольку его концентрация в крови возрастала на фоне сохранной почечной экскреции.
Повышение продукции СДМА может быть связано с увеличением скорости распада СДМА-содержащих белков. Например, метаболический ацидоз при уремии усиливает катаболизм белков мышечной ткани [Mitch et al., 1989], а интраренальное воспаление и оксидативный стресс повышают экспрессию ферментов, метилирующих АРГ в белках почечной ткани [Matsuguma et al., 2006].
Концентрация АДМА в плазме животных после повреждения почек не изменялась значимо, а его суточная экскреция, напротив, многократно возрастала. Такие изменения могут свидетельствовать об увеличении продукции АДМА. Вероятно, что гиперпродукцию АДМА при ОПН обуславливают те же факторы, что продукцию СДМА.
Другой причиной увеличения экскреции АДМА с мочой может быть нарушение ферментативного пути элиминации этого диметиларгинина при повреждении почек. АДМА, в отличие от СДМА, подвергается гидролизу ферментом ДДАГ [Pope et al., 2009]. Показано, что почка содержит большое количество данного фермента [Palm et al., 2007].
ММА является предшественником АДМА и СДМА [Nicholson et al., 2009], поэтому изменения в метаболизме диметиларгининов вероятно должны были бы затрагивать и метаболизм ММА, однако этого не отмечено. Отсутствие в литературе информации о ММА затрудняет интерпретацию полученных нами результатов. Повидимому, интенсивность монометилирования и диметилирования АРГ в белках регулируется независимо. Однако механизмы, контролирующие интенсивность диметилирования АРГ, до настоящего времени не исследованы.
Повреждение почек затрагивало метаболизм АРГ, о чём говорит снижение концентрации АРГ в плазме на фоне его неизменной суточной экскреции с мочой. Низкий уровень циркулирующего в крови АРГ также был зарегистрирован в модели ОПН, индуцированной уранил-нитратом [Schramm et al., 2002] и у пациентов с ХБП [Schramm et al., 2002; Brunini et al., 2006]. Вероятной причиной уменьшения концентрации АРГ в крови может быть нарушение его продукции в почке. Известно, что клетки проксимальных канальцев почки являются основным местом продукции АРГ в организме млекопитающих [Dhanakoti et al., 1990]. Этот метаболический путь служит важным источником циркулирующего в крови АРГ [Featherson et al., 1973].
Изменения в метаболизме АРГ и метиларгининов приводили к снижению количества АРГ на единицу его метилированных аналогов в плазме крови. Так, соотношение АРГ/(АДМА+ММА) снижалось со 151.9118.69 до 108.555.13, p<0.05. Данное соотношение субстрата и ингибиторов NOS отражает биодоступность NO. Показано, что снижение величины АРГ/АДМА в крови крыс ассоциируется с уменьшением тока крови через почки, печень и селезёнку [Richir et al., 2009].
Содержание АРГ и метиларгининов в почечной ткани при острой почечной недостаточности Концентрация АРГ в ткани почки животных обеих групп была на несколько порядков выше, чем концентрации метиларгининов.
Спустя 72 ч после индукции ОПН наблюдалось значимое снижение концентраций АРГ и его метилированных аналогов: уровень АРГ уменьшался на 66.42.4%, ММА на 40.66.4%, АДМА на 58.07.9% и СДМА на 59.61.1%, p<0.00001 (рис. 9). В тоже время концентрация общего белка в образцах ткани была выше, чем у контрольной группы (11.40.34 и 9.380.32 соответственно, p<0.005).
Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между концентрациями анализируемых веществ в почечной ткани и маркёрами почечной функции. Так, r=0.80 для СКФ и АРГ, r=0. для СКФ и ММА, r=0.84 для СКФ и АДМА, r=0.91 для СКФ и СДМА (p<0.05 для всех связей).
ММА АРГ АДМА СДМА 302520* * 1500 * 1000 * 0 0 К О К О К О К О Рис. 9. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в почечной ткани животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как Mm. * - p<0.00001 между К и О.
Изменение уровня АРГ и метиларгининов в почечной ткани при ОПН приводило к уменьшению количества АРГ на единицу его метилированных аналогов. Так, АРГ/(АДМА+ММА) снижалось с 40.312.92 до 32.222.11, p<0.05. При этом было уменьшено количество каждого диметиларгинина на единицу своего предшественника (ММА), а соотношение АДМА/СДМА не менялось. Такие изменения отражают усиленную (по отношению к диметиларгининам) продукцию ММА.
Уменьшение содержания АРГ в почечной ткани также показано на модели ОПН, индуцированной уранил-нитратом [Schramm et al., 2002]. Недостатком АРГ в почечной ткани, вероятно, объясняется феномен усиленного захвата АРГ из системного кровотока почкой после ишемии [Prins et al., 2002], тогда как в физиологических условиях этот орган, напротив, служит источником циркулирующего в крови АРГ [Featherson et al., 1973].
Снижение концентраций АРГ и метиларгининов в ткани почки может быть следствием нарушенной реабсорбции аминокислот повреждёнными канальцами нефрона и/или уменьшения синтеза АРГ почкой. Возможно также, что свободные метиларгинины высвобождаются из почечной ткани в системную циркуляцию при повреждении почки. Такое предположение согласуется с исследованием, про нмоль / г ткани нмоль / г ткани нмоль / г ткани нмоль / г ткани демонстрировавшим, что почка в реперфузионный период после супраренального клипирования аорты переключается с утилизации диметиларгининов из системного кровотока на их выброс в циркуляцию [Yeung et al., 2011].
Активность ДДАГ и продукция АРГ в ткани почки при острой почечной недостаточности ДДАГ ткани почки животных контрольной группы расщепляла АДМА со скоростью 119.18.4 пмоль/мин/мг белка. Активность этого фермента у животных с ОПН была значительно ниже (рис.
10а).
Скорость продукции АРГ в почечной ткани животных контрольной группы составляла 399.649.6 пмоль/мин/мг белка. Повреждение почек также сопровождалось выраженным снижением синтеза АРГ тканью почки (рис. 10б).
ДДАГ а) АРГ б) Рис. 10. Активность диметиларгинин диметиламино1400 гидролазы (ДДАГ) и продукция аргинина (АРГ) в почечной ткани животных контрольной группы (К) и 2при острой почечной недо* * статочности (О). Данные представлены как Mm. * - 0 p<0.01 между К и О.
К О К О Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между активностью ДДАГ, скоростью продукции АРГ в почечной ткани и маркёрами почечной функции. Так, r=0.89 для СКФ и активности ДДАГ, r=0.81 для СКФ и скорости продукции АРГ (p<0.для обеих связей). В то же время, активность ДДАГ и продукция АРГ в почечной ткани не имели значимых линейных связей с уровнем циркулирующих в крови АДМА и АРГ. Однако, активность ДДАГ коррелировала отрицательно с параметрами экскреции АДМА с мочой.
В литературе представлены единичные работы, касающиеся ДДАГ при повреждениях почек. Однако они свидетельствуют о во белка белка пмоль / мин / мг пмоль / мин / мг влечении этого фермента в патологию. Показано, что реперфузия почки крыс, подвергавшейся 45 мин ишемии, сопровождается снижением активности ДДАГ и экспрессии ДДАГ-I в почечной ткани [Li Volti et al., 2008].
Подавление активности ДДАГ в почке, вероятно, обусловлено интраренальным воспалением, оксидативным стрессом и деструкцией эпителия канальцев. Показано, что ДДАГ очень чувствительна к оксидативному стрессу [Murray-Rust et al., 2001]. Ещё одним медиатором, участвующим в подавлении ферментативного гидролиза АДМА при повреждении почек может быть ангиотензин II [Chen et al., 2007; Onozato et al., 2008].
Примечательно, что выраженное снижение активности ДДАГ не оказывало значимого влияния на концентрацию АДМА в плазме крови. Многие исследователи полагают, что уровень циркулирующего в крови АДМА главным образом регулируется ДДАГ [Palm et al., 2007; Leiper and Nandi, 2011]. Одной возможной причиной, по которой концентрация АДМА в плазме крови крыс с ОПН оставалась неизменной, может быть его нарушенная реабсорбция в повреждённых канальцах. Вследствие такого нарушения не гидролизованный АДМА экскретировался с мочой, а не накапливался в плазме. Это предположение подкрепляется обнаруженной сильной обратной корреляционной связью между активностю ДДАГ, экскретированной фракцией и количеством экскретированного АДМА. Возможно также компенсаторное повышение экспрессии и/или активности ДДАГ в других органах, например, в печени. Однако работ, прямо демонстрирующих такой механизм при патологии in vivo, в литературе не представлено.
Интересно, что при ОПН количество АДМА в суточной моче становилось равным количеству ММА. Концентрации данных веществ в крови также были примерно равными. Можно заключить, что ММА и АДМА в организме крыс образуются в сопоставимых количествах. Полученные данные также подтверждают предположение о том, что при подавлении активности ДДАГ в почке с мочой экскретировался тот АДМА, который в физиологических условиях подвергался ферментативной деградации.
Полученные данные позволяют полагать, что активность ДДАГ в ткани почки не играет значимой роли в элиминации ММА у крыс, поскольку связь между почечным клиренсом ММА и активностью ДДАГ отсутствовала. В то же время, активность ДДАГ отрицательно коррелировала с клиренсом АДМА (r=-0.72, p<0.05).
Снижение продукции АРГ почечной тканью при ОПН обусловлено рядом факторов: разрушением клеток почечных канальцев, подавлением активности ферментов ASS и ASL, дефицитом реабсорбции цитруллина (субстрата для синтеза АРГ). Возможно также усиление утилизации АРГ в креатин или агматин, но не в орнитин, поскольку активность аргиназы в почке при глицериновой ОПН снижается [Aydogdu et al., 2006]. Использованный нами способ измерения продукции АРГ позволяет оценить конечный результат совокупности процессов синтеза и деградации АРГ, однако не даёт информации о вкладе отдельных процессов в его продукцию.
Отсутствие значимой связи между продукцией АРГ и его концентрацией в крови свидетельствует о влиянии и других факторов на уровень АРГ в системном кровотоке. Например, усиленный захват АРГ клетками печени [Perez et al., 1977] или эритроцитами [Brunini et al., 2006] при уремии. Усиление метилирования АРГсодержащих белков, вероятно, также вносит вклад в уменьшение циркулирующего АРГ. Об этом говорит снижение количества АРГ на единицу метиларгининов в плазме крыс с ОПН.
Конечные метаболиты оксида азота в моче и крови при острой почечной недостаточности Концентрация нитрит/нитрат-ионов (NOX) в моче, приведенная к концентрации креатинина и их суточная экскреция с мочой значительно снижались при повреждении почек (рис. 11).
а) Рис. 11. Концентрация (а) б) суммарных нитрит/нитрат0,ионов в моче, приведенная к концентрации креатинина 0,(Кр) и их суточная экскреция (б) у животных контрольной * группы (К) и при острой по0,чечной недостаточности (О).
* Данные представлены как 0,00 Mm. * - p<0.01 между К и К О К О О.
мкмоль / 24 ч мкмоль / мкмоль Кр Обнаружены линейные связи между экскрецией NOX и маркерами функции почек: r=0.85 для СКФ r=-0.81 для мочевины, и r=0.80 для креатинина (p<0.05 для всех связей). Также выявлены значимые связи между экскрецией NOX и активностью ДДАГ (r=0.90, p<0.05) и продукцией АРГ (r=0.85, p<0.05) в ткани почки.
В то же время, острое повреждение почек не оказывало значимого влияния на концентрацию NOX в плазме крови: 23.6910.мкМ в контрольной группе против 12.606.54 мкМ при ОПН, p=0.377.
Характерной чертой повреждения почек, индуцированного рабдомиолизом, является интраренальная вазоконстрикция и снижение почечного кровотока. Дефицит вазодилататора NO за счёт его связывания с миоглобином [Zager, 1996] в микроциркуляторном русле и эндотелиальная дисфункция ренальных сосудов [Bonventre and Weinberg, 2003] играют важную роль в уменьшении почечного кровотока. Мы, наряду с другими авторами [Valdivielso et al., 2000;
Tsikas, 2005; Chander and Chopra, 2006], использовали суточную экскрецию NOX с мочой как показатель синтеза NO во всём организме и обнаружили снижение его продукции при остром повреждении почек.
Повреждение почек в нашей работе сопровождалось уменьшением количества субстрата NOS (АРГ) на единицу её ингибиторов (АДМА и ММА) как в ткани почки, так и в крови. Такое изменение, может, наряду с другими факторами, обуславливать прегломерулярную вазоконстрикцию, эндотелиальную дисфункцию и снижение продукции NO почечными клубочками, характерные для глицериновой модели повреждения почек [Valdivielso et al., 2000; Bonventre and Weinberg, 2003]. Экзогенный АРГ, по-видимому, может компенсировать недостаток АРГ. Положительные эффекты его введения на развитие и течение ОПН неоднократно продемонстрированы [Maree et al., 1994; Chander and Chopra, 2006], причём в основе эффектов АРГ лежало усиление продукции NO.
Подавление оксидативного стресса также оказывает благоприятный эффект на острое повреждение почек [Chander and Chopra, 2006]. Данные нашей работы позволяют предположить, что одной из причин положительного эффекта антиоксидантов на ОПН может быть увеличение активности ДДАГ, однако такая гипотеза нуждается в дополнительной проверке.
Выводы 1. Количество аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина в суточной моче не изменялось при глицериновой острой почечной недостаточности, что свидетельствует об отсутствии влияния острого повреждения почек на почечную экскрецию аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина.
2. Ферментативный гидролиз асимметричного диметиларгинина диметиларгинин диметиламиногидролазой (основной путь элиминации асимметричного диметиларгинина) в почечной ткани снижается при глицериновой острой почечной недостаточности. Концентрация асимметричного диметиларгинина в крови при этом не изменяется, а его количество, экскретируемое с мочой, возрастает, что говорит о компенсаторной активации альтернативного пути элиминации асимметричного диметиларгинина (почечной экскреции).
3. Концентрация симметричного диметиларгинина в плазме крови при глицериновой острой почечной недостаточности возрастала на фоне его неизменной почечной экскреции, что свидетельствует об увеличении продукции симметричного диметиларгинина в организме при остром повреждении почек.
4. Концентрация монометиларгинина в плазме крови и его суточная экскреция с мочой при глицериновой острой почечной недостаточности не изменялись, что указывает на отсутствие влияния острого повреждения почек на метаболизм монометиларгинина.
5. За счет снижения продукции аргинина поврежденной тканью почки изменяется баланс субстрат/ингибиторы NO-синтазы, что регистрируется как уменьшение отношения АРГ/(ММА+АДМА).
Нарушение этого баланса приводит к снижению биодоступности оксида азота как в ткани почки, так и в целом организме.
6. Суточная экскреция с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота (нитрит- и нитрат-ионов) снижается при остром повреждении почек, что свидетельствует об угнетении синтеза оксида азота в организме.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Asymmetric dimethylarginine level varies considerably in urine but not in blood during ARF of rat / M. Gilinsky, R. Sukhovershin, G.
Petrakova // XLVII ERA-EDTA Congress. June 25-28, 2010. Munich, Germany. [Abstract Su167] 2. Methylarginines correlate with serotonin in the blood of hemodialysis patients / M.A. Gilinsky, S.I. Anokhin, T.V. Latysheva, S.A.
Koroleva, G.M. Petrakova, M.V. Popov, R.A. Sukhovershin // V Symposium on ADMA ADMA: Bench to bedside and back; exploring new paradigms. November 11-12, 2010. Chikago, Illinois. [Abstract #7] 3. Plasma ADMA does not reflect acute renal failure in the rat / R.A.
Sukhovershin, M.A. Gilinsky // V Symposium on ADMA ADMA:
Bench to bedside and back; exploring new paradigms. November 11-12, 2010. Chicago, Illinois. [Abstract #17] 4. Метиларгинины в эндогенной регуляции биодоступности оксида азота / М.А. Гилинский, Т.В. Латышева, Г.М. Петракова, Р.А.
Суховершин // Тез. докл. XXI съезда физиол. общества им. И.П.
Павлова. - Москва-Калуга. - 2010. - С. 143.
5. Особенности эндогенной регуляции в системе оксида азота при острой почечной недостаточности / Р.А. Суховершин, М.А. Гилинский // Тез. докл. XXI съезда физиол. общества им. И.П. Павлова - Москва-Калуга. - 2010. - С. 588.
6. Метиларгинины у крыс в глицериновой модели острой почечной недостаточности / М.А. Гилинский, Р.И. Айзман, Г.А. Корощенко, Т.В. Латышева, Т.И. Новоселова, Г.М. Петракова, Р.А. Суховершин, М.А. Cуботялов // Бюлл. СО РАМН. - 2010. - Т. 30. - № 4. - С.82-86.
7. Диметиларгинины в глицериновой модели острой почечной недостаточности у крыс / М.А. Гилинский, Р.А. Суховершин // Медицинский академический журнал. - Т. 10. - № 5. - 2010. - С. 1011.
8. Активность диметиларгинин диметиламиногидролазы и продукция аргинина в почечной ткани при миоглобинурической острой почечной недостаточности / Р.А. Суховершин, М.А. Гилинский // Материалы конкурса молодых ученых ФГБУ НИИ физиологии СО РАМН. - 2012. - С. 4.
9. Эндогенные регуляторы биодоступности оксида азота при острой почечной недостаточности у крыс / Р.А. Суховершин, М.А.
Гилинский // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2012. - Т. 153. - № 4. - С.
430-434.
10. Роль асимметричного диметиларгинина в регуляции уровня оксида азота при остром повреждении почек у крыс / Р.А. Суховершин, М.А. Гилинский // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.
Ц 2012. - Т. 98. - № 4. - С. 497-505.
11. Влияние миоглобинурической почечной недостаточности на продукцию оксида азота у крыс / Р.А. Суховершин // Бюлл. СО РАМН. - 2012. - Т. 32. - № 3. - С.131-135.
Список сокращений АДМА асимметричный диметиларгинин АРГ аргинин ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография ДДАГ диметиларгинин диметиламиногидролаза ММА монометиларгинин ОПН острая почечная недостаточность СДМА симметричный диметиларгинин ССК 5-сульфосалициловая кислота ХБП хроническая болезнь почек Cd кадмий NO оксид азота NOS NO-синтаза NOX суммарные нитрит- и нитрат-ионы Соискатель Суховершин Р.А.